HUT76096A - Compositions which inhibit apoptosis, methods of purifying the compositions and uses thereof - Google Patents

Description

A találmány tárgyát az apoptotikus sejtpusztulás gátlásában hatásos készítmények képezik.

Az apoptózis egy normális fiziológiai folyamat, amely az egyes sejtek pusztulásához vezet. A programmozott sejthalálnak ez a folyamata számos különböző normális és patogén biológiai eseményben szerepet játszik, és számos, egymással kapcsolatban nem levő dologgal serkenthető. Az apoptózis biológiai szabályozásában változások lépnek fel az öregedés során, és ezek felelősek az öregedéshez kapcsolódó számos állapotért és betegségért. Az apoptózis legújabb tanulmányozása során kiderült, hogy a sejthalálhoz vezető általános metabolikus út számos különböző szignállal beindítható, beleértve hormonokat, szérum növekedési faktorok megvonását, kemoterápiás ágenseket, ionizáló sugárzásokat és a humán immunhiányos megbetegedést okozó vírussal (HÍV) való fertőződést [Wyllie: Natúré 284, 555-556 (1980); Kanter és mtsai; Biochem. Biophys. Rec. Commun. 118, 392-399 (1984); Duke és Cohen: Lymphokine Rés.; 5. 289-299 (1986); Tóméi és mtsai: Biochem. Biophys. Rec. Commun. 155, 324-331 (1988); Kruman és mtsai: J.Cell. Physiol. 148, 267-273 (1991); Ameisen és Capron: Immunology Today 12, 102 (1991); Sheppard és Ascher J. AIDS 5, 143 (1992)]. Tehát az apoptózis biológiai szabályozását befolyásoló ágensek terápiás alkalmazhatósággal rendelkeznek számos különböző klinikai állapotban.

Az apoptotikus sejtpusztulást a sejtek összezsugorodása, a kromatin kondenzációja, a citoplazma hólyagosodása, a fokozott membrán-permeabilitás és az • ··9 999999 · • 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 · 9 9 9 · internukleoszomális DNS hasítás jellemzi [Geschenson és mtsai: FASEB J. 6, 24502455 (1992); Cohen és Duke: Ann. Rév. Immunoi. 10, 267 (1992)].

Mind az eddig, mind az ezután idézett publikációkat a továbbiakban referenciaként kezeljük.

Számos különböző táplálék-kiegészítőt, amelyek részben részlegesen feldolgozott növényi kivonatokat tartalmaznak, használtak eddig azoknak a gasztrointesztinális rendellenességeknek az enyhítésére, amelyek gyakran kísérik a kemoterápiás kezelést, a besugárzást és az AIDS-t. A kiegészítők általában szénhidrátokat, zsírt és növényi fehérje hidrolizátumokat tartalmaznak [Tóméi és Cope és mtsai: Apoptosis The Molecular Basis of Cell Death, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1991)].

Számos, növényi kivonatból származó proteináz inhibitor rendelkezik antikarcinogén aktivitással [Troli és mtsai: Adv. Cancer. Rés. 49, 265-283 (1987)]. A Bowman-Birk inhibitorokat írták le eddig legjobban az eddig ismert inhibitorok közül [Birk: Int. J. Pép. Pro. Rés. 25, 113-131 (1985)]. A Bowman-Birk inhibitorokat egy olyan családként írják le, amely diszulfid kötéseket tartalmazó fehérjékből áll, molekulasúlyuk körülbelül 8 kDa, és elnyomják a celluláris transzformációt [Chou és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 74, 1748-1752 (1974); Yavelow és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 82, 5395-5399 (1985); Yavelow és mtsai: Cancer Rés. (Suppl.) 43, 2454s-2459s (1983)]. Leírtak nyers szójabab kivonatokat, amelyek Bowman-Birk inhibitorokat tartalmaznak [Kennedy és mtsai: 4,793,996 számú Amerikai Egyesült Államok-beli bejelentés; WO 94/20121 számú PCT publikáció; Kennedy, A.R.: Cancer Rés. (Suppl) 54, 1999s-2005s (1994)]. A Bowman-Birk inhibitorokat immunológiailag is leírták [WO 90/03574; 4,959,310 és 5,053,327 számú Amerikai Egyesült Államokbeli beje• · · ·· · · · · • ··· ·····« · • · · · · · ···· ·· ·· · ····

- 4 lentés]. A Bowman-Birk inhibitorokról azt is leírták, hogy a makrofágok degranulálásában is rendelkeznek aktivitással [63051335 számú Japán bejelentés],

A lizofoszfatidsavat (LPA) számos különböző növényi termékben megtalálták, különböző foszfolipidek formájában. Az LPA-ról kiderült, hogy számos különböző fiziológiai aktivitással rendelkezik, beleértve a mitogenezist, a növekedési faktort és egy zsugorodás-ellenes ágenst [4,263,286; 4,746,652; 5,326,690 és 5,340,568 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés]. Az LPA-t részletesen ismertetik a szakirodalomban [Moolenaar: TICB 4, 213-219 (1994); Eichholtz és mtsai: Biochem. J. 291,677-680 (1990).

A jelen találmány tárgyát olyan eljárások képezik, amelyekkel apoptózist gátló készítmények állíthatók elő. valamint a találmány tárgyát képezik a készítmények is. A készítményeket fitogén apoptózis inhibitoroknak nevezik (PAI-k). A találmány tárgyát képezik a PAI-k beadására alkalmas, fiziológiásán elfogadható készítmények, az apoptózis befolyásolására alkalmas mennyiségben. A találmány tárgyát képezik továbbá a PAI-k alkalmazási módszerei.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.

Az 1. ábrán a PAI-k anti-apoptotikus hatása látható egybefüggően egymáshoz érő C3H 10T1/2 sejtekre.

A 2. ábrán a PAI-k koncentráció-függő anti-apoptotikus hatása látható a C3H 10T1/2 sejtekre az exponenciális növekedési fázisban.

A 3. ábrán az etanolos extrakcióval tisztított PAI-k és a méretkizárásos gélszüréssel tovább tisztított PAI-k anti-apoptotikus aktivitása látható a C3H 10T1/2 sejteken. Az adatokat tripszingátló aktivitásban adjuk meg.

A 4. ábrán a szójabab PAI-k különböző koncentrációinak anti-apoptotikus aktivitása látható cikloheximiddel kezelt, nyugalmi állapotban levő C3H 10T1/2 sejteken.

Az 5. ábrán a PAI-ban levő monoszacharidok kromatogramja látható.

A 6. ábrán a patkány szív miocitákkal kapott eredmények láthatók.

A 7. ábrán a szójaliszt kivonatok hatása látható metotrexáttal kezelt patkányokon.

A 8. ábrán a szójaliszt kivonatok hatása látható metotrexáttal kezelt patkányokon.

A 9. ábrán a szója AcE hatása látható metotrexáttal kezelt patkányokon.

A 10. ábrán a szójaliszt kivonatok hatása látható metotrexáttal kezelt patkányokon.

A 11. ábra egy oszlopdiagramm, amelyen a hasmenéses patkányok előfordulási gyakorisága látható metotrexáttal való kezelés és különböző étrend után.

A 12. ábra egy oszlopdiagramm, amelyen a hasmenéses patkányok előfordulási gyakorisága és súlynövekedése látható metotrexáttal való kezelés és különböző étrend után.

A 13. ábra egy fénykép, amelyen a DNS létra látható, az apoptózis mértékét mutatja egy HIV-vel fertőzött egyedből kapott limfocitákban.

A 14. ábra egy oszlopdiagramm, amely a lizofoszfatidsav anti-apoptotikus hatása látható, BSA-val és B frakcióval való előinkubálássai fokozva. A használt rövidítések: LPA, L-tt-lizofoszfatidsav, oleoil (C18:1, [cis]-9); BSA, szarvasmarha szérumalbumin, V-ös frakció, etanollal extrahálva; és “B” frakció szójalisztből, főleg foszfatidil-inozit.

A 15. ábra egy grafikon, amelyen a lizofoszfatidsav, oleoil (C18:1, [cis]-9) antiapoptotikus hatása látható in vitro, olyan C3H 10T1/2 sejteken, amelyektől a szérumot megvontuk.

·*»·

Kiderült, hogy számos növényrész tartalmaz olyan komponenseket, amelyek, ha legalább részben tisztítjuk és izoláljuk, akkor apoptózist gátló tulajdonságot mutatnak. Ezek a komponensek könnyen elválaszthatók a Bowman-Birk inhibitoroktól, és eltérnek a többi, terápiásán hatékony növényi terméktől is. A készítmények kémiai összetétele enyhén változhat, a forrástól és a növénynek, amelyből származnak, a növekedési körülményeitől. A készítményeket a továbbiakban PAI-k” néven említjük, mivel a találmány tárgyát képezik a rokon készítmények is, amelyeket az ismertetett módszerrel állítunk elő, de más-más növényi forrásokból. A készítmény előállítható szintetikusan is, a lipidszintézis területén ismert módszerekkel. Számos viszonylag megtisztított készítményt állítunk elő a találmány szerint, ezek jelzése L/G, AcE, MAcE és FAcE, hogy az alábbiakban ismertetett különböző tisztasági mértékeket meg tudjuk különböztetni. Viszonylag tiszta frakciókat is előállítunk, ezek jelzése “D és “L, az alábbiak szerint, mindegyik egy foszfolipid keverék. Két további, viszonylag tiszta készítményt is előállítunk, mindegyik tartalmaz lizofoszfatidsavat (LPA); LPA-t és egy fehérjehordozót, valamint LPA-t és egy egyébként inaktív “B frakciót.

A PAI-kat számos különböző növényből és növényi szervből előállíthatjuk. A növények előnyös a leguminosae családba tartoznak (babok és borsók, stb.), a PAIk izolálhatok egyéb növényekből is, azaz például a solanum (azaz burgonyák) és az allium (azaz fokhagyma) családba tartozó növényekből is. A PAI-k előállíthatok részlegesen tisztított növényi kivonatokból is, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat a melaszokat, lecitint, részlegesen tisztított fehérjesürítményeket és részlegesen tisztított fehérje hidrolizátumokat is. A szakterületen jártas szakember meg tudja határozni, az alábbiakban ismertetett módszerek alkalmazásával, hogy egy adott növényfajból, növénykivonatból vagy egy növényben levő szervből izolálhatók-e PAI-k.

• · · · · · ···· ·· ·· · ···»

Bármelyik növényi kivonat, vagy annak egy része, amelyből készítmény előállítható, alkalmas a jelen találmányban való alkalmazásra. A használható növényi szervek közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a szárak, a levelek, gyökerek, virágok, rizómák, és előnyösen a tároló szervek, azaz például a magok, gümők és gumók. A használt növényi részek előnyösen, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a burgonyák és a fokhagyma. Legelőnyösebbek a zöldségek magvai, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a szójababok és a borsók, a feldolgozás egyszerűsége miatt. Jóllehet az alábbiakban a “mag és “magvak” szakkifejezést használjuk, az nyilvánvaló, hogy ezek a szakkifejezések bármely olyan növényi részt is jelenthetnek, amelyekből legalább egy, terápiásán aktív PAI előállítható, vagy sejttenyészetben aktív PAI állítható elő.

A találmány tárgyát képezik a PAI-k részleges tisztítására szolgáló módszerek. Különböző mértékű tisztaság érhető el. A magvakat megőröljük vagy elporítjuk, előnyösen por vagy liszt formára. A továbbiakban a por szakkifejezés őrölt szárított növényi részt jelent. A por részecskéi elég kicsinyek lehetnek ahhoz, hogy elég nagy felszíni érintkezési lehetőséget biztosítsanak a velük érintkező különböző folyadékoknak. Bármely őrlési vagy porítási módszer alkalmazható, a magvak őrlését általában egy kereskedelmi forgalomban levő malomban végezzük. A PAI-k általában hőre nem érzékenyek, ezért az őrlést olyan hőmérsékleten végezhetjük, amelyen számos fehérje denaturálódik. Különböző magvak kereskedelmi forgalomban kapható lisztjei is használhatók. Kiderült például a szójalisztről és a különböző sárga és zöld borsók lisztjéről, hogy aktív PAI-kat tartalmaznak.

A magvak porát azután bármelyik, a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerrel lipidmentesítjük. Szükség lehet arra is, hogy a port inért környezetben, azaz például oxigénmentes nitrogénben vagy argonban lipidmentesítsük, vagy antioxidánsokat alkalmazzunk az eljárás során, például BHT-t vagy BHA-t, s

hogy fokozzuk az aktivitást, vagy minimalizáljuk az oxidatív természetű változásokat. A lipidmentesítést általában úgy hajtjuk végre, hogy a port egy szerves oldószert tartalmazó oldattal extraháljuk. A megfelelő szerves oldószer lehet, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az aceton, a széntetraklorid, az éter, a hexán és a kloroform. A szerves oldószer koncentrációja az oldatban általában 50-100% között lehet. A szerves oldószer előnyösen aceton. A szerves oldat koncentrációja változhat a használt oldószertől és a mag típusától függően; a hatásos koncentráció meghatározása a szakterületen jártas szakember számára rutinfeladat. Az aceton esetében a koncentráció körülbelül 70%.

Többszörös szerves oldószeres extrahálást is végezhetünk. A szerves oldat és a por aránya (tömeg/térfogat) is változhat. Jóllehet nem korlátozódik az alábbi tartományra, az alkalmazott arányok általában 2:1 és 1:20 között változnak (a por tömege/a szerves oldat térfogata). Az aceton esetében az 1:5 arány az előnyös.

A PAI-k stabilitása miatt a hőmérsékletet és az atmoszferikus nyomást, amelyen a lipidmentesítést végezzük, csak a használt szerves oldószerek fagyás- és forráspontja korlátozza. Általában, az alkalmazás egyszerűsége miatt, a lipidmentesítést szobahőmérsékleten és atmoszferikus nyomáson végezzük. Hasonlóképpen, az extrahálás ideje sem kritikus, és nagy mértékben a por és a szerves oldószer arányától függ. Ha 70%-os acetonnal végezzük az extrakciót 1:5 arány mellett, akkor a lipidmentesítés 30 perc alatt lejátszódik, folyamatos kevertetés mellett.

A szerves oldatot azután bármely, a szakterületen ismert módszerrel elválasztjuk a portól. A port előnyösen centrifugálással távolítjuk el a szerves fázisból. Az elválasztás bármelyik alkalmas formája használható, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a szűrést vagy a gravitációs elválasztást. A PAI-k az extrahált porban maradnak.

- ι)

A lipidmentesített port azután egy vizes oldattal extraháljuk, így kapunk egy vizes retentátot, amelyik a PAI-kat tartalmazza. A vizes oldat lehet puffereit oldat, azaz például egy foszfáttal puffereit sóoldat (PBS), és tartalmazhat maximum 80% vízzel elegyedő szerves oldószert. A megfelelő vízzel elegyedő oldószerek közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az acetonitril, az alacsony szénatomszámú alkanolok, főleg az 1-4 szénatomszámú alkoholok, azaz például az etanol, a metanol és a propanol, az alacsony szénatomszámú alkéndiolok, különösen a 2-4 szénatomszámú alkéndiolok, azaz például az etiiénglikol, valamint az alacsony szénatomszámú alkéndiolok polimerjei, különösen a polietilénglikol. Előnyösen az etanolt használjuk, a legelőnyösebb, ha 50% koncentrációban.

A vizes oldat és a por aránya is változhat. A extrahálás aránya 1:1 és 1:20 között változhat (a por tömege/a vizes oldat térfogata). Általában 50%-os etanolt használunk 1:10 arányban. Az extrakciós idő is változik és függ a vizes oldat térfogatától, valamint a használt, vízzel elegyedő szerves oldószer százalékától. Abban az esetben, ha 50% etanolt használunk 1:10 arányban, akkor az extrakció 1 óra hosszat tart, folyamatos kevertetés vagy rázatás közben.

A vizes oldat pH-tartományáról kiderült, hogy egyáltalán nem lényeges tényező, a pH=2,5-11-es tartományt átvizsgálva; ezért valószínű, hogy még szélesebb tartomány is hatékony lehet. Az alkalmazás egyszerűsége miatt a pH általában 7és 8 között van.

A vizes extrakció hőmérsékleti és atmoszférikus körülményei széles körben változhatnak, és nagy mértékben a vizes oldat fagyás- és forráspontjától függenek. Az extrakciókat általában szobahőmérsékleten végezzük, atmoszferikus nyomáson. Ha a vizes extrakció már lejátszódott, akkor a vizes retentátot eltávolítjuk további feldolgozás céljából. Bármelyik, a szakterületen ismert eltávolítás! módszer használha• · · ·· ·· · · · · • · · ······ · • « · · · • ·· ·· · ···· tó, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a centrifugálást és a szűrést.

A vizes retentátot tovább tisztítva kapjuk a PAI-t. Bármelyik vízzel elegyedő oldószer eltávolítható a szakterületen ismert módszer alkalmazásával, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az ultraszürést. szárítást és dialízist. Az ultraszürést egy 10 kDa molekulasúly vágási értékkel hajthatjuk végre, hogy eltávolítsuk az alacsony molekulasúlyú fehérjéket, azaz például a Bowman-Birl inhibitorok monomerjeit és a szerves oldószert. Hasonlóképpen, a dialízis cső vágási értéke 10 kDa lehet.

A maradék szerves oldószert diaszüréssel távolíthatjuk el az ultraszűrés után, vagy a dializátum többszöri cseréjével, például tiszta vízzel. A vizes retentátot több napig tárolhatjuk oldatban, és végtelen hosszú ideig tárolhatjuk liofilezett szilárd anyag formájában. A vizes retentátot előnyösen liofilezzük. A liofilezett szilárd anyag az AcE, ha a kiindulási anyag a szójaliszt. Mind a vizes retentátot mind a liofilezett retentátot további feldolgozási lépéseknek vethetjük alá; a liofilezett retentátot egy megfelelő vizes oldószerben szuszpendálhatjuk a további feldolgozás előtt.

A kapott anyagot tovább is elválaszthatjuk, bármelyik molekulaméret kizárási kromatográfia alkalmazásával, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a Sepharose S100HR töltetet (Pharmacia Biotechnology Piscataway NJ. USA) vagy a BioGel P-100 töltetet (BioRad Laboratories Inc., Hercules CA. USA) vizes pufferben. A megfelelő pufferek közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a 0,1-0,3 mol/l koncentrációjú ammónium-hidrogén-karbonát, vagy a 0,ΙΟ,3 mol/l nátrium-klorid 10-50 mmol/l koncentrációjú foszfát pufferben, semleges pHn.

A méretkizárásos kromatográfiával kapott PAI-k az üres térfogatban találhatók, látszólagos molekulasúlyuk nagyobb mint 80 kDa. Az ebben a frakcióban talált • ··· ······ · * · · · · · ···· ·· ·· · ····

- I I anyagot nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) lehet szétválasztani, redukáló körülmények között. Az anyag sok fehérjét tartalmaz. A Coomassie Blue-val végzett festés azt mutatja, hogy 6-8 fehérje van jelen, molekulasúlyuk 18 és 68 kDa között változik. A vékonyréteg kromatográfiával végzett elemzés azt mutatja, hogy számos lipid-típusú vegyület van jelen.

A kromatográfiával eluált frakciók közül a 280 nm-en legnagyobb elnyelést mutatók egybeesnek azokkal a frakciókkal, amelyek a legnagyobb biológiai aktivitással rendelkeznek. A biológiai aktivitás elválik az alacsony molekulasúlyú anyagtól, és az üres térfogatban eluálódik egy olyan pozícióban, amely egybeesik a 80 kDanál nagyobb molekulasúly, vagy egy aggregátum pozíciójával. Ezt az anyagot töményíthetjük, dializálhatjuk, Iiofilezhetjük és végtelen hosszú ideig tárolhatjuk liofilezett formában. A liofilezett szilárd anyag a FAcE, ha a kiindulási anyag a szójabab.

Az oldatba vitt PAI-k acetonnal kicsaphatok, ha az aceton koncentrációja 70% vagy több. Azonban a különböző ágensekkel végzett kezelés, beleértve az erős savakkal végzett kezelést is, elroncsolja az aktivitásukat. Például a triklórecetsav, a sósav, a trifluorecetsav és a fenol tönkreteszi az aktivitásukat. Azonban a 2,5-nél alacsonyabb pH nem teszi tönkre az aktivitást, csakúgy, mint ahogy az 1%-os ecetsav sem érinti a PAI-k aktivitását.

A PAI-k tovább izolálhatok egy zsírmentesített és etanollal szárított maglisztből kapott fagyasztva szárított nagy molekulasúlyú frakciónak egy egyfázisú kloroforrmmetanol: víz (4:8:3) elegybe való extrahálásával. Ezt a legegyszerűbben úgy tehetjük meg, ha a szárított anyagot a víz frakcióban oldjuk, utána hozzáadjuk a metanolt, majd a kloroformot, összekeverjük, és eltávolítjuk a csapadékot. Ezzel az extrakcióval kapunk egy glikolipid/lipid/foszfolipid frakciót, amely megtartja a PAI aktivitását.

• · · · ··· ··· ··· • · · • · · · ·

Például a nagy molekulasúlyú frakcióból (FAcE) 0,1 gEQ-t (ez a mennyiség 0,1 g kiindulási anyagból származik) oldunk 7,5 ml vízben, állandó kevertetés közben, majd 20 ml etanolt adunk hozzá, utana pedig 10 ml kloroformot adunk hozzá. Az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolítjuk (8000 x g, 10 perc), majd az oldatból rotációs bepárlással visszanyerjük a PAI-t, az oldószer eltávolítása céljából, majd fagyasztva szárítjuk, a víz eltávolítása céljából. A kapott frakció jelzése az L/G frakció. Az L/G frakció szénhidrát komponense arabinózt és galaktózt tartalmaz 3:2 arányban, fukózzal, ramnózzal, glükózaminnal, glükózzal és mannózzal együtt, amelyek mind minor komponens formájában vannak jelen.

Az L/G frakciót tovább tisztíthatjuk, az oldhatósága alapján elválasztva egy kloroforrmmetanol elegyben, majd szilikagél kromatográfiával szétválasztva egy kromatográfiás oszlopon vagy vékonyréteg lapon (TLC).

Az anyagot azután előzetes kromatográfiás lépésnek vetjük alá szilikasavon, azaz például Mallinckrodt SiO₂x H₂O, 100 mesh-es poron. Az aktív anyagot kloroformban visszük fel, majd kloroformmal mossuk, vagy pedig 90:10 vagy 80:20 arányú kloroforrmmetanol eleggyel, és metanollal vagy kloroforrmmetanol (10:90 vagy 20:80) eleggyel eluáljuk.

Az aktív anyagot tovább tisztíthatjuk diói oszlopon, azaz Diói SepPak cartridge-okon (Waters, Millipore) végzett kromatográfiával. Kiindulási anyagként használható például a szilikáton tisztított L/G, a nyers, kereskedelmi forgalomban levő lecitin, vagy egyéb szója foszfolipid készítmények, amelyek kloroformban oldódnak. Körülbelül 100-1000 mg mintát oldunk körülbelül 100 mg/l koncentrációban kloroformban, majd 10 g, előre kiegyensúlyozott diói oszlopra visszük. Az oszlopot 2-5 térfogat kloroformmal mossuk, eluáljuk 2-5 térfogat etanollal, majd végül 2,5 térfogat metanollal eluáljuk. Az aktivitás zöme a metanol frakcióban eluálódik, jóllehet valamennyi aktivitás megtalálható az etanol frakcióban is. Az aktivitást szárítással izolálhatjuk a metanolból. A megfelelő szárítási módszerek közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a rotációs bepárlás vagy a csökkentett nyomáson való bepárlás. Néhány mintában csapadék keletkezik ha éjszakán át -20 °C-on tároljuk; ezt a csapadékot azonban az aktivitás elvesztése nélkül, centrifugálással eltávolíthatjuk.

Az aktív anyag tovább tisztítható HPLC kromatográfiával szilikát oszlopon, azaz például Dynamax 60A Si oszlopon (Rainin Instrument Co., Inc.). Az aktív anyag eluálására használt gradiens összetétele 95:3:2 0,05 acetonitril:metanol:víz:ammónium-hidroxíd elegytől 65:21:14 0,35 acetonitril:metanol:víz:ammónium-hidroxid elegyig terjed. Az elúciós profilt 205 nm-en követjük. Amint azt az alábbiakban ismertetett példákban leírjuk, ebben a tisztítási lépésben öt különböző terméket kapunk, ezeknek a jele 1-5-ös frakció. Ezeket a frakciókat elválasztjuk, majd külön elemezzük az összetételüket és anti-apoptotikus aktivitásukat. Számos frakciót egyesítünk, és vizsgáljuk az anti-apoptotikus aktivitásukat. Azt találtuk, hogy az átfolyó főleg lizofoszfatidsavat (LPA) tartalmaz, amely, amint azt az alábbiakban ismertetjük, egy vegyületcsoport. Az aktivitását vizsgáivá kiderült, hogy egy kereskedelmi forgalomban levő LPA-nak, az L-a-lizofoszfatidsavnak, oleoil (C18:1, [ciszj-9) nincs anti-apoptotikus aktivitása. Az ebben a frakcióban talált LPA-nak, és a kereskedelmi forgalomban levő LPA-nak van azonban anti-apoptotikus aktivitása, olyan fehérje vagy fehérjék jelenlétében, amelyekhez specifikusan kötődik. Tehát a jelen találmány egyik megvalósítási módját képezik azok a készítmények, amelyek LPA-t és egy specifikus kötő fehérje hatásos mennyiségét tartalmazzák. A kötő fehérje előnyösen a szérumalbumin. Meg kell azonban jegyezni, hogy a Bowman-Birk inhibitorok jelenléte nem hozza létre az LPA anti-apoptotikus aktivitását. Az is kiderült, hogy egy “B” jelű frakció jelenlétében az LPA-nak van anti-apoptotikus aktivitása. A B frakció, amely főleg foszfatidil-inozit, nem rendelkezik anti-apoptotikus aktivitással. Tehát a

Η jelen találmány egy másik megvalósítási módja egy olyan készítmény, amely LPA-t tartalmaz, valamint a B frakciónak vagy aktív komponensének egy hatásos mennyiségét. Meg kell jegyeznünk, hogy a B frakció nem tartalmaz fehérjét, tehát az a képessége, hogy az LPA-ban anti-apoptotikus aktivitást indukál, alapjában a foszfolipideknek köszönhető. Jóllehet nem ragaszkodunk semmilyen elmélethez, mégis azt gondoljuk, hogy a B frakció hatasa egy micella vagy liposzóma képződésének köszönhető, amely megvédi az LPA-t és/vagy lehetővé teszi az LPA korrekt bemutatását a sejteknek.

A “D frakciót is kinyertük, és kiderült, hogy rendelkezik anti-apoptotikus aktivitással. Ez a frakció megfelel a 8. példában ismertetett 3-as csúcsnak. A találmány tárgyát képezi tehát a D frakciót tartalmazó frakció is.

Az “L” frakciót is kinyertük, és kiderült, hogy anti-apoptotikus aktivitással rendelkezik. Ez a frakció a 8. példa 5-ös csúcsának felel meg. A találmány tárgyát képezi tehát az L frakciót tartalmazó készítmény is. A D és L frakciók tehát additív antiapoptotikus aktivitással rendelkeznek. A találmány tárgyát képezi tehát a D és L frakciókat tartalmazó készítmény is.

Tehát az előzőkben említett megvalósítási módok is a PAI szakkifejezés hatálya alá tartoznak, és használhatók az alábbiakban ismertetett indikációkban és készítményekben. Az LPA szerkezetét a I általános képlettel lehet leírni, amelyben R jelentése helyettesített vagy helyettesítetlen, telített vagy telítetlen, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, amely 11-23 szénatomot tartalmaz.

A továbbiakban az LPA szakkifejezés számos molekulára vonatkozhat, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat a 2-dezoxi- vagy 2-dezoxi-2halo-lizofoszfatidsavakat, amelyeket a II általános képlettel lehet leírni, vagy ezeknek gyógyászatilag elfogadható sóit, amelyekben Rjelentése helyettesített vagy helyettesítetlen, telített vagy telítetlen, egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, amely 11-23

I? • · · · · · • · · ······ · • · · · · •· · · · ···· szénatomot tartalmaz, az X jelentése O- vagy S atom; Y jelentése 0 atom vagy CH₂csoport; Z jelentése hidrogénatom, halogénatom, NH₂-, SH-, OH- vagy -OPO₃H₂ csoport.

Ide tartozik az RC(O)-csoport is. amely lehet lauril-, mirisztil-, palmitil-, sztearil, palmitoleil-, oleil- vagy linoleil-csoport; pontosabban oleil-, palmitoleil-, mirisztil-, palmitil- vagy lauril-csoport; különösen mirisztil- vagy lauril-csoport.

Az LPA-k gyógyászatilag elfogadható sói közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az alkálifém sók, azaz például a nátrium- és káliumsók; az alkáli földfém sók, azaz például a kalcium- és magnéziumsók; a nem-toxikus nehézfémsók; az ammóniumsók; a trialkil-ammónium sók, azaz például a trimetil-ammónium- és a trietil-ammónium-sók; valamint az alkoxiammónium-sók, azaz például a trietilammónium-, tri(2-hidroxietil)ammónium- és trimetamin-sók (trisz(hidroximetil)aminometán). Különösen előnyösek a kalciumsók.

Egy specifikus kötő fehérjével vagy B frakcióval kombinálva jól használható LPA vegyületek közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az alábbiak: L és D 1-mirisztoil-2-fluor-2-dezoxi-glicerin-3-foszfát. L és D 1-lauroil-2fluor-2-dezoxi-glicerin-3-foszfát, L és D 1-oleoil-2-fluor-2-dezoxi-glicerin-3-foszfát, L és D 1-palmitoleoil-2-fluor-2-dezoxi-glicerin-3-foszfát, L és D mirisztoil-2-fluor-2dezoxi-glicerin-3-foszfát, L és D 1-lauroil-2-klór-2-dezoxi-glicerin-3-foszfát, LésD 1mirisztoil-2-klór-2-dezoxi-glicerin-3-foszfát, valamint ezek kalciumsói.

Egyéb faktorok, amelyek befolyásolhatják ezeknek a készítményeknek az aktivitását, az LPA lánchosszúsága, koleszterin jelenléte, micellák, liposzómák, detergensek és emulgeáló ágensek jelenléte, valamint a láncpozíció az LPA-ban, azaz az első vagy a második szénatom a glicerinen. A micellák, liposzómák és detergensek esetében a micellák és a liposzómák az aktivitás fokozódását okozzák,

-1()míg a detergensek vagy detergens-szerű molekulák az aktivitás csökkenését okozzák.

A HPLC szilikagél kromatográfiával kapott aktív frakciókat tovább szeparálhatjuk a hidrofobicitásuk alapján, például HPLC-vel egy C18 oszlopon (Dynamax 60A, Rainin Instrument Co. Inc.), számos különböző metanoltartalmú pufferben, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a 100%-os metanolt, amely 800 mg/l ammónium-acetátot tartalmaz, a 99% metanolt, amely 1 mmol/l nátrium-foszfátot tartalma (pH 7,4); és a 90% metanol, 10% nátrium-foszfát puffért (pH=7,4). Az anyagot izokratikusan eluáljuk 90:10 metanol: 5 mmol/l NaPO₄ (pH=7,4) oldattal.

A szakterületen számos módszer ismert lipidek tisztítására és elemzésére. A jelen találmány végrehajtására bármelyik ismert módszer alkalmazható, feltéve, hogy aktív frakciót eredményez [Bligh és Dyer: Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959); Patton és mtsai: J. Lipid Rés. 23, 190-196 (1982); Jungalwala: Recent Developments in Techniques fór Phospholipid Analysis, in “Phospholipids in Nervous Tissues, szerk.: Eichberg, John Wiley and Sons, 1-44 (1985); Hamilton és mtsai: “A Practical Approach” című sorozatban, szerk.: Richwood és munkatársai, IRL Press at Oxford University Press (1992); Kates: Techniques of Lipidology: Isolation, Analysis and Identification in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology; szerk.: Burdon és munkatársai, Elsevier (1986)].

Általában szójalisztet vagy annak frakcióját extraháljuk, vízben szuszpendálva (20 tömeg/térfogat százalék a liszt esetében), majd két térfogat metanolt és egy térfogat kloroformot adunk hozzá. így egy fázist kapunk, ezt kevertetjük szobahőmérsékleten 30 perc - 1 óra hosszat. Ehhez a keverékhez egy térfogat kloroformot adunk, összekeverjük, majd egy térfogat vizet adunk hozzá. így két fázist kapunk, majd a fázisokat centrifugálással vagy választótölcsérrel választjuk el, miután először eltávolítottuk a szilárd anyagokat (ha lisztet használtunk kiindulási anyagként). Az aktivitás a szerves (alsó) fázisban található.

A PAI-k in vitro apoptózis gátló aktivitása láthatóan főleg az aktívan szaporodó sejtekre korlátozódik; a nyugalomban levő sejteket láthatóan nem nagyon érinti.

A PAI-k aktív komponensei nagyon stabilak proteázok jelenlétében. A PAI-kat például tripszinnel, kimotripszinnel, papainnal, elasztázzal, szubtilizinnel és proteináz K-val kezeltük a proteolízishez megfelelő körülmények között, de a proteázoknak nincs hatásuk az aktivitásukra.

A találmány tárgyát képezik továbbá a lényegében tisztított PAI-kat tartalmazó gyógyászati készítmények. A készítményhez szükséges tisztasági szint tapasztalati úton határozható meg, ez pedig a szakterületen jártas szakember számára nem okozhat nehézséget. A készítmények alkalmasak számos különböző rendellenességben való felhasználásra, amint azt az alábbiakban ismertetjük, mind humán mind állatgyógyászati alkalmazásokban.

A PAI-k, valamint a tisztítás során kapott aktív frakcióik aktivitását a szakterületen ismert anti-apoptózis vizsgálattal lehet mérni. Ezek közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat a C3H 10T1/2 sejt szérummegvonási vizsgálata, amit részletesen ismertettek a WO 9425621 számú PCT publikációban (ez az előnyben részesített módszer), valamint a 3. és 4. példában ismertetett módszerek. Emellett az in vivő apoptózis gátlás bármelyik, a szakterületen ismert módszerrel mérhető.

A PAI-k általában gyógyászatilag elfogadhatók, mivel alacsony a toxicitásuk a terápiás dózistartományban, stabilak, és számos különböző hordozóval együtt adhatók a különböző beadási módoknak megfelelően. A PAI-kat beadhatjuk önmagukban vagy más gyógyászatilag hatékony ágensekkel együtt, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az antibiotikumokat, sebgyógyító ágenseket, antioxidánsokat és egyéb terápiás ágenseket. A megfelelő antioxidánsok közé tar] s toznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az ampi( tetraciklin, kloramfenikol és a penicillin. A megfelelő sebgyógyító anyagok közéznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a transzformáló növekedésorok (TGF(Pk), az epidermális növekedési faktorok (EGF-ek), a fibroblaszt növesi faktorok (FGF-ek) és a vérlemezke eredetű növekedési faktorok (PDGF-el megfelelő antioxidánsok közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk maat, a C és az E vitamin.

A készítmények legalább egy PAI-ból legalább terápiásán hat;mennyiséget tartalmaznak, valamint tartalmaznak legalább egy fiziológiásán edható hordozót. A fiziológiásán elfogadható hordozó az, amely nem okoz károsékhatást a beadás során, és benne a PAI-k megfelelően oldhatók ahhoz, hogegyületből egy terápiásán hatásos mennyiséget lehessen beadni. A PAI-k terán hatásos mennyisége függ részben a bejuttatás módjától és a kezelendő tűnél, valamint egyéb kritériumoktól, amelyek nyilvánvalóak a szakterületen jártas smber számára. A terápiásán hatásos mennyiség elegendő az apoptózis befolysára a kezelendő állapotban, amit igazol a tünetek enyhülése. A terápiásán h;s mennyiség 0,5-100 tömegszázalékot jelent legalább egy PAI-ból. Az adott iten használható beadás ut(ak)at az alábbiakban tárgyaljuk, és ezek jól ismertezakterülétén jártas szakember számára.

A beadási utak közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznángunkat, a topikális, transzdermális, parenterális, gasztrointesztinális, transz;hiális és transzalveoláris. A topikális beadást végezhetjük topikálisan alkalm krémmel, géllel, öblítéssel, stb., amely a PAI-kból terápiásán hatásos mennyistartalmaz. A transzdermális beadást végezhetjük egy krém, öblítés, gél, stb. aazásával, amely lehetővé teszi, hogy a PAI-k behatoljanak a bőrbe és eljussanaáráramba. A parenterális beadási utak közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátok magun- i ^ι> kát, a közvetlen injekciózás, azaz például az intravénás, intramuszkuláris. intraperitoneális vagy szubkután injekció. A gasztrointesztinális beadási utak közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a lenyelés és a rektális út. A transzbronchiális és transzalveoláris beadási utakhoz tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a belégzés, vagy a szájon, vagy az orron keresztül, valamint a közvetlen injekciózás egy légútba. azaz például egy tracheotómián keresztül.

Jóllehet a PAI-kat beadhatjuk topikálisan egymagukban is, előnyös lehet, ha keverékben alkalmazzuk őket egy topikális, gyógyászatilag vagy kozmetikailag elfogadható hordozóval.

A “topikális gyógyászatilag elfogadható hordozó szakkifejezés a továbbiakban bármelyik, lényegében nem toxikus hordozót jelenti, amely szokványosán alkalmazható gyógyszerek topikális beadására, és amelyben a PAI-k stabilak, biológiailag hozzáférhetők maradnak, ha közvetlenül a bőrre vagy a nyálkahártyákra alkalmazzuk őket. A PAI-k például feloldhatók egy folyadékban, diszpergálhatók vagy emulgeálhatók egy közegben a szokványos módon, így egy folyadék készítményt kapunk, vagy összekeverhetjük egy félig szilárd (gél) vagy szilárd hordozóval, így kapunk egy pasztát, port, kenőcsöt, krémet, borogatóvizet vagy hasonlót.

A megfelelő topikális gyógyászatilag elfogadható hordozók közé tartozik a víz, a petróleum-kocsonya (vazelin), az ásványolaj, a növényolaj, állati olaj, szerves és szervetlen viaszok, azaz például a mikrokristályos paraffin és az ozokerit viasz, a természetes polimerek, azaz például a xantánok, zselatin, cellulóz, kollagén, keményítő vagy gumiarábikum, a szintetikus polimerek, azaz amint azt például az alábbiakban tárgyaljuk, az alkoholok, poliolok és hasonlóak. A hordozó lehet vízzel elegyedő hordozó készítmény,amely lényegében elegyedik vízzel. Az ilyen vízzel elegyedő topikális gyógyászatilag elfogadható hordozó készítmény lehet olyan, amelyet egy vagy több, az előzőkben ismertetett megfelelő adalékanyaggal állítunk elő, de tartalmazhat fenntartó vagy késleltetett kibocsátású hordozókat, beleértve a víztartalmú, vízzel diszpergálható vagy vízben oldható készítményeket, azaz például a liposzómákat, mikroszivacsokat, mikrogömböket vagy mikrokapszulákat, vizes alapú kenőcsöket, víz az olajban vagy olaj a vízben emulziókat, géleket vagy hasonlókat.

A találmány egyik megvalósítási módja szerint a topikális gyógyászatilag elfogadható hordozó egy folyamatos kibocsátású vagy késleltetett kibocsátású hordozót tartalmaz. A hordozó lehet bármely anyag, amely képes a PAI-k folyamatos vagy késleltetett kibocsátására, hogy ezzel hatékonyabb bejuttatást biztosítsunk, aminek az eredménye a PAI-k egyszeri vagy kisebb gyakoriságú, vagy kisebb dózisú beadása, a kezelés könnyűsége, valamint a meghosszabbított vagy késleltetett hatásai a dermatológiás állapotokra. A hordozó képes kibocsátani a PAI-kat, ha bármely olajos, zsíros, viaszos vagy nedves körülménynek tesszük ki a kezelendő területen, vagy diffúzióval, vagy kibocsátással, ami a PAI-knak a hordozókba bevitt mennyiségétől függ, ahhoz, hogy a PAI-k kibocsátását megkapjuk. Az ilyen hordozók lehetnek, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a liposzómák, a mikroszivacsok, mikrogömbök vagy természetes illetve szintetikus polimerekből készült mikrokapszulák és hasonlók. A megfelelő hordozók nedves körülmények között való folyamatos vagy késleltetett kibocsátásához megfelelő hordozók közé tartozik a zselatin, a gumiarábikum, a xantán polimerek; a bevitt mennyiségtől függő kibocsátáshoz alkalmas hordozók lehetnek a lignin polimerek és hasonlók, az olajos, zsíros vagy viaszos környezetben való kibocsátáshoz megfelelő hordozók lehetnek a termoplasztikus vagy flexibilis hőre keményedő műanyag vagy elasztomer, beleértve a termoplasztikus gyantákat, azaz például a polivinil-halidokat, a polivinil-észtereket, a polivinilidén-halidokat és a halogénezett poliolefineket, az elasztomereket, azaz például a brasiliensis-t, a polidiéneket és a halogénezett természetes valamint szintetikus gumikat, és a flexibilis hőre keményedő gyantákat, azaz például a poliuretánokat, epoxi gyantákat és a hasonlókat. A folyamatos vagy késleltetett kibocsátású hordozó előnyösen egy liposzóma, mikroszivacs, mikrogömb vagy gél.

A dermatológiai állapotok kezelésére használt, a találmány szerinti vegyületeket közvetlenül a kezelendő felületre visszük fel. Jóllehet nem szükséges, mégis kívánatos, hogy a topikális készítmények tartsák a PAI-kat a kívánt helyen legalább

24-48 óra hosszat.

Ha szükséges, akkor egy vagy több további adalékanyagot, amelyek szokványosán megtalálhatók a topikális gyógyászati vagy kozmetikai készítményekben, is betehetünk a hordozóba. Ilyen például a nedvesítőszer, áztatószer, illatmódosító, puffer, pigment, konzerválószer, vitaminok, azaz példáulaz A, C és E vitamin, emulgeálószer, diszpergáló ágens, nedvesítőszer, illatmódosító ágens, gélképző ágens, stabilizálószer, hajtótöltet, antimikrobiális ágens, napvédő, enzimek és a hasonlóak. A topikális gyógyászati készítmények területén átlagos jártassággal rendelkező szakember könnyen ki tudja választani a megfelelő specifikus addicionális adalékanyagokat és azok mennyiségét. Az addicionális adalékanyagok közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a szuperoxid diszmutáz, sztearil-alkohol, izopropil-mirisztát, szorbitán-monooleát, polioxietilén-sztearát, propilénglikol, víz, alkálifém- vagy alkáli földfém lauril-szulfát, metiiparaben, oktil-dimetil-p-aminobenzoesav (Padimát O), ursav, retikulin, polimukoszacharidok, hialuronsav, aloe vera, lecitin, polioxietilén-szorbitán-monooleát, A vagy C vitamin, tokoferol (E vitamin), alfa-hidroxi- vagy alfa-keto-savak, azaz például piroszőlősav, tejsav, glikolsavak, vagy bármely egyéb topikális adalékanyag, amely megtalálható a 4,340,586, 4,695,590, 4,959,353 vagy 5,130,298 és 5,140,043 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentésekben.

Mivel a kezelendő dermatológiai állapotok szabad szemmel láthatók, a topikális hordozó lehet egy topikális, kozmetikailag elfogadható hordozó. A továbbiakban a “topikális kozmetikailag elfogadható hordozó szakkifejezés alatt bármelyik, lényegében nem-toxikus hordozó értendő, amelyet általában kozmetikumok topikális alkalmazásában használnak, amelyekben a PAI-k stabilak és biológialag hozzáférhetők maradnak, ha közvetlenül a bőr felszínére visszük őket. A szakterületen jártas szakember számára ismertek a kozmetikailag elfogadható hordozók, ide tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat a kozmetikailag elfogadható folyadékok, krémek, olajak, öblítővizek, kenőcsök, gélek vagy szilárd anyagok, szépítőszerek és szépítőszer alapok, maszkok és hasonlók. így a toplikális kozmetikailag elfogadható hordozók hasonlóak, gyakran esetleg azonos természetűek, így a legtöbb előző, a gyógyászatilag elfogadható hordozókra vonatkzoó megjegyzés érvényes a kozmetikailag elfogadható hordozókra is. A készítmények tartalmazhatnak egyéb, a kozmetikában megszokott adalékanyagokat is, beleértve a parfümöket, ösztrogéneket, az A, C vagy E vitaminokat, az alfa-hidroxi- vagy alfa-keto-savakat, azaz például a piroszőlősavat, tejsavat vagy glikoisavakat, lanolint, vazelint, aloe vera-t, metil- vagy propil-paraben-t, pigmenteket és hasonlókat.

A dermatológiai állapotok vagy betegségek kezelésére használt készítményekben a PAI-k hatásos mennyisége számos faktortól függően változik, azaz például a bőr állapotától, a bőr korától, az adott PAI-tól, vagy a használt PAI tisztaságától, a készítmény és a hordozó adalékanyag típusától, az alkalmazás gyakoriságától, a kezelendő beteg általános egészségi állapotától és hasonlóktól függően. Az egyes betegeknél a használandó pontos mennyiség meghatározható a gyógyászatban jártas szakember számára, figyelembe véve az említett faktorokat és a jelen leírást. A készítményt előnyösen naponta legalább két dózisban de nem több mint hat dózisban adjuk be, vagy kevesebben, ha folyamatos vagy késleltetett felszabadulási formát használunk.

A topikális beadásra használt készítmények általában körülbelül 0,0001-90 tömegszázalékban tartalmazzák a PAI-kat, a készítmény össztömegéhez viszonyítva, előnyösen körülbelül 0,5-20 tömegszázalék PAI-t tartalmaznak a készítmény össztömegéhez viszonyítva, előnyösen körülbelül 2-5 tömegszázalék PAI-t tartalmaznak a készítmény össztömegéhez viszonyítva.

A topikális készítményeket úgy alkalmazzuk, hogy egy borítást vagy réteget viszünk fel a kezelni kívánt bőrre vagy nyálkahártyára. Az egyszerűség kedvéért a felvitt anyagot bedörzsöljük a felületbe. Azoknál a készítményeknél, amelyeket nem kell a bőrbe bedörzsölni, az réteget vagy a borítást éjszakán át a bőrön hagyhatjuk.

A jelen találmány tárgyát a transzdermális alkalmazáshoz megfelelő készítmények képezik, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a gyógyászatilag elfogadható borogatásokat, szuszpenziókat, olajakat, krémeket, kenőcsöket, lemosókat, géleket és liposzóma hordozókat, megfelelő hordozóban szuszpendálva, amelyhez előzőleg terápiásán hatásos mennyiségű PAI-t kevertünk. Az ilyen készítményeket közvetlenül a bőrre visszük, vagy egy védő hordozóba, azaz például egy transzdermális berendezésbe (az úgynevezett patch) tesszük. A megfelelő krémek, kenőcsök, stb. megtalálhatók például a Physician's Desk Reference című kiadványban. A megfelelő transzdermális berendezések leírása megtalálható például a 4,818,540 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban (Chien és mtsai).

A jelen találmány tárgyát képezik a parenterális beadásra alkalmas PAI készítmények is, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a gyógyászatilag elfogadható steril izotóniás sóoldatokat is. Az ilyen oldatok közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a sóoldat és a foszfáttal puffereit sóoldat, a PAI-k intramuszkuláris, intraperitoneális vagy szubkután injekciózásához.

• · · · · · • ··· ······ · • · · · · ·

A jelen találmány tárgyát képezik a gasztrointesztinális beadásra alkalmas PAI készítmények, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a gyógyászatilag elfogadható porokat, pirulákat vagy folyadékokat lenyelés céljára, és a kúpokat a rektális beadáshoz.

A jelen találmány tárgyát képezik a transzbronchiális és transzalveoláris beadásra alkalmas PAI készítmények, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a különböző típusú gyógyászatilag elfogadható aeroszolokat inhaláláshoz. Az areoszol formában beadott gyógyszerre példa a pentamidin, amit AIDS betegeknek adnak be inhalálás útján, hogy megakadályozzák a Pneumicystis carinii által okozott tüdőgyulladást.

A jelen találmány tárgyát képezik a PAI-k transzbronchiális és transzalveoláris beadására alkalmas berendezések. Az ilyen berendezések közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az atomizerek és a gőzölögtetők. A jelen találmány tárgyát képezik továbbá az elektromos vagy közvetlen injekciózásra alkalmas berendezések. Az elektromos injekciózás, vagy iontoforézis, az a folyamat, amely során kis elektromos áramot alkalmaznak töltött részecskéknek, vegyületeknek és gyógyszereknek a bőrbe való juttatására, azzal a céllal, hogy a gyógyászati készítményt bejuttassuk a lokális szövetbe vagy a teljes testbe, anélkül, hogy áttörnénk a bőrt.

A jelen találmány tárgyát képezik tovább a szervek átültetés előtti tárolására használt oldatok. A megfelelő oldatokat Chien és munkatársai ismertetik [Chien és mtsai: “Hibernation Induction Trigger fór Organ Preservation”, Medical Intelligence Unit, R.G. Landes Co. Austin TX (1993)]. A PAI-k például arra használhatók, hogy velük a jelenleg használt sokkal szennyezettebb szójakészítményeket helyettesítsük (azaz például a Soyacal-t).

• · • · ·

Az előzőkben említett készítményeket azzal a céllal ismertettük, hogy leírjuk, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, azokat a készítményeket,amelyek alkalmasak a találmány szerinti PAI-k beadására. A különböző készítmények előállítási módszerei a szakterületen jártas szakember számára ismertek, ezért az alábbiakban nem ismertetjük részletesen.

Az injekciózáshoz, topikális alkalmazáshoz, atomizáláshoz és elgőzölögtetéshez használt berendezések ismertek a szakterületen, ezért nem ismertetjük őket részletesen.

A találmány tárgyát képezik továbbá az apoptózis kezelésére szolgáló módszerek, amelyek során az apoptózis gátlására alkalmas mennyiségű PAI-t juttatunk be a szervezetbe. A különböző apoptózissal kapcsolatban álló indikációkat kezelhetjük a módszerrel, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a korosodás, rendellenességek és betegségek dermatológiai hatásait, az immunszuppressziót, a gasztrointesztinális zavarokat, a keringési rendellenességeket, az átültetett szövetek kilökődését és az Alzheimer betegséget.

Kiderült, hogy a PAI-kat topikálisan alkalmazhatjuk a bőrre, hogy ezzel számos különböző dermatológiai állapotot kezeljünk. Ezek közé az állapotok közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a zsugorodás, megereszkedés, a kor és/vagy a fénykárosodás, pszoriázis következtében. A jelen találmány tárgyát képezik tehát a dermatológiai állapotok kezelési módszerei. Továbbá a kopaszodást is okozhatja a hajhagymák sejtjeinek apoptózisa. Ennek következtében a PAI-k jól alkalmazhatók a bőr topikális kezelésére, hogy ezzel megelőzzük a további hajvesztést.

Amint azt az előzőkben tárgyaltuk, ezeket az állapotokat előnyösen kezelhetjük hatékony mennyiségű PAI-kat tartalmazó készítménnyel való kezeléssel. A PAInak az a hatékony mennyisége, amelyik enyhíti vagy csökkenti a dermatológiai álla• ·· ·· ·· · · • ··· ······ · • · · · · · ···· ·· ·· · ···«

- 2(1 potok tüneteit. A kezelés előnyösen a dermatológiai állapotok eltűnését eredményezi, vagy a normális bőrfunkciók helyreállását: azonban a tünetek bármely enyhítése vagy csökkentése a jelen találmány oltalmi körébe tartozik.

Az immunszuppresszióhoz kapcsolódó rendellenességeket számos különböző inger okozhatja, amelyek közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a vírusok, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a HIV-et, a kemoterápiás ágensek és a sugárzás. Ezek az ingerek indítják be számos rendellenességben az apoptózist, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az emésztőszervi szöveteket és a kapcsolódó gasztrointesztinális zavarokat.

A gasztrointesztinális zavarok közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a bélbevonat károsodását, a súlyos krónikus fekélyeket, kolítiszt, besugárzás okozta károsodást, kemoterápia okozta károsodást, a gasztrointesztinális rendszer paraziták által okozott zavarát és a bármely egyéb okú hasmenést. A különböző virális és bakteriális fertőzésekről közismert, hogy gasztrointesztinális zavarokat okoznak; a PAI-k alkalmasak arra is, hogy az ezekhez a fertőzésekhez kapcsolódó mellékhatások kezelésében használjuk őket. A PAI-k különösen jól használhatók a kemoterápia által okozott gasztrointesztinális zavarok enyhítésére. Amint az az alábbiakban ismertetett példákból látható, a metotrexáttal és különböző PAI-kkal kezelt patkányok kisebb táplálkozási problémákkal néztek szembe, és nem volt hasmenésük, ami megvolt a kontroll állatokban. A PAI-k tehát alkalmasak nemcsak a kemoterápiához kapcsolódó hasmenés, hanem a hányinger megelőzésére is.

A PAI-k különösen jól használhatók különböző gasztrointesztinális állapotok kezelésére állatokban, főleg szarvasmarhákban. Az ilyen állapotok, különösen a hasmenés számos borjú elvesztését okozzák. A gasztrointesztinális állapotok kezelését előnyösen gasztrointesztinális beadással végezzük. A borjak esetében a PAI-k • · · · · · • · · ···«·· · • · · · · ·· · · · ·«·· hatékony mennyiségét kényelmesen belekeverhetjük a tápba. Az emberek esetében a beadást végezhetjük bármelyik a szakterületen gasztrointesztinális beadásra használt módszerrel.

A PAI-kat emellett beadhatjuk immundeficiens betegeknek, főleg HIV-pozitív betegeknek, hogy megakadályozzuk, vagy legalább csillapítsuk a T-sejteknek az állapothoz kapcsolódó apoptotikus pusztulását,ami az immundeficienciák súlyosbodását okozhatja, amint azt a teljesen kifejlődött AIDS-ben szenvedő betegeknél láthatjuk. A PAI-k adagolását ezeknek a betegeknek előnyösen parenterálisan végezzük, de a beadás módja lehet transzdermális vagy gasztrointesztinális is.

A PAI-kat beadhatjuk azzal a céllal is, hogy a számos kondícióban, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a koszorúér eltömődést, agyinfarktust, gerincvelő/fej sérülést és az ezzel együttjáró súlyos bénulást; reperfúziós károsodásban, valamint az egyéb károsodás, azaz például fagysérülés okozta reperfúziós károsodásban, valamint bármely egyéb indikációban, amelyről korábban azt gondolták, hogy szuperoxid-diszmutázzal (SÓD) kezelhető, előforduló apoptózist kezeljük velük. Az oxigéngyökök szívbetegségekre gyakorolt hatásának összefoglalása megtalálható a szakirodalomban [Singal; Oxygen Radicals in the Pathophysiology of Heart Disease, Kluwer Academic Publishers, MA, USA (1988)].

A miokardiális és agyi infarktusokat általában az arteriális vagy vénás vérellátás hirtelen elégtelensége okozza, embólia, vérrög, vagy nyomás következtében, amely makroszkopikus nekrotikus területet hoz létre; a szív, az agy, a lép, a vese, a belek, a tüdő és a herék a legvalószínűbben érintettek. Apoptózis lép fel azokban a szövetekben, amelyek az infarktust veszik körül, a vérnek a területre való újabb beáramlását követően; tehát a PAI-k akkor hatékonyak, ha az infarktus beállásakor, a reperfúzió során, vagy röviddel azután alkalmazzuk.

- 2S

A találmány tárgyát képezik tehát a reperfúzióhoz kapcsolódó apoptózis kezelési módszerei, azzal jellemezve, hogy legalább egy PAI-ból terápiásán hatásos mennyiséget adunk be egy ilyen kezelésre szoruló betegnek.

A találmány tárgyát képezi továbbá a miokardiális és agyi infarktusokhoz kapcsolódó apoptózis és reperfúziós károsodás kezelési eljárása, olyan betegeknél, akiknél a szívroham és sztrók kockázata magas, azzal jellemezve, hogy legalább egy PAI-ból terápiásán hatásos mennyiséget adunk be egy ilyen kezelésre szoruló betegnek.

A reperfúziós károsodás kezelését előnyösen a találmány szerinti készítmények parenterális beadásával érhetjük el. Bármely egyéb megfelelő módszer alkalmazható azonban, beleértve például a közvetlen szívinjekciót szívinfarktus esetében. Az injekció beadására alkalmas berendezések ismertek a szakterületen, ilyen például az Aboject szívfecskendő.

A találmány tárgyát képezik továbbá a sejtek apoptózisának korlátozására és megelőzésére szolgáló módszerek emlős szervek, szövetek és sejtek tenyésztése vagy fenntertása során, hatékony mennyiségű PAI-k-nak bármely tápközeghez vagy oldathoz való hozzáadásával, amelyet emlős szervek, szövetek és sejtek tenyésztése vagy fenntartása során alkalmaznak.

A találmány tárgyát képezik tovább azok az emlős szervek, szövetek és sejtek fenntartására használt, a szakterületen ismert táptalajok és oldatok, amelyek legalább egy PAI-ból hatékony mennyiséget tartalmaznak, hogy korlátozzuk vagy megakadályozzuk a tenyészetben levő sejtek apoptózisát.

A találmány említett tárgyai olyan emlős sejttenyésztő táptalajokra vonatkoznak, amelyek hatékony mennyiséget tartalmaznak legalább egy PAI-ból, valamint vonatkoznak az ilyen táptalajok alkalmazására az apoptózis korlátozására vagy megelőzésére emlős sejttenyészetben. A PAI-król kiderült, hogy olyan körülmények ······ · • * · «

- 2‘) között korlátozzák vagy akadályozzák az apoptózist, amely körülmények között a sejtek a normálisan apoptózist serkentő enyhe traumának vannak kitéve. Ilyen trauma lehet, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az alacsony szintű besugárzás, a lefagyasztott törzstenyészet felolvasztása, gyors változás a hőmérsékletben, a pH-ban, az ozmolaritásban vagy a tenyésztő táptalaj ionkoncentrációjában, a tenyésztő táptalaj nem-optimális hőmérsékletének, ozmolaritásának vagy ionkoncentrációjának való ismételt kitétel, citokininekkel való érintkeztetés, a primer sejttenyészetek létrehozása során a sejtek leválasztása az érintetlen szövetről, szérum megvonás (vagy szérummentes táptalajon való szaporítás).

Tehát a találmány tárgyát képezik a szövettenyésztő táptalajt és legalább egy PAI hatékony mennyiségét tartalmazó készítmények. A szérummentes táptalajok, amelyekhez a PAI-kat hozzá lehet adni anti-apoptotikus táptalaj kiegészítőként, lehetnek az alábbiak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat: AIM V“ Media, Neuman and Tytell féle Serumless Media, Trovell féle T8 Media, Waymouth féle MB 752/1 és 705/1 Media és a Williams féle Media E. A szérummentes táptalajok mellett a megfelelő emlős sejtenyésztő táptalajok, amelyekhez a PAI-kat anti-apoptotikus tápkiegészítőként hozzá lehet adni, lehetnek az alábbiak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat: Basal Eagle Media, Fischer Media, McCoy Media, Media 199, RPMI Media 1630 és 1640, F-10 és F-12 Nutrient Mixtures alapú táptalajok, Leibovitz L-15 Media, Glasgow Minimum Essential Media és a Dulbecco Modified Eagle Media. Az emlős sejttenyésztő táptalajok, amelyekhez a PAI-kat hozzá lehet adni, tartalmazhatnak még bármilyen, a szakterületen ismert táptalajkiegészítőt, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat a cukrokat, vitaminokat, hormonokat, metalloproteineket, antibiotikumokat, gombaellenes szereket, növekedési faktorokat, lipoproteineket és szérumokat.

- .'ΊΙ

A találmány tárgyát képezik tovább az emlős szervek transzplantáció előtti fenntartására szolgáló oldatok, amelyek legalább egy PAI-ból hatékony mennyiséget tartalmaznak, valamint a találmány tárgyát kepezi ezeknek az oldatoknak az alkalmazása az apoptózis korlátozására vagy megakadályozására az ilyen emlős szervekben a sebészeti eltávolításuk és transzplantáció előtti kezelésük során. Mindegyik esetben az apoptózis korlátozására vagy megakadályozására szükséges PAIk koncentrációját a szakterületen jártas szakember tapasztalati úton határozza meg, azokkal a módszerekkel, amelyek például megtalálhatók a 2., 3. és 4. példában, valamint egyéb, a szakterületen ismert módszerrel.

Az is kiderült, hogy az előzőkben említett PAI frakciók egy bizonyos koncentrációban micellákat képeznek az oldatban. A találmány tárgyát képezik továbbá a micellákat tartalmazó készítmények is.

Az alábbi példákat a találmány illusztrálására és nem oltalmi körének korlátozására adjuk meg.

1. Példa

A PAI izolálása és tisztítása

Körülbelül 100 g kereskedelmi forgalomban levő szójalisztet (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO. USA és Central Soya, Archer Dániel Midlands) szuszpendálunk 70%-os acetonban, majd 30 percig szobahőmérsékleten kevertetjük. A lipidmentesített szójalisztet centrifugálással nyerjük ki (1500 x g, 10 perc). Ezt az anyagot szuszpendáljuk 1 liter 50%-os etanolban, majd 30 percig szobahőmérsékleten kevertetjük. A felülúszót, a vizes retentátot centrifugálással nyerjük ki (1500 x g, 10 perc).

A vizes retentátot ultraszűréssel töményítjük, majd az etanolt diaszűréssel távolítjuk el egy 10 kDa-os membránt alkalmazva (Amicon Beverly MA. USA). Ezt az • · · · ······ · • · · · · · anyagot visszük fel közvetlenül Sepharose S100HR-re (Pharmacia Biotechnology, Inc. Piscataway, N.J. USA), amit előzőleg 100 mmol/l ammónium-hidrogén-karbonáttal hoztunk egyensúlyba. Az A₂₈₀-on abszorbeáló anyag csúcsa az üres térfogatban eluálódik, ezt egyesítjük majd liofilezzük. A fagyasztva szárított nagy molekulasúlyú anyagot egyfázisú kloroform:metanol:víz (3:8:4) elegybe extraháljuk, az egyfázisú elegyet a megszárított anyaghoz adva, majd 30 percig szobahőmérsékleten kevertetve. Az elegyet azután centrifugáljuk, az oldhatatlan anyag eltávolítása céljából. Az oldhatatlan anyag egy lipid/glikolipid frakció,amely megtartja a PAI aktivitását. Ennek a frakciónak a jelzése L/G frakció. Az L/G frakció szénhidrát-összetétele arabinóz és galaktóz 3:2 arányban, minimális mennyiségben jelenlevő fukózzal, ramnózzal, glükózaminnal, glükózzal és mannózzal. A szénhidrát-összetételt meghatároztuk, az 5. példában leírtak alapján.

Az L/G frakciót tovább tisztíthatjuk a kloroform.metanol (80:20) keverékben való oldhatósága alapján, valamint szilikagélen végzett kromatográfiával (Silicic Acid, 100 mesh, Mallickrodt Chemical, Inc. KY). A szilikagél kromatográfiát metanollal végezzük, így kapunk egy aktív frakciót (SiMe).

A szójaliszt kivonat különböző tisztítási állapotaiban való fizikai és kémiai jellemzőinek részletes összefoglalása az 1. táblázatban látható, amelyben az “ND” jelentése “nem mutatható ki”.

Az 1. táblázatban a négy tisztítási lépésben kapott termékek aktivitása és fizikai jellemzőit határozzuk meg. A négy tisztítási lépés a következő: vizes retentát;

70%-os acetonos kivonat; a 70%-os acetonos üledék 50%-os etanolos kivonata; és az 50% etanolos frakcióból méretkizárásos gélszüréses kromatográfiával tisztított nagy molekulasúlyú frakció. A fehérjekitermelést a kiindulási anyag szárazsúlyára (gramm) számítjuk, a Bradford módszerrel mérve (BioRad Laboratories). Az antiapoptotikus aktivitást az anyagnak arra a számított koncentrációjára (pg/ml közeg) fejezzük ki, amely ahhoz kell, hogy a szérummentes kezelésből felszabadult sejtek 50%-át megmentsük (2. példa). A tripszingátlást relatív egységek per a mintában levő ug fehérje egységekben fejezzük ki. A relatív egységet (U) úgy határozzuk meg, mint azt a gátló aktivitást, amely 50%-kal csökkenti egy 100 umol-os szubsztrát 2 ug tripszinnel való hidrolízisének kezdeti sebességét 1 ml össztérfogatban. A 260 és 280 nm-en mért abszorbancia értékeket egy gramm kiindulási anyagra vetítve fejezzük ki, 1 ml sejtben. Ez megmutatja a jelenlevő relatív fehérje és nukleinsav koncentrációkat. A 260/280 arányt használjuk a jelenlevő nukleinsav mennyiségének megbecslésére [Dawson és mtsai: Data fór Biochemical Research, 3. kiadás, Oxford Science Publications (1990)].

1. Táblázat

A szójaliszt PAI kivonat fizikai jellemzése a tisztítás különböző lépéseiben

Fehérje koncentráció	Anti-apoptotikus qátlás aktivitás	Tripszin	A280	A260	Nukleinsav
Szójaliszt 196mg/g vizes kivonat	Gátló	0,561 U/pg	116/g	134/g	2,4%
Szójaliszt 140 pg/g 70%-os acetonos kivonat	Gátló	ND	4,5/g	7,2/g	11%
Szójaliszt 310 pg/g acetonos üledék 50%-os kivonat (AcE)	11 pg/ml	177 U/pg	32/g	36/g	ND
Szójaliszt 62 /.ig/g acetonos üledék 50%-os etanolos gélszürés pool (FAcE)	0,14 pg/ml	3,5 U/mg	10/g	12/g	ND
Szójaliszt 20 pg/g acetonos üledék 50%-os etanolos gélszürés pool szerves kivonat (L/G)	45 ng/ml	ND	8,4/g	9,1/g	ND
Szójaliszt 0,9 pg/g	12 ng/mf	ND	6,55/g	7.7/g	ND

acetonos üledék 50%-os etanolos gélszürés pool szerves kivonat szilikagél metanoloos eluátum (SiMe) • · · • ··· ······ · • · · · · V • · · · · · ·· · ····

- >4 2. Példa

Apoptózis vizsgálat CH3 10T1/2 sejtekkel

Ahhoz, hogy meghatározzuk a PAI-k apoptotikus aktivitását, az alábbi kísérletet végeztük el. A sejt esszé leírása a WO 9425621 számú PCT publikációban található meg. Röviden, a sejteket, a 8-as C3H 10T1/2 kiónt egybefolyó növekedési állapotában vizsgáljuk (1. ábra) az exponenciális növekedési fázisban, amikor a sejtciklus pozíciója véletlenszerű, és nincs a G_n fázisban leállt sejt (2. és 3. ábra), valamint nincs nyugalmi állapotban levő sejt (4. ábra). Az exponenciális növekedési fázist úgy biztosítjuk, hogy milliliterenként 2000 sejttel oltunk (5 ml egy 60 mm-es átmérűjü lemezre), öt nappal a kísérlet megkezdése előtt. T=0-nál a tenyészeteket szérummentes táptalajra visszük át, apoptózis serkentés céljára, majd magkivonatokat adunk hozzájuk. A kontrollok 10’⁷ mol/l 12-O-tetradekanoil-forbol-13-acetátot (TPA) tartalmaznak, hogy biztosítsuk a sejttenyészet válaszadását. Az etanolos extrakcióval és gélszüréssel előállított PAI mintákat hozzáadjuk a szérummentes közeghez 0,1 g szárazsúly ekvivalens értékben, majd a tenyészetekhez való hozzáadás előtt sterilre szűrjük. A vizsgálatokat három vagy négy párhuzamosban végezzük. A sejtválaszok elemzését a szérummegvonás, és/vagy a szójaliszt eredetű PAI-kkal végzett kezelés után 22-28 órával végezzük. Két vizsgálatot végzünk mindegyik sejttenyészet lemezen, amelyek eltérő sejtszámot tartalmaznak.

1. Minden nem tapadó vagy csak lazán tapadó sejtet eltávolítunk a tenyésztő lemezről, majd megfelelő technikák alkalmazásával megszámláljuk, általában elektromos részecskeszámlálót alkalmazva. Ezek az apoptotikus sejtek, a szérummegvonás miatt elszabadult (SDR) sejtek, amelyek a szérummentes közegben való tenyésztés következtében szabadultak el. Ezeknek az elszabadult sejteknek körülbelül 95%-a apoptotikus, amit mind az ultrastrukturális elemzés mind a DS fragmentációs elemzés igazol.

2. A megmaradt tapadó sejteket (ADH) puffereit, tipikusan pH=7,3-ra puffereit kiegyensúlyozott sóoldattal hozzuk érintkezésbe, azaz például a Hanks Balanced Salt Solution-nal, amely nem tartalmaz kalcium és magnézium sókat, de tartalmaz 0,05% tripszint és 0,53 mmol/l etiléndiamin-tetraecetsavat (EDTA). Mindegyik tenyészetet vagy szobahőmérsékleten vagy 37 °C-on inkubáljuk egy rázógépen, hogy biztosítsuk a tripszin reagens egyenletes eloszlását a tenyészet felszínén. Standardizált időtartam, azaz körülbelül 10 perc elteltével, a felszabadult sejteket eltávolítjuk mindegyik tenyészlemezről, és ugyanúgy megszámláljuk őket mint ahogy az előzőkben ismertettük, azaz általában elektronikus részecskeszámlálóval. Ez az

ADH sejtszám mind a tripszin-rezisztens mind a tripszin-érzékeny sejteket tartalmazza, amint az a WO 9425621 számú PCT publikációban le van írva.

Az apoptózis sejtvizsgálatokkal kapott eredmények az 1., 2., 3. és 4. ábrán láthatók. Az 1. ábrán az apoptózison átesett sejtek (SDR) százalékát és a tapadó sejtek (ADH) százalékát mutatjuk be egymástól elkülönülten. Az 1. ábra adatai azt igazolják, hogy a PAI-k hatékonyak az egybefüggő sejtek apoptózisának csökkentésében, a Basal Médium Eagle-vel (BME), a szérummentes kontrollal összehasonlítva.

A 2. ábrán az eredményeket PAI-kkal kezelt mintákban levő tapadó sejtek százaléka formájában fejezzük ki, a kontroll, azaz PAI-kat nem tartalmazó szérummentes mintában levő tapadó sejtek számára normalizálva. Másszóval, az apoptózistól PAI kezeléssel megmentett sejtek százaléka. A 2. ábrán bemutatott eredmények azt igazolják, hogy a szója PAI-knak koncentrációfüggő anti-apoptotikus hatásuk van a CH3 10T1/2 sejtekre az exponenciális növekedési fázisban.

A 3. ábrán az 50%-os etanolos extrakcióval kapott PAI-k (jobb oldal) és a méretkizárásos gélszűréses kromatográfiával tovább tisztított PAI-k (bal oldal) antiapoptotikus aktivitása látható. A 3. ábrán látható eredményeket az apoptózistól

- ?() megmentett sejtek százalékában fejezzük ki (ADH sejtekké konvertált SDR sejtek), PAI-kkal való kezeléssel, a PAI kezelést nem kapott kontroll mintákkal összehasonlítva, és ezeket mind a tripszingátló egységek függvényében fejezzük ki. A 3. ábrán bemutatott adatok azt demonstrálják, hogy ha a Bowman-Birk inhibitorok koncentrációját (amit a tripszingátlással mérünk) méretkizárásos gélszürési kromatográfiával csökkentjük, akkor a PAI-k anti-apoptotikus aktivitása megmarad. Tehát a PAI készítmények anti-apoptotikus aktivitása nem a Bowman-Birk inhibitorok jelenlétének köszönhető.

A 4. ábrán a szója PAI-k különböző koncentrációinak nyugalmi állapotban levő, cikloheximiddel kezelt C3H 10T1/2 sejtekkel szemben mutatott anti-apoptotikus aktivitása látható. Azok a nyugalmi állapotban levő sejtek, amelyek az apoptózisba kerülve már nem reagálnak a szérummegvonásra. Az apoptózis inkább serkentődik ezekben a sejtekben 10 pg/ml cikloheximidnek a C3H 10T1/2 sejtekhez adásával. Ezek a sejtek általában körülbelül egy hét alatt képeznek egybefüggő réteget tenyészetben és tenyészetben körülbelül két hét alatt kerülnek nyugalmi állapotba. A 4. ábrán látható eredményeket egy adott kezelés után életképesen megmaradt sejtek (ADH) függvényében fejezzük ki. A 4. ábrán látható adatok azt sugallják, hogy a szója PAI-knak van egy kis, de jelentős anti-apoptotikus hatásuk a nyugalmi állapotban levő C3H 10T1/2 sejtekre.

3. Példa

Apoptózis újszülött patkányok szív miocitáiban

A miocitákat egynapos patkányok szívéből állítjuk elő, a szakirodalomban ismertetett módszerrel [Circulation Research 56, 884-894 (1985)]. Röviden, az egyes sejteket szobahőmérsékletű tripszinizálás és mechanikus dezaggregáció rövid, alternáló ciklusaival állítjuk elő. A sejteket összegyűjtjük, mossuk, majd MEM-ben szuszpendáljuk, amely tartalmaz 5% borjúmagzat szérumot és 50 E/ml penicillin-G-t. A miocitáktól eltérő sejtekkel való szennyeződés csökkentésére a sejteket előszélesztjük 30 percre. A nem-tapadó szív miocitákat eltávolítjuk a tenyésztő lemezről, megszámláljuk egy hemocitométerrel, majd újra szuszpendáljuk a közegben, 600,000 életképes sejt/ml koncentrációban. A sejtszuszpenziót különböző tenyésztő lemezekre osztjuk szét, majd 16-24 óra hosszat 37 °C-on, 5% CO₂-t tartalmazó atmoszférájú inkubátorban inkubáljuk. A kitermelés 3-5 χ 10⁶ sejt/szív, az életképes sejtek száma tripánkék festéssel >90%.

A tenyésztés első napján a sejteket többször mossuk Minimál Eagle Médiummal (MÉM), hogy eltávolítsuk a törmeléket és a nem-tapadó sejteket. Majd az előzőkben ismertetett módon szérummal kiegészített táptalajjal kiegészítjük. A miocitákat a következő napon különböző állapotoknak tesszük ki RPMI 1640 táptalajban. A kapott eredményeket a 2. táblázatban mutatjuk be, ahol a PAI 1x jelenti a 0.1 g szójaliszt kiindulási anyagból kapott anyagot.

2. Táblázat

Újszülött kardiomiociták Ütésszám Sejtszám

Szérummentes + 11606

Kondicionált táptalaj +++++ 5128

PAI1x +++ 15062

Az eredmények azt mutatják, hogy a PAI frakció képes megőrizni a sejtek jó állapotát egy apoptózist indukáló bántalom esetében.

- 5S 4. Példa

A PAI szénhidrát-összetételének meghatározása

Ahhoz hogy meghatározzuk, hogy a PAI-k tartalmaznak-e szénhidrátot, a PAIk L/G frakcióját különböző körülményeknek tesszük ki, majd a kapott szénhidrátokat vizsgáljuk. A PAI-kat a Sigma Soy flour Lót No. 103H0820-ból állítjuk elő, amit az 1. példában leírtak alapján kezelünk PAI-k előállítása céljából. A kezeletlen PAI-kban levő szabad monoszacharidokat HPLC-vel határozzuk meg Dionex Carbopac™ PA1-en 16 mmol/l NaOH-ban, a 034441 számú Dionex dokumentumban leírt módon. A kapott eredményeket a 3. ábrán mutatjuk be. A mintát azután 2 mol/l TFA-val hidrolizáljuk négy óra hosszat 100 °C-on [Hardy és Townsend: Methods in Enzymology 230, 208-225 (1994)]. A mintát tovább hidrolizáljuk 6 óra hosszat 6 mol/l sósavval 100 °C-on, Hardy és Townsend módszerével [Hardy és Townsend:

Methods in Enzymology 230, 208-225 (1994)]. A kapott eredmények az 5. ábrán láthatók.

3. Táblázat

A PAI-kban kimutatott monoszacharidok

Monoszacharid	nq/25 uq PAI	nq/mq PAI
Arabinóz	1,098	45,9
Glükóz	0,058	2,36
Összesen	1,157	48,26

• · « · · ·«· ·«· « • · * «

4. Táblázat

Hidrolízissel felszabaduló monoszacharidok

Monoszacharid	nq/50 uq PAI	uq/mq PAI
Fukóz	1625	32,50
Arabinóz	4605	92,10
Galaktózamin	86	1,71
Glükózamin	478	9,56
Galaktóz	5280	105,60
Glükóz	352	7,04
Xilóz	520	10,40
Összesen	12946	258,91

5. Példa

A PAI-k alkalmazása a kemoterápia által indukált gasztrointesztinális rendellenességek megelőzésére

Ahhoz hogy meghatározzuk a PAI-k in vivő aktivitását, az alábbi állatkísérleteket hajtottuk végre. A 6. és 7. példában az állat-teszteket lényegében Fűnk és Baker leírása szérint hajtottuk végre [Fűnk és Baker: J. Nutr. 121, 1684-1692 (1991); Fűnk és Baker: J. Nutr. 121, 1673-1683 (1991)]. Röviden, Sprague-Dawley patkányokat használunk annak meghatározására, hogy az 1. példában leírtak alapján szójalisztből kinyert izolált AcE és L/G képes-e csökkenteni a metotrexát (MTX) toxicitását. A patkányokat egyenként tartjuk dróthálós fenekű rozsdamentes acél ketrecekben, majd 7 nappal az MTX injekció előtt a megfelelő étrendre állítjuk őket, és ezen az étrenden hagyjuk őket az injekció után hét napig. Az etetett táp félig tisztított patkánytáp volt, az alábbi adalékanyagokkal:

1. kazein

2. kazein és szójakoncentrátum (10 g és 10 g)

3. kazein és szójaliszt (10 g és 10 g) ···

- 40 * ·· ·« · · · « *·· «····« • · · · · ««·· «· «· * »

4. kazein és AcE

5. kazein és L/G

Az AcE-t és az L/G-t a szójalisztből extrahált mennyiséggel azonos mennyiségben használtuk.

A patkányok súlyát és a táplálékfelvételt feljegyeztük az injekciózás előtti periódusban. A patkányokat ip. injekciózzuk 20 mg/kg MTX-szel. A hétnapos injekciózás utáni periódusban feljegyezzük a patkányok súlyát, a felvett táplálék mennyiségét és a hasmenés előfordulási gyakoriságát. A patkányok súlyát és a táplálékfelvételt nem-paraméteres Kruskal-Wallis teszttel és post-hoc összehasonlítással vizsgáljuk. A P értéket többszörös összehasonlításhoz állítjuk be, 0,05-öt az összehasonlítások számával (10) osztva. Nem-paraméteres tesztet használunk, mivel a csoportok közötti variancia nem homogén, ezért a varianciák elemzésére tett feltételezések nem voltak jók. Az MTX injekciót követő táplálékfelvételt mindegyik állatnál az injekció előtti 3 nap átlagos felvételének százalékában fejezzük ki. így tehát mindegyik állat a saját kontrolljaként szolgál. Csak az MTX injekció utáni 3., 4., 5. és 6. napokat elemezzük statisztikailag. Ennek az az oka, hogy a 3. és 4. nap az a nap, amikor a toxicitás a legsúlyosabb, és az 5. valamint a 6. nap az a nap, amikor a felépülés megkezdődik. A hasmenéses adatokat mind Fisher's Exact Test-tel, mind loglineáris elemzéssel elemezzük.

Az eredmények azt mutatják, hogy a szójakoncentrátum és a szójaliszt kiindulási anyag valamint mind az AcE mind az L/G képes fokozni a táplálékfelvételt az MTX injekciót követően (5. táblázat és 7. ábra). A 3. napon a szójalisztet és szójakoncentrátumot fogyasztó patkányok táplálékfelvétele statisztikusan nagyobb volt, mint a csak kazeint vagy a kazeint L/G-vel kiegészítve fogyasztó állatoké. A kazeint AcE-vel fogyasztó patkányok táplálék-felvétele átmenetet képezett a 3. napon, és statisztikusan mindegyik csoportéhoz hasonló volt, kivéve a szójalisztet fogyasztó- ti • · · fc 9 9 w » * · · · · · · • *·* «·· ··» * * · · ··'· «· ·« t két. A 4. napon hasonló volt a helyzet, azzal az eltéréssel, hogy mivel az L/G-t fogyasztó patkányok táplálékfelvétele a 3. naphoz viszonyítva enyhén megnőtt, ezért ezek a patkányok statisztikailag nem tértek el azoktól a patkányoktól, amelyek szójakoncentrátumot fogyasztottak, jóllehet számszerűleg a táplálékfelvétel lényegesen alacsonyabb maradt. A felépülés nyilvánvaló volt az 5. és 6. napon, és a táplálékfelvétel statisztikailag hasonló volt mindegyik csoportnál. A súlyváltozás (6. táblázat) a várt mintázatot mutatja a táplálékfelvételben. A szójakoncentrátumot és szójalisztet fogyasztó patkányoknak jelentősen gyarapodott a testsúlyuk az MTX injekciót követő első négy napban. Az AcE-t, L/G-t vagy csak kazeint fogyasztó patkányok testsúlya kevesebbet nőtt, a csak kazeint fogyasztók testsúlya pedig statisztikusan kevésbé nőtt mint azoké, amelyek szójakoncentrátumot vagy szójalisztet kaptak. A hasmenés előfordulásában levő különbségek nem voltak statisztikailag jelentősek, de a hasmenés mintázata összhangban volt a táplálékfelvétellel és a súlyváltozással (6. táblázat). A szójakoncentrátumot vagy szójalisztet fogyasztó patkányoknak nem volt hasmenésük, míg néhány hasmenés volt megfigyelhető az AcE-t fogyasztó patkányoknál (10%) és közepes számú hasmenés volt megfigyelhető azoknál, amelyek L/G-t vagy csak kazeint fogyasztottak (30-40%).

Összefoglalva, ez a kísérlet azt mutatta, hogy a szójakoncentrátum és a szójaliszt adja a vizsgált komponensek közül a legjobb védelmet. A kazein AcE-vel együtt közepesnek bizonyult, de jobbnak bizonyult, mint amikor csak kazeint vagy L/G-t használtunk, amit igazolt a táplálékbevitel és súly jobb fennmaradása és a hasmenés kisebb gyakorisággal való előfordulása. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a szójából izolált vegyületek védelmet biztosíthatnak az MTX toxicitásával szemben. Ebben a kísérletben az L/G frakció ebben a koncentrációban láthatóan nem mutatott védelmet. A 7. ábrán azonban látható, hogy az L/G nagyobb koncentrációi hatékonyak.

- 42 • ··· · · · · • * · · co

..o

Q ro c

cd hcm +1

CD

OO

O

CO	uo	<o	o_
co	co	Tt	T“
Yl	Yl	4-]	+1
co	V“	LO
V—“	Od	cd	co
o	o	CO	CO

A táplálék és a metotrexát hatása a táplálékfelvételre

C

-ro rö cn ρ

(D

N

CD

-X ro rö rö j>

ro

S:

-ro jTO

Q ro

H

Q ro c:

cd

Q ro c

’sfQ ro c

cd

LO cd	LO	co	CD	co
	CM	cd	<d
Ή	+1	+1	+1	Yl
O	co	C\l	cd	co
co'	co'	CO'	co	LD
co	co	CO	co	r-

Oj	o _Ű	n ra	n ra
o	o_	o	CO	CM
co	co	o	o'	N
	T—	cd	T-	T—
Yl	Ή	H	-H	+1
CD	00	-ί-	CO	CO
cn		σο	co'	co'
co	co	co	CO	LO

ro CD	CJ n LO	CJ CO	_Ω ro CO	ro n-
T—	co'	st	cn	t—
Yl	+1	Ή	Yl	Yl
v—	co	o	CD	co
’Tt	•V	cd	CO	cd
co	co	co	CD

o ro cn

-ro ro

N ro st

C\J_ ro

4—» •ro

2>

ro

P •ro ρ

Q ro

Q.

ro c

CT

co	LO			C0_
σ'	o'	o	cd	o'
+i	+1	Yl	Yl	+1
	N-	co	uo	o
oo	co	[d	co	cd
T—	T—		T—	t—

o

LO o

LO •ro ρ

Q

-ro

H c

	ro	—.
	N	o
	ro	LO
	sz	o
	E	Y
	o	c
	-ro	'ro
		N
	rö	ro	LLI o <
	ro o c	sz 1 N	O Zj
	o	cn	1	1
C	JX		c	c
'ro	ro	rö	'ro	'ro
N	:o	:o	N	N
ro	N	N	ro	ro
X	ω	ω		Sí

cn	ω
O
σ
ro	N
c	ω
-ro	Φ
JZ	ω
ro	:—
sz o	ω Ξ
ΓΜ
N •o	rö sz
rö	cn
	Σ3
ro
'c.	Sí
Q_	lo' o_
—	o'
O	VI
•ra	Q_
X	—
ro L_	sz ro
o	c
ro	-ro
E
	rö
<	sz
	ro
c	sz
ro	-ro
σ -ro	•ro		rö ro
rö r~	-o		ro
E	N
o C*—	ro E		-rö CT	rö ro
cn -ro u. ro	ro ra		P •rö CL	Y •rö
rö	rö		ro c	sz P
σ	X			ro
_ ro σ	ro σ c		E o	N -ra N
c	·—~		•ro	cn
ro cn	Ό cn		sz	P
Ή	P		rö	-rö >
ct	Ό		ro	ro
ro	L_ •ro		cn	M—
*		-ro	-_£3
-ro	rö		σ ro	rö
sz	ό >		ro	ro
rö		XJ	cn
ro	ro		X	-ro
ro			H	ro
	c			N
	ro		ro
•ro	σ		N	SZ
CT ro	sz O		ra	ro
-ro	CL O		rö	rö
c -ro	N cn o		-ro > ro M—	rö > P
sz ro	N <		sz ro	sz -ro
CL			•ro	•ro
E	c	cn	CL	CL
-ro	-ro	-ro	P
σ	o	-ror
N	cn —T	c o	-4—< :O	c P
SZ	_) T3	cn ro	ro	rö
ro	;O		cn	cn
sz	c_	ro	•ro	-ro
-ro ro:	ro CL	N cn	ro N	ro N
-ro	cn	cn	ro	ro
N	-O	•CJ	sz	sz
<	rö -ro	o o σ	<	<
	Q.	f
	ro	ω
	T3	o
1—	ro	Q_	CM	cd

• ·· • · · · ro cn, jra ra p

o

O

CO

O ’T

A táplálék és a metotrexát hatása a patkányok testsúlyára (Λ •ro

N

O >

-ra ω

tn

Φ

C

Cü

E cn ra <

Q ra c

cd

I ’T

Q ro c

’t

I o

CT ld +1 co

CD n

UO

J3 ro +1

CM

CM +1 o

Ή hLD_ ’t

Ti co cd

ro	-Q	.Q	n m	X) ro
CO	LD	CD	r-	CD
ld	τ—”	5—	^r	LD
+	+ !	Ή	Ή	+1
CM	T—	r-	r^.	CT_
	CM	CM	r—	cd
	CM	CM	τ—

Ό

Φ tn

-Φ

Φ

N

Φ

LZ

-ra tn

		’T	CM	v-
’t	’T	’t	co	ld'
+1	+1	+1	+1	Ή
o	CM	CM	co	CT_
o	rA	|A	CJ	cm
CO	CM	CM	co	co
CM	CM	CM	CM	CM

O

CD

O

LD

c.

-Φ

Q

-ra l·—

Φ	,_.
	N	o
	ra	LD
	1	O
	E	LD
	ra	C
	-ro	Φ
		N
	c	ro	LLI cj <
	Φ o ra	l N	O Ej
	o	tn	1	1
c	JZ		c	c
Φ	ra	73	'φ	Φ
N	o	:o	N	N
ro	N	N	ro	ro
5Z	ω	ω	5E	y:

tn	(Λ
O	•Φ
CL	t .
ro	N
c	ω
-Φ	Φ
JC	ω
ro	'—
JtC ra N	ra <: I
M -o	“ra
'cj	co
	□
φ
[σ'
Q_	LD O
O	o
73	CL
X	---'
Φ	Φ
ő	c
	L_
Φ	'Φ
E
	φ
<
	Φ
c
ro	'Φ
JD	k_
-ro	'Φ
:σΓ E	Ό N
o	ra E
ω	ra
•Φ	4-4
Φ	ro
4—'	-*-*
Φ	φ
σ	X
	φ
ro	TJ
TTO	C
c
ra	•Ό
tn	tn
Ή	^Φ
CT	Ό
ro
	-Φ
-ra
	Φ
4—4	Ό
ra	>
Φ	_Φ
Φ	C
	ro
•ro	JD
CT	-X
ro	O
	CL
ro	o
	N
c	tn
•ro	O
	N
ro	<
CL
E	c	tn
•ro	•ro
JC	ra
N	tn	ra o
4—<	ra	tn
	TJ	ro
Φ	•o	ra:
-X	T_	Φ
•Φ	Φ	N
	CL	cn
•φ N <	tn •O ’cj •ro	tn :O CJ o raz
	Q.	i
	ro	to
	TJ	O
V.	ro	Q_

A kezelés előtti tetsúly az átlagos testsúlyt jelenti az injekciózás napján.

- -14 6. Példa

A PAI-k alkalmazása a kemoterápiával indukált qasztrointesztinális rendellenességek megelőzésére

Hím Sprague-Dawley patkányokat használunk annak meghatározására, hogy az izolált szójafrakciók (AcE, L/G és MAcE) különböző szintjei képesek-e enyhíteni a metotrexát (MTX) toxicitását. Az állatokat egyenként tartjuk drótháló fenekű, rozsdamentes acél ketrecekben. A patkányokat az MTX injekció előtt 7 nappal adaptáljuk a megfelelő étrendhez, majd az injekció után 7 napig ugyanezen a étrenden maradnak. A használt tápok félig tisztítottak, kazeint tartalmaznak, valamint az alábbi adalékanyagokat:

1. Nincs adalékanyag

2. AcE (100 mg/20 g kazein; 1X)

3. AcE (300 mg/20 g kazein; 3X)

4. AcE (1000 mg/20 g kazein; 10X)

5. L/G (10 mg/20 g kazein; 1X)

6. L/G (30 mg/20 g kazein; 3X)

7. L/G (100 mg/20 g kazein; 10X)

8. MAcE (100 mg/20 g kazein; 1X)

9. MAcE (300 mg/20 g kazein; 3X)

10. MAcE (1000 mg/20 g kazein; 10X)

MAcE (3000 mg/20 g kazein; 30X)

Meg kell jegyeznünk, hogy a MAcE-t szójamelaszból extraháljuk, ugyanúgy, mint ahogy a szójalisztet extraháljuk az AcE kinyerésére. Mindegyik étrendcsoportban 8 patkány volt, a csak kazeint kapó csoport kivételével, amelyben 10 patkány volt. A patkányok testsúlyát és táplálékfelvételét a preinjekciós periódusban ··· ··· ··· • « · « • · · · · • · · ·

- 45 feljegyeztük. A patkányokat IP injekciózzuk 20 mg/kg MTX-szel. A hétnapos posztinjekciós periódusban a patkány súlyát, táplálékfelvételét és a hasmenés előfordulási gyakoriságát feljegyeztük. Az egyes csoportok táplálékfelvételét a 8-10. ábrán láthatjuk. A hasmenés előfordulási gyakoriságát a 11. ábrán mutatjuk be. Az egész csoportra a patkánytáp felvétele a 12. ábrán látható. A patkánysúly és táplálékfelvétel adatokat ANOVA-val elemezzük, a kezelések faktoriális elrendezését alkalmazva, hogy ellenőrizzük a vegyület és a dózis fő hatását valamint a lehetséges kölcsönhatást a vegyület és a dózis között. Faktorelemzést végeztünk, az egyes vegyületeknek csak az 1X, 3X és 10X dózisainak felhasználásával. Emellett t-tesztet használtunk, hogy meghatározzuk a különbséget az egyes vegyületek 10X szintje és a csak kazeint tartalmazó étrend között. Az MTX injekciót követő táplálékfelvételt az egyes állatok az injekció előtti 3 nap alatt átlagosan felvett táplálékának százalékában fejezzük ki. így tehát mindegyik állat a saját kontrolljaként szolgál. Csak az MTX injekció utáni 3., 4., 5. és 6. napokat elemezzük statisztikailag. Ennek az az oka, hogy a 3. és 4. nap az a nap, amikor a toxicitás a legsúlyosabb, és az 5. valamint a 6. nap az a nap, amikor a felépülés megkezdődik. A hasmenéses adatokat Fisher's Exact Test-tel elemezzük. Az egyes vegyietekből csak a 10X szintet elemeztük statisztikailag kazeinnal szemben, a hasmanés előfordulás gyakoriságában levő különbségeket vizsgálva. Ennek az az oka, hogy a Fisher teszt egy konzervatív teszt. Ha többszörös összehasonlításokat teszünk, akkor a hibaarányt be kell állítani. Ahhoz, hogy fokozzuk a statisztikai szignifikancia esélyeit, csak azokat az összehasonlításokat végeztük el, amelyeknél az egyes vegyületekre a legjobb válasz jött létre, amit a táplálékfelvétel és a súlyváltozás adatai igazoltak.

A táplálékfelvétel és a súlyváltozás faktoriális elemzésének eredményeit a 7. és 8. ábrán mutatjuk be. Az eredmények azt mutatják, hogy az MTX toxicitás enyhítésében az AcE vegyület volt a leghatékonyabb. Az MTX dózis beadását követő 3.

··· ··· • · * - napon a legnagyobb táplálékfelvétel az AcE csoportoknál volt megfigyelhető, a másik két csoporttal összehasonlítva, és a 4. napon nagyobb maradt, mint annál, amelyben a patkányok MAcE-t fogyasztottak (P<0,05). Az AcE-t fogyasztó patkányoknál a MAcE-vel összehasonlítva a csökkent toxicitást tükrözik a súlymintázatok, mivel az AcE-t fogyasztó patkányok súlya többet nőtt az MTX beadása utáni első négy napban mint a MAcE-t fogyasztó patkányoké (P<0,05). A felvétel és a testsúly javulása megfigyelhető az egyes vegyületeket növekvő szintje mellett, a MAcE 30X szintje mellett, jóllehet ez nem szignifikáns statisztikailag. Az egyes vegyületeknek a legjobb választ adó szintje a 10X szint volt. Az egyes vegyületek 10X szintjét összehasonlítva a csak kazeint tartalmazó táplálékkal, az AcE statisztikailag nagyobb volt a beadás utáni 3.,4. és 5. napon (P<0,05). A hasmenés mintázata illeszkedett a táplálékfelvételi eredményekhez. A kazeint fogyasztó állatok 50 százaléka hasmenéses lett. A vegyületek 10X szintjét fogyasztó állatok közül egy sem lett hasmenéses, ami statisztikailag kevesebb, mint a csak kazeint fogyasztóknál megfigyelt eredmény (P=0,088). Mindegyik másik csoportban megfigyelhető volt valameny nyi hasmenés, a 3X AcE-t fogyasztók kivételével.

Következésképpen a vizsgált vegyületek közül az AcE enyhítette legjobban az MTX toxicitását. Az L/G és a MAcE pozitívan érintette az MTX toxicitást, amit igazol a hasmenés ritkább előfordulása a csak kazeint fogyasztó állatok csoportjával összehasonlítva, valamint a statisztikailag nem szignifikáns javulás a táplálék felvételében és a testsúly megmaradásában. Az lehetséges, hogy az AcE és az L/G további védelmet biztosít. A MAcE 30X szintje hatástalannak bizonyult, és erősen hasonlított arra, amikor csak kazeint esznek az állatok. Ebből kiderült számunkra, hogy ha egy határértéket elértünk, akkor onnan kezdve a magasabb szinteknek káros hatásuk van. Az lehetséges, hogy a MAcE hatásosabb valahol az ebben a kísérletben alkalmazott 10X és 30X dózisok között.

• · ·

7. Táblázat

Az étrend és a metotrexát hatása a táplálékfelvételre¹

Táplálékfelvétel a kezelés után (%)

CO

a.

co c

uh

Q.

CO c

Ν' cd

CO

-o ω

N

CD o

•cd

CD

M— JXÍ 'Φ uo Q •CO c

T3 c

CD •LLJ

cn	co	r--	co	co	co	cn	co	n-	o Cu	<o
UO*	Ν’	M·’	M-	co	tn	cn	Ν'	co	1—	rr
+l	4-I	Hl	+l	4-i	rl	+!	rí	+	+1
co	O_	CO	CO		CM	cn	CH	rT	co	rT
CO	co’	uh		uh	tn	cn	O	θ'	eh	θ'
cn	σ>	o	cn	o	o	o	O	o	co
				--						V-

M	CM
Cm	X-	o	r-
τ—	T-	co’	co
+1	+1	+1	+i
cn	CO	co_	co
oo’	τ—'	cm’	o’
uo	n-	cn	cn

Μ-

	co_	cn	o
	co’
+1		rl	Hl n-
uo	l<	cn
co	cm’	•τ—	co r^-
co	un

ΜΗ

CO o

co

o	00	H-	CD
cm		00		co’	m.
,—	.-	CD	T—	-<—	cd
+1	-Hl	+1	+1	+1	+1
co	CM	<—	CM	M
cd	eh	oh	cm	o	co
	H-	uo	co	N-	uo

Η

CO uh

Ν'

co cm 0^	co CM +1 cn	Ν- αό’ +1 uo	CO- θ’ T— +1 N·-	Ν’ eh + CM	co eh + CD
o’	x—~	Ν’	uo’	cm	co
uo	co	CO	Μ-	UO	CO

UO +1 uo	co cm +i co	o +1 Ν'-	CM oh +1 CM	Ν- αό Hl O	co eh Hl O-	CD oh +1 co	CM o +i co	Ν- οο +1 Ο-	co uo’ +1 Ν’-	o co +1 o
eh	r~·’	V-	co	o	co	o	ö	σο’	eh	o’
co	uo	CD	n-	Ν'	Ν’	CO	Ν'	CO	UO	co

CL

ra	uo	CO	rT	Ν’	N-	r-	co	H-	UO	Ν’	rT
c	o	o	ö	o	o	o	o’	CO	o	CD	o
'δ)	+1	+1	4-1	+1	+!	Hl	+1	+1	+!	+1	+1
	uo	r-	CM_	h-	CD	CO	CO	UO	CM	OO-	rT
	co’	cd	co	co’	h-’	CO	r-~	oo’	r-7	co	co
	t—	t—	T—	T—	t—	T—	T-	T—	T—	T—	T-

CO CO CO

CO CO 00

CO CO

CO

CM CO M UO CO 7 co eh

- 48 Φ

Φ

-φ

N

3X

CD

Φ 'cn φ

A számértékek formája átlag ± standard hiba, hím patkányoknál. A metotrexátot IP injekciózzuk egy hétnapos adapΦ

Έ •03

Φ ω

•ω φ

Ν

Φ

ΖΖ <

Φ

Φ

Ώ ;Ο

Ί_

Φ

α.

ω

Ο

α.

ω

Ε ο

ί_

-Ω

Ό

Φ ω

Ό

Φ

-Ω ν—<

X

Φ

Ο φ

Ε

Ίφ

-Φ j>

φ

Μ— -X -φ ΧΌ Ω. -03

Ό

Φ

Φ

-φ

Φ

Ν

Φ

ΖΖ <

ω '5 φ

φ φ

Ο ;Ο

S— φ

Ω.

Φ •Ο 'φ

2Ε

LU ο

<

Ω 'φ

Ν

-X

Φ •Φ

ÍQ

Ο

Ω 'φ Ν 03 -X 03

Ω

Ε

Φ

-Φ >

-τ- Φ

Ω

-4—<

Φ φ

-φ

Ν

Ε _φ φ

ra ra φ

•03

ΖΖ

-Φ

Ν •03

Ν φ

Φ

-Φ _>

φ •Ο

Φ

Φ •φ

Φ

Ν

Φ φ

·

-φ >

.Ω

U.

ο

α.

ο φ

ο

Ω 'φ

Ν

-X

Ω

Ε φ

φ •φ

2>

φ ν— .χ

-φ )03

Ω.

Ω φ

•Φ

Φ

Ν ω

Ώ£3

Ω φ

Ό φ

ω φ

-φ <

>

ο

Ζ <

ιω ο

σ' ν

ο_ ζζ φ

Ω δ

Ω_

Ο

Φ

Ο

LU ο

<

Ζ>

Φ

Ν ζΖ η

Ε

	;ro			φ
Έ	ο	ζζ 03		φ -φ >
φ	2 ts	Ω ζζ
φ		Ο		^φ
-φ	-*—>	Ε Ε
φ Ν Φ	Ν Φ Φ		ra
Φ	-ο Ν		φ φ
03 -Ω -Ω	Φ Φ X	ο ro		-φ φ Ν
Ο	Φ	ro .Ω		Φ
ΕΕ	Ω		ζζ
	03	Ι-		03
I	Ε $	Ο Ω.		4Φ .Ω
_	φ	Ο		Ο
•ra Ω	Ζ	Φ υ		ζζ
rz		.—		03
Ο	φ	CT,		Ω
L·.				i_
Ο	—ΐ	.—'	Ν	Ο
Ω_	ω	X	Φ	Ω.
Ο	ο	Φ	Ο
Φ	φ		I	Φ
Ο	-φ			Ο
LU Ο < )	< > Ο	LU Ο <	5? ο_ ο	1_U ο < )
Ω	Ζ	Ω	ν	Ω
’φ	<	'φ	Ω_	'φ
Ν		Ν	-—-	Ν
03	LO	03	ζζ	03
ζζ	Ο	rz	ra	ζζ
<	ο’	<	Ω ν'	<
	V Ω_		Ο
			ro

C\l •03

Ω ζζ

Ο δ

Ω.

C0 •03

-Ο

Ν

Ο

Ω '2

Φ

Φ

-Φ

Ν <—

Ω _Φ

Φ

Φ

Ε ο

+—I rz ra rz

Φ -*—<

Ν

Φ

Φ ν-* _Φ

Φ

Φ

Ζ

Φ

Ω

Ε $

φ ··· ·«···· · • · · · · • « ·· · ·«··

- 49 8. Táblázat

Az étrend és a metotrexát hatása a patkányok testsúlyára és a hasmenésre Súlyváltozás

Kezelés előtti A hasmanés

CO ro cn

-_ro □

σ

Ö

M—

Ό ω

Q ro c

CD

Xt

Cd

Q ro c

'T

I o

c

Ό

C ω

•LLJ

LO LO

LO pj LO O

L ί i-xl

LO

Ol

co	1^-	o	LO	CD	co	CN	N	o-	co	CN
y—	o~	CN	y—	T—	T-	r~	CN	T“
4-1	u-l	4-|	+1	+-I	+1	+1	FI	+1	co	—
CN	T“	CO	CD	CO	CN	CO	LO	CO	FI	FI
			-		-	-	-	-	CO	O
co’	X—	o'	o	Ν'	CN	5—	CO	—
						X—	T—			o n-

OO J_i	CD lo	o co*	N LO FI	D CO	CO CO	o lo’	co CN	co or	04 co’	N co
	Ή	+ 1	N	-H	4!	44	4-1	+!	+1	CO
T—„	CO	o		LO	co	co	o	LO	T—
CN	co’	co'	L \J	04	co’	cd	o	A	co	CN 1

LO	CN	CD	CO	O-	CO	LO	CO	CN	CO	CO
LD	of	CO’	co’	CN~	CO	ot	CO	co’	CN	CN
+1	+1	4-j	+1	+!	+1	+1	+1	+1	+1	+1
CN	LO_	A.	co	CO_	LO	CD	o-	-ί-	CN	CO
o	co	of	h-’	CN	LO	CN	of	Ο	LO*	cd
CN	co	CN	04	CO	CN	CO	co	CN	CO	04
CN	CN	CN	CN	04	04	CN	04	CN	CN	04

cococooocococoooooco

CN CO LO CD 1^- co cn • · · • · * * • *

Φ cn •Φ

N >>

CD

Φ, 'cn

CD

A számértékek formája átlag ± standard hiba, hím patkányoknál. A metotrexátot IP injekciózzuk egy hétnapos adap•ro cn fn

Φ cn

O cn _ro •ro

Ό

Φ •O

Ό

P, 'c

N ro •ro cn ín

Φ

Ό

Φ cn •Φ

Φ

N

Φ <

C •03 ro cn ro n

p

Φ

CL cn •g

Ό •ro o

cn o

CO

LU c

'φ

N

TO ro c

E c

-ro o

cn cn •ro g

x o

ro ro

N ro •ro cn ω

Φ ro

4—·

-a ro

1— ro

E cn

Φ

E c

ro .Ω

O

Aj •ro c

o

4—·

u.

o

CL o

cn υ

LU o

<

I c

Φ

N ro <

CM o

N o

ί_

TO

S o

CL

O ω

υ

X o

LU o

<

I c

'φ

N	•t—· N
ro	cn
14	Φ
<	1
c.	uo
~s	o
ro	o
	V
cn •Φ	CL
N
E	-ro
φ	c 14
φ	O
	4—»
<n	ro
p	üü
o	p
2 03 s—	N cn ro
	>.
_^_7	cn
N	o
tO	M—
Φ	4—<
	c
_ω	Φ
d	N
Φ	ro 14
l	14
ω	ro
c	cn
ω	o
E	ra
5
φ	c
z	E
c φ	cn •Φ
TJ	N
ro	cn
ω	Φ >
cn	p,
•Φ	•ro
<	cn
>	ín Φ
O
z	ro
<	—
	o
in	>
o_	10
co V cr	10 Φ cn
	X
üö	Üü
c	. c
14	14
o	o
	p
o
CL	ÜÖ

I φ

Ν

TO ro cn ο

ro c

E ro cn

-ro cn *L_ o

-X ro >S cn cn ρ

ro

Ό

1—

P p

Φ cn •Φ c

Φ

E cn ro ro φ

w

X o

1^V^- •ro c

o p

ÜÖ •o

N cn ro >, cn o

;Φ c

n cn

X o

Φ p

:ro >>

cn

Φ >

<

co

Φ cn

Φ c

Φ

E cn ro

1=

N cn

Φ o

ro x

Φ

Φ •Φ

M—

Φ ω

LL co co o_ o~

V rr ϊϋ c

o

4—· p

íö •ο

N cn ro >· cn o

7.Példa

A PAI-k alkalmazása az apoptózis gátlására HIV-vel fertőzött betegből nyert limfocitákban

A szójalisztből izolált PAI-k L/G frakcióját vizsgáljuk, hogy képes-e gátolni az apoptózist HIV-vel fertőzött betegből nyert limfocitákban.

Perifériális vér monocitákat (PBMC-k) nyerünk ki a betegből, majd standard módszerekkel izoláljuk. A PBMC-ket 2x1O'Vluk koncentrációban tenyésztjük 24-lukas lemezeken (Costar - Cambridge. MA) 72 óra hosszat 37 °C-on 5% CO₂-t tartalmazó atmoszférában, lukanként 2 ml RPMI 1640 táptalajban, amely antibiotikumokat és 10% hAB-t tartalmaz. Néhány tenyészet 10 ug/ml alkörmös mitogént (PWM) tartalmaz (Sigma, St. Louis, MO). A timocita szuszpenziókat közvetlenül az eltávolítás után használjuk fel, vagy pedig 18 órás, RPMI + 10% borjúmagzat szérumban (kiegészítve 5 pmol/l dexametazonnal, DEX) (Sigma, St. Louis, MO) való tenyésztés után. A sejteket három napra érintkezésbe hozzuk az L/G frakciókkal az alábbiakban ismertetett koncentrációkban, aholis a 0,5 gEQ frakció a 0,5 g kiindulási anyagból (liszt) származó frakció.

Sáv# PWM L/G

Nincs

Tisztított L/G - 0,5 gEQ/ml

Tisztított L/G - 0,05 gEQ/ml

Tisztított L/G - 0,005 gEQ/ml

Semmi

Tisztított L/G - 0,5 gEQ/ml

Tisztított L/G - 0,05 gEQ/ml

Tisztított L/G - 0,005 gEQ/ml

Kezeletlen patkány timociták (negatív kontroll) Dexametazonnal kezelt patkány timociták (pozitív kontroll)

123 bázispár méretű DNS standardok

A DNS-t extraháljuk, majd gélelektroforézist végzünk [Sambrook és mtsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual: Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]. Röviden, a sejteket centrifugálással nyerjük ki, majd 400 μΙ 50 mmol/l KCI, 10 mmol/l TRIS-HCI (pH=8), 1% NP-40, 1% Tween-20 és 0,5 mg/ml Proteináz K (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) összetételű oldatban lizáltatjuk 1 óra hosszat, 60 °C-on. Fenol-kloroformos extrakció és etanolos kinyerés után a

DNS-t egy 1,5%-os agaróz gélen futtatjuk (SeaKem, Rockland, ME) 90 mmol/l TRISBorát, 2,5 mmol/l EDTA (pH=8,3) összetételű pufferben, 50 volt feszültség mellett körülbelül 4 óra hosszat. Egy 123 bázispáros létrát (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) használunk DNS standard (DS) markerként. A géleket 1 ug/ml koncentrációjú etídium-bromiddal (Molecular Probes, Eugene, OR) festjük, majd desztillált vízzel eltávolítjuk a fölösleges festéket.

Az eredményeket a 13. ábrán mutatjuk be, ahol a sávok az előzőkben ismertetettek.

A kapott eredmények azt mutatják, hogy jelentős DNS fragmentálódás figyelhető meg a PWM stimuláció távollétében (1. sáv), és ezt a fragmentálódást majdnem teljesen gátolni lehet olyan tenyészetekben, amelyek 0,5 gEQ L/G-t tartalmaznak (2. sáv). Az L/G alacsonyabb koncentrációi (0,05 gEQ és 0,005 gEQ) nem gátolják a DNS fragmentálódást PWM távollétében (3. és 4. sáv), vagy PWM jelenlétében (7. és 8. sáv). A DNS fragmentálódás PWM jelenlétében (5. sáv) fokozódik a PWM nélküli tenyészetekhez viszonyítva. A DNS fragmentálódás enyhe gátlása figyelhető meg PWM jelenlétében ha 0,5 gEQ L/G van jelen (6. sáv), az 5. sávhoz viszonyítva. A negatív és pozitív kontrollok a várt módon működtek (10. és 11. sáv).

8. Példa

A PAI-k további tisztítása és jellemzése

A mintákat tovább tisztítjuk extrakcióval, az 1 példában leírtak alapján, majd szilikagél, diói és HPLC szilikagél kromatográfiát hajtunk végre, majd a termékeket elemezzük a kémiai összetétel, molekulasúly és szerkezet szerint. A szilikagél HPLC-nél az átfolyót és öt fő csúcsot figyeltünk meg.

Az átfolyó lizofoszfatidsavat tartalmaz, amit NMR-rel és ’³C elemzéssel határozunk meg. A zsírsav elemzés azt mutatja, hogy C16:0 és C18;2 keveréket kaptunk (hexadekánsav és 9,12-oktadekadiénsav) 60:40 - 50:50 arányban, a kiindulási szójaliszttől függően.

A kettes csúcsot foszfatidil-inozitnak azonosítottuk tömegspektrometriával, NMR-rel valamint TLC elemzésnél az autentikus standardokkal való együtt-vándorlás alapján. Emellett a zsírsav-elemzés a C16:0 és a C18:2 (hexadekánsav és 9,12oktadekadiénsav) hasonló arányát mutatta ki mindkét lehetséges pozícióban, 60:40 aránytól (ez a fő, és ez jellemző a szója foszfatidil-inozitra) 50:50 arányig, a csúcsban levő anyag pozíciójától függően (azaz a csúcs elején vagy a farkában találhatóe).

A hármas csúcs négy azonosítható zsírsavat tartalmaz: C16:0, C18:0, C18:1 és C18:2 variánsokat, azaz hexadekánsavat, oktadekánsavat, c/s-9-oktadekánsavat és 9,12-oktadekadiénsavat, 40:5:10:45 arányban, a legaktívabb 45:5:5:45 arányt tartalmaz. Emellett ez a csúcs egy azonosítatlan zsírsav komponenst is tartalmaz, amelyik 16,2-16,3 perces migrációs időnél jelenik meg, sokkal később mint a 16:0 (10,8 perc) és a 18:0, 18:1 és 18:2, amelyek 13,2 és 14,1 perc között jönnek le az oszlopról. Az azonosítatlan anyag a teljes zsírsavtartalom 50-68%-át tartalmazza. Tömegspektrometriás elemzéssel lizofoszfatidil-inozitot azonosítottunk, mind a 16:0 mind a 18:2 variánssal. Ez a csúcs tartalmaz még foszfatidil-inozitot is 16:0 és 18:

<1 r · · I · • k · · *« · · · · · · · zsírsavval az R1 és R2 pozíciókban. Három azonosítatlan, 861, 864 és 939-940 molekulasúly anyagot is találtunk.

A hármas csúcs a “D” jelzést kapta, főként ez található a szójaliszt kivonatban. A négyes csúcs a “B” jelzést kapta, ennek nincs anti-apoptotikus aktivitása.

Az ötös csúcs jelzése “L. és ez főleg a lecitinből származó anyagban található meg. Az ötös csúcs két azonosítható zsírsavat tartalmaz a C16:0, C18:0 variánsokból, azaz hexadekánsavat és oktadekánsavat 75:25 arányban. Emellett ez a csúcs tartalmaz egy azonosítatlan zsírsav komponenst is, amely 19-22 perces elúciós idővel jön le. Az azonosítatlan anyag a jelenlevő összes zsírsav 66%-át képezi. Tömegspektrometriát alkalmazva foszfatidil-inozitot azonosítottunk a 16:0 és 18:0 zsírsav variánssal. Két azonosítatlan anyagot is megfigyeltünk, molekulasúlyuk 113 és 191.

A zsrsavakat zsírsav-metilészterek formájában elemeztük. Az átészterező reagens a vízmentes HCI/MeOH volt, előállítását a szakirodalomban ismertetik [Christie: “HPLC and Lipids” (1987)], majd Christie leírása alapján elemezzük [Christie: Gas Chromatography and Lipids: a practical guide (1989)], mindkettőt az Oily Press Ltd. adta ki (Dundee, Scotland). Mindegyik mintához 300 μΙ CH₂CI₂-t és

700 μΙ HCI/MeOH-t adunk. A derivatizálást nitrogén alatt végezzük 18 óra hosszat szobahőmérsékleten. Ezután 1 ml vizet adunk hozzá, majd a mintákat 3x2 ml hexánnal extraháljuk. Az egyesített extraktumokat nitrogénáramban szárítjuk, majd újra oldjuk 100 μΙ hexánban és GC-MS edényekbe visszük át. A minták elemzését egy

Hewlett-Packard 5890 gázkromatográffal végezzük, egy Hewlwtt-Packard 5971 sorozatba tartozó tömegszelektív detektorral, van den Berg és munkatársai leírása alapján [van den Berg és mtsai: J. Lipid Rés. 34, 2005-2012 (1993)].

• »·· ·«···· · • * · · · · ··· ·· ·· 9 99 99

Elektropermet tömegspektroszkópiát (MS) alkalmazunk egy VG BloQ Triple kvadrupol tömegspektrométeren, elektropermet ionizációval negatív módban. A forrás hőmérséklete 80 °C, az oldószer metanol vagy metanol 0,05% ammónium-acetáttal kiegészítve, 5 μΙ/perc sebességgel, a kapilláris feszültsége 4,7 kV. A tömegspektrometria általános leírása megtalálható a szakirodalomban [Christie: “Gas Chromatography and Lipids: a practical guide, Oily Press Ltd. (Dundee, Scotland) (1989)].

9. Példa

Az ismert foszfolipidek anti-apoptotikus aktivitása

Ismert foszfolipid vegyületeknek vizsgáljuk az anti-apoptotikus aktivitását szérumtól mentes 10T1/2 sejteken, a 2. példában leírtak alapján. Minden kereskedelmi mintát 10 mmol/l koncentrációban oldunk (a vizsgálati koncentráció tízszerese) 1%os szarvasmarha szérumalbumin (BSA), 0.5 mmol/l kalcium-klorid összetételű oldatban, szobahőmérsékleten. Minden vegyületet 1% BSA-ban való előinkubálás után vizsgálunk meg. Az apoptózisban a BSA végkoncentrációja <0,01%. A BSA-val vagy a “B frakcióval, ami főleg Pl, való előinkubálás fokozta az LPA anti-apoptotikus aktivitását (14. ábra). Minden vizsgált anyagot a Sigma-tól szereztünk be. A BSA-t a Boehringer Mannheim-től szereztük be. A kapott eredményeket a 9. táblázatban és a 15. ábrán mutatjuk be.

VEGYÜLET

AKTIVITÁS ···· ·· ·· ····

9. Táblázat

L-a-lizofoszfatidsav, oleoil (C18:1, (cis]-9)

L-a-lizofoszfatidil-L-szerin L-a-lizofoszfatidil-kolin, Vl-os típus L-a-lizofoszfatidil-inozit L-a-lizofoszfatidil-etanolamin,

IV-es típus

L-a-foszfatidsav, dioleoil (C18:1. [cis]-9)

L-a-foszfatidil-szerin, szarvasmarha agyból

L-a-foszfatidíl-kolin V-EA típus L-a-foszfatidil-inozit L-a-foszfatidil-etanolamin, IV-es típus ++

Kulcs: ++ anti-apoptotikus aktivitás nincs aktivitás apoptotikus vagy nekrotikus hatás ** tömegspektrometriával azonosított'vegyületek, az aktív frakciókban találhatók meg.

Jóllehet a jelen találmányt illusztrációkkal és példákon keresztül bizonyos részletességgel ismertettük, a jó megérthetőség céljából, az nyilvánvaló a szakterületen jártas szakember számára, hogy bizonyos változtatások és módosítások megtehetők. Ennélfogva a leírásokat és a példákat nem tekinthetjük a találmány oltalmi köre korlátozásának, amit a mellékelt igénypontokban fogalmazunk meg.

Claims (41)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás egy anti-apoptotikus aktivitással rendelkező készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza;

   a) egy növényi eredetű port lipidmentesítünk egy lipidmentesítő ágenssel;

   b) a port elválasztjuk a lipidmentesítő ágenstől;

   c) a lipidmentesített port egy vizes oldattal extraháljuk; és

   d) a vizes oldatot elválasztjuk a lipidmentesített portól, vízmentes retentát előállítása céljából.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi eredetű port szerves oldószerrel extrahálva lipidmentesítjük, a szerves oldószert az alábbi csoportból választva: aceton, széntetraklorid, éter, hexán és kloroform.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi port a növény bármelyik részéből előállíthatjuk.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi rész egy raktározó szerv.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a raktározó szervet az alábbi csoportból választhatjuk: gumók, magvak és hagymák.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi por a leguminosae, solanum és allium növénycsaládba tartozó növényekből származik.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi por borsóból vagy szójabab magokból származik.
8. 8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi por burgonyagumókból származik.

   • · ·· * · • · · · · ·
9. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizes oldat egy vagy több vízzel elegyedő oldószert tartalmaz, az oldat 80%-áig terjedő koncentrációban.
10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizes oldat egy puffereit sóoldat.
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizes oldat egy foszfáttal puffereit sóoldat.
12. 12. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vízzel elegyedő szerves oldószereket az alábbi csoportból választjuk: acetonitril, alacsony szénatomszámú alkanolok, különösen az 1-4 szénatomot tartalmazó alkanolok, alacsony szénatomszámú alkéndiolok, 2-4 szénatomot tartalmazó alkéndiolok, valamint az alacsony szénatomszámú alkéndiolok polimerjei.
13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vízzel elegyedő szerves oldószer az etanol.
14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az etanol 50 százalékos koncentrációban van jelen.
15. 15. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy további lépést tartalmaz a visszamaradt vízzel elegyedő szerves oldószer eltávolítására.
16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a visszamaradt vízzel elegyedő oldószer eltávolítására használt lépés lehet dialízis, ultraszürés vagy liofilezés.
17. 17. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy lépést a vizes retentát szennyeződéseinek eltávolítására.
18. 18. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy lépést a készítménynek a vizes oldatban levő egyéb komponensektől való elválasztására, a vizes oldatot méretkizárásos gélszürés kromatográfiának vetve alá.

    ···

    - 59
19. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a használt kromatográfiás ágens lehet Sepharose vagy BioGel.
20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a használt kromatográfiás ágens a Sepharose S100HR.
21. 21. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy kromatográfiás puffért használunk, amit az alábbi csoportból választunk: 0,1-0,3 mol/l ammónium-hidrogén-karbonát vagy 0,1-0,3 mol/l nátrium-klorid, és 10-50 mmol/! foszfát semleges pH-n.
22. 22. A 21. igénypont szerinti puffer, azzal jellemezve, hogy a kromatográfiás puffer 0,1 mol/l koncentrációjú ammónium-hidrogén-karbonát.
23. 23. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a frakciókat összegyűjtjük a gélszűréses kromatográfia után, majd a 280 nm-en legnagyobb abszorbanciát mutató frakciókat egyesítjük.
24. 24. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a frakciókat összegyűjtjük a gélszűréses kromatográfia után, majd a 80 kDa-nál nagyobb molekulasúlyú anyagot tartalmazó frakciókat egyesítjük.
25. 25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a frakciókat összegyűjtjük a gélszűréses kromatográfia után, majd a készítményt tartalmazó frakciókat dialízissel és liofilezéssel tisztítjuk és töményítjük.
26. 26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve hogy tartalmaz egy lépést a vizes retentát extrahálására víz és szerves oldószerek egyfázisú elegyével, olyan vizes fázis előállítása céljából, amely tartalmazza a vizes fázist és egy szerves fázist.
27. 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy lépést a vizes retentát liofilezésére.

    «······ ·· • · · · ···«·· · * · · · · · ♦ ·· · ·« *· · ·*»·
28. 28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépéseket tartalmaz:

    a) a liofilezett anyag extrahálására szerves oldószerek és viz egyfázisú elegyével; és

    b) a glikolipid és foszfolipid tartalmú frakció izolálására, az oldhatatlan anyagot elválasztva az extraháló keverékből.
29. 29. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szerves oldószerek és a víz egyfázisú keveréke kloroformot, metanolt és vizet tartalmaz.
30. 30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kloroform, a metanol és a víz 4:8:3 arányban van jelen.
31. 31. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben szereplő elválasztást szűréssel vagy centrifugálással végezzük.
32. 32. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy szilikagél kromatográfiás lépést. kloroform:metanol elegy alkalmazásával.
33. 33. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy diói oszlopon végzett elválasztási lépést.
34. 34. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy szilikagél oszlopon végzett HPLC elválasztási lépést, átfolyó és öt frakció előállítására.
35. 35. Készítmény, amely tartalmazza a 34. igénypont szerinti módszerrel előállított átfolyót.
36. 36. Készítmény, amely tartalmazza a 34. igénypont szerinti módszerrel előállított átfolyót és kettes frakciót.
37. 37. Készítmény, amely tartalmazza a 34. igénypont szerinti módszerrel előállított hármas frakciót.

    ’ *

    - 6 1
38. 38. Készítmény, amely tartalmazza a 34. igénypont szerinti módszerrel előállított négyes frakciót.
39. 39. Készítmény, amely tartalmazza a 34. igénypont szerinti módszerrel előállított ötös frakciót.
40. 40. Eljárás anti-apoptotikus aktivitással rendelkező készítmény előállítására, amely a következő lépéseket tartalmazza:

    a) szárított borsók porának előállítása;

    b) a por lipidmentesítése 70 százalék acetont tartalmazó szerves fázissal, mikoris a szerves fázis térfogata hozzávetőleg ugyanannyi, mint a por súlya;

    c) az aceton elválasztása a lipidmentesített portól;

    d) a lipidmentesített por extrahálasa etanolt és vizet tartalmazó vizes fázissal, mikoris a vizes fázis térfogata hozzávetőleg ugyanannyi, mint a lipidmentesített por súlya;

    e) a vizes fázis elválasztása az extrahált növényi portól, vizes retentát előállítása céljából;

    f) az etanol eltávolítása a retentátból szűréssel; és

    g) az f) lépésben kapott por liofilezése.
41. 41. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy lépést a g) lépésben liofilezett termék extrahálására 4:8:3 arányban jelenlevő kloroform, metanol és víz egyfázisú eleggyel; és a lipid/ glikolipid/foszfolipid tartalmú frakció izolálására, az oldhatatlan anyagot centrifugálással elválasztva az extraháló elegytől.

    42. Az 1. igénypont szerinti 43. A 15. igénypont szerinti 44. A 17. igénypont szerinti 45. A 18. igénypont szerinti

    eljárással készített készítmény, eljárással készített készítmény, eljárással készített készítmény, eljárással készített készítmény.

    «*· ··· · · ' ♦

    - Λ2 46. A 32. igénypont szerinti eljárással készített készítmény.

    47. A 33. igénypont szerinti eljárással készített készítmény.

    48. Növényből vagy növényi termékekből származó apoptózis inhibitort tartalmazó készítmény, amely szobahőmérsékleten oldódik 50 százalék etanol/50 százalék víz elegyében, és lényegében oldhatatlan 70 százalék aceton/30 százalék víz elegyében.

    49. Növényből vagy növényi termékekből származó apoptózis inhibitort tartalmazó készítmény, amely szobahőmérsékleten oldódik vizes 60 százalékos ammónium-szulfát oldatban, és oldódik vizes 50 mmol/1 MgCI₂ oldatban.

    50. A 49. igénypont szerinti készítmény, amely stabil 2,5 és 11 közötti pH értékeken.

    51. Eljárás apoptózis kezelésére, azzal jellemezve, hogy egy ilyen kezelésre szoruló betegnek egy gyógyászatilag elfogadható készítményből terápiásán hatásos mennyiséget adunk be, amely az 1. igénypont szerinti készítményt tartalmazza.

    52. Az 51. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a beteg emésztőrendszeri zavaroktól szenved.

    53. Az 52. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az emésztőrendszeri zavarokat az alábbi csoportba tartozó ingerek okozzák: humán immundeficiencia vírus, kemoterápiás ágensek és besugárzás.

    54. Az 52. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelés csökkenti az immunszuppresszív vírusok, kemoterápiás ágensek vagy besugárzások által okozott immundeficienciát.

    55. Az 54. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vírus humán immundeficiencia vírus.

    ··«· *

    56. Az 55. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelés mérsékeli a T-sejteknek a humán immundeficiencia vírushoz kötődő apoptotikus pusztulását.

    57. Az 51. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a beteg reperfúzióhoz kötődő apoptózison esik át.

    58. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reperfúzió koszorúér elzáródáshoz, agyinfarktushoz, gerinc/agy sérüléshez és azt kísérő súlyos bénuláshoz, fagysérüléshez és bármely olyan indikációhoz kötődik, amelyről korábban azt gondolták, hogy szuperoxid diszmutázzal kezelhető.

    59. Az 58. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelés bármely olyan indikációhoz kötődik, amelyről korábban azt gondolták, hogy szuperoxid diszmutázzal kezelhető.

    60. Készítmény, amely egy szövettenyésztő táptalajt és legalább egy PAIból hatékony mennyiséget tartalmaz.

    61. A 60. igénypont szerinti készítmény, amelyben a szövettenyésztő táptalajt az alábbi csoportból választjuk: Basal Eagle’s Media, Fischer’s Media, McCoy's Media, Media 199, RPMI Media 1630 és 1640, F-10 és F-12 Nutrient Mixtures alapú táptalajok, Glasgow Minimum Essential Media és Dulbecco’s Modified Eagle Media.

    62. A 60. igénypont szerinti készítmény, amelyben a szövettenyésztő táptalaj szérummentes.

    63. A 62. igénypont szerinti készítmény, amelyben a szérummentes szövettenyésztő táptalajt az alábbi táptalajok közül válsztjuk ki: AIM V” Media, Neuman and Tytell’s Serumless Media, Trovell’s T8 Media, Waymouth’s MB 752/1 és 705/1

    Media és Williams’ Media E.

    64. Eljárás apoptózis megakadályozására tenyésztett sejtekben, azzal jellemezve, hogy a sejteket a 60. igénypont szerinti készítménnyel kezeljük.

    • · · · · ··· ··· ·«· • 9 · «· ·· · «···

    65. A 64. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek emlős sejtek.

    66. A 65. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek emberi sejtek.

    67. A 64. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek szövet részei.

    68. A 64. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek egy szerv részei.

    69. Eljárás transzplantációra használt szervek konzerválásának javítására, azzal jellemezve, hogy legalább egy PAI-ból hatékony mennyiséget adunk ahhoz az oldathoz, amelyben a szervet tároljuk.