JPH03170503A - 細胞外エキソポリマー、その調製方法及び該エキソポリマーを含む薬剤組成物 - Google Patents
細胞外エキソポリマー、その調製方法及び該エキソポリマーを含む薬剤組成物Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
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- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野コ
本発明は、Ijfjdobicterjuz属の選択さ
れた細菌株を培養することによって産生され、免疫調節
特性を付与された、細胞外エキソポリマーに関する。本
発明はまた、このエキソポリマーの調製方法、並びにこ
のエキソポリマーを活性戊分として含有する薬剤にも関
するものである。
れた細菌株を培養することによって産生され、免疫調節
特性を付与された、細胞外エキソポリマーに関する。本
発明はまた、このエキソポリマーの調製方法、並びにこ
のエキソポリマーを活性戊分として含有する薬剤にも関
するものである。
[従来の技術コ
アレルギー 自己免疫疾患、ある種の感染症及びある種
のがんなどの数多くの疾病は、それらの共通の公約数と
して、免疫系の原発性または二次性異常を有する。原発
性免疫不全症は稀であり、一般に遺伝的な原因を有する
ものであるが、二次性免疫不全症はより頻繁なものであ
って、それらの原因はほとんどの場合内因性であり、た
とえば再発性の感染症、老化、がん、低栄養、免疫毒性
物質に対する暴露、及びストレスなどがある。
のがんなどの数多くの疾病は、それらの共通の公約数と
して、免疫系の原発性または二次性異常を有する。原発
性免疫不全症は稀であり、一般に遺伝的な原因を有する
ものであるが、二次性免疫不全症はより頻繁なものであ
って、それらの原因はほとんどの場合内因性であり、た
とえば再発性の感染症、老化、がん、低栄養、免疫毒性
物質に対する暴露、及びストレスなどがある。
免疫療法は、原発性免疫不全症の症状を軽減し、二次性
免疫不全症の場合には免疫状態を回復させることを可能
ならしめる。
免疫不全症の場合には免疫状態を回復させることを可能
ならしめる。
多くの免疫療法剤が、免疫刺激剤や免疫抑制剤の形で開
発されてきている。一般に、免疫調節剤というものは、
宿主の特異的反応性及び非特異的エフェクター機構を非
特異的に増強する薬剤である。合成免疫調節剤と、生物
学的な由来の免疫調節剤との間で区別を行うことができ
る。後者は微生物の産生物、及び動物やヒト由来の抽出
物であり、例えば胸線ホルモン、白血球の透析抽出物、
インターフェロン及びサイトキ二ンの如きである。
発されてきている。一般に、免疫調節剤というものは、
宿主の特異的反応性及び非特異的エフェクター機構を非
特異的に増強する薬剤である。合成免疫調節剤と、生物
学的な由来の免疫調節剤との間で区別を行うことができ
る。後者は微生物の産生物、及び動物やヒト由来の抽出
物であり、例えば胸線ホルモン、白血球の透析抽出物、
インターフェロン及びサイトキ二ンの如きである。
実際に、リンパ球やマクロファージの活性化、及びこれ
らの相互調節は、微生物の構造分子や微生物によって産
生された生物学的活性成分に対する暴露によって大きく
修正される。広範囲な種々の微生物及び微生物的産生物
が、免疫系に対する影響を立証してきている。この微生
物由来の免疫調節剤の従来例には、ミコバクテリア及び
その産生物、ダラム陰性細菌のリボ多糖、コレラ菌(
1/ibr10 c/tolerie)のエンテロトキ
シン、連鎖球菌( Streptococcus)の産
生物、種々のダラム陰性細菌のりボタンパク質及び糖タ
ンパク質、及び種々の由来の多糖が含まれる。
らの相互調節は、微生物の構造分子や微生物によって産
生された生物学的活性成分に対する暴露によって大きく
修正される。広範囲な種々の微生物及び微生物的産生物
が、免疫系に対する影響を立証してきている。この微生
物由来の免疫調節剤の従来例には、ミコバクテリア及び
その産生物、ダラム陰性細菌のリボ多糖、コレラ菌(
1/ibr10 c/tolerie)のエンテロトキ
シン、連鎖球菌( Streptococcus)の産
生物、種々のダラム陰性細菌のりボタンパク質及び糖タ
ンパク質、及び種々の由来の多糖が含まれる。
この分野では、現在活発な研究が行われている。
[発明の解決しようとする課題]
本発明は、この免疫療法の分野に別個の要素を追加する
ものである。というのは、本発明は、非常に興味深い免
疫調節特性を付与された新規な細胞外エキソポリマーに
関するものだからである。より正確には、本発明は、特
許請求の範囲第1項に規定された如き、そこに記述の方
法によって調製された前記工牛ソボリマー、並びに細胞
外エキソポリマーを得るための方法を包含している。本
発明の他の項目については、以下に記載される。
ものである。というのは、本発明は、非常に興味深い免
疫調節特性を付与された新規な細胞外エキソポリマーに
関するものだからである。より正確には、本発明は、特
許請求の範囲第1項に規定された如き、そこに記述の方
法によって調製された前記工牛ソボリマー、並びに細胞
外エキソポリマーを得るための方法を包含している。本
発明の他の項目については、以下に記載される。
本発明に係るエキソポリマーは、新規に分離されたlj
fidobscteriuz infztttis l
oHttx種の遺択された株を培養することによって産
生された。これはダラム陽性細菌であり、指標形質は1
ifidobsclert’uz infstttis
とlifidobscteriuxlθ/ll:IIの
間のものを示す。免疫調節特性を有していることが実験
的に立証され、従ってこのエキソポリマーはヒト及び動
物に対する薬剤について非常に興味のあるものである。
fidobscteriuz infztttis l
oHttx種の遺択された株を培養することによって産
生された。これはダラム陽性細菌であり、指標形質は1
ifidobsclert’uz infstttis
とlifidobscteriuxlθ/ll:IIの
間のものを示す。免疫調節特性を有していることが実験
的に立証され、従ってこのエキソポリマーはヒト及び動
物に対する薬剤について非常に興味のあるものである。
[課題を解決するための手段]
本発明に包含される方法は、パスツール研究所(Ins
titut Pas’teur)の国立微生物培養菌寄
託所(Collect10n Nat10nale d
e Culture deMicroorganjsm
es (CNCM))にNo. I−885として寄託
されたIifidobscteriuz infant
is Iottguzの細菌株IBSを適当な培地にお
いて嫌気的条件下で培養し、培地から該微生物を除去し
た後に産生されたエキソポリマーを分離し、濃縮し、次
いで有機溶媒を添加して沈澱させることを特徴としてい
る。最後に、沈澱によって得られた生成物は凍結乾燥さ
れる。
titut Pas’teur)の国立微生物培養菌寄
託所(Collect10n Nat10nale d
e Culture deMicroorganjsm
es (CNCM))にNo. I−885として寄託
されたIifidobscteriuz infant
is Iottguzの細菌株IBSを適当な培地にお
いて嫌気的条件下で培養し、培地から該微生物を除去し
た後に産生されたエキソポリマーを分離し、濃縮し、次
いで有機溶媒を添加して沈澱させることを特徴としてい
る。最後に、沈澱によって得られた生成物は凍結乾燥さ
れる。
IBS株は、その戊分が10, 000ドルトンよりも
低い分子量の適当な培地のどのようなタイプにおいても
、嫌気的条件下において好ましくは約37℃で培養する
ことができる。かかる培地の組戊の詳細については後述
する。
低い分子量の適当な培地のどのようなタイプにおいても
、嫌気的条件下において好ましくは約37℃で培養する
ことができる。かかる培地の組戊の詳細については後述
する。
微生物は好ましくは遠心分離によって培地から除去され
、エキソポリマーは例えば、10, 000ドルトンに
等しいかまたはこれよりも大きな保持閾値を有する較正
された多孔質膜上で限外濾過することによって分離され
る。
、エキソポリマーは例えば、10, 000ドルトンに
等しいかまたはこれよりも大きな保持閾値を有する較正
された多孔質膜上で限外濾過することによって分離され
る。
こうして分離された産生物は、次いで濃縮され、透析さ
れ、有機溶媒、好ましくはエタノールを添加することに
よって枕澱され、そして最後に凍結乾燥される。
れ、有機溶媒、好ましくはエタノールを添加することに
よって枕澱され、そして最後に凍結乾燥される。
その結果得られるエキソポリマーは、本来的に多糖的な
性質を有し、1:1から4=1の割合のグルコースとガ
ラクトースとから基本的になり、多くて30重量%に等
しいタンパク質的フラクションを含んでいる。
性質を有し、1:1から4=1の割合のグルコースとガ
ラクトースとから基本的になり、多くて30重量%に等
しいタンパク質的フラクションを含んでいる。
本発明のエキソポリマーの有するみかけの分子量は10
, 000から10o, 000ドルトン、好ましくは
20, 000から30, 000ドルトンである。こ
れは平衡状態において、低分子量のユニットとともに、
約10’の゜分子量の集塊を形威し得る。これはまた、
核酸、脂質及び有機酸を含んでいない。
, 000から10o, 000ドルトン、好ましくは
20, 000から30, 000ドルトンである。こ
れは平衡状態において、低分子量のユニットとともに、
約10’の゜分子量の集塊を形威し得る。これはまた、
核酸、脂質及び有機酸を含んでいない。
こうして分離され精製されたエキソポリマーは、無毒で
ある一方、興味深い免疫調節特性を有している。in
vjtro及びity yiyoのいずれの実験におい
ても、IBS株から産生されたエキソポリマーが免疫調
節剤のように作用し、宿主の非特異的耐性を高めること
が示された。これはまた明確な抗白血病(抗腫瘍)特性
を有するが、その由来は後述するrlBs株産生エキソ
ポリマーの免疫調節特性の測定」に記載されたその免疫
調節特性に結び付けることができる。
ある一方、興味深い免疫調節特性を有している。in
vjtro及びity yiyoのいずれの実験におい
ても、IBS株から産生されたエキソポリマーが免疫調
節剤のように作用し、宿主の非特異的耐性を高めること
が示された。これはまた明確な抗白血病(抗腫瘍)特性
を有するが、その由来は後述するrlBs株産生エキソ
ポリマーの免疫調節特性の測定」に記載されたその免疫
調節特性に結び付けることができる。
かくして、IBS株によって産生されたエキソポリマー
は各種の薬剤の活性成分として有利に用いることができ
、かかる薬剤は経口、非経口並びに局所的に投与するこ
とができる。これらの薬剤は、ヒト及び動物用の薬剤と
して通常用いられている形態、例えば錠剤や糖衣錠、カ
プセル、小丸剤、液体、シロノプ、座薬、注射液、ペノ
サリー クリーム、ポマード、ローション、点滴剤及び
目薬などの形態で提供することができる。
は各種の薬剤の活性成分として有利に用いることができ
、かかる薬剤は経口、非経口並びに局所的に投与するこ
とができる。これらの薬剤は、ヒト及び動物用の薬剤と
して通常用いられている形態、例えば錠剤や糖衣錠、カ
プセル、小丸剤、液体、シロノプ、座薬、注射液、ペノ
サリー クリーム、ポマード、ローション、点滴剤及び
目薬などの形態で提供することができる。
活性戊分(エキソポリマー)は上記のような薬剤中に、
単独で叉は他の薬理学的活性剤と共に含有させることが
できる。この目的について用いられる賦形剤は通常のも
のであり、例えばタルク、アラビアゴム、マンニトール
、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、力ヵオバター
水性又は非水性ビヒクル、動物又は植物由来の脂肪性物
質、バラフィン誘導体、グリフール類、各種の湿潤剤、
分散剤叉は乳化剤、並びに防腐剤などである。
単独で叉は他の薬理学的活性剤と共に含有させることが
できる。この目的について用いられる賦形剤は通常のも
のであり、例えばタルク、アラビアゴム、マンニトール
、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、力ヵオバター
水性又は非水性ビヒクル、動物又は植物由来の脂肪性物
質、バラフィン誘導体、グリフール類、各種の湿潤剤、
分散剤叉は乳化剤、並びに防腐剤などである。
動物については、マウスについての著しい免疫調節効果
が、マウスー匹あたり4−400μgの間の投与量にお
いて観察された。
が、マウスー匹あたり4−400μgの間の投与量にお
いて観察された。
以下に示す実施例は、限定ではなく本発明を例示的に示
すことを意図している。これらはより特定的には、エキ
ソポリマー(PBaDともいう)の調製と、その薬理作
用に関するものである。
すことを意図している。これらはより特定的には、エキ
ソポリマー(PBaDともいう)の調製と、その薬理作
用に関するものである。
lBS株を以下の寒天培地において、37℃の嫌気的条
件下(空気は発酵の開始時に除去した)で培養する。
件下(空気は発酵の開始時に除去した)で培養する。
ベブトン(MW< 10, 000ドルトン〉5g/塩
化ナトリウム 3 g/グルコー
ス 10 g/システイン
0.5 g/酢酸ナトリウム
2 g/リン酸水素二ナトリウ
ム 2.87 g/リン酸二水素カリウム
1.12g/硫酸マグネシウム
0.09 g/リン酸二水素ナトリウム 0
.15g/炭酸水素ナトリウム 2.2
g/ITween 80
1 ml/1ビタミン溶液 1
0 ml/1収率を上げるために、CYTODEX@
叉は同様な固形支持体を培地に添加すると有利となり得
る。
化ナトリウム 3 g/グルコー
ス 10 g/システイン
0.5 g/酢酸ナトリウム
2 g/リン酸水素二ナトリウ
ム 2.87 g/リン酸二水素カリウム
1.12g/硫酸マグネシウム
0.09 g/リン酸二水素ナトリウム 0
.15g/炭酸水素ナトリウム 2.2
g/ITween 80
1 ml/1ビタミン溶液 1
0 ml/1収率を上げるために、CYTODEX@
叉は同様な固形支持体を培地に添加すると有利となり得
る。
この条件下において、IBs株はエキソポリマーを産生
じ、それはここにおける目的のために開発された後述の
EL I SA試験法を用いて、上清中で定量すること
ができる。
じ、それはここにおける目的のために開発された後述の
EL I SA試験法を用いて、上清中で定量すること
ができる。
実施例
10リットルの上記培地を調製し、殺菌するために12
リットルの発酵槽に入れた。次いでこの発酵槽に、同じ
培地で48時間培養したIBs株の培養細菌1000m
lを接種した。90%のN,と10%のCO,の混合物
を、1分あたり3リットルの割合で20分間にわたって
吹き込んだ。
リットルの発酵槽に入れた。次いでこの発酵槽に、同じ
培地で48時間培養したIBs株の培養細菌1000m
lを接種した。90%のN,と10%のCO,の混合物
を、1分あたり3リットルの割合で20分間にわたって
吹き込んだ。
培養は37℃において400rpmで攪拌しながら、発
酵の最初の2時間の間に培地に注入される通常の割合の
N./Co.混合物の存在下において行った。48時間
後の発酵過程の完了に際し、産生された多糖の量をEL
I SA法によって測定した。
酵の最初の2時間の間に培地に注入される通常の割合の
N./Co.混合物の存在下において行った。48時間
後の発酵過程の完了に際し、産生された多糖の量をEL
I SA法によって測定した。
最小収量は35μg/m 1であった。
段階B:産生エキソポリマーの分離精製発酵過程の完了
に際し、細胞を遠心によって分離する。細胞が沈降した
後、Amicon hallowFiber H5 P
IO−43型の装置を用いて、上清を限外濾過する。1
0, 000ドルトンよりも大きな分子だけが保持され
る。産生されたエキソポリマーを含む溶液を10倍に濃
縮し、次いで透析する。
に際し、細胞を遠心によって分離する。細胞が沈降した
後、Amicon hallowFiber H5 P
IO−43型の装置を用いて、上清を限外濾過する。1
0, 000ドルトンよりも大きな分子だけが保持され
る。産生されたエキソポリマーを含む溶液を10倍に濃
縮し、次いで透析する。
濃縮した溶液は、アルコール(エタノール/水;3:1
v/v)で沈澱させる。
v/v)で沈澱させる。
最後に、エタノールで沈澱させた産生物を凍結乾燥する
。かくして得られた生成物は、白っぽく、繊維質に見え
る。
。かくして得られた生成物は、白っぽく、繊維質に見え
る。
実施例
前述した培地から10リットルの上清溶液が得られ、遠
心によって1リットルに濃縮した。蒸留水を用いて容積
を10リットルに調節し、次いで再度の遠心によって1
リットルに濃縮した。
心によって1リットルに濃縮した。蒸留水を用いて容積
を10リットルに調節し、次いで再度の遠心によって1
リットルに濃縮した。
この操作を2度行った。かくして得られた1リットルの
濃縮溶液を、次いでエタノールを用いて沈澱させたくエ
タノール/水;3:1v/v)。
濃縮溶液を、次いでエタノールを用いて沈澱させたくエ
タノール/水;3:1v/v)。
得られた沈澱物を凍結乾燥し、約400mgの凍結乾燥
物を生成させた。
物を生成させた。
EL I SA法
用いた抗原は、フェノールによる付加的な脱タンパクに
よって純度を高めた多糖調製物である。初期投与jl0
.5mgをウサギに対し2回の注射により、即ち一つは
腹腔内注射、もう一つは皮下注射により、フロイントの
完全アジュバントと共に注入した。
よって純度を高めた多糖調製物である。初期投与jl0
.5mgをウサギに対し2回の注射により、即ち一つは
腹腔内注射、もう一つは皮下注射により、フロイントの
完全アジュバントと共に注入した。
この注射を15日目に、今度はフロイントの不完全アジ
ュバントと共に再度行った。その15日後にウサギから
採血し、SEPHADEX G 200のカラムによる
クロマトグラフィーにより精製されたエキソポリマーと
、エタノールで沈澱させた後にlifiσσbacte
rluzの培地の上清中に存在しているエキソポリマー
をEL I SA法によって認識するのを可能ならしめ
るだけの高い抗体レベルの抗血清を得た。
ュバントと共に再度行った。その15日後にウサギから
採血し、SEPHADEX G 200のカラムによる
クロマトグラフィーにより精製されたエキソポリマーと
、エタノールで沈澱させた後にlifiσσbacte
rluzの培地の上清中に存在しているエキソポリマー
をEL I SA法によって認識するのを可能ならしめ
るだけの高い抗体レベルの抗血清を得た。
EL I SAテストは、マイクロプレート上で行った
。抗原を吸着させ、次いで、空いたまま残された個所に
血清アルブミンを満たした。次にウサギから得た特異的
抗体を用いて培養を行った。次いでこのウサギの抗体に
対する抗体を添加した。これらはアルカリホスファター
ゼに接合されていた。最後に基質(オルトニト口フェニ
ルホスフェート)を添加した。培養の後、3M NaO
Hを用いて反応を停止させた。EL I SAリーダー
により、405 nmで光学密度 (吸光度)を測定し
た。この手順により、4μgの精製抗原濃縮物について
lO−4という抗血清の希釈倍率についても確実な読み
取りを可能ならしめるだけの十分に高い抗体力価が得ら
れる。
。抗原を吸着させ、次いで、空いたまま残された個所に
血清アルブミンを満たした。次にウサギから得た特異的
抗体を用いて培養を行った。次いでこのウサギの抗体に
対する抗体を添加した。これらはアルカリホスファター
ゼに接合されていた。最後に基質(オルトニト口フェニ
ルホスフェート)を添加した。培養の後、3M NaO
Hを用いて反応を停止させた。EL I SAリーダー
により、405 nmで光学密度 (吸光度)を測定し
た。この手順により、4μgの精製抗原濃縮物について
lO−4という抗血清の希釈倍率についても確実な読み
取りを可能ならしめるだけの十分に高い抗体力価が得ら
れる。
IBS林産生エキソポリマーの性質
1)得られた産生物は本質的に、5:1の比率の糖質(
フェノール/硫酸法により測定)とタンパク質(ローリ
一法により測定)とからなる。
フェノール/硫酸法により測定)とタンパク質(ローリ
一法により測定)とからなる。
イオン排除クロマトグラフィー叉はガスクロマトグラフ
ィーによる分析結果によれば、この産生物はいかなる核
酸も含んではいない。
ィーによる分析結果によれば、この産生物はいかなる核
酸も含んではいない。
いかなる場合にも、氷解物はペントースを含まない。n
−へブタンで抽出した後にガスクロマトグラフィーで得
た結果によれば、この産生物は脂質を含まない。イオン
排除クロマトグラフィーにより行った測定によれば、有
機酸は存在していない。
−へブタンで抽出した後にガスクロマトグラフィーで得
た結果によれば、この産生物は脂質を含まない。イオン
排除クロマトグラフィーにより行った測定によれば、有
機酸は存在していない。
2) RP−8 300人のカラムによる高性能液体
クロマトグラフィーにより得られた結果によれば、産生
物は糖タンパク質的な性質を有する。
クロマトグラフィーにより得られた結果によれば、産生
物は糖タンパク質的な性質を有する。
3) イオン排除、薄層およびガスクロマトグラフィー
によって得られた分析的な証拠によれば、糖質部分はグ
ルコースとガラクトースとからなる。
によって得られた分析的な証拠によれば、糖質部分はグ
ルコースとガラクトースとからなる。
4) メタノリシスにより加水分解し次いでトリフルオ
ロアセチル化によりアセチル化したモノマーからガスク
ロマトグラフィーによって得た結果によれば、グルコー
スとガラクトースは3:2の割合で存在している。
ロアセチル化によりアセチル化したモノマーからガスク
ロマトグラフィーによって得た結果によれば、グルコー
スとガラクトースは3:2の割合で存在している。
5) メチル化され(メタノリシスにより)次いでアセ
チル化された(トリフルオロアセチル化により)モノマ
ーからのガスクロマトグラフィーにより得たクロマトグ
ラムによれば、多糖部分は1−2、1−3、1−4及び
1一6結合で分岐している。
チル化された(トリフルオロアセチル化により)モノマ
ーからのガスクロマトグラフィーにより得たクロマトグ
ラムによれば、多糖部分は1−2、1−3、1−4及び
1一6結合で分岐している。
6) ブラーク形戊細胞(PFC)の数の増大を刺激す
る能力として測定される生物学的活性は、糖質部分に由
来しており、プロテイナーゼKで処理してタンパク質部
分を損傷した後にも維持される。
る能力として測定される生物学的活性は、糖質部分に由
来しており、プロテイナーゼKで処理してタンパク質部
分を損傷した後にも維持される。
7)おおよその分子量は、SEPHADEX G 20
0を用いたクロマトグラフィーによって得られた結果に
よれば、20, 000から30, 000ドルトンの
間である(低分子量のピーク値)。
0を用いたクロマトグラフィーによって得られた結果に
よれば、20, 000から30, 000ドルトンの
間である(低分子量のピーク値)。
このエキソポリマーは、低分子量のユニットとの平衡状
態において、約lO@ドルトンの分子量の集塊を形成し
得る。
態において、約lO@ドルトンの分子量の集塊を形成し
得る。
牌細胞の増殖
マイトジェンの存在下における牌細胞の増殖は、ミトコ
ンドリア脱水素酵素によるM T T (3−(4.5
−ジメチルチアゾール−2イル)−2. 5−ジフエニ
ルテトラゾリウムブロマイド)のホルマザンへの還元に
よって測定することができる。
ンドリア脱水素酵素によるM T T (3−(4.5
−ジメチルチアゾール−2イル)−2. 5−ジフエニ
ルテトラゾリウムブロマイド)のホルマザンへの還元に
よって測定することができる。
犬凰剋
増殖(マウスの牌細胞C57BL/6)は560 ru
++での光学密度(吸光度)により、PB3D又は基準
PB3Dの誘起する増殖は、は、LPSによって誘起さ
れるよりも僅かに少ない。
++での光学密度(吸光度)により、PB3D又は基準
PB3Dの誘起する増殖は、は、LPSによって誘起さ
れるよりも僅かに少ない。
IBS 産生エキソポリマーの免疫調節特性の測定(
inyiyo試験) 抗体合戊細胞の産生の刺激 マウスについて、本発明のエキソポリマーは、羊赤血球
と共に経口投与した場合、叉は羊赤血球なしで腹腔内投
与した場合に、抗体合戊細胞の産生を非特異的に刺激す
る。このエキソポリマーはまた、シクロホスファミドで
免疫抑制されたマウスについてのこの能力を正常化する
。
inyiyo試験) 抗体合戊細胞の産生の刺激 マウスについて、本発明のエキソポリマーは、羊赤血球
と共に経口投与した場合、叉は羊赤血球なしで腹腔内投
与した場合に、抗体合戊細胞の産生を非特異的に刺激す
る。このエキソポリマーはまた、シクロホスファミドで
免疫抑制されたマウスについてのこの能力を正常化する
。
実施例
PB3Dを5日間経口投与し、19日目と20日目に追
加免疫した後(処置予定A)、叉は追加免疫せずに(処
置予定B)、投与量に応じてマウスの牌臓におけるPF
Cの数の増大を観察し*=p<0.05 X塁旦 マウスあたり400μgの投与量のPB3Dを一回で腹
腔内投与した後、4日の後にPFCの数シク口ホスファ
ミドで免疫抑制されたマウスに対して本発明のエキソポ
リマーを投与することにより、未処理のマウスと比較し
て、処理されたマウスにおいては免疫抑制がより低<、
アるいはPFCの通常の数への回復がより早いこ1)シ
クロホスファミドで免疫抑制されたマウ2)シクロホス
ファミドで免疫抑制され後にP3Dを与えられたマウス 3〉生理的食塩水を与えられたマウス 血清タンパク質の組成に対する影響 ス B 種々の免疫調節剤が、X,LA及びLBとして認識され
る免疫電気泳動法によるパターンを変動させる。本発明
によるエキソポリマーは、そのような変動を生ずるもの
である。
加免疫した後(処置予定A)、叉は追加免疫せずに(処
置予定B)、投与量に応じてマウスの牌臓におけるPF
Cの数の増大を観察し*=p<0.05 X塁旦 マウスあたり400μgの投与量のPB3Dを一回で腹
腔内投与した後、4日の後にPFCの数シク口ホスファ
ミドで免疫抑制されたマウスに対して本発明のエキソポ
リマーを投与することにより、未処理のマウスと比較し
て、処理されたマウスにおいては免疫抑制がより低<、
アるいはPFCの通常の数への回復がより早いこ1)シ
クロホスファミドで免疫抑制されたマウ2)シクロホス
ファミドで免疫抑制され後にP3Dを与えられたマウス 3〉生理的食塩水を与えられたマウス 血清タンパク質の組成に対する影響 ス B 種々の免疫調節剤が、X,LA及びLBとして認識され
る免疫電気泳動法によるパターンを変動させる。本発明
によるエキソポリマーは、そのような変動を生ずるもの
である。
X敷盟
マウス1匹あたりPB3D400μgを腹腔内投与した
ところ、24時間後及び4日後に、大腸菌(Esche
richia coli )のリボ多糖(LPS)によ
って生ずるのと共通性のある血清タンパク質の変性が生
じた。
ところ、24時間後及び4日後に、大腸菌(Esche
richia coli )のリボ多糖(LPS)によ
って生ずるのと共通性のある血清タンパク質の変性が生
じた。
X皇盟
同様に、合計で400μgの投与量を5日続けて80μ
gの投与量に分割して経口投与したところ、エキソポリ
マーの投与の5日後に、タンパク質のそれとわかる変性
が生じた。
gの投与量に分割して経口投与したところ、エキソポリ
マーの投与の5日後に、タンパク質のそれとわかる変性
が生じた。
コロイドカーボンクリアランス
BALB/cマウスに対してエキソポリマーを静脈内投
与したくマウスあたり2. 5mg)。48時間後に、
コロイドカーボン懸濁液0、2mlを静脈内注射した。
与したくマウスあたり2. 5mg)。48時間後に、
コロイドカーボン懸濁液0、2mlを静脈内注射した。
クリアランスと呼ばれる血液中のカーボンの消失を、カ
ーボンの量を時間に対してプロットした対数グラフの傾
斜により表した。本発明のエシク口ホスファミドで免疫
抑制され低温に暴露されたマウスについて、本発明によ
るエキソポリマーが、粘膜レベルにおいてプソイドモナ
ス(PseudozottδS)により引き起こされる
ような細菌感染やウイルス感染(コクサッキ−Bウイル
ス)に対する宿主の非特異的耐性を増大することを観察
することができる。
ーボンの量を時間に対してプロットした対数グラフの傾
斜により表した。本発明のエシク口ホスファミドで免疫
抑制され低温に暴露されたマウスについて、本発明によ
るエキソポリマーが、粘膜レベルにおいてプソイドモナ
ス(PseudozottδS)により引き起こされる
ような細菌感染やウイルス感染(コクサッキ−Bウイル
ス)に対する宿主の非特異的耐性を増大することを観察
することができる。
実施例
200mg/kgのシクロホスファミドを腹腔内投与す
ることにより、マウスの免疫抑制を行った。
ることにより、マウスの免疫抑制を行った。
3日目に、エキソポリマーによる前述した5日間の経口
処理(80μg/マウス7日)を開始した。
処理(80μg/マウス7日)を開始した。
対照とするマウスには、等量の生理的食塩水を与えた。
処理の後数時間後に、マウスについて病原性としたPs
eudozonss serugittosttの株を
マウスに鼻内感染させた。生存率は、処理したマ200
mg/kgのシクロホスファミドを一回で腹腔内投与す
ることにより、マウスの免疫抑制を行った。3日目に、
エヰソボリマーによる前述した5日間の経口処理(80
μg/マウス/臼)を開始した。対照とするマウスには
、等量の生理的食塩水を与えた。処理の後数時間後に、
コクサッキ−85ウイルス(0.5ml.PFU 10
’)でマウスを腹腔内感染させ、生存率を評価した。生
存率は、本発明によるエキソポリマーは、AKRマウス
(自発性白血病を非常に頻繁に生ずる種類の近交系マウ
ス)における白血病の発現を遅らせることができる。こ
のエキソポリマーはまたRFマウスについて、メチルコ
ラントレンのような発ガン性物質により誘発された白血
病の発現を遅らせることができる。(RFという種類は
、メチルコラントレンが自発性白血病を急速に発現させ
る種類の近交マウスである。) 実施例 AKRマウスの二つのグループに、前述した5日間のP
B3Dの経口投与による治療を毎月行い、他方において
もう一つのグループにはこのテスト用生成物を与えずに
対照用のグループとした。処理した二つのグループのう
ち、一方には月々合計で400μg(80μg/マウス
7日を5日間連続)の投与量を与え、他方のグループに
は月々合計で4μgの投与量(0.8μg/マウス7日
を5日間連続)を与えた。
eudozonss serugittosttの株を
マウスに鼻内感染させた。生存率は、処理したマ200
mg/kgのシクロホスファミドを一回で腹腔内投与す
ることにより、マウスの免疫抑制を行った。3日目に、
エヰソボリマーによる前述した5日間の経口処理(80
μg/マウス/臼)を開始した。対照とするマウスには
、等量の生理的食塩水を与えた。処理の後数時間後に、
コクサッキ−85ウイルス(0.5ml.PFU 10
’)でマウスを腹腔内感染させ、生存率を評価した。生
存率は、本発明によるエキソポリマーは、AKRマウス
(自発性白血病を非常に頻繁に生ずる種類の近交系マウ
ス)における白血病の発現を遅らせることができる。こ
のエキソポリマーはまたRFマウスについて、メチルコ
ラントレンのような発ガン性物質により誘発された白血
病の発現を遅らせることができる。(RFという種類は
、メチルコラントレンが自発性白血病を急速に発現させ
る種類の近交マウスである。) 実施例 AKRマウスの二つのグループに、前述した5日間のP
B3Dの経口投与による治療を毎月行い、他方において
もう一つのグループにはこのテスト用生成物を与えずに
対照用のグループとした。処理した二つのグループのう
ち、一方には月々合計で400μg(80μg/マウス
7日を5日間連続)の投与量を与え、他方のグループに
は月々合計で4μgの投与量(0.8μg/マウス7日
を5日間連続)を与えた。
得られた結果は、処理したマウスにおける白血病の発現
の遅れを示していた。この遅れの程度は、月々合計で4
00μgの投与を受けていたグループについて明らかに
重要なものであった。
の遅れを示していた。この遅れの程度は、月々合計で4
00μgの投与を受けていたグループについて明らかに
重要なものであった。
このことは、処理グループにそれぞれ400μgと40
μgのPB3Dを投与した別の実験によって確認された
。
μgのPB3Dを投与した別の実験によって確認された
。
実JLL
実施例
前述した如きメチルコラントレンの投与に先立つ2カ月
の間に、RFマウスの二つのグループにPB3Dを3週
間離して2回経口投与した。
の間に、RFマウスの二つのグループにPB3Dを3週
間離して2回経口投与した。
一方のグループには月々合計で400μg(80μg/
マウス7日を5日間連続)の量を投与し、他方のグルー
プには月々合計で4μgの量(0.8μg/マウス7日
を5日間連続)を与えた。対照とするコントロールグル
ープには何も処理を行わなかった。白血病は、マウスの
体の適切に剃毛した区域で皮膚に塗布することによって
誘発した。PB3Dの投与は、白血病の発現を遅らせた
。この遅れは、400μgのPB3Dを投与されたグル
ープにおいて明らかに重要なものであった。
マウス7日を5日間連続)の量を投与し、他方のグルー
プには月々合計で4μgの量(0.8μg/マウス7日
を5日間連続)を与えた。対照とするコントロールグル
ープには何も処理を行わなかった。白血病は、マウスの
体の適切に剃毛した区域で皮膚に塗布することによって
誘発した。PB3Dの投与は、白血病の発現を遅らせた
。この遅れは、400μgのPB3Dを投与されたグル
ープにおいて明らかに重要なものであった。
急性毒性
急性毒性に関する試験は、エキソポリマーを次の投与量
でもって静脈内注射することによって実行した。即ちマ
ウスあたり1μg、10μg、15μg, 100μg
, 300μg, 600μg及び1200μgを、各
々の投与量について5匹のマウスに対し、尾例の静脈内
に投与した。どの投与量についてもマウスにおける何の
拒絶反応もなく、マウスは注射後2カ月の後も生存して
いた。
でもって静脈内注射することによって実行した。即ちマ
ウスあたり1μg、10μg、15μg, 100μg
, 300μg, 600μg及び1200μgを、各
々の投与量について5匹のマウスに対し、尾例の静脈内
に投与した。どの投与量についてもマウスにおける何の
拒絶反応もなく、マウスは注射後2カ月の後も生存して
いた。
細菌株の説明
1ifidobaclerjuz infantis
lottguzのIBs株は、1989年7月6日に、
国立微生物培養菌寄託所(Collect10n Na
t10nale de Culture deMicr
oorganismes (CNCM)) (バスツ
ール研究所(Institut Pasteur, 2
5 rue du Docteur Roux,757
24 Paris, Cedex, France)内
〉に寄託された。その寄託番号はNo. !−885で
ある。
lottguzのIBs株は、1989年7月6日に、
国立微生物培養菌寄託所(Collect10n Na
t10nale de Culture deMicr
oorganismes (CNCM)) (バスツ
ール研究所(Institut Pasteur, 2
5 rue du Docteur Roux,757
24 Paris, Cedex, France)内
〉に寄託された。その寄託番号はNo. !−885で
ある。
この株はヒト由来の糞便排泄物を含有する廃水から分離
され、lifidobzcteriuz infant
isと!Hfidobzcteriuz loHuxの
間の指標形質を示す。
され、lifidobzcteriuz infant
isと!Hfidobzcteriuz loHuxの
間の指標形質を示す。
そしてこの株は、構戊戊分のプロフィール、D一グルフ
ースの発酵異化代謝産物のプロフィール、抗性物質耐性
のプロフィール、及び本発明に包含されるエキソポリマ
ーの産生によって類型化可能である。
ースの発酵異化代謝産物のプロフィール、抗性物質耐性
のプロフィール、及び本発明に包含されるエキソポリマ
ーの産生によって類型化可能である。
[発明の効果]
以上のごとく本発明によれば、免疫調節特性を与えられ
た細胞外エキソポリマーが、バスツール研究所(CNC
M)にNo. I−885として寄託された1ifid
obscterittz ittfsntis/IoH
uz株を適当な培地で嫌気的条件下で培養することによ
り調製される。微生物を培地から除去した後に、産生さ
れたエキソポリマーは分離され、濃縮され、次いで有機
溶媒を添加することによって沈澱され、最後にこの沈澱
により得られた生成物が凍結乾燥される。
た細胞外エキソポリマーが、バスツール研究所(CNC
M)にNo. I−885として寄託された1ifid
obscterittz ittfsntis/IoH
uz株を適当な培地で嫌気的条件下で培養することによ
り調製される。微生物を培地から除去した後に、産生さ
れたエキソポリマーは分離され、濃縮され、次いで有機
溶媒を添加することによって沈澱され、最後にこの沈澱
により得られた生成物が凍結乾燥される。
こうして得られたこのエキソポリマーは、細胞性免疫及
び体肢性免疫について活性を有し、従って全ての潜在的
な治療的用途において免疫調節剤として使用することが
できる。
び体肢性免疫について活性を有し、従って全ての潜在的
な治療的用途において免疫調節剤として使用することが
できる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 仏国国立微生物培養菌寄託所(CNCM)にNo.
1−885として寄託したビフィドバクテリウム・イン
ファンティス・ロングム(Bifidobacteri
uminfantis longum)の細菌株を適当
な培地において嫌気的条件下で培養し、培地から該微生
物を除去し、産生されたエキソポリマーを分離し、濃縮
し、次いで有機溶媒を添加して前記エキソポリマーを沈
澱させ、最後に沈澱により得られた生成物を凍結乾燥す
ることを特徴とする細胞外エキソポリマー。 2 免疫調節特性を特徴とする、請求項1記載のエキソ
ポリマー。 3 本質的に多糖的性質を有し、基本的にグルコースと
ガラクトースを1:1から4:1の間の割合で含み、多
くて30重量%に等しいタンパク質画分を含有すること
を特徴とする、請求項1叉は2記載のエキソポリマー。 4 グルコース対ガラクトースの比が3:2の範囲にあ
ることを特徴とする、請求項3記載のエキソポリマー。 5 みかけの分子量が10,000から100,000
ドルトン、好ましくは20,000から30,000ド
ルトンの間にあり、低分子量のユニットとの平衡におい
て約10^6ドルトンの分子量の集塊を形成し得ること
を特徴とする、請求項1から4のいずれか1つに記載の
エキソポリマー。 6 核酸、脂質及び有機酸を含まないことを特徴とする
、請求項1から5のいずれか1つに記載のエキソポリマ
ー。 7 請求項1に記載の細胞外エキソポリマーの調製方法
であって、CNCMにNo.1−885として寄託した
ビフィドバクテリウム・インファンティス・ロングム(
Bifidobacterium infantisl
ongum)の細菌株を適当な培地において嫌気的条件
下で培養し、培地から該微生物を除去した後に産生され
たエキソポリマーを分離し、濃縮し、有機溶媒を添加し
て沈澱させ、最後に沈澱により得られた生成物を凍結乾
燥することを特徴とする方法。 8 エキソポリマーは、10,000ドルトンに等しい
か叉はこれよりも高い保持閾値を有する較正された多孔
質膜上で限外濾過することによって培地から分離される
ことを特徴とする、請求項7記載の方法。 9 培地から分離されたエキソポリマーは限外濾過によ
って濃縮されることを特徴とする、請求項7叉は8記載
の方法。 10 エキソポリマーはアルコール、好ましくはエタノ
ールを添加することにより沈澱されることを特徴とする
、請求項7から9のいずれか1つに記載の方法。 11 請求項1から6のいずれか1つによる細胞外エキ
ソポリマーを活性成分として含有する薬剤組成物。 12 免疫調節活性、抗感染及び/叉は抗腫瘍治療活性
を有する、請求項11記載の薬剤組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CH3536/89-3 | 1989-09-29 | ||
CH3536/89A CH679677A5 (ja) | 1989-09-29 | 1989-09-29 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03170503A true JPH03170503A (ja) | 1991-07-24 |
Family
ID=4258109
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2251646A Pending JPH03170503A (ja) | 1989-09-29 | 1990-09-20 | 細胞外エキソポリマー、その調製方法及び該エキソポリマーを含む薬剤組成物 |
Country Status (37)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5114848A (ja) |
JP (1) | JPH03170503A (ja) |
KR (1) | KR910006489A (ja) |
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BG (1) | BG60275B1 (ja) |
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EG (1) | EG19285A (ja) |
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