CH679677A5 - - Google Patents
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- CH679677A5 CH679677A5 CH3536/89A CH353689A CH679677A5 CH 679677 A5 CH679677 A5 CH 679677A5 CH 3536/89 A CH3536/89 A CH 3536/89A CH 353689 A CH353689 A CH 353689A CH 679677 A5 CH679677 A5 CH 679677A5
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Description
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CH679 677 A5
Description
L'invention se rapporte à un exopolymère extracellulaire obtenu par culture de souches sélectionnées du genre Bifidobacterium et doué de propriétés immunomodulatrices. L'invention a également pour objet un procédé de préparation de cet exopolymère, de même qu'une composition pharmaceutique contenant ledit exopolymère comme principe actif.
De nombreuses affections comme les allergies, les maladies autoimmunes, certaines maladies infectieuses ou certains cancers, ont pour commun dénominateur un dérèglement primaire ou secondaire du système immunitaire. Si les immunodéficiences primaires sont rares et généralement d'origine génétique, les déficiences secondaires sont plus fréquentes et leurs causes le plus souvent extrinsèques, causes parmi lesquelles on trouvera la survenue d'infections répétées, le vieillissement, le cancer, des déficits nutritionnels, l'exposition à des substances immunotoxiques, le stress, par exemple.
L'immunothérapie permet de pallier aux symptômes des déficiences primaires et de restaurer l'état immunitaire lors de déficiences secondaires.
Un grand nombre d'agents immunothérapeutiques ont été développés, qu'il s'agisse d'immunostimu-lants ou d'immunosuppresseurs. De façon générale, sous la définition d'immunomoduiateur sont regroupés les agents qui améliorent de manière non spécifique la réactivité spécifique de l'hôte ainsi que les mécanismes effecteurs non spécifiques. On distinguera des immunomodulateurs de synthèse et des immu-nomodulateurs d'origine biologique se regroupant en produits microbiens et extraits d'origine animale, voire humaine, dont les hormones thymiques, les extraits dialysables de leucocytes, les interférons et cytokines par exemple.
De fait, l'activation des lymphocytes ou des macrophages, ainsi que leurs intermodulations sont signi-ficativement modifiées par l'exposition à des molécules structurelles de microorganismes ou à des composants biologiquement actifs produits par ces derniers. Une grande variété de bactéries et de produits bactériens ont montré leur influence sur le système immun: cet arsenal d'agents immunomodulateurs d'origine bactérienne inclut les mycobactéries et leurs produits, les lipopolysaccharides de bactéries gram-, des entérotoxines de Vibrio cholerae, des produits de Streptococcus, des lipoprotéines et glyco-protéines de diverses bactéries gram-, des Polysaccharides d'origines diverses. Une recherche intensive est actuellement menée dans ce domaine.
L'invention apporte un élément supplémentaire à cet édifice qu'est l'immunothérapie puisqu'elle a pour objet un nouvel exopolymère extracellulaire doué de propriétés immunomodulatrices fort intéressantes. L'invention a plus précisément pour objet un procédé de préparation du dit exopolymère tel que défini à la revendication 1, de même que l'exopolymère extracellulaire résultant de la mise en œuvre du dit procédé. D'autres objets de la présente invention apparaîtront à la lecture du texte ci-après.
L'exopolymère objet de l'invention est plus particulièrement issu de ia culture de souches séléction-nées de bactéries gram+ de l'espèce Bifidobacterium infantis/Iongum. Doué de propriétés immunomodulatrices comme démontré par expérimentation, il présente de ce fait un intérêt réel pour la médecine humaine aussi bien que vétérinaire.
Le procédé selon l'invention se caractérise par le fait que l'on cultive dans un milieu approprié, en conditions anaérobes, la souche 1BS de Bifidobacterium infantis/Iongum déposée à l'Institut Pasteur (collection nationale de culture de microorganisme -CNCM) sous le No. I 885 et, qu'après élimination des microorganismes du milieu de culture, on isole puis concentre l'exopolymère ainsi produit, on le précipite par addition de solvant organique et finalement lyophilise le produit résultant de la précipitation.
La culture de la souche 1 BS peut être effectuée dans tout type de milieu approprié dont les composants ont un poids moléculaire inférieur à 10 000 daltons, en conditions anaérobes, de préférence à 37°C environ dans un milieu dont la composition détaillée figure plus loin.
L'élimination des microorganismes du milieu de culture s'effectue de préférence par centrifugation, l'isolation de l'exopolymère s'effectuant par exemple par ultrafiltration sur membrane poreuse calibrée présentant un seuil de rétention supérieur ou égal à 10 000 daltons.
Le produit ainsi isolé est ensuite soumis à concentration et dialyse subséquente, précipitation à l'aide d'un solvant organique, de l'éthanol de préférence, et finalement lyophilisation.
L'exopolymère résultant est caractérisé par le fait qu'il est essentiellement de nature polysacchari-dique, composé surtout de glucose et de galactose dans une proportion comprise entre 1:1 et 4:1 et par une fraction protéique au plus égale à 30% en poids. Au sein de ia fraction polysacharidique, la proportion de glucose et de galactose est de l'ordre de 1:1 à 4:1, préférentiellement de l'ordre de 3:2.
L'exopolymère selon l'invention possède un poids moléculaire apparent compris entre 10 000 et 100 000 daltons, de préférence entre 20 000 et 30 000 daltons. II peut former des agrégats de poids moléculaire d'environ 106 daltons et ce en équilibre avec les unités de poids moléculaire inférieur. Il se caractérise en outre par le fait qu'il est exempt d'acides nucléiques, de lipides et d'acides organiques n'intervenant pas dans l'activité biologique de l'exopolymère.
L'exopolymère ainsi isolé et purifié présente d'intéressantes propriétés immunomodulatrices tout en étant dépourvu de toxicité. Les expérimentations in vitro et in vivo effectuées montrent que l'exopolymère issu de la souche 1 BS se comporte comme immunomodulateur et qu'il induit une augmentation de la résistance non spécifique. Il possède en outre des propriétés antileucémiques (antitumoraies) cer2
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taines, dont l'origine est sans doute à rechercher dans ses propriétés immunomodulatrices dont la description figure sous «Détermination des propriétés immunomodulatrices de l'exopolymère issu de la souche 1 BS».
De ce fait, l'exopolymère issu de la souche 1BS peut être avantageusement utilisé comme principe actif de diverses compositions pharmaceutiques, administrables aussi bien par voie orale, que parentérale ou locale. Ces compositions peuvent se présenter sous les formes couramment utilisées en médecine humaine ou vétérinaire, par exemple sous forme de comprimés, simples ou dragéifiés, de gélules, de granulés, de solutions, de sirops, de suppositoires, de préparations injectables, d'ovules, de crèmes, de pommades, de lotions, de gouttes, de collyres; elles sont préparées selon les méthodes usuelles.
Dans de telles compositions, le principe actif (exopolymère) peut être incorporé seul ou conjointement à d'autres agents pharmacologiquement actifs. Les excipients utilisés à cet effet sont des excipients usuels, tels le talc, la gomme arabique, le mannitol, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffi-niques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs.
Sur l'animal, des effets immunomodulateurs significatifs ont été observés pour des doses totales de 4-400 ng par souris.
Les exemples ci-après illustrent l'invention sans pour autant la limiter. Ils concernent plus particulièrement la préparation de l'exopolymère et la mise en évidence de ses propriétés pharmacologiques.
Préparation de l'exopolymère par culture de la souche Bifidobacterium infantis/lonaum (1BSÌ
Stade A:
culture de la souche 1 BS.
La souche 1 BS est cultivée en conditions anaérobes, à 37°C (l'air étant éliminé en début de fermentation) dans le milieu nutritionnel suivant:
Un support solide tel que le CYTODEX ou un autre support équivalent peut être avantageusement ajouté au milieu de culture dans le but d'améliorer le rendement. La souche 1 BS produit dans ces conditions un exopolymère qui peut être dosé dans le surnageant à l'aide d'un test ELISA mis au point dans ce but et tel qu'il sera décrit plus loin.
On prépare 10 I du milieu de culture défini ci-dessus que l'on place dans un fermenteur d'une capacité de 121 et que l'on stérilise.
Le fermenteur est inoculé par 1000 ml d'une culture de la souche 1 BS cultivée sur le même milieu durant 48 heures. On fait barboter un mélange d'N2 90% et CO2 10% durant 20 min, à raison de 3 l/min.
On incube à 37°C sous agitation (400 rpm) et pour initier la fermentation, sous un mélange de N2/CO2 dans les proportions usuellement employées. Après 48 h, une fois le processus de fermentation terminé, on détermine la quantité de Polysaccharide produit par la méthode ELISA, le rendement minimal est de 35 (xg/ml.
Peptone (PM <10 000 daltons)
NaCI
Glucose
Cystéine
Acétate de sodium
NaaHPQ*
KH2PQ4
MgSÛ4
NaH2P04
NaHCOs
Tween
Solution de vitamine
5gH ■ 3g/l 10g/l 0,5 g/l 2 g/i 2,87 g/l 1,12g/I 0,09 g/I 0,15 g/l 2,2 g/i 1 ml/1 10 ml/1
Exemple:
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Stade B:
isolation et purification de l'exopolymère produit.
Une fois le procédé de fermentation terminé, les cellules sont séparées par centrifugation.
Le surnageant, une fois les cellules sédimentées, est soumis à ultrafiltration avec un appareillage de type Hallow Fiber H5 P10-43 de Amicon. Sont retenues uniquement les molécules de poids moléculaire supérieur à 10 000. La solution contenant l'exolpoylmère produit est concentrée 10 x puis soumise à dialyse.
Le concentré est précipité à l'alcool (éthanol: eau 3:1 v/v).
Finalement, le produit précipité à l'éthanol est lyophilisé. Le produit ainsi obtenu présente un aspect fibreux de couleur blanchâtre.
Exemple:
A partir de la culture ci-dessus, on obtient 10 I de liquide surnageant qui sont alors concentrés à 1 I par ultrafiltration.
Le volume est ajusté à 10 I avec de l'eau distillée puis réduit une nouvelle fois par ultrafiltration jusqu'à un volume approximatif de 1 I. Cette opération est répétée deux fois. Le concentré d'un volume de 1 I tel qu'obtenu est ensuite précipité à l'éthanol (3:1, v/v). Le précipité résultant est soumis à une opération de lyophilisation permettant l'obtention d'environ 400 mg de lyophilisât.
Technique ELISA
On utilise comme antigène une préparation polysaccharidique dont la pureté est garantie par une dé-protéinisation supplémentaire au phénol. On injecte à un lapin une première dose de 0,5 mg en deux injections, l'une par voie intrapéritonéale et l'autre par voie sous-cutanée conjointement à l'adjuvant complet de Freund. L'injection est répétée au jour 15 en utilisant cette fois l'adjuvant incomplet de Freund. 15 jours plus tard, le lapin est saigné donnant ainsi un antisérum avec des titres élevés en anticorps qui par la technique ELISA permettent de reconnaître l'exopolymère purifié par Chromatographie sur SEPHA-DEX G 200 et celui présent dans le surnageant des cultures de Bifidobacterium après précipitation à l'éthanol.
Le test d'ELISA est réalisé en microplaque, l'antigène est absorbé, puis des emplacements laissés libres sont colmatés dans les godets par de l'albumine sérique. Une incubation avec les anticorps spécifiques obtenus chez le lapin est pratiquée; puis sont ajoutés les anticorps, dirigés contre les anticorps de lapin, ils sont conjugués à la phosphatase alcaline. Finalement, le substrat l'orthonitrophénylphos-phate est ajouté. La réaction est arrêtée à l'aide de NaOH 3M. La densité optique est lue à 405 nm avec un lecteur d'ELISA.
Par ce procédé on obtient des titres d'anticorps suffisamment élevés qui permettent pour des concentrations d'antigènes purifiés de 4 |ig d'obtenir des lectures positives pour des dilutions de 10-4 d'antisé-rum.
Caractérisation de l'exopolymère issu de la souche 1 BS.
1. - Le produit obtenu est constitué essentiellement de glucides (tels que mesurés par la méthode au phénol/acide sulfurique) et de protéines (mesurées par la méthode de Lowry) dans une proportion 5-1.
Le produit ne contient pas d'acides nucléiques selon les résultats analytiques obtenus par Chromatographie d'exclusion ionique ou par Chromatographie en phase gazeuse. En aucun cas l'hydroiysat ne contient de pentoses. Le produit est dépourvu de lipides selon les résultats de Chromatographie gazeuse après extraction au n-heptane. Il n'y a pas d'acides organiques selon les mesures pratiquées en Chromatographie d'exclusion ionique.
2. - Selon les données de Chromatographie HPLC avec une colonne RP-8 300 Â, il s'agit d'un produit de nature glycoprotéique.
3. - La partie glucidique est constituée par du glucose et du galactose selon les différentes preuves analytiques (Chromatographie d'exclusion ionique, Chromatographie sur couches minces, Chromatographie gazeuse).
4. - Le glucose et le galactose sont présents en proportion 3:2 selon les résultats obtenus en Chromatographie en phase gazeuse des monomères hydrolysés par méthanolyse puis acétylés par trifluoroacé-tylation.
5. - La partie polysaccharidique est ramifiée avec les liaisons 1-2,1-3,1-4, et 1-6 selon le chromato-gramme obtenu en Chromatographie en phase gazeuse des monomères méthylés (méthanolyse) puis acétylés (trifluoroacétylation).
6. - L'activité biologique mesurée par la capacité à stimuler une augmentation de plages d'hémolyse directe provient de la partie glucidique et est maintenue après traitement à la protéinase K endommageant la partie protéique.
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7. - Le poids moléculaire approximatif est situé entre 20 000 et 30 000 daltons selon la Chromatographie sur SEPHADEX G 200 (pic de bas poids moléculaire).
L'exopolymère peut former des agrégats de poids moléculaire d'environ 106 daltons et ce en équilibre avec les unités de poids moléculaire inférieur.
Détermination des propriétés immunomodulatrices de l'exopolymère issu de la souche 1BS (preuve in vitroi.
Prolifération lymphocytaire de cellules spléniques
La prolifération lymphocytaire de cellules spléniques en présence de mitogènes peut être mesurée par la réduction de MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) en formazan par la déhydrogénase mitochondriale.
Exemple:
La prolifération lymphocytaire (cellules spléniques de souris C57BL/6) est exprimée par la densité optique à 560 nm, en fonction de la concentration en PB3D ou en LPS servant de référence:
PB3D
LPS
jig/ml
DO à 560 nm ug/ml
DO à 560 nm
333
1,483
20
1,486
111
1,593
6,77
1,308
37
1,459
2,22
0,964
12,3
1,018
0,74
0,725
4,1
0,580
0,25
0,526
1,4
0,427
0,08
0,423
0,03
0,366
Contrôle 0
0,273
Contrôle 0
0,273
Le PB3D induit une prolifération lymphocytaire légèrement inférieure à celle du LPS.
Détermination des propriétés immunomodulatrices de l'exopolymère issu de la souche 1BS (preuves in vivoi.
Stimulation de la production de cellules synthétisant des anticorps.
L'exopolymère produit stimule de manière non spécifique chez la souris la production de cellules produisant des anticorps soit administré par voie orale conjointement aux globules rouges de mouton, soit i.p. sans globules rouges de mouton. Il normalise aussi cette capacité chez la souris immunodéprimée par la cyclophosphamide.
Exemple:
Après administration par voie orale de PB3D pendant 5 jours consécutifs, et un rappel aux 19 et 20ème jour (organigramme A), ou de PB3D pendant 5 jours consécutifs sans rappel (organigramme B), on observe suivant les doses administrées une augmentation du nombre de plages d'hémolyse dans la rate des souris.
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GRM
PFC/106 cellules
PFC/rate
Organigramme A:
400 ng
100%
126%*
136%*
(avec rappel)
100%
134%*
145%*
100%
131%*
143%*
40 ng
100%
115%*
123%*
100%
125%*
133%*
100%
120%*
128%*
Organigramme B:
400 (ig
100%
104%
104%
100%
109%
104%
100%
101%
101%
40 ng
100%
111%*
113%*
100%
117%*
123%*
100%
110%*
113%*
* = p < 0.05
Exemple:
Après administration par voie intrapéritonéale d'un seule dose de 400 ng/souris de PB3D, on observe après 4 jours une augmentation significative du nombre de PFC.
Produit inoculé
PFC/rate
Relation groupe expérimental/contrôle
Contrôle
12,5±0
PB3D
43,75 ±31,37
3,5
Contrôle
6,25 ±6,85
PB3D
27,08±24,26
4,3
Exemple:
L'exopolymère administré à des souris immunodéprimées par la cyclophosphamide permet d'observer chez les animaux traités une immunosuppression inférieure ou une restauration plus rapide des niveaux normaux du nombre de PFC par rapport aux animaux sans traitement.
Jours après l'immunosuppresslon
Traitement
PFC/rate
PFC/108 lymphocytes
5
CY1
1,04 ±2,25
30 ±73
PB2
4,71 ±7,32
83 ±146
7
CY
0
PB
7,29 ±6,14
81 ±84
10
CY
18,75± 13,11
46±38
PB
60,41 ± 64,4
382 ±508
19
CY
25 ±10,2
110±96
PB
18,75 ±8,83
86 ±83
Contrôles3
9,5 ±8,75
58,31 ±49,2
1 animaux immunodéprimés à la cyclophosphamide
2 animaux immunodéprimés à la cyclophosphamide qui après ont reçu PB3D.
3 animaux quî ont reçu une solution salins
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Influence sur la composition des protéines sériques
Différents immunomodulateurs produisent un changement du profil immunoélectrophorétique des protéines du sérum reconnues sous les dénominations X, LA et LB. L'exopolymère de la présente invention provoque une telle modification.
Exemple:
L'administration intrapéritonéale de 400 jxg par souris de PB3D produit après 24 h et après 4 jours un changement des protéines sériques comparable à celui provoqué par le lipopolysaccharide de E. coli (LPS).
Exemple:
De même l'administration orale d'une dose totale de 400 ng répartie en 5 doses durant 5 jours consécutifs de 80 ftg par jour provoque un changement des protéines perceptible 5 jours après l'administration de l'exopolymère.
Elimination du carbone colloïdal
L'exopolymère est administré par voie i.v. (2,5 mg/souris) à des souris Balb C. Après 48 h, 0,2 ml d'une suspension de carbone colloïdal sont injectés par voie i.v.
La disparition du carbone dans le sang, appelée clearance, est exprimée par la pente des logarithmes de la concentration du carbone en fonction du temps. L'exopolymère augmente la clearance.
Temps
Témoin
Traité
(min)
HüO-NaCI 0,9%
PB3D 2,5 mg
0
1,865 ±0,087
1,815 ±0,044
2
1,800 ±0,031
1,662 ±0,037
4
1,754 ±0,032
1,531 ±0,065
6
1,588 ±0,009
1,432± 0,096
8
1,657 ±0,038
1,305 ±0,073
10
1,535 ±0,134
1,207 ±0,105
12
1,588 ±0,045
1,079 ±0,154
Augmentation de ia résistance non spécifique
Chez les animaux immunodéprimés par la cyclophosphamide et soumis au froid, il a été possible d'observer que l'exopolymère de la présente invention confère une augmentation de la résistance non spécifique vis-à-vis d'une infection bactérienne telle que provoquée par Pseudomonas au niveau des muqueuses ou vis-à-vis d'une infection virale (virus Coxsackie B).
Exemple:
L'immunosuppression est pratiquée avec une dose intrapéritonéale de cyclophosphamide (200 mg/kg). Au 3ème jour commence le traitement oral avec l'exopolymère (80 ng/souris/jour) durant 5 jours consécutifs. Les animaux de contrôle reçoivent un volume équivalent de solution saline. Quelques heures après la fin du traitement, les animaux sont infectés par voie intranasale par une souche de Pseudomonas aeruginosa rendue pathogène pour la souris.
La survie est améliorée chez les animaux traités:
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Expérience
Traitement
Survie
(%)
1
Contrôle
8/18
(44)
400 jig PB3D
11/20
(55)
2
Contrôle
0/14
(0)
400 ng PB3D
10/29
(34)
3
Contrôle
7/12
(58)
400 ng PB3D
9/12
(82)
Exemple:
L'immunosuppression est pratiquée avec une dose intrapéritonéale de cyclophosphamide (200 mg/kg). Au 3ème jour commence le traitement oral avec l'exopolymère (80 jig/souris/jour) durant 5 jours consécutifs. Les contrôles reçoivent un volume équivalent de solution saline. Quelques heures après la fin du traitement les animaux sont infectés par voie intraperitonéale par le virus de Coxsackie B5 (0,5 ml avec 107PFU) et le taux de survie évalué. Il est amélioré chez les animaux traités.
Traitement Conditions Survie (%) après infection
Contrôle 4-6°C 0/20 (0)
PB3D 4-6°C 16/20 (80)
Contrôle 20°C 6/10 (60)
PB3D 20°C 10/10 (100)
Essais de leucémie spontanée ou induite
L'exopolymère de la présente invention est susceptible de retarder l'apparition de leucémie chez les souris AKR (souche de souris «inbreed» développant à une fréquence élevée de la leucémie spontanée). De même, l'exopolymère est susceptible de retarder chez les souris de la souche RF l'apparition de leucémie induite par une substance carcinogénique comme le méthylcholantrène. (Cette souche RF est une souche «inbreed» chez laquelle le méthylcholantrène provoque une apparition rapide de leucémie spontanée).
Exemple:
Deux groupes de souris AKR ont reçu mensuellement un traitement oral de 5 jours de PB3D un troisième groupe n'a pas reçu le produit à tester et sert de contrôle. Des deux groupes traités, l'un a reçu 5 doses journalières de 80 ]ig (dose totale mensuelle de 400 ng); et l'autre 5 doses journalières de 0,8 (ig (dose totale mensuelle de 4 |ig). Les résultats montrent un retard dans l'apparition de la leucémie chez les animaux traités. Cette différence est clairement significative dans le groupe ayant reçu 400 ng comme dose totale. Elle a été confirmée par une autre expérience durant laquelle les groupes traités ont reçu respectivement 400 et 40 ng.
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25
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CH 679 677 A5
Expérience 1
Age (jours)
Incidence de lymphome (%)
PB3D 400 hq
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Contrôles
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5
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26
240
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255
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37
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315
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61
79
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67-
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345
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360
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93
375
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83
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100
480
76
89
100
495
82
94
100
9
5
10
15
20
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35
40
45
50
55
CH 679 677 A5
Expérience 2
Age (jours)
Incidence de iymphome (%)
PB3D 400 jxg
PB3D 40 ng
Contrôles
168
0
5
5
175
0
10
5
182
5
10
5
196
5
15
5
203
5
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210
10
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11
217
15
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11
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16
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238
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245
25
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287
53
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294
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308
53
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58
315
53
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63
336
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63
343
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350
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70
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560
80
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100
Exemple:
Deux groupes de souris RF ont reçu dans les deux mois précédant l'administration (par voie topique) de méthylcholantrène deux traitements par voie orale de PB3D espacés de 3 semaines. Un groupe a reçu une dose mensuelle de 400 ng réparties en 5 doses de 80 ng durant 5 jours consécutifs, l'autre groupe une dose totale mensuelle de 4 ng répartie également en 5 doses de 0,8 jig. Le groupe de contrôle n'a reçu aucun traitement. L'induction de la leucémie est réalisée par traitement cutané dans une zone du corps convenablement rasé. Le traitement au PB3D retarde l'apparition de leucémie; ce retard est clairement significatif chez les animaux ayant reçu 400 ng.
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CH 679 677 A5
Temps après traitement Age Incidence de lymphome (%) au méthylcholantrène Qrs) PB3D 400 ng PB3D4}ig Contrôles (jours)
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0
6
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80
200
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60
110
230
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170
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Toxicité aigüe
Des tests de toxicité aigüe ont été réalisés par injection intraveineuse de l'exopolymère aux doses suivantes: 1 ng, 10 ng, 15 ng, 100 ng, 300 |ig, 600 (tg et 1200 ng par souris dans la veine caudale de 5 souris pour chaque dose. Aucune dose n'a provoqué de quelconques réactions négatives chez les souris qui étaient encore en vie deux mois après l'injection.
Description de la souche
La souche de Bifidobacterium infantis/Iongum 1BS a été déposée le 6 juillet 1989 auprès de l'Institut Pasteur (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX, France). Elle porte le No. d'enregistrement I 885.
Il s'agit d'une souche isolée à partir d'eaux usées contenant des matières fécales d'origine humaine et présentant des caractéristiques taxonomiques intermédiaires entre Bifidobacterium infantis et Bifidobacterium longum identifiables par le profil de leurs composants structurels, par les profils des cataboli-tes de fermentation du D glucose et, par le profil de résistance aux antibiotiques et par la production de l'exopolymère faisant l'objet de la présente invention.
Claims (1)
- Revendications1. Procédé de préparation d'un exopolymère extracellulaire doué de propriétés immunomodulatrices, caractérisé par le fait que l'on cultive dans un milieu approprié, en conditions anaérobes, une souche de Bifidobacterium infantis/Iongum déposée à l'Institut Pasteur sous le No. I 885, et qu'après élimination des microorganismes du milieu de culture, on isole puis concentre l'exopolymère ainsi produit, on le précipite par addition de solvant organique et finalement lyophilise le produit résultant de la précipitation.2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'isolation de l'exopolymère du milieu de culture s'effectue par ultrafiltration sur membrane poreuse calibrée présentant un seuil de rétention supérieur ou égal à 10 000 u (daltons)3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que l'exopolymère isolé du milieu de culture est concentré par ultrafiltration.4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l'exopolymère est précipité par addition d'alcool, de préférence par addition d'éthanol.5. Exopolymère extracellulaire obtenu au moyen du procédé selon la revendication 1.6. Exopolymère selon la revendication 5, caractérisé par le fait qu'il est essentiellement de nature polysaccharidique, composé surtout de glucose et de galactose dans une proportion comprise entre 1:1 et 4:1 et qu'il peut contenir une fraction protéique au plus égale à 30% en poids.7. Exopolymère selon la revendication 6, caractérisé par le fait que la proportion de glucose et galactose est de l'ordre de 3:2.8. Exopolymère selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé par le fait qu'il possède un poids moléculaire apparent compris entre 10 000 et 100 000 u (daltons), de préférence entre 20 000 et 30 000 u (daltons) et qu'il peut former des agrégats de poids moléculaire d'environ 106 u (daltons) et ce en équilibre avec les unités de poids moléculaire inférieur.1151015202530354045505560CH 679 677 A59. Exopolymère selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé par le fait qu'il est exempt d'acides nucléiques, de lipides et d'acides organiques n'intervenant de toute façon pas dans l'activité biologique de l'exopolymère.10. Compositions pharmaceutiques, destinées à la médecine humaine ou véterinaire, caractérisées en ce qu'elles contiennent à titre de principe actif l'exopolymère extracellulaire selon la revendication 5 pouvant servir d'agent immunomodulateur, antiinfectieux ou antitumoral.12
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