JP3638955B2 - 連鎖球菌属からのリポテイコ酸を含有する抗腫瘍及び抗コレステロール製剤 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は新規なリポテイコ酸（以下LTA−Ｔという）、それと必要に応じてモノカイン及び／又はヒアルロニダーゼと共に含む医薬組成物、抗腫瘍有効量のそれを投与することを含んでなる癌を治療する方法、新規な化合物及び新規な医薬組成物の製造方法、新規なLTATの２つの分解生成物及びそれらの使用並びに新規化合物を単離することができる新規な連鎖球菌属菌株に関する。
発明の背景
リポテイコ酸（LTA）はグラム陽性細菌の外側細胞膜から細胞壁を通って表面に伸長する細胞壁中に見い出される１群の両親媒性物質である。主要な群のLTAは親水性ポリ（グリセロリン酸エステル）主鎖と疎水性糖脂質部分からなる。親水性の主鎖はアラニン、ヘキソース及びヘキソサミンで置換されてもよい。これまで記載された糖脂質は主にジヘキソシルグリセロール及びいくつかのトリヘキソシルグリセロールであった。リポテイコ酸は疎水性の鎖の重合の程度、グリコシド置換の性質及び程度、Ｄ−アラニルエステル置換の量、並びに脂質部分の構造に、属及び種変異を示す（A.J.Wichen他「Science」187,p1161〜1167（1975）及び「Microbiology」p.360〜365（1977）,Fischer W.,細菌におけるリポテイコ酸の生理学、「Adv.Microb.Physiol.」29（233）,p.233〜302（1988）,Fischer W.,Mannsfeld T.,Hagen G.,リポテイコ酸ポリ（グリセロリン酸エステル）の基本構造について、「Biochem.Cell Biol.」68（１）,p.33〜43（1990））。
LTAは抗腫瘍活性を有すると報告されてきた（欧州特許第135820号明細書、米国特許第4678773号明細書、A.山本他「Br.J.Cancer」51,p.739〜742,1985年及びH.Usami他「Br.J.Cancer」57,p.70〜73,1988年）。
LTAは乳酸杆菌属ヘルベチクス（NCIB 8025）、発酵乳酸杆菌（NCTC 6991）、糞便連鎖球菌39、球酸連鎖球菌（ATCC 9936）、連鎖球菌属ミュータンス、AHT（A.J.Wichen他、1975年）及び化膿連鎖球菌SV株（ATCC 21059）から単離された（欧州特許第135820号明細書、H.Usami他、1985年）。
グリセロホスホガラクトフラノシルグリセロールはJ.H.Veekamp及びF.W.Van Schalkの「Biochem et Biophys.Acta」348,第370〜387頁（1974年）に記載された。しかしながら、ビフィドバクテリウム属ビフィドゥム変異ペニシルバニクス（Bifidobacterium bifidum var.pennsylvanicus）からの単離は純粋な化合物を生じなかった。相当するガラクトピラノシル化合物の10〜20％の量がなお存在していた。この細菌からの主要な構造は後で、Werner Fischer「J.Biochem」165,第639〜646頁（1987年）により提案された。それは本発明のLTAとは関係がない。
K.K.Brownは国際特許出願公開第94/20115号明細書に癌の治療にヒアルロン酸を用いることを開示し、そこにはそれといっしょにリポテイコ酸を用いることができることが開示されている。
抗腫瘍活性を有する連鎖状球菌酸糖タンパク質（SAGP）がM.Kanaoka他〔「Jp.J.Cancer Res.（Gann）」78,p.1409〜1414（1987年）〕によって、低毒性化膿連鎖球菌株Su ATCC 21060から単離された。前記菌株からの細胞調製物であるOK−432は、抗腫瘍剤として臨床的に用途が発見された。しかしながら、そうしているうちに、それは市場から回収された。
LTAは現在まで、グリセロ糖脂質アンカー中に１より多い単糖類を担持していると記載されている。種々の糖脂質構造がフィッシャー他（1988年及び1990年）により記載されている。
脂質アンカーとして、モノヘキソシルジアシルグリセロ糖脂質を有するLTAは今までに記載されていない。
発明の目的
本発明の目的は強い抗腫瘍活性を有する精製された新規なLTAを提供することである。
さらなる目的は、この新規なLTAを、必要によりモノカイン及び／またはヒアルロニダーゼと共に含む医薬製剤を提供することである。
さらなる目的は患者に抗腫瘍有効量の上記新規なLTAを、必要によりモノカイン及び／またはヒアルロニダーゼと組み合せて投与することを含む癌の治療方法を提供することである。
さらなる目的はヒト患者にコレステロールを低下させる量のLTAを投与することを含むヒト患者における血液のコレステロールレベルを低下させる方法を提供することである。
さらなる目的は前記新規なLTA及び新規な製剤を提供することである。
さらなる目的は２つの新規LTAの分解生成物及びそれらの用途を提供することである。
さらなる目的は前記新規LTAを単離できる新規な連鎖球菌属菌株及びその増殖方法を提供することである。
発明の詳細な説明
本発明は新規な連鎖球菌属種菌株DSM 8747から単離可能な新規な精製されたリポテイコ酸（LTA）に関する。
最初に発見された新規なLTAをLTA−Ａという。それは、第５頁の表に示されているように鎖長及び脂肪酸組成の微不均一性を伴った、式Ｉに示されているように定義された化合物からなる。この微不均一性は、脂質の高分子両親媒性物質の典型的特徴である〔Fischer W.,リポテイコ酸で例示する、疎水相互作用クロマトグラフィーによる脂質高分子親媒性物質の分子の分析、「Anal.Biochem.」208,p.49〜56〕。天然のLTA−Ｔの正確な組成は容易には決定することができない。それは微生物の培養の条件に依存する。
より詳細には、本発明は式Ｉ

（式中、R₁は水素またはリンに対するモル比が0.27〜0.35のＤ−アラニルで、R₂は炭素原子12,14,16または18の飽和または不飽和脂肪酸の残基で、ｎの平均値は９である）のリポテイコ酸LTA−Ｔ及びその塩を提供する。
LTA−Ｔは、モノヘキソシル糖脂質部分を含有する新規な型のリポテイコ酸である。このようなモノヘキソシル糖脂質部分は、いまだにリポテイコ酸の一部分として他の微生物中には見い出されていない。下記の式IIに示すように、この脂質アンカーは、ベータ−ガラクトフラノシル（１−３）グリセロール−ジ−R₂エステルで、ここでR₂はグリセロール部分の２つの隣接する水酸基に対してエステル化された種々の脂肪酸の残基である。
脂肪酸残基R₂は直鎖の炭素原子12,14,16または18の飽和またはモノ不飽和カルボン酸由来のもので、飽和ラウリン（Ｃ−12）酸、ミリスチン（Ｃ−14）酸、パルミチン（Ｃ−16）酸及びステアリン（Ｃ−18）酸並びにそれぞれ、7,9,11または13位置に１個の二重結合を有する、相当するモノ不飽和カルボン酸を包含する。分布は不均一で、全膜脂質における分布を反映する。次のおよその％は典型的な培養についてのR₂について見い出された。
Ｃ−12、飽和 約 6.0％
Ｃ−14、飽和 約17.0％
Ｃ−14、モノ不飽和（位置不明） 約 3.7％
Ｃ−16、飽和 約33.0％
Ｃ−16、たぶん７−位置にモノ不飽和 約 3.8％
Ｃ−16、シス−９−位置にモノ不飽和 約11.3％
Ｃ−16、シス−11−位置にモノ不飽和 約 2.4％
Ｃ−18、飽和 約10.0％
Ｃ−18、たぶん９−位置にモノ不飽和 約 3.2％
Ｃ−18、11位置（シス）にモノ不飽和 約 8.5％
Ｃ−18、たぶん13−位置にモノ不飽和 約 1.1％
親水性主鎖は、平均10のグリセロリン酸エステル単位のポリ（グリセロリン酸エステル）からなる。グリセロール部分の位置２の水酸基は遊離であるか、またはＤ−アラニンによりエステル化されている。リンに対する置換のモル比はLTA−T 1分子当り2.7〜3.5 D−アラニン基に相当する、0.27〜0.35である。Ｄ−アラニンの含有量は培養条件に依存する。
リン原子における遊離の水酸基は酸性である。pH4.7の酢酸ナトリウム緩衝液及び生理食塩水においては、カチオンはナトリウムイオンである。LTA−Ｔは他の陽荷電したイオンと塩、特に生理的に許容し得る塩、たとえばアルカリ金属もしくはアルカリ土金属塩、重金属塩、たとえば、亜鉛もしくは鉄塩も、または第１級、第２級、第３級もしくは第４級アンモニウム塩（酸付加塩）を生成することができる。上記他の塩は、たとえばカリウム、カルシウム、アンモニウム、モノ−、ジ−、トリ−またはテトラ−低級アルキル−、たとえばメチル−もしくはエチル−、またはメチル−エチル−、プロピル−またはブチル−アンモニウム塩である。生理的に許容できない塩、たとえば重金属塩、たとえば銅塩はLTA−Ｔの単離及び精製に用いることができる。上記のようにLTAを精製する時に、好ましい塩はナトリウム塩である。
治療用途については、医薬組成物中の陽荷電したイオンの量は、生理的に許容し得るpH、特にpH7または7.2付近となるように調整すべきである。
本発明は、リポテイコ酸LTA−Ｔを連鎖球菌属種（DSM 8747）から単離し、慣用の方法によりそを精製することを特徴とする、リポテイコ酸LTA−Ｔの製造方法に関する。
LTA−Ｔの単離及び精製は、「Eur.J.Biochem.」133,第523〜530頁（1983年）〔Fischer W.,Koch H.U.,Haars R.（リポテイコ酸の改良製法）〕または任意の他の方法と同様にして達成することができる。たとえば、細菌の細胞（DSM 8747）を蒸留水または好ましくは緩衝液、たとえばpH3.0のクエン酸緩衝液に懸濁し、好ましくは冷却下、たとえばホモジナイザー及びガラスビーズの手段により粉砕する。壊れた細胞の懸濁液をたとえば重炭酸ナトリウムでpH4.7に調整する。水性懸濁液を適度に上昇した温度、たとえば約68℃まででフェノール抽出する。水性相を分離し、数回、たとえばpH4.7の酢酸ナトリウム緩衝液に対して、分子量カットオフ10〜12KDを有するダイヤフラムで、透析する。残存する透明な溶液をPM10膜を備えた限外ろ過装置中で濃縮し、不溶物質、たとえば多糖類を遠心分離により除去する。
粗抽出物から、さらに所望しない物質、たとえばタンパク質、核酸及び多糖類をたとえば疎水相互作用クロマトグラフィー（HIC）によって、たとえばオクチル−Sepharoseカラム上にpH4.7のプロパノール／酢酸ナトリウム溶液中に入れて装てんすることによって除去する。LTA−ＴをたとえばpH4.7の酢酸ナトリウム中のプロパノールの直線グラジエントを用いて溶出する。溶出物を、「Biochem.Zentralblatt」332:167187（1959年）

にしたがって、有機リンの比色測定により監視する。LTA−Ｔはプロパノール濃度約30〜38％で溶出する。LTA−Ｔを含有する分画を緩衝液、たとえばpH4.7の酢酸ナトリウムに対して透析し、PM10膜を用いる限外ろ過で濃縮するか、真空中で完全に乾燥させる。精製されたLTA−Ｔまたはその濃縮溶液を−20℃で貯蔵する。
細菌の細胞（DSM 8747）を慣用の方法で、複合媒地、たとえばトッド・ヘウィット（Todd Hewitt）ブロスまたはトリプチン・大豆（Tryptic Soy）ブロス中で37℃、pH約7.2で、撹拌下、通気なしで培養することにより得る。対数増殖期の終りに細胞をたとえば遠心分離によって収集し、慣用の緩衝液、たとえばpH3のクエン酸緩衝液中に懸濁し、その中でそれらはさらに使用するために低温、たとえば−20℃で貯蔵することができる。
本発明はさらにリポテイコ酸LTA−Ｔまたはその生理的に許容し得る塩を、必要に応じてモノカイン及び／またはヒアルロニダーゼと組み合せて含む医薬製剤に関する。
モノカインは、たとえばインターフェロン、たとえばアルファ群のもの、たとえばインターフェロン アルファ2b、またたはインターフェロン ガンマーで、サイトカインは、たとえばインターロイキン、たとえばインターロイキン−１−アルファ、−１−ベータ、−２、−３、−４、−５、−６、−７もしくは−８、腫瘍壊死因子、たとえばTNF−アルファもしくはベータ、またはTGF−ベータ−１、−ベータ−２、−ベータ−３、−ベータ−５及び−アルファである。
ヒアルロニダーゼは任意の市販のもの、たとえばPermease（商標）である。
医薬の製剤は慣用のものである。
本発明のLTA−Ｔまたは医薬の組み合せは、任意の医薬形態で経口または非経口的に投与されて、治療効果を達成する。これらは持続性放出製剤を包含する、固体及び液体単位投与形態、たとえば、錠剤、カプセル、粉末、懸濁液、溶液及びシロップ、経皮性膏薬、吸入製剤及びその他同様のもの、並びに液体注射可能形態、たとえば、滅菌された溶液及び懸濁液を包含する。
用語「投薬形態」は本明細書及び請求の範囲で用いる時、ヒトまたは温血動物に、１回または多数回投薬で投与される物理的に別個の単位であって、各々、予め定められた量の活性物質と共に必要な希釈剤、担体または賦形剤を含有する単位に関する。活性物質の量は１またはそれよりも多い上記単位の投与により所望の治療効果を生ずるように計算された量である。
粉末は前記化合物を適当な細かい大きさに砕き、同様に細かく砕いた希釈医薬担体、たとえば食用炭水化物材料、たとえば澱粉と混合することにより調製する。甘味剤、香味剤、保存剤、分散剤及び着色剤も加えることができる。粉末は吸入により有利に適用され、この目的のために吸入器に充填される。このような乾燥粉末のための吸入器はこの分野で既知である。
カプセルは上記のように粉末を調製し、形成されたゼラチンの入れものに充填することによって作る。滑沢剤、たとえばタルク、ステアリン酸マグネシウム及びステアリン酸カルシウムを充填操作の前に補助剤として加えることができる。コロイダルシリカのような滑剤を流動性を改良するために加えることができる。崩壊剤または溶解化剤をカプセルが摂取されたときの医薬の効用を改良させるために加えることができる。
錠剤は、粉末混合物を調製し、顆粒化またはスラッギングし、滑沢剤及び崩壊剤を加えて、所望の形に圧縮することにより作る。粉末混合物を適当に細かく砕いた前記化合物と希釈剤または基剤、たとえば澱粉、砂糖、カオリン、リン酸ジカルシウム、その他の混合することにより調製する。粉末混合物を結合剤、たとえばシロップ、澱粉ペースト、アカリア粘液またはセルロース物質もしくは重合体物質の溶液で湿潤させ、ふるいを押し通すことにより顆粒化することができる。顆粒化に代えて、粉末混合物を打錠機を通過させ、生じる不完全に形成されたスラッグを顆粒に砕くことができる。顆粒は、錠剤形成ダイにくっつかないように、ステアリン酸、ステアリン酸塩、タルクまたは鉱油を添加する方法により滑沢化することができる。滑沢化された混合物を次いで錠剤に圧縮する。医薬は自由に流動する不活性担体と組み合せ、顆粒化またはスラッギング工程を経ずに直接に錠剤に圧縮することもできる。シェラックの密封コーティング、砂糖または重合体物質のコーティング及びワックスのつや出しコーティングからなる防水膜掛けを供給することができる。コーティングは胃の中で耐性があり、腸の中で活性成分が放出するようにすることができる。種々の投薬単位を識別するためにこれらのコーティングに染料を加えることができる。
内用液剤、たとえばシロップ剤及びエリキシル剤は、与えられた量、たとえば、茶さじ１杯が、前記化合物の予め定められた量を含むように、単位投薬形態に調製することができる。シロップ剤は活性化合物を適当に味をつけたショ糖の水溶液に溶解することにより調製することができるが、エリキシル剤は非毒性アルコール、たとえばエタノール賦形剤を用いて調製する。懸濁液及び乳化液は医薬を非毒性賦形剤中に分散させることによって製剤化することができる。
非経口投与については、液体単位投薬形態は計量された量の活性物質を注射に適切な非毒性液体賦形剤、たとえば水性、アルコール性、たとえばエタノールまたは油性媒体中に懸濁または溶解することによって調製することができる。このような液体投薬単位形態は、溶解化剤、たとえばポリエチレングリコール、安定剤、及び緩衝剤たとえばクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液を所望の浸透圧を与えるために含有することができる。代りに、計量された量の活性化合物をガラスびんに入れ、そのガラスびん及びその内容物を滅菌して、密封する。随伴するガラスびんまたは運搬具は投与の前に混合に備えることができる。溶液を特に吸入のために調製し、吸入器の手段により適用することもできる。液体用の吸入器は当分野で既知である。
経皮適用については、粉末またはシロップ剤を適当な経皮膏薬に製造し得る。このような膏薬は当分野に既知である。
モノカイン及び／またはヒアルロニダーゼとLTA−Ｔの組み合せを心に描くなら、このような組合せは、別々に及び同時にもしくは連続的に用いるか、またはさもなければ、上記方法にしたがって１つの医薬製剤中にいっしょに処方し得る。
本発明は、さらにLTA−Ｔまたはその生理的に許容し得る塩及び必要に応じてモノカイン及び／またはヒアルロニダーゼを含む医薬組成物を慣用の方法により製造する方法に関する。
本発明はさらに、抗腫瘍有効量のリポテイコ酸LTA−Ｔまたはその生理的に許容し得る塩及び必要に応じてモノカイン及び／またはヒアルロニダーゼを癌にかかっている患者、腫瘍またはその悪性細胞に投与することを含む癌を治療する方法に関する。
Bhakdi S.,Klonisch T.,Nuber P.,Fischer W.,の「リポテイコ酸によるモノカイン生産の刺激作用」（「Infect.Immun.」59（12）：第4614〜4620頁、1991年）及びKeller R.,Fischer W.,Keist R.,Bassetti S.の「細胞へのマクロファージ応答：リポテイコ酸による著るしい分泌及び細胞活性の誘導」（「Infect.Immun.」60（９）：第3664〜3672頁、1992年）にしたがって、測定された下記の生物学的効果は、各々LTA−Ｔを用いる単核細胞の誘導８時間後に見い出された。

同じ実験のセットで得られた公知の化膿連鎖球菌及び乳連鎖球菌のLTA用いる誘導についての値はこれらのデータより２〜４倍小さい。
新規なLTA−Ｔは、好ましくは、皮下、静脈または腹腔内に、0.1〜20マイクロモル/mlの量のLTA−Ｔまたはその生理的に許容し得る塩及び／またはそれよりも多い医薬担体を含む医薬製剤の投薬単位形態を投与する。LTA−Ｔの抗腫瘍有効量はたとえば約0.001〜約20mg、たとえば１〜20mg/kg、好ましくは0.01〜2mg/kgであって、必要に応じて、通常の体重の患者に対して、治療の全期間の間に１回または好ましくは数回投与する。投与の量及び方法は病気の型及びひどさ、患者の体重及び一般的な状態に依存し、医者の判断に任されている。新規なLTA−Ｔを予防的に前記の量で適用することができる。
ヒアルロニダーゼを用いるなら、約500〜約5000、好ましくは約1000U USPの量で、好ましくは皮下で適用される。
モノカインが用いられるなら、約0.1×10⁶〜20×10⁶、好ましくは約６×５ミオ（mio）単位で、好ましくは皮下で適用される。
いろいろな種類の腫瘍／癌にかかっている８人の患者を、濃度１マイクロモル/mlの生理食塩水溶液で皮下で１回または繰返し投与で治療した。大部分の患者は皮下でヒアルロニダーゼも得、１人はインターフェロン−アルファも得た。結果は例７の表２にしたがう。
本発明はさらに新規なLTA−Ｔを単離できる新規な連鎖球菌種株DSM 8747に関する。
新規な細菌株を完全な緩解状態の悪性乳癌腫を有する女性患者の丹毒から単離した。その菌株は連鎖球菌属の中で新しい種である。それは連鎖球菌種PTと呼ばれ、ブダペスト条約の下で、

（Braunschwig,ドイツ国）に1993年11月25日に寄託番号DSM 8747として寄託された。
その菌株は前記のように慣用の条件で培養及び貯蔵できる。
本発明はさらにLTA−Ｔの新規な分解生成物及び慣用の手段、たとえばアルカリまたはフッ化水素（HF）加水分解によるそれらの製法に関する。
上記新規分解生成物は、たとえば式Ｉの脱アシル化dLTA−Ｔであって、式中R¹及びR²は両方共水素である。この化合物は慣用の方法、たとえばLTA−Ｔの塩基、たとえば0.1M NaOH水溶液を用いる、37℃約１時間の処理により、脂肪酸及び/D−アラニル基の分離により得る。生成したdLTA−ＴをFolch J.,Lees M.,Sloan Stanley G.M.S.「動物組織からの全脂質の単離と精製のための簡易方法」（「J.Biol.Chem.」第497〜509頁、1957年）にしたがって、２相系クロロホルム：メタノール：水（1:0.9:0.9）の間の分割により分離及び精製する。
他の新規な分解生成物は式II

（式中、R₂は炭素原子12,14,16または18の飽和または不飽和脂肪酸残基）のベータ−ガラクトフラノシル（１−３）グリセロール−ジ−R₂−エステル、式IIに入る個々の化合物及びそれらの塩である。
式IIの化合物は、ガラクトフラノシル基の６−ヒドロキシ基とリン酸部分の間の結合を、たとえば48％フッ化水素による２℃で約36時間の処理により、分裂させることにより製造する。
R₂が水素である（脱アシル化脂質アンカー）、式IIの化合物は式Ｉの化合物から、たとえば0.2M NaOHを用い、100℃で12時間の処理及び引き続くホスホモノエステラーゼによるホスホモノエステルの分割により製造する。
分解生成物はLTA−の同定及び特徴づけのための分析手段として、特定の基R²を有する新規なLTAの、たとえば特定の脂肪酸を用いるdLTA−Ｔのエステル化による製造のための出発物質として及びガラクトフラノシル部分の６−ヒドロキシ基にエステル化された特定の疎水性基を有する新規なLTAの製造のための出発物質として有用である。
下記の例は本発明をさらに詳しく説明する。しかしながら、それらは本発明を限定するものと解すべきではない。
例1:細菌株及び培養

にDSM 8747として寄託された、グラム陽性細菌連鎖球菌種PTを悪性乳癌腫を有するヒト患者の丹毒から単離した。それは連鎖球菌のグループに属する。16 S RNA配列化はこの菌株は既知のグループに分類することができないことを示した。それは連鎖球菌種PTと呼ばれ、次の増殖特性を有する。
形態：剪断力に依存して、５〜40単位の鎖を生成する球菌
増殖最適条件：最適pH:pH7.2、最適温度:37℃、微好気性菌の増殖
細菌をトッド・ヘウィット ブロス（Difco,米国）中で対数増殖期の終りまで培養する。培養条件は：
作業容積V_R:500l
温度:37℃
pH:7.2±0.
通気量:0〜0.05vvm
撹拌速度:550rpm
培養ブロスを冷却し、遠心分離により細胞を直ちに収集する。細胞（400g湿重量/l）を0.1Mクエン酸緩衝液pH3.0に懸濁させ、さらなる使用のために−20℃で貯蔵する。
例2:リポテイコ酸LTA−Ｔの単離及び精製
特に記載されていない時は、すべての工程は４℃で達成する。
細菌細胞DSM 8747の0.1Mクエン酸緩衝液pH3.0の懸濁液（例１て得られた400g湿重量/l）（250ml）を等容積のガラスビーズ（Braun Melsungen,φ0.17〜0.18mm）と混合し、CO₂冷却装置を取り付けたBraun崩壊機中で冷却しながら６分間撹拌する。
壊れた細胞の懸濁液をガラスフィルターGlを通してデカンターに移し、残存するガラスビーズを0.1Mの酢酸ナトリウムpH4.7で洗浄する。ろ液と洗浄液とをいっしょにし、1MのNaHCO₃でpH4.7に調節する。粗懸濁液を等容積の80:20（v/v）フェノール／水で、68℃で１時間抽出する。冷却後、水相を3000rpm（1800g）で30分間遠心分離により分離する。上方の水相を収集し、等容量の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液pH4.7を残存フェノール相に加え、前記のように、抽出し、遠心分離し、収集する。水相が曇っているなら、再びフェノールで室温で（水の容積の1/8（v/v））30分間抽出し、前記のように遠心分離する。
いっしょにした水相は分子量カットオフ（MWCO）10〜22KDのMedicell^▲Ｒ▼管中で0.05M酢酸ナトリウムpH4.7に対して広範囲にわたって透析する（少なくとも24時間に４回の5l変換）。
透明な溶液をpM10膜（MWCO 10kDa）を備えたAmicon^▲Ｒ▼限外ろ過装置で濃縮し、不溶性物質（たとえば多糖類）を遠心分離により分離する。
粗抽出液から、疎水相互作用クロマトグラフィー（HIC）により、タンパク質、核酸及び多糖類を除去する。その目的のために0.1Mの酢酸ナトリウムpH4.7中の15％プロパノール中の粗LTA調製物を、前もって同じ緩衝液−プロパノール溶液で平衡化したオクチル−セファローズ（Pharmacia LKBスウェーデン）上に積載した。核酸、タンパク質及び多糖類の分離後、LTA−Ｔを0.1M酢酸ナトリウムpH4.7中の15〜55％のプロパノールの直線グラジエントで溶出する。各溶出物をシュニットガー（Schnitger,同書）にしたがって、有機リンの比色測定により監視する。LTAはプロパノール濃度約33％で溶出される。LTAを含有する分画を収集し、0.5M酢酸ナトリウムpH4.7に対して透析し、PM10膜（MWCO 10kDa）を備えたAmicon^▲Ｒ▼限外ろ過装置中に限外ろ過により約５マイクロモルのリン含有量/mlに濃縮する。濃縮されたLTA−Ｔの溶液を−20℃で貯蔵する。
このLTA−Ｔの透明な溶液は、汚染物質であるタンパク質（酸加水分解後アミノ酸のHPLCにより示される）、核酸（正確なGro/P比）及び炭水化物（酸加水分解後汚染物質がない）がない。その溶液を乾燥まで蒸発させて粉末を得ることができるが、この粉末はミセラの生成のため再び水に溶解させることが難しい。この粉末を水及び有機溶媒、たとえばエタノールの混合物、または溶解化剤、たとえばポリエチレングリコールに溶解することができる。
LTA−Ｔは例３に記載のように、フッ化水素を用いる加水分解後、そのユニークな脂質アンカーにより特徴づけることができる。
例3:構造的特徴づけ
精製されたLTAをHF加水分解に付し（48％HF、36時間、２℃）、親水性部分（主鎖の生成物）及び疎水性部分（脂質アンカー）をクロロホルム：メタノール：水（1:0.9:0.9）中でFolch分割〔Folch J.,Lees M.,Sloane−Stanley G.H.S.,動物組織からの全脂質の単離及び精製のための簡単な方法、「J.Biol.Chem.」第497〜509頁（1957年）〕により分離する。
２つの部分を別々に分析する。脂質アンカーの中心部を脱アシル化後、GLC−MS分析により、部分的にメチル化された酢酸アルジトールとして分析する。1,2−ジメチル−３−アセチルグリセロール及び2,3,5,6−テトラ−Ｏ−メチル−1,4−ジ−Ｏ−アセチルガラクチトールの典型的な分割が認められる。親水性生成物はHCl加水分解の前及び後またはアルカリ性脱アラニル化の後、GLC（気液クロマトグラフィー）により分析する。それにより糖は検出されない。
モル組成について、LTAを2M HClで2.5時間、100℃で加水分解し、その後ホスホノモノエステルを除去するためにホスホノモノエステラーゼで処理する。リン、グリセロール、ガラクトース及びアラニンが1:1.05:0.11:0.27で得られ、式Ｉで示された提案された構造を示す〔Fischer W.,細菌におけるリポテイコ酸の生理学、「Adv.Microb.Physiol.」29（233），第233〜302頁（1988）に記載された方法にしたがって〕。
LTA−Ｔ（dLTA−Ｔ）の脱アシル化化合物のNMR分析は明確な構造的特徴づけを可能にする。NMRスペクトルを図１に示す。ピークの同定は次の表２に列挙する。

要約すると、他のLTAの特徴に対するこのLTAの特徴は下記のとおりである。
−脂質アンカーとしてのベータ−ガルフ−（１−３）ジアシルグリセロール
−非−グリコシル化、直鎖状、非分枝GroP−鎖
−平均鎖長 10GroP単位
−脂質型
例4:脱アシル−LTA−Ｔ（dLTA−Ｔ）の調製
LTA−Ｔを穏和なアルカリ加水分解に付す（0.1M NaOH、１時間、37℃）。溶液をHClでpH3に調整し、石油エーテル：クロロホルム（4:1）を用いて、脂肪酸を４回抽出する。水溶液をNaOHで中和し、2kDのカットオフを備えた管中で水に対して広範囲にわたって透析する。濃縮水中の生成物は、アラニンエステルのない、そして脂肪酸のないLTA−Ｔで、dLTA−Ｔと呼ばれる。
例5:ベータ−ガラクトフラノシル（１−３）グリセロール−ジ−R₂−エステルの調製
式IIの脂肪アンカーであるベータ−ガラクトフラノシル（１−３）グリセロール−ジ−R₂エステルを、例３に概説するようにHF加水分解により単離することができる。
ガラクトフラノシル−ベータ−１−３−グリセロールは膜脂質の一部としても見い出されるので、それを全脂質調製物から単離することができる。
脂質をBligh−Dyerの方法〔Bligh E.G.,Dyer W.J.,全脂質抽出及び精製の迅速法「Can J.Biochem Physion」37:第9111〜9117頁（1959年）〕により単離し、粗脂質抽出物を最初にアニオン交換カラム（DEAEセルロース）で分画し、さらにシリカゲルで精製する。溶出をクロロホルム：アセトンの異なった混合物で行う。最終の精製をシリカゲルプレート上での予備TLCにより行う〔Kates M.「Techniques in lipidology.In:Laboratory techniques in biochemistry and milecular biology」Work T.S.,Work E.（編）,North−Holland publishing company,Amsterdam（1986）〕。
例6:医薬製剤
0.05Mの酢酸ナトリウムpH4.7中の精製されたLTA−Ｔを生理食塩水（0.9％）に対して、広範囲にわたって透析し、生理食塩水で容積を１マイクロモルのLTA−Ｔ（リン含有量に基づいて）に調整する。フィルター膜（Millipore 0.22μｍ）を通す前記溶液のろ過後、ろ液の1mlアリコートを殺菌条件下で、殺菌されたガラスびんに入れる。これらのガラスびんは１マイクロモル/mlのLTA−Ｔリンを含有し、治療目的のため皮下的に用いる。
例7:臨床治療の結果
多様な種類の腫瘍／癌にかかっている８人の患者を濃度１マイクロモル/mlのLTA−Ｔの生理食塩水溶液を皮下に１回または繰返し投与で治療した。ほとんどの患者は皮下にヒアルロニダーゼも得、１人はインターフェロン−アルファも得た。結果を表３にまとめる。

微生物の寄託
本発明で用いられた連鎖球菌属種PTという微生物PTはブダペスト条約の下で、1993年11月25日に番号DSM 8747として、DSM DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH（Mascheroder Weg 1b,D−38124 Braunschweig）に寄託された。

Claims (14)

1. 連鎖球菌属の種PT株DSM 8747から単離し得る、ベータ−ガラクトフラノシル（１−３）グリセロール−ジエステル部分を含有する精製リポテイコ酸（LTA −Ｔ）。
2. 式Ｉ
   

   

   （式中、R₁は水素またはリンに対するＤ−アラニルのモル比が0.27〜0.35のＤ−アラニルで、R₂は炭素原子12,14,16または18の飽和または不飽和脂肪酸の残基であって、ｎの平均値は９である）の請求項１に記載のリポテイコ酸LTA−Ｔ及びそれらの塩。
3. 請求項１に記載のリポテイコ酸であって、生理的に許容し得る塩、たとえば陽荷電したイオンからの、たとえばアルカリ金属もしくはアルカリ土金属イオン、または陽荷電した第１級、第２級、第３級もしくは第４級アンモニウムイオン（酸付加塩）、たとえばナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛、アンモニウム、モノ−、ジ−、トリ−もしくはテトラ−低級アルキル、たとえばメチル−もしくはエチルまたはメチル−エチル−、プロピルもしくはブチル−アンモニウムイオン、特にナトリウムイオンからの塩の形で存在するリポテイコ酸。
4. 請求項１に記載のリポテイコ酸LTA−Ｔの 製造方法であって、以下のステップ：
   蒸留水又は緩衝液中で連鎖球菌属の種（DSM 8747）の細 胞を粉砕し、
   上記懸濁液をフェノールにより抽出し、
   上記水相を透析し、濃縮し、そして遠心分離し、
   上記粗抽出物から、好ましくない物質をクロマトグラフ ィーにより除去し、
   上記LTA−Ｔ含有画分を透析し、そして
   限外ろ過又は真空乾燥によって濃縮する、
   を含む、連鎖球菌属の種（DSM 8747）からリポテイコ酸 LTA−Ｔを単離し、そして精製することを特徴とする前 記製造方法。
5. 請求項１に記載のリポテイコ酸またはその生理的に許容し得る塩を投薬単位形態で含む医薬製剤。
6. アルファ−インターフェロンと組み合せた、請求項５に記載の医薬製剤。
7. ヒアルロニダーゼと組み合せた、請求項５に記載の医薬製剤。
8. インターフェロン−アルファ及びヒアルロニダーゼと組み合せた、請求項５に記載の医薬製剤。
9. 前記LTA−Ｔと医薬担体を混合することに よる、請求項１に記載のリポテイコ酸を含む医薬製剤の製造方法。
10. 抗腫瘍有効量の請求項１に記載のリポテイコ酸LTA−Ｔまたはその生理的に許容し得る塩を含 む、腫瘍またはその悪性の細胞を病んでいる患者に投与される癌治療用医薬製剤。
11. 請求項１に記載のリポテイコ酸LTA−Ｔ を産生することができる連鎖球菌属の種PT株DSM 8747。
12. 連鎖球菌属の種PT DSM 8747を増殖させる方法であって、前記細菌株を増殖条件下に増殖させることを特徴とする方法。
13. R₁及びR₂が両方共水素であって、ｎの平均値は９である、請求項２に記載の式Ｉの脱アシル化LT A−Ｔまたはその塩。
14. 式II
    

    

    （式中、R₂は炭素原子12,14,16または18の飽和または不飽和脂肪酸の残基である）のベータ−ガラクトフラノシル（１−３）グリセロール−ジ−R₂−エステル、その個々の化合物及びそれらの塩。

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