DE4028018A1 - Extrazellulaeres exopolymer: herstellungsverfahren und pharmazeutische zubereitungen, in denen es enthalten ist - Google Patents

Extrazellulaeres exopolymer: herstellungsverfahren und pharmazeutische zubereitungen, in denen es enthalten ist

Info

Publication number
DE4028018A1
DE4028018A1 DE4028018A DE4028018A DE4028018A1 DE 4028018 A1 DE4028018 A1 DE 4028018A1 DE 4028018 A DE4028018 A DE 4028018A DE 4028018 A DE4028018 A DE 4028018A DE 4028018 A1 DE4028018 A1 DE 4028018A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
exopolymer
daltons
culture medium
extracellular
molecular weight
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE4028018A
Other languages
English (en)
Inventor
Farras Ramon Pares
Torroella Juan Jofre
Jean-Paul Ricard
Adrian Schulthess
Jean-Claude Farine
Marie-Christine Michelet
Agnes Ramsteiner
Jacques Bauer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
OM LAB SA
Original Assignee
OM LAB SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by OM LAB SA filed Critical OM LAB SA
Publication of DE4028018A1 publication Critical patent/DE4028018A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein extrazelluläres Exopolymer welches durch Kultivierung ausgewählter Bakterienstämme der Gattung Bifidobacterium gewonnen wird und immunmodulatorische Eigenschaften besitzt. Die vorliegende Erfindung umfaßt außerdem ein Verfahren zur Herstellung dieses Exopolymers sowie pharmazeutischer Zubereitungen, die das genannte Exopolymer als Wirkstoff enthalten.
Primäre oder sekundäre Störungen des Immunsystems sind der gemeinsame Nenner zahlreicher Erkrankungen, wie Allergien, Autoimmunkrankheiten, bestimmter Infektions- und Krebserkrankungen. Primäre Immundefekte sind selten und haben im allgemeinen genetische Ursachen. Sekundäre Immundefekte dagegen sind relativ häufig, und ihre Ursachen sind überwiegend extrinsisch. Hierzu gehören beispielsweise rezidivierende Infektionen, Alterung, Krebserkrankungen, Fehlernährung, Exposition gegenüber immuntoxischen Substanzen und Streß.
Die Immuntherapie ermöglicht bei primären Immundefekten eine Besserung der Symptome und bei sekundären Immundefekten eine Normalisierung des Immunstatus.
Es wurden zahlreiche Immuntherapeutika in Form von Immunstimulantien oder Immunsuppressiva entwickelt. Immunmodulatoren führen im allgemeinen zu einer unspezifischen Besserung der spezifischen Wirtsreaktivität und unspezifischer Effektormechanismen. Dabei können synthetische Immunmodulatoren und Immunmodulatoren biologischer Herkunft unterschieden werden. Bei der zuletzt genannten Gruppe handelt es sich um Substanzen, die durch Mikroorganismen erzeugt werden, und um Extrakte tierischer oder auch menschlicher Herkunft, wie beispielsweise Thymushormone, dialysierbare Leukozytenextrakte, Interferone und Zytokine.
Die Aktivierung von Lymphozyten oder Makrophagen und ihre Wechselwirkungen werden durch die Einwirkung von Strukturmolekülen von Mikroorganismen oder biologisch aktiven, von Mikroorganismen gebildeten Substanzen erheblich beeinflußt. Für eine Vielzahl von Bakterien und Bakterienprodukten wurde eine Wirkung auf das Immunsystem nachgewiesen. Dieses Spektrum immunmodulatorischer Subtanzen bakterieller Herkunft umfaßt Mykobakterien und deren Produkte, Lipopolysaccharide von gramnegativen Bakterien, Enterotoxine von Vibrio cholerae, Produkte von Streptococcus, Lipoproteine und Glykoproteine verschiedener gramnegative Bakterien sowie Polysaccharide unterschiedlicher Herkunft. Auf diesem Gebiet wird derzeit intensiv geforscht.
Die vorliegende Erfindung ergänzt die Immuntherapie um ein weiteres Element. Es handelt sich um ein neues extrazelluläres, mit hochinteressanten immunmodulatorischen Eigenschaften ausgestattetes Exopolymer. Genauer gesagt umfaßt die vorliegende Erfindung das genannte Exopolymer, wie es entsprechend dem unter Patentanspruch 1 beschriebenen Verfahren hergestellt wird, sowie den Herstellungsvorgang dieses extrazellulären Exopolymers selbst. Andere Bestandteile der vorliegende Erfindung werden im Anschluß dargestellt.
Das Exopolymer, das den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bildet, wurde durch Kultivierung ausgewählter Stämme einer neu isolierten Spezies von Bifidobacterium infantis longum, ein grampositives Bakterium mit taxonomischen Eigenschaften, aufgrund derer es zwischen Bifidobacterium infantis und Bifidobacterium longum einzuordnen ist, hergestellt. Dieses Exopolymer besitzt experimentell nachweisbare immunmodulatorische Eigenschaften und ist daher für die Human- und Veterinärmedizin von größtem Interesse.
Charakteristisch für das in der vorliegenden Erfindung enthaltene Verfahren ist, daß der Bakterienstamm 1BS von Bifidobacterium infantis longum, hinterlegt unter der Nummer I-885 am Institut Pasteur - Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), in einem geeigneten Medium unter anaeroben Bedingungen kultiviert wird und daß das so gebildete Exopolymer nach Entfernung der Mikroorganismen aus dem Kulturmedium isoliert, konzentriert und anschließend durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels ausgefällt wird. Die mit Hilfe dieser Präzipitation gewonnene Substanz wird schließlich lyophilisiert.
Der Stamm 1BS kann unter anaeroben Bedingungen, vorzugsweise bei ca. 37°C, in jedem geeigneten Medium kultiviert werden, dessen Komponenten ein Molekulargewicht von weniger als 10 000 Dalton aufweisen. Die genaue Zusammensetzung eines derartigen Mediums wird weiter unten beschrieben.
Die Mikroorganismen werden vorzugsweise durch Zentrifugation aus dem Kulturmedium entfernt, und das Exopolymer wird beispielsweise durch Ultrafiltration über eine kalibrierte Porenmembran mit einer Retentionsschwelle von 10 000 Dalton oder höher isoliert.
Die auf diese Weise isolierte Substanz wird anschließend konzentriert, dialysiert, durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels, vorzugsweise Äthanol, präzipitiert und schließlich lyophilisiert.
Bei dem entstehenden Exopolymer handelt es sich im wesentlichen um ein Polysaccharid. Dieses besteht in erster Linie aus Glukose und Galaktose in einem Verhältnis von 1 : 1 bis 4 : 1 und enthält eine Proteinfraktion mit einem Gewichtsanteil von maximal 30%. Innerhalb der Polysaccharid-fraktion beträgt das Verhältnis von Glukose und Galaktose ca. 1 : 1 bis 4 : 1, vorzugsweise ca. 3 : 2.
Das Exopolymer der vorliegenden Erfindung hat ein apparentes Molekulargewicht zwischen 10 000 und 100 000 Dalton, vorzugsweise zwischen 20 000 und 30 000 Dalton. Es kann Aggregate mit einem Molekulargewicht von ca. 10⁶ Dalton bilden, die im Gleichgewicht mit Einheiten niedrigeren Molekulargewichts stehen. Es ist außerdem frei von Lipiden, Nukleinsäuren und sonstigen organischen Säuren.
Das auf diese Weise isolierte und gereinigte Exopolymer besitzt interessante immunmodulatorische Eigenschaften, ohne toxisch zu sein. Sowohl durch Untersuchungen in vitro als auch in vivo wurde gezeigt, daß sich das durch den Stamm 1BS gebildete Exopolymer wie ein Immunmodulator verhält und die unspezifische Abwehrkraft des Wirtsorganismus steigert. Auch hat es eindeutige antileukämische (antitumorale) Wirkungen, die mit seinen immunmodulatorischen Eigenschaften, wie sie im Abschnitt "Bestimmung der immunmodulatorischen Eigenschaften des durch den Stamm 1BS gebildeten Exopolymers" beschrieben sind, in Zusammenhang stehen könnten.
Das durch den Stamm 1BS gebildete Exopolymer ist somit ein sinnvoller Wirkstoff verschiedener oral, parenteral oder lokal anwendbarer pharmazeutischer Zubereitungen. Diese können in unterschiedlicher Formen, wie sie in der Human- oder Veterinärmedizin üblich sind, hergestellt werden, z. B. als Tabletten oder Drag´es, Kapseln, Pastillen, Lösungen, Sirups, Suppositorien, injizierbare Präparationen, Pessare, Cremes, Salben, Lotionen, Tropfen und Augentropfen. Alle werden nach den herkömmlichen Verfahren hergestellt.
Der Wirkstoff (das Exopolymer) kann in diese pharmazeutischen Zubereitungsformen allein oder in Kombination mit anderen pharmakologisch wirksamen Substanzen eingebracht werden. Zu diesem Zweck werden die herkömmlichen Trägermittel verwendet, wie z. B. Talkum, Gummi arabicum, Mannitol, Stärke, Magnesiumstearat, Kakaobutter, wäßrige oder nichtwäßrige Trägermittel, tierische oder pflanzliche Fette, Paraffinderivate, Glykole, unterschiedliche Netzmittel, Dispersionsmittel oder Emulgatoren und Konservierungsmittel.
In Tierversuchen wurden bei der Maus signifikante immunmodulatorische Wirkungen bei Dosen zwischen 4-400 µg pro Maus beobachtet.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung illustrieren, ohne sie zu beschränken. Sie betreffen insbesondere die Herstellung des Exopolymers (auch als PB3D bezeichnet) sowie den Nachweis seiner pharmakologischen Eigenschaften.
Herstellung des Exopolymers durch Kultivierung des Bakterienstammes 1BS von Bifidobacterium Infantis Longum Stadium A Kultivierung des Stammes 1BS
Der Stamm 1BS wird bei 37°C unter anaeroben Bedingungen (Elimination der Luft zu Beginn der Fermentierung) in folgendem Nährmedium kultiviert:
Pepton (MG < 10 000 Dalton)|5 g/l
NaCl 3 g/l
Glukose 10 g/l
Zystein 0,5 g/l
Natriumazetat 2 g/l
Na₂HPO₄ 2.87 g/l
KH₂PO₄ 1.12 g/l
MgSO₄ 0.09 g/l
NaH₂PO₄ 0.15 g/l
NaHCO₃ 2.2 g/l
Tween 1 ml/l
Vitaminlösung 10 ml/l
Zur Verbesserung der Ausbeute kann auch ein Festsubstrat, wie CYTODEX® oder etwas Gleichwertiges, zum Kulturmedium gegeben werden. Unter diesen Bedingungen bildet der Stamm 1BS ein Exopolymer, das mit Hilfe eines speziell zu diesem Zweck entwickelten ELISA Testverfahrens im Überstand quantifiziert werden kann. Dieses Verfahren wird später beschrieben.
Beispiel
10 Liter des oben definierten Kulturmediums werden hergestellt und zur Sterilisation in einen 12 Liter Fermenter eingebracht. Dieser wird anschließend mit 1000 ml einer Kultur des über 48 Stunden in demselben Medium kultivierten 1BS Stamms inokuliert. Ein Gemisch von 90% N₂ und 10% CO₂ wird mit einer Rate von 3 Litern pro Minute während 20 Minuten eingesprudelt.
Die Inkubation erfolgt bei 37°C unter einem N₂/CO₂ Gemisch im üblichen Verhältnis, welches während der ersten 2 Stunden der Fermentation ins Medium eingebracht wird, wobei mit einer Drehfrequenz von 400 rpm gerührt wird. Nach 48 Stunden, d. h. nach Abschluß der Fermentierung, wird die Menge des gebildeten Polysaccharids mittels ELISA bestimmt. Die minimale Ausbeute beträgt 35 µg/ml.
Stadium B Isolierung und Reindarstellung des gebildeten Exopolymers
Nach Abschluß der Fermentierung werden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt. Nach Sedimentieren der Zellen wird der Überstand unter Verwendung des Geräts des Typus "AMICON Hallow Fiber H5 P10-43′′ ultrafiltriert. Nur Moleküle mit einem Molekulargewicht von über 10 000 Dalton werden zurückgehalten. Die Lösung mit dem gebildeten Polymer wird zehnfach konzentriert und anschließend dialysiert.
Die konzentrierte Lösung wird mit Alkohol präzipitiert (Äthanol : Wasser, Volumanteile 3 : 1).
Schließlich wird die mit Äthanol präzipitierte Substanz lyophilisiert. Das auf diese Weise gewonnene Produkt ist weißlich und sieht faserig aus.
Beispiel
Aus der obigen Kultur werden 10 Liter der Überstandsflüssigkeit entnommen und anschließend durch Ultrafiltration auf 1 Liter konzentriert. Mit destilliertem Wasser wird das Volumen auf 10 Liter aufgefüllt und dann durch Ultrafiltration wieder auf ca. 1 Liter reduziert. Dieser Vorgang wird zweimal durchgeführt. Der auf diese Weise erhaltene 1 Liter konzentrierter Lösung werden anschließend mit Äthanol (Volumenanteile 3 : 1) präzipitiert. Das entstehende Präzipitat wird lyophilisiert und liefert ca. 400 mg Lyophilisat.
Das ELISA-Verfahren
Bei dem verwendeten Antigen handelt es sich um eine Polysaccharidzubereitung, deren Reinheit durch zusätzliche Deproteinisierung mit Phenol gewährleistet wird. Zusammen mit komplettem Freund-Adjuvans wird einem Kaninchen eine Anfangsdosis von 0.5 mg in Form von zwei Injektionen, eine intraperitoneal und eine subkutan, verabreicht. Die Injektion wird am 15. Tag wiederholt, wobei nun inkomplettes Freund-Adjuvans angewandt wird. Nach weiteren 15 Tagen wird dem Kaninchen Blut entnommen, um ein Antiserum mit hohen Antikörperkonzentrationen zu erhalten, so daß das chromatographisch auf einer SEPHADEX G 200 Säule gereinigte und das im Überstand der Bifidobacterium Kulturen nach Präzipitation mit Äthanol vorhandene Exopolymer mittels ELISA identifiziert werden kann.
Der ELISA Test wird auf einer Mikroplatte durchgeführt. Das Antigen wird adsorbiert. Freigelassene Vertiefungen werden mit Serumnalbumin gefüllt. Dann wird unter Verwendung der spezifischen, vom Kaninchen gewonnenen Antikörper inkubiert. Anschließend werden die gegen die Kaninchenantikörper gerichteten Antikörper hinzugefügt. Diese sind mit alkalischer Phosphatase konjugiert. Schließlich wird das Substrat (Orthonitrophenylphosphat) hinzugefügt. Nach Inkubation wird die Reaktion unter Verwendung von 3 M. NaOH unterbrochen. Die optische Dichte (Absorption) wird bei 405 nm auf einem ELISA Lesegerät gemessen. Durch dieses Verfahren werden ausreichend hohe Antikörpertiter erzielt, um positive Ablesungen bei Antiserumverdünnungen von 10-4 von gereinigten Antigenen in Konzentrationen von 4 µg zu ermöglichen.
Beschreibung des durch den Stamm 1BS gebildeten Exopolymers
  • 1) Die gewonnene Substanz besteht im wesentlichen aus Gluziden (Messung mit dem Phenol/Schwefelsäure-Verfahren) und Proteinen (Messung mit dem Lowry-Verfahren) im Verhältnis 5 : 1.
    Gemäß der Analyse durch Ionenausschlußchromatographie oder Gaschromatographie enthält die Substanz keine Nukleinsäuren. In keinem Fall enthält das Hydrolysat irgendwelche Pentosen. Entsprechend den nach Extraktion mit n-Heptan durch Gaschromatographie ermittelten Ergebnissen ist die Substanz frei von Lipiden und nach den Messungen durch Ionenausschlußchromatographie frei von organischen Säuren.
  • 2) Nach den mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) auf einer RP-8 300 Å Säule ermittelten Ergebnissen ist die Substanz von der Art der Glykoproteine.
  • 3) Nach den mittels Ionenausschluß-, Dünnschicht- und Gaschromatographie ermittelten Ergebnissen besteht der Gluzidteil aus Glukose und Galaktose.
  • 4) Nach den mittels Gaschromatograpie von hydrolysierten (durch Methanolyse) und anschließend azetylierten (durch Trifluorazetylierung) Monomeren ermittelten Ergebnissen sind Glukose und Galaktose in einem Verhältnis von 3 : 2 vorhanden.
  • 5) Nach dem durch Gaschromatographie an methylierten (durch Methanolyse) und anschließend azetylierten (durch Trifluorazetylierung) Monomeren ermittelten Chromatogramm ist der Polysaccharidteil mit den Bindungen 1-2, 1-3, 1-4 und 1-6 verzweigt.
  • 6) Die anhand der Fähigkeit zur Stimulation der Vermehrung plaquebildender Zellen (PFC) gemessene biologische Aktivität geht vom Gluzidteil aus und bleibt nach Behandlung mit einer den Proteinteil zerstörenden Proteinase K bestehen.
  • 7) Nach den durch Chromatographie auf SEPHADEX G 200 (Spitzenwert des niedrigen Molekulargewichts) ermittelten Ergebnissen liegt das ungefähre Molekulargewicht zwischen 20 000 und 30 000 Dalton.
    Das Exopolymer kann Aggregate mit einem Molekulargewicht von ca. 10⁶ Dalton bilden, die im Gleichgewicht mit Einheiten niedrigen Molekulargewichts stehen.
Bestimmung der Immunmodulatorischen Eigenschaften des durch den Stamm 1BS gebildeten Exopolymers (in-vitro-Beweis) Proliferation von Splenozyten
Die Proliferation von Splenozyten in Gegenwart von Mitogenen kann anhand der Reduktion von MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid) zu Formazan durch die Dehydrogenase der Mitochondrien bestimmt werden.
Beispiel
Die Proliferation (Splenozyten der Maus C57BL/6) wird durch die optische Dichte (Absorption) bei 560 nm als Funktion der Konzentration von PB3D oder dem als Referenz dienenden LPS ausgedrückt:
PB3D induziert im Vergleich zu LPS eine etwas geringere Proliferation.
Bestimmung der Immunmodulatorischen Eigenschaften des durch den Stamm 1BS gebildeten Exopolymers (in-vivo-Beweis) Stimulation der Bildung antikörperproduzierender Zellen
Bei der Maus führt das Exopolymer zu einer unspezifischen Stimulation der Bildung antikörperproduzierender Zellen, wenn es zusammen mit Schafserythrozyten oral oder ohne Schafserythrozyten intraperitoneal verabreicht wird. Bei der Maus unter Immunsuppression mit Cyclophosphamid führte das Exopolymer außerdem zu einer Normalisierung dieser Funktion.
Beispiel
Nach fünftägiger oraler Verabreichung von PB3D und einer Booster-Dosis am 19. und 20. Tag (Organigramm A) oder ohne Booster-Dosis (Organigramm B) wird in Abhängigkeit von den verabreichten Dosen in der Milz der Maus ein zahlenmäßiger Anstieg der PFC beobachtet.
Beispiel
Nach intraperitonealer Verabreichung einer Einzeldosis von 400 µg/Maus PB3D wird nach vier Tagen ein signifikanter Anstieg der PFC-Zahl beobachtet.
Beispiel
Durch Verabreichung des Exopolymers an Mäuse unter Immunsuppression mit Cyclophosphamid kann bei behandelten Mäusen eine im Vergleich zu unbehandelten Mäusen geringere Immunsuppression bzw. eine raschere Normalisierung der PFC Zahl beobachtet werden.
Einfluß auf die Zusammensetzung der Serumproteine
Verschiedene Immunmodulatoren modifizieren das immunelektrophoretische Muster der als X, LA und LB bezeichneten Serumproteine. Das Expolymer der vorliegenden Erfindung führt zu einer derartigen Modifikation.
Beispiel
Die intraperitoneale Verabreichung von 400 µg/Maus PB3D führt nach 24 Stunden und nach vier Tagen zu einer Modifikation der Serumproteine. Diese ist mit der vergleichbar, wie sie durch das Lipopolysaccharid von Escherichia coli (LPS) hervorgerufen wird.
Beispiel
In ähnlicher Weise führt die orale Verabreichung von insgesamt 400 µg in fünf aufeinanderfolgenden Teildosen von täglich 80 µg zu einer Proteinveränderung. Diese ist fünf Tage nach Verabreichung des Exopolymers erkennbar.
Kolloidale Kohlenstoff-Clearance
Das Exopolymer wird Balb/c Mäusen intravenös (2.5 mg/Maus) verabreicht. Nach 48 Stunden werden 0.2 ml einer kolloidalen Kohlenstoffsuspension intravenös injiziert. Das als Clearance bezeichnete Verschwinden des Kohlenstoffs aus dem Blut wird anhand des logarithmischen Abfalls des Kohlenstoffspiegels in Abhängigkeit von der Zeit ausgedrückt. Das Exopolymer steigert die Clearance.
Zunahme der unspezifischen Abwehrkraft
Bei Mäusen unter Immunsuppression mit Cyclophosphamid und Kälteexposition konnte beobachtet werden, daß das Exopolymer der vorliegenden Erfindung die unspezifische Abwehrkraft des Wirts gegenüber einer bakteriellen Infektion, wie sie durch Pseudomonas an den Schleimhäuten hervorgerufen wird, oder einer Virusinfektion (Coxsackie B Virus) steigert.
Beispiel
Durch intraperitoneale Verabreichung von 200 mg/kg Cyclophosphamid wird eine Immunsuppression hervorgerufen. Die fünftägige orale Behandlung mit dem Exopolymer (80 µg/Maus/Tag) beginnt am dritten Tag danach. Die Kontrolltiere erhalten eine äquivalente Menge Kochsalzlösung. Einige Stunden nach Behandlungsende werden die Mäuse intranasal mit einem für die Maus pathogen gemachten Stamm von Pseudomonas aeruginosa infiziert. In der Gruppe der behandelten Mäuse besteht eine höhere Überlebensrate:
Beispiel
Durch intraperitoneale Verabreichung einer Einzeldosis von 200 mg/kg Cyclophosphamid wird eine Immunsuppression hervorgerufen. Die fünftägige orale Behandlung mit dem Exopolymer (80 µg/Maus/Tag) beginnt am dritten Tag danach. Die Kontrolltiere erhalten eine äquivalente Menge Kochsalzlösung. Einige Stunden nach Behandlungsende erfolgt eine intraperitoneale Infektion der Mäuse mit dem Coxsackie B5 Virus (0.5 ml mit 10⁷ PFU). Die Überlebensrate ist in der Gruppe der behandelten Mäuse höher.
Tests bei spontanen oder induzierten Leukämien
Das Exopolymer der vorliegenden Erfindung kann bei AKR Mäusen (einem Stamm von Inzuchtmäusen, die sehr häufig spontane Leukämien entwickeln) das Auftreten einer Leukämie verzögern. Bei RF Mäusen kann das Exopolymer außerdem das Auftreten von durch karzinogene Substanzen wie Methylcholanthren induzierten Leukämien verzögern. (Der Stamm RF ist ein Inzuchtstamm, bei dem Methylcholanthren ein rasches Auftreten spontaner Leukämien hervorruft.)
Beispiel
Zwei Gruppen von AKR Mäusen wurden jeden Monat über fünf Tage mit PB3D oral behandelt, während eine dritte Gruppe die Testsubstanz nicht erhielt und als Kontrollgruppe diente. Von den beiden behandelten Gruppen erhielt die eine fünf aufeinanderfolgende Tagesdosen zu 80 µg/Maus (Gesamtdosis pro Monat 400 µg), während die andere fünf aufeinanderfolgende Tagesdosen zu 0.8 µg/Maus (Gesamtdosis pro Monat 4 µg) erhielt.
Bei den behandelten Mäusen zeigte sich ein verzögertes Auftreten der Leukämie. In der Gruppe unter der Gesamtdosis von 400 µg war dieser Unterschied eindeutig signifikant. Dies wurde durch einen weiteren Versuch bestätigt, in welchem die behandelten Gruppen 400 bzw. 40 µg PB3D erhielten.
Versuch 1
Versuch 2
Beispiel
Während der beiden Monate vor der topischen Anwendung von Methylcholanthren wurde zwei Gruppen von RF Mäusen in dreiwöchigem Abstand zweimal PB3D oral verabreicht. Die eine Gruppe erhielt eine monatliche Gesamtdosis von 400 µg (80 µg/Tag/Maus an fünf aufeinanderfolgenden Tagen), während der anderen eine monatliche Gesamtdosis von 4 µg (0.8 µg/Tag/Maus an fünf aufeinanderfolgenden Tagen) verabreicht wurde. Die Kontrollgruppe blieb unbehandelt. Durch kutane Applikation an einer gut rasierten Stelle wurde eine Leukämie induziert. Die Verabreichung von PB3D verzögerte das Auftreten der Leukämie. In der Gruppe unter 400 µg PB3D war diese Verzögerung eindeutig signifikant.
Akute Toxizität
Akute Toxizitätstests wurden durch intravenöse Injektion des Exopolymers in folgenden Dosen vorgenommen: 1 µg, 10 µg, 15 µg, 100 µg, 300 µg, 600 µg und 1200 µg pro Maus in die Schwanzvene von fünf Mäusen für jede Dosis. Bei den Mäusen, die zwei Monate nach der Injektion noch immer am Leben waren, traten bei keiner der verschiedenen Dosen negative Reaktionen auf.
Beschreibung des Stammes
Der Stamm 1BS von Bifidobacterium infantis longum wurde am 6. Juli 1989 bei der "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" (Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 - Paris, Cedex, France) hinterlegt. Er trägt die Code Nummer I-885.
Dieser Stamm wurde aus Abwässern isoliert, die Fäkalmaterial menschlicher Herkunft enthalten. Taxonomisch ist er zwischen Bifidobacterium infantis und Bifidobacterium longum einzuordnen und anhand des Profils seiner Strukturkomponenten, der Profile der Fermentierungskataboliten von D-Glukose, dem Resistenzprofil gegenüber Antibiotika und der Bildung des Exopolymers der vorliegenden Erfindung typisierbar.

Claims (12)

1. Extrazelluläres Exopolymer, hergestellt durch Kultivierung eines Bakterienstammes von Bifidobacterium infantis longum (hinterlegt unter Nr. I-885 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, CNCM/Institut Pasteur) unter anaeroben Bedingungen in einem geeigneten Medium, Entfernung der Mikroorganismen aus dem Kulturmedium, Isolierung des auf diese Weise gebildeten Exopolymers, Konzentration und Präzipitation des genannten Exopolymers durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels sowie anschließende Lyophilisierung des Präzipitats.
2. Exopolymer gemäß Patentanspruch 1 mit immunmodulatorischen Eigenschaften.
3. Exopolymer gemäß Patentanspruch 1 oder 2, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich im wesentlichen um eine polysaccharidartige Substanz handelt und in erster Linie Glukose und Galaktose in einem Verhältnis zwischen 1 : 1 und 4 : 1 enthält und daß es eine Proteinfraktion mit einem Gewichtsanteil von maximal 30% enthalten kann.
4. Exopolymer gemäß Patentanspruch 3 mit einem Glukose-Galaktose-Quotienten in der Größenordnung von 3 : 2.
5. Exopolymer gemäß einem der Patentansprüche 1 bis 4 mit einem apparenten Molekulargewicht von 10 000 bis 100 000 Dalton, vorzugsweise zwischen 20 000 und 30 000 Dalton, das Aggregate mit einem Molekulargewicht von ca. 10⁶ Dalton bilden kann, die im Gleichgewicht mit den Einheiten niedrigeren Molekulargewichts stehen.
6. Exopolymer gemäß einem der Patentansprüche 1 bis 5, das keine Nukleinsäuren, Lipide oder organische Säuren enthält.
7. Herstellungsverfahren des extrazellulären Exopolymers gemäß Patentanspruch 1, bei dem ein beim CNCM unter Nr. I-885 hinterlegten Bakterienstamm von Bifidobacterium infantis longum unter anaeroben Bedingungen in einem geeigneten Medium kultiviert, das auf diese Weise gebildete Exopolymer nach Entfernung der Mikroorganismen aus dem Kulturmedium isoliert, konzentriert und durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels präzipitiert und das Präzipitat schließlich lyophilisiert wird.
8. Verfahren gemäß Patentanspruch 7, bei dem das Exopolymer mittels Ultrafiltration durch eine kalibrierte Porenmembran mit einer Retentionsschwelle von 10 000 Dalton oder höher aus dem Kulturmedium isoliert wird.
9. Verfahren gemäß Patentanspruch 7 oder 8, bei dem das aus dem Kulturmedium isolierte Exopolymer durch Ultrafiltration konzentriert wird.
10. Verfahren gemäß einem der Patentansprüche 7 bis 9, bei dem das Exopolymer durch Zugabe von Alkohol, vorzugsweise Äthanol, präzipitiert wird.
11. Pharmazeutische Zubereitungen, die als Wirkstoff das extrazelluläre Exopolymer gemäß einem der Patentansprüche 1 bis 6 enthalten.
12. Pharmazeutische Zubereitungen gemäß Patentanspruch 11, die eine immunmodulatorische, antiinfektiöse und/oder antitumorale therapeutische Wirkung aufweisen.
DE4028018A 1989-09-29 1990-09-04 Extrazellulaeres exopolymer: herstellungsverfahren und pharmazeutische zubereitungen, in denen es enthalten ist Withdrawn DE4028018A1 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH3536/89A CH679677A5 (de) 1989-09-29 1989-09-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE4028018A1 true DE4028018A1 (de) 1991-04-11

Family

ID=4258109

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE4028018A Withdrawn DE4028018A1 (de) 1989-09-29 1990-09-04 Extrazellulaeres exopolymer: herstellungsverfahren und pharmazeutische zubereitungen, in denen es enthalten ist

Country Status (37)

Country Link
US (1) US5114848A (de)
JP (1) JPH03170503A (de)
KR (1) KR910006489A (de)
AR (1) AR242263A1 (de)
AT (1) ATA188490A (de)
AU (1) AU644604B2 (de)
BE (1) BE1004569A3 (de)
BG (1) BG60275B2 (de)
BR (1) BR9004147A (de)
CA (1) CA2025155A1 (de)
CH (1) CH679677A5 (de)
CZ (1) CZ466590A3 (de)
DD (1) DD295764A5 (de)
DE (1) DE4028018A1 (de)
DK (1) DK191290A (de)
EG (1) EG19285A (de)
ES (1) ES2025972A6 (de)
FI (1) FI95483C (de)
FR (1) FR2652590B1 (de)
GB (1) GB2244998B (de)
GR (1) GR900100706A (de)
HU (1) HU210826B (de)
IT (1) IT1243709B (de)
LU (1) LU87809A1 (de)
MA (1) MA21945A1 (de)
NL (1) NL9001998A (de)
NO (1) NO178345C (de)
NZ (1) NZ235338A (de)
PE (1) PE15391A1 (de)
PL (1) PL165512B1 (de)
PT (1) PT95346A (de)
RU (2) RU2023445C1 (de)
SE (1) SE9002557L (de)
TN (1) TNSN90122A1 (de)
TR (1) TR25353A (de)
YU (1) YU47646B (de)
ZA (1) ZA906492B (de)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2276728T3 (es) 2001-02-23 2007-07-01 Chemisches Laboratorium Dr. Kurt Richter Gmbh Composicion de uso topico.
WO2005034971A2 (en) * 2003-10-08 2005-04-21 Masami Moriyama Antiviral agent
RU2373957C2 (ru) 2006-10-13 2009-11-27 Александр Метталинович Тишин Носитель для лекарственных средств и биологически активных веществ для лечения и диагностики и применение его для создания лекарственных средств и способа регулируемой управляемой доставки лекарственного средства или биологически активного вещества с регулируемой десорбцией его
PL2176299T3 (pl) 2007-05-04 2017-11-30 Alimentary Health Limited Polisacharyd wyizolowany z Bifidobacterium infantis 35624 (NCIMB 41003)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0201332A2 (de) * 1985-05-09 1986-11-12 Morinaga Milk Industry Co., Ltd. Gegen Infektionen aktive Verbindung
US4645667A (en) * 1982-12-27 1987-02-24 Morinaga Milk Industry Co., Ltd. Antitumor agent and process for manufacturing said agent
EP0295961A2 (de) * 1987-06-18 1988-12-21 Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Polysaccharide und antivirale Medikamente mit Polysacchariden als wirksamer Inhaltsstoff

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS56103194A (en) * 1980-01-23 1981-08-18 Meiji Seika Kaisha Ltd Antitumor substance and its preparation
US4435389A (en) * 1980-07-07 1984-03-06 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Composition for promoting growth of bifidobacteria
JPS58203913A (ja) * 1982-05-25 1983-11-28 Meiji Milk Prod Co Ltd 高分子多糖類物質ｍｐｓ−８２及びその利用
US4701907C1 (en) * 1986-02-03 2002-08-27 Collins Mary Dynamically reconfigurable time-space-time digital switch and network

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4645667A (en) * 1982-12-27 1987-02-24 Morinaga Milk Industry Co., Ltd. Antitumor agent and process for manufacturing said agent
EP0201332A2 (de) * 1985-05-09 1986-11-12 Morinaga Milk Industry Co., Ltd. Gegen Infektionen aktive Verbindung
EP0295961A2 (de) * 1987-06-18 1988-12-21 Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Polysaccharide und antivirale Medikamente mit Polysacchariden als wirksamer Inhaltsstoff

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Derwent Abstracts Nr. 84-008643 *

Also Published As

Publication number Publication date
ATA188490A (de) 1997-05-15
NO904041D0 (no) 1990-09-17
BE1004569A3 (fr) 1992-12-15
BG60275B1 (bg) 1994-03-31
EG19285A (en) 1994-10-30
NO178345C (no) 1996-03-06
AU644604B2 (en) 1993-12-16
BR9004147A (pt) 1991-09-03
PE15391A1 (es) 1991-05-04
GR900100706A (el) 1992-01-20
AR242263A1 (es) 1993-03-31
PT95346A (pt) 1991-05-22
FR2652590B1 (fr) 1993-06-25
LU87809A1 (fr) 1991-02-18
YU47646B (sh) 1995-12-04
DD295764A5 (de) 1991-11-14
CH679677A5 (de) 1992-03-31
CA2025155A1 (en) 1991-03-30
US5114848A (en) 1992-05-19
NO178345B (no) 1995-11-27
ZA906492B (en) 1991-05-29
IT9021332A0 (it) 1990-08-29
AU6263190A (en) 1991-04-11
TNSN90122A1 (fr) 1991-03-05
DK191290A (da) 1991-03-30
IT9021332A1 (it) 1992-02-29
FI95483B (fi) 1995-10-31
FR2652590A1 (fr) 1991-04-05
FI903777A0 (fi) 1990-07-27
CZ466590A3 (en) 1997-03-12
GB2244998B (en) 1993-10-06
GB2244998A (en) 1991-12-18
HU905988D0 (en) 1991-03-28
GB9020112D0 (en) 1990-10-24
PL165512B1 (pl) 1994-12-30
MA21945A1 (fr) 1991-04-01
BG60275B2 (en) 1994-03-31
SE9002557L (sv) 1991-03-01
YU156990A (sh) 1992-12-21
FI95483C (fi) 1996-02-12
PL286821A1 (en) 1991-11-04
HUT61333A (en) 1992-12-28
NZ235338A (en) 1991-09-25
RU2023445C1 (ru) 1994-11-30
NL9001998A (nl) 1991-04-16
DK191290D0 (da) 1990-08-10
SE9002557D0 (sv) 1990-08-02
JPH03170503A (ja) 1991-07-24
KR910006489A (ko) 1991-04-29
TR25353A (tr) 1993-03-01
IT1243709B (it) 1994-06-21
ES2025972A6 (es) 1992-04-01
HU210826B (en) 1995-08-28
NO904041L (no) 1991-04-02
RU2025127C1 (ru) 1994-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3517629C2 (de)
DE2331144A1 (de) Wasserloesliche extrakte von mycobacterien
DE2659808C3 (de) Proteingebundene Polysaccharide und deren Verwendung zur Bekämpfung von Tumoren
DE3241990C2 (de) Saures Polysaccharid und Verfahren zu seiner Herstellung
US4596709A (en) Novel immunostimulating glycoproteins
DE2941551A1 (de) Immunologisch wirksame verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende arzneimittel
DE3109335A1 (de) Die neue, physiologisch wirksame substanz ebelacton und verfahren zur herstellung derselben
DD202168A5 (de) Verfahren zur herstellung eines glycoproteins
DE3301997A1 (de) Verfahren zur herstellung von disaccharid-tripeptiden und disaccharid-tetrapeptiden
DE4028018A1 (de) Extrazellulaeres exopolymer: herstellungsverfahren und pharmazeutische zubereitungen, in denen es enthalten ist
DD222895A5 (de) Verfahren zur herstellung eines hypotriglyceridemisch aktiven polysaccharids
DE1617397B2 (de) Herstellung eines tumorstatisch wirkenden Mittels durch Züchten von Streptococcus haemolyticus
CH639133A5 (de) Verfahren zur herstellung einer antitumor wirksamen substanz mit immunostimulierender wirkung.
CH657989A5 (de) Biologisch aktive substanz, verfahren zur herstellung der substanz, sowie die substanz enthaltende, immunoaktive zusammensetzung.
DE2408724A1 (de) Biologische extrakte und verfahren zu ihrer herstellung
DE2146674C3 (de) Faktor und seine Verwendung als Arzneimittel
CH625553A5 (en) Process for the preparation of an antibiotic in the form of compound 890A1 or compound 890A3 or a mixture of these two compounds
DE2133181C3 (de) Tuberactinomycin-N, Verfahren zu dessen Herstellung und dieses enthaltende Arzneimittel
DE2803681A1 (de) Neue polysaccaride und verfahren zu ihrer herstellung
DE3329255A1 (de) Neues verfahren zur herstellung einer substanz mit carcinostatischer und immunostimulierender aktivitaet
CH648042A5 (de) Carcinostatische substanzen, verfahren zur herstellung derselben und mittel mit einem gehalt derselben.
DE2833799A1 (de) Substanz 34129 rp, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende arzneimittel
DE3205074A1 (de) Neue carcinostatische und immunostimulierende substanzen, verfahren zur herstellung derselben und carcinostatische mittel mit einem gehalt derselben
DE2820463A1 (de) Neues polysaccharid, verfahren zu dessen herstellung und hypocholesterin- zusammensetzungen, welche diese enthalten
EP0022425A2 (de) Antibiotika, Verfahren und Zwischenprodukte zu deren Herstellung und deren Verwendung als pharmazeutische Präparate

Legal Events

Date Code Title Description
8110 Request for examination paragraph 44
8139 Disposal/non-payment of the annual fee