DE69434459T2

DE69434459T2 - Zusammensetzung, welche apoptosis verhindert, methode zur reinigung dieser zusammensetzung und verwendungen davon

Info

Publication number: DE69434459T2
Application number: DE69434459T
Authority: DE
Inventors: Ian Cyril Bathurst; John D. Bradley; L. David Tomei; Philip J. Barr
Original assignee: Sky High Evanston LLC; Sky High LLC
Current assignee: Sky High Evanston LLC; Sky High LLC
Priority date: 1993-11-30
Filing date: 1994-11-30
Publication date: 2006-04-06
Anticipated expiration: 2014-12-01
Also published as: US5635187A; JP2007084573A; EP0732930A4; NO962187D0; DE69434459D1; FI962246A0; US5635186A; US5620885A; AU678090B2; WO1995015173A1; NZ277403A; JPH11501284A; US5567425A; HU9601449D0; US5624672A; US20020110608A1; EP0732930B1; KR960706350A; NO962187L; US5759548A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Materialzusammensetzungen, die bei der Hemmung des apoptotischen Zelltods wirksam sind.
Hintergrund der Erfindung
Apoptose ist ein normaler physiologischer Prozeß, der zum individuellen Zelltod führt. Dieser Prozeß des programmierten Zelltods ist an einer Vielzahl normaler und pathogener biologischer Ereignisse beteiligt und kann durch eine Anzahl nicht in Beziehung stehender Reize ausgelöst werden. Veränderungen der biologischen Regulierung der Apoptose treten auch während des Alterns auf und sind für viele der Zustände und Krankheiten, die mit dem Altern verbunden sind, verantwortlich. Kürzliche Studien der Apoptose haben angedeutet, dass ein gemeinsamer metabolischer Weg, der zum Zelltod führt, von einer breiten Vielfalt von Signalen, wozu Hormone, Serum-Wachstumsfaktor-Entzug, chemotherapeutische Mittel, ionisierende Strahlung und Infektion mit dem menschlichen Immunschwächevirus (HIV) gehören, in Gang gesetzt werden kann. Wyllie (1980) Nature 284: 555–556; Kanter et al. (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 118: 392–399; Duke and Cohen (1986) Lymphokine Res. 5: 289–299; Tomei et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 155: 324–331; und Kruman et al. (1991) J. Cell. Physiol. 148: 267–273; Ameisen and Capron (1991) Immunol. Today 12: 102–105; und Sheppard and Ascher (1992) J. Aids 5: 143–147. Mittel, die die biologische Kontrolle der Apoptose beeinflussen, haben daher bei zahlreichen klinischen Indikationen therapeutischen Nutzen.
Der apoptotische Zelltod ist durch Zellschrumpfung, Chromatin-Verdichtung, zytoplasmatische Bläschenbildung, erhöhte Membrandurchlässigkeit und internucleosomale DNA-Spaltung gekennzeichnet. Gerschenson et al. (1992) Faseb J. 6: 2450–2455; und Cohen and Duke (1992) Ann. Rev. Immunol. 10: 267–293.
Eine Vielzahl von Nahrungs-Ergänzungsstoffen, die zum Teil teilweise verarbeitete Pflanzenextrakte enthalten, wurden zur Besserung der gastrointestinalen Störungen, die oft eine Chemotherapie, Bestrahlung und Aids begleiten, verwendet. Die Ergänzungsstoffe enthalten im allgemeinen Kohlehydrate, Fett und Pflanzenprotein-Hydrolysate. Siehe z. B. Tomei and Cope et al. in Apoptosis The Molecular Basis of Cell Death (1991) Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Mehrere von Pflanzenextrakten stammende Proteinase-Inhibitoren haben anticarcinogene Aktivität. Troll et al. (1987) Adv. Cancer Res. 49: 265–283. Von diesen Inhibitoren sind die Bowman-Birk-Inhibitoren die am besten beschriebenen. Birk (1985) Int. J. Pep. Pro. Res. 25: 113–131. Bowman-Birk-Inhibitoren werden als eine Familie von Disulfid-gebundenen Proteinen mit einem Molekulargewicht von etwa acht kD beschrieben, die die Zellumwandlung unterdrücken. Chou et al. (1974) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 1748–1752; Yavelow et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5395–5399; und Yavelow et al. (1983) Cancer Res. (Suppl.) 43: 2454s–2459s. Es wurden rohe Sojabohnen-Extrakte, die Bowman-Birk-Inhibitoren enthielten, beschrieben. Kennedy et al. US-Patent Nr. 4 793 996; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/20121; und Kennedy, A. R. (1994) Cancer Res. (Suppl) 54: 1999s–2005s. Bowman-Birk-Inhibitoren wurden auch immunologisch beschrieben. WO 90/03574; und US-Patent Nr. 4 959 310 und Nr. 5 053 327. Es wurde auch gefunden, dass Bowman-Birk-Inhibitoren Aktivität bei der Degranulierung von Makrophagen haben. Japanisches Patent Nr. 63051335.
Lysophosphatidsäure (Lysophosphatidic acid, LPA) wird in einer Vielfalt von Pflanzenprodukten gefunden, wie eine Vielzahl von Phospholipiden. Von LPA wurde gefunden, dass sie eine Vielzahl physiologischer Aktivitäten hat, wozu Mitogenese, als Wachstumsfaktor und als ein Mittel gegen Falten gehören. US-Patent Nr. 4 263 286; Nr. 4 746 652; Nr. 5 326 690 und Nr. 5 340 568. LPA wird detailliert besprochen von Moolenaar (1994) TICB 4: 213–219; und Eichholtz et al. (1990) Biochem. J. 291: 677–680.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst Verfahren zur Erhaltung von Zusammensetzungen, die die Apoptose hemmen, und die dadurch erhaltenen Zusammensetzungen. Die Zusammensetzungen werden als Apoptose-Hemmstoffe pflanzlichen Ursprungs (phytogenic apoptosis inhibitors, PAIs) bezeichnet. Die Erfindung umfasst physiologisch annehmbare Zusammensetzungen, die geeignet sind zur Verabreichung der PAIs in einer zur Regulierung der Apoptose ausreichenden Menge. Die Verwendung der PAIs zur Herstellung eines Arzneimittels wird ebenfalls beschrieben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erhaltung einer Zusammensetzung bereitgestellt, die einen Faktor mit anti-apoptotischer Aktivität aufweist, wobei das Verfahren aufweist:

a) Lipid-Entfernung aus einem Extrakt von einer Pflanze der Familie der Hülsenfrüchte, der Nachtschattengewächse oder der Zwiebelartigen (wobei der Extrakt ein Pulver umfasst) mit einem Lipid-Entfernungsmittel;
b) Trennen des Extrakts von dem Lipid-Entfernungsmittel;
c) Extrahieren des Produkts, aus dem Lipide entfernt wurden, mit einer wässrigen Lösung; und
d) Trennen der wässrigen Lösung von dem Produkt, aus dem Lipide entfernt wurden, um ein wässriges Retentat zu erhalten.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt die anti-apoptotische Wirkung von PAIs auf konfluierende C3H 10T1/2-Zellen dar.
2 stellt die konzentrationsabhängige anti-apoptotische Wirkung von PAIs auf C3H10T1/2-Zellen in der Phase exponentiellen Wachstums dar.
3 stellt einen Vergleich der anti-apoptotischen Aktivität von PAIs, die durch Ethanolextraktion gereinigt wurden, und PAIs, die durch Größenausschluß-Gelfiltrationschromatographie weiter gereinigt wurden, auf C3H 10T1/2-Zellen dar. Die Daten sind als eine Funktion der Trypsin-Hemmaktivität dargestellt.
4 stellt die anti-apoptotische Aktivität verschiedener Konzentrationen von Soja-PAIs auf ruhende, mit Cycloheximid behandelte C3H 10T1/2-Zellen dar.
5 stellt ein Chromatogramm von in PAI vorhandenen Monosacchariden dar.
6 veranschaulicht die Ergebnisse, die bei den Ratten-Herzmykozyten erhalten wurden.
7 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung von Sojamehl-Extrakten auf mit Methotrexat behandelte Ratten veranschaulicht.
8 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung von Sojamehl-Extrakten auf mit Methotrexat behandelte Ratten veranschaulicht.
9 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung von Soja-AcE auf mit Methotrexat behandelte Ratten veranschaulicht.
10 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung von Sojamehl-Extrakten auf mit Methotrexat behandelte Ratten veranschaulicht.
11 ist ein Balkendiagramm, das die Häufigkeit von Diarrhöe zeigenden Ratten nach Behandlung mit Methotrexat und verschiedener Ernährung veranschaulicht.
12 ist ein Balkendiagramm, das die Häufigkeit von Diarrhöe und Gewichtszunahme bei Ratten, die mit Methotrexat und verschiedener Ernährung behandelt wurden, zusammenfaßt.
13 ist eine photographische Aufnahme, die die DNA-Leiterauftrennung (DNA laddering) als ein Maß der Apoptose bei Lymphozyten, die von einem mit HIV-infizierten Individuum erhalten wurden, veranschaulicht.
14 ist ein Balkendiagramm, das die anti-apoptotische Aktivität von Lysophosphatidsäure, gesteigert durch Vorinkubation mit BSA oder Fraktion B, veranschaulicht. Die verwendeten Abkürzungen sind: LPA, L-α-Lysophosphatidisäure, Oleoyl (C18:1, [cis]-9); BSA, Rinderserumalbumin (bovine serum albumin), Fraktion V, mit Ethanol extrahiert; und "B", Fraktion B aus Sojamehl, vorwiegend Phosphatidyl-Inositol.
15 ist eine graphische Darstellung, die die anti-apoptotische Wirkung von Lysophosphatidsäure, Oleoyl (C18:1, [cis]-9) auf C3H 10T1/2-Zellen, denen Serum entzogen wurde, in vitro veranschaulicht.
Arten zur Ausführung der Erfindung
Es wurde nun gefunden, dass eine Vielzahl von Pflanzenteilen Bestandteile enthalten, die, wenn sie zumindest teilweise gereinigt und gereinigt wurden, die Fähigkeit zur Hemmung der Apoptose zeigen. Diese Zusammensetzungen sind von Bowman-Birk-Inhibitoren leicht trennbar und sind von anderen, bekannten, therapeutisch wirksamen Pflanzenprodukten verschieden. Die Zusammen setzung kann hinsichtlich der chemischen Komponenten, abhängig von der Quelle und den Wachstumsbedingungen der Pflanze, von denen sie stammen, leicht variieren. Die Zusammensetzungen werden hierin als "PAIs" bezeichnet, da die Erfindung verwandte Zusammensetzung umfaßt, die nach den hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, aber von verschiedenen Pflanzenquellen erhalten wurden. Die Zusammensetzung kann auch synthetisch nach Verfahren, die in der Lipid-Synthesetechnik bekannt sind, hergestellt werden. Mehrere relativ gereinigte Zusammensetzungen werden bereitgestellt und werden als L/G, AcE, MAcE und FAcE bezeichnet, um verschiedene Reinheitsgrade zu bezeichnen, wie unten diskutiert. Relativ reine Fraktionen werden ebenfalls bereitgestellt, die als "D" und "L" bezeichnet werden, wie unten diskutiert, von denen jede ein Gemisch von Phospholipiden ist. Zwei zusätzliche, relativ reine Zusammensetzungen werden bereitgestellt, die beide Lysophosphatidsäure (LPA); LPA und einen Protein-Träger; und LPA und eine ansonsten inaktive Fraktion "B" enthalten.
PAIs können aus eine Vielfalt verschiedener Pflanzen und Pflanzenorgane isoliert werden. Bevorzugt sind die Pflanzen aus der Familie der Hülsenfrüchte (Bohnen und Erbsen, etc.), aber PAIs können aus anderen Pflanzen wie denen aus der Familie der Nachtschattengewächse (wie Kartoffeln) und der Zwiebelartigen (wie Knoblauch) isoliert werden. PAIs können auch aus teilweise gereinigten Pflanzenextrakten isoliert werden, wozu Melassen, Lecithin, teilweise gereinigte Protein-Konzentrate und teilweise gereinigte Protein-Hydrolysate gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein. Es liegt innerhalb der Fähigkeiten eines Fachmanns, der die hierin beschriebenen Verfahren verwendet, zu bestimmen, ob PAIs aus einer bestimmten Pflanzenspezies, einem bestimmten Pflanzenextrakt oder Organ innerhalb einer Pflanze isoliert werden können.
Jeder Extrakt einer Pflanze oder Teil davon, der die Zusammensetzungen ergibt, ist zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet. Die Pflanzenorgane, die verwendet werden können, umfassen, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Stengel, Blätter, Wurzeln, Blüten, Wurzelstöcke, und bevorzugt Speicherorgane wie Samen, Knollen und Zwiebeln. Bevorzugt ist der verwendete Pflanzenteil ein Speicherorgan, wozu Kartoffeln und Knoblauch gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein. Aus Gründen der leichten Verarbeitung werden am meisten bevorzugt die getrockneten Samen von Hülsenfrüchten verwendet, wozu Sojabohnen und Erbsen gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein. Obwohl hierin die Begriffe "Samen" und "Saaten" verwendet werden, sollte klar sein, dass diese Begriffe jeden Pflanzenteil umfassen, der mindestens einen therapeutisch aktiven PAI oder einen PAI, der in Zellkultur aktiv ist, ergibt.
Die Erfindung umfaßt Verfahren, um PAIs im wesentlichen zu reinigen. Es können verschiedene Reinheitsgrade erreicht werden. Die Samen werden zerkleinert oder pulverisiert, bevorzugt zu einem Pulver oder Mehl. Der Begriff Pulver, wie er hierin verwendet wird, bezeichnet einen zerkleinerten getrockneten Pflanzenteil. Die Pulverteilchen sollten ausreichend klein genug sein, um die Oberflächen-Fläche den verschiedenen Flüssigkeiten, denen sie exponiert werden, im wesentlichen zu exponieren. Jedes Verfahren zur Zerkleinerung oder Pulverisierung ist zur Verwendung hierin geeignet, wobei das Zerkleinern von Samen typischerweise durch eine handelsübliche Mühle durchgeführt wird. PAIs sind ungewöhnlich hitzestabil, weshalb das Zerkleinern bei Temperaturen durchgeführt werden kann, die viele Proteine denaturieren. Im Handel erworbene Samenmehle können ebenfalls verwendet werden. Beispielsweise wurde gefunden, dass Sojabohnen-Mehl und verschiedene gelbe und grüne Erbsenmehle aktive PAIs enthalten.
Aus dem Samenpulver werden dann die Lipide nach irgendeinem in der Technik bekannten Verfahren entfernt. Es kann notwendig sein, die Lipide in einer inerten Umgebung aus dem Pulver zu entfernen, beispielsweise in sauerstofffreiem Stickstoff oder Argon, oder während des Verfahrens Antioxidantien mit einzubeziehen, beispielsweise BHT oder BHA, um die Aktivität zu verbessern oder Veränderungen einer oxidativen Art zu minimieren. Die Lipid-Entfernung wird im allgemeinen durch Extrahieren des Pulvers mit einer Lösung, die ein organisches Lösungsmittel enthält, durchgeführt. Zu geeigneten organischen Lösungsmitteln gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Aceton, Kohlenstofftetrachlorid, Ether, Hexan und Chloroform. Typischerweise beträgt die Konzentration an organischem Lösungsmittel in der Lösung von 50–100%.
Bevorzugt ist das organische Lösungsmittel Aceton. Die Konzentration der verwendeten organischen Lösung kann im Hinblick auf das bestimmte Lösungsmittel und den Samen-Typ variieren; die Bestimmung der wirksamen Konzentration liegt innerhalb der Fähigkeiten eines Fachmanns. Im Fall von Aceton ist die Konzentration etwa 70%.
Es können auch mehrere organische Extraktionen durchgeführt werden. Die Verhältnisse von organischer Lösung zu Pulver (Gewicht/Volumen) können ebenfalls variieren. Typischerweise werden die Verhältnisse, obwohl sie nicht auf den folgenden Bereich beschränkt sind, von etwa 2:1 bis etwa 1:20 (Gewicht des Pulvers/Volumen der organischen Lösung) verwendet. Im Fall von Aceton ist ein Verhältnis von 1:5 bevorzugt.
Wegen der Stabilität von PAIs werden die Temperatur und der atmosphärische Druck, unter denen die Lipid-Entfernung stattfindet, im wesentlichen nur durch die jeweiligen Gefrier- und Siedepunkte der verwendeten organischen Lösungen beschränkt. Typischerweise findet die Lipid-Entfernung wegen der Einfachheit des Gebrauchs bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck statt. Die Extraktionszeit ist gleichermaßen nicht zwingend und hängt im wesentlichen von dem Verhältnis von Pulver zu organischer Lösung ab. Im Falle einer 70% Aceton-Extraktion mit einem Verhältnis von 1:5 findet die Lipid-Entfernung typischerweise 30 Minuten lang unter dauerndem Rühren statt.
Die organische Lösung wird dann durch irgendein in der Technik bekanntes Verfahren von dem Pulver getrennt. Bevorzugt wird das Pulver von der organischen Phase durch Zentrifugieren und Entfernen der organischen Phase entfernt. Irgendeine geeignete Form von Abtrennung kann ebenfalls eingesetzt werden, einschließlich aber nicht begrenzt auf, Filtration oder Trennung durch Schwerkraft. Die PAIs verbleiben in dem extrahierten Pulver.
Das Pulver, aus dem die Lipide entfernt wurden, wird dann mit einer wässrigen Lösung extrahiert, um ein wässriges Retentat (retentate), das die PAIs enthält, zu ergeben. Die wässrige Lösung kann eine gepufferte Lösung wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (phosphate buffered saline, PBS) sein und kann auch bis zu etwa 80% wassermischbare organische Lösungsmittel enthalten. Zu geeigneten wassermischbaren organischen Lösungsmitteln gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Acetonitril, niedrigere Alkanole, insbesondere C₁-C₄-Alkanole wie Ethanol, Methanol und Propanol, niedrigere Alkandiole, insbesondere C₂-C₄-Alkandiole wie Ethylenglycol, und Polymere niedrigerer Alkandiole, insbesondere Polyethylenglycol. Bevorzugt wird Ethanol verwendet, am meisten bevorzugt in einer Konzentration von 50%.
Das Verhältnis von wässriger Lösung zu Pulver kann ebenfalls variiert werden. Das Extraktionsverhältnis kann von etwa 1:1 bis mindestens etwa 1:20 (Gewicht des Pulvers/Volumen der wässrigen Lösung betragen. Im allgemeinen wird ein Verhältnis von 1:10 von 50% Ethanol verwendet. Die Extraktionszeit variiert ebenfalls und hängt von dem Volumen der wässrigen Lösung und dem Prozentsatz der verwendeten wassermischbaren organischen Lösungsmittel ab. Im Falle eines Volumens von 1:10 von 50% Ethanol findet die Extraktion eine Stunde lang unter dauerndem Vermischen oder Rühren (oder Bewegung) statt.
Es wurde gefunden, dass der pH-Bereich der wässrigen Lösung im wesentlichen irrelevant ist, wobei Bereiche zwischen 2,5 und 11 getestet wurden; es ist daher wahrscheinlich, dass ein sogar breiterer Bereich wirkungsvoll sein kann. Typischerweise ist wegen der Einfachheit der Anwendung der pH-Bereich 7 bis 8.
Die Temperatur und die atmosphärischen Bedingungen der wässrigen Extraktion können in breitem Umfang variieren und hängen im wesentlichen von den Gefrier- und Siedepunkten der wässrigen Lösung ab. Typischerweise werden die Extraktionen bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck durchgeführt. Sobald die wässrige Extraktion stattgefunden hat, wird das wässrige Retentat zur weiteren Behandlung entfernt. Jedes in der Technik bekannte Entfernungsverfahren ist geeignet, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Zentrifugierung und Filtration.
Das wässrige Retentat wird dann gereinigt, um den PAI zu ergeben. Jegliches wassermischbare organische Lösungsmittel wird durch irgendein in der Tech nik bekanntes Verfahren entfernt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Ultrafiltration, Trocknung und Dialyse. Eine Ultrafiltration kann unter Verwendung eines 10 kD Molekulargewicht-Ausschlusses (cut oft) durchgeführt werden, um Proteine mit niedrigem Molekulargewicht wie Monomere der Bowman-Birk-Inhibitoren und organische Lösungsmittel zu entfernen. Gleichermaßen kann der Molekulargewicht-Ausschluß (cut oft) des Dialyseschlauchs 10 kD sein.
Restliches organisches Lösungsmittel kann durch Diafiltration nach Ultrafiltration oder durch mehrfaches Auswechseln des Dialysats, beispielsweise durch reines Wasser, entfernt werden. Das wässrige Retentat kann in Lösung bis zu mehrere Tage gelagert werden, und als gefriergetrockneter Feststoff unbegrenzt gelagert werden. Bevorzugt wird das wässrige Retentat gefriergetrocknet. Der gefriergetrocknete Feststoff ist AcE, wenn das Ausgangsmaterial Sojamehl ist. Sowohl das wässrige Retentat als auch das gefriergetrocknete Retentat können weiteren Verarbeitungsschritten unterzogen werden; wobei das gefriergetrocknete Retentat vor der weiteren Verarbeitung in einer geeigneten wässrigen Lösung erneut suspendiert wird.
Erhaltenes Material kann mittels Passage durch irgendeine Molekulargewicht-Größenausschluß-Chromatographie einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Sepharose S100HR (Pharmacia Biotechnology Piscataway N. J. USA) oder Bio-Gel P-100 (BioRad Laboratories Inc, Hercules Ca. USA) in einem wässrigen Puffer weiter getrennt werden. Zu geeigneten Puffern gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, 0,1–0,3 M Ammonium-bicarbonat oder 0,1–0,3 M NaCl in 10–50 mM Phosphat bei neutralem pH.
Die aus der Größenausschluß-Chromatographie erhaltenen PAIs sind in dem Hohlraumvolumen zu finden und haben ein scheinbares Molekulargewicht von größer als 80 kD. Das in dieser Fraktion gefundene Material kann durch Natrium-dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter reduzierenden Bedingungen getrennt werden und enthält mehrere Proteine. Färbung mit Coomassie Blau zeigt die Anwesenheit von 6–8 Proteinen eines Molekulargewicht-Bereichs von 18 bis 68 kD an. Eine Analyse durch Dünn schicht-Chromatographie zeigt die Anwesenheit mehrerer Verbindungen vom Lipid-Typ.
Die aus der Chromatographie eluierten Fraktionen mit der größten Extinktion bei 280 nm stimmen mit den Fraktionen überein, die die größte biologische Aktivität enthalten. Die biologische Aktivität trennt sich von Material niedrigen Molekulargewichts und eluiert in das Hohlraumvolumen an einer Position, die mit der eines Molekulargewichts von größer als 80 kD oder einem Aggregat in Einklang steht. Dieses Material kann konzentriert, dialysiert, gefriergetrocknet und in gefriergetrockneter Form unbegrenzt gelagert werden. Der gefriergetrocknete Feststoff ist FAcE, wenn das Ausgangsmaterial Sojamel ist.
Solubilisierte PAIs können mit Aceton bei einer Konzentration von 70% oder mehr ausgefällt werden. Die Behandlung mit verschiedenen Mitteln, einschließlich starken Säuren, zerstört jedoch ihre Aktivität. Beispielsweise zerstören Trifluoressigsäure, Salzsäure, Trichloressigsäure und Phenol ihre Aktivität. So niedrige pH-Werte wie 2,5 zerstören die Aktivität jedoch nicht, da 1%ige Essigsäure die Aktivität von PAIs nicht beeinträchtigt.
Die PAIs können weiter isoliert werden durch Extrahieren einer gefriergetrockneten Fraktion hohen Molekulargewichts, die aus entfettetem und mit Ethanol extrahiertem Samenmehl erhalten wurde, in ein einphasiges Gemisch aus Chloroform:Methanol:Wasser (4:8:3). Dies wird am günstigsten durchgeführt durch Auflösen des getrockneten Materials in der Wasser-Fraktion, dann Zugeben von Methanol, gefolgt von Chloroform, Mischen und Entfernen der Ausfällung. Diese Extraktion ergibt eine Glycolipid/Lipid/Phospholipid-Fraktion, die die PAI-Aktivität behält.
Beispielsweise wurden 0,1 gEQ (die aus 0,1 g Ausgangsmaterial stammende Menge) der Fraktion hohen Molekulargewichts (FAcE) in 7,5 ml Wasser gelöst, und unter dauerndem Mischen wurden 20 ml Methanol zugegeben, gefolgt von 10 ml Chloroform. Das unlösliche Material wurde durch Zentrifugieren (8000 × g × 10 Min) entfernt und der PAI aus der Lösung durch Rotationsverdampfung zur Entfernung der organischen Lösungsmittel und durch Gefriertrocknen zur Ent fernung des Wassers zurückgewonnen. Die erhaltene Fraktion wurde als die L/G-Fraktion bezeichnet. Die Kohlehydrat-Zusammensetzung der L/G-Fraktion besteht aus Arabinose und Galactose in einem Verhältnis von 3:2, mit Fucose, Rhamnose, Glucosamin, Glucose und Mannose, die alle als Nebenbestandteile vorliegen.
Die L/G-Fraktion kann auf der Basis ihrer Löslichkeit in einem Gemisch von Chloroform:Methanol weiter aufgetrennt und durch Silica-Chromatographie entweder in einer Chromatographie-Säule oder durch eine Dünnschicht-Chromatographie (thin-layer chromatography, TLC) im Plattenformat getrennt werden.
Das Material wird dann einem vorbereitendem Chromatographie-Schritt auf Kieselsäure, d. h. einem Mallinckrodt SiO₂·xH₂O-Pulver von 100 mesh, unterzogen. Das aktive Material wird in Chloroform eingetragen und mit Chloroform oder einem Chloroform:Methanol-Gemisch von 90:10 oder 80:20 gewaschen und mit Methanol oder CHCl₃:MeOH (10:90 oder 20:80) eluiert.
Das aktive Material kann durch Chromatographie auf einer Diol-Säule wie Diol-SepPak-Patronen (Waters, Millipore) weiter gereinigt werden. Beispielsweise können mit Silica gereinigte L/G-, im Handel erhältliche Rohlecithin- oder andere Soja-Phospholipid-Präparate, die in Chloroform löslich sind, als ein Ausgangsmaterial verwendet werden. Beispielsweise werden etwa 100–1000 mg der Probe in einer Konzentration von etwa 100 mg/ml in Chloroform gelöst und auf eine vorher äquilibrierte 10 g Diol-Säule geladen. Die Säule wird mit 2–5 Volumina Chloroform gewaschen, mit 2–5 Volumina Isopropanol eluiert, mit 2–5 Volumina Ethanol eluiert, und schließlich mit 2–5 Volumina Methanol eluiert. Die Hauptaktivität wird in der Methanol-Fraktion eluiert, wenn auch eine gewisse Aktivität in der Ethanol-Fraktion zu finden ist. Die Aktivität kann durch Trocknen aus dem Ethanol isoliert werden. Zu geeigneten Trocknungsverfahren gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Rotationsverdampfung oder unter Vakuum. Manche Proben entwickeln bei Aufbewahrung bei –20°C über Nacht einen Niederschlag; dieser Niederschlag kann jedoch ohne Verlust von Aktivität durch Zentrifugieren entfernt werden.
Das aktive Material kann weiter getrennt werden durch HPLC-Chromatographie auf einer Silica-Säule wie einer Dynamax 60A Si-Säule von Rainin Instrument Co., Inc. Der zum Eluieren des aktiven Materials verwendete Gradient ist von 95:3:2:0,05 Acetonitril:Methanol:Wasser:Ammoniumhydroxid bis 65:21:14:0,35 Acetonitril:Methanol:Wasser:Ammoniumhydroxid. Das Elutionsprofil wird bei 205 nm überwacht. Wie in den unten vorgelegten Beispielen beschrieben, erzeugt diese Reinigungsstufe fünf getrennte Produkte, die als Fraktionen 1–5 bezeichnet werden. Diese Produkte wurden isoliert und getrennt hinsichtlich ihrer Zusammensetzung und anti-apoptotischen Aktivität analysiert. Mehrere Fraktionen wurden wieder vereinigt und hinsichtlich ihrer anti-apoptotischen Aktivität untersucht. Es wurde gefunden, dass der Durchfluß vorwiegend Lysophosphatidsäure (LPA) enthielt, die, wie unten beschrieben, eine Klasse von Verbindungen ist. Bei der Untersuchung hinsichtlich Aktivität wurde gefunden, dass eine im Handel erhältliche LPA, L-α-Lysophosphatidsäure, Oleoyl (C18:1, [cis]-9), keine anti-apoptotische Aktivität hatte. In dieser Fraktion gefundene LPA und im Handel erhältliche LPA in Anwesenheit eines Proteins oder von Proteinen, an die sie spezifisch bindet, besitzen antiapoptotische Aktivität. Daher sind eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Zusammensetzungen, die LPA und eine wirksame Menge eines spezifischen Bindungsproteins aufweisen. Bevorzugt ist das Bindungsprotein Serumalbumin. Man beachte, dass die Anwesenheit von Bowman-Birk-Inhibitoren LPA keine anti-apoptotische Aktivität verleiht. Es wurde auch gefunden, dass LPA in Anwesenheit einer als "B" bezeichneten Fraktion ebenfalls antiapoptotische Aktivität besaß. Fraktion "B", in erster Linie Phosphatidylinositol, besitzt keine anti-apoptotische Aktivität. Daher ist eine weitere Ausführungsform der Erfindung eine Zusammensetzung, die LPA und eine wirksame Menge an Fraktion B oder eines aktiven Bestandteils davon aufweist. Man beachte, dass Fraktion B kein Protein enthält, daher liegt die Fähigkeit zur Herbeiführung von anti-apoptotischer Aktivität bei LPA einzig und allein an der Anwesenheit von Phospholipiden. Ohne durch irgendeine Theorie gebunden zu sein, kann die Wirkung von Fraktion B an der Bildung einer Micelle oder eines Liposoms, die (das) LPA schützt und/oder erlaubt, dass LPA den Zellen korrekt präsentiert wird, liegen.
Fraktion "D" wurde ebenfalls erhalten, und es wurde gefunden, dass sie antiapoptotische Aktivität besitzt. Diese Fraktion entspricht Peak 3 in Beispiel 8. Daher sind eine weitere Ausführungsform der Erfindung Zusammensetzungen, die Fraktion D aufweisen.
Fraktion "L" wurde ebenfalls erhalten und es wurde gefunden, dass sie antiapoptotische Aktivität besitzt. Diese Fraktion entspricht Peak 5 in Beispiel 8. Daher sind eine weitere Ausführungsform der Erfindung Zusammensetzungen, die Fraktion L aufweisen. Die Fraktionen D und L können hinsichtlich ihrer anti-apoptotischen Aktivität additiv sein. Daher sind eine weitere Ausführungsform der Erfindung Zusammensetzungen, die die Fraktionen D und L aufweisen.
Daher sind die obigen Ausführungsformen ebenfalls mit dem Begriff PAI umfaßt, und sie sind zur Verwendung bei den hierin beschriebenen Indikationen und Zusammensetzungen geeignet. LPA hat die Struktur:
worin R unsubstituiertes oder substituiertes, gesättigtes oder ungesättigtes, geradkettiges oder verzweigtkettiges Alkyl mit 11 bis etwa 23 Kohlenstoffatomen ist.
LPA, wie hierin verwendet, umfaßt auch eine Vielfalt von Molekülen, einschließlich aber nicht beschränkt auf, eine 2-Deoxy- oder 2-Deoxy-2-halo-lysophosphatidsäure-Verbindung mit der Struktur:
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, worin R ein unsubstituiertes oder substituiertes, gesättigtes oder ungesättigtes, geradkettiges oder verzweigtkettiges Alkyl mit 11 bis etwa 23 Kohlenstoffatomen ist; jedes X unabhängig O oder S ist; Y O oder CH₂ ist; und Z H, Halo, NH₂, SH, OH, oder OPO₃H₂ ist.
Ebenso umfaßt ist, dass RC(O)O-Lauryl, Myristyl, Palmityl, Stearyl, Palmitoleyl, Oleyl oder Linoleyl; genauer Oleyl, Palmitoleyl, Myristyl, Palmityl oder Lauryl; insbesondere Myristyl oder Lauryl; ist.
Pharmazeutisch annehmbare Salze von LPAs umfassen, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Salze von Alkalimetallen wie Natrium und Kalium; Salze von Erdalkalimetallen wie Calcium und Magnesium; ungiftige Schwermetall-Salze; Ammonium-Salze; Salze von Trialkylammonium wie Trimethylammonium und Triethylammonium; und Salze von Alkoxyammonium wie Triethanolammonium, Tri(2-hydroxyethyl)ammonium und Trimethamin(tris(hydroxymethyl)aminomethan). Besonders bevorzugt sind Calciumsalze.
Bevorzugte Verbindungen, die als LPA in Verbindung mit einem spezifischen Bindungsprotein oder Fraktion B brauchbar sind, umfassen, aber ohne darauf beschränkt zu sein, L und D 1-Myristoyl-2-fluor-2-deoxy-glycerol-3-phosphat, L und D 1-Lauroyl-2-fluor-2-deoxy-glycerol-3-phosphat, L und D 1-Oleoyl-2-fluor-2-deoxy-glycerol-3-phosphat, L und D 1-Palmitoleoyl-2-fluor-2-deoxy-glycerol-3-phosphat, L-D Myristoyl-2-deoxy-glycerol-3-phosphat, L und D 1-Lauroyl-2-chlor-2-deoxy-glycerol-3-phosphat, L und D 1-Myristoyl-2-chlor-2-deoxy-glycerol-3-phosphat und Calciumsalze davon.
Andere Faktoren, die die Aktivität dieser Zusammensetzungen beeinflussen können, sind die Kettenlänge von LPA, die Anwesenheit von Cholesterol, die Anwesenheit von Micellen, Liposomen, Detergenzien und Emulgiermitteln, und die Kettenposition in LPA, d. h., der erste oder zweite Kohlenstoff auf dem Glycerol. Im Falle von Micellen, Liposomen und Detergenzien bewirken Micel len und Liposome eine Steigerung der Aktivität, während Detergenzien oder detergenzienartige Moleküle eine Verringerung der Aktivität bewirken.
Die aus der HPLC-Silica-Chromatographie erhaltenen aktiven Fraktionen können weiter getrennt werden auf der Basis ihrer Hydrophobie, beispielsweise durch HPLC auf einer C18-Säule (Dynamax 60A, Rainin Instrument Co. Inc.), in einer Vielfalt von Methanol enthaltenden Puffern, einschließlich aber nicht beschränkt auf, 100% Methanol, enthaltend 800 mg/Ammoniumacetat; 99% Methanol, enthaltend 1 mM Natriumphosphat, pH 7,4; und 90% Methanol, 10% Natriumphosphat, pH 7,4. Das Material wird isokratisch in 90:10-Methanol:5 mM NaPO₄, pH 7,4, eluiert.
Zum Reinigen und Analysieren von Lipiden sind in der Technik eine Vielzahl von Verfahren bekannt. Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung kann jedes in der Technik bekannte Verfahren verwendet werden, vorausgesetzt, dass es zur Reinigung einer aktiven Fraktion führt. Zur Übersicht, siehe Bligh and Dyer (1959) Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911–917; Patton et al. (1982) J. Lipid Res. 23: 190–196; Jungalwala (1985) Recent Developments in Techniques for Phospholipid Analysis, in Phospholipds in Nervous Tissues (ed. Eichberg) John Wiley and Sons, Seiten 1–44; Hamilton et al. (1992) in der Reihe A Practical Approach (Richwood et al. eds.) IRL Press at Oxford University Press; und Kates (1986) Techniques of Lipidology: Isolation, Analysis and Identification in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (Burdon et al. eds.) Elsevier.
Typischerweise wird Sojamehl, oder Fraktionen davon, durch Suspendieren in Wasser (20 Volumen% im Fall von Mehl) und Zugeben von zwei Volumina Methanol und einem Volumen Chloroform extrahiert. Dies ist eine einzige Phase, und sie wird bei Raumtemperatur 30 Minuten bis 1 Stunde lang gerührt/gemischt. Zu diesem Gemisch wird ein Volumen Chloroform zugegeben, gemischt, und ein Volumen Wasser zugegeben. Dies bildet zwei Phasen, und die Phasen werden durch Zentrifugieren oder einen Scheidetrichter getrennt, nachdem zuerst jegliche Feststoffe entfernt wurden (wenn Mehl als das Aus gangsmaterial verwendet wurde). Die Aktivität ist in der organischen (Boden-)Phase.
Die in vitro Apoptose hemmende Aktivität der PAIs scheint im wesentlichen auf aktiv proliferierende Zellen beschränkt zu sein; ruhende Zellen scheinen relativ unbeeinflußt zu bleiben.
Die aktiven Bestandteile der PAIs sind hochgradig stabil in Anwesenheit von Proteasen. Beispielsweise wurden die PAIs mit Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Elastase, Subtilisin und Proteinase K unter für die Proteolyse geeigneten Bedingungen behandelt, aber die Proteasen haben keine Wirkung auf ihre Aktivität.
Die Erfindung umfaßt außerdem therapeutische Zusammensetzungen, die im wesentlichen gereinigte PAIs aufweisen. Der für die Zusammensetzung erforderliche Reinheitsgrad kann empirisch bestimmt werden und liegt innerhalb der Fähigkeiten eines Fachmanns. Die Zusammensetzungen sind zur Verwendung bei einer Vielzahl von Störungen, wie unten beschrieben, und sowohl für Anwendungen beim Menschen als auch tiermedizinische Anwendungen geeignet.
Die Aktivität der PAIs sowie aktiver Fraktionen davon, die während des Reinigungsverfahrens erhalten wurden, kann mit irgendeiner Anti-Apoptose-Untersuchung, in der Technik bekannt ist, gemessen werden. Dazu gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, der Serum-Entzug der C3H 10T1/2-Zellen-Untersuchung, die genau in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 9425621 mit gemeinsamer Inhaberschaft beschrieben ist, die das bevorzugte Untersuchungsverfahren ist, sowie die in den Beispielen 3 und 4 beschriebenen Verfahren. Außerdem kann die in vivo Apoptose-Hemmung durch jedes in der Technik bekannte Verfahren gemessen werden.
Im allgemeinen sind PAIs pharmazeutisch annehmbar wegen ihrer geringen Toxizität im therapeutischen Dosisbereich, ihrer Stabilität und Fähigkeit, in eine breite Vielfalt von Vehikeln für zahlreiche Verabreichungswege eingemischt zu werden. Die PAIs können alleine oder in Verbindung mit anderen pharmazeu tisch wirksamen Mitteln, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Antibiotika, Wundheilmittel, Antioxidanzien und andere therapeutische Mittel, verabreicht werden. Zur geeigneten Antibiotika gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Ampicillin, Tetracyclin, Chloramphenicol und Penicillin. Zu geeigneten Wundheilmitteln gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, transformierende Wachstumsfaktoren (TFG-βs), epidermale Wachstumsfaktoren (EGFs), Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs) und Thrombozyten-Wachstumsfaktoren (PDGFs). Zu geeigneten Antioxidanzien gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, die Vitamine C und E.
Die Zusammensetzungen enthalten mindestens eine therapeutisch wirksame Menge mindestens eines PAI und können mindestens einen physiologisch annehmbaren Träger enthalten. Ein physiologisch annehmbarer Träger ist einer, der bei Verabreichung keine ungünstige physikalische Reaktion verursacht, und einer, in dem PAIs ausreichend löslich sind, um eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung zuzuführen. Die therapeutisch wirksame Menge von PAIs hängt teilweise von der Art der Einführung und der zu behandelnden Indikation und von anderen Kriterien ab, die für einen Durchschnittsfachmann offensichtlich sind. Typischerweise ist eine therapeutisch wirksame Menge eine, die ausreichend ist zur Regulierung der Apoptose bei dem behandelten Zustand, wie durch Besserung der Symptome deutlich wird. Typischerweise beträgt eine therapeutisch wirksame Menge etwa 0,5–100 Gew.-% mindestens eines PAI. Der Verabreichungsweg (die Verabreichungswege), der (die) bei einer bestimmten Indikation brauchbar ist (sind), wird (werden) unten diskutiert und ist (sind) einem Fachmann wohl bekannt.
Zu Verabreichungswegen gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, topische, transdermale, parenterale, gastrointestinale Verabreichung, Verabreichung durch die Bronchien und durch die Alveolen. Die topische Verabreichung wird durchgeführt mittels einer Creme, eines Gels, einer Spülung, etc., die therapeutisch wirksame Mengen an PAIs enthalten, die topisch verabreicht werden. Die transdermale Verabreichung wird durchgeführt durch Anwendung einer Creme, einer Spülung, eines Gels, etc., die in der Lage sind, die PAIs die Haut durchdringen zu lassen und in den Blutstrom eintreten zu lassen. Zu pa renteralen Verabreichungswegen gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, die direkte Injektion wie die intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale oder subkutane Injektion. Zu gastrointestinalen Verabreichungswegen gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Einnehmen und rektale Verabreichung. Zu Verabreichungswegen durch die Bronchien und durch die Alveolen gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Inhalieren, entweder durch den Mund oder intranasal, und direkte Injektion in einen Luftweg wie mittels einer Tracheotomie.
Die PAIs können zwar alleine topisch verabreicht werden, aber es kann wünschenswert sein, sie im Gemisch mit einem pharmazeutisch oder kosmetisch annehmbaren topischen Träger zu verabreichen.
"Pharmazeutisch annehmbarer topischer Träger", wie hierin verwendet, ist irgendein im wesentlichen nicht toxischer Träger, der üblicherweise zur topischen Verabreichung von Pharmazeutika verwendbar ist, in dem die PAIs bei direkter Aufbringung auf Haut- oder Schleimheit-Oberflächen stabil und biologisch verfügbar bleiben. Beispielsweise können die PAIs in einer konventionellen Weise in einer Flüssigkeit gelöst, in einem Medium dispergiert oder emulgiert werden, um ein flüssiges Präparat zu bilden, oder mit einem halbfesten (Gel) oder festen Träger gemischt werden, um eine Paste, ein Pulver, eine Salbe, eine Creme, eine Lotion oder dergleichen zu bilden.
Zu geeigneten pharmazeutisch annehmbaren topischen Trägern gehören Wasser, Petroleumgel (Vaseline), Petrolat, Mineralöl, Pflanzenöl, tierisches Öl, organische und anorganische Wachse wie mikrokristallines Paraffin und Ozokeritwachs, natürliche Polymere wie Xanthane, Gelatine, Cellulose, Collagen, Stärke oder Gummiarabikum, synthetische Polymere wie sie unten diskutiert werden, Alkohole, Polyole und dergleichen. Der Träger kann eine wassermischbare Trägerzusammensetzung sein, die im wesentlichen in Wasser mischbar ist. Eine derartige wassermischbare, pharmazeutisch annehmbare, topische Trägerzusammensetzung kann jene umfassen, die mit einem oder mehreren geeigneten Bestandteilen, die oben dargelegt sind, hergestellt sind, kann aber auch Träger mit Langzeitfreisetzung oder verzögerter Freisetzung umfassen, einschließlich Wasser enthaltenden, wasserdispergierbaren oder wasserlöslichen Zusammensetzungen, wie Liposome, Mikroschwämme, Mikrokugeln oder Mikrokapseln, Salben auf wässeriger Basis, Wasser-in-Öl- oder Öl-in-Wasser-Emulsionen, Gele oder dergleichen.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung weist der pharmazeutisch annehmbare, topische Träger einen Träger mit Langzeit- oder verzögerter Freisetzung auf. Der Träger ist irgendein Material, das zur Langzeit- oder verzögerten Freisetzung der PAIs in der Lage ist, um eine wirkungsvollere Verabreichung zu schaffen, die zu einer oder mehreren der folgenden Wirkungen weniger häufige und/oder verringerte Dosierung der PAIs, Einfachheit der Handhabung und verlängerte oder verzögerte Auswirkungen auf dermatologische Zustände führt. Der Träger ist in der Lage, die PAIs freizusetzen, wenn er auf dem behandelten Bereich einer öligen, fettigen, wachsigen oder feuchten Umgebung ausgesetzt wird, oder durch Diffusion oder durch Freisetzung in Abhängigkeit vom Grad der Beladung des Trägers mit den PAIs, um Freisetzungen der PAIs zu erhalten. Nicht begrenzende Beispiele für derartige Träger umfassen Liposome, Mikroschwämme, Mikrokugeln oder Mikrokapseln aus natürlichen und synthetischen Polymeren und dergleichen. Beispiele für geeignete Träger zur Langzeit- oder verzögerten Freisetzung in einer feuchten Umgebung umfassen Gelatine, Gummi Arabicum, Xanthan-Polymere; durch den Grad der Beladung umfassen Lignin-Polymere und dergleichen; durch ölige, fettige oder wachsige Umgebung umfassen thermoplastisches oder flexibles wärmehärtbares Harz oder Elastomer, wozu thermoplastische Harze wie Polyvinylhalogenide, Polyvinylester, Polyvinyliden-Halogenide und halogenierte Polyolefine, Elastomere wie Brasiliensis, Polydiene und halogenierte natürliche und synthetische Gummi, und flexible wärmehärtbare Harze wie Polyurethane, Epoxyharze und dergleichen gehören. Bevorzugt ist der Träger mit Langzeit- oder verzögerter Freisetzung ein Liposom, ein Mikroschwamm, eine Mikrokugel oder ein Gel.
Die Zusammensetzungen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Behandlung dermatologischer Zustände verwendet werden, werden direkt auf die zu behandelnden Bereiche aufgetragen. Es ist zwar nicht erforderlich, aber wünschenswert, dass die topische Zusammensetzung die PAIs etwa 24 bis 48 Stunden an der gewünschten Stelle hält.
Wenn gewünscht, kann ein zusätzlicher Inhaltsstoff oder mehrere zusätzliche Inhaltsstoffe, die üblicherweise in pharmazeutischen oder kosmetischen topischen Zusammensetzungen zu finden sind, in den Träger aufgenommen werden: wie ein Feuchthaltemittel, Anfeuchter, Duft-Modifikationsmittel, Puffer, Pigment, Konservierungsmittel, Vitamine wie A, C und E, Emulgiermittel, Dispergiermittel, Benetzungsmittel, Duft-Modifikationsmittel, Geliermittel, Stabilisatoren, Treibmittel, antimikrobielle Mittel, Sonnenschutz, Enzyme und dergleichen. Fachleute auf dem Gebiet der pharmazeutischen topischen Formulierungen können leicht die geeigneten spezifischen zusätzlichen Inhaltsstoffe und ihre Mengen auswählen. Zu geeigneten nicht beschränkenden Beispielen zusätzlicher Inhaltsstoffe gehören Superoxiddismutase, Stearylalkohol, Isopropyl-myristat, Sorbitan-monooleat, Polyoxyethylen-stearat, Propylenglycol, Wasser, Alkali- oder Erdalkali-laurylsulfat, Methylparaben, Octyl-dimethyl-p-aminobenzoesäure (Padimate O), Harnsäure, Reticulin, Mucopolysaccharide, Hyaluronsäuren, Aloe vera, Lecithin, Polyoxyethylen-sorbitan-monooleat, Vitamin A oder C, Tocopherol (Vitamin E), alpha-Hydroxy- oder alpha-Ketosäuren wie Pyruvinsäure, Milchsäure oder Glycolsäure, oder irgendwelche der topsichen Inhaltsstoffe, die in den US-Patenten 4 340 586, 4 695 590, 4 959 353 oder 5 130 298 und 5 140 043 offenbart sind.
Weil die zu behandelnden dermatologischen Zustände sichtbar sein können, kann der topische Träger auch ein kosmetisch annehmbarer, topischer Träger sein. Mit "kosmetisch annehmbarer, topischer Träger", wie hierin verwendet, ist irgendein im wesentlichen nicht-toxischer Träger, der üblicherweise zur topischen Verabreichung von Kosmetika verwendbar ist, gemeint, in dem die PAIs bei direkter Aufbringung auf die Hautoberfläche stabil und biologisch verfügbar bleiben. Geeignete kosmetisch annehmbare Träger sind Fachleuten bekannt und umfassen, aber ohne darauf beschränkt zu sein, kosmetisch annehmbare Flüssigkeiten, Cremes, Öle, Lotionen, Salben, Gele oder Feststoffe, wie übliche kosmetische Nachtcremes, Grundierungscremes, Bräunungslotionen, Sonnenschutzmittel, Handlotionen, Make up und Make up-Grundstoffe, Abdeckungen und dergleichen. Daher sind kosmetisch annehmbare topische Träger und pharmazeutisch annehmbare Träger in einem wesentlichen Ausmaß von ähnlicher, wenn nicht oft von identischer Art, so dass das meiste der früheren Diskussion zu pharmazeutisch annehmbaren Trägern auch auf kosmetisch annehmbare Träger zutrifft. Die Zusammensetzungen können andere Inhaltsstoffe, die bei Kosmetika üblich sind, enthalten,wozu Duftstoffe, Estrogen, die Vitamine A, C oder E, alpha-Hydroxy oder alpha-Ketosäuren wie Pyruvinsäure, Milchsäure oder Glycolsäure, Lanolin, Vaseline, Aloe Vera, Methyl- oder Propyl-paraben, Pigmente und dergleichen gehören.
Die wirksame Menge der PAIs in den Zusammensetzungen, die zur Behandlung dermatologischer Zustände oder Erkrankungen verwendet werden, kann von solchen Faktoren abhängen wie dem Zustand der Haut, dem Alter der Haut, dem jeweiligen PAI oder dem Reinheitsgrad der verwendeten PAIs, dem Typ der Formulierung und der verwendeten Träger-Inhaltsstoffe, der Häufigkeit der Verabreichung, der Gesundheit des behandelten Individuums insgesamt, und dergleichen. Die genaue Menge, die für einen bestimmten Patienten verwendet wird, kann von Fachleuten auf dem pharmazeutischen Gebiet unter Berücksichtigung dieser Faktoren und der vorliegenden Offenbarung bestimmt werden. Bevorzugt wird die Zusammensetzung in mindestens zwei Dosen und nicht mehr als etwa sechs Dosen pro Tag, oder weniger, wenn eine Form mit Langzeit- oder verzögerter Freisetzung verwendet wird, verabreicht.
Die Zusammensetzungen zur topischen Verabreichung enthalten üblicherweise von etwa 0,0001 Gew.-% bis etwa 90 Gew.-% PAIs im Vergleich zum Gesamtgewicht der Zusammensetzung, bevorzugt von etwa 0,5 Gew.-% bis etwa 20 Gew.-% PAIs zu Zusammensetzung, und insbesondere von etwa 2 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-% PAIs zu Zusammensetzung.
Die topische Zusammensetzung wird durch Aufbringen einer Schicht oder Lage auf den Hautbereich oder Schleimhautbereich, der behandelt werden soll, verabreicht. Als eine praktische Angelegenheit der Zweckmäßigkeit wird das aufgebrachte Material in den Bereich eingerieben. Die Auftragungen brauchen nicht in die Haut eingerieben zu werden, und die Lage oder Schicht kann über Nacht auf der Haut belassen werden.
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die zur transdermalen Verabreichung geeignet sind, wozu pharmazeutisch annehmbare Lotionen, Suspensionen, Öle, Cremes, Salben, Spülungen, Gele und liposomale Träger, die in einem geeigneten Vehikulum suspendiert sind, wozu eine therapeutisch wirksame Menge an PAIs zugemischt wurde, gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein. Solche Zusammensetzungen werden direkt auf die Haut aufgebracht oder in einen schützenden Träger wie eine transdermale Vorrichtung (ein sogenanntes "Pflaster") eingebracht. Beispiele für geeignete Cremes, Salben, etc., sind beispielsweise im ärztlichen Nachschlagewerk für den Schreibtisch zu finden. Beispiele für geeignete transdermale Vorrichtungen sind beispielsweise in dem US-Patent Nr. 4 818 540 (Chien et al.) beschrieben.
Die vorliegende Erfindung umfaßt PAI-Zusammensetzungen, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, wozu pharmazeutisch annehmbare, sterile, isotonische Lösungen gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein. Solche Lösungen umfassen, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Kochsalzlösung und phosphatgepufferte Kochsalzlösung zur intravenösen, intramuskulären, intraperitonealen oder subkutanen Injektion von PAIs.
Die vorliegende Erfindung umfaßt PAI-Zusammensetzungen, die zur gastrointestinalen Verabreichung geeignet sind, wozu pharmazeutisch annehmbare Pulver, Tabletten oder Flüssigkeiten zum Einnehmen und Suppositorien zur rektalen Verabreichung gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein.
Die vorliegende Erfindung umfaßt PAI-Zusammensetzungen, die zur Verabreichung durch die Bronchien und durch die Alveolen geeignet sind, wozu verschiedene Arten pharmazeutisch annehmbarer Aerosole zum Inhalieren gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein. Ein Beispiel für ein Arzneimittel, das in Form eines Aerosols verabreicht wird, ist Pentamidin, das AIDS-Patienten durch Inhalieren verabreicht wird, um von Pneumocystis carnii verursachte Lungenentzündung zu verhindern.
Die vorliegende Erfindung umfaßt außerdem Vorrichtungen, die zur Verabreichung von PAIs durch die Bronchien und durch die Alveolen geeignet sind. Derartige Vorrichtungen umfassen, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Zerstäuber und Verdampfer. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Vorrichtungen zur elektrischen oder direkten Injektion. Eine elektrische Injektion, oder Iontophorese, ist das Verfahren der Verwendung eines kleinen elektrischen Stroms, um geladene Elemente, Verbindungen und Arzneimittel zum Zweck der Zuführung der therapeutischen Verbindung zu den lokalen Geweben oder zum gesamten Körper durch die Haut zu treiben, ohne die Haut zu unterbrechen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt außerdem Lösungen, die zur Lagerung von Organen vor dem Transplantieren geeignet sind. Geeignete Lösungen sind in Chien et al. (1993) "Hibernation Induction Trigger for Organ Preservation" in Medical Intelligente Unit, R. G. Landes Co. Austin, TX, beschrieben. PAIs können beispielsweise verwendet werden, um viel unreinere Soja-Präparate, die gegenwärtig in Gebrauch sind (z. B. Soyacal), zu ersetzen.
Die oben angegebenen Zusammensetzungen sind dazu gedacht, die zur Verabreichung der PAIs der Erfindung geeigneten Zusammensetzungen zu beschreiben, aber nicht zu beschränken. Die Verfahren zur Herstellung der verschiedenen Zusammensetzungen liegen innerhalb der Fähigkeiten eines Fachmanns und werden hier nicht im Detail beschrieben.
Die Verfahren zur Herstellung geeigneter Vorrichtungen zur Injektion, topischen Aufbringung, Zerstäuber und Verdampfer, sind in der Technik bekannt und werden nicht im Detail beschrieben.
Die Erfindung stellt außerdem Verfahren zur Behandlung von Apoptose bereit, aufweisend die Verabreichung einer Menge der PAIs, die zur Hemmung von Apoptose wirksam ist. Mit dem Verfahren können verschiedene mit Apoptose im Zusammenhang stehende Indikationen behandelt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, dermatologische Auswirkungen des Alterns, Störungen und Erkrankungen, Immunsuppression, gastrointestonale Störungen, car diovaskuläre Störungen, Abstoßung von Gewebe-Transplantaten und Alzheimer-Krankheit.
Es wurde nun gefunden, dass PAIs topisch auf die Haut aufgebracht werden können, um eine Vielfalt dermatologischer Zustände zu behandeln. Zu diesen Zuständen gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, faltig oder schlaft Werden aufgrund von Alter und/oder Beschädigung durch Licht, Psoriasis. Die vorliegende Erfindung umfaßt daher Verfahren zur Behandlung dermatologischer Zustände. Außerdem kann Kahlheit durch Apoptose der Zellen der Haarfollikel verursacht werden. Daher wären die PAIs zur Verwendung bei der topischen Behandlung der Haut zur Verhinderung von fortgesetztem Haarverlust geeignet.
Wie oben diskutiert, werden diese Zustände bevorzugt durch topische Aufbringung einer Zusammensetzung, die eine wirksame Menge an PAIs enthält, behandelt. Eine wirksame PAI-Menge ist eine, die die Symptome der dermatologischen Zustände verbessert oder verringert. Bevorzugt führt die Behandlung zur Beseitigung des dermatologischen Zustands oder zur Wiederherstellung der normalen Hautfunktion; jedoch wird jede Verbesserung oder Verringerung von Symptomen von der Erfindung umfaßt.
Mit Immunsuppression in Beziehung stehende Störungen werden von einer Vielfalt von Reizen verursacht, wozu Viren einschließlich HIV, aber nicht auf HIV beschränkt, chemotherapeutische Mittel und Bestrahlung gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein. Diese Reize lösen bei einer Vielfalt von Störungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, jene der Verdauungstrakt-Gewebe und damit zusammenhängende gastrointestinale Störungen, Apoptose aus.
Zu gastrointestinalen Störungen gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, eine Schädigung der Darmauskleidung, schwere chronische Geschwüre, Colitis, von Strahlung verursachte Schädigung, durch Chemotherapie verursachte Schädigung, und die durch Parasiten bewirkte Störung des gastrointestinalen Trakts, und Diarrhöe aufgrund irgendeiner anderen Ursache. Von verschiedenen viralen und bakteriellen Infektionen ist bekannt, dass sie zu gastrointesti nalen Störungen führen. Die PAIs sind auch geeignet zur Verwendung bei der Behandlung der mit diesen Infektionen verbundenen Nebenwirkungen. PAIs sind insbesondere geeignet zur Verwendung zur Besserung der mit einer Chemotherapie verbundenen gastrointestinalen Störungen. Wie in den unten vorgelegten Beispielen gezeigt ist, litten mit Methotrexat und verschiedenen PAIs behandelte Ratten weniger unter Fütterungsproblemen und hatten keine Diarrhöe, die man bei den Kontrolltieren fand. Daher sind PAIs nicht nur zur Verwendung bei der Verhinderung der mit einer Chemotherapie verbundenen Diarrhöe, sondern auch der Übelkeit, geeignet.
Die PAIs sind besonders geeignet zur Behandlung verschiedener gastrointestinaler Zustände bei Tieren, insbesondere Rindern. Der Verlust vieler Kälber geht auf das Konto derartiger Zustände, insbesondere Diarrhöe. Die Behandlung gastrointestinaler Zustände findet bevorzugt durch gastrointestinale Verabreichung statt. Im Falle von Rindern kann eine wirksame Menge der PAIs zweckmäßigerweise dem Futter zugemischt werden. Bei Menschen kann die Verabreichung durch irgendein auf dem Gebiet der gastrointestinalen Verabreichung bekanntes Verfahren erfolgen.
Zusätzlich können die PAIs immunschwachen Patienten, insbesondere HIV-positiven Patienten, verabreicht werden, um den mit dem Zustand verbundenen, apoptotischen Tod von T-Zellen, der zur Verschlimmerung von Immunschwächen führt, wie man bei Patienten mit voll entwickeltem Aids sieht, zu verhindern oder zumindest zu vermindern. Bevorzugt findet die Verabreichung von PAIs an solche Patienten parenteral statt, aber sie kann transdermal oder gastroinestinal stattfinden.
Die PAIs können auch verabreicht werden, um Apoptose zu behandeln, die mit einer Schädigung durch erneute Durchblutung, die mit einer Vielzahl von Zuständen einhergeht, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Coronararterienverschluß, Hirninfarkt, Rückenmark/Schädel-Trauma und damit einhergehender schwerer Lähmung; Schädigung durch erneute Durchblutung aufgrund anderer Einwirkungen wie einer Erfrierung; und irgendeiner Indikation, von der man früher glaubte, dass sie mit Superoxiddismutase (SOD) behandelbar sei, verbunden ist. Zur Übersicht über die Wirkung von Sauerstoff-Radikalen bei Herzkrankheiten, siehe Singal (1988) "Oxygen Radicals in the Pathophysiology of Heart Disease" Kluwer Academic Publishers, MA, USA.
Herzmuskel- und Hirninfarkte werden im allgemeinen von einer plötzlichen Insuffizienz der arteriellen oder venösen Blutzufuhr aufgrund von Embolie, Blutgerinnseln, oder Druck, was einen mit bloßem Auge sichtbaren Nekrosebereich erzeugt, verursacht; es ist wahrscheinlich, dass Herz, Gehirn, Milz, Niere, Darm, Lunge und Hoden in Mitleidenschaft gezogen werden. Apoptose tritt bei dem Gewebe, das den Infarkt umgibt, bei erneuter Durchblutung des Bereichs auf; daher sind PAIs wirksam, wenn sie beim Einsetzen des Infarkts, während der erneuten Durchblutung oder kurz danach verabreicht werden.
Daher stellt die Erfindung Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von mit erneuter Durchblutung verbundener Apoptose durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge mindestens eines PAI an einen Patienten, der einer derartigen Therapie bedarf, bereit.
Die Erfindung umfaßt ferner Zusammensetzungen zur Verwendung zur Verringerung der Apoptose und der Schädigung durch erneute Durchblutung, die mit Herzmuskel- und Hirn-Infarkten verbunden sind, für Patienten mit einem hohen Herzanfall- und Herzschlag-Risiko durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge mindestens eines PAI an einen Patienten, der einer derartigen Therapie bedarf.
Bevorzugt werden Zusammensetzungen zur Behandlung einer Schädigung durch erneute Durchblutung durch parenterale Verabreichung der Zusammensetzungen der Erfindung bereitgestellt. Es kann jedoch jedes andere geeignete Verfahren verwendet werden, beispielsweise direkte Injektion in das Herz im Falle eines Herzmuskelinfarkts. Vorrichtungen für eine solche Injektion sind in der Technik bekannt, beispielsweise die Aboject-Herzspritze.
Die Erfindung stellt außerdem Verfahren bereit zur Begrenzung und Verhinderung von Apoptose in Zellen während der Kultur oder der Aufbewahrung von Säugetier-Organen, -Geweben und -Zellen, durch den Zusatz einer wirksamen Menge an PAIs zur irgendwelchen Medien oder Lösungen, die auf dem Gebiet der Kultur oder Aufbewahrung von Säugetier-Organen, -Geweben und -Zellen verwendet werden.
Die Erfindung umfaßt außerdem Medien und Lösungen, die auf dem Gebiet der Kultur und Aufbewahrung von Säugetier-Organen, -Geweben und -Zellen bekannt sind, die eine Menge mindestens eines PAI aufweisen, die wirksam ist, um Apoptose der kultivierten Zellen zu begrenzen oder zu verhindern.
Diese Aspekte der Erfindung umfassen Säugetier-Zellkulturmedien, die eine wirksame Menge mindestens eines PAI aufweisen, und die Verwendung derartiger Medien zur Begrenzung oder Verhinderung von Apoptose bei der Säugetier-Zellkultur. Es wurde gefunden, dass PAIs Apoptose unter Umständen, unter denen Zellen milden Traumata unterzogen werden, die normalerweise eine Apoptose stimulieren würden, begrenzen oder verhindern. Zu solchen Traumata können Bestrahlung geringer Stärke, Auftauen gefrorener Zellstämme, schnelle Veränderungen der Temperatur, des pH, der Osmolarität oder der Ionenkonzentration von Kulturmedien, längeres Aussetzen einer nicht optimalen Temperatur, pH, Osmolarität oder Ionenkonzentration der Kulturmedien, Zellgift-Exposition, Abtrennung von Zellen von einem intakten Gewebe bei der Herstellung von primären Zellkulturen, Serum-Entzug (oder Wachstum in serumfreien Medien) gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein.
Daher umfaßt die Erfindung Zusammensetzungen, die Gewebekulturmedium und eine wirksame Menge mindestens eines PAI aufweisen. Zu serumfreien Medien, denen PAIs als Ergänzungsmittel für anti-apoptotische Medien zugesetzt werden können, gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, AIM V^® Media, Neuman und Tytell's Serumless Media, Trowell's T8 Media, Waymouth's MB 752/1 und 705/1 Media und William's Media E. Zusätzlich zu serumfreien Medien gehören zu geeigneten Säugetier-Zellkulturmedien, denen PAIs als Ergänzungsmittel für anti-apoptotische Medien zugesetzt werden können, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Basal Eagle's Media, Fischer's Media, McCoy's Media, Media 199, RPMI Media 1630 und 1640, Medien auf der Basis von F-10 und F-12-Nährstoffgemischen, Leibovitz's L-15 Media, Glasgow Minimum Essential Media, und Dulbecco's Modified Eagle Media. Säugetier-Zellkulturmedien, denen PAIs zugesetzt werden können, weisen außerdem irgendwelche auf dem Gebiet bekannte Medien-Ergänzungsmittel auf, wozu Zucker, Vitamine, Hormone, Metalloproteine, Antibiotika, Antimykotika, Wachstumsfaktoren, Lipoproteine und Seren gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein.
Die Erfindung umfaßt außerdem Lösungen zur Aufbewahrung von Säugetierorganen vor der Transplantation, die eine wirksame Menge mindestens eines PAI aufweisen, und die Verwendung solcher Lösungen zur Begrenzung oder Verhinderung von Apoptose in derartigen Säugetierorganen während ihrer chirurgischen Entfernung und Handhabung während der Transplantation. In allen Fällen können die Konzentrationen an PAIs, die zur Begrenzung oder Verhinderung von Apoptose erforderlich sind, von einem Fachmann durch Verfahren wie diejenigen, die in den Beispielen 2, 3 und 4 zu finden sind, sowie durch andere in der Technik bekannte Verfahren empirisch bestimmt werden.
Es wurde auch gefunden, dass die obigen PAI-Fraktionen in bestimmter Konzentration in Lösung Micellen bilden können. Die Erfindung umfaßt daher Zusammensetzungen, die Micellen aufweisen.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die Erfindung zu veranschaulichen, aber nicht zu beschränken.
Beispiel 1
PAI-Isolierung und -Reinigung
Näherungsweise 100 g im Handel erhältliches Sojabohnen-Mehl (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO. USA und Central Soya, Archer Daniel Midlands) wurden in 500 ml 70%igem Aceton suspendiert und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gerührt. Das Sojabohnen-Mehl, aus dem die Lipide entfernt waren, wurde durch 10 Minuten langes Zentrifugieren bei 1500 g zurück gewonnen. Dieses Material wurde in 1 l 50%igem Ethanol erneut suspendiert und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Der Überstand, das wässrige Retentat, wurde durch 10 Minuten langes Zentrifugieren bei 1500 g wieder gewonnen.
Das wässrige Retentat wurde durch Ultrafiltration konzentriert, und das Ethanol wurde durch Diafiltration über eine 10 kD-Membran (Amicon Beverly MA. USA) entfernt. Dieses Material wurde dann direkt auf Sepharose S100HR (Pharmacia Biotechnology, Inc. Piscataway, N. J., USA), in 10 mM Ammoniumbicarbonat äquilibriert, geladen. Der Peak des Materials mit A280 Absorption eluierte in das Hohlraumvolumen und wurde zusammengefaßt und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Material hohen Molekulargewichts wurde in ein einphasiges Gemisch von Chloroform:Methanol:Wasser (3:8:4) extrahiert, indem das einphasige Gemisch zu dem getrockneten Material zugegeben wurde und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gemischt wurde. Das Gemisch wurde dann zentrifugiert, um das unlösliche Material zu entfernen. Das unlösliche Material ergab eine Lipid/Glycolipid-Fraktion, die die PAI-Aktivität beibehielt. Diese Fraktion wurde als die L/G-Fraktion bezeichnet. Die Kohlehydrat-Zusammensetzung der L/G-Fraktion besteht aus Arabinose und Galactose in einem Verhältnis von 3:2, mit Fucose, Rhamnose, Glucosamin, Glucose und Mannose, die alle als Nebenbestandteile vorliegen. Die Kohlehydrat-Zusammensetzung wurde bestimmt wie in Beispiel 5 beschrieben.
Die L/G-Fraktion kann auf der Basis ihrer Löslichkeit in einem Gemisch von Chloroform:Methanol (80:20) und Chromatographie auf Silica (Kieselsäure 100 mesh, Mallinckrodt Chemical, Inc. KY) weiter aufgetrennt werden. Die Silica-Chromatographie wird in Methanol getrennt, um eine aktive Fraktion (SiMe) zu ergeben.
Für eine detaillierte Zusammenfassung der physikalischen und chemischen Eigenschaften des Sojamehl-Extrakts in verschiedenen Reinigungsstatien siehe Tabelle 1, worin ND für "nicht nachgewiesen" (none detected) steht.
In Tabelle 1 wurden die Aktivitäten und die physikalischen Eigenschaften der Produkte aus vier Reinigungsstadien bestimmt. Diese vier Stadien waren: wässriges Retentat; 70%iger Aceton-Extrakt; 50%iger Ethanol-Extrakt des 70%igen Aceton-Pellets; und die Fraktion hohen Molekulargewichts, gereinigt durch Größenausschluß-Gelfiltrationschromatogaphie aus der 50%igen Ethanol-Fraktion. Die Protein-Ausbeute wird ausgedrückt als pro Gramm Trokkengewicht an Ausgangsmaterial gewonnenes Protein, wie gemessen durch das Bradford-Testverfahren (BioRad Laboratories). Die anti-apoptotische Aktivität wird ausgedrückt als die berechnete Konzentration an Material (μg/ml Medium), die erforderlich ist, um 50% der bei der serumfreien Behandlung freigesetzten Zellen zu retten, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Trypsin-Hemmung wird in relativen Einheiten pro μg Protein in der Probe ausgedrückt. Eine relative Einheit (U) wurde definiert als die Menge an hemmender Aktivität, die die Anfangsrate der Hydrolyse eines Substrats von 100 μM durch zwei μg Trypsin in einem Gesamtvolumen von 1 ml um 50% verringert. Die Extinktionswerte bei 260 und 280 nm werden pro Gramm Ausgangsmaterial in einer Zelle von 1 ml ausgedrückt. Dies ergibt ein Anzeichen für die vorhandenen relativen Protein- und Nucleinsäure-Konzentrationen. Das Verhältnis von 260/280 wurde verwendet, um die Menge an vorhandener Nucleinsäure zu schätzen, wie beschrieben in Dawson et al., Data for Biochemical Research, Third Edition, 1990 published Osford Science Publications.
Beispiel 2
Apoptose-Untersuchung mit C3H 10T1/2-Zellen
Zur Bestimmung der apoptotischen Aktivität der PAIs wurde das folgende Experiment durchgeführt. Die Zelluntersuchung ist in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 9425621 beschrieben. In Kürze, die Zellen, C3H 10T1/2 Klon 8, wurden bei Konfluenz (1), während der Phase exponentiellen Wachstums, wenn die Zellzyklus-Position statistisch verteilt ist ohne Zellen mit Wachstumsstillstand in G₀ (2 und 3), und in Ruhe (4) untersucht. Die Phase exponentiellen Wachstums wurde sichergestellt durch Ansetzen einer Kultur mit 2000 Zellen pro 1 ml (5 ml für eine 60 mm Kulturplatte) fünf Tage vor Beginn des Experiments. Bei T = 0 wurden die Kulturen in ein serumfreies Medium, als ein Apoptose-Reiz, überführt, und Kulturansatz-Extrakte wurden zugesetzt. Die Kontrollen enthielten 10^–7 M 12-0-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA), um die Reaktionsfähigkeit der Zellkultur sicherzustellen. Die durch Extraktion mit Ethanol und durch Gelfiltration hergestellten PAI-Proben wurden in Trockengewicht-Äquivalenten von 0,1 g zu serumfreiem Medium zugegeben und vor der Zugabe zu den Kulturen steril filtriert. Die Untersuchungen wurden dreifach oder vierfach durchgeführt. Die Analysen der Zellreaktionen wurden zwischen 22 und 28 Stunden nach dem Serumentzug und/oder der Behandlung mit von Sojamehl stammenden PAIs ausgeführt. Zwei Untersuchungen wurden an jeder Zellkulturplatte durchgeführt, die aus Unterscheidungs-Zellzählungen bestanden.

1. Alle nicht anhaftenden oder lose anhaftenden Zellen wurden von der Kulturschale entfernt und durch geeignete Techniken gezählt, typischerweise eine Zählung durch ein elektrisches Teilchenzählgerät. Diese sind die aptototischen Zellen, die freigesetzten Zellen ohne Serum (SDR, serum deprived released cells), freigesetzt durch die Wirkung der Kultivierung in serumfreiem Medium. Näherungsweise 95% dieser freigesetzten Zellen sind apoptotisch, wie sowohl durch Feinstrukturanalyse als auch durch DNA-Fragmentationsanalyse gezeigt wird.
2. Die verbleibenden anhaftenden Zeilen (ADH, adherent cells) werden einer gepufferten, typischerweise pH 7,3, ausgewogenen Salzlösung wie der Hanks Balanced Salt Solution ohne Calciumsalze und Magnesiumsalze, die 0,05% Trypsin und 0,53 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält, ausgesetzt. Jede Kultur wird entweder bei Raumtemperatur oder bei 37°C auf einer Schwingplattform inkubiert, um eine gleichmäßige Verteilung des Trypsin-Reagens über die Kulturoberfläche sicherzustellen. Nach einer Normzeit, typischerweise 10 Minuten, werden die freigesetzten Zellen von jeder Kulturschale entfernt und mit denselben Mitteln wie oben beschrieben, typischerweise einer elektronischen Teilchenzählung, gemessen. Diese ADH-Zellzählung besteht sowohl aus Trypsin-resistenten als auch Trypsin-empfindlichen Zellen, wie in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 9425621 beschrieben.

Die aus den Apoptose-Zelluntersuchungen erhaltenen Ergebnisse werden in den 1, 2, 3 und 4 vorgelegt. in 1 wird der Prozentsatz an Zellen, die einer Apoptose unterlagen (SDR), und an anhaftenden Zellen (ADH) getrennt vorgelegt. Die Daten in 1 zeigen, dass die PAIs, verglichen mit dem Basal Medium Eagle (BME), der Kontrolle mit Serumentzug, hinsichtlich Verringerung der Apoptose in konfluenten Zellen wirksam sind.
In 2 werden die Ergebnisse als ein Prozentsatz anhaftender Zellen in den mit PAIs behandelten Proben, normalisiert hinsichtlich der Anzahl anhaftender Zellen in der serumfreien Kontrollprobe ohne PAIs, vorgelegt. Mit anderen Worten, der Prozentsatz an Zellen, der durch Behandlung mit PAIs vor der Apoptose gerettet wurde. Die in 2 vorgelegten Daten zeigen, dass Soja-PAIs eine konzentrationsabhängige anti-apoptotische Wirkung auf C3H 10T1/2-Zellen in der Phase exponentiellen Wachstums haben.
In 3 wird die anti-apoptotische Aktivität für PAIs nach Extraktion mit 50% Ethanol (rechte Seite) und PAIs, die durch Größenausschluß-Gelfiltrationschromatographie weiter gereinigt wurden (linke Seite), vorgelegt. Die Ergebnisse in 3 sind ausgedrückt als der Prozentsatz an Zellen, die durch Behandlung mit PAIs vor der Apoptose gerettet wurden (in ADH-Zellen umge wandelte SDR-Zellen), verglichen mit den serumfreien Kontrollproben ohne PAIs, wobei alle als eine Funktion Trypsin hemmender Einheiten ausgedrückt werden. Die in 3 vorgelegten Daten zeigen, dass, wenn die Konzentration an Bowman-Birk-Inhibitoren (wie gemessen durch Trypsin-Hemmung) durch Größenausschluß-Gelfiltrationschromatographie verringert wird, die antiapoptotische Aktivität der PAIs beibehalten wird. Daher liegt die anti-apoptotische Aktivität der PAI-Präparate nicht an der Anwesenheit von Bowman-Birk-Inhibitoren.
In 4 wird die anti-apoptotische Aktivität verschiedener Konzentrationen von Soja-PAIs hinsichtlich ruhender C3H 10T1/2-Zellen, die mit Cycloheximid behandelt wurden, vorgelegt. Ruhende Zellen sind jene, die auf Serum-Entzug nicht länger mit dem Beginn von Apoptose reagieren. Vielmehr wird die Apoptose bei diesen Zellen durch die Zugabe von 10 μg/ml Cycloheximid zu C3H 10T1/2 ausgelöst. Typischerweise werden diese Zellen nach etwa einer Woche in Kultur konfluierend, und nach etwa zwei Wochen in Kultur ruhend. Die Ergebnisse in 4 sind ausgedrückt als lebensfähige Zellen, die nach einer gegebenen Behandlung verbleiben (ADH). Die Daten in 4 zeigen, dass Soja-PAIs eine kleine, aber signifikante anti-apoptotische Wirkung auf ruhende C3H 10T1/2-Zellen haben.
Beispiel 3
Apoptose-Untersuchung mit Herzmuskelzellen neugeborener Ratten
Muskelzellen wurden aus Herzen von einen Tag alten Ratten präpariert wie beschrieben in Circulation Research 56: 884–894, 1985. In Kürze, die einzelnen Zellen wurden durch kurze, alternierende Zyklen von Raumtemperatur-Trypsinisierung und mechanisches Zerteilen erhalten. Die Zellen wurden gesammelt, gewaschen und erneut in MEM, 5%igem fetalem Rinderserum und 50 U/ml Penicillin-G suspendiert. Um eine Kontaminierung durch Nicht-Muskelzellen zu verringern, wurde eine Vor-Plattenkultur der Zellen 30 Minuten lang angelegt. Die nicht anhaftenden Herzmuskelzellen wurden aus der Kulturschale ent fernt, auf einem Hämozytometer gezählt und erneut in Medium suspendiert in einer Konzentration von 600.000 lebensfähigen Zellen/ml. Die Zellsuspension wurde auf verschiedene Kulturschalen verteilt und 16 bis 24 Stunden lang in einem Inkubator mit 37°C, 5% CO₂ inkubiert. Die Ausbeute war 3–5 × 10⁶ Zellen/Herz, und die lebensfähigen Zellen waren >90% bei Trypanblau-Färbung.
Am ersten Kulturtag wurden die Zellen mehrere Male mit Minimal Eagle Medium (MEM) gespült, um Zellreste und nicht anhaftende Zellen zu entfernen. Sie wurden mit Serum-ergänzten Medien wie oben aufgefüllt. Am nächsten Tag wurden die Muskelzellen unter unterschiedlichen Bedingungen in RPMI 1640 provoziert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 vorgelegt, worin PAI 1 × für das aus 0,1 g Sojamehl-Ausgangsmaterial erhaltene Material steht.
Tabelle 2
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen an, dass die PAI-Fraktion in der Lage ist, das Wohlbefinden von Zellen in Anwesenheit einer Apoptose auslösenden Einwirkung zu erhalten.
Beispiel 4
Bestimmung der Kohlehydrat-Zusammensetzung der PAI
Um zu bestimmen, ob PAIs Kohlehydrat enthalten, wurde die L/G-Fraktion von PAIs verschiedenen Bedingungen ausgesetzt, und die sich ergebenden Kohlehydrat-Reste wurden untersucht. Die PAIs wurden von Sigma erhalten, Sojamehl Charge Nr. 103H0820, die wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt wurde, um PAIs zu erhalten. Die freien Monosaccharide in unbehandelten PAIs wurden durch HPLC auf Dionex Carbopac^TM PAI in 16 mM NaOH nach dem in der Dionex-Schrift Nr. 034441 beschriebenen Verfahren bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 vorgelegt. Die Probe wurde dann vier Stunden lang bei 100°C mit 2 N TFA hydrolysiert, wie von Hardy and Townsend (1994) Meth. Enzymol.230: 208–225 beschrieben. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 vorgelegt. Die Probe wurde außerdem sechs Stunden lang bei 100°C mit 6 N NCl hydrolysiert, wie durch das von Hardy and Townsend (1994) beschriebene Verfahren festgelegt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 5 dargestellt.
Tabelle 3 In PAI nachgewiesene Monosaccharide
Tabelle 4 Bei Hydrolyse freigesetzte Monosaccharide
Beispiel 5
Verwendung von PAIs zur Verhinderung von durch Chemotherapie herbeigeführte gastrointestinale Störungen
Zur Bestimmung der in vivo-Aktivität der PAIs wurden die folgenden Tierversuche durchgeführt. In den Beispielen 6 und 7 wurden die Tierversuche im wesentlichen durchgeführt wie in Funk and Baker (1991) J. Nutr. 121: 1684–1692; und Funk and Baker (1991) J. Nutr. 121: 1673–1683 beschrieben. In Kürze, es wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten verwendet, um zu bestimmen, ob isolierte AcE und L/G, die wie in Beispiel 1 beschrieben aus Sojamehl erhalten wurden, die Methotrexat (MTX)-Toxizität lindern konnten. Die Ratten wurden in Edelstahl-Einzelkäfigen mit Drahtboden gehalten und wurden sieben Tage lang vor der Injektion von MTX an ihre jeweilige Ernährung gewöhnt und blieben sieben Tage lang nach der Injektion bei derselben Ernährung. Die gefütterten Nahrungen waren halbgereinigtes Rattenfutter mit den folgenden Zusätzen:

1. Casein
2. Casein und Sojakonzentrat (10 g und 10 g)
3. Casein und Sojamehl (10 g und 10 g)
4. Casein und AcE
5. Casein und L/G

AcE und L/G wurden in Konzentrationen verwendet, die gleich den aus dem Soja-Ausgangsmaterial extrahierten waren.
Während des Zeitraums vor der Injektion wurde über das Gewicht und die Nahrungsaufnahme der Ratten Buch geführt. Den Ratten wurde IP 20 mg/kg MTX injiziert. Während des Zeitraums von sieben Tagen nach der Injektion wurde das Rattengewicht, die Nahrungsaufnahme und das Auftreten von Diarrhöe aufgezeichnet. Die Daten zu Gewicht und Nahrungsaufnahme der Ratten wurden unter Verwendung des nicht parametrischen Kruskal-Wallis-Tests und durch post-hoc-Vergleich analysiert. Der P-Wert wurde an Vielfach-Vergleiche angepaßt, indem 0,05 durch die Anzahl an gemachten Vergleichen (10) dividiert wurde. Ein nicht-parametrischer Test wurde verwendet, weil die Abweichungen zwischen den Gruppen nicht homogen waren und daher die Voraussetzungen zur Analyse von Abweichungen nicht erfüllt waren. Die Nahrungsaufnahme nach der MTX-Injektion wurde für jedes Tier als ein Prozentsatz der durchschnittlichen Aufnahme 3 Tage vor der Injektion ausgedrückt. Daher diente jedes Tier als seine eigene Kontrolle. Nur die Tage 3, 4, 5 und 6 nach der MTX-Injektion wurden statistisch analysiert. Der Grund dafür ist, dass die Tage 3 und 4 diejenigen sind, wenn die Toxizität am stärksten ist, und die Tage 5 und 6 diejenigen sind, wenn die Genesung beginnt. Diarrhöe-Daten wurden unter Verwendung sowohl des Fischer's Exakttests als auch loglinearer Analyse analysiert.
Die Ergebnisse zeigten, dass Sojakonzentrat- und Sojamehl-Ausgangsmaterial und sowohl AcE als auch L/G in der Lage waren, die Nahrungsaufnahme nach MTX-Injektion zu verbessern (Tabelle 5 und 7). Am Tag 3 war die Nahrungsaufnahme bei Ratten, die Sojamehl und Sojakonzentrat konsumierten, statistisch größer als bei jenen, die Casein alleine oder Casein mit L/G konsumierten. Ratten, die Casein mit AcE konsumierten, lagen am Tag 3 hinsichtlich Nahrungsaufnahme dazwischen und waren statistisch allen Gruppen mit Ausnahme derjenigen, die Sojamehl konsumierten, ähnlich. Tag 4 zeigte ein identisches Muster mit der Ausnahme, dass, da die Nahrungsaufnahme für L/G konsumierende Ratten verglichen mit Tag 3 leicht anstieg, diese Ratten nicht länger statistisch von Ratten verschieden waren, die Sojakonzentrat konsumierten, obwohl die zahlenmäßige Nahrungsaufnahme wesentlich niedriger blieb. An den Tagen 5 und 6 war die Erholung offensichtlich, und die Nahrungsaufnahme war unter allen Gruppen statistisch ähnlich. Die Gewichtsveränderung (Tabelle 6) spiegelte die bei der Nahrungsaufnahme beobachteten Muster wieder, was erwartet wurde. Ratten, die Sojakonzentrat und Sojamehl konsumierten, nahmen während der ersten vier Tage nach der MTX-Injektion eine wesentliche Menge an Gewicht zu. Ratten, die AcE, L/G oder Casein alleine konsumierten, nahmen weniger Gewicht zu, und jene, die Casein konsumierten, nahmen statistisch weniger zu als jene, denen Sojakonzentrat oder Sojamehr gefüttert wurde. Die Unterschiede im Auftreten von Diarrhöe waren nicht statistisch unterschiedlich, aber das Diarrhöe-Muster war im Einklang mit der Nahrungsaufnahme und der Gewichtsveränderung (Tabelle 6). Ratten, die Sojakonzentrat oder Sojamehl konsumierten, hatten keine Diarrhöe, während bei Ratten, die AcE konsumierten, ein leichtes Ausmaß an Diarrhöe vorlag (10%), und bei denjenigen, die L/G oder Casein alleine konsumierten, ein mäßiges Ausmaß an Diarrhöe vorlag (30–40%).
Schließlich zeigte dieses Experiment, dass Sojakonzentrat und Sojamehl von den getesteten Komponenten den besten Schutz boten. Casein mit AcE schien dazwischen zu liegen und Casein alleine oder L/G überlegen zu sein, wie bewiesen durch die bessere Beibehaltung der Nahrungsaufnahme und des Gewichts und das geringere Auftreten von Diarrhöe. Dieses Ergebnis zeigt, dass aus Soja isolierte Verbindungen Schutz gegen MTX-Toxizität bieten können. In diesem Experiment schien die L/G-Fraktion in dieser Konzentration keinen Schutz zu bieten. Beispiel 7 jedoch zeigt, dass erhöhte Konzentrationen an L/G wirksam sind.
Beispiel 6
Verwendung von PAIs zur Verhinderung von durch Chemotherapie herbeigeführten gastrointestinalen Störungen
Männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden verwendet, um festzustellen, ob abgestufte Mengen isolierter Soja-Fraktionen (AcE, L/G und MAcE) die Methotrexat(MTX)-Toxizität lindern konnten. Die Tiere wurden in Edelstahl-Einzelkäfigen mit Drahtboden gehalten. Die Ratten wurden vor der Injektion von MTX 7 Tage lang an ihre jeweilige Ernährung gewöhnt und blieben nach der Injektion 7 Tage lang bei derselben Ernährung. Die verfütterte Nahrung war halbgereinigt und Casein mit Zusätzen wie folgt:

1. keine Zusätze
2. AcE (100 mg/20 g Casein; 1×)
3. AcE (300 mg/20 g Casein; 3×)
4. AcE (1000 mg/20 g Casein; 10×)
5. L/G (10 mg/20 g Casein; 1×)
6. L/G (30 mg/20 g Casein; 3×)
7 L/G (100 mg/20 g Casein; 10×)
8. MAcE (100 mg/20 g Casein; 1×)
9. MAcE (300 mg/20 g Casein; 3×)
10. MAcE (1000 mg/20 g Casein; 10×)
11. MAcE (3000 mg/20 g Casein; 30×)

Man beachte, dass MAcE Soja-Melasse ist, wie sie für Sojamehl extrahiert wird, um AcE zu erhalten. Jede Ernährungs-Gruppe enthielt 8 Ratten mit Ausnahme der Gruppe, die Casein ohne zugesetzte Verbindung erhielt, die 10 Ratten enthielt. Während des Zeitraums vor der Injektion wurde über das Gewicht und die Nahrungsaufnahme der Ratten Buch geführt. Den Ratten wurde ip 20 mg/kg MTX injiziert. Während des 7-tägigen Zeitraums nach der Injektion wurden das Rattengewicht, die Nahrungsaufnahme und das Auftreten von Diarrhöe aufgezeichnet. Die Nahrungsaufnahme für verschiedene Gruppen ist in den 8 bis 10 dargestellt. Das Auftreten von Diarrhöe ist in 11 dar gestellt. Die Nahrungsaufnahme der Ratten für die gesamte Gruppe ist in 12 dargestellt. Die Daten zu Gewicht und Nahrungsaufnahme der Ratten wurden mittels ANOVA analysiert, wobei eine faktorielle Anordnung von Behandlungen verwendet wurde, um die Hauptwirkungen von Verbindung und Dosis und die mögliche Wechselwirkung zwischen Verbindung und Dosis zu testen. Es wurde eine faktorielle Analyse durchgeführt, wobei nur die Behandlungsgruppen mit der 1-fachen, 3-fachen und 10-fachen Dosis jeder der Verbindungen verwendet wurden. Zusätzlich wurden t-Tests verwendet, um die Unterschiede zwischen dem 10-fachen Gehalt jeder Verbindung und der nur Casein enthaltenden Ernährung zu bestimmen. Die Nahrungsaufnahme nach der MTX-Injektion wurde für jedes Tier als ein Prozentsatz der durchschnittlichen Aufnahme 3 Tage vor der Injektion ausgedrückt. Daher diente jedes Tier als seine eigene Kontrolle. Nur die Tage 3, 4, 5 und 6 nach der MTX-Injektion wurden statistisch analysiert. Der Grund dafür ist, dass es die Tage 3 und 4 sind, wenn die Toxizität am stärksten ist, und die Tage 5 und 6 sind, wenn die Genesung beginnt. Diarrhöe-Daten wurden unter Verwendung des Fisher's Exakt Test analysiert. Für jede der Verbindungen wurden nur die 10-fachen Gehalte statistisch gegenüber Casein hinsichtlich Unterschieden beim Auftreten von Diarrhöe analysiert. 12. Der Grund dafür ist, dass Fisher's Test ein konservativer Test ist. Wenn mehrere Vergleiche gemacht werden, muß die Fehlerrate angepaßt werden. Um die Chancen einer statistischen Signifikanz zu erhöhen wurden nur jene Vergleiche durchgeführt, bei denen die beste Reaktion für jede der Verbindungen festgestellt wurde, wie durch die Daten der Nahrungsaufnahme und der Gewichtsveränderung deutlich gemacht.
Die Ergebnisse der faktoriellen Analyse der Nahrungsaufnahme und der Gewichtsveränderung werden in den Tabellen 7 und 8 vorgelegt. Die Ergebnisse zeigten, dass die AcE-Verbindung bei der Linderung der MTX-Toxizität die wirksamste war. Am Tag 3 nach der MTX-Dosierung war die Nahrungsaufnahme für alle AcE-Gruppen zusammen größer als für beide der anderen Gruppen, und blieb am Tag 4 größer als bei jenen, die MAcE konsumierten (P < 0,05). Eine verringerte Toxizität bei Ratten, die AcE konsumierten, verglichen mit MAcE, spiegelte sich auch in den Gewichtsmustern wieder, da jene, die AcE konsumierten, während der ersten vier Tage nach der Dosierung mehr Gewicht zunahmen, als jene, die MAcE konsumierten (P < 0,05). Verbesserungen bei der Aufnahme und bei der Beibehaltung des Gewichts wurden mit steigenden Mengen jeder der Verbindungen mit Ausnahme der 30-fachen Menge an MAcE festgestellt, obwohl dies nicht statistisch signifikant war. Die Menge jeder Verbindung, bei der die Reaktion am besten war, war 10-fach. Beim Vergleichen der 10-fachen Menge jeder der Verbindungen mit Casein alleine, war AcE an den Tagen 3, 4 und 5 nach der Dosierung statistisch größer (P < 0,05). Das Diarrhöe-Muster stimmte mit den Nahrungsaufnahme-Ergebnissen überein. 50% der Casein konsumierenden Tiere entwickelte Diarrhöe. Keine Tiere, die die 10-fache Menge der Verbindungen konsumierten, entwikkelten Diarrhöe, was statistisch weniger war als jene, die Casein alleine konsumierten (P = 0,088). Alle anderen Gruppen litten etwas unter Diarrhöe mit Ausnahme von jenen, die die 3-fache Menge an AcE konsumierten.
Schließlich war, für die getesteten Verbindungen, AcE die beste bei der Linderung der MTX-Toxizität. L/G und MAcE beeinflußten die MTX-Toxizität positiv, wie deutlich gemacht wurde durch das verringerte Auftreten von Diarrhöe im Vergleich mit Casein alleine, und durch die statistisch nicht signifikante Verbesserung bei der Nahrungsaufnahme und Beibehaltung des Gewichts. Es ist möglich, dass höhere Mengen an AcE und L/G zusätzlichen Schutz schaffen. Die 30-fache Menge an MAcE erwies sich als nicht wirksam und glich stark Casein alleine. Daher scheint es, dass, sobald eine Schwelle erreicht ist, höhere Mengen schädlich sind. Es ist möglich, dass MAcE bei einer Dosis irgendwo zwischen den in diesem Experiment getesteten 10-fachen und 30-fachen Mengen wirksamer ist.
Tabelle 7 (Fortsetzung)
Auswirkung von Ernährung und Methotrexat auf die Nahrungsaufnahme¹

1. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts für männliche Ratten. Methotrexat wurde nach einer 7-tägigen Gewöhnungszeit ip injiziert. Die Nahrungsaufnahme vor der Behandlung steht für den Mittelwert der 3-tägigen Zeitdauer vor der Verabreichung von Methotrexat. Die Aufnahme nach der Behandlung steht für den Prozentsatz der Aufnahme vor der Behandlung.
2. Die Casein-AcE-Gruppen (2–4) erhielten eine bessere Aufnahme nach der Behandlung aufrecht als die Casein-L/G-Gruppen (5–6) und die Casein-MAcE-Gruppen (8/11) (P < 0,05, ANOVA und Student Newmans-Keuls-Test nach faktorieller Analyse).
3. Casein-AcE (10-fach)-Tiere (3) hatten eine größere Aufnahme nach der Behandlung als Casein (p < 0,05, t-Test).
4. Die Casein-AcE-Gruppen erhielten eine bessere Aufnahme nach der Behandlung aufrecht als die Casein-MAcE-Gruppen (P < 0,05, ANOVA und Student Newmans-Keuls-Tests nach faktorieller Analyse).

Tabelle 8 (Fortsetzung)
Fußnoten:

1. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts für männliche Ratten. Methotrexat wurde nach einer 7-tägigen Gewöhnungszeit ip injiziert. Das Gewicht vor der Behandlung gibt das Durchschnittsgewicht am Tag der Injektion an.
2. Die Casein-AcE-Gruppen (2–4) behielten während der akuten Toxizität das Gesamtgewicht besser bei als die Casein-MAcE-Gruppen (8–11) (P < 0,05, ANOVA- und Student Newmans-Keuls-Test nach faktorieller Analyse). Die Casein-AcE (10-fach)-Tiere (4) zeigten signifikant weniger Gewichtsverlust als Casein (p < 0,05, t-Test).
3. Tiere, die die 10-fache Menge der Verbindungen (4, 7, 10) konsumierten, hatten ein signifikant geringeres Auftreten von Diarrhöe als Tiere, die Casein konsumierten (p < 0,088, Fisher's Exakttest auf Diarrhöe).

Beispiel 7
Verwendung von PAIs zur Hemmung von Apoptose bei Lymphozyten, die von einem HIV-infizierten Patienten erhalten wurden
Die L/G-Fraktion von PAIs, die aus Sojamehl isoliert wurde, wurde auf ihre Fähigkeit zur Hemmung von Apoptose bei Lymphozyten von einem HIV-infizierten Patienten getestet.
Peripherblut-Monozyten (PBMCs) wurden von dem Patienten erhalten und nach Standardverfahren isoliert. Die PBMCs wurden mit 2 × 10⁶/Mulde in 24 Mulden-Platten (Costar – Cambridge, MA), die 2 ml/Mulde RPMI 1640 mit Antibiotika und 10% hAB enthielten, 72 Stunden lang bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert. Manche Kulturen enthielten 10 μg/ml Kermesbeeren (Pokeweed)-Mitogen (PWM) (Sigma, St. Louis, MO). Thymozyten-Suspensionen wurden unmittelbar nach der Entfernung oder nach 18-stündiger Kultur in RPMI + 10% fetalem Rinderserum mit 5 μM Dexamethason (DEX) (Sigma – St. Louis, MO) verwendet. Die Zellen wurden 3 Tage lang den L/G-Fraktionen in den unten angegebenen Konzentrationen ausgesetzt, wobei 0,5 gEQ die aus 0,5 g Mehl-Ausgangsgewicht gewonnene Fraktion ist.
DNA wurde extrahiert und eine Gel-Elektrophorese durchgeführt wie beschrieben von Sambrook et al. Molecular Cloning – Laboratory Manuals, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY S. 134–135, E3-E4 und E10-E11. In Kürze, die geernteten Zellen wurden durch Zentrifugieren pelletisiert und bei 60°C eine Stunde lang in 400 μl 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8), 1% NP-40, 1% Tween-20, und 0,5 mg/ml Proteinase K (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) aufgelöst. Nach Extraktion mit Phenol-Chloroform und Rückgewinnung mit Ethanol wurde die DNA in 90 mM Tris-Borat, 2,5 mM ED-TA, pH 8,3, bei 30–50 V näherungsweise 4 Stunden lang durch ein 1,5%iges Agarosegel (SeaKem, Rockland, ME) laufen lassen. Eine 123 Basenpaar-Leiter (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) wurde als die DNA-Standard (DS)-Marker verwendet. Die Gele wurden mit 1 μg/ml Ethidiumbromid (Molecular Probes, Eugene, OR) gefärbt und in destilliertem H₂O entfärbt.
Die Ergebnisse sind in 13 gezeigt, worin die Bahnen so wie oben angegeben sind.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen an, dass in Abwesenheit einer PWM-Stimulierung (Bahn 1) eine signifikante DNA-Fragmentierung beobachtet wurde, und diese Fragmentierung wurde in Kulturen, die 0,5 gEQ L/G enthielten, nahezu vollständig gehemmt (Bahn 2). Niedrigere Konzentrationen an L/G (0,05 gEQ und 0,005 gEQ) hemmten die DNA-Fragmentierung in Abwesenheit von PWM (Bahnen 3 und 4) oder in Anwesenheit von PWM (Bahnen 7 und 8) nicht. Die DNA-Fragmentierung in Anwesenheit von PWM (Bahn 5) war im Vergleich mit Kulturen ohne PWM (Bahn 1) erhöht. Eine leichte Hemmung der DNA-Fragmentierung in Anwesenheit von PWM wurde in Anwesenheit von 0,5 gEQ L/G (Bahn 6) verglichen mit Bahn 5 beobachtet. Negative und positive Kontrollen (Bahnen 10 und 11) verhielten sich wie erwartet.
Beispiel 8
Weitere Reinigung und Charakterisierung von PAIs
Die Proben wurden durch Extraktion gereinigt wie in Beispiel 1 beschrieben, dann wurden Silica-, Diol- und HPLC-Silica-Chromatographie durchgeführt, und die Produkte wurden hinsichtlich chemischer Zusammensetzung, Molekulargewicht und Struktur analysiert. Aus der Silica-HPLC wurden der Durchfluß und die fünf Hauptmaxima betrachtet.
Der Durchfluß enthielt Lysophosphatidsäure, wie durch NMR-Proton- und NMR-Kohlenstoff 13-Analyse bestimmt wurde. Die Fettsäure-Analyse ergab ein Gemisch von C16:0 und C18:2 (Hexadecanon und 9,12-Octadecadienon) im Verhältnis von 60:40 bis 50:50 in Abhängigkeit vom Soja-Ausgangsmaterial.
Peak zwei wurde mittels Massenspektrometrie, NMR und Co-Migration mit Originalstandards in TLC-Analyse als Phosphatidylinositol identifiziert. Zusätzlich zeigte die Fettsäure-Analyse ein ähnliches Verhältnis von C16:0 und C18:2 (Hexadecanon und 9,12-Octadecadienon) an jeder der zwei möglichen Positionen im Verhältnis von 60:40 (dies ist die Hauptmenge und ist typisch für Soja-Phosphatidylinositol) bis 50:50 in Abhängigkeit von der Lage der Probe in dem Peak, d. h. Vorderkante oder Hinterkante.
Peak drei enthält vier identifizierbare Fettsäuren der C16:0, C18:0, C18:1 und C18:2-Varianten, d. h. Hexadecanon, Octadecanon, cis-9-Octadecenon und 9,12-Octadecadienon im Verhältnis von 40:5:10:45, wobei die aktivste ein Verhältnis von 45:5:5:45 enthält. Zusätzlich enthält dieser Peak eine unidentifizierte Fettsäure-Komponente, die mit einer Eluierungszeit von 16,2 bis 16,3 Minuten wandert; viel später als 16:0 (mit 10,8 Minuten), und die 18:0, 18:1, und 18:2, die zwischen 13,2 und 14,1 Minuten eluieren. Die unidentifizierte Komponente machte von 50 bis 68% der gesamten vorhandenen Fettsäure aus. Unter Verwendung von Massenspektrometrie-Analyse wurde Lysophosphatidylinositol mit den beiden Fettsäure-Varianten 16:0 und 18:2 identifiziert.
Dieser Peak enthält auch Phosphatidylinositol mit Fettsäure 16:0 und 18:2 an den Positionen R1 und R2. Drei unidentifizierte Spezies mit Molekulargewichten von 861, 864 und 939–940 wurden ebenfalls gefunden.
Peak 3 wurde insofern mit "D" bezeichnet, als er in erster Linie in dem Sojamehl-Extrakt gefunden wurde. Peak 4, mit "B" bezeichnet, hat keine antiapoptotische Aktivität.
Peak 5 wurde mit "L" bezeichnet und wird hauptsächlich in dem von Lecithin stammenden Material gefunden. Peak 5 enthält zwei identifizierbare Fettsäuren der Varianten C16:0, C18:0, d. h. Hexadecanon und Octadecanon, im Verhältnis von 75:25. Zusätzlich enthält dieser Peak einen unidentifizierten Fettsäure-Bestandteil, der mit einer Eluierungszeit von 19 bis 22 Minuten wandert. Die unidentifizierte Komponente macht 66% der gesamten vorhandenen Fettsäure aus. Unter Verwendung von Massenspektrometrie wurde Phosphatidylinositol in den Fettsäure-Varianten 16:0 und 18:0 identifiziert. Zwei unidentifizierte Spezies mit Molekulargewichten von 113 und 191 wurden ebenfalls beobachtet.
Die Fettsäuren wurden als Fettsäure-methylester analysiert. Das Umesterungsreagens war wasserfreies HCl/MeOH, hergestellt wie in Christie "HPLC and Lipids" (1987) beschrieben, und analysiert wie in Christie "Gas Chromatography and Lipids: a practical guide" (1989) beschrieben, beide veröffentlicht von Oily Press Ltd. Dundee Scotland. Zu jeder Probe wurden 300 μl CH₂Cl₂ und 700 μl HCl/MeOH zugegeben. Die Derivatisierung wurde unter Stickstoff bei Raumtemperatur 18 Stunden lang durchgeführt. Danach wurde 1 ml Wasser zugegeben und die Proben wurden mit 3 × 2 ml Hexan extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden unter einem Stickstoffstrom getrocknet, erneut in 100 μl Hexan gelöst und in GC-MS-Ampullen überführt. Die Analysen der Proben wurden mit einem Hewlett-Packard 5890-Gaschromatographen mit einem massenselektiven Detektor Hewlett-Packard Serie 5971 durchgeführt, wie beschrieben in van den Berg et al. (1993) J. Lipid Res. 34: 2005–2012.
Elektrospritz-Massenspektrometrie (MS) wurde mit einem Tripel-Quadrupol-Massenspektrometer VG BloQ mit Elektrospritz-Ionisierung im negativen Mo dus durchgeführt. Die Quellentemperatur war 80°C, das Lösungsmittel war Methanol oder Methanol mit 0,05% Ammoniumacetat bei 5 μl/min, und die Kapillarspannung war 4,7 kV. Massenspektrometrie wird allgemein beschrieben in "Christie's Gas Chromatography and Lipids" (1989).
Beispiel 9
Anti-apoptotische Aktivität bekannter Phospholipide
Bekannte Phospholipid-Verbindungen wurden auf anti-apoptotische Aktivität an 10T1/2-Zellen mit Serum-Entzug untersucht, wie in Beispiel 2 beschrieben. Alle im Handel erhältlichen Proben wurden bei Raumtemperatur in einer Konzentration von 10 mM (100 × Test-Konzentration) in 1% Rinderserumalbumin (BSA), 0,5 mM Calciumchlorid, 0,5 mM Magnesiumchlorid gelöst. Alle Verbindungen wurden nach Vor-Inkubation in 1% BSA getestet. Die Endkonzentration an BSA in der Apoptose war ≤ 0,01%. Vor-Inkubation mit BSA oder Fraktion "B", die hauptsächlich PI ist, steigerte die anti-apoptotische Aktivität von LPA (14). Alle getesteten Verbindungen wurden von Sigma erhalten. Das BSA wurde von Boehringer Mannheim erhalten. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 9 und 15 vorgelegt.
Tabelle 9
Schlüssel:

++

anti-apoptotische Aktivität

0

keine Aktivität

––

apoptotische oder nekrotische Wirkung

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Verbindungen durch Massenspektrometrie identifiziert, in aktiven Fraktionen vorhanden

Obwohl die vorstehende Erfindung zu Zwecken der Klarheit des Verständnisses recht detailliert durch Darlegung und Beispiele beschrieben wurde, wird es für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig sein, dass gewisse Veränderungen und Abwandlungen ausgeführt werden können. Daher sollten die Beschreibungen und Beispiele nicht so ausgelegt werden, dass sie den Umfang der Erfindung, der durch die angefügten Ansprüche wiedergegeben wird, beschränken.

Claims

Verfahren zur Erhaltung einer Zusammensetzung, die einen Faktor mit anti-apoptotischer Aktivität aufweist, wobei das Verfahren aufweist: a) Lipid-Entfernung aus einem Extrakt von einer Pflanze der Familie der Hülsenfrüchte, der Nachtschattengewächse oder der Zwiebelartigen (wobei der Extrakt ein Pulver umfasst) mit einem Lipid-Entfernungsmittel; b) Trennen des Extrakts von dem Lipid-Entfernungsmittel; c) Extrahieren des Produkts, aus dem Lipide entfernt wurden, mit einer wässrigen Lösung; und d) Trennen der wässrigen Lösung von dem Produkt, aus dem Lipide entfernt wurden, um ein wässriges Retentat zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Lipid-Entfernung aus dem Pflanzenextrakt durch Behandlung mit einem organischen Lösungsmittel, das aus Aceton, Kohlenstofftetrachlorid, Ether, Hexan und/oder Chloroform besteht, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Pflanzenextrakt von irgendeinem Pflanzenteil erhalten wird und/oder der Extrakt ein Pulver ist.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der Pflanzenteil ein Speicherorgan ist.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das Speicherorgan eine Knolle, ein Samen oder eine Zwiebel ist.
Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, bei dem der Pflanzenextrakt von Erbsen- oder Sojabohnen-Samen stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem der Pflanzenextrakt von Kartoffelknollen stammt.
Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, bei dem die wässrige Lösung aus einem oder mehreren wassermischbaren organischen Lösungsmitteln mit Konzentrationen von bis zu 80% der Lösung besteht.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem das wassermischbare organische Lösungsmittel Acetonitril, ein niedrigeres Alkanol (gewünschtenfalls ein C₁-C₄-Alkanol), ein niedrigeres Alkandiol (gewünschtenfalls ein C₂-C₄-Alkandiol), oder ein Polymer eines niedrigeren Alkandiols ist.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das wassermischbare organische Lösungsmittel Ethanol ist, das gewünschtenfalls in einer Konzentration von 50% anwesend ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, außerdem aufweisend den Schritt des Entfernens des wassermischbaren organischen Restlösungsmittels.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Schritt des Entfernens des wassermischbaren organischen Restlösungsmittels durch Dialyse, Ultrafiltration oder Gefriertrocknung stattfindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die wässrige Lösung eine gepufferte Salzlösung ist.
Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die wässrige Lösung phosphatgepufferte Kochsalzlösung ist.
Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, außerdem aufweisend das Ausfällen von Verunreinigungen des wässrigen Retentats.
Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, außerdem aufweisend das Trennen der Zusammensetzung von anderen Bestandteilen in der wässrigen Lösung durch Unterziehen der wässrigen Lösung einer Größenausschluss-Gelfiltrationschromatographie.
Verfahren nach Anspruch 16, bei dem das verwendete chromatographische Mittel Sepharose^TM oder BioGel^TM ist.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das verwendete chromatographische Mittel Sepharose^TM S100HR ist.
Verfahren nach Anspruch 16, bei dem ein Chromatographie-Puffer verwendet wird und 0,1 bis 0,3 M Ammoniumbicarbonat oder 0,1 bis 0,3 M Natriumchlorid oder 10 bis 50 mM Phosphat bei neutralem pH ist.
Verfahren nach Anspruch 19, bei dem der Chromatographie-Puffer 0,1 M Ammoniumbicarbonat aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, bei dem Fraktionen aus der Gelfiltrationschromatographie gesammelt werden und die Fraktionen mit der größten Extinktion bei 280 nm gesammelt und zusammengefasst werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, bei dem Fraktionen aus der Gelfiltrationschromatographie gesammelt werden und die Fraktionen mit einem scheinbaren Molekulargewicht von größer als 80 kD gesammelt und zusammengefasst werden.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem Fraktionen aus der Gelfiltrationschromatographie gesammelt werden und diejenigen, die die Zusammensetzung enthalten, gereinigt und durch Dialyse und Gefriertrocknung konzentriert werden.
Verfahren nach Anspruch 23, außerdem aufweisend das Extrahieren des wässrigen Retentats mit einem einphasigen Gemisch von organischen Lösungsmitteln und Wasser, um eine wässrige Phase, die die Zusammensetzung enthält, und eine organische Phase zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 24, außerdem aufweisend das Gefriertrocknen des wässrigen Retentats.
Verfahren nach Anspruch 25, außerdem aufweisend: a) Extrahieren des gefriergetrockneten Materials mit einem einphasigen Gemisch von organischen Lösungsmitteln und Wasser; und b) Isolieren einer Glycolipid und Phospholipid enthaltenden Fraktion durch Trennen des unlöslichen Materials von dem Extraktionsgemisch.
Verfahren nach Anspruch 26, bei dem das einphasige Gemisch von organischen Lösungsmitteln und Wasser Chloroform, Methanol und Wasser aufweist.
Verfahren nach Anspruch 27, bei dem das Chloroform, Methanol und Wasser in einem Verhältnis von 4:8:3 anwesend sind.
Verfahren nach Anspruch 26, 27 oder 28, bei dem das Trennen in b) durch Filtration oder Zentrifugieren durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, außerdem aufweisend die Trennung durch Silica-Chromatographie in einem Gemisch von Chloroform:Methanol.
Verfahren nach Anspruch 30, außerdem aufweisend die Trennung auf einer Diol-Säule.
Verfahren nach Anspruch 31, außerdem aufweisend die Durchführung einer HPLC-Trennung auf einer Silica-Säule, um einen Durchfluss und fünf Fraktionen zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren aufweist: a) Erhalten eines Pulvers aus getrockneten Erbsen; b) Lipid-Entfernung aus dem Pulver mit einer 70% Aceton aufweisenden organischen Phase, wobei die organische Phase ein Volumen hat, das dem Gewicht des Pulvers näherungsweise gleich ist; c) Trennen des Acetons von dem Pulver, aus dem Lipide entfernt wurden; d) Extrahieren des Pulvers, aus dem Lipide entfernt wurden, mit einer wässrigen Phase, die Ethanol und Wasser aufweist, wobei die wässrige Phase ein Volumen hat, das dem Gewicht des Pulvers, aus dem Lipide entfernt wurden, näherungsweise gleich ist; e) Trennen der wässrigen Phase von dem extrahierten Pflanzenpulver, um ein wässriges Retentat zu erhalten; f) Entfernen des Ethanols von dem wässrigen Retentat durch Filtration; und g) Gefriertrocknen des Produkts von Schritt f).
Verfahren nach Anspruch 33, außerdem aufweisend das Extrahieren des gefriergetrockneten Produkts von g) mit einem einphasigen Gemisch aus Chloroform, Methanol und Wasser, die in einem Verhältnis von 4:8:3 anwesend sind; und das Isolieren einer Lipid/Glykolipid/Phospholipid enthaltenden Fraktion durch Trennung des unlöslichen Materials von dem Extraktionsgemisch durch Zentrifugieren.
Zusammensetzung mit anti-apoptotischer Aktivität, die nach einem Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch herstellbar ist.
Zusammensetzung mit anti-apoptotischer Aktivität, aufweisend: a) den nach dem Verfahren nach Anspruch 32 erhaltenen Durchfluss, der vorwiegend Lysophosphatidsäure enthält; b) den nach dem Verfahren nach Anspruch 32 erhaltenen Durchfluss und die nach dem Verfahren nach Anspruch 32 erhaltene Fraktion 2, die vorwiegend Lysophosphatidsäure und Lysophosphatidsäure enthalten; oder c) den nach dem Verfahren nach Anspruch 32 erhaltenen Durchfluss und die nach dem Verfahren nach Anspruch 32 erhaltene Fraktion 4, die Lysophosphatidsäure enthalten.
Zusammensetzung mit anti-apoptotischer Aktivität, wie in den Ansprüchen 35 oder 36 definiert, die eine Lysophosphatidsäure (LPA) und ein spezifisches Bindungsprotein aufweist.
Zusammensetzung mit anti-apoptotischer Aktivität, wie in den Ansprüchen 35 oder 36 definiert, die eine Lysophosphatidsäure (LPA) und Phosphatidylinositol aufweist.
Zusammensetzung mit anti-apoptotischer Aktivität, wie in einem der Ansprüche 35 bis 38 definiert, zur Verwendung in einem therapeutischen Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.
Zusammensetzung mit anti-apoptotischer Aktivität, wie in einem der Ansprüche 35 bis 38 definiert, und ein Gewebekulturmedium.
Zusammensetzung nach Anspruch 40, bei der das Gewebekulturmedium Basal Eagle's Medium, Fischer's Medium, McCoy's Medium, Medium 199, RPMI Medium 1630 und 1640, Medium auf der Basis von F-10 & F-12-Nährstoffgemischen, Leibovitz's L-15 Medium, Glasgow Minimum Essential Medium und Dulbecco's Modified Eagle Medium ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 41, bei der das Gewebekulturmedium serumfrei ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 42, bei der das serumfreie Gewebekulturmedium AIM V^® Medium, Neuman und Tytell's Serumless Medium, Trowell's T8 Medium, Waymouth's MB752/1 und 705/1 Medium oder William's Medium E ist.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 35 bis 38 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Apoptosis.
Verwendung nach Anspruch 44, bei der die Apoptosis in Beziehung zu einer erneuten Durchblutung steht.
Verwendung nach Anspruch 45, bei der die erneute Durchblutung mit Coronararterienverschluss, Hirninfarkt, Rückenmark/Schädel-Trauma und damit einhergehender schwerer Lähmung, Erfrierung oder irgendeiner Indikation, von der man früher glaubte, dass sie mit Superoxiddismutase behandelbar sei, zusammenhängt.
Verwendung nach Anspruch 46 zur Behandlung von Infarkten und von einen Infarkt umgebenden Gewebeschäden, Herzmuskel- und Hirn-Infarkten oder leichtem Trauma, das eine Apoptosis stimuliert.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 35 bis 38 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Magen-Darm-Störung.
Verwendung nach Anspruch 48, bei der: a) die Magen-Darm-Störung durch einen Reiz verursacht wird, der ein menschliches Immunschwächevirus, ein chemotherapeutisches Mittel oder Strahlung ist; b) die Behandlung Immunschwächen, die mit einem die Immunreaktion unterdrückenden Virus, einem chemotherapeutischen Mittel oder Strahlung zusammenhängen, verringert; und/oder c) die Behandlung den mit menschlichem Immunschwächevirus zusammenhängenden apoptotischen Tod von T-Zellen vermindert.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 35 bis 38 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der dermatologischen Wirkungen des Alterns, von Immunschwäche, der Unterdrückung der Immunreaktion, von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, der Abstoßung von Gewebetransplantaten oder von Alzheimer-Krankheit.
Verwendung nach Anspruch 50, bei der die dermatologischen Zustände Faltig Werden oder Schlaff Werden der Haut, Psoriasis, Kahlheit oder Haarausfall sind.
Therapeutische Zusammensetzung, aufweisend mindestens einen anti-apoptotisch aktiven Bestandteil einer Zusammensetzung, wie sie einem der Ansprüche 35 bis 38 definiert ist, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Verfahren zur Verhinderung von Apoptosis in gezüchteten Zellen, wobei das Verfahren die Behandlung der Zellen mit einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 40 bis 43 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 53, bei dem die Zellen Säugetierzellen, gewünschtenfalls menschliche Zellen, sind.
Verfahren zur Verbesserung der Organ-, Gewebe- oder Zell-Konservierung für eine nachfolgende Transplantation, wobei das Verfahren die Zugabe einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 35 bis 38 zu einer Lösung, in der sich das Organ, das Gewebe oder die Zelle befindet oder aufbewahrt wird, aufweist.