PL165512B1

PL165512B1 - S posób wytwarzania pozakom órkowego egzopolim eru PL PL PL

Info

Publication number: PL165512B1
Application number: PL90286821A
Authority: PL
Inventors: Farras Ramon Pares; Torroella Juan Jofre; Jean-Paul Ricard; Adrian Schulthess; Jean-Claude Farine; Marie-Christine Michelet; Agnes Ramsteiner; Jacques Bauer
Original assignee: Om Lab Sa
Priority date: 1989-09-29
Filing date: 1990-09-10
Publication date: 1994-12-30
Also published as: FI95483B; PE15391A1; SE9002557L; DK191290A; FI903777A0; DK191290D0; AU6263190A; NO904041L; RU2025127C1; PL286821A1; YU47646B; NO178345C; MA21945A1; TR25353A; DE4028018A1; EG19285A; HUT61333A; GB2244998A; HU905988D0; FI95483C

Description

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania egzopolimeru pozakomórkowego, wykazującego właściwości immunomodulacyjne. Egzopolimer ten stosuje się do wytwarzania preparatów farmaceutycznych.

Wiele chorób takich jak alergia, choroby autoimmunizacyjne, niektóre choroby zakaźne i niektóre raki, posiada wspólną cechę charakterystyczną, a mianowicie pierwotne lub wtórne zaburzenia układu odpornościowego. Podczas gdy pierwotne niedobory odpornościowe są rzadkie i na ogół mają przyczyny genetyczne, to wtórne niedobory odpornościowe występują częściej i przyczyny ich są głównie zewnętrzne, takie jak np. powtarzające się zakażenia, starzenia się, rak, złe odżywianie, stykanie się z substancjami immunotoksycznymi i stresy.

Immunoterapia pozwala łagodzić objawy pierwotnych niedoborów odpornościowych i przywracać odporność w przypadku wtórnych niedoborów odporności.

Opracowano wiele środków immunoterapeutycznych w postaci środków albo immunostymulujących albo immunosupresyjnych. Ogólnie, immunomodulatory stanowią środki, które w sposób nieswoisty zwiększają swoistą reaktywność gospodarza i nieswoiste mechanizmy efektorowe. Można rozróżnić syntetyczne immunomodulatory oraz immunomodulatory pochodzenia biologicznego. Te ostatnie stanowią produkty pochodzące od drobnoustrojów i ekstrakty pochodzenia zwierzęcego lub nawet ludzkiego, takie jak np. hormony grasicy, dające się dializować ekstrakty leukocytów, interferonów i cytokinów.

Faktem jest, że można znacznie modyfikować aktywację limfocytów lub makrofagów i ich intermodulację przez poddawanie ich działaniu strukturalnych cząsteczek drobnoustrojów lub biologicznie aktywnych związków wytwarzanych przez drobnoustroje. Wykazano, że wiele różnych bakterii i produktów pochodzenia bakteryjnego ma wpływ na układ odpornościowy. Powyższy zasób środków immunomodulujących pochodzena bakteryjnego obejmuje mikrobakterie i wytwarzane przez nie produkty, lipopolisacharydy wytwarzane przez bakterie Gram-ujemne, enterotoksyny wytwarzane przez Vibrio cholerae, produkty wytwarzane przez paciorkowce, lipoproteiny i glikoproteiny wytwarzane przez różne bakterie Gram-ujemne i polisacharydy różnego pochodzenia. Prowadzone są w dalszym ciągu intensywne badania w tej dziedzinie.

Niniejszy wynalazek stanowi dalszy postęp w dziedzinie immunoterapii, ponieważ dotyczy sposobu wytwarzania nowego pozakomórkowego egzopolimeru, posiadającego bardzo interesujące właściwości immunomodulacyjne.

165 512

Sposób według wynalazku wytwarzania egzopolimeru polega na hodowli wybranych szczepów nowo-wyizolowanego gatunku Bifidobacterium infantis longum, który jest bakterią Gram-dodatnią, o charakterystyce taksonomicznej pomiędzy Bifidobacterium infantis i Bifidobacterium longum. Powyższy egzopolimer posiada właściwości immunomodulacyjne, wykazane doświadczalnie i w związku z tym jest rzeczywiście interesujący w zastosowaniu do medycyny i weterynarii.

Sposób według wynalazku polega na tym, że szczep bakteryjny IBS Bifidobacterium infantis longum, zdeponowany pod nr I-885 w Institut Pasteur - Collection Nationale de Culture de Microorganismes /CNCM/, poddaje się hodowli w warunkach anaerobowych w odpowiednim środowisku, po czym po usunięciu drobnoustrojów ze środowiska hodowlanego tak otrzymany egzopolimer wyodrębnia się zatęża i następnie wytrąca przez dodanie rozpuszczalnika organicznego. Wreszcie, wytrącony produkt poddaje się liofilizacji.

Szczep IBS można hodować w dowolnym rodzaju odpowiedniego środowiska, którego składniki mają ciężar cząsteczkowy poniżej 10 000 daltonów, w warunkach anaerobowych, korzystnie około temperatury 37°C. Szczegółowy skład takiego środowiska podano poniżej.

Drobnoustroje usuwa się ze środowiska hodowlanego korzystnie przez odwirownie, wyodrębnia się egzopolimer, np. przez ultrafiltrację na kalibrowanej, porowatej membranie o progu retencji wyższym lub równym 10 000 daltonów.

Następnie wyodrębniony produkt zatęża się, dializuje, wytrąca przez dodanie rozpuszczalnika organicznego, korzystnie etanolu i wreszcie liofilizuje się.

Otrzymany egzopolimer ma zasadniczo charakter polisacharydu składającego się głównie z glikozy i galaktozy w stosunku 1:1 - 4:1 i zawiera frakcję białkową co najmniej równą 30% wagowych. W zakresie frakcji polisacharydowej stosunek glikozy do galaktozy leży w zakresie 1:1 - 4:1, a korzystnie wynosi około 3:2.

Egzopolimer wytwarzany sposobem według wynalazku posiada pozorny ciężar cząsteczkowy 10 000 - 100 000 daltonów, korzystnie 20 000 - 30 000 daltonów. Może tworzyć agregaty o ciężarze cząsteczkowym około 10⁶ daltonów pozostających w równowadze z cząsteczkami o niższym ciężarze cząsteczkowym. Jest on również wolny od kwasów nukleinowych, lipidów i kwasów organicznych.

Tak wyodrębniony i oczyszczony egzopolimer posiada interesujące właściwości immunomodulacyjne, a jednocześnie nie jest toksyczny. Zarówno doświadczenia in vitro jak in vivo wykazały, że egzopolimer wytwarzany ze szczepu 1BS zachowuje się jak immunomodulator i że wzmaga nieswoistą odporność gospodarza. Ma on też wyraźnie właściwości przeciwbiałaczkowe /przeciwnowotworowe/, których źródło można wiązać z jego właściwościami immunomodulacyjnymi, opisanymi w Determination of the immunomodulatory properties of the exopolymer produced by the strain IBS.

Dlatego też egzopolimer wytwarzany przez szczep 1BS można korzystnie stosować jako substancję czynną różnych środków farmaceutycznych, które można podawać doustnie, pozajelitowo oraz miejscowo. Środki te mogą mieć typowe postaci stosowane w medycynie lub weterynarii, np. mogą być w formie prostych lub powlekanych cukrem tabletek, kapsułek, małych pigułek, syropów, czopków, preparatów do wstrzykiwań, krążków macicznych, kremów, pomad, płynów, kropli i płynów do oczu. Wytwarza się je zwykłymi sposobami.

Substancję czynną, czyli egzopolimer, można wprowadzać do tych środków samą lub łącznie z innymi substancjami aktywnymi farmakologicznie. Jako zarobki stosuje się konwencjonalne substancje, takie jak talk, guma arabska, mannit, skrobia, stearynian magnezu, masło kakaowe, wodne lub niewodne nośniki, substancje tłuste pochodzenia zwierzęcego lub roślinnego, pochodne parafiny, glikole, różne środki zwilżające, dyspergujące lub emulgujące i środki konserwujące.

W przypadku zwierząt zaobserwowano znaczne efekty immunomodulacyjne na myszach przy stosowaniu dawek 4-400 gg na mysz.

Poniższe przykłady ilustrują wynalazek bez ograniczania jego zakresu. W szczególności dotyczą one wytwarzania egzoplimeru /nazywanego też PB 3D/ oraz jego farmakologicznego działania.

165 512

Wytwarzanie egzopolimeru przez poddanie hodowli szczepu bakteryjnego 1BS Bifidobacterium infantis longum

Etap A: hodowla szczep 1BS

Szczep 1BS hoduje się w warunkach anaerobowych w temperaturze 37°C /powietrze eliminuje się na początku fermentacji/, w następującym środowisku odżywczym:

Pepton /ciężar cząsteczkowy < 10 000 daltonów/ 5 g/l

NaCl 3 g/l

Glikoza 10 g/l

Cysteina 0,5 g/l

Octan sodu 2 g/l

Na2HPO4 2,87 g/l

KH2PO4 1,12 g/l

MgS04 0,09 g/l

NaH2PO4 0,15 g/l

NaHCO₃ 2,2 g/l

Tween 1 ml/l

Roztwór witamin 10 ml/l

W celu polepszenia wydajności do środowiska hodowlanego dodaje się korzystnie stały nośnik taki jak CYTODEX® lub inny równoważny nośnik. W tych warunkach szczep 1BS wytwarza egzopolimer, który można ilościowo oznaczyć w supernatancie stosując metodę testu ELISA, opracowaną w tym celu i opisaną poniżej

Przykład I. Sporządza się 10 litrów środowiska hodowlanego opisanego w etapie A, po czym umieszcza się je w 12 litrowym fermentorze dla sterylizacji. Następnie fermentor zaszczepia się 1000 ml hodowli szczepu 1BS, hodowanego w tym samym środowisku w ciągu 48 godzin. Przepuszcza się przez bełkotkę mieszaninę 90% N2 i 10%o CO2 w ciągu 20 minut z szybkością 31/min. Inkubację prowadzi się w temperaturze 37°C, mieszając z szybkością 400 obrotów/minutę, w atmosferze N2/CO2 w zwykłym stosunku, przy czym mieszaninę gazową wtłacza się do środowiska podczas pierwszych dwóch godzin fermentacji. Po 48 godzinach, po zakończeniu procesu fermentacji, oznacza się ilość wytworzonego polisacharydu metodą eLISA. Minimalna wydajność wynosi 35 gg/ml.

Etap B: Wyodrębnianie i oczyszczanie wytworzonego egzopolimeru.

Po zakończeniu procesu fermentacji oddziela się komórki przez wirowanie. Po osadzeniu się komórek supernatant ultrafiltruje się stosując aparat typu Amicon Hollow Fiber H5 P10-43. Zatrzymują się tylko cząsteczki o ciężarze cząsteczkowym ponad 10 000 daltonów. Roztwór zawierający wytworzony egzopolimer poddaje się dziesięciokrotnemu zatężaniu i następnie dializie.

Stężony roztwór wytrąca się za pomocą alkoholu /etanol: woda w stosunku objętościowym 3:1/.

Wreszcie, produkt wytrącony etanolem liofilizuje się. Otrzymany tak produkt jest białawy i ma włóknisty wygląd.

Przykład II. 10 litrów supernatantu uzyskanego z hodowli prowadzonej w przykładzie I, przy zastosowaniu sposobu opisanego w etapie B, poddaje się zatężeniu do 1 litra przez ultrafiltrację. Objętość doprowadza się do 10 litrów wodą destylowaną i zatęża się ponownie przez ultrafiltrację do około 1 litra. Operację tę przeprowadza się dwukrotnie. Natomiast 1 litr tak otrzymanego roztworu poddaje się wytrącaniu etanolem / 3:1, objętościowo/. Otrzymany osad liofilizuje się uzyskując 400 mg liofilizatu.

Metoda ELISA

Stosowanym antygenem jest preparat polisacharydowy, którego czystość zapewnia się przez dodatkową deproteinizację fenolem. Wstrzykuje się królikowi początkową dawkę 0,5 mg w dwóch wstrzyknięciach - jedno śródotrzewnowo, drugie podskórnie - razem z kompletnym adiuwantem Freunda. Wstrzyknięcie powtarza się 15 dnia, stosując tym razem niekompletny adiuwant Freunda. Po 15 dniach wykrwawia się królika w celu otrzymania surowicy odpornościowej zawierającej przeciwciała, o wysokim poziomie przciwciał, które umożliwiają, za pomocą metody ELISA, rozpoznanie egzopolimeru oczyszczonego chromatograficznie na ko165 512 lumnie Sephadex G 200 oraz egzopolimeru obecnego w supernatancie po hodowli Bifidobacterium po wytrąceniu etanolem.

Test ELISA prowadzi się na mikropłytce. Antygen zostaje zaadsorbowany. Następnie miejsca, które pozostały wolne, zostają wypełnione albuminą surowicy w zagłębieniach. Następnie prowadzi się inkubację ze swoistymi przeciwciałami otrzymanymi z królika. Następnie dodaje się przeciwciała skierowane przeciw przeciwciałom królika. Są one koniugowane do alkalicznej fosfatazy. Wreszcie dodaje się podłoże/ ortofosforan nitrofenylu/. Po inkubacji zatrzymuje się reakcję stosując 3M NaOH. Mierzy się absorbancję przy 405 nm na czytniku ELISA. Sposobem tym otrzymuje się wystarczająco wysokie miana przeciwciał, aby umożliwić pozytywne odczyty dla rozcieńczeń 10'⁴ surowicy odpornościowej przy stężeniach oczyszczonych antygenów 4 mikrogramy.

Charakterystyka egzopolimeru wytwarzanego przez szczep 1BS .

1/ Otrzymany produkt składa się zasadniczo z glicydów /oznaczanych metodą fenol/kwas siarkowy/ i z białek /oznaczanych metodą Lwory/ w stosunku 5:1.

Produkt nie zawiera żadnych kwasów nukleinowych, zgodnie z wynikami analitycznymi otrzymanymi na drodze chromatografii jono-ekskluzyjnej lub gazowej. W żadnym przypadku hydrolizat nie zawiera pentoz. Produkt jest wolny od lipidów, zgodnie z wynikami otrzymanymi na drodze chromatografii gazowej po ekstrakcji n-heptanem. Zgodnie z wynikami chromatografii jono-ekskluzyjnej produkt nie zawiera kwasów organicznych.

2/ Zgodnie z wynikami otrzymanymi z cieczową chromatografią ciśnieniową /HPLC/ na kolumnie RP-8 300 A produkt ma charakter glikoproteidu.

3/ Część glicydowa składa się z glikozy i galaktozy zgodnie z dowodami analitycznymi uzyskanymi na drodze chromatografii jono-ekskluzyjnej, cienkowarstwowej i gazowej.

4/ Glikoza i galaktoza obecne są w stosunku 3:2, zgodnie z wynikami chromatografii gazowej z monomerów, hydrolizowanych przez metanolizę i acetylowanych trifluoroacetylacją.

5/ Część polisacharydowa jest rozgałęziona z wiązaniami 1-2, 1-3, 1-4, 1-6, zgodnie z chromatogramem z chromatografii gazowej prowadzonej na metylowanych /przez metanolizę/ i następnie acetylowanych / przez trifluoroacetylację/ monomerach.

6/ Aktywność biologiczna, którą się mierzy za pomocą zdolności stymulowania zwiększania ilości komórek wytwarzających łysinki /PFC/, pochodzi od części glicydowej i utrzymuje się po traktowniu proteinazą K, która uszkadza część białkową.

7/ Przybliżony ciężar cząsteczkowy waha się w granicach 20 000 - 30 000 daltonów, zgodnie z wynikami chromatgrafii na Sephadex G 200 /pik o niskim ciężarze cząsteczkowym/.

Egzopolimer może tworzyć agregaty o ciężarze cząsteczkowym około 106 daltonów, w równowadze z cząsteczkami o niższym ciężarze cząsteczkowym.

Oznaczenie właściwości immunomodulacyjnych egzopolimeru wytwarzanego przez szczep 1BS /in vitro/

Proliferacja splenocydów

Profilerację splenocydów w obecności mitogenów można mierzyć za pomocą redukcji MTT /to jest bromku 3-/4,5-dimetylotiazol-2-ilo/-2,5-difenylotetrazoliowego/ do formazanu przez dehydrogenazę mitochondrialną.

Przykład III. Proliferacja /splenocyty myszy C 57BL/6/ wyrażana jest przez absorbancję przy 560 nm jako funkcja stężenia PB3D lub LPS, który służy do celów porównawczych:

Tabela 1

PB 3D	LPS
pg/ml	OD przy 560 nm	pg/ml	OD przy 560 nm
1	2	3	4
333	1.483	20	1.486
111	1.593	6,77	1.308

165 512

1	2	3	4
37	1.459	2,22	0,964
12,3	1.018	0,74	0,725
4,1	0,580	0,25	0,526
1,4	0,427	0,08	0,423
		0,03	0,366
kontrola 0	0,273	kontrola 0	0,273

PB3D wywołuje proliferację, która jest nieco niższa niż proliferacja wywoływana przez LPS.

Oznaczenie właściwości immunomodulacyjnych egzopolimeru wytwarzanego przez szczep 1BS /in vivo/

Stymulowanie wytwarzania komórek wytwarzających przeciwciała

Przy podawaniu myszom doustnie razem z czerwonymi krwinkami owcy lub śródotrzewnowo bez czerwonych krwinek owcy, egzopolimer nieswoiście stymuluje produkcję komórek wytwarzających przeciwciała. Egzopolimer również normalizował tę zdolność u myszy, u których zahamowano odpowiedź immunologiczną za pomocą cyklofosfamidu.

Przykład IV. Po pięciodniowym doustnym podawaniu PB3D dawki przypominającej w dniach 19 i 20 /organigram AJ lub bez dawki przypominającej /organigram B/ obserwuje się wzrost liczby PFC w śledzionie myszy, w zależności od podanych dawek.

Tabela 2

	SRBC	PFC/10⁶ komórki	PFC śledziona
Organigram A: 400 μg	100%	126%*	136%*
/z dawką przypominającą/	100%	134%*	145%*
	100%	131%*	143%*
40 μg	100%	115%*	123%*
	100%	125%*	133%*
	100%	120%*	128%*
Organigram B: 400 μg	100%	104%*	104%*
	100%	109%*	104%*
	100%	101%*	101%*
40 μg	100%	111%*	113%*
	100%	117%*	123%*
	100%	110%*	113%*

* = p < 0,05

Przykład V. Po śródotrzewnowym podaniu pojedynczej dawki 400 ggramów/mysz PB3D, obserwuje się po 4 dniach znaczny wzrost PFC.

Tabela 3

Zaszczepiony produkt	PFC/śledziona	Stosunek grupa testowana/ grupa kontrolna
Kontrola	12,5 ± 0
PB3D	43,75 ± 31,37	3,5
Kontrola	6,25 ± 6,85
PB 3D	27,08 ± 24,26	4,3

Przykład VI. Podawanie egzopolimeru myszy, u której zahamowano odpowiedź immunologiczną za pomocą cyklofosfamidu, umożliwia obserwowanie u traktowanej myszy

165 512 niższe zahamowanie odpowiedzi immunologicznej lub szybszy powrót do normalnej liczby PFC w porównaniu do myszy nietraktowanej.

Tabela 4

Dni po zahamowaniu odpowiedzi immunologicznej	Traktowanie	PFC/śledziona	PFC/10⁸ limfocyty
5	CY^1Z	1,04 ± 2,25	30 ± 73
	PB²⁷	4,71 ± 7,32	83 ± 146
7	CY	0
	PB	7,29 + 6,14	81 ± 84
10	CY	18,75 ± 13,11	46 ± 38
	PB	60,41 ± 64,4	382 ± 508
19	CY	25 ± 10,2	110 ±96
	PB	18,75± 8,83	86 ± 83
Kontrolne³)		9,5 ± 8,75	58,31 ± 49,2

Mysz, u której zahamowano odpowiedź immunologiczną za pomocą cyklofosfamidu. 2) Mysz, u której zahamowano odpowiedź immunologiczną za pomocą cyklofosfamidu, a następnie podano PB3D.

Mysz, której podano roztwór soli.

Wpływ na skład białek surowicy

Różne immunomodulatory modyfikują układ immunoelektroforetyczny białek surowicy określanych jako X, LA i LB. Egzopolimer wytwarzany sposobem według wynalazku powoduje taką modyfikację.

Przykład VII. Podanie śródotrzewnowe 400 ggramów/mysz PB3D powoduje po 24 godzinach i po 4 dniach modyfikację białek surowicy porównywalną z modyfikacją wywoływaną przez lipopolisacharyd z Escherichia coli /LPS/.

Przykład VIII. Analogiczne podanie całej dawki 400 gg doustnie i podzielonej na 5 kolejnych dawek dziennych po 80 gg powoduje modyfikację białek zauważalną po pięciu dniach od podania egzopolimeru.

Klirens koloidalnego węgla

Podaje się egzopolimer dożylnie /2,5 gg/mysz/ myszy Ba 1b/c. Po 48 godzinach wstrzykuje się dożylnie 0,2 ml zawiesiny koloidalnego węgla. Zniknięcie węgla w krwi, zwane klirensem, wyraża się spadkiem poziomu węgla względem czasu.

Egzopolimer przyspiesza klirens.

Tabela 5

Czas /min./	Grupa kontrolna HO-NaCl 0,9%	Grupa traktowana PB3D 2,5 mg
0	1,865 ± 0,087	1,815+ 0,044
2	1,800 ± 0,031	1,662+ 0,037
4	1,754± 0,032	1,531± 0,065
6	1,588 ± 0,009	1,432 ± 0,096
8	1,657 ± 0,038	1,305 ± 0,073
10	1,535± 0,134	1,207 ± 0,105
12	1,588 ± 0,045	1,079 ± 0,154

Wzrost nieswoistej odporności

Można zaobserwować, że u myszy, u której zahamowano odpowiedź immunologiczną cyklofosfamidem i wystawiono na działanie zimna, egzopolimer wytwarzany sposobem według

165 512 wynalazku zwiększa nieswoistą oporność gospodarza na zakażenia bakteryjne, np. wywoływane przez Pseudomonas na poziomie błon śluzowych lub na zakażenia wirusowe /wirus Coxsackie B/.

Przykład IX. Wywołuje się zahamowanie odpowiedzi immunologicznej przez śródotrzewnowe podanie 200 mg/kg cyklofosfamidu. Trzeciego dnia rozpoczyna się pięciodniowe podawanie doustne egzopolimeru /80 gg/mysz/dzień/. Kontrolne myszy dostają równoważną ilość roztworu soli. Parę godzin po zakończeniu podawania myszy zakaża się donosowo szczepem Pseudomonas aeruginosa, któremu nadano patogeniczność w stosunku do myszy. Stopień przeżycia jest wyższy u myszy z grupy traktowanej:

Tabela 6

Doświadczenie	Traktowanie	Stopień przeżycia /%/
1	Kontrolne	8/18 /44/
	400 gg PB3D	11/20 /55/
2	Kontrolne	0/14 /0/
	400 gg PB3D	10/29 /34/
3	Kontrolne	7/12 /58/
	400 gg PB3D	9/12 /82/

Przykład X. Wywołuje się zahamownie odpowiedzi immunologicznej przez pojedyncze śródotrzewnowe podanie 200 mg/kg cyklofosfamidu. Trzeciego dnia rozpoczyna się pięciodniowe podawanie doustne egzopolimeru /80 gg/ mysz/dzień/. Myszy z grupy kontrolnej dostają równoważną ilość roztworu soli. Parę godzin po zakończeniu traktowania myszy zakaża się śródotrzewnowo wirusem Coxsackie B5 /0,5 ml z 10⁷ PFU/ i ocenia się stopień przeżycia. Jest on wyższy w grupie myszy traktowanych.

Tabela 7

Traktowanie	Warunki po zakażeniu	Stopień przeżycia /%/
Kontrolne	4-6°C	0/20 /0/
PB3D	4 - 6°C	16/20 /80/
Kontrolne	20°C	6/10 /60/
PB3D	20°C	10/10 /100/

Testy na spontaniczną lub wywoływaną białaczkę

Egzopolimer wytwarzany według wynalazku jest zdolny do opóźniania pojawienia się białaczki u myszy AKR /szczep myszy ze wspólnych rodziców, u których pojawia się bardzo często spontaniczna białaczka/. Egzopolimer jest również zdolny do opóźnienia pojawienia się u muszy RF białaczki, wywołanej rakotwórczą substancją taką jak metylocholantren. /Szczep RFjest szczepem ze wspólnych rodziców, u którego metylocholantren wywołuje bardzo szybkie pojawianie się spontanicznej białaczki/.

Przykład XI. Dwom grupom myszy AKR podaje się doustnie pięciodniową kurację PB3D co miesiąc, podczas gdy trzeciej grupie nie podaje się badanego związku i służy ona jako grupa kontrolna. Z dwóch grup traktowanych jedna dostaje całkowitą dawkę miesięczną 400 gg /8 gg/dzień/mysz/, a druga dostaje całkowitą dawkę miesięczną 4 gg /0,8 gg/ dzień/mysz/ w ciągu 5 kolejnych dni/.

Otrzymane wyniki, przedstawione w tabelach 8 i 9, wykazują opóźnienie pojawiania się białaczki u myszy traktowanych. Różnica tajest wyraźnie znacząca w grupie otrzymującej dawkę 400 gg/miesiąc. Potwierdza to drugie doświadczenie, w którym traktowane grupy dostają odpowiednio po 400 gg i 40 gg PB3D.

165 512

Tabela 8

Doświadczenie 1

Wiek /dni/	Wystąpienie chłoniaka %
PB3D 400 gg	PB3D 4 gg	Kontrolna
210	5	0	19
225	5	0	26
240	11	10	40
255	21	10	48
270	26	44	55
285	37	55	62
300	37	55	65
315	42	61	79
330	47	67	83
345	55	72	91
360	61	78	93
375	65	78	98
390	71	83	100
405	71	83	100
420	76	83	100
435	76	83	100
450	76	83	100
465	76	89	100
480	76	89	100
495	82	94	100

Tabela 9 Doświadczenie 2

Wiek /dni/	Wystąpienie chłoniaka %
PB3D 400 gg	PB3D 4 gg	Kontrolna
1	2	3	4
168	0	5	5
175	0	10	5
182	5	10	5
196	5	15	5
203	5	15	11
210	10	20	11
217	15	30	11
224	15	30	16
231	20	30	26
238	25	30	26
245	25	30	32
252	25	40	32
259	30	40	42
273	37	45	47
280	42	45	53
287	53	50	53
294	53	55	58

165 512

1	2	3	4
301	53	60	58
308	53	65	58
315	53	65	63
336	60	65	63
343	60	65	68
350	60	70	68
406	65	70	74
462	65	80	84
518	80	85	95
560	80	85	100

Przykład XII. Podczas dwóch miesięcy poprzedzających miejscowe podawanie metylocholantrenu, dwu grupom myszy RF podaje się dwa razy doustnie PB3D, w odstępie 3 tygodni. Jedna z grup otrzymuje miesięczną dawkę całkowitą 400 gg /80 gg/dzień/mysz w ciągu 5 kolejnych dni/, zaś druga otrzymuje miesięczną dawkę całk<^^wii^^4 gg /0,8 gg/dzień/mysz w ciągu 5 kolejnych dni/. Grupa kontrolna nie jest traktowana. Białaczkę wywołuje się podając na skórę metylocholantren na dobrze wygolonym obszarze ciała. Podanie PB3D opóźnia pojawianie się białaczki. Opóźnienie to jest wyraźnie znaczące u grupy otrzymującej 400 gg PB3D.

Tabela 10

Czas po traktowaniu metylocholantrenem /dni/	Wiek /dni/	Wystąpienie chłoniaka %
PB 3D 400 gg	PB3D 4 gg	Kontrolna
50	170	0	6	14
80	200	10	25	60
110	230	25	44	75
140	260	35	62	83
170	290	55	69	95
190	310	55	69	100
220	340	55	81	100
250	370	55	100	100
280	400	60	100	100
290	410	65	100	100

Ostra toksyczność

Teksty na ostrą toksyczność prowadzono podając wstrzyknięcia dożylne egzopolimeru w następujących dawkach: 1 gg, 10 gg, 15 gg, 100. gg, 300 gg, 600 gg 120 gg na mysz do żyły ogonowej, stosując pięć myszy na każdą dawkę. Żadna dawka nie wywołała ujemnych reakcji myszy, które były wciąż żywe jeszcze dwa miesiące po wstrzyknięciu.

Opis szczepu

Szczep 1BS Bifidobacterium infantis longum zdeponowano 6 lipca 1989r. w Collection Natronale de Cultures de Microorganismes /Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, Cedex, Francja/ pod numerem depozytu I-885.

Szczep ten był wyizolowany z wody ściekowej zawierającej substancje kałowe pochodzenia ludzkiego; ma on charakterystykę taksonomiczną pomiędzy Bifidobacterium infantis i Bifidobacterium longum; typ jego określa się za pomocą profilu składników strukturalnych, profilu katabolitów fermentacji D-glikozy, profilu oporności naantybiotyki i produkcji egzopolimeru według wynalazku.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania pozakomórkowego egzopolimeru, znamienny tym, że szczep bakteryjny Bifidobacterium infantis longum, zdeponowany w Collection Nationale de Coltures de Microorganismes /CNCM/Institut Pasteur/ pod numerem I-885, poddaje się hodowli w warunkach anaerobowych w odpowiednim środowisku, po czym, po wyeliminowaniu drobnoustrojów ze środowiska hodowlanego, tak wytworzony egzopolimer wyodrębnia się, zatęża i następnie wytrąca przez dodanie rozpuszczalnika organicznego, po czym otrzymany przez wytrącenie produkt poddaje się liofilizacji.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że egzopolimer wyodrębnia się ze środowiska hodowlanego przez ultrafiltrację na kalibrownej, porowatej membranie o progu retencji wyższym lub równym 10 000 daltonów.
3. Sposób według zastrz. 1 albo zastrz. 2, znamienny tym, że egzopolimer wyodrębniony ze środowiska hodowlanego zatęża się przez ultrafiltrację.
4. Sposób według zastrz. 1 albo zastrz. 2 albo zastrz. 3, znamienny tym, że egzopolimer wytrąca się za pomocą dodania alkoholu, korzystnie etanolu.