KR102586733B1

KR102586733B1 - 강글리오사이드 GM3, GM4, GD1b, GD1a 및 GM1을 포함하는 비경구용 제제의 제조 방법

Info

Publication number: KR102586733B1
Application number: KR1020210041181A
Authority: KR
Inventors: 강재선; 김형회; 최시훈; 표재성; 이승재; 황예진; 김형수; 강연호; 김성호; 권지후; 김현우
Original assignee: 경성대학교 산학협력단; 주식회사 에이아이인사이트; 권지후
Priority date: 2021-03-30
Filing date: 2021-03-30
Publication date: 2023-10-16
Also published as: KR20220135472A

Abstract

본 발명은 강글리오사이드 GM3, GM4, GD1b, GD1a, GM1을 포함하는 비경구용 제제의 제조 방법에 관한 것으로, 녹용 또는 녹각을 물과 에탄올을 이용하여 단계적으로 추출하면서 GM2를 제거하고 GM3, GM4, GD1b, GD1a, GM1만을 선택적으로 추출한 후, 계면활성제, 키토산 및 알칼리성 아미노산을 이용하여 가용화하여 비경구용 제제로 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

강글리오사이드 GM3, GM4, GD1b, GD1a 및 GM1을 포함하는 비경구용 제제의 제조 방법{Preparing method for parenteral formulation comprising ganglioside GM3, GM4, GD1b, GD1a, and GM1}

본 발명은 강글리오사이드 GM3, GM4, GD1b, GD1a 및 GM1을 유효성분으로 포함하는 비경구용 제제의 제조 방법에 관한 것이다.

동물 생약으로 한약에 많이 이용되는 녹용은 사슴의 뿔의 새순으로서 면역조절 및 보혈제로 많이 이용되어 왔다. 동의보감 등의 문헌에도 녹용은 강장작용, 보혈작용, 강정작용, 진통작용, 조혈작용, 생장발육촉진작용, 심부전증 치료작용 및 기능 항진작용 등이 있는 것으로 기록되어 있으며, 이 밖에도 피로회복, 신체활력증강 및 신장의 이뇨기능강화효과 등 많은 효능을 갖고 있는 것으로 알려져 있다.

녹용을 대신하여 새순이 아닌 오래된 부위인 녹각을 이용하는 경우도 많다. 주로 건녹용은 생녹용의 3배정도에 해당하는 고형물을 가지며 성인의 1회 복용량은 약 100 g을 이용하여 달인 물을 100 ml로 농축하여 복용한다. 건조된 녹용은 수분 12%와 무기질 34% 그리고 유기물 54%로 구성되어 있으며, 유기물은 단백질, 지질, Glycosaminoglycan(GAG), 호르몬 및 성장인자 등으로 구성되어 있다. 이 중, 약리작용을 가지는 성분으로는 강글리오사이드(Gangliosides), 아미노산, 인산칼슘, 탄산칼슘, 콜라겐, 인지질, Chondroitins, glucosamins 그리고 Hyaluronic acids 등이다.

이 중, 녹용이나 녹각의 주요 약리성분은 PLAG (1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetyl-rac-glycerol) 및 강글리오사이드이다. PLAG는 주로 녹용 (Cervi Parvum corum, velvet antler) 유래의 활성물질로, 함유량이 0.002%로 극미량 존재한다. 자연상태에서는 이처럼 존재량이 매우 적어, 녹용 12 kg에서 PLAG는 250 mg 정도만을 얻을 수 있다. 식품의약품안전처의 건강기능성 식품의 1일 섭취 인증범위가 1,000 mg인 것을 감안하면 1일 섭취량 기준으로 녹용 46 kg이 필요하므로 경제성이 낮아 추출정제로서는 제품화가 어렵다.

또 다른 주요 약리성분인 강글리오사이드는 글리코스핑고지질(glycosphingolipid)의 하나로서 친수성인 당부분과 소수성인 세라마이드(ceramide)로 구성되어 있는 양쪽성 물질로서, 한 개 이상의 시알산(sialic acid 혹은 N-acetyl neuraminic acid, NANA)을 가지고 있는 당지질이다. 강글리오사이드는 시알산의 개수 등에 따라 여러 종류로 존재한다. 명명법에서, G는 강글리오사이드 계열을 나타내고, 두 번째 문자는 시알산 잔기의 수(Mono, Di, Tri 등 )를 나타낸다. Ganglioside Mono silalic acid의 의미로 GM으로 표기하며 Ganglioside Di-silalic acid의 의미로 GD, 그리고 Ganglioside Tri-silalic acid의 의미로 GT로 표기하며, 세 번째 표기인 수자(1, 2, 3)는 박층크로마토그래피(Thin Layer Chromatography)상의 강글리오사이드들의 이동순서를 나타낸다. 기본 구조 내에서 변형을 나타내기 위하여 GD1a, GT1b 등의 용어가 추가되었다 (Esstential of Glycobiology. 2017). 녹용과 녹각에는 GM3, GM4, GT1b, GD1b가 거의 대부분의 강글리오사이드로 존재하며 그 외에도 GM1, GM2 등이 존재한다.

강글리오사이드는 중추신경 조직 내에 존재하고 있으며 신경 신호 전달 기능과 세포막의 여러 가지 기능에 관여한다 (Yu R.K. 등, 2011). 또한, 암세포를 정상세포로 환원하는 기능 (Fernandez L.E. 등, 2010) 과 비만 (Lipina C. 등, 2015), 항염 (Wang Y 등, 2015) 등에 효과가 뛰어난 것으로 알려져 있다.

그러나, 강글리오사이드 중 GM2는 Adenocacinoma에서 높게 발현되어 암의 성장, 침입, 그리고 진행에 관련이 있다고 발표되었고, 신경세포 형성에 방해를 일으킨다는 연구결과도 있다. 또한 뇌와 척수의 신경파괴로 인한 테이삭스(Tay-Sachs)질환과도 관련이 있는 것으로 보고되었다 (Guetta E. 등, 2008). 특히 GM2가 녹용 복용 시, 체질에 따라 아이들의 경련, 경기의 부작용을 유발하는 원인물질일 수 있다는 가설도 있다.

또한, 강글리오사이드의 구성성분인 세라마이드는 강글리오사이드로부터 분해되어 용출되는 경우 세포막을 재배열하여 세라마이드가 풍부한 막 영역(membrane domain)을 형성함으로써 세포신호전달체(signalosome)로서의 역할을 하며, 세라마이드가 풍부한 막 영역은 세포사멸(apoptosis)를 촉진하는 분자들을 모이게 하여 세포사멸의 유도에 관여한다. 또한 세라마이드가 풍부한 막 영역은 병원균의 내재화(internalization)와 감염된 상피세포로부터 사이토카인(cytokine) 생성을 조절하는 데 관여하고 있다. 세포사멸을 유도하는 항암제, 이온화 방사선(ionizing radiation), 자외선(UV light) 등에 의해 세라마이드 형성이 증가되면 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다. 그 외에도 세라마이드는 신경질환, 암, 비만과 같은 다양한 질환에 관여하고 있다.

따라서 녹용이나 녹각에 존재하는 강글리오사이드 중 GM3, GM4를 선택적으로 추출하거나 또는 대량 추출하기 위하여 효소분해, 발효나 열처리 과정을 거치면서 GM2 또는 세라마이드가 많아지는 문제가 있었다.

종래 기술로, 한국등록특허 제1968926호에는 녹각 추출물의 정제 방법 및 정제 녹각 추출물 에 관한 것으로, 상세하게는 녹각의 유효성분을 효과적으로 추출하기 위한 동물성 유지를 이용한 정제 추출 방법, 이를 이용하여 수득된 녹각 추출물, 및 이를 포함하는 조성물이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제2185132호에는 녹용 추출물의 유산균 발효물 제조방법 및 이로부터 제조된 녹용 추출물의 유산균 발효물이 기재되어 있으며, 녹용 추출물의 기능성 성분인 시알산, 우론산 등의 함량을 현저히 높일 수 있는 제조방법이 기재되어 있다. 그러나, 상기 기술들은 본 발명의 구성 및 효과와 상이하다. 또한, 한국등록특허 제2095917호에는 GM3, GM1, GD1a, GT1b 및 GQ1b 중에서 선택되는 어느 하나의 강글리오사이드를 함유하는 근육 질환 예방 또는 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물이 기재되어 있으나, 각 강글리오사이드의 효과만이 기재되어 있을 뿐, 녹용 또는 녹각으로부터 GM2 또는 세라마이드 성분을 획기적으로 낮추고 유효 약리성분을 선택하여 증폭시켜 추출하는 본 발명의 강글리오사이드 GM3, GM4, GD1b, GD1a, GM1을 포함하는 주사제의 제조 방법과는 그 구성 및 효과에서 차이가 있다.

한국등록특허 제1968926호, 녹각 추출물의 정제 방법 및 정제 녹각 추출물, 2019. 04. 09. 등록. 한국등록특허 제2185132호, 녹용 추출물의 유산균 발효물, 2020. 11. 25. 등록. 한국등록특허 제2095917호, 강글리오사이드를 함유하는 근육 질환 예방 또는 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물, 2020. 03. 26. 등록.

발효녹용의 균주선별 및 발효녹용의 생리활성 (한국식품영양과학회지, 2009) PLAG 가 건강한 성인에게 미치는 면역기능 (Immune network, Vol 15, No 3, 150~160, 2015) Esstential of Glycobiology. 3rd edition, chapter 11, 2017 Guetta E, Peleg L., Rapid Detection of Fetal Mendalian Disorders: Tay-Sachs Disease", Methods Mol. Biol. 2008; 444: 147-59 Robert K Yu 1, Yi-Tzang Tsai, Toshio Ariga, Makoto Yanagisawa, Structures, biosynthesis, and functions of gangliosides-an overview, J Oleo Sci. 2011;60(10):537-44. Luis E Fernandez, Mariano R Gabri, Marcelo D Guthmann, Roberto E Gomez, Silvia Gold, Leonardo Fainboim, Daniel E Gomez, Daniel F Alonso, NGcGM3 ganglioside: a privileged target for cancer vaccines, Clin Dev Immunol. 2010;2010:814397. Christopher Lipina, Harinder S.Hundal, Ganglioside GM3 as a gatekeeper of obesity-associated insulin resistance: Evidence and mechanisms, FEBS Letters 589, 21, 24 October 2015, 3221-3227 Wang Y, Cui Y, Cao F, Qin Y, Li W, Zhang J, Ganglioside GD1a suppresses LPS-induced pro-inflammatory cytokines in RAW264.7 macrophages by reducing MAPKs and NF-κB signaling pathways through TLR4, International Immunopharmacology, 11 Jun 2015, 28(1):136-145 S U Walkley, D A Siegel, K Dobrenis, M Zervas, GM2 ganglioside as a regulator of pyramidal neuron dendritogenesis, Ann N Y Acad Sci. 188~199. 1998 Norihiko Sasaki, Kenichi Hirabayashi, Masaki Michishita, Kimimasa Takahashi, Fumio Hasegawa, Fujiya Gomi, Yoko Itakura, Naoya Nakamura, Masashi Toyoda, and Toshiyuki Ishiwata, Ganglioside GM2, Highly expressed in the MIA PaCa-2 pancreatic ductal adenocarcinoma cell line, is correlated with growth, invasion, and advanced stage, Sci Rep 16369, 2019

본 발명의 목적은 강글리오사이드 GM3 및 GM4을 포함하는 비경구용 제제의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 녹용 또는 녹각으로부터 강글리오사이드 GM2가 제거된 강글리오사이드 GM3 및 GM4를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 녹용 또는 녹각 추출물을 제공한다. 상기 녹용 또는 녹각의 추출물은 알코올 또는 알코올 수용액 추출물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 비경구용 제제의 제조 방법은 에탄올로 GM3, GM4를 추출하고 잔류물에서 GM1, GD1b, GD1a을 물로 추출하는 유효성분을 더 추출할 수 있다. 또한 상기 GM3, GM4, GM1, GD1b, GD1a은 녹용이나 녹각을 대상으로 하여 추출 정제하여 제조할 수 있다.

상기 강글리오사이드 GM1, GM2 및 GM3 의 분자구조를 도 1에 나타내었다. 또한, 도 2 내지 4에 GD1b, GD1a 및 GM4의 분자구조를 나타내었다. GD1a, GD1b는 sialic acid 2개가 분자구조 내에 존재한다.

도 5는 본 발명에 따른 녹용 또는 녹각으로부터 GM3, GM4, GD1b, GD1a 및 GM1의 추출 방법을 도식화한 것이다.

상기 녹용 또는 녹각으로부터 강글리오사이드 GM2가 제거된 강글리오사이드 GM3 및 GM4를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 녹용 또는 녹각 추출물의 제조방법은,

녹용 또는 녹각을 파쇄하여 70~100%(v/v) 에탄올에 실온에서 0.5~3시간 동안 용출시킨 후, 원심분리하여 상등액(supernatant, No.3)과 펠렛(pellet)으로 분리하는 단계 (1 단계);

상기 1 단계의 상등액(No.3)을 4℃에서 10~16시간 방치한 후 다시 원심분리하여 상등액(supernatant, No.3-1)과 펠렛(pellet, No.3-3)으로 분리하는 단계 (2a 단계); 및

상기 2a 단계의 상등액(No.3-1)을 농축한 후, 4℃의 물로 세척한 다음 농축하여 농축물 (No.3-2)을 제조하는 단계(3a 단계);

를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 제조 방법으로 제조된 추출물의 비경구용 제제의 제조 방법은,

상기 3a 단계에서 제조한 농축물에 계면활성제를 혼합하여 1차 혼합물을 제조하는 단계 (4a 단계);

상기 4a 단계의 1차 혼합물에 에탄올을 넣은 후, 가용성 키토산을 혼합하여 2차 혼합물을 제조하는 단계 (5a 단계);

상기 5a 단계의 2차 혼합물에 염기성 아미노산 및 정제수를 첨가하여 녹이고, pH가 8.6이 되도록 맞추어 3차 혼합물을 제조하는 단계 (6a 단계); 및,

상기 6a 단계의 3차 혼합물을 멸균 처리하는 단계 (7a 단계);

를 포함하는 GM3, GM4 가용화 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 4a 단계의 계면활성제(detergent)는 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(polyoxyethylene sorbitan monooleate, Tween-80), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테레이트(polyoxythylene sorbitan monostearate, Tween-60), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미페이트(polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, Tween-40), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(polyoxyethylene sorbitan monolaurate, Tween-20), 트리톤 X-100(triton X-100), 및 노닐페녹시폴리에톡실에탄올(nonyl phenoxypolyethoxylethanol, NP-40), 소르비탄 모노라우레이트(Sorbitan Monolaurate), 소르비탄 모노스테아레이트(Sorbitan Monostearate), 소르비탄 모노올레이트(Sorbitan Monooleate)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 일 수 있다.

상기 4a 단계의 계면활성제는 바람직하게는 친수소수평형(HLB)의 수치가 5 이상인 15이하인 군에서 선택된 1종을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(polyoxyethylene sorbitan monolaurate, Tween-20)이다.

상기 6a 단계의 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘 또는 이들의 2 이상의 혼합물일 수 있다.

본 발명은 녹용 또는 녹각으로부터 강글리오사이드 GM2가 제거된 강글리오사이드 GM3, GM4, GM1, GD1b 및 GD1a 를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 녹용 또는 녹각 추출물을 제공한다. 상기 녹용 또는 녹각의 추출물은 알코올 또는 알코올 수용액 추출물인 것을 특징으로 하는 녹용 또는 녹각 추출물이다.

상기 녹용 또는 녹각으로부터 강글리오사이드 GM2가 제거된 강글리오사이드 GM3, GM4, GM1, GD1b 및 GD1a 를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 녹용 또는 녹각 추출의 제조방법은,

본 발명의 비경구용 제제의 제조 방법은

상기 1 단계의 펠렛(pellet)에 동일 중량의 물을 넣어 현탁하고 60 ℃에서 1시간 교반 추출한 후, 실온에서 1~3 시간 동안 방치하여 용출물을 제조하는 단계 (2b 단계);

상기 2b 단계의 용출물을 원심분리하여 상등액을 동결건조(No.2)시키는 단계 (3b 단계);

상기 3b 단계의 동결건조물(No.2)을 pH 2~3으로 조절한 -20℃의 70~100%(v/v) 에탄올로 용해시켜, 용해되지 않는 잔사(No.2-1)를 제거하고 상등액을 동결건조(No.2-2)하는 단계 (4b 단계); 및

상기 4b 단계 의 동결건조물(No.2-2)을 상기 3a 단계의 농축물 (No.3-2)과 혼합하여 강글리오사이드 GM3, GM4, GM1, GDb1 및 GD1a 농축물을 제조하는 단계 (5b단계);

를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 5b 단계의 강글리오사이드 GM3, GM4, GM1, GDb1 및 GD1a 농축물 에 계면활성제를 혼합하여 1차 혼합물을 제조하는 단계 (6b 단계);

상기 6b 단계의 1차 혼합물에 에탄올을 넣은 후, 가용성 키토산을 혼합하여 2차 혼합물을 제조하는 단계 (7b 단계);

상기 7b 단계의 2차 혼합물에 염기성 아미노산 및 정제수를 첨가하여 녹이고, pH가 8.6이 되도록 맞추어 3차 혼합물을 제조하는 단계 (8b 단계); 및

상기 8b 단계의 3차 혼합물을 멸균 처리하는 단계 (9b 단계)를 포함하는 GM3, GM4, GM1, GDb1 및 GD1a의 현탁액 제조 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 6b 단계의 계면활성제(detergent)는 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(polyoxyethylene sorbitan monooleate, Tween-80), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테레이트(polyoxythylene sorbitan monostearate, Tween-60), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미페이트(polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, Tween-40), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(polyoxyethylene sorbitan monolaurate, Tween-20), 트리톤 X-100(triton X-100), 및 노닐페녹시폴리에톡실에탄올(nonyl phenoxypolyethoxylethanol, NP-40), 소르비탄 모노라우레이트(Sorbitan Monolaurate), 소르비탄 모노스테아레이트(Sorbitan Monostearate), 소르비탄 모노올레이트(Sorbitan Monooleate)로 이루어진 군 중에서 선택되는 2종 이상이다.

상기 계면활성제는 바람직하게는 친수소수평형(HLB)의 수치가 10 이상인 군에서 1종, 10 이하인 군에서 1종을 선택하여 2종을 사용하는 것이며, 더욱 바람직하게는 상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(polyoxyethylene sorbitan monolaurate, Tween-20)와 소르비탄 모노올레이트(Sorbitan Monooleate)이다.

상기 8b 단계의 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘 또는 이들의 2 이상의 혼합물일 수 있다.

상기 가용화 또는 미세현탁화는 물에 잘 녹지 않은 물질의 용해 및 분산도가 증가하는 현상을 말하는 것으로, 난용성 물질인 본 발명의 GM3, GM4의 용해 및 분산도를 높이기 위해 상기 용해 및 분산 방법을 이용할 수 있다.

상기 계면활성제는 난용성 물질 대비 0.01중량% 이상으로 첨가될 수 있다.

상기 가용성 키토산은, 수용성 키토산의 용해성을 증가시키고, 균일성을 높이기 위한 것으로, 분자량 20,000 이하를 이용하여 녹이는 단계를 통해 제조할 수 있다.

상기 가용성 키토산은 약학 조성물을 기준으로 0.1~10%[w/v]가 포함될 수 있다. 가용성 키토산의 함량이 0.1% 미만일 경우는 분산력을 부여하기 어렵고 실질적인 효과가 나타나지 않으며, 10%를 초과할 경우에는 과도한 점성으로 오히려 균일성이 떨어지며, 제조용량이 증가하면 혼합하기도 어렵고, 경제적으로도 바람직하지 못하다.

상기 염기성 아미노산은 용해 보조제로 활용하는 것으로, 아르기닌, 라이신, 히스티딘 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 바람직하게는 아르기닌 또는 라이신이다.

상기 염기성 아미노산은 약학 조성물을 기준으로 0.1~4%[w/v]가 포함될 수 있다. 염기성 아미노산의 함량이 0.1% 미만일 경우에는 용해성을 보조하기가 어렵고 실질적인 효과가 나타나지 않으며, 4%를 초과할 경우에는 과도한 점성으로 인해 겔화가 될 수 있으며, 경제적으로도 바람직하지 못하다.

상기 제제는 GM3, GM4 및 가용화제를 이용하여 가용화하는 제조방법을 제공한다. 또한 GM3, GM4, GM1, GD1b, GD1a를 포함하여 현탁화제를 사용한 현탁제제 제조방법을 제공한다. 상기 GM3, GM4, GM1, GD1b, GD1a은 전체 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001 내지 50중량%, 더 바람직하게는 0.001 내지 40중량%, 가장 바람직하게는 0.001 내지 30중량%로 하여 첨가될 수 있다.

상기 비경구용 제제는 사람과 같은 동물의 하나 또는 그 이상의 피부 또는 점막의 층 아래 또는 통해서 주입하기 위한 저분자 약물을 의미한다. 상기 약학적 조성물은 멸균주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 계면활성제, 산조조절제, 용해보조제을 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)-61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.001㎎/㎏/일 내지 대략 200㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 50㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 제제는 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 및 피부 도포에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명은 강글리오사이드 GM3, GM4, GD1b, GD1a, GM1을 포함하는 비경구용 제제의 제조 방법에 관한 것으로, 녹용 또는 녹각으로부터 유효 약리성분을 추출하고, 유해 성분을 선택적으로 제거함으로써 독성 및 부작용이 거의 없는 강글리오사이드 비경구용 제제를 제공할 수 있다.

도 1은 강글리오사이드 GM1, GM2, GM3 의 분자구조를 나타낸 것이다.
도 2는 강글리오사이드 GD1b의 분자구조를 나타낸 것이다.
도 3은 강글리오사이드 GD1a의 분자구조를 나타낸 것이다.
도 4는 GM4의 분자구조를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 녹용 또는 녹각으로부터 GM3, GM4, GD1b, GD1a 및 GM1의 추출 방법을 도식화한 것이다.
도 6은 본 발명에 따라 각 단계에서 추출된 정제 농축물을 보여주는 사진이다. (A) No.3-1. (B) No.3-2, (C) No.2-1, (D) No.2-2 (도면에서 No.는 #로 표기함)
도 7은 본 발명에 따라 각 단계에서 추출된 No.3-1, No.3-2, No.3-3, No.2-1 및 No.2-2의 박막크로마토그래피 결과이다. 점적 10회 (단, No.3-3은 100회).
도 8은 본 발명에 따라 추출, 정제후 가용화된 GM3, GM4 (A) 및 GM3, GM4, GDb1, GD1a 및 GM1의 현탁액 (B) 사진이다.
도 9는 본 발명에 따라 추출, 정제 후 현탁화된 최종제품의 입자도를 현미경으로 관찰한 사진이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

< 실시예 1. GM3, GM4, GM1, GD1b , GD1a의 추출정제>

녹용 또는 녹각으로부터 GM3, GM4, GM1, GD1b 및 GD1a을 추출정제하였다. 각 과정은 도 5에 모식도로 나타내었다.

1.1 GM3, GM4의 정제

녹용 또는 녹각으로부터 GM3 및 GM4 농축물을 제조하였다.

상기 GM3 및 GM4 농축물의 제조단계 (A단계)는,

녹용 또는 녹각을 파쇄하여 70~100%(v/v) 에탄올에 실온에서 0.5~3 시간 동안 용출시킨 후, 원심분리하여 상등액(supernatant, No.3)과 펠렛(pellet)으로 분리하는 단계 (1 단계);

상기 1단계의 상등액(No.3)을 4℃에서 10~16 시간 방치한 후 다시 원심분리하여 상등액(supernatant, No.3-1)과 펠렛(pellet, No.3-3)으로 분리하는 단계 (2a단계);

상기 2a단계의 상등액(No.3-1)을 농축한 후, 4℃의 물로 세척한 다음 농축하여 농축물 (No.3-2)을 제조하는 단계(3a단계);를 포함한다.

이를 구체적으로 설명하면,

녹용 또는 녹각 200 g을 1 mm이하의 크기로 파쇄하고, 여기에 중량 5배의 70~100%(v/v) 에탄올을 넣어서 잘 흔들어 실온에서 0.5~3 시간 동안 용출시킨 후 원심분리하여 에탄올층과 침전물층을 분리하였다. 원심분리는 3,000 rpm에서 10분간 실시하였다. 이때 에탄올층에는 지용성이 높은 물질인 GM3, GM4 그리고 일부의 GM2가 추출될 것이다. 원심분리로 상등액(No.3)과 펠렛(pellet)을 분리하고, 여기서 얻은 상등액(No.3)은 4 ℃에서 보관하여 용해도가 낮은 GM2를 침전시켰다. 이 후, 이 용액을 원심분리하고 상등액(No.3-1)을 분리한 후, 회전농축기를 이용하여 농축한 다음, 4 ℃에서 보관된 물을 이용하여 세척하여 불순물을 제거하고 농축물을 0.34 g을 보관하였다. 이 과정에서 농축물에는 GM2가 제거되어 GM3, GM4가 함유되게 된다. 상기 과정을 통하여 에탄올 추출물은 고형물로 약 0.17 w/w%가 추출되었다 (NO.3-1). 이것을 에탄올 10 ml로 녹여내서 농축하여 0.245 g을 얻었고 (NO.3-2), 이는 0.125 w/w%에 해당하는 추출정제량이다.

1-2. GM1, GD1b 및 GD1a의 정제

상기 실시예 1-1의 에탄올 추출 잔류물인 펠렛(pellet)에는 에탄올에 용해되지 않는 GM1, GD1b 및 GD1a이 다량 포함되어 있으며, GM3, GM4 및 GM2도 존재한다. 상기 펠렛(pellet)으로부터 물에 용해되는 GM1, GD1b 및 GD1a 농축물을 제조하였다.

상기 GM1, GD1b 및 GD1a의 제조단계 (B단계)는,

상기 실시예 1-1의 1단계의 펠렛(pellet)에 동일 중량의 물을 넣어 현탁하고 60 ℃에서 1시간 교반 추출한 후, 실온에서 0.5~3 시간 동안 방치하여 용출물을 제조하는 단계 (2b단계);

상기 2b단계의 용출물을 원심분리하여 상등액을 동결건조(No.2)시키는 단계 (3b단계);

상기 3b단계의 동결건조물(No.2)을 pH 2~3으로 조절한 -20℃의 70~100%(v/v) 에탄올로 용해시켜, 용해되지 않는 잔사(No.2-1)를 제거하고 상등액을 동결건조(No.2-2)하는 단계 (4b단계);를 포함한다.

이를 구체적으로 설명하면,

상기 실시예 1-1의 1단계의 펠렛(pellet)에 동일 중량의 물을 넣어 현탁하고 60 ℃에서 1시간 교반 추출한 후, 실온에서 1시간 이상 방치하였다. 이후, 이를 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상기 원심분리로 분리한 상등액을 동결건조 (No.2) 하였고, 이때 수득한 동결건조물 (No.2)은 녹용 또는 녹각 200 g에 대하여 약 0.36w/w%이었다. 상기 동결건조물 (No.2)을 -20 ℃에서 보관중인 산도 2의 에탄올 용액로 용해시켜, 용해되지 않는 잔사(No.2-1)를 제거하고 상등액을 동결건조(No.2-2)하였다. 이 과정은 2~3회 반복하여 GM1, GD1b, GD1a이 함유하고 있는 에탄올 용액을 얻었으며 0.305w/w%가 수거되었다 (도 5 의 No.2-2). 즉, 불순물로 존재하는 GM2를 제거하기 위하여 -20 ℃ 에탄올을 첨가하여 GM1, GD1b, GD1a를 녹여내고 2~3회 반복하여 불순물로 존재하는 GM2를 남겨놓고 GM1, GD1b, GD1a 만을 추출하는 것이다.

상기 실시예 1-1 및 1-2에서 수득한 No.3-1, No.3-2, No.2-1 및 No.2-2 의 사진을 도 6 에 나타내었다.

1-3. GM3, GM4, GM1, GD1b , GD1a 및 GM2 확인

상기 실시예 1-1 및 1-2에서 수득한 GM3 및 GM4 추출정제물과 GM1, GD1b 및 GD1a의 추출정제물의 성분을 확인하기 위하여 Thin Layer Chromatography(TLC)를 수행하였다.

TLC판을 사용하여 4℃에서 실행하였으며, 전개 용매로는 Chloroform/Methanol/0.2% CaCl₂수용액(55:45:10 v/v/v)을 사용하였다. 이는 극성도가 높은 당지질 및 Mono-sialo-ganglioside의 분리에 적당하다. 상기 실시예 1-1 및 1-2에서 수득한 No.3-1, No.3-2, No.3-3, No.2-1 및 No.2-2를 50 μg/ml이 되도록 용해시킨 후, 각 검체 10 μl를 점적하고 건조하였으며, 이를 10회(도 7; 단, No.3-3은 100회) 반복하였다. 검체 건조가 끝난 후, 박막(Thin Layer)을 전개용매가 있는 전개조에 넣어 전개하였다. 전개 후 염색은 Orcinol-ferric Chloride-Sulfuric Acid Solution을 사용하여 실시하였고 TLC 판을 120 ℃에서 15~20분간 가열하여 Sialic Acid와 이를 포함하는 Gangliosides를 염색하고 이를 도 7에 나타내었다.

도 7에서 보는 바와 같이, 검체 No.3-2 에 GM3 및 GM4가 다량으로 포함되어 있는 것을 확인하였으며, GM2는 검출되지 않았다. 이에 반하여 검체 No.3-1에서는 GM2가 검출되었으며, 검체 No.3-3의 농도를 10배 높여 점적한 결과, GM2가 검출되는 것을 확인하였다. Image J 프로그램을 이용하여 도 7의 GM2 Spot을 분석한 결과, GM2 불순물은 정제과정에서 90% 이상 정제된 것을 확인하였다. GM2가 검출된 검체 No. 3-3(0.0061g)는 GM3 및 GM4가 다량 포함된 검체 No.3-1(0.34g)의 1.79%로 이 과정에서 GM2가 대부분 제거되었으며, 이후, 검체 No.3-1의 에탄올 세척과정에서 거의 완전히 제거된 것으로 사료된다. 검체 No.2-2에는 GM3, GM4 그리고, GM1, GDb1 및 GD1a 가 검출되었으며, GM2는 검출되지 않았다.

이로써 본 발명의 제조방법을 통하여 생체 내에서 부정적인 효과를 일으킬 수 있는 GM2를 분리시키고, 녹용 또는 녹각의 유효 약리성분인 GM3, GM4 그리고, GM1, GDb1 및 GD1a을 선택적으로 추출하여 농축할 수 있음을 확인하였다.

< 실시예 2. GM3, GM4의 가용화 및 GM3, GM4, GM1, GD1b , GD1a의 미세현탁화된 용액의 제조 >

2.1 GM3 및 GM4의 가용화

상기 실시예 1에서 농축물과 동결건조물을 제제화하였다. GM3 및 GM4가 다량 포함되어 있는 No.2-2를 최종농도 3 v/v%가 되도록 90~99%(v/v) 에탄올로 용해시킨 후, 1 w/v% Tween 80에 잘 혼합하였다. 이후, 여기에 가용화 키토산(soluble chitosan, 분자량 20,000, 속초물산)을 넣어 가용화시켰다. 강글리오사이드는 최종농도 0.1% 또는 0.5%로 사용하였고 최종제품의 고형물의 농도(Brix)가 2 w/v%가 넘지 않도록 가용화 키토산을 첨가하였다. 이때 pH 8.6으로 조정하였고, 고온증기멸균으로 무균화하였다 (도 8A 참조).

2.2 GM3, GM4, GM1, GD1b 및 GD1a의 현탁액 제조

상기 GM3, GM4, GM1, GD1b 및 GD1a가 포함된 No.2-2를 이용하여 현탁액을 제조하였다. 상기 GM3, GM4, GM1, GD1b 및 GD1a가 포함된 No.2-2에, 상기 GM3 및 GM4가 다량 포함된 No.3-2를 혼합한 혼합물로 현탁액을 제조할 수 있다.

상기 GM3, GM4, GM1, GD1b 및 GD1a가 포함된 No.2-2 또는 상기 GM3, GM4, GM1, GD1b 및 GD1a가 포함된 No.2-2에 GM3 및 GM4이 다량 포함된 No.3-2를 혼합한 혼합물에 Tween 20 및 Span 80을 각각 0.5 w/v% 씩 사용하여 최종 계면활성제 농도가 1 w/v% 이 되도록 하였다. 여기에 가용화 키토산(soluble chitosan, 분자량 20,000, 속초물산)을 넣어 가용화제로 이용하였다. 강글리오사이드는 최종농도 0.1% 또는 0.5%로 사용하였고 최종제품의 고형물의 농도(Brix)가 2 w/v%가 넘지 않도록 사용량을 맞추어 가용화 키토산을 첨가하였다. 산도는 8.6으로 조정하였고, 고온증기멸균으로 무균화하였다 (도 8B 참조).

2.3 현탁액의 입자도 확인

비경구용 제제 중, 주사제로 투여할 수 있는 용액은 맑은 액제이거나 입자도 150 μm이하여야 한다. 또한 산도는 4.6이상 9.0이하이다. 또한 고형분의 량(Brix)은 0.6% 이상 2% 이하이어야 통증이 없다. 따라서 미세현탁액도 입자도가 150 μm 이하인 미세현탁액을 제조하는 것이 중요하다. 따라서 상기 실시예 2.2에서 제작된 GM3, GM4, GM1, GDb1 및 GD1a의 현탁액의 입자도를 현미경으로 관찰하여 도 9에 나타내었다. 도 9에서 보는 바와 같이, 현미경상(×400) 관찰결과 입자는 25 μm 이하의 크기를 보였으며, 균일성이 높아진 것을 확인하였고, 주사제로 적합한 것을 확인하였다.

Claims

녹용으로부터 강글리오사이드 GM2가 제거된 강글리오사이드 GM3 및 GM4를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 녹용 추출물.
제1항에 있어서,
상기 녹용 추출물은 알코올 또는 알코올 수용액 추출물인 것을 특징으로 하는 녹용 추출물.
제1항의 추출물의 제조 방법은,
녹용을 파쇄하여 70~100%(v/v) 에탄올에 실온에서 0.5~3시간 동안 용출시킨 후, 원심분리하여 상등액(supernatant, No.3)과 펠렛(pellet)으로 분리하는 단계 (1 단계);
상기 1 단계의 상등액(No.3)을 4℃에서 10~16시간 방치한 후 다시 원심분리하여 상등액(supernatant, No.3-1)과 펠렛(pellet, No.3-3)으로 분리하는 단계 (2a 단계); 및
상기 2a 단계의 상등액(No.3-1)을 농축한 후, 4℃의 물로 세척한 다음 농축하여 농축물 (No.3-2)을 제조하는 단계(3a 단계);
를 포함하는 것을 특징으로 하는 녹용 추출물의 제조 방법.
제3항의 제조 방법으로 제조된 추출물의 비경구용 제제의 제조 방법은,
상기 3a 단계에서 제조한 농축물에 계면활성제를 혼합하여 1차 혼합물을 제조하는 단계 (4a 단계);
상기 4a 단계의 1차 혼합물에 에탄올을 넣은 후, 가용성 키토산을 혼합하여 2차 혼합물을 제조하는 단계 (5a 단계);
상기 5a 단계의 2차 혼합물에 염기성 아미노산 및 정제수를 첨가하여 녹이고, pH가 8.6이 되도록 맞추어 3차 혼합물을 제조하는 단계 (6a 단계); 및,
상기 6a 단계의 3차 혼합물을 멸균 처리하는 단계 (7a 단계);
를 포함하는 GM3, GM4 가용화 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비경구용 제제의 제조 방법.
제4항에 있어서,
상기 4a 단계의 계면활성제(detergent)는 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(polyoxyethylene sorbitan monooleate, Tween-80), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테레이트(polyoxythylene sorbitan monostearate, Tween-60), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미페이트(polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, Tween-40), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(polyoxyethylene sorbitan monolaurate, Tween-20), 트리톤 X-100(triton X-100), 노닐페녹시폴리에톡실에탄올(nonyl phenoxypolyethoxylethanol, NP-40), 소르비탄 모노라우레이트(Sorbitan Monolaurate), 소르비탄 모노스테아레이트(Sorbitan Monostearate), 및 소르비탄 모노올레이트(Sorbitan Monooleate)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 비경구용 제제의 제조 방법.
제5항에 있어서,
상기 4a 단계의 계면활성제는 친수소수평형(HLB)의 수치가 5 이상인 15이하인 군에서 선택된 1종을 사용하는 것을 특징으로 하는 비경구용 제제의 제조 방법.
제6항에 있어서,
상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(polyoxyethylene sorbitan monolaurate, Tween-20)인 것을 특징으로 하는 비경구용 제제의 제조 방법.
제4항에 있어서,
상기 6a 단계의 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘 또는 이들의 2 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 비경구용 제제의 제조 방법.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항의 비경구용 제제의 제조 방법으로 제조한 녹용 유래의 강글리오사이드 GM2가 제거된 강글리오사이드 GM3, GM4, GD1b, GD1a 및 GM1를 유효성분으로 포함하는 비경구용 제제.
녹용으로부터 강글리오사이드 GM2가 제거된 강글리오사이드 GM3, GM4, GM1, GD1b 및 GD1a 를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 녹용 추출물.
제10항에 있어서,
상기 녹용 추출물은 물, 알코올 또는 알코올 수용액 추출물인 것을 특징으로 하는 녹용 추출물.
제10항의 추출물의 제조 방법은,
녹용 또는 녹각을 파쇄하여 70~100%(v/v) 에탄올에 실온에서 0.5~3시간 동안 용출시킨 후, 원심분리하여 상등액(supernatant, No.3)과 펠렛(pellet)으로 분리하는 단계 (1 단계);
상기 1 단계의 상등액(No.3)을 4℃에서 10~16시간 방치한 후 다시 원심분리하여 상등액(supernatant, No.3-1)과 펠렛(pellet, No.3-3)으로 분리하는 단계 (2a 단계); 및
상기 2a 단계의 상등액(No.3-1)을 농축한 후, 4℃의 물로 세척한 다음 농축하여 농축물 (No.3-2)을 제조하는 단계(3a 단계);
상기 1 단계의 펠렛(pellet)에 동일 중량의 물을 넣어 현탁하고 60 ℃에서 1시간 교반 추출한 후, 실온에서 1~3 시간 동안 방치하여 용출물을 제조하는 단계 (2b 단계);
상기 2b 단계의 용출물을 원심분리하여 상등액을 동결건조(No.2)시키는 단계 (3b 단계);
상기 3b 단계의 동결건조물(No.2)을 pH 2~3으로 조절한 -20℃의 70~100%(v/v) 에탄올로 용해시켜, 용해되지 않는 잔사(No.2-1)를 제거하고 상등액을 동결건조(No.2-2)하는 단계 (4b 단계); 및
상기 4b 단계 의 동결건조물(No.2-2)을 상기 3a 단계의 농축물 (No.3-2)과 혼합하여 강글리오사이드 GM3, GM4, GM1, GD1b 및 GD1a 농축물을 제조하는 단계 (5b단계);
를 포함하는 것을 특징으로 하는 녹용 추출물의 제조 방법.
제12항의 제조 방법으로 제조된 추출물의 비경구용 제제의 제조 방법은,
상기 5b 단계의 강글리오사이드 GM3, GM4, GM1, GD1b 및 GD1a 농축물에 계면활성제를 혼합하여 1차 혼합물을 제조하는 단계 (6b 단계);
상기 6b 단계의 1차 혼합물에 에탄올을 넣은 후, 가용성 키토산을 혼합하여 2차 혼합물을 제조하는 단계 (7b 단계);
상기 7b 단계의 2차 혼합물에 염기성 아미노산 및 정제수를 첨가하여 녹이고, pH가 8.6이 되도록 맞추어 3차 혼합물을 제조하는 단계 (8b 단계); 및
상기 8b 단계의 3차 혼합물을 멸균 처리하는 단계 (9b 단계)를 포함하는 GM3, GM4, GM1, GD1b 및 GD1a의 현탁액 제조 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 비경구용 제제의 제조 방법.
제13항에 있어서,
상기 6b 단계의 계면활성제(detergent)는 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(polyoxyethylene sorbitan monooleate, Tween-80), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테레이트(polyoxythylene sorbitan monostearate, Tween-60), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미페이트(polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, Tween-40), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(polyoxyethylene sorbitan monolaurate, Tween-20), 트리톤 X-100(triton X-100), 및 노닐페녹시폴리에톡실에탄올(nonyl phenoxypolyethoxylethanol, NP-40), 소르비탄 모노라우레이트(Sorbitan Monolaurate), 소르비탄 모노스테아레이트(Sorbitan Monostearate), 소르비탄 모노올레이트(Sorbitan Monooleate)로 이루어진 군 중에서 선택되는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 비경구용 제제의 제조 방법.
제14항에 있어서,
상기 계면활성제는 친수소수평형(HLB)의 수치가 10 이상인 군에서 1종, 10 이하인 군에서 1종을 선택하여 2종을 사용하는 것을 특징으로 하는 비경구용 제제의 제조 방법.
제15항에 있어서,
상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(polyoxyethylene sorbitan monolaurate, Tween-20)와 소르비탄 모노올레이트(Sorbitan Monooleate)인 것을 특징으로 하는 비경구용 제제의 제조 방법.
제13항에 있어서,
상기 8b 단계의 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘 또는 이들의 2 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 비경구용 제제의 제조 방법.
제13항 내지 제17항 중 어느 한 항의 비경구용 제제의 제조 방법으로 제조한 녹용 유래의 강글리오사이드 GM2가 제거된 강글리오사이드 GM3, GM4, GD1b, GD1a 및 GM1를 유효성분으로 포함하는 비경구용 제제.