PT95346A - Processo para a producao de um exopolimero extracelular e de composicoes farmaceuticas que o contem - Google Patents
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Description
-2- 71 361 JFL/sr/10573
MEMÓRIA DESCRITIVA O presente invento cobre o processo para a preparação de um exopolímero extracelular, produzido por cultura de estirpes bacterianas ssleccionadas do género Bifidobacterium, e dotado de propriedades imunomoduladoras, 0 presente invento também se refere a este exopolímero, bem como aos produtos farmacêuticos contendo o dito exopolímero como princípio activo.
Numerosas doenças tais como alergias, doenças auto-imunes, certas doenças infecciosas e certos cancros, têm como denominador comum uma desordem primária ou secundária do sistema imunológico» Enquanto as imunodsficiências primárias são raras e têm, geralmente, causas genéticas, as imunodsficiências secundárias são mais frequentes e as suas causas são, na maior parte dos casos, extrínsecas e incluem, por exemplo, infseções recorrentes, envelhecimento, cancro, má nutrição, exposição a substâncias imunotóxicas e stress. A imunoterapia permite o alivio dos sintomas das imunodeficiências primárias e o restauro do estado de imunidade no caso de imunodeficiências secundárias, Têm sido desenvolvidos muitos agentes imunoterapêuticos, quer na forma de imune-estimulantes quer na de imunossupressores. De uma forma geral, os imunomoduladores são agentes que melhoram não-especificamente a reaetividade especifica do hospedeiro e os mecanismos efsetores não específicos» Pode ser feita uma distinção entre os imunomoduladores sintéticos e os imunomoduladores de origem biológica» Os ‘últimos são produtos microbianos e extractos de origem animal, ou mesmo de origem humana, tais como, por exemplo, hormonas tímicas, extractos dialisáveis de leucócitos, interferões e citoquinos.
De facto, a activação de linfócitos ou de macrofagos e as suas inter-modulações são, significativamente modificadas pela exposição a moléculas estruturais de microorganismos ou a componentes biologicamente activos produzidos por nácroorganismos. Uma larga variedade de bactérias e de produtos bacterianos demonstraram a sua influência no sistema imunológico» Este -3- 71 361 JFL/sr/10573 arssnal de agentes imunomoduladores de origem baeteriana inclui mierobaetérias e seus produtos, 1ipopolissacáridos de bactérias gram-, enterotoxinas de Vibrio cholerae, produtos de Streptococus, lipoproteínas e glicoproteínas de várias bactérias gram-, e polissacáridos de várias origens. Está, presentemente, a ser feita investigação intensiva neste campo. 0 presente invento junta outro elemento ao campo da imunoterapia, já que se refere a novos exopolimeros extracelulares dotados de propriedades imunomoduladoras extremamente interessantes. Mais precisamente, o presente invento cobre um processo para a preparação do dito exopolímero, como definido na reivindicação 1, bem como o dito exopolímero produzido pelo uso do processo referido. Outros itens do presente invento serão aqui desenvolvidos seguidamente. 0 exopolímero, que á o objecto do presente invento, foi produzido cultivando estirpes seleccionadas de uma espécie recentemente isolada Bifidobacterium infantis longum. uma bactéria gram+, que apresenta características taxonómicas entre a Bifidobacterium infantis e a Bifidobacterium longum. Possuindo propriedades imunomoduladoras demonstradas experimentalmente, este exopolímero é, assim, de interesse real para a medicina humana e veterinária. 0 processo coberto pelo presente invento é caracterizado por a estirpe baeteriana IBS da Bifidobacterium infantis longum, depositada sob ο N2. 1-885 no Instituto Pasteur - Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) - ser cultivada sob condições anaeróbicas num meio adequado e por o exopolímero assim produzido, após separação dos microrganismos do meio de cultura, ser isolado, concentrado e, então, precipitado por adição de um solvente orgânico. Finalmente, o produto resultante da precipitação é liofilizado. A estirpe IBS pode ser cultivada em qualquer tipo de meio de cultura adequado, cujos componentes tenham um peso molecular inferior a 10 000 daltons, sob condições anaeróbicas, de preferência, a cerca de 37SC. A composição detalhada de um tal -4— -4— 71 361 JFL/sr/10573 4,/— meio é descrita a seguir.
Os microorganismos são separados do meio de cultura, de preferência, por centrifugação, o exopolímero é isolado, por exemplo, por ultrafiltração numa membrana porosa calibrada, com um limite de retenção superior ou igual a 10 000 daltons. 0 produto assim isolado é, então, concentrado, dialisado, precipitado por adição de um solvente orgânico, de preferência etanol, e, finalmente liofilizado. 0 exopolímero resultante é, essencialmente, de natureza polissacãrida, composto principalmente por glucose e galactoss, na razão de 1:1 a 4=1, e contém uma fracção proteica igual, no máximo, a 30¾ em peso. Ma fracção polissacárida, a proporção de glucose e galactose está na gama de 1:1 a 4:1, de preferência, cerca de 3:2. 0 exopolímero do presente invento tem um peso molecular aparente de 10 000 a 100 000 daltons, de preferência, 20 000 a 30 000 daltons. Pode formar agregados com um peso molecular de cerca de 106 daltons, em equilíbrio com unidades de peso molecular mais baixo. Está, também isento de ácidos nucleicos, de lípidos e de ácidos orgânicos. 0 exopolímero, assim isolado e purificado, tem propriedades imunomoduladoras interessantes, sendo simultaneamente não tóxico. Experiências, quer in vitro quer in vivo, demonstrar aro que o exopolímero produzido pela estirpe IBS se comporta como um imuriomodulador © que aumenta a resistência não-específica do hospedeiro. Tem, também, propriedades anti-leucémicas definidas (anti-tumorais), cuja origem se pode ligar às suas propriedades imunomoduladoras descritas em "Determination of the immunomodula-tory properties of the exopolymer produesd by the strain IBS".
Assim, o exopolímero produzido pela estirpe IBS pode. ser, vantajosamente, usado como o princípio acfcivo de vários produtos farmacêuticos que podem ser administrados oralmente, parentericam-ente, bem como, localmente. Estes fármaeos podem ser apresentados em formas usadas comumments em medicina humana ou -5- JFL/sr/10573 veterinária, p.e. na forma de comprimidos simples ou revestidos com açúcar, cápsulas, pequenas pílulas, soluções, xaropes, supositórios, preparações injectáveis, pessários, cremes, pomadas, loções, gotas e loções para os olhos. São todos preparados por métodos usuais. 0 princípio activo (exopolímero) pode ser incorporado em
conjunto com outros agentes farmacologieamente activos. Os excipientes usados para este propósito são excipientes comuns, tais como, talco, goma arábica, manitol, amido, estearato de magnésio, manteiga de cacau, veículos aquosos ou não aquosos, substâncias gordas de origens animal ou vegetal, derivadas da parafina, glicóis, vários agentes molhantes, dispersantes ou emulsionantes e conservantes.
Foram observados, em ratinhos, efeitos imunomoduladores significativos a doses entre 4-400 ng por ratinho.
Os exemplos aqui apresentados seguidamente pretendem ilustrar o presente invento sem o limitarem. Eles referem-se, mais particularmente, à preparação do exopolímero (também chamado PB3D) e às suas acções farmacológicas.
PREPARAÇÃO DO EXOPOLÍMERO POR CULTURft DA ESTIRPE BftCTERIANfi IBS DA BIFIDOBACTERIUn INFANTIS LONSUM
Fase As cultura da estirpe IBS A estirpe IBS é cultivada em condições anaeróbicas a 37SC (sendo, o ar, eliminado no início da fermentação) no seguinte meio nutrlente'
Peptona (PM < 10 000 daltons) 5 g/1
NaCl
Glucose Cisteína
Acetato de sódio
Na2HP04 kh2po4 MgS04
NaH2P04 3 g/1 10 g/1 0,5 g/1 2 g/1 2,87 g/1 1,12 g/i 0,09 g/10,15 g/1
71 361 JFL/sr/10573 is!aHC03 2,2 9/1 Tween 1 ml/1 Solução vitamínica 10 rnl/1 Um suporte sólido, como 0 CYT0DEX © , ou equivalente, pode ser, vantajosamente, adicionado ao meio de cultura para melhorar o rendimento. Nestas condições, a estirpe IBS produz um exopolímero que pode ser quantificado no sobrenadante usando um teste ELISA desenvolvido para este propósito e descrito mais à frente.
Exemplo São preparados 10 litros do meio de cultura definido acima, e são colocados num fermentador de 12 litros, para esterilização. 0 fermentador é, em seguida, inoculado com 1000 ml de uma cultura da estirpe IBS, cultivada no mesmo meio durante 48 horas. Borbulha-se uma mistura de 90¾ de 5¾ e 10¾ CO2, durante 20 minutos, a um caudal de 3 litros por minuto. A incubação é realizada a 37ÔC, com agitação a 400 rpm, sob uma mistura de N2/CO2 a um caudal usual, que é injectado no meio durante as primeiras duas horas de fermentação. Após 48 horas, depois de ter cessado o processo de fermentação, a quantidade ds polissacárido produzida é determinada pelo método ELISA. 0 rendimento mínimo é de 35 ug/ml.
Fase B: isolamento e purificação do exopolímero produzido
Tendo cessado o processo de fermentação, as células são separadas por cenfcrifugação. Depois das células sedimentarem, o sobrenadante é ultrafiltrado usando um aparelho do tipo Amicon hallow Fiber H5 P10-43, Apenas são retidas as moléculas mais pesadas do que 10 000 daltons, A solução contendo o exopolímero produzido é concentrada para o décuplo s, em seguida dialisada. A solução concentrada é precipitada com álcool (etanol:águaj 3 :1 v/v).
Finalmente, o produto precipitado com etanol é liofilizado. 0 produto assim obtido é esbranquiçado e parece fibroso.
71 361 JFL/sr/10573
Exemplo A partir da cultura acima, obtêm-se 10 litros de líquido sobrenadante que é concentrado para 1 litro, por ultrafiltração. 0 volume é ajustado a 10 litros com água destilada e, então, reduzido, novamente, por ultrafiltração, para cerca de 1 litro, Esta operação é realizada duas vezes, A solução concentrada a 1 litro assim obtida é, então, precipitada com etanol (3-1 v/v). 0 precipitado resultante é liofilizado para produzir cerca de 400 mg de liofilizado.
O método ELISA 0 antigénio usado é urna preparação da polissaeárido cuja pureza é assegurada por desproteinização adicional com fenol, Injecta-se uma dose inicial da 0,5 mg num coelho, em ' duas injecções - uma i ntrsper i toneal e a outra subcutânea - em conjunto com adjuvante de Freund completo. A injecção é repetida ao 155 dia, usando desta vez, :'jv’..-ante ds Freund incompleto. Quinze dias mais tarde, o coelho é sangrado para obter um anti-soro com níveis elevados de anticorpo, que- permitem, pelo método ELISA, reconhecer o exopolimero, purificado por cromatografia numa coluna SEPHADEX G 200, e o exopolimero presente no sobrenadante das culturas de Bifidobacterium após precipitação com etanol. 0 teste ELISA é realizado numa microplaca. 0 antigénio ê adsorvido, Os locais deixados vazios são cheios com seralburnina, nos alvéolos. Realiza-se, em seguida, uma incubação com os anticorpos específicos, obtidos do coelho. Então, são adicionados os anticorpos dirigidos contra os anticorpos do coelho. São conjugados com fosfatase alcalina. Finalrnente, adiciona-se o substrato (fosfato de orto-nitrofenil). Apôs incubação, a reaeção é parada usando NaOH 3M. Mede-se a densidade óptica (absorvância) a 405 n® num leitor de ELISA, Por este procedimento são obtidos títulos de anticorpos suficientemente elevados, para permitirem leituras positivas para diluições de antisoro de 10~4, para concentrações de antigénio de 4 wg.
71 361 JFL/sr/10573 -8-
Caracterisação do exopolímero Produzido pela estirpe irr 1} 0 produto obtido consiste, essencialmente, de glúcidos (medidos pelo método fenol/ácido sulfúrico) e proteínas (medidas pelo método de Lowry) na razão de 5:1,
De acordo com os resultados analíticos obtidos sor cromatografia de exclusão de ião e por cromatografia de fase gasosa, o produto não contém quaisquer ácidos nucleicos. Em caso algum, o hidrolisado contém quaisquer pentoses. 0 produto está isento de lipidos, de acordo com os resultados obtidos por cromatografia de fase gasosa após extracção com n-beptano, Não existem ácidos orgânicos, ds acordo com as medidas feitas por cromatografia de exclusão de ião, 2) De acordo com os resultados obtidos por cromatografia liquido-liquido de alta eficiência (HPLC) numa coluna RP-8 300 Â, o produto é de natureza glico-proteica» 3) A parte glucido é composta de glucose s galactose, de acordo com as provas analíticas obtidas por cromatografia de exclusão de ião, em camada fina e de fase gasosa, 4) A glucose e a galactose estão presentes na razão 3=2, de acordo com os resultados obtidos por cromatografia de fase gasosa dos monómeros hidrolisados por metanolise e, sra seguida, acetilados por trifluoroacetilação. 5) A parte polissacárida é ramificada cora ligações- 1-2, 1-3, 1-4 e 1-6, de acordo com o cromatograma obtido Pc-cromatografia em fase gasosa dos monómeros metilados (Por metanólise) e, depois, acetilados (por trifluoroacetilaçso)- 6) fi actividade biológica, que é medida pala capacidade para estimular um aumento no número/células formadoras de placa (PFC), é originada na parte glueidica e ê mantida após tratamento com proteinase K danificando a parte proteica, 7) O peso molecular aproximado varia entre 20 000 e 30 000 tons, de acordo com os resultados obtidos por cromatog» numa SEPHADEX G 200 (pico de peso molecular baixo).
71 361 JFL/sr/10573 -9- 0 exopolímero pode formar agregados de peso molecular de cerca de 10^ daltons, em equilíbrio com unidades de peso molecular mais baixo. DETERMINAÇÃO DAS PROPRIEDADES IMUN0M0DULAD0RAS DO EXOPQLIMERQ PRODUZIDO PELA ESTIRPE IBS {PROVA IN VITRO^
Proliferação de esplenócitos fí proliferação de esplenócitos na presença de mitogénios pode ser medida pela redução de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetil-~tiazol~2-il)-2,5-difeniltetrazónio) a formazan por desidrogenase íiií tocônd r i ca.
Exemplo pela fí proliferação (esplenócitos de ratinho C57SL/6) densidade óptica (absorvância) a 560 nm, como é expressa função da concentração de PE3D ou do LPS que serve como referência: s-ig/ml PB3D 0D a 560 nm .ug/ml LPS 0D a 560 nm 333 1,483 20 1,486 111 1,593 6,77 1,308 37 1,459 2,22 0,964 12,3 1,018 0,74 0,725 4,1 0,580 0,25 0,526 1,4 0,427 0,08 0,423 0,273 0,03 0,366 Controlo 0 Controlo 0 0,273 que a 0 PB3D induz uma proliferação que é ligeiramente mais baixa induzida pelo LPS. -10- 71 361 JFL/sr/10573
ELOPOLÍMERO
DETERMINACSO DftS PROPRIEDADES IMUNOMQDULAPQPRAS DO PRODUZIDO PELA ESTIRPE IBS fPROVAS IM VIVO)
Estimul; odu el .s sinfcetizadoras de anticorpo
No ratinho, o exopolímero estimula, í 130 ss pecificamente, a produção células SÍ. iTijtst i. 2 S-iCsOÍP 3.3 c's snti administr ado oraliisnte sbi conjunto com dlCbltl r"r carneiro ou i ntrapsritonealments sem glóbulos carneiro. 0 exopolífner o também regulari .sou esta •cr po, quando vsrmelhos de vermelhos de capacidade no ratinho imunossuprimido com ciclofosfamida.
Exemplo
Após administração oral dose de reforço nos 192 e 202 de PS3D, durante dia (organigrama cinco dias A), ou sera e uma dose de reforço (organigrama B) observa no número de PFC, dependente das •se no baço do ratinho um doses administradas= aumento SR BC PFC/10^ células PFC/baço Organigrama A* 400 Rg 100¾ 126%* 136%* (com reforço) 100¾ A\ "Z A O/'!' JL -w* -r •"'o 145%* 100¾ 131%* *H ,-i l7 <v9í-JL 40 u.g 100¾ 115%"' 123%* 100¾ 125%“' 133%* 100¾ 120%* 128%* 0r~ C$3 π i 3^3 0" 400 ng 100¾ 104% 104% 100¾ 109%'“' 10-4-¾ 100¾ 101% 101% 40 1.1 g 100¾ 111%" 113%* 100¾ 117%“ 123%* 100¾ 110%* 113%* — p x 0,03 -11- 71 361 JFL/sr/10573
Exemplo
Após administração intraperitoneal de uma dose única de PS3D de 400 ug/ratinho, observa-se após quatro dias um aumento significativo do número de PFC„
Podufo inoculado PFC/baço Razão grupo de teste/grupo ds controlo
Controlo 12,5 ± 0 PB3D 43,75 ± 31,37 3,5 Controlo 6,25 ± 6,85 PS3D 27,08 ± 24,26 4,3
Exemplo 0 exopolímero administrado a ratinhos imunosuprimidos com c-iclof osf amida, torna possível a observação, nos ratinhos tratados, de imunosupressão mais baixa ou restauração mais rápida do número normal de PFC, comparada com os ratinhos não tratados,
Dias após imu- Tratamento PFC/baço PFC/1G® nossupressão linfócitos 5 CY1) 1,04 ± 2,25 30 ± 73 PB2) 4,71 jb 7,32 83 146 7 CY 0 PB- 7,29 - 6,14 SI ± 84 10 CY 18,75 13,11 46 38 PB 60,41 ± 64,4 382 ± 508 19 CY 25 ± 10,2 110 ± 96 PB 18,75 ± 8,S3 86 ± 83 Controlos^) 9,5 ± 8,75 58,31 ± 49,2
71 361 JFL/sr/10573 -12- 1) Ratinhos imunossuprimidos com ciclofosfamida
2) Ratinhos imunossuprimidos com ciclofosfamida sendo-lhes dado, depois, PB3D 3) Ratinhos aos quais foi dada solução salina Influência das proteínas do soro na composição Vários imunomoduladores modificam o padrão imuno-elsctrofo-rético das proteínas do soro, conhecidas como X, LA e LB, 0 exopolimero abrangido pelo presente invento, causa tal modificação.
Exemplo fi administração intraperitoneal de PB3D a 400 ng/ratinho provoca, após 24 horas e após quatro dias, uma modificação nas proteínas de soro comparável ã causada pelo 1ipopolisacárido da Eschericha coli (LPS).
Exemplo
Duma forma idêntica, a administração total de 400 wg por via oral e dividida ®m 5 doses diárias consecutivas de 80 pg, causa uma modificação nas proteínas, percsptivsl cinco dias após administração do exopolimero.
Clearance do carbono coloidal O exopolimero é administrado i ntravenosaments (2,5 mg/rati-nho) a ratinhos Balb/c. Após 48 horas, injeeta-se intravenosa-mente 0,2 ml de uma suspensão de carbono coloidal. 0 desaparecimento do carbono no sangue, chamado clearance, é expresso pelo declive 1ogaritmico do nível de carbono versus tempo. O exopolímero aumenta a clearance.
SEQUE TABELA -13- 71 361 jFL/sr/10573
Tempo Controlo Tratado
(min) í-^O-NaCl 0,9¾ 2,5 mg de PB3D 0 1,865 0,087 1,815 ± 0,044 2 1,800 ± 0,031 1,662 ± 0,037 4 1,754 0,032 1,531 ± 0,065 6 1,588 ± 0,009 1,432 ± 0,096 8 1,657 ± 0,038 1,305 — 0,073 10 1,535 ± 0,134 1,207 ± 0,105 12 1,588 + 0,045 1,079 ± 0,154
Aumento da resistência não especifica
Foi possível observar em ratinhos imunossupr imidos com ciclofosfamida e expostos ao frio, que o exopolimero abrangido pelo presente invento, aumenta a resistênia não específica do hospedeiro a uma infecção bacterlana, tal como a que é provocada pela Fseudomonasao nível das membrantas mucosas, ou a uma infecção virai (virus de Coxsackie 3).
Exemplo
Confere-se imunosupressão, por administração intraperitoneal de 200 mg/kg de ciclofosfamida. Ao terceiro dia, começa o f ΟΓΐ tratamento oral, de cinco dias, com o exopolímero pg/rati nh o /dia).
Os ratinhos de controlo recebem unia quantidade equavaientw de solução salina. Urnas horas depois do fim do tratamento, os ratinhos sao infectados intravenosamente com uma estirpe Pseudomonas aeruginosa tornada patogénica para o ratinho- A taxa de sobr evidencia é mais elevada para o grupo de ratihiio» tratados: -14- 71 361 JFL/sr/10573
Experiência Tratamento Taxa de sobrevivência (¾) 1 Controlo 8/13 (44) 400 p.g PB3D 11/20 (55) 2 Controlo 0/14 (0) 400 s-ig PB3D 10/29 (34) •ar Controlo 7/12 (58) 400 ng PB3D 9/12 (82)
Exemplo
Confere-se a imunossupressão por uma administração intraperitonsal única de 200 mg/kg de ciclofosfamida. No terceiro dia, começa-se o tratamento oral, de cinco dias, com o exopolimero (30 ug/ratinho/dia). Os ratinhos de controlo recebem uma quantidade equivalente de solução salina, Algumas horas após o fim do tratamento, os ratinhos são infectados intraperitoneal-mente com o virus de Coxsaekie B5 (0,5 ml com 10^ PFU) e a taxa de sobrevivência é avaliada, É mais elevada para o grupo de ratinhos tratados:
Tratamento Condiçoes após Taxa de sobre-infecção vivência (¾)
Controlo 4 - 62C 0/20 (0) PB3D 4 - Ó2C 16/20 (80) Controlo 202C 6/10 (60) PS3D 202C 10/10 (100)
71 361 JFL/sr/10573
Testes da leucemia espontânea ou induzida 0 exopolímer© abrangido pelo presente invento é capas de atrasar o aparecimento de leucemia em ratinhos AKR (uma estirpe de ratinhos consanguíneos que desenvolvem, muito frequentemente, leucemia espontânea). 0 exopolimero é7 também, capas de atrasar o aparecimento ds leucemia induzida por uma substância carcinogénica, tal como o metiIcolantereno, em ratinhos RF> (ft estirpe RF é uma estirpe consanguínea, à qual o metiIcolantereno causa o aparecimento rápido de leucemia espontânea.
Exemplo
Administrou-se oralmente,.a dois grupos de ratinhos AKR, uma terapia com PB3D, de cinco dias, todos os meses, enquanto que um terceiro grupo não recebeu o produto testado s serviu como grupo de controlo. Dos dois grupos tratados, a um deu-se uma dose mensal total de 400 pg (80 pg/dia/ratinho durante cinco dias consecutivos), enquanto que o outro recebeu uma dose mensal total de 4 pg (0,8 ng/dia/ratinho, durante cinco dias consecutivos).
Os resultados obtidos mostraram um atraso no aparecimento de leucemia nos ratinhos tratados. Esta diferença era claramente significativa no grupo recebendo uma dose mensal total de 400 p.g, Isto foi confirmado por outra experiência durante a qual os grupos tratados receberam 400 pg e 40 ug de FS3D respectivamente. 71 361 JFL/sr/10573
Experiência 1
Idade (dias) 400 «4 .g de Incidência ΡΞ3Β1 4 M.g 1inferna (¾) de ΡΞ30 Controlos 210 5 0 19 225 5 0 26 240 11 10 40 255 21 10 48 270 26 44 C ET 285 37 c c 62 300 37 55 65 315 42 61 79 330 47 67 83 345 55 72 91 360 61 78 93 375 65 78 98 390 71 83 100 405 71 S3 100 420 76 83 100 76 07 Ú„' 100 450 76 83 100 465 76 oo s_jy 100 480 76 89 100 495 94 100
71 361 JFL/sr/10573 -17-
Experiênc-ia 2
Idade (dias) Incidência < áe linfoma (¾) 400 p.g de PB3D 40 wg de P83D Controlos 168 0 5 5 175 0 10 5 182 5 10 5 196 5 15 5 203 5 15 11 210 10 20 11 217 15 30 11 224 15 30 16 231 20 30 26 238 25 30 26 245 25 30 32 252 25 40 32 · 259 30 40 42 273 37 45 47 280 ã'? 45 53 007 í 53 50 53 294 53 55 58 301 53 60 58 308 53 65 58 315 53 65 63 336 60 65 63 343 60 65 68 350 60 70 68 406 65 70 74 462 65 80 84 CIO w* -JL W* 80 oc (J-wí 95 560 80 85 100 18- jf / τ~ 71 361 JFL/sr/10573
Exemplo
Durante os dois meses que antecederam a administração tópica de metileolantereno, dois grupos de ratinhos RF receberam doas administrações orais de PB3D, separadas per três semanas. Deu-se a um dos grupos uma dose mensal total de 400 ng (80
Hg/dia/ratinhoj durante cinco dias consecutivos) enquanto que o outro recebeu uma dose mensal total de 4 ng (0,8 ug/dia/ratinho durante cinco dias consecutivos), 0 grupo de controlo não recebeu tratamento, Foi induzida leucemia por aplicação cutânea numa área do corpo apropriadamente barbeada, A administração do P33D atrasou o aparecimento da leucemia. Este atraso era claramente significativo no grupo que tinha recebido 400 p.g de PB3D,
Tempo após tratamento com meti 1co1an tereno (dias) Idade (dias) Incidências 400 ng de PB3D 4 de ug linf©ma de PB3D (¾) Cont .rolos 50 170 0 á 14 80 200 10 25 60 110 230 25 44 75 140 260 35 62 83 170 290 55 69 95 190 310 55 69 100 220 340 55 81 100 250 370 55 100 100 280 400 60 100 100 290 410 65 100 100
Toxicidade Aguda
Os testes de toxicidade aguda foram conduzidos por injecçãc intravenosa do exopolímero nas seguintes dosesϊ 1 wg, 10 ug, 15 ug, 100 yci, 300 wg, 600 wg e 1200 u.g por ratinho, na veia da cauda de cinco ratinhos em cada dose. Nenhuma das doses, produziu -19- t 71 361 JFL/sr/10573 incla estavam vivos quaisquer reacçoes negativas nos ratinhos que dois meses após a injecçao,
Descriçao da estirpe A estirpe *1 OQ CS 4* j.£s-«í Cscí ull . idobacteri um infantis longum foi depositada em 6 de Julho de 1989 na "Collection Mationale Cultures de Mi . cr oor ga n ismes " (Instituto Pasteur, 25 r ue du Doe fceur Roux, 75724 Paris, Cedex, Francs ).. '"'so o número de depósito 1-885,
Esta estirpe foi isolada de águas efluentes contendo matéria focal de origem humana e apresenta caracteristicas taxonómicas entre a B i f idobacterium infantis e a Bifidobacterium longum e é tipificável pelo perfil dos componentes estruturais, os perfis catabolitos da fermentação da D-glucose, o perfil de resistência a antibióticos e presente invento. produção do sxopolímeros cobertos pelo
Claims (8)
- 71 3él JFL/sr/10573 -20- REIVINDICfiCOES 1 - Processo para a preparação de um exopolímero extracelular, earacterizado por se cultivar a estirpe bacteriana Bifidobacterium infantis longumu depositada na Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM/Institut Pasteur) sob ο N2. 1-885, sob condições anaeróbieas, num meio adequado, por, após eliminação dos microrganismos do meio de cultura, o exopolímero assim produzido ser isolado, concentrado e, em seguida, precipitado por adição de um solvente orgânico e, finalmente, por o produto resultante da precipitação ser liofilizado.
- 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o exopolímero ser isolado do meio de cultura por ultrafiltração numa membrana porosa calibrada com um limite de retenção maior ou igual a 10 000 daltons»
- 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o exopolímero isolado do meio de cultura ser concentrado por ultrafiltração.
- 4 - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado por o exopolímero ser precipitado por adição de álcool, de preferência stanol.
- 5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o exopolímero ser, essencialmente, de natureza polissacárida e compreender, principalmente, glicose e galactose numa razão entre 1:1 e 4:1, e por poder conter uma fracção proteica, no máximo, igual a 30¾, em peso,
- 6 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o exopolímero produzido ter uma razão de glicose para galactose na gama de 3:2.
- 7 - Processo de acordo com uma das reivindicações 1, 5 e é, caracterizado por o exopolímero ter um peso molecular aparente entre 10 000 e 100 000 daltons, de preferência entre 20 000 e 30 000 daltons, e por poder formar agregados, de peso molecular de cerca de 10^ daltons, em equilíbrio com unidades de peso -21- JFL/sr/10573 molecular mais baixo. 3 - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 5 a 7, caracterizado por o exopolímero produzido estar isento de ácidos nucleicos, de lípidos e de ácidos orgânicos.
- 9 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica com actividade terapêutica imunomodulador aanti-infecciosa e/ou anti-tumoral, caracterizado por se associar, como principio activo, o exopolímero extraceiular produzido de acordo com uma das reivindicações anteriores com veículos e/ou excipientss farmaceuticamente aceitáveis. Lisboa, JB. SET. 1990 Por LABORATORIES QH S.A, - 0 AGENTE OFICIAL -
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