FR2652590A1 - Exopolymere extracellulaire, son procede de preparation et compositions pharmaceutiques le contenant. - Google Patents
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Abstract
Exopolymère extracellulaire doué de propriétés immunomodulatrices obtenu par culture, en conditions anaérobes dans un milieu approprié, de la souche de Bifidobacterium infantis longum déposée à l'Institut Pasteur sous le No. I-885. Une fois les microorganismes éliminés du milieu de culture, l'exopolymère ainsi produit est isolé, concentré et précipité par l'adjonction d'un solvant organique; finalement le produit résultant de la précipitation est lyophilisé. L'exopolymère ainsi obtenu possède sur l'immunité tant cellulaire que humorale une activité telle qu'elle permet d'envisager son utilisation thérapeutique en tant qu'agent immunomodulateur dans toutes ses potentialités.
Description
La présente invention se rapporte à un exopolymère extracellulaire obtenu
par culture de souches bactériennes sélectionnées du genre Bifidobacterium et doué de propriétés immunomodulatrices. La présente invention a également pour objet le procédé de préparation de cet exopolymère ainsi que les médicaments contenant le dit
exopolymère comme principe actif.
De nombreuses affections comme des allergies, des maladies autoimmunes, des maladies infectieuses ou certains cancers, ont pour commun dénominateur un dérèglement primaire ou secondaire du système immunitaire. Si les immunodéficiences primaires sont rares et généralement d'origine génétique, les déficiences secondaires sont plus fréquentes et leurs causes le plus souvent extrinsèques parmi lesquelles on trouvera la survenue d'infections répétées, le vieillissement, le cancer, des déficits nutritionnels, l'exposition
à des substances immunotoxiques et le stress.
L'immunothérapie permet de palier aux symptômes des déficiences primaires et de restaurer l'état immunitaire lors de déficiences
secondaires.
Un grand nombre d'agents immunothérapeutiques ont été développés, qu'il s'agisse d'immunostimulants ou d'immunosuppresseurs. De façon générale, sous la définition d'immunomodulateur sont regroupés les agents qui améliorent de manière non spécifique la réactivité spécifique de l'hôte ainsi que les mécanismes effecteurs non spécifiques. On distinguera des immunomodulateurs de synthèse et des immunomodulateurs d'origine biologique se regroupant en produits microbiens et extraits d'origine animale, voire humaine, dont les -2 - hormones thymiques, les extraits dialysables de leucocytes, les interférons et cytokines. De fait, l'activation des lymphocytes ou des macrophages, ainsi que leurs intermodulations sont significativement modifiées par l'exposition à des molécules structurelles de microorganismes, ou à des composants biologiquement actifs produits par ces derniers. Une grande variété de bactéries et de produits bactériens ont montré leur influence sur le système immun; cet arsenal d'agents immunomodulateurs d'origine bactérienne inclut les mycobactéries et leurs produits, les lipopolysaccharides de bactéries gram -, des entérotoxines de Vibrio cholerae, des produits de Streptococcus, des lipoprotéines et glycoprotéines de diverses bactéries gram -, et des polysaccharides d'origines diverses. Une recherche intensive est actuellement
menée dans ce domaine.
L'invention apporte un élément supplémentaire à cet édifice qu'est l'immunothérapie puisqu'elle a pour objet un nouvel exopolymère extracellulaire doué de propriétés immunomodulatrices fort intéressantes. Plus précisément, l'invention a pour objet un exopolymère extracellulaire tel que produit par la culture en conditions anaérotes dans un milieu approprié d'une souche bactérienne de Bifidobacterium infantis longum déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM/Institut Pasteur) sous le N I-885, et isolé par élimination des microorganismes du milieu de culture, concentré puis précipité par l'adjonction d'un solvant organique et finalement lyophilisé. L'invention a également pour objet le procédé d'obtention de cet exopolymère extracellulaire. D'autres objets de la présente invention apparaîtront à la lecture du texte ci-après _ 3 L'exopolymère objet de la présente invention est produit lors de la culture de souches sélectionnées de l'espèce Bifidobacterium infantis longum nouvellement isolée, bactérie gram +, présentant des caractéristiques taxonomiques intermédiaires entre Bifidobacterium infantis et Bifidobacterium longum. Doué de propriétés immunomodulatrices démontrées expérimentalement, cet exopolymère présente donc un réel intérêt pour la médecine humaine et vétérinaire. Le procédé selon l'invention se caractérise par le fait que l'on cultive dans un milieu approprié, en conditions anaérobes, la souche - 4 - lBS de Bifidobacterium infantis longum déposée à l'Institut Pasteur (Collection Nationale de Culture de Microorganismes - CNCM) sous le N 1-885 et, qu'après élimination des microorganismes du milieu de culture, on isole puis concentre l'exopolymère ainsi produit, on le précipite par addition de solvant organique et
finalement lyophilise le produit résultant de la précipitation.
La culture de la souche lBS peut être effectuée dans tout type de milieu approprié dont les composants ont un poids moléculaire inférieur à 101000 daltons, en conditions anaérobes, de préférence à 37 C environ dans un milieu dont la composition détaillée figure
plus loin.
L'élimination des microorganismes du milieu de culture s'effectue de préférence par centrifugation, la séparation de l'exopolymère s'effectuant par exemple par ultrafiltration sur membrane poreuse calibrée présentant un seuil de rétention supérieur ou égal à 10'000 daltons. Le produit ainsi isolé est ensuite soumis à concentration et dialyse subséquente, précipitation à l'aide d'un solvant organique, de
l'éthanol de préférence, et finalement lyophilisation.
L'exopolymère résultant est caractérisé par le fait qu'il est essentiellement de nature polysaccharidique, composé surtout de glucose et de galactose dans une proportion comprise entre 1:1 et 4:1 et par une fraction protéique au plus égale à 30 % en poids. Au sein de la fraction polysacharidique, la proportion de glucose et de galactose est de l'ordre de 1:1 à 4:1, préférentiellement de l'ordre de 3:2 L'exopolymère selon l'invention possède un poids moléculaire apparent compris entre 10'000 et 100'000 daltons, de préférence entre 20'000 et 30'000 daltons. Il peut former des agrégats de poids moléculaire d'environ 106 daltons et ce en équilibre avec les unités de poids moléculaire inférieur. Il se caractérise en outre / -5 - par le fait qu'il est exempt d'acides nucléiques, de lipides et
d'acides organiques.
L'exopolymère ainsi isolé et purifié présente d'intéressantes
propriétés immunomodulatrices tout en étant dépourvu de toxicité.
Les expérimentations in vitro et in vivo effectuées montrent que l'exopolymère issu de la souche lBS se comporte comme immunomodulateur et qu'il induit une augmentation de la résistance non spécifique. Il possède en outre des propriétés antileucémiques (antitumorales) certaines, dont l'origine est sans doute à rechercher dans ses propriétés immunomodulatrices dont la
description figure sous "Détermination des propriétés
immunomodulatrices de l'exopolymère issu de la souche lBS".
De ce fait, l'exopolymère issu de la souche lBS peut être avantageusement utilisé comme principe actif de diverses compositions pharmaceutiques, administrables aussi bien par voie orale, que parentérale ou locale. Ces compositions peuvent se présenter sous les formes couramment utilisées en médecine humaine ou vétérinaire, par exemple sous forme de comprimés, simples ou dragéifiés, de gélules, de granulés, de solutions, de sirops, de suppositoires, de préparations injectables, d'ovules, de crèmes, de pommades, de lotions, de gouttes et de collyres; elles sont
préparées selon les méthodes usuelles.
Dans de telles compositions, le principe actif (exopolymère) peut être incorporé seul ou conjointement à d'autres agents pharmacologiquement actifs. Les excipients utilisés à cet effet sont des excipients usuels, tels le talc, la gomme arabique, le mannitol, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents
mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs.
1./. - 6 - Chez l'animal, des effets immunomodulateurs significatifs ont été
observés pour des doses totales de 4-400 pg par souris.
Les-exemples ci-après illustrent l'invention sans pour autant la limiter. Ils concernent plus particulièrement la préparation de l'exopolymère (aussi appellé PB3D) et la mise en évidence de ses
propriétés pharmacologiques.
PREPARATION DE L'EXOPOLYMERE PAR CULTURE DE LA SOUCHE BACTERIENNE
lBS DE BIFIDOBACTERIUM INFANTIS LONGUM STADE A: Culture de la souche lBS La souche lBS est cultivée en conditions anaérobes (l'air sera éliminé au début de la fermentation) à 37 C dans un milieu dont la composition est donnée ci-dessous: Peptone (PM < 10'000 daltons) 5 g/l NaCl 3 g/l Glucose 10 g/1 Cystéine 0,5 g/l Acétate de sodium 2 g/l Na2HPO4 2,87 g/l KH2PO4 1, 12 g/l MgSO4 0,09 g/l NaH2PO4 0,15 g/l NaHCO3 2,2 g/1 Tween 1 ml/1 Solution de vitamine 10 ml/l Un support solide tel que le Cytodex ou un autre support équivalent peut être avantageusement ajouté au milieu de culture. La souche lBS produit dans ces conditions un exopolymère qui peut être dosé dans le surnageant à l'aide d'un test ELISA mis au point dans ce but et
tel qu'il sera décrit plus loin.
--7 -
Exemple
On prépare 10 I de milieu de culture répondant à la formule donnée plus haut
que l'on place dans un fermenteur d'une capacité de 12 I et que l'on stérilise.
Le fermenteur est inoculé par 1000 ml d'une culture de la souche lBS cultivée sur le même milieu durant 48 heures. On met barboter un mélange d'N2 90 % et CO2 10 % durant 20 min. à raison de 3 I/min On incube à 37 C sous agitation (400 tl7min) et on injecte durant les deux premières heures de fermentation un mélange de N2/CO2 dans les proportions usuellement employées. Après 48 heures, une fois le processus de fermentation terminé, on détermine la quantité de polysaccharide produit par
la méthode ELISA. Le rendement minimal est de ug/ml.
STADE B: Séparation et purification de l'exopolymère Une fois le procédé de fermentation terminé, les cellules sont séparées par centrifugation. Le surnageant, une fois les cellules sédimentées, est soumis à ultrafiltration avec un appareillage de type Hallow Fiber H5 P 10-43 de Amicon ou équivalent. Sont retenues uniquement les molécules de poids moléculaire supérieur à 10'000 daltons. La soluti on contenant l'exopolymère
produit est concentrée 10 x puis soumise à dialyse.
Le concentré est précipité à l'alcool (éthanol: eau; 3:1; v:v).
Finalement, le produit précipité à l'éthanol est lyophilisé. Le produit ainsi
obtenu présente un aspect fibreux de couleur blanchâtre.
Exemple
A partir de la culture obtenue comme décrit plus haut, 10 I de surnageant sont concentrés à 1 I par ultrafiltration. Le volume est ajusté à 10 I avec de l'eau distillée puis réduit une nouvelle fois par ultrafiltration jusqu'à un volume approximatif de I 1. Cette opération est répétée deux fois. Le concentré d'un volume de I I _ 8 ainsi obtenu est ensuite précipité à l'éthanol (3:1, v:v). Le précipité résultant est soumis à une opération de lyophilisation
permettant l'obtention d'environ 400 mg de lyophilisat.
Technique ELISA On utilise comme antigène une préparation polysaccharidique dont la pureté est garantie par une déprotéinisation supplémentaire au phénol. On injecte à un lapin une première dose de 0,5 mg répartie en deux doses de 0,25 mg, l'une par voie intrapéritonéale et l'autre
par voie sous-cutanée conjointement à l'adjuvant complet de Freund.
L'injection est répétée au jour 15 en utilisant cette fois l'adjuvant incomplet de Freund. 15 jours plus tard, le lapin est saigné donnant ainsi un antisérum avec des titres élevés en anticorps qui par la technique ELISA permettent de reconnaître l'exopolymère purifié sur Sephadex G 200 et celui présent dans le surnageant des cultures de Bifidobacterium après précipitation à l'éthanol. Le test d'ELISA est réalisé en microplaque, l'antigène est adsorbé, puis les emplacements laissés libres sont colmatés dans les godets par de l'albumine sérique. Une incubation avec les anticorps spécifiques obtenus chez le lapin est pratiquée; puis sont ajoutés les anticorps, dirigés contre les anticorps de lapin, ils sont conjugués à la phosphatase alcaline. Finalement, le substrat l'orthonitro-phénylphosphate est ajouté. La réaction est arrêtée à l'aide de NaOH 3M. La densité optique est lue à 405 nm avec un lecteur d'ELISA. Par ce procédé on obtient des titres d'anticorps suffisamment élevés qui permettent pour des concentrations d'antigènes purifiés de 4 pg d'obtenir des lectures positives pour
des dilutions de 10-4 d'antisérum.
Caractérisation de l'exopolymère produit par la souche lBS 1) Le produit obtenu selon le procédé d'obtention faisant l'objet de la présente invention, est constitué essentiellement de glucides (tels que mesurés par la méthode au phénol/acide - 9 - sulfurique) et de protéines (mesurées par la méthode, de Lowry)
dans une proportion 5:1.
Le produit ne contient pas d'acides nucléiques selon les résultats analytiques obtenus par chromatographie d'exclusion ionique ou par chromatographie en phase gazeuse. En aucun cas l'hydrolysat ne contient de pentoses. Le produit est dépourvu de lipides selon les résultats de chromatographie gazeuse après extraction au n-heptane. Il n'y a pas d'acides organiques selon
les mesures pratiquées en chromatographie d'exclusion ionique.
2) Selon les données de chromatographie liquide haute pression (HPLC) avec une colonne RP-8 300 A, il s'agit d'un produit de
nature glycoprotéique.
3) La partie glucidique est constituée par du glucose et du galactose selon les différentes preuves analytiques (chromatographie d'exclusion ionique, chromatographie sur
couches minces, chromatographie gazeuse).
4) Le glucose et le galactose sont présents en proportion 3:2 selon les résultats obtenus en chromatographie en phase gazeuse des monomères hydrolysés par méthanolyse puis acétylés par
tri f1 uoroacétyl ati on.
) La partie polysaccharidique est ramifiée avec les liaisons 1-2, 1-3, 14, et 1-6 selon le chromatogramme obtenu en chromatographie en phase gazeuse des monomères méthyl1s
(méthanolyse) puis acétylés (trifluoroacétylation).
6) L'activité biologique mesurée par la capacité à stimuler une augmentation de plages d'hémolyse directe (PFC) provient de la partie glucidique et est maintenue après traitement à la
protéinase K endommageant la partie protéique.
. /.. _10 _ 7) Le poids moléculaire approximatif est situé entre 20'000 et '000 daltons selon la chromatographie sur Sephadex G 200 (pic
de bas poids moléculaire).
L'exopoymère peut former des agrégats de poids moléculaire d'environ 106 daltons et ce en équilibre avec les unités de
poids moléculaire inférieur.
DETERMINATION DES PROPRIETES IMMUNOMODULATRICES DE L'EXOPOLYMERE
ISSU DE LA SOUCHE lBS (PREUVE IN VITRO) Proliferation des cellules spléniques La prolifération de cellules spléniques en présence de mitogènes peut être mesurée par la réduction de MTT (bromure de 3-(4,5dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium) en formazan
par la déhydrogénase mitochondriale.
Exemple
La prolifération (cellules spléniques de souris C57BL/6) est exprimée par la densité optique à 560 nm en fonction de la concentration en PB3D ou en LPS servant de référence:
PB3D LPS
pg/ml DO à 560 nm pg/ml DO à 560 nm
333 1,483 20 1,486
111 1,593 6,77 1,308
37 1,459 2,22 0,964
12,3 1,018 0,74 0,725
4,1 0,580 0,25 0,526
1,4 0,427 0,08 0,423
0,03 0,366
Contrôle 0 0,273 Contrôle 0 0,273
Le PB3D induit une prolifération légèrement inférieure à celle du LPS.
DETERMINATION DES PROPRIETES IMMUNOMODULATRICES DE L'EXOPOLYMERE ISSU
DE LA SOUCHE lBS (PREUVES IN VIVO) Stimulation de la production de cellules synthétisant des anticorps L'exopolymère stimule de manière non spécifique chez la souris la production de cellules produisant des anticorps soit administrés par voie orale conjointement aux globules rouges de mouton, soit i.p. sans globules rouges de mouton. Il normalise aussi cette capacité chez les
souris immunodéprimées par la cyclophosphamide.
Exemple
Après administration par voie orale de PB3D pendant 5 jours consécutifs, et un rappel aux 19 et 20ème jour (organigramme A), ou de PB3D pendant 5 jours consécutifs sans rappel (organigramme B), on observe suivant les doses administrées une augmentation du nombre de
plages d'hémolyse dans la rate des souris.
GRM PFC/106cellules PFC/rate Organigramme A: 400 pg 100% 126%* 136%* (avec rappel) 100% 134%* 145%*
% 131%* 143%*
pg 100% 115%* 123%*
% 125%* 133%*
% 120%* 128%*
Organigramme B: 400 pg 100% 104% 104% (sans rappel) 100% 109%* 104%
% 101% 101%
pg 100% 111%* 113%*
% 117%* 123%*
% 110%* 113%*
* = P < 0,05
- 12 -
Exemple
Après administration par voie intrapéritonéale d'une seule dose de 400 pg/souris de PB30, on observe après 4 jours une augmentation
significative du nombre de PFC.
Produit inoculé PFC/rate Relation groupe ex-
périmental/contrôle Contrôle 12,5 + 0
PB3D 43,75 + 31,37 3,5
Contrôle 6,25 6,85
PB3D 27,08 24,26 4,3
Exemple
L'exopolymère administré à des souris immunodéprimées par la cyclophosphamide permet d'observer chez les animaux traités une immunosuppression inférieure ou une restauration plus rapide des niveaux normaux du nombre de PFC par rapport aux animaux sans traitement. Jours après Traitement PFC/rate PFC/108 l'immunosup- lymphocytes pression
CY1) 1,04 2,25 30 73
PB) 4,71 7,32 83 146
7 CY 0
PB 7,29 6,14 81 84
CY 18,75 13,11 46 38
PB 60,41 64,4 382 508
19 CY 25 10,2 110 96
PB 18,75 8,83 86 83
Contrôles3) 9,5 8,75 58,31 49,2 1) animaux immunodéprimés à la cyclophosphamide 2) animaux immunodéprimés à la cyclophosphamide qui après ont reçu PB3D 3) animaux qui ont reçu une solution saline /. -13 Influence sur la composition des prot4ines sériques Différents immunomodulateurs produisent un changement du profil immunoélectrophorétique des protéines du sérum reconnues sous les dénominations X, LA et LB. L'exopolymère de la présente invention
provoque une telle modification.
Exemple
L'administration intrapéritonéale de 400 pg/souris de PB3D produit après 24 h et après 4 jours un changement des protéines sériques comparable à celui provoqué par le lipopolysaccharide de Escherichia
coli (LPS).
Exemple
De même l'administration orale d'une dose totale de 400 pg répartie en doses durant 5 jours consécutifs de 80 pg par jour provoque un changement des protéines perceptibles 5 jours après l'administration de l'exopolymère. Elimination du carbone colloïdal L'exopolymère est administré par voie i.v. (2,5 mg/souris) à des souris Balb/C. Après 48 h, 0,2 ml d'une suspension de carbone colloïdal sont
injectés par voie i.v.
La disparition du carbone dans le sang, appelée "clearance", est exprimée par la pente des logarithmes de la concentration du carbone en
fonction du temps. L'exopolymère augmente la "clearance".
/.. -14 - Temps Témoin Traité (min) H20-NaCl 0,9% PB3D 2,5 mg
0 1,865 + 0,087 1,815 0,044
2 1,800 + 0,031 1,662 + 0,037
4 1,754 + 0,032 1,531 + 0,065
6 1,588 + 0,009 1,432 0,096
8 1,657 + 0,038 1,305 + 0,073
1,535 + 0,134 1,207 0,105
12 1,588 + 0,045 1,079 0,154
Augmentation de la résistance non spécifique Chez les animaux immunodéprimés par la cyclophosphamide et soumis au froid, il a été possible d'observer que l'exopolymère de la présente invention confère une augmentation de la résistance non spécifique vis-à-vis d'une infection bactérienne telle que celle provoquée par Pseudomonas au niveau des muqueuses ou vis-à-vis d'une infection
virale (virus Coxsakie B).
Exemple
L'immunosuppression est pratiquée avec une dose intrapéritonéale de cyclophosphamide (200 mg/kg). Au 3ème jour commence le traitement oral avec l'exopolymère (80 pg/souris/jour) durant 5 jours consécutifs. Les animaux de contrôle reçoivent une solution saline. Quelques heures après la fin du traitement, les animaux sont infectés par voie intranasale par une souche de Pseudomonas aeruqinosa rendue pathogène
pour la souris. La survie est améliorée chez les animaux traités.
- 15 _
Expérience Traitement Survie (%) 1 Contrôle 8/18 (44) 400 pg PB3D 11/20 (55) 2 Contrôle 0/14 (0) 400 pg PB3D 10/29 (34) 3 Contrôle 7/12 (58) 400 pg PB3D 9/12 (82)
Exemple
L'immunosuppression est pratiquée avec une dose intrapéritonéale de cyclophosphamide (200 mg/kg). Au 3ème jour commence le traitement oral avec l'exopolymère (80 pg/souris/jour) durant 5 jours consécutifs. Les
contrôles reçoivent une quantité équivalente de solution saline.
Quelques heures après la fin du traitement les animaux sont infectés par voie intraperitonéale par le virus de Coxsakie B5 (0,5 ml avec 107 PFU) et le taux de survie évalué. Il est amélioré chez les
animaux traités.
Traitement Conditions après Survie (%) infection Contrôle 4 - 6 C 0/20 (0)
PB3D 4 - 6 C 16/20 (80)
Contrôle 20 C 6/10 (60)
PB3D 20 C 10/10 (100)
Essais de leucémie spontanée ou induite L'exopolymère de la présente invention est susceptible de retarder l'apparition de leucémie chez les souris AKR (souche de souris "inbred" développant à une fréquence élevée de la leucémie spontanée). De même, l'exopolymère est susceptible de retarder chez les souris de la souche RF l'apparition de leucémie induite par une substance carcinogéne comme le méthylcholanthrène). (Cette souche RF est une souche "inbred" chez laquelle le méthylcholanthrène provoque une apparition rapide de
leucémie spontanée).
Exemple
Deux groupes de souris AKR ont reçu mensuellement un traitement oral de jours de PB3D; un troisième groupe n'a pas reçu le produit à tester et sert de contrôle. Des deux groupes traités, l'un a reçu 5 doses journalières de 80 pg (dose totale mensuelle de 400,ug) et l'autre 5 doses journalières de 0,8 pg (dose totale mensuelle de 4 pg). Les résultats montrent un retard dans l'apparition de la leucémie chez les animaux traités. Cette différence est clairement significative dans le groupe ayant reçu 400 pg comme dose totale. Elle a été confirmée par une autre expérience durant laquelle les groupes traités ont reçu
respectivement 400 et 40 pg.
Expérience 1 Age (jours) Incidence de lymphome (%) PB3D 400 pg PB3D 40 pg Contrôles
210 5 0 19
225 5 0 26
240 11 10 40
255 21 10 48
270 26 44 55
285 37 55 62
300 37 55 65
315 42 61 79
330 47 67 83
345 55 72 91
360 61 78 93
375 65 78 98
390 71 83 100
405 71 83 100
420 76 83 100
435 76 83 100
450 76 83 100
465 76 89 100
480 76 89 100
495 82 94 100
/..
- 17 -
Expérience 2 Age (jours) Incidence de lymphome (%) PB3D 400 pg PB3D 40 pg Contrôles
168 0 5 5
0 10 5
182 5 10 5
196 5 15 5
203 5 15 11
210 10 20 11
217 15 30 11
224 15 30 16
231 20 30 26
238 25 30 26
245 25 30 32
252 - 25 40 32
259 30 40 42
273 37 45 47
280 42 45 53
287 53 50 53
294 53 55 58
301 53 60 58
308 53 65 58
315 53 65 63
336 60 65 63
343 60 65 68
350 60 70 68
406 65 70 74
462 65 80 84
518 80 85 95
560 80 85 100
Exemple
Deux groupes de souris RF ont reçu dans les deux mois précédant l'administration (par voie topique) de méthylcholanthrène deux traitements par voie orale de PB3D espacés de 3 semaines. Un groupe a reçu une dose mensuelle de 400 pg réparties en 5 doses de 80 pg durant jours consécutifs, l'autre groupe une dose totale mensuelle de 4 pg répartie également en 5 doses de 0,8 pg. Le groupe de contrôle n'a reçu aucun traitement. L'induction de la leucémie est réalisée par traitement cutané dans une zone du corps convenablement rasé. Le traitement au PB3D retarde l'apparition de leucémie; ce retard est
clairement significatif chez les animaux ayant reçu 400 pg.
Temps après Age Incidence de lymphome (%) traitement au (jours) méthylcholan- PB3D 400 pg PB3D 40 pg Contrôles thrène (jours)
170 0 6 14
200 10 25 60
230 25 44 75
260 35 62 83
290 55 69 95
310 55 69 100
220 340 55 81 100
250 370 55 100 100
280 400 60 100 100
290 410 65 100 100
Toxicité aiquë
Des tests de toxicité aiguë ont été réalisés par injection intra-
veineuse de l'exopolymère aux doses suivantes: 1 pg, 10 pg, 15 pg, 100 pg, 300 pg, 600 pg et 1200 pg par souris dans la veine caudale de 5 souris pour chaque dose. Aucune dose n'a provoqué de quelconques réactions négatives chez les souris qui étaient encore en vie deux mois
après l'injection.
Description de la souche
La souche lBS de Bifidobacterium infantis lonqum a été déposée le 6 juillet 1989 auprès de l'Institut Pasteur (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris
CEDEX, France). Elle porte le N d'enregistrement 1-885.
Il s'agit d'une souche isolée à partir d'eaux usées contenant des matières fécales d'origine humaine et présentant des caractéristiques taxonomiques intermédiaires entre Bifidobacterium infantis et Bifidobacterium lonqum identifiables par le profil de leurs composants structurels, par les profils des catabolites de fermentation du D-glucose et, par le profil de résistance aux antibiotiques et par
la production de l'exopolymère faisant l'objet de la présente invention.
1./.
- 20 -
Claims (10)
1) Exopolymère extracellulaire tel que produit par la culture en conditions anaérobes dans un milieu approprié d'une souche bactérienne de Bifidobacterium infantis longum déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM / Institut Pasteur) sous le No. 1-885, et isolé par élimination des microorganismes du milieu de culture, concentré puis précipité par l'adjonction d'un solvant organique et finalement lyophilisé. 2) Exopolymère selon la revendication 1, caractérisé par ses
propriétés immunomodulatrices.
3) Exopolymère selon la revendication i ou 2,caractérisé par le fait qu'il est essentiellement de nature polysaccharidique, composé surtout de glucose et de galactose dans une proportion comprise entre 1:1 et 4:1 et qu'il peut contenir une fraction protéique au
plus égale à 30 % en poids.
4) Exopolymère selon la revendication 3,caractérisé par le fait que
la proportion de glucose et galactose est de l'ordre de 3:2.
) Exopolymère selon les revendications 1 à 4,caractérisé par le fait
qu'il possède un poids moléculaire apparent compris entre 10'000 et 100'000 daltons, de préférence entre 20'000 et 30'000 daltons, et qu'il peut former des agrégats de poids moléculaire d'environ 106 daltons et ce en équilibre avec les unités de poids
moléculaire inférieur.
6) Exopolymère selon une des revendications 1 à 5,caractérisé par le
fait qu'il est exempt d'acides nucléiques, de lipides ou d'acides organiques.
- 21 _
7) Procédé de préparation de l'exopolymère extracellulaire selon la revendication 1,caractérisé par le fait que l'on cultive en conditions anaérobes dans un milieu approprié une souche bactérienne de Bifidobacterium infantis lonqum déposée auprès de la CNCM sous le No. 1885 et qu'après élimination des microorganismes du milieu de culture, on isole l'exopolymère ainsi produit, on le concentre et le précipite par adjonction d'un solvant organique et que finalement, on lyophilise le produit
résultant de la précipitation.
8) Procédé selon le revendication 7,caractérisé par le fait que l'exopolymère est isolé du milieu de culture par ultrafiltration sur membrane de porosité calibrée dont le seuil de rétention est
supéreur ou égal à 10'000 daltons.
9) Procédé selon le revendication 7 ou 8,caratérisé par le fait que l'exopolymère isolé du milieu de culture est concentré par ultrafiltration.
) Procédé selon une des revendications 7 à 9,caractérisé par le fait
que l'exopolymère est précipité par adjonction d'alcool, de
préférence de l'éthanol.
11) Compositions pharmaceutiques contenant comme principe actif
l'exopolymère extracellulaire selon une des revendications 1 à 6.
12) Compositons pharmaceutiques selon la revendication 11 présentant des activités thérapeutiques immunomodulatrices, antiinfectieuses
et/ou antitumorales.
13) Micro-organisme du genre Bifidobacterium, identique à la souche bacté-
rienne déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Micro-
organismes - CNM - de l'Institut Pasteur, sous le N I-885.
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