본 발명은 산양유와 양하 추출물을 함유하는 아토피 피부용 화장료 조성물에 관한 것이다.
산양(goat)이란 염소라고도 불리고, 젖을 이용하는 유용종, 고기를 이용하는 육용종 그리고 겸용종이 있다. 흑염소는 육용종이며, 젖을 주로 사용하는 유산양은 유용종이다. 산양유란 염소에서 짜낸 젖으로, 성분은 수분 88.0 %, 단백질 3.1 %, 지방 3.6 %, 젖당 4.5 %, 회분 0.8 %이다. 열량은 100 g당 62 kcal이며, 우유보다 단백질·지방·회분이 많고 단백질 중에서는 알부민의 비율이 높다. 산양유의 지방입자(脂肪粒子)는 작아서 연한 커드(curd)를 이루어 소화율이 높으며, 카로틴이 우유보다 적으므로 빛깔은 희게 보인다. 우유류의 단백질원인 카제인 마이셀(Casein Micelle)은 알파S-1 카제인, 베타카제인, 감마카제인의 세 요소로 구성되어 있다. 산양유에는 일반 우유와 달리 베타 카제인이 주 구성요소이다. 사람의 인체 내로 산양유나 우유가 들어갈 때 단백질의 필수 아미노산을 비롯한 여러 아미노산의 연결고리에 효소(Protease)가 침투하여 분해해야만 원활한 소화가 이루어지는데, 이 때 크기가 큰 우유의 카제인 마이셀은 분해되기 힘든 반면, 산양유의 카제인 마이셀은 크기가 작아 효소가 침투하여 분해 작용을 하기 용이하여 소화가 잘 이루어진다. 또한 산양유에는 우유와 달리 알파S-1카제인이 거의 없어 부드럽게 소화된다. 우유를 원료로 한 일반 조제분유와 달리 산양유로 만든 산양분유는 모유와 성분이 비슷해 특히 알레르기 질환이 있거나 소화율이 낮은 아기들의 대용식으로도 좋다. 산양유에 함유되어 있는 철분과 아연은 흡수가 잘 되고 생체 이용률이 높아 성장 발달을 도와 줄뿐 아니라 항산화 성분 셀레늄이 우유보다 27% 많이 함유돼 있다. 모유는 갓난아이에게 완전식품이기 때문에 단백질의 영양학적 가치 평가는 모유 단백질의 조성과 비교하는 것이 현실적인 방법이라 할 수 있다. 그런 면에서 산양유는 모유와 가장 가까운 식품으로 사람의 인체에 가장 적합한 식품이라 할 수 있다. 한국 ·일본에서는 각 가정에서 음용(飮用)하는 것이 대부분이지만, 지중해 연안에서는 산양유는 양(陽) 의 기운이 강한 대표적인 식품으로 양기를 돋우고 신(腎)에 좋은 식품으로 알려져 있으며 양의 기운이 약한 노약자, 환자들에게 권장하는 식품으로 알려져 왔다. 그래서 예로부터 산양유를 “가난한 자의 젖”이라 불렀으며 인도의 간디는 오랜 단식 후 몸의 회복을 위해 항상 산양유를 마셨다고 한다.
양하(Zingiber mioga ) 는 생강과 식물로 아시아 열대 지방이 원산지이다. 뿌 리줄기는 옆으로 벋고 비늘 조각 모양의 잎으로 덮여있다. 잎은 바소꼴 또는 긴 타원 모양이고 밑 부분이 잎집으로 되어 서로 감싸면서 줄기 모양으로 자라 높이가 40∼100cm에 달한다. 꽃은 8∼10월에 황색으로 피고 지름이 5cm이며 꽃줄기에 긴 타원 모양의 꽃차례를 이루며 달린다. 꽃줄기는 뿌리줄기 끝에서 비늘 조각 모양의 잎에 싸여 나오고 길이가 5∼7cm에 달한다. 포는 좁은 달걀 모양이고 끝이 뾰족하다. 꽃받침은 통 모양이고, 화관은 3개로 갈라진다. 입술꽃잎은 3개로 갈라지고 갈라진 조각 중 가운데 것이 가장 크며, 수술은 1개이다. 꽃이 피기 전의 꽃줄기를 식용하고, 봄에는 잎이 피기 전의 줄기를 식용한다. 한방에서는 뿌리줄기와 종자를 약재로 쓰는데, 뿌리줄기는 여성의 생리불순과 백대하를 치료하고 진해·거담 효과가 있으며 종기와 안구 충혈에도 사용한다. 종자는 복통이 심할 때 설탕과 물을 넣고 달여서 복용한다.
상기 조성물을 화장료 조성물에 사용하는 경우에는, 상기한 산양유 및 양하 추출물의 유효성분 외에 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함한다. 예를 들어 점증제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장품은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 그 자체가 식품에서 유래한 것으로 독성 및 부작용이 거의 없어 화장품 재료로서 안전하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 양하를 추출하여 얻은 건조 추출물을 살균된 산양유와 혼합함으로써 제조할 수 있다.
양하 추출물의 제조방법은 다음과 같다. 먼저, 건조된 양하를 중량에 대하여 추출 용매로서 물이나 무수 또는 함수 에탄올, 부탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 용매를 5-20배를 가한다. 이를 냉각 콘덴서가 장착되어 용매가 증발되는 것을 방지한 상태에서 50-95℃에서 3-20시간 가열하여 추출하거나, 또는 5-37℃에서 1-15일간 침적시켜 유효성분을 추출하는 방법을 사용할 수 있다. 이렇게 추출한 양하 추출물을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치를 이용하여 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 완전히 감압 농축한 후, 동결건조 또는 분무 건조하여 건조 추출물을 얻는다. 양하 추출물은 전체 추출액에 대한 고형분 환산으로 0.01 내지 10.0 (w/v)%의 넓은 범위에서 적절히 선택하여 제조될 수 있으며, 바람직하게는, 0.1 내지 5.0(w/v)%의 양으로 포함될 수 있다.
산양유는 산양 목장에서 얻어진 산양유를 통상적인 우유의 저온살균법을 사용하여 살균한 후 냉각시킨다. 살균된 산양유를 활성탄 등을 이용하여 화장품에 첨가시 문제로 될 수 있는 산양유 특유의 취와 피부에 자극을 줄 수 있는 염 등을 제거한다. 그 후 마이크로 플루다이저 등을 이용하여 더욱 피부에 흡수되기 좋게 균질화하여 양하 추출물과 일정비율로 섞어 혼합 추출물을 제조할 수 있다.
산양유와 양하 추출물의 혼합물은 화장료 처방시 조성물 총 중량을 기준으로 1-10%의 넓은 범위에서 적절히 선택하여 포함시킬 수 있다.
본 발명에 의한 화장료 조성물은 아토피성 피부염에 의한 가려움이나 염증을 일으키는 제1형 알러지를 억제하는 효과가 뛰어날 뿐만 아니라, 피부발적, 피부 건조, 홍반 등의 피부에 대한 자극이 없어 안전하게 사용할 수 있으며 화장료 배합시 보존 안정화가 쉽다.
아래의 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 설명하나, 본 발명의 내용이 여기에 한정되지는 않는다.
<실시예>
실시예
1-1. 양하 추출물 제조방법
완전 건조시킨 양하 500g 을 증류수 10kg에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 5시간 끓여 추출하였다. 그 후 추출물은 400 메쉬 여과포로 여과하고 상온으로 냉각한 후, 5-15℃에서 7일간 방치하여 숙성시킨 후 와트만 2번 여과지로 여과하였다. 이 추출물을 0.45㎛ 의 필터로 여과한 후 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압 농축하여 20.2g(건조중량)을 얻었다.
실시예
1-2~1-7
하기 표1의 용매를 사용하고 실시예 1-1과 동일한 방법으로 추출하여 그 결과를 하기 표 1에 기재하였다.
용매 조성에 따른 양하 추출물 및 그 수율
|
추출용매 |
고형분(%) |
수득량(g) |
실시예 1-1 |
증류수 |
1.98 |
480 |
실시예 1-2 |
에틸알코올 |
2.0 |
473 |
실시예 1-3 |
30% 함수 에틸알코올 |
2.4 |
498 |
실시예 1-4 |
부틸렌글리콜 |
2.6 |
495 |
실시예 1-5 |
30% 함수 부틸렌글리콜 |
2.5 |
479 |
실시예 1-6 |
프로필렌글리콜 |
2.12 |
472 |
실시예 1-7 |
30% 함수 프로필렌글리콜 |
2.1 |
474 |
실시예
2
산양유
제조 방법
강원도 대관령에서 얻어진 산양유 50L를 65℃에서 30분간 살균하여 4℃로 냉각시킨 후, 여기에 80-100 mesh(알드리치사) 크기의 활성탄 50g을 넣어 1시간동안 교반하여 준다. 활성탄과 잘 섞인 산양유를 10,000 rpm에서 원심분리 후, 0.8㎛, 0.4㎛, 0.2㎛ 및 0.1㎛ 입자 크기의 여과지를 사용하여 순서대로 여과하였다. 여과된 산양유를 마이크로플루다이저를 사용하여 1,000bar의 압력으로 3회 반복하여 균질화시켜 45.2L의 균질화된 산양유를 얻었다.
예비
실험예
1.
여러 용매로 추출한 양하 추출물의 아토피 피부염의 예방 및 완화효과를 알아보기 위해 진피를 배양하여 자극을 유발시킨 후 각 부위별 추출물의 IL-1α의 방출양을 알아보았다. 이 중 가장 좋은 활성을 나타낸 추출용매의 양하 추출물을 산양유와 혼합하여 사용하였다.
IL-1α(interleukin-1α)는 전염증 작용인자 (pre-inflammatory mediator)로 작용하는 세포간 신호물질 (cytokine)로 상처 (wound)의 재상피화(re-epithelialization)의 잠재적인 유도체로서 작용할 뿐만 아니라 알레르기 반응과 염증성 반응 조절인자로서 백혈구 운동을 촉진시키는 leukotriene B4, 5-, 12-, 15 HETE 같은 arachidonic acid lipoxygenase metabolites 생산을 증진시키는 것으로 알려져 있다.
TypeⅠ collagen matrix (Bioland, Korea)와 5배로 농축된 DMEM(Dubelcco's Modified Eagle Medium, GIBCO BRL, USA), 그리고 2.2% NaHCO3와 200mM HEPES, 0.05N NaOH로 제조된 완충용액을 7:2:1로 섞어 만든 human fibroblasts cell line(ATCC, American Type Culture Collection, Cat. No. CRL-2076) 을 density 1×105 cells/ml로 혼합하여 직경 10mm의 insert에 각 각 200㎕의 피브로블라스트(fibroblasts)가 혼합된 콜라겐 용액을 넣어 진피를 제조한다. 진피 제조 후 10% FBS를 함유하는 DMEM를 2일마다 교체하여 7일간 배양한다. 배양된 진피 위에 10 ㎕의 피부자극물질 (SLS : sodium lauryl sulfate)을 투여하고 4 시간 뒤 각각의 추출물을 10 ㎕ 적용한 후 37 ℃, 5% CO2에서 24 시간 동안 배양한다. IL-1α는 배지 표본을 취하여 Human IL-1α assay kit (Endogen Inc. Boston, MA, USA)을 이용하였으며 ELISA-reader (enzyme-linked immunosorbent assay)로 450 nm에서 측정하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.
진피에서의 항염증 효과
예비 실시예 |
추출 용매 |
반응액중에 함유시킨 추출물의 최종농도(㎍/ml) |
IL-1α 방출량(pg/ml) |
SLS(염증유발물질) |
|
0.07% |
89.7 |
예비 실시예 1 |
증류수 |
100 |
66.5 |
예비 실시예 2 |
에틸알코올 |
100 |
73.9 |
예비 실시예 3 |
30% 함수 에틸알코올 |
100 |
69.3 |
예비 실시예 4 |
프로필렌글리콜 |
100 |
69.6 |
예비 실시예 5 |
30% 함수 프로필렌글리콜 |
100 |
63.9 |
예비 실시예 6 |
부틸렌글리콜 |
100 |
67.3 |
예비 실시예 7 |
30% 함수 부틸렌글리콜 |
100 |
59.8 |
산양유와
양하 추출 혼합물의 제조
산양유와 양하 추출물을 표3과 같은 혼합비로 섞은 후 아토피 피부염의 예방 또는 완화 효과를 측정하였다.
산양유와 양하 추출 혼합 비율
실시예 |
추출물의 혼합비율(%) |
산양유 |
양하 추출물 |
실시예 1 |
0 |
100 |
실시예 2 |
10 |
90 |
실시예 3 |
20 |
80 |
실시예 4 |
30 |
70 |
실시예 5 |
40 |
60 |
실시예 6 |
50 |
50 |
실시예 7 |
60 |
40 |
실시예 8 |
70 |
30 |
실시예 9 |
80 |
20 |
실시예 10 |
90 |
10 |
실시예 11 |
100 |
0 |
실험 예 1
. 마우스
귀부종에
대한 항염증 실험
산양유와 양하 추출 혼합물에 대한 항염증 효과를 알아보기 위하여 마우스 좌측귀를 대조부위, 우측귀를 시험부위로 하여 시료를 적용 전 에탄올로 귀를 깨끗하게 세척하고, 시료 20㎕를 1일 1회 4일간 지속적으로 도포하고 마지막 도포 1시간 후에 좌측귀에 에탄올을 우측귀에는 아라키돈산(Arachidonic acid)을 2㎎/ear을 도포하여 1시간 후 귀부종(ear edema)정도를 마이크로미터로 양쪽 귀를 3회씩 반복 측정하였다.
항염효과는 아라키돈산(Arachidonic acid) 처리군을 기준으로 부종억제 정도로 판정하였으며 그 결과를 표5에 나타내었다.
※ 억제율(%) = (A―B) / A × 100
A : 대조군귀의 평균두께(아라키돈산 처리귀의 두께-비처리 귀의두께)
B : 시료도포군 귀의두께(시료처리귀의 두께-비처리귀의 두께)
산양유와 양하 추출 혼합물의 국소적용에 의한 귀두께 및 염증 억제율
시료 |
시료 처리 량 |
용매 |
귀두께(㎛) |
억제율(%) |
시료처리전 |
시료처리후 |
Indomethacin |
1.0㎍/ml |
에탄올 |
284 |
421 |
45.6 |
아라키돈산 |
2㎎/ear |
에탄올 |
299 |
551 |
- |
실시예 1 |
100㎕ |
에탄올 |
284 |
505 |
12.4 |
실시예 2 |
100㎕ |
에탄올 |
294 |
511 |
13.8 |
실시예 3 |
100㎕ |
에탄올 |
295 |
503 |
17.4 |
실시예 4 |
100㎕ |
에탄올 |
295 |
498 |
19.6 |
실시예 5 |
100㎕ |
에탄올 |
263 |
466 |
19.5 |
실시예 6 |
100㎕ |
에탄올 |
279 |
495 |
14.3 |
실시예 7 |
100㎕ |
에탄올 |
288 |
499 |
16.4 |
실시예 8 |
100㎕ |
에탄올 |
284 |
487 |
19.3 |
실시예 9 |
100㎕ |
에탄올 |
283 |
472 |
25.0 |
실시예 10 |
100㎕ |
에탄올 |
296 |
497 |
20.2 |
실시예 11 |
100㎕ |
에탄올 |
279 |
477 |
21.4 |
실험예
2.
면역세포의 생육활성 측정
MTT assay는 살아있는 세포의 수를 측정함으로써 세포 증식이나 독성에 많이 사용되는 실험법으로, 살아있는 세포는 미토콘드리아 내에서 수용성이고 노란색의 염인 MTT(3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)가 숙신산탈수소효소에 의해 수불용성인 파란색의 formazan 유도체로 환원되는 원리를 이용하는 것이다. 생성된 formazan 유도체는 용해제를 넣고 용해시킨 후 흡광도를 측정한다. 좀 더 자세히 설명하면, 사람 면역세포인 Raji(Human B cell)과 Jurkat(Human CD4+ T cell)을 MTT(3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5- diphenyltetrazolium bromide) assay를 이용하여 실시하였다. 세포의 생육은 RPMI1640(GIBCO, USA) 배지에서 10% FBS를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 면역세포 생육활성 측정은 24well plate에 세포농도를 4x104 cells/ml로 하여 배양 24시간 후 각 시료를 농도별로 적용한다. 48시간 배양 후 각각의 well에 있는 배지를 버리고 MTT 용액을 well당 1000㎕씩 가한 후 4시간 후에 MTT를 제거하고 DMSO를 well당 1000㎕씩 가한 후 하룻밤 37℃에서 인큐베이션 후 570nm에서 흡광도를 측정 하였다. 이때 산양유와 양하 추출 혼합물을 첨가하지 않고 같은 방법으로 실험을 진행한 것을 대조군으로 하여 상대적인 흡광도의 차이를 총 8일에 걸쳐 측정하여 세포의 생육활성을 관찰하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.
사람 면역세포인 Raji(Human B cell)과 Jurkat(Human CD4+ T cell)을 사용하여 면역세포의 생육활성을 측정한 결과 실시예 9를 적용한 경우 가장 좋은 생육활성을 보여 면역활성을 높여줌을 알 수 있다.
산양유와 양하 추출 혼합물의 면역세포 생육 활성 평가 결과
실시예 |
반응액중에 함유시킨 산양유와 양하 추출 혼합물의 최종농도(㎍/ml) |
생육활성(%) |
B 세포 |
T 세포 |
실시예 1 |
200 |
100 |
102 |
실시예 2 |
200 |
103 |
101 |
실시예 3 |
200 |
101 |
106 |
실시예 4 |
200 |
104 |
107 |
실시예 5 |
200 |
105 |
109 |
실시예 6 |
200 |
107 |
106 |
실시예 7 |
200 |
105 |
111 |
실시예 8 |
200 |
112 |
109 |
실시예 9 |
200 |
117 |
120 |
실시예 10 |
200 |
113 |
110 |
실시예 11 |
200 |
110 |
107 |
실험예
3.
항알러지
실험 (β-
hexosaminidase
방출량 측정)
β-hexosaminidase는 mast cell에 함유되어 있는 효소로 mast cell이 면역반응에 의해 활성화되면 histamine과 함께 방출된다. 그러므로, mast cell의 탈과립 지표로 사용할 수 있다. <Planta Med. 64, 577-578 (1998)>
RBL-2H3 cell을 10% FBS과 글루타민을 함유하고 있는 EMEM로 배양한다. 24well plate에 세포를 well당 5x105 개로 분주한다. 이 때 사용 배지는 EMEM 에 0.5㎍/㎖의 mouse monoclonal IgE 함유된 것을 사용하고, 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한다. 세포를 well 당 siraganian buffer I 500㎕를 사용하여 헹구어 내고, siraganian buffer II 160㎕ 첨가 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 10분 동안 배양한다. 산양유와 양하 혼합 추출물을 처리한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 20분 동안 배양하고 10분간 antigen(1㎍/㎖, DNP-BSA)을 처리한다. 10분간 ice bath 에 처리하여 반응을 정지시키고 원심분리한다. 상층액에 substrate(1mM ρ-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide) 20㎕ 처리 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 1시간 인큐베이션 한 후 0.1M Na2CO3/NaHCO3를 넣어 반응을 정지시킨다. ELISA reader를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
※ 억제율(%) =(B-C-D)/(A-C-D)
-A(control) : test material 첨가하지 않은 것 (allergen IgE 반응 측정)
-B(treated) : test material 첨가 (allergen IgE 반응 측정)
-C(blank) : test material 과 substrate 만 ELISA plate에 첨가
-D(spontaneous) : antigen, IgE , test material 첨가하지 않은 것
산양유와 양하 추출 혼합물의 항알러지 평가 결과
시 료
|
반응액중에 함유시킨 산양유와 양하 추출 혼합물의 최종농도(㎍/ml) |
β-
hexosaminidase
방출 저해율(%)
|
실시예 1. |
200 |
21.3 |
실시예 2. |
200 |
23.6 |
실시예 3. |
200 |
27.9 |
실시예 4. |
200 |
32.8 |
실시예 5. |
200 |
25.6 |
실시예 6. |
200 |
29.9 |
실시예 7. |
200 |
30.4 |
실시예 8. |
200 |
35.8 |
실시예 9. |
200 |
45.8 |
실시예 10. |
200 |
39.4 |
실시예 11. |
200 |
35.9 |
실험예
4.
알러지
평가(
LLNA
assay
)
산양유와 양하 추출 혼합물에 대한 알러지 유발여부를 확인하기 위하여 3일 동안 하루 한번씩 시료를 마우스 귀에 25㎕씩 도포하여 4일째 임파절을 떼어내어 임파구를 분리후 5% 이산화탄소 배양기에서 24 - 48시간 배양한후 증폭정도를 방사선 동위원소 [3H]-메칠티미딘(methyl thymidine)의 삽입량으로 측정한다. 국부임파절평가 (LLNA:local lymph node assay)결과는 대조군에 비해 시료군의 임파구 증폭정도로 나타내며 한 가지 농도에서라도 시료의 자극지수(S.I:stimulation index)가 3이상이고 농도별로 증가하는 경향을 보일 경우 알러젠으로 간주하였다.
※-cpm(counter per minute):[3H]-메칠티미딘(methyl thymidine)이 세포내로 삽입되는 양
-S.I(stimulation index) :시료의 평균 cpm을 대조군의 평균 cpm으로 나눈 값
표 7에서 보는 바와 같이 추출물의 자극지수(S.I)가 3 이하로 알러지 유발 가능성이 거의 없는 것으로 나타났다.
산양유와 양하 추출 혼합물의 알러지 평가 결과
시료 |
반응액중에 함유시킨 산양유와 양하 추출 혼합물의 최종농도(㎍/ml) |
평균 cpm |
증폭정도(S.I) |
에탄올(60%) |
100 |
2261 ± 121 |
― |
실시예 1 |
100 |
3215 ± 125 |
1.86 |
실시예 2 |
100 |
3233 ± 265 |
1.62 |
실시예 3 |
100 |
3187 ±288 |
1.54 |
실시예 4 |
100 |
2993 ±231 |
1.98 |
실시예 5 |
100 |
4533 ± 215 |
1.45 |
실시예 6 |
100 |
4238 ± 241 |
1.27 |
실시예 7 |
100 |
4548 ± 331 |
2.01 |
실시예 8 |
100 |
4522 ± 135 |
1.70 |
실시예 9 |
100 |
4002 ± 195 |
1.74 |
실시예 10 |
100 |
4566 ± 301 |
1.59 |
실시예 11 |
100 |
4577 ± 302 |
1.32 |
처방예
1.
실시예 9의 산양유와 양하 추출 혼합물을 함유한 화장료 중 영양로션의 처방예는 다음과 같다.
번호 |
원 료 |
처방예 1 |
처방예 1-1 |
비교처방예 1 |
1 |
산양유와 양하 추출혼합물 (실시예 5) |
5.0 |
10.0 |
- |
2 |
밀납 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
3 |
폴리솔베이트 60 |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
4 |
솔비탄 세스퀴올레이트 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
5 |
유동 파라핀 |
10.0 |
10.0 |
10.0 |
6 |
소르비탄 스테아레이트 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
7 |
친유형 모노스테아린산 글리세린 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
8 |
스테아린산 |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
9 |
글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
10 |
프로필렌글리콜 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
11 |
카르복시폴리머 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
12 |
트리에탄올아민 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
13 |
방부제 |
미량 |
미량 |
미량 |
14 |
색소 |
미량 |
미량 |
미량 |
15 |
향료 |
미량 |
미량 |
미량 |
16 |
정제수 |
잔량 |
잔량 |
잔량 |
17 |
물 |
- |
- |
10 |
<제조방법>
처방예 1, 1-1: 10, 11, 13, 16을 혼합교반하면서 80 내지 85℃로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12를 80 내지 85℃로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃ 까지 열 냉각한 뒤 15번을 투입하고, 45℃까지 냉각한 뒤 14번을 투입하고, 35℃에 1번을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.
비교예 : 10, 11, 13, 16을 혼합교반하면서 80 내지 85℃로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12를 80 ~ 85℃사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃ 까지 열냉각한 뒤 15번을 투입하고, 45℃까지 냉각한 뒤 14번을 투입하고, 35℃에 17번을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.
처방예
2
실시예 9의 산양유와 양하 추출 혼합물을 함유한 화장료 중 영양크림의 처방예는 다음과 같다.
번호 |
원 료 |
함량(중량%) |
1 |
산양유와 양하 추출혼합물 (실시예 5) |
5.0 |
2 |
스테아린산 |
2.0 |
3 |
세틸알콜 |
2.0 |
4 |
글리세릴모노스테아레이트 |
2.0 |
5 |
폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트 |
0.5 |
6 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
0.5 |
7 |
글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트 /폴리옥시에틸렌스테아레이트 |
1.0 |
8 |
왁스 |
1.0 |
9 |
유동파라핀 |
4.0 |
10 |
스쿠알란 |
4.0 |
11 |
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 |
4.0 |
12 |
카르복시비닐폴리머 |
0.3 |
13 |
부틸렌글리콜 |
5.0 |
14 |
글리세린 |
3.0 |
15 |
트리에탄올아민 |
0.5 |
16 |
정제수 |
잔량 |
<제조방법>
12, 13, 14, 16을 혼합교반하면서 80 내지 85℃로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11을 80 내지 85℃로 가열하여 투입한 뒤 15를 투입하여 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각하고, 1번을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.
처방예
3.
실시예 9의 산양유와 양하 추출혼합물을 함유한 화장료 중 워시폼의 처방예는 다음과 같다.
번호 |
원 료 |
함량(중량%) |
1 |
산양유와 양하 추출 혼합물 (실시예 5) |
5.0 |
2 |
티.이.에이.-코코일 글루타메이트 |
30.0 |
3 |
디소듐 라우레스 설포썩시네이트글리세린 |
10.0 |
4 |
글리세린 |
10.0 |
5 |
코카마이드 디.이.에이. |
2.0 |
6 |
피.이.지.-120 메칠글루코오스 디올리에이트 |
1.0 |
7 |
메칠글루세스-20 |
0.5 |
8 |
피.이.지.-150 펜타에리트리틸 테트라 스테아레이트 |
0.5 |
9 |
테트라소듐 이.디.티.에이. |
0.05 |
10 |
방부제 |
미량 |
11 |
향료 |
미량 |
12 |
정제수 |
잔량 |
<제조방법>
2,3,4,5,6,7,8,9,10을 순차적으로 제조부에 투입하고 60 내지 65℃로 가열한 후 15분간 교반 한다. 교반이 끝나면 12의 일부를 투입하고 30분간 교반후 다시 12의 일부를 천천히 투입하고, 30분간 교반 후에 35℃까지 냉각하고 1,11을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.
처방예
4.
실시예 9의 산양유와 양하 추출혼합물을 함유한 화장료 중 샴푸의 처방예는 다음과 같다.
번호 |
원 료 |
함량(중량%) |
1 |
산양유와 양하 추출 혼합물 (실시예 5) |
5.0 |
2 |
티.이.에이.-코코일 글루타메이트 |
35.0 |
3 |
소듐 라우레스 설페이트 |
10.0 |
4 |
글리세린 |
5.0 |
5 |
코카마이드 디.이.에이 |
3.0 |
6 |
디소듐 라우레스 설포썩시네이트 |
2.0 |
7 |
라우레스-2 |
1.5 |
8 |
피.이.지.-150 펜타에리트리틸 테트라 스테아레이트 |
1.5 |
9 |
리놀아미노프로필 피.지-디모늄 클로라이드 인산 |
1.5 |
10 |
소듐 코코일 이세치오네이트 |
1.0 |
11 |
올리브오일 피.이.지.-7 에스테르 |
1.0 |
12 |
피.이.지.-120 메칠글루코오스 디올리에이트 |
1.0 |
13 |
메칠글루세스-20 |
1.0 |
14 |
피.이.지-12 디메치콘 |
0.7 |
15 |
폴리쿼터늄-7 |
0.5 |
16 |
폴리쿼터늄-10 |
0.1 |
17 |
테트라소듐 이.디.티.에이. |
0.1 |
18 |
방부제 |
적량 |
19 |
향료 |
적량 |
20 |
정제수 |
잔량 |
<제조방법>
2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,17,18을 순차적으로 제조부에 투입하고 60 내지 65℃로 가열한 후 30분간 교반한다. 별도 용해부에서 15,16,20의 일부를 투입하고 30분간 교반후 제조부에 투입하고 30분간 교반한다. 다시 20의 일부를 천천히 투입하고 30분간 교반 후에 35℃까지 냉각하고, 1,19를 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.
적용예
1. 3차원
생인공피부에서의
항염증(
IL
-1α 방출량 측정)
IL-1α(interleukin-1α)는 전염증 작용인자 (pre-inflammatory mediator)로 작용하는 세포간 신호물질 (cytokine)로 상처 (wound)의 재상피화(re-epithelialization)의 잠재적인 유도체로서 작용할 뿐만 아니라 알레르기 반응과 염증성 반응 조절인자로서 백혈구 운동을 촉진시키는 leukotriene B4, 5-, 12-, 15 HETE 같은 arachidonic acid lipoxygenase metabolites 생산을 증진시키는 것으로 알려져 있다. 3차원 인공피부를 배양하여 염증을 유발시킨 후 산양유와 양하 추출 혼합물의 IL-1α의 방출량을 알아보았다.
처방예 1,1-1과 비교처방예 1 의 로션을 시험에 사용하였다.
TypeⅠ collagen matrix (Bioland, Korea)와 5배로 농축된 DMEM(Dubelcco's Modified Eagle Medium, GIBCO BRL, USA), 그리고 2.2% NaHCO3와 200mM HEPES, 0.05N NaOH로 제조된 완충용액을 7:2:1로 섞어 만든 human fibroblasts cell line(ATCC, American Type Culture Collection, Cat. No. CRL-2076) 을 density 1×105 cells/ml로 혼합하여 직경 10mm의 insert에 각 각 200ul의 fibroblasts가 혼합된 collagen solution을 넣어 진피를 제조한다. 진피 제조 후 10% FBS를 함유하는 DMEM를 2일마다 교체하여 7일간 배양한다. 배양된 진피위에 normal keratinocyte를 3×105 cells/insert로 접종한다. DMEM (10% FBS)와 K-SFM (Keratinocyte Serum Free Medium, GIBCO, USA) (supplemented with EGF (epidermal growth factor) and BPE(bovine pituitary extract)를 1:1로 섞은 배지를 넣고 7일간의 submerge culture 후 기액 계면에서 배양 (air-liquid interface culture)하기 위하여 insert안의 배지는 제거하고 insert 밖에만 submerge culture시 사용한 배지를 사용하여 14일 동안 air-liquid interface culture 하였다. 배양된 인공피부의 배양배지를 모두 제거한 다음 새 배지를 조직 배양 용기밖에 1.5 ㎖을 넣는다. Insert 내에 10 ㎕의 피부자극물질 (SLS : sodium lauryl sulfate)을 투여하고 4 시간 뒤 각 농도의 산양유와 양하 추출 혼합물을 10 ㎕ 적용한 후 37 ℃, 5% CO2에서 24 시간 동안 배양한다. SLS 와 산양유와 양하 추출 혼합물의 농도는 용액에 대한 독성 물질의 무게 퍼센트로 하였다. IL-1α는 배지 표본을 취하여 Human IL-1α assay kit (Endogen Inc. Boston, MA, USA)을 이용하였으며 ELISA-reader (enzyme-linked immunosorbent assay)로 450 nm에서 측정하였다. 그 결과는 표8에 나타내었다.
3차원 생인공 피부에서의 항염증 효과
시 료
|
반응액중에 함유시킨 산양유와 양하 추출 혼합물의 최종농도(㎍/ml) |
IL
-1α 방출량(
pg
/
ml
)
|
SLS |
0.07% |
79.3 |
비교처방예 1 |
50 |
73.2 |
처방예 1 |
50 |
62 |
처방예 1-1 |
50 |
50.1 |
적용예
2.
피부1차
자극 후 홍반 완화 효과 (
폐쇄첩포실험
)
처방예 1, 처방예 1-1 과 비교처방예 1의 영양로션에 피부자극제인 소디움라우릴설페이트(Sodium Laurly Sulfate)이 0.5% 되도록 넣고 피부 도포시 홍반 완화효과를 확인하기 위해서 다음과 같은 임상 확인 실험을 하였다. 아토피 피부염과 다른 습진의 현병력 및 과거력이 없는 현재 피부질환이 없다고 판단된 3세 이상의 건강한 남, 여 소아 및 어린이 20명(연령분포:3-8세, 평균연령:5세, 남자 15명, 여자 5명)을 대상으로 하였다.
피검자의 양측 전완부 내측 부위에 시료를 도포하기 전에 홍반지수(erythema index: E-index)를 측정하고 large finn chamber(Epitest, Hyryla Finland)와 여과지를 이용하여 각 시료의 일정량(0.2g)을 24시간 동안 첩포를 부착하였다. 첩포를 제거하고 홍반지수측정은 공기의 이동이 없고 직사광선이 없는 공간에서 피검자가 검사 부위를 노출시킨 다음 30분 동안 안정을 취한 후 시행하였다. Dermaspectometer(Cortex Technology, Hadsund, Denmark)를 이용하여 측정 후 그 결과를 다음과 같이 나타내었다. 실내온도는 22℃, 습도는 43%였다.
피부1차 홍반 완화 시험결과
시 료
|
BL
|
DAY0
|
DAY1
|
DAY2
|
WEEK1
|
소디움라우릴설페이트
0.5%
|
8.9 |
16.9 |
14.1 |
13.3 |
11.1 |
비교
처방예
1
|
8.9 |
14.8 |
12.1 |
10.3 |
10.1 |
처방예
1
|
9.0 |
12.9 |
10.7 |
9.8 |
9.5 |
처방예
1-1
|
8.8 |
12.3 |
10.2 |
9.4 |
9.2 |
상기 조사결과와 같이 산양유와 양하 추출 혼합물을 첨가하여 제조한 처방예 1과 처방예 1-1의 화장료가 첨가되지 않고 제조한 비교처방예 1보다 피부 홍반 완화 효과가 우수하다는 것을 알 수 있다.
적용예
3.
피부감작에
의한 접촉성 과민반응(contact hypersensitivity) 억제 효과
처방예 1,1-1과 비교처방예 1 의 로션을 시험에 사용하였다.
일주일간의 순화기간을 거친 8-10주령의 C57BL/6 생쥐를 대상으로 복부를 제모한 후 FS-20 sun lamp를 이용하여 자외선 B 2.4KJ/㎡ 로 조사하여 접촉성 과민반응(contact hypersensitivity)이 대조군에 비해 억제되는 것을 관찰하였다. 제모한 쥐 복부에 처방예 2, 2-1과 비교처방예 2의 로션을 UV 조사 후 도포하고 3일이 경과한 다음 UV 조사 영역에 3% trinitrochlorobenzene으로 감작시켰다. 6일 후 1%의 trinitrochlorobenzene을 생쥐의 귀에 도포하고 부종상태를 측정하여 면역증강효과를 표 10에 나타내었다.
시 료
|
면역증강효과 (%) |
비교
처방예
1
|
2.7 |
처방예
1
|
18.9 |
처방예
1-1
|
25.6 |
처방예 1,1-1과 비교처방예 1 의 로션을 제조하여 피부감작에 의한 접촉성 과민반응(contact hypersensitivity)을 실험한 결과 처방예 1, 1-1 적용한 경우, 1차 자극 후 2차 피부 감작에 따라 나타난 피부 자극 및 홍반, 부종을 효과적으로 줄이는 것으로 보아 면역증강 효과가 향상된 것으로 판단된다.