JPS6320807B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はビフイドバクテリウム属に属する細菌
（以下ビフイズス菌と記載する）の細胞壁から分
離した多糖体を有効成分として含有する感染防御
剤に関する。 〔技術の背景及び先行技術〕 ビフイズス菌は人間の腸内に常任する偏性嫌気
性、グラム陽性の桿菌であり、特に乳幼児では、
腸内細菌叢の90％以上を占める有用細菌として知
られている。腸内細菌と宿主たる人間とのあいだ
の相互作用について、有害と有益の二面性の観点
から研究が急速に進展しているが、腸内細菌叢の
中心的な細菌であるビフイズス菌は、病原菌等の
有害細菌の腸内定着を阻害する作用、腸内での異
常増殖を抑止する作用、更には有害細菌による中
毒、腸管感染等を防止する作用を有する細菌とし
て知られている。特に、免疫力の未発達な乳児の
場合は、腸内細菌叢が感染症に対する抵抗力を賦
与するものとして重要な意義を有しており、ビフ
イズス菌による健全な腸内細菌叢の形成を促すこ
とが、乳児の腸管感染の危険性を低減させる有効
な方法のひとつであるとも考えられている。乳幼
児に頻発する腸管感染症には、大別すると病原菌
の産生する毒素によつて起こる毒素型と病原菌が
直接腸組識又は細胞へ接触、侵入する感染型とが
ある。ビフイズス菌は、これら病原菌の増殖又は
毒素産生を抑制する酢酸及び乳酸を腸内で産生す
ること及び直接病原菌の増殖を阻止する作用のあ
ることで知られている。中谷らはビフイズス菌が
人間の培養細胞へ侵入する性質のある赤痢菌の細
胞内感染防止作用を有することを報告している
（小児科診療、47巻、５号、723頁、1984年）。 一方、ビフイズス菌の細胞壁又はその構成成分
については、従来抗腫瘍剤又は制がん剤としての
利用が知られているが（特公昭56−42271号公報、
特開昭56−103194号公報、特開昭57−212122号公
報及び特開昭59−118712号公報）、これらの物質
の感染防御作用については知られていない。そし
てこれらの発明における有効成分には、いずれも
ペプチドあるいは蛋白質が含まれているという特
長がある。 本発明者らは、乳幼児並びに老人に起こる腸管
感染及び眼けん又は上気道粘膜等の感染を防止す
る薬剤の開発を目的としてビフイズス菌の生菌が
示すこの赤痢菌の細胞内侵入阻止活性に注目し、
この阻止活性を発揮するビフイズス菌の有効成分
について検索を行なつた。その結果、本発明者ら
はビフイズス菌の細胞壁の構成成分である多糖体
に赤痢菌の細胞内侵入阻止作用があることを見出
し、この知見に基づいて本発明を完成するに到つ
た。 〔発明の目的及び発明の要約〕 本発明の目的は副作用のない感染防御剤を提供
することにある。 本発明の他の目的は細胞内に侵入する病原菌に
のみ特異的に作用する感染防御剤を提供すること
にある。 本発明はビフイズス菌の細胞壁から分離した多
糖体を有効成分として含有することを特徴とする
感染防御剤である。 〔発明の具体的な説明〕 本発明の感染防御剤の製造に使用するビフイド
バクテリウム属に属する細菌は、アール・イー
ブキヤナンおよびエヌ・イー ギボンス編「バー
ジエイス マニユアル オブ デターミナテイブ
バクテリオロジー」（R.E.Buchanan＆N.E.
Gibbons；Bergey's manual of determinative
bacteriology）第８版 第669頁 ザ ウイリア
ムスおよびウイルキンス社（The Williams＆
Wilkins Co.）1974年に記載されている公知の細
菌であり、ザ アメリカン タイプ カルチヤー
コレクシヨン；カタログ オブ ストレインズ
（The American Type Culture Collection；
Catalogue of Strains）第11版 1978年
（ATCCのカタログ）に記載されていて、容易に
入手することができる。 本発明の感染防御剤は次のようにして製造され
る。ビフイズス菌を常法により嫌気的に培養し、
60〜65℃で30〜60分間加熱殺菌し、遠心分離して
菌体を集める。蒸留水又は生理食塩水で菌体を洗
浄し、常法により菌体を破砕し（例えば20KHz〜
40KHzにおいて20〜60分間超音波破砕機で処理す
る）20000〜30000×ｇで30〜60分間遠心分離して
破砕菌体を集める。次いで破砕菌体を常法に従い
蛋白分解酵素及び核酸分解酵素で処理し、該破砕
菌体に含まれる蛋白質及び核酸を分解して除去
し、細胞壁画分を得る。該細胞壁画分を蒸留水に
対して透析し、凍結乾燥する。該凍結乾燥画分
を、100〜250倍量の弱酸水溶液（例えば0.1N
HC1又は５％トリクロロ酢酸）に懸濁し、30〜
60℃で１〜24時間保持して加水分解処理し、細胞
壁より多糖体を遊離する。次いで2N NaOHで中
和し、不溶性物質を濾別し、減圧濃縮し、アルコ
ールを最終濃度90％になるよう加え、該多糖体を
沈澱させ、遠心分離して多糖体沈澱物を回収し、
蒸留水に溶解し、必要ならばアルコール沈澱を数
度繰り返して、純粋な多糖体を得る。該多糖体を
蒸留水に対して透析し、凍結乾燥し、白色、無味
無臭の粉末状多糖体を得る。 以上のようにして製造された多糖体は次のよう
な理化学的性状を有している。この理化学的性質
は、実施例１によつて製造した多糖体による。 (1) 分子量 TSK G3000SW（東洋曹達製）を用いたゲル
濾過クロマトグラフイーにより分画し、分子量
分布はフエノール−硫酸法による多糖体の定量
分析によつた。結果は第１図に示すとおりであ
り、分子量18000に大きなピークが認められ、
分子量15000から200000の範囲に広く分布して
いた。 (2) 溶解性 多糖体は水に可溶、有機溶媒に不溶であつ
た。 (3) 赤外線吸収スペクトル 粉末状の多糖体の赤外線吸収スペクトルを
KBr錠剤法により測定した。結果は第２図に
示すとおりであり、3600〜3200cm^-1及び1160〜
1000cm^-1に強い吸収、2950〜2850cm^-1及び1640
cm^-1に中程度の吸収が認められた。 (4) 呈色反応 α−ナフトール硫酸反応、インドール硫酸反
応、アンスロン硫酸反応及びフエノール硫酸反
応により糖の呈色反応を示した。ビユーレツト
法及びローリーフオリン法による蛋白質、ペプ
チドの呈色反応は示さない。 (5) 構成糖 多糖体を1N硫酸に溶解し、100℃で６時間加
水分解し、アンバーライトIRA−400を充てん
したカラムを通過させてTMS化し、ガスクロ
マトグラフイーにより分析した。その結果、多
糖体を構成する糖は、主としてグルコース、ガ
ラクトースであり、そのモル比率はグルコース
１：ガラクトース約2.8であつた。 (6) 元素分析 常法による元素分析の結果、炭素44.6％、水
素6.2％及び窒素0.2％以下であつた。 (7) 色及び性状 多糖体は白色であり、無味無臭であつた。 以上の理化学的性質から本発明の感染防御剤の
主要成分である多糖体は、ほぼグルコース及びガ
ラクトースのみからなり、蛋白質及びペプチドを
含有していないことは明らかである。この多糖体
はそのまま、又は適当な粉末状倍散剤で倍散さ
れ、経口的に投与され腸管の感染防御剤として、
あるいは水又は生理食塩水に溶解され、直接眼け
んに投与され、眼けんの感染防御剤として用いら
れる。 次に試験例を示して本発明を更に詳述する。 〔試験１〕細胞における感染防御試験 感染実験方法は岡村らの方法〔インフエクシヨ
ン アンド イミユニテイ（Infection and
Immunity）39巻、第505〜513頁、1983年〕に従
つた。 １チエンバー当り２、1.5、１、0.5及び０mgの
割合で実施例１及び２と同一の方法で製造した多
糖体を加え、さらにシゲラ・フレキシネリ
（Shigella flexneri）2a−5503を１チエンバー当
り１×10⁷個接種し、水蒸気飽和、7.5％CO₂、37
℃で２時間培養し、シゲラ・フレキシネリをイン
テステイン（Intestine）407細胞又はヒーラ
（Hela）Ｓ−３細胞に感染させた。 次いで培養液をカナマイシン含有培地と交換
し、さらに２時間培養し、培養液を除去し、メタ
ノール固定し、ギムザ染色し、各添加量について
３チエンバーの約1000個の細胞あたりの赤痢菌侵
入細胞を計数し、その平均から細胞侵入百分率を
求めた。なお対照としてグリコーゲン及びデキス
トランについても同様の試験を行なつた。その結
果は第１表及び第２表に示すとおりであつた。

【表】

【表】 第１表及び第２表から明らかなようにいずれの
細胞においてもグリコーゲン及びデキストランは
顕著な感染防御作用を示さないのに対して、多糖
体を1.5mg添加した群では感染率が無添加のそれ
の1/2以下に低下し、顕著な感染防御作用を示し
た。従つて多糖体は感染防御効果を有することが
判明した。 〔試験２〕生体における感染防御試験 自然感受性動物（ヒト、サル）に病原性のある
強毒株赤痢菌はモルモツトの眼にも特異的に病原
性を示すこと及びその病像が自然感受性宿主の腸
の病像と共通点が多いことが既に知られている。
このことを利用して該多糖体の示す感染防御効果
をモルモツトの眼けん感染について更に試験し
た。 実施例１と同一の方法で製造した多糖体及び対
照としてグリコーゲンを各々生理食塩水に溶解
し、モルモツトの片眼あたり0.5、2.5、5.0mgずつ
各々滴下し、同時に強毒株赤痢菌シゲラ・フレキ
シネリ（Shigella flexneri）2aを生理食塩水に懸
濁し、モルモツトの片眼あたり10⁹個の割合で滴
下し、48時間経過後のモルモツト眼けんにおける
結・角膜炎発症を観察した。なおモルモツトは１
群５匹とした。 その結果は第３表に示すとおりであつた。第３
表から明らかなように対照としたグリコーゲン投
与群では5.0mgの投与量でも５匹中４匹が発症し
たのに対し、多糖体投与群では0.5mgの投与量で
５匹中３匹に発症を認めたが、2.5mgの投与量で
はほぼ完全に感染を防御し得ることが認められ
た。

【表】 この結果から、通常の生体内における感染より
も著しく強度の感染においても、多糖体を少なく
とも2.5mg投与することにより、自然感受性動物
の感染を防止し得ることが判明した。 更に前記のように自然感受性宿主の腸管病像と
共通点が多いことから、本発明の感染防御剤は人
の腸管感染にも有効であることが推定される。 〔試験３〕毒性試験 試験動物としてＡ／Ｊ雌及び雄マウス（７週
令、体重22±２ｇ）を用いた。生理食塩水に溶解
した多糖体（実施例１と同一の方法で製造）を体
重１Kgあたり１ｇ、５ｇ、10ｇの各投与量で10日
間連続して経口投与した。対照群には生理食塩水
を10日間連日投与した。１群10匹の各群について
投与後30日間観察し、死亡したマウスの数を調べ
た。 試験結果は第４表に示すとおりであつた。

【表】 第４表から明らかなように、多糖体の各投与量
で死亡したマウスは観察されなかつた。この結果
は、本発明の多糖体が極めて毒性の少ないことを
示すものである。 〔試験４〕眼けん刺激性試験 ドライゼ（Draize）法による眼けん刺激性試
験を実施した。実施例１及び２と同一の方法で製
造した多糖体を100mg／mlの濃度で生理食塩水に
溶解したものを、0.1mlずつ１群10匹のウサギの
片眼結膜のうに滴下した。そして滴下５分後に眼
けんを洗浄した群（５分間暴露群）及び24時間後
に眼けんを洗浄した群（24時間暴露群）について
１、４、24、48、72時間後及び４、７日目に眼け
んの病理的観察を行なつた。 その結果は第５表に示すとおりであつた。５分
間暴露群、24時間暴露群ともに、１〜７日間の観
察において、角膜と虹彩の潰瘍、混濁、結膜の充
血、浮腫及び潰瘍、壊死を認めなかつた。

〔発明の効果〕

本発明によつて奏せられる効果は次のとおりで
ある。 (1) 毒性の極めて少ない感染防御剤が得られる。 (2) 副作用の極めて少ない感染防御剤が得られ
る。 (3) 感染防御作用の極めてすぐれた感染防御剤が
得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図はゲル濾過クロマトグラフイーによる多
糖体の溶出曲線を示す図表、そして第２図は多糖
体の赤外線吸収スペクトルを示す図表である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ビフイドバクテリウム属に属する細菌の細胞
   壁から分離した多糖体を有効成分として含有する
   ことを特徴とする感染防御剤。 ２ ビフイドバクテリウム属に属する細菌の細胞
   壁から分離した多糖体が次の理化学的性状を有す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
   の感染防御剤。 (a) 分子量： ゲル濾過法により15000〜200000、 (b) 溶解性： 水に可溶、有機溶媒に不溶、 (c) 赤外線吸収スペクトル： 第２図に示す吸収スペクトルを示し、3600〜
   3200cm^-1及び1160〜1000cm^-1に強い吸収及び
   2950〜2850cm^-1及び1640cm^-1に中程度の吸収を
   示す、 (d) 呈色反応： α−ナフトール硫酸反応、インドール硫酸反
   応、アンスロン硫酸反応及びフエノール硫酸反
   応により糖の呈色反応を示し、ビユーレツト法
   及びローリーフオリン法による蛋白質、ペプチ
   ドの呈色反応を示さない、 (e) 構成糖： 主としてグルコース及びガラクトースからな
   り、そのモル比はグルコース１：ガラクトース
   約2.8である、 (f) 元素分析 炭素(C)： 44.6％ 水素(H)： 6.2％ 窒素（Ｎ）： 0.2％以下 (g) 色及び性状 白色、無味無臭の粉末、 ３ ビフイドバクテリウム属に属する細菌がビフ
   イドバクテリウム・インフアンテイス、ビフイド
   バクテリウム・ロンガム、及びこれらの混合から
   なる群より選択されたものであることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項又は第２項のいずれかに
   記載の感染防御剤。