DE60125708T2

DE60125708T2 - Zusammensetzung zur topischen Anwendung

Info

Publication number: DE60125708T2
Application number: DE60125708T
Authority: DE
Inventors: Stefan Borchert; Rolf-Dieter Petersen
Original assignee: Chemisches Laboratorium Dr Kurt Richter GmbH
Current assignee: ELC Management LLC
Priority date: 2001-02-23
Filing date: 2001-07-31
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2021-08-01
Also published as: US20020168388A1; CA2366065A1; EP1236463B1; ATE350010T1; JP3910394B2; ES2276728T3; US6790434B2; DE60125708D1; CA2366065C; JP2002255777A; EP1236463A1

Description

Die Erfindung betrifft kosmetische Zusammensetzungen, die eine verbesserte regenerative und schützende Wirkung auf epidermale und dermale Zellen und deren extrazelluläre Umgebung haben. Sie umfasst einen neuen aktiven Komplex von aktiven Bestandteilen, die dahingehend optimiert sind, die Haut vor möglicherweise schädlichen Umwelteinwirkungen zu schützen.
Entsprechend der Erfindung bestehen die wesentlichen Bestandteile des aktiven Komplexes aus inaktivierten und aufgelösten Kulturen von Bakterien der Gattung Bifidobacterium oder Bakterien, welche mit dieser Gattung verwandt sind, und aus einer Zusammensetzung aus extrazellulärer Pflanzenmatrix, welche bevorzugt aus Sojabohnen hergestellt wird.
Das Aussetzen von Haut gegenüber UV-Strahlung kann verschiedene biologische Effekte bedingen, einschließlich Sonnenbrand (Entzündung), Auslösung von Hautkrebs (Melanom), vorzeitige Hautalterung und Veränderung von Immunzellen der Haut (Immunsuppression), was alles zu einer (dauerhaften) Schädigung der Hautzellen führt.
Eine Schädigung von Hautzellen aufgrund von UV wird durch verschiedene Mechanismen wie UV-bedingte Immunsuppression, UV-bedingten DNA-Schaden und Anhäufung von DNA-Schäden ausgelöst.
Die Immunsuppression ist ein Zustand eines immunologischen Ungleichgewichts der Haut (Kripke, 1984; Baadsgard, 1991). Es ist bekannt, dass die Aussetzung der Haut gegenüber UVB-Strahlung (280–320 nm) eine systemische Unterdrückung der durch T-Zellen vermittelten Kontakthypersensitivität (CHS) gegenüber Haptenen und Hypersensitivitätsreaktionen vom verzögerten Typ (DTH) gegenüber Proteinantigenen wie Herpes simplex-Virus, Candida albicans oder Mykobakterien (Otani et al., 1987; Giannini, 1986; Denkins et al., 1989; Jeevan et al., 1989) auslöst. Insbesondere Langerhanszellen (LC), welche hochspezialisierte antigenpräsentierende Zellen (APC) sind, spielen eine wesentliche Rolle bei der Auslösung von Immunantworten gegenüber Kontaktallergenen, viralen Antigenen und wahrscheinlich Hauttumorantigenen (Teunissen, 1992). Von UVB-Strahlung wurde gezeigt, dass sie die Zahl von LC in der Epidermis reduziert.
Ratis et al., 1998, haben gezeigt, dass die Aussetzung gegenüber UVB LC über wenigstens zwei unterschiedliche Wege beeinflusst:

1. Die Expression von Interzellulären Adhäsionsmolekülen-1 (ICAM-1) und insbesondere von CD 86 wird wesentlich reduziert und
2. Die Vitalität von LC wird reduziert, was zu apoptotischem Zelltod führt.

Beide Mechanismen tragen zu durch UVB bedingten immunsuppressiven Effekten bei.
Neben LC spielen Keratinocyten (KC) eine wichtige Rolle bei der durch UV bedingten Immunsuppression. UV-Licht beeinflusst abhängig von seiner Wellenlänge die Produktion und Sekretion von immunmodulierenden Cytokinen von KC. Insbesondere von der IL-10-Expression wurde gezeigt, dass sie eine große Rolle bei der Auslösung von systemischer Immunsuppression und der differentiellen Aktivierung von T-Helfer-Untergruppen spielt. Shreedar et al., 1998, beschrieben, dass die Freisetzung von Prostaglandin E₂ (PGE₂) von bestrahlten KC IL-4 im Serum hervorruft, was wieder die Freisetzung von IL-10 auslöst. Somit aktiviert die Aussetzung gegenüber UV eine Cytokinkaskade, welche eine systemische Immunsuppression ergibt.
Neueste Ergebnisse haben gezeigt, dass auch die UVA-Bestrahlung über einen oxidativen Weg, der die antigenpräsentierende Funktion von epidermalen Zellen unterdrückt und durch eine Unterdrückung der Expression von kostimulatorischen Molekülen auf LC begleitet wird, zu einer Immunsuppression beiträgt (Iwai et al., 1999). Es wird angenommen, dass diese Wirkung durch reaktive Sauerstoffspezies vermittelt wird.
Verschiedene gefährliche Wirkungen wie die Induktion von Apoptose oder programmiertem Zelltod werden durch die immunsuppressiven Eigenschaften der UV-Strahlung vermittelt. Apoptotische Zellen in der Haut werden "Sonnenbrand-Zellen" genannt (Daniels et al., 1961; Young, 1987). Sonnenbrand-Zellen zeigen einige charakteristische morphologische Veränderungen: das aufgeweitete endoplasmatische Retikulum bildet Vakuolen, das Chromatin wird gespalten und kondensiert, oft Sphären bildend, entlang der Kernmembran und eine dramatische Zellschrumpfung ist das am häufigsten vorkommende Merkmal von apoptotischen Sonnenbrand-Zellen.
Zahlreiche Gene, die Mediatoren kodieren, welche die Apoptose regulieren, wurden identifiziert, unter ihnen das Tumorsupressorgen p53 und das Apoptose-Inhibitorgen bcl-2, von welchen angenommen wird, dass sie wichtige Rollen spielen. Wang et al., 1998, nahmen an, dass UVA und UVB die Apoptose durch Auslösung von zwei verschiedenen Signalübertragungswegen auslösen. Während UVA, reaktive Sauerstoffspezies erzeugend – hauptsächlich Singulett-Sauerstoff – welche Lipidperoxidation (Kane et al., 1993) und eine Zerstörung der Membranpermeabilität bedingen, zu einer unmittelbaren Apoptose durch Herabregulierung der bcl-2-Expression führt, bedingt UVB eine verzögerte Apoptose, die durch eine Auslösung von DNA-Schädigung in der Form von Pyrimidin-Dimeren und der nachfolgenden Expression und Anhäufung von p53-Proteinen charakterisiert ist.
Es gibt zunehmende Belege, dass die Apoptose eine wichtige Rolle bei der Immunantwort spielen könnte (Lynch et al., 1995).
Klassische UV-Hautschutzmittel, welche als Sonnenschutz verwendet werden, absorbieren UVA- oder UVB-Strahlung direkt auf der Hautoberfläche. Der bereitgestellte Schutz wird durch ihren Sonnenschutzfaktor (SPF) ausgedrückt, welches die minimale Dosis ist, bei welcher ein Erythem beobachtet wird (minimale Erythem-Dosis, MED) und welche in hohem Maße vom Hauttyp des Anwenders abhängig ist. Der Nutzen solcher Sonnenschutze ist insofern begrenzt, als sie nur einen bestimmten Grad von Schutz bereitstellen, während man der Sonne direkt ausgesetzt ist. Sie haben keine regenerierende Wirkung, noch können sie mit jeglichen durch UV bedingten biochemischen Änderungen in der Haut interagieren oder diese verhindern.
Für einen umfassenden Lichtschutz insbesondere gegen vorzeitige Hautalterung, Lichtallergien, Immunsuppression und Hautkrebs ist es jedoch notwendig, durch UV ausgelöste biochemische Änderungen in der Haut umzukehren oder zu reduzieren.
JP 05-017363 beschreibt die anti-entzündliche Wirkung, welche durch Lactobacillus, Bifidobakterien oder deren Zellwände in Bezug auf Sonnenbrand erzeugt wird.
Es ist gut belegt, dass die Aussetzung gegenüber UV die Dimerisierung von zwei nebeneinanderliegenden Pyrimidinmolekülen der DNA bewirken kann. Ein zelleigenes, enzymatisch gesteuertes Excisionsreparatursystem ist fähig, solch einen Schaden zu reparieren, solange die Häufigkeit des Schadens die physiologische Reparaturkapazität nicht überschreitet. Wenn die Reparaturkapazität nicht ausreichend ist, was in alternder Haut oder nach exzessiver Aussetzung gegenüber UV der Fall sein könnte, könnten Zellen mit nicht reparierter DNA fähig sein, zu überleben. Die Konsequenz kann ein chronischer Lichtschaden wie funktionelle Störungen der Haut mit daraus folgendem vorzeitigen Altern, der Entwicklung von präkarzinogenen Stadien der Zellen oder schließlich der Entwicklung von Hautkrebs sein.
EP 0 043 128 B1 und US-A 4,464,362 beschreiben eine kosmetische Zusammensetzung, die den DNA-Reparaturvorgang der Haut fördert und welche inaktivierte Kulturen von Bifidobakterien oder Bakterien, welche mit dieser Gattung verwandt sind, enthält.
Basierend auf umfassenden in vitro- und in vivo-Tests in Tieren genauso wie im Menschen wurde herausgefunden, dass die vorstehende Zusammensetzung, topisch angewendet, die DNA-Reparaturrate in durch UV geschädigten Zellen signifikant steigert.
Die vorstehende Reparaturzusammensetzung ist dadurch ein wesentlicher Beitrag zum Fachgebiet, da zum ersten Mal ein Wirkstoff bereitgestellt wird, welcher effektiv durch UV ausgelösten DNA-Schaden in Hautzellen verhindern kann.
Wie vorstehend diskutiert, umfasst jedoch durch UV ausgelöster Hautschaden eine Kaskade von pathophysiologischen Ereignissen und ist nicht auf DNA-Schaden beschränkt. In den letzten Jahren wurde es offensichtlich, dass durch UV ausgelöste Unterdrückung von zellvermittelter Immunität ein weiterer sehr wichtiger Faktor ist, welcher zum dauerhaften Hautschaden einschließlich der Entwicklung von Hautkrebs und vorzeitiger Hautalterung beiträgt.
Fischer et al., 1998, beschreiben molekulare Mechanismen der Lichtalterung. Aussetzung gegenüber UVR führt zur Stimulation der Freisetzung von Cytokinen aus Keratinocyten oder Hautfibroblasten. Dies führt zu der Aktivierung von Proteinkinasen-Signaltransduktionskaskaden mit der Folge der Aktivierung des Transkriptionsfaktors AP-1, welcher die Expression von Matrix-Metalloproteinasen (MMP) induziert. MMPs bauen die extrazelluläre Matrix in der Lederhaut ab. Dem ECM-Schaden folgt die Reparatur der Matrix, welche nicht perfekt ist und dadurch zu einer vorzeitigen Lichtalterung der Haut führt.
Somit ist das Problem, das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, eine kosmetische Zusammensetzung bereitzustellen, welche dadurch wesentlich verbesserte Eigenschaften hat, dass sie auf der DNA-Ebene durch Förderung des endogenen DNA-Reparaturmechanismus genauso wie auf der immunologischen Ebene chronischen, durch UV ausgelösten Lichtschaden in der Haut minimiert oder verhindert.
Während es Berichte gegeben hat, dass die systemische oder orale Verabreichung von entweder Metaboliten oder Fraktionen von Bifidobakterien zur Immunmodulation verwendet werden kann ( DE 402 8 018 , JP 01-242532 und JP 06-056618), gibt es keine/n Offenbarung oder Beleg, dass die topische Anwendung einer Zusammensetzung, wie sie durch vorstehende US-A 4,464,362 beschrieben wird, irgendeine Wirkung auf durch UV ausgelöste Immunsuppression haben wird.
Unerwartet wurde herausgefunden, dass eine kosmetische Zusammensetzung, umfassend die Biomasse von Bifidobakterien oder mit dieser Gattung verwandten Bakterien, welche in einer Zusammensetzung aus einer extrazellulären Pflanzenmatrix suspendiert und aufgelöst wurde, einen optimalen Schutz gegen chronischen, durch UV ausgelösten Hautschaden durch Wirken gegen Immunsuppression, Verhinderung von DNA-Strangbrüchen und Wiederherstellung des Gleichgewichts zwischen Hautzellen und ihrer extrazellulären Umgebung bereitstellt.
EP 0 668 072 B1 und US 5,547,997 , welche hierdurch durch Bezugnahme eingeschlossen sind, offenbaren die Zusammensetzung und kosmetische Verwendung einer extrazellulären Pflanzenmatrix. Die primäre Zellwand von höheren Pflanzen kann als eine extrazelluläre Pflanzenmatrix definiert werden. Gemäß Roberts, 1990, kann die primäre Pflanzenzellwand aus einer Vielfalt von Proteinfraktionen wie den Hydroxyprolin-reichen Glycoproteinen, repetitiven Prolinreichen Proteinen, Arabinogalaktan-Proteinen, Extensinen, Nachtschattengewächs-Lektinen, Glycin-reichen Proteinen und Thioninen bestehen. Zusätzlich zu den Proteinfraktionen sind die folgenden Komponenten für gewöhnlich in der primären Zellwand vorhanden: Pektin, Xyloglycan, Arabinoxylan, β1-3- und β1-4-Glucane, Cellulose, Callose und Lignin (siehe Roberts, 1989).
Die Pflanzenzellwand besteht aus einem strukturell komplexen Netzwerk von Polysacchariden und Proteinen. Neuere Forschung hat gezeigt, wie Makromoleküle der Zellwand und Fragmente davon an Prozessen wie Zellwachstum, Zell- und Gewebedifferenzierung und Kontrolle der Pathogenese beteiligt zu sein scheinen (Levy et al., 1992).
Auf der Suche nach Ähnlichkeiten zwischen der extrazellulären Matrix von Pflanzen- und tierischen Zellen wurde unter Verwendung einer cDNA-Sonde und Antikörpern gegen menschliches Vitronectin gezeigt, dass Lilien-, Puffbohnen-, Sojabohnen- und Tomatenpflanzen ein Polypeptid von 55 kD enthalten, welches mit Vitronectin verwandt ist. Dies legt nahe, dass die Vitronectin-artigen Moleküle eine Rolle bei der Zelladhäsion und -migration in einer zu tierischen Zellen ähnlichen Weise erfüllen (Sanders et al., 1991).
Hoher Soja-Genuss, welcher zu hohen Aussetzung gegenüber Soja-Isoflavonen führt, wurde mit einem reduzierten Risiko für Krebs assoziiert. Isoflavone besitzen eine Vielfalt von Eigenschaften wie antioxidative, antiproliferative und die Differenzierung fördernde Fähigkeiten. Die Rolle der Immunfunktion ist zunehmend wichtig bei der Vorbeugung von Krebs geworden (Zhang et al., 1997).
Während von kosmetischen Formulierungen, welche die extrazelluläre Pflanzenmatrix enthalten, gezeigt wurde, dass sie durch UV ausgelöster vorzeitiger Hautalterung durch Entgegenwirken der Kollagen-Quervernetzung entgegenwirken und die Festigkeit und Elastizität bei der Haut im Menschen verbessern, gibt es keine Offenbarung oder keinen Vorschlag, dass solch eine Zusammensetzung aus Pflanzenmatrix, topisch appliziert, irgend eine schützende Wirkung gegen durch UV ausgelöste Immunsuppression hat.
Wie vorstehend kurz dargestellt, wurde überraschenderweise herausgefunden, dass in einer Zusammensetzung einer extrazellulären Pflanzenmatrix aufgelöste Bifidobakterien einen optimalen Schutz gegen durch UV ausgelöste Hautveränderungen bereitstellen. Somit wird die Zusammensetzung zusätzlich zur Verhinderung von DNA-Strangbrüchen auch der durch UV ausgelösten Immunsuppression entgegenwirken und die Intaktheit der extrazellulären Matrix erhalten.
Dieses Ergebnis ist unerwartet und konnte basierend auf den bekannten Eigenschaften von jeder der individuellen Komponenten nicht vorhergesagt werden. Die kombinierte Präparation des aktiven Substanzkomplexes entsprechend der Erfindung stellt eine hervorragende kosmetische Zusammensetzung bereit, welche durch UV ausgelöstem/r DNA-Schaden und Immunsuppression entgegenwirkt. Angesichts dieses einzigartigen Aktivitätsprofils wird ein neuer umfassender Ansatz für die Vorbeugung von durch UV ausgelöster vorzeitiger Alterung der Haut bereitgestellt.
Die erste Komponente des erfinderischen aktiven Komplexes wird aus inaktivierten Bakterien der Gattung Bifidobacterium wie der Spezies Bifidobacterium longum (Reuter) oder anderen nicht-sporenbildenden Gram-positiven Bakterien erhalten, welche mit der Gattung Bifidobacterium, wie beschrieben in EP 0 043 128 B1 und US-A 4,464,362, welche hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind, verwandt sind. Sie enthält die metabolischen Produkte, die Cytoplasmafraktion und Zellwandbestandteile wie Murein und Polysaccharide.
Die Bifidobakterien können anaerob in einem geeigneten Medium zum Beispiel unter den in EP 0 043 128 B1 und US-A 4,464,362 beschriebenen Bedingungen gezüchtet werden. Nach Erreichen der frühen stationären Phase werden die Bakterien durch Pasteurisierung inaktiviert (bei 60–65°C über etwa 30 Minuten). Die Bakterien werden durch konventionelle Trennungsmethoden zum Beispiel Membranfiltration oder Zentrifugation geerntet, in steriler physiologischer NaCl-Lösung resuspendiert und erneut aufgetrennt. Das Waschen wird zwei- oder dreimal wiederholt und die Biomasse wird gesammelt und kann tiefgefroren aufbewahrt werden.
Andere geeignete Ausgangsmaterialien, welche verwendet werden können, sind Bakterien, die mit der Gattung Bifidobacterium verwandt sind, wie sie zum Beispiel in Bergery's Manual of Determinative Bacteriology, B. Auflage (1975) unter Actinomycetaceae, Propionibacteriaceae, Lactobacillaceae und coryneforme Bakterien (siehe unter anderem Seiten 576, 599, 633 und 659 bis 600) aufgeführt sind.
Die zweite Komponente des aktiven Substanzkomplexes ist entsprechend der Erfindung eine Zusammensetzung aus extrazellulärer Pflanzenmatrix, welche zum Beispiel aus Seetang, Kudzu, Mais, Karotte, Tomate, Tabak, Bohne, Sojabohne, Zuckerrübe, Kartoffel, Melone oder Petunie hergestellt werden kann. Eine besonders bevorzugte Quelle ist die Sojabohne. Bevorzugte Extraktionsverfahren werden in EP-0-668072 auf S. 4 Zeile 42 – S. 5 Zeile 27 offenbart.
Besonders bevorzugte Verfahrensschritte zur Gewinnung der zweiten Komponente sind nachstehend beschrieben:

(a) Das Pflanzengewebe, bevorzugt von Sojabohnen, wird zerkleinert und mit einer wässrigen Lösung gewaschen, welche gegebenenfalls als Antioxidans Metabisulfit (Na₂S₂O₅) bevorzugt in einer Konzentration von 4 mM enthält. Jegliche andere Konzentration im mM-Bereich ist geeignet. Die Waschlösung enthält weiter bevorzugt in einer Konzentration von 0,3 bis 0,4 % ein Konservierungsmittel, zum Beispiel Phenonip.
(b) Das fakultative Antioxidans wird in einer wässrigen Waschlösung, welche ein Konservierungsmittel, zum Beispiel Phenonip, bevorzugt in einer Konzentration von 0,3 bis 0,4 % enthält, ausgewaschen.
(c) Das zerkleinerte und gewaschene Pflanzengewebe wird unter nicht-hydrolysierenden Bedingungen mit einer Lösung von bevorzugt 0,2 M CaCl₂, pH-Wert annähernd 4, konserviert mit bevorzugt 0,3 bis 0,4 % Phenonip, extrahiert. Das Verhältnis von Pflanzengewebe zu Extraktionslösung ist bevorzugt 1:10 (Gew./Vol.). Die Extraktion wird über wenigstens 24 Stunden unter Rühren bei reduzierter Temperatur von etwa 5°C fortgesetzt.
(d) Das unlösliche Material wird aus dem Extrakt unter Verwendung konventioneller Trennungsmethoden zum Beispiel Zentrifugation und abschließender Filtration unter Verwendung einer 0,45 μm-Membran entfernt.

Die entsprechend der Erfindung erhaltene extrazelluläre Pflanzenmatrix-Zusammensetzung, welche durch die vorstehenden Extraktionsverfahren erhältlich ist, umfasst eines oder mehrere der folgenden, im Wesentlichen in seiner nativen Konformation vorliegenden Komponenten: Glycoproteine, einschließlich Hydroxyprolin-reicher Proteine (Extensine); repetitive Prolin-reiche Proteine, Arabinogalaktan-Proteine und Lektine; und Kohlenydratpolymere wie Pectin, Xyloglycan, Arabinoglycan, Glucan, Callose und Lignin.
Der relative Anteil dieser extrazellulären Pflanzenmatrix-Komponenten in dem Extrakt hängt von der Quelle des Extrakts, das heißt der Art der verwendeten Pflanze, und von der verwendeten Extraktionstechnik ab. Zum Beispiel enthält ein Extrakt aus Kudzu-blättern mehr Hydroxyprolin-reiche Glycoproteine als ein Extrakt aus Mais. In jedem Fall haben jedoch die Komponenten der extrazellulären Matrix im Wesentlichen ihre native Konformation und sind fähig, die biologische Funktion der extrazellulären Matrix zu vermitteln, und sind so für kosmetische Zusammensetzungen nützlich.
Die so hergestellte Zusammensetzung aus extrazellulärer Pflanzenmatrix in einem konservierten wässrigen Puffer kann direkt verwendet werden, um die inaktivierte Biomasse von Bifidobakterien oder mit dieser Gattung verwandten Bakterien zu resuspendieren. Die Konzentration von inaktivierten Kulturen von Bifidobacterien in dem Extrakt der extrazellulären Pflanzenmatrix ist bevorzugt in dem Bereich von 0,1 g/l bis 10 g/l (stärker bevorzugt im Bereich von 0,4 g/l). Diese Suspension kann durch Ultraschall, mechanische Techniken wie eine Zellmühle, Hochdruck-Homogenisierung oder durch Kombination der erwähnten Verfahren aufgelöst werden.
Der aktive Komplex entsprechend der Erfindung (das heißt die als ein endogener Teil der Zusammensetzung aus der extrazellulären Pflanzenmatrix homogenisierten inaktivierten Kulturen von Bifidobacterien) kann in emulgierten, wässrigen und wässrig-alkoholischen kosmetischen Präparationen, welche für die topische Anwendung auf Haut ausgelegt sind, durch dem Durchschnittsfachmann wohl bekannte Mittel und Verfahren formuliert werden. Die bevorzugte Dosierung in einer kosmetischen Zusammensetzung ist 0,1 % bis 10 %, ist aber nicht auf diesen Bereich beschränkt. In besonderen Fällen kann der erfinderische aktive Komplex ohne einen kosmetischen Träger angewendet werden.
Durch die topische Anwendung der kosmetischen Zusammensetzungen entsprechend der Erfindung kann permanentem Zellschaden aufgrund von DNA-Schaden und Immunsuppression, welche durch UV-Strahlung bedingt sind, entgegengewirkt und der durch Licht bedingte Alterungsprozess der Haut verzögert werden, so werden kosmetische Zusammensetzungen mit im hohen Maße wünschenswerten Qualitäten bereitgestellt.
Die folgenden Formulierungen sind exemplarische erfindungsgemäße Ausführungsformen, sind aber nicht gedacht, den Umfang dieser Erfindung zu begrenzen oder diese auf diese bestimmten Formulierungen zu beschränken. Beispiel 1: Körperlotion Eine Körperlotion (Öl in Wasser), welche die aktive Zusammensetzung enthält, umfassend:
Das Gemisch a) wird bei annähernd 70°C geschmolzen und das Gemisch b) wird auf annähernd 70°C erhitzt und unter Rühren dem Gemisch a) hinzugefügt.
Das Rühren wird fortgesetzt, bis die Lotion auf annähernd 30°C abgekühlt ist. Dann werden Zusammensetzung c) und d) unter Rühren hinzugefügt, die Lotion ist homogenisiert. Beispiel 2: Gel-Lotion Eine Gel-Lotion, welche die aktive Zusammensetzung enthält, umfassend:
Das Gemisch a) wird bei annähernd 50°C aufgelöst.
Das Gemisch b) wird bei Raumtemperatur dispergiert und unter Rühren zu a) hinzugefügt.
Dann wird dem die Zusammensetzung c) unter Rühren hinzugefügt. Beispiel 3: Creme Eine Creme (Öl in Wasser), welche die aktive Zusammensetzung enthält, umfassend:
Das Gemisch a) wird bei annähernd 70°C geschmolzen und das Gemisch b) wird gleichfalls auf annähernd 70°C erhitzt und unter Rühren zum Gemisch a) hinzugefügt.
Das Rühren wird fortgesetzt, bis die Creme auf annähernd 30°C abgekühlt ist. Dann wird die Zusammensetzung c) unter Rühren hinzugefügt und die Creme ist homogenisiert. Beispiel 4: Creme Eine Creme (Wasser in Öl), welche die aktive Zusammensetzung enthält, umfassend:
Das Gemisch a) wird auf annähernd 80°C erhitzt, das Gemisch b) wird gleichfalls auf 80°C gebracht und unter Rühren zu a) hinzugefügt.
Das Rühren wird fortgesetzt, bis die Creme auf annähernd 30°C abgekühlt ist. c) und d) werden hinzugefügt. Die Creme wird durch eine Walze homogenisiert.
Der kombinierte aktive Komplex zeigte in Bezug zu dem, was von den bekannten Effekten der einzelnen Komponenten erwartet werden konnte, unerwartet hohe Wirksamkeit.
Die nachstehend beschriebenen Experimente zeigen klar die günstige Wirkung des Komplexes aus Bifidobakterien/extrazellulärer Pflanzenmatrix gemäß der Erfindung gegen durch UV-Strahlung ausgelösten Hautschaden.
Test 1: Einfluss auf die DNA-Reparatur in Keratinocyten
Zur Untersuchung des Einflusses des erfindungsgemäßen aktiven Komplexes auf die DNA-Reparatur wurde der Cell Proliferation ELISA, BrdU (erhältlich von Roche; 1647229) verwendet.
Kurze Beschreibung des Testverfahrens:
Menschliche Keratinocyten (HaCaT), gezüchtet in DMEM + 5 % FKS + L-Glutamin + Gentamycin (Kulturmedium), in der stationären Wachstumsphase wurden mit Trypsin behandelt und eine Zellsuspension von 3 × 10⁵ Zellen/ml wurde hergestellt.

• Die erhaltene Zellsuspension wurde in Mikrotiterplatten unter Verwendung von 50 μl/Vertiefung (1,5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) gesät.
• Probenverdünnungen (0,01 %; 0,1 %) des aktiven Komplexes gemäß der Erfindung wurden unter Verwendung des FKS-freien Kulturmediums hergestellt und 50 μl von jeder dieser Verdünnungen wurden in die entsprechenden Vertiefungen gefüllt; als Kontrolle wurde nur FKS-freies Kulturmedium verwendet.
• Die Platte wurde im CO₂-Inkubator bei 37°C über 72 Stunden inkubiert.
• Dann wurde der Überstand entfernt und jede Vertiefung wurde zweimal mit 200 μl PBS pro Vertiefung gewaschen.
• 50 μl PBS wurden zu den Zellen in jeder Vertiefung hinzugefügt, welche dann bestrahlt wurden (2 J/cm² UVA + 0,2/cm² UVB).
• Der Überstand wurde entfernt und durch FKS-freies Kulturmedium ersetzt (100 μl/Vertiefung).
• Nach Hinzufügen der BrdU-Lösung (10 μl/Vertiefung) wurden die Platten im CO₂-Inkubator bei 37°C über 18 Stunden inkubiert.
• Dann wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden gewaschen und fixiert.
• Dann wurde der anti-BrdU-POD-Antikörper bei Umgebungstemperatur über zwei Stunden inkubiert (100 μl/Vertiefung der Antikörperlösung).
• Die Platten wurden gewaschen und die Substratlösung (100 μl/Vertiefung) wurde hinzugefügt (annähernd 20 Min.).
• Der Test wurde durch die Zugabe von 50 μl/Vertiefung 1 M H₂SO₄ beendet und die OD-Werte wurden bei 450 nm abgelesen (Bezug: 630 nm).

Wie in 1 gezeigt, erhöht das erfinderische Produkt nach der UV-Bestrahlung von Keratinocyten den Einbau von Bromdesoxyuridin (BrdU) in die DNA um bis zu 18 %, wobei der BrdU-Spiegel ein direktes Maß für die DNA-Reparatur ist.
Test 2: Einfluss auf die Bildung von DNA-Fragmenten (Nucleosomen) nach UV-Bestrahlung
Für die Bestimmung der Bildung von DNA-Fragmenten wurde der Cell Death Detection ELISA (erhältlich von Roche, 1774425) verwendet.
Kurze Beschreibung des Testverfahrens:

• Menschliche Keratinocyten (HaCaT), gezüchtet in DMEM + 5 % FKS + L-Glutamin + Gentamycin (Kulturmedium), in der stationären Wachstumsphase wurden mit Trypsin behandelt und eine Zellsuspension von 3 × 10⁵ Zellen/ml wurde hergestellt.
• Die erhaltene Zellsuspension wurde in Mikrotiterplatten unter Verwendung von 50 μl/Vertiefung (1,5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) gesät.
• Probenverdünnungen (0,05 %, 0,1 %) des aktiven Komplexes gemäß der Erfindung wurden unter Verwendung des FKS-freien Kulturmediums hergestellt und 50 μl von jeder dieser Verdünnungen wurden in die entsprechenden Vertiefungen gefüllt; als Kontrolle wurde nur FKS-freies Kulturmedium verwendet.
• Die Platte wurde im CO₂-Inkubator bei 37°C über 72 Stunden inkubiert.
• Dann wurde der Überstand entfernt und jede Vertiefung wurde zweimal mit 200 μl PBS pro Vertiefung gewaschen.
• 50 μl PBS wurden in jede Vertiefung hinzugefügt und die Platte wurde bestrahlt (1 J/cm² UVA + 0,1/cm² UVB).
• Der Überstand wurde entfernt und durch FKS-freies Kulturmedium ersetzt (100 μl/Vertiefung). Dann wurde die Platte im CO₂-Inkubator bei 37°C über 18 Stunden inkubiert
• Danach wurden die Zellen mit 200 μl Lysereagenz lysiert und bei 200 × g über 10 Min. zentrifugiert.
• Der sich ergebende Überstand wurde in eine Mikrotiterplatte gefüllt und die Nucleosomen wurden unter Verwendung eines anti-Histon-Biotin-Antikörpers und eines anti-DNA-POD-Antikörpers nachgewiesen (Cell Death Detection ELISA (Roche; 1774425).
• Die OD-Werte wurden bei 405 nm abgelesen (Bezug: 490 nm).

Wie in 2 demonstriert, verhindert der aktive Komplex gemäß der Erfindung die Bildung von DNA-Doppelstrangbrüchen (Nucleosomen) nach UV-Bestrahlung.
Test 3: Einfluss auf die Zelllebensfähigkeit von Keratinocyten nach UV-Bestrahlung (MTT-Test)
Kurze Beschreibung des Testverfahrens:

• Menschliche Keratinocyten (HaCaT), gezüchtet in DMEM + 5 % FKS + L-Glutamin + Gentamycin (Kulturmedium), in der stationären Wachstumsphase wurden mit Trypsin behandelt und eine Zellsuspension von 3 × 10⁵ Zellen/ml wurde hergestellt.
• Die erhaltene Zellsuspension wurde in Mikrotiterplatten unter Verwendung von 50 μl/Vertiefung (1,5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) gesät.
• Probenverdünnungen (0,01 %; 0,05 %, 0,1 %; 0,5 %) des aktiven Komplexes gemäß der Erfindung wurden unter Verwendung des FKS-freien Kulturmediums hergestellt und 50 μl von jeder dieser Verdünnungen wurden in die entsprechenden Vertiefungen gefüllt; als Kontrolle wurde nur FKS-freies Kulturmedium verwendet.
• Die Platte wurde im CO₂-Inkubator bei 37°C über 72 Stunden inkubiert.
• Dann wurde der Überstand entfernt und jede Vertiefung wurde zweimal mit 200 μl PBS pro Vertiefung gewaschen.
• 50 μl PBS wurden jeder Vertiefung hinzugefügt und die Platte wurde bestrahlt (2 J/cm² UVA + 0,2/cm² UVB).
• Dann wurde der Überstand entfernt und 100 μl/Vertiefung FKS-freies Medium wurden hinzugefügt.
• Die Platte wurde dann im CO₂-Inkubator bei 37°C über 18 Stunden inkubiert.
• 10 μl MTT-Lösung (5 mg PBS pro ml) wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt und die Platte wurde bei 37°C über vier Stunden inkubiert (10 % CO₂).
• Der Überstand wurde entfernt und 100 μl saure SDS/DMSO-Lösung wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt.
• Die OD-Werte wurden bei 570 nm abgelesen.

Wie in 3 gezeigt, wirkt der aktive Komplex gemäß der Erfindung der Reduktion der Zellentwicklung nach UV-Bestrahlung entgegen.
Test 4: Einfluss auf die Interleukin-10-Expression nach UV-Bestrahlung von Keratinocyten.
Kurze Beschreibung des Testverfahrens:

• Menschliche Keratinocyten (HaCaT), gezüchtet in DMEM + 5 % FKS + L-Glutamin + Gentamycin (Kulturmedium), in der stationären Wachstumsphase wurden mit Trypsin behandelt und eine Zellsuspension von 3 × 10⁵ Zellen/ml wurde hergestellt.
• Die erhaltene Zellsuspension wurde in Mikrotiterplatten unter Verwendung von 50 μl/Vertiefung (1,5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) gesät.
• Probenverdünnungen (0,01 %; 0,1 %) des aktiven Komplexes gemäß der Erfindung wurden unter Verwendung des FKS-freien Kulturmediums hergestellt und 50 μl von jeder dieser Verdünnungen wurden in die entsprechenden Vertiefung gefüllt; als Kontrolle wurde nur FKS-freies Kulturmedium verwendet.
• Die Platte wurde im CO₂-Inkubator bei 37°C über 72 Stunden inkubiert.
• Dann wurde der Überstand entfernt und jede Vertiefung wurde zweimal mit 200 μl PBS pro Vertiefung gewaschen.
• 50 μl PBS wurden dann in jede Vertiefung hinzugefügt und die Platte wurde bestrahlt (2 J/cm² UVA + 0,2/cm² UVB).
• Der Überstand wurde entfernt und 100 μl/Vertiefung FKS-freies Medium wurden hinzugefügt.
• Die Platte wurde dann im CO₂-Inkubator bei 37°C über 12 Stunden inkubiert, dann wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden gewaschen und fixiert.
• Der anti-IL-10-Antikörper wurde bei 37°C über zwei Stunden inkubiert, dann wurde die Platte gewaschen.
• Der anti-Maus-IgG-Biotin-Antikörper wurde bei 37°C über 1 Stunde inkubiert, dann wurde die Platte wieder gewaschen.
• Die Platte wurde mit dem Streptavidin-POD-Komplex bei 37°C über 1 Stunde inkubiert, nach weiterem Waschen wurde die Substratlösung (ABTS) hinzugefügt.
• Die Reaktion wurde mit 50 μl/Vertiefung 1 M H₂SO₄ gestoppt und die OD-Werte wurden bei 450 nm abgelesen (Bezug: 630 nm).

4 zeigt, dass der aktive Komplex gemäß der Erfindung die IL-10-Expression von mit UV bestrahlten Keratinocyten um etwa 30 % reduziert und somit systemischer Immunsuppression entgegenwirkt.
Test 5: Wirkung auf die Interleukin-10-Sekretion durch menschliche Monocyten
Der Einfluss auf die IL-10-Sekretion wurde durch den Quantikine^TM ELISA für menschliches IL-10 (erhältlich von R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland) bestimmt.
Kurze Beschreibung des Testverfahrens:

• Monocyten und Lymphocyten aus von einem gesunden Freiwilligen erhaltenem peripherem Blut wurden durch Dichtegradientenisolierung (Polymorphprep^TM) isoliert. Die Monocyten wurden durch Inkubation von Monocyten und Lymphocyten in RPMI 1640-Medium mit 10 % FKS über zwei Stunden abgetrennt, wobei die Monocyten an die Kulturplatten adhärierten.
• Der aktive Komplex gemäß der Erfindung (0,01 % und 0,001 %) wurde durch 10 μg Lipopolysaccharide (LPS) stimulierten Monocyten hinzugefügt (1,75 × 10⁵ Zellen/200 μl/Vertiefung). Durch 10 μg/ml LPS stimulierte Monocyten dienten als Positivkontrolle.
• Die Monocyten wurden über 18 Stunden (37°C, 10 % CO₂) gezüchtet.
• Das IL-10 in Zellkulturüberständen wurde durch einen kommerziell erhältlichen Sandwich-ELISA (Quantikine^TM-ELISA, für menschliches IL-10 erhalten von R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland) quantifiziert, welcher in doppelter Ausführung durchgeführt wurde.

Die Aussetzung gegenüber UV führt zu einer systemischen Immunsuppression, welche durch IL-10, das durch Monocyten sezerniert wird, vermittelt wird. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass der aktive Komplex gemäß der Erfindung die IL-10-Sekretion von stimulierten Monocyten in einer dosisabhängigen Weise, wie in 5 gezeigt, reduziert.
Test 6: Einfluss auf die Matrix-Metalloproteinase-1 (MMP-1) nach UV-Bestrahlung
Die Expression von MMP-1 nach UV-Bestrahlung wurde unter Verwendung des MMP-1-Activity Assay System (erhalten von Biotrak [Amersham Pharmacia]; RPN 2629) bestimmt.
Kurze Beschreibung des Testverfahrens:

• Menschliche Keratinocyten (HaCaT), gezüchtet in DMEM + 5 % FKS + L-Glutamin + Gentamycin (Kulturmedium), in der stationären Wachstumsphase wurden mit Trypsin behandelt und eine Zellsuspension von 3 × 10⁵ Zellen/ml wurde hergestellt.
• Die erhaltene Zellsuspension wurde in Mikrotiterplatten unter Verwendung von 50 μl/Vertiefung (1,5 10⁴ Zellen/Vertiefung) gesät.
• Probenverdünnungen (0,1 %; 0,5 %) des aktiven Komplexes gemäß der Erfindung wurden unter Verwendung des FKS-freien Kulturmediums hergestellt und 50 μl von jeder dieser Verdünnungen wurden in die entsprechenden Vertiefungen gefüllt; als Kontrolle wurde nur FKS-freies Kulturmedium verwendet.
• Die Platte wurde im CO₂-Inkubator bei 37°C über 72 Stunden inkubiert.
• Dann wurde der Überstand entfernt und jede Vertiefung wurde zweimal mit 200 μl PBS pro Vertiefung gewaschen.
• 50 μl PBS wurden jeder Vertiefung hinzugefügt, dann wurde die Platte bestrahlt (1 J/cm² UVA + 0,1/cm² UVB).
• Der Überstand wurde entfernt und FKS-freies Medium (100 μl/Vertiefung) wurde hinzugefügt, dann wurde die Platte im CO₂-Inkubator bei 37°C über 48 Stunden inkubiert.
• Dann wurden 100 μl des Überstands zu den entsprechenden Vertiefungen der mit anti-MMP-1 beschichteten Testplatte hinzugegeben, welche dann bei 4°C über 18 Stunden inkubiert wurde.
• Die Platte wurde gewaschen und Nachweislösung (50 μl/Vertiefung) wie 50 μl des Testpuffers (füge dem Standard APMA-Lösung anstatt des Testpuffers hinzu) wurden hinzugefügt.
• Nach kurzem Schütteln wurde die Platte bei 405 nm abgelesen (Abs_t=0)
• Nach einer Inkubation bei 37°C über sechs Stunden wurde die Platte erneut bei 405 nm (Abs_t=6) abgelesen.
• Die Expression von aktivem MMP-1 wurde unter Verwendung der nachstehenden Formel berechnet:

Wie in 6 gezeigt, reduziert der aktive Komplex gemäß der Erfindung die Expression von MMP-1 nach UV-Bestrahlung von menschlichen Keratinocyten verglichen mit der Kontrolle um bis zu 68 %. Die Reduktion der MMP-1-Aktivität stellt einen Schutz gegen die hydrolytische Spaltung von tripelhelicalem Kollagen der Typen I, II und III dar.
Die Ergebnisse der vorstehenden Tests zeigen klar, dass der Komplex aus Bifidobakterien/extrazellulärer Pflanzenmatrix gemäß der Erfindung im Entgegenwirken eines durch UV ausgelösten Schadens von Hautzellen ist besonders effizient.
Literatur

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Claims

Kosmetische Zusammensetzung zur topischen Anwendung zur Entgegenwirkung von Hautschäden verursacht durch UV-Strahlung, umfassend als Wirkstoffe eine erste Komponente, erhalten aus inaktivierten Bakterienkulturen der Gattung Bifidobacterium oder den folgenden Bakterien, welche mit der Gattung Bifidobacterium verwandt sind: Actinomycetaceae, Propionimycetaceae, Lactobacillaceae und coryneforme Bakterien, und eine zweite Komponente, welche ein Extrakt aus extrazellulärer Pflanzenmatrix ist, bestehend aus einem oder mehreren von einem Glykoprotein im Wesentlichen in seiner nativen Konformation, einem Kohlenhydratpolymer im Wesentlichen in seiner nativen Konformation und einem Arabinogalaktan-Protein im Wesentlichen in seiner nativen Konformation, wobei die Zusammensetzung erhältlich ist durch ein Verfahren, bei dem das inaktivierte Bakterium in dem Extrakt aus extrazellulärer Pflanzenmatrix aufgelöst wird.
Kosmetische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die durch UV-Strahlung verursachten Hautschäden Immunsuppression, DNA-Schäden, Reduktion der Zellentwicklung, Transformation in ein prekarzinogenes Stadium, Bildung von Sonnenbrand-Zellen oder vorzeitige Hautalterung sind.
Kosmetische Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1–2, wobei Immunsuppression durch erhöhte IL-10-Expression verursacht wird.
Kosmetische Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1–2, wobei vorzeitige Hautalterung durch erhöhte MMP-1-Expression verursacht wird.
Kosmetische Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1–4, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoffkomplex eine zweite Komponente bestehend aus extrazellulärer Pflanzenmatrix der folgenden Pflanzen umfasst: Seetang (Kelp), Kudzu, Mais, Karotte, Tomate, Tabak, Bohne, Sojabohne, Zuckerrübe, Kartoffel, Melone oder Petunie.
Kosmetische Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Komponente aus der ersten oder zweiten Pflanzenzellwand herrührt.
Kosmetische Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1–6, wobei die inaktivierte Bakterienkultur durch folgende Schritte erhältlich ist: (a) Bifidobakterien werden unter anaeroben Bedingungen in einem geeigneten Medium gezüchtet, (b) nach Erreichen der frühen stationären Phase werden die Bakterien durch Pasteurisierung inaktiviert, gefolgt vom (c) Ernten durch konventionelle Trennungsmethoden und zwei- oder dreimaliges Waschen mit physiologischer NaCl-Lösung, und (d) die gesammelte Biomasse kann tiefgefroren aufbewahrt werden.
Kosmetische Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1–7, wobei die zweite Komponente durch folgende Verfahrensschritte erhältlich ist: (a) das Pflanzengewebe wird zerkleinert und mit einer wässrigen Lösung gewaschen, welche gegebenenfalls ein Antioxidans und weiter ein Konservierungsmittel enthält, (b) das fakultative Antioxidans wird mit einer wässrigen Waschlösung, welche ein Konservierungsmittel enthält, ausgewaschen, (c) das zerkleinerte und gewaschene Pflanzengewebe wird unter nicht-hydrolysiernden Bedingungen extrahiert, und (d) das unlösliche Material aus dem Extrakt durch konventionelle Trennungsmethoden und abschließende Filtration entfernt.
Kosmetische Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1–8, erhältlich durch ein Verfahren, wobei (a) die Biomasse der Bifidobakterien, erhalten gemäß Anspruch 7, in dem Extrakt aus einer extrazelluläreren Pflanzenmatrix, erhalten gemäß Anspruch 8, in einem Verhältnis von Biomasse zu Extrakt von vorzugsweise etwa 0.4 g in 1 1 suspendiert wird und (b) die Suspension, welche die inaktivierten Bakterien enthält, vorzugsweise unter Verwendung mechanischer Techniken wie einer Zellmühle gelöst wird.