DE2820463A1 - Neues polysaccharid, verfahren zu dessen herstellung und hypocholesterin- zusammensetzungen, welche diese enthalten - Google Patents

Description

Neues Polysaccharide Verfahren zu dessen Herstellung und Hypocholesterin-Zusammensetzungen, welche diese enthalten

Die Erfindung betrifft ein neues Polysaccharid, ein Verfahren zu deren Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzungen, welche diese enthalten. Sie betrifft insbesondere ein neues Polysaccharid mit der Bezeichnung "M-30-C", ein Verfahren zur Herstellung des genannten Polysaccharids, in dem man einen neuen Stamm mit der Bezeichnung Pseudomonas polysaccharogenes M-30 kultiviert und eine Zusammensetzung zur Verminderung von Cholesterin, welcher als aktiven Bestandteil das genannte Polysaccharid enthält.

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Die fermentative Bildung von Polysacchariden ist schon bei verschiedenen Verfahren vorgeschlagen worden, bei denen als Medium solche verwendet wurden, die als Hauptkohlenstoff quelle Zucker enthielten. Es wurde auch schon versucht, als Kohlenstoffquelle petrochemische Produkte wie Normalparaffin, Äthanol, Propanol, Äthylenglykol und organische Säure anstelle von Gluciden zu verwenden (Japan. Patentveröffentlichung 18493/1973). Solche Kohlenstoffquellen sind jedoch problematisch hinsichtlich der Wasserlöslichkeit, der Menge und der Kosten für das Fermentationsmaterial und dergl., und man erhält auch keine befriedigende Ausbeute an einem Polysaccharid.

Die vorliegende Erfindung betrifft nun insbesondere Methanol als eine billige Kohlenstoffquelle und es wurden viele Methanol-lösliche Bakterien aus Bodenproben im Gebiet von Shimotsuma der Ibaraki-Prefektur, Japan, am 1. Mai 1975 gesammelt und untersucht. Als Ergebnis konnte erfolgreich ein neuer Stamm isoliert werden vom Genus Pseudomonas, der beim Kultivieren in einem Medium,das als alleinige oder Hauptkohlenstoffquelle Methanol enthält ein Polysaccharid bildet, das beim Auflösen in Wasser oder heißem Wasser viskos ist, wobei diese Bildung in hoher Ausbeute erfolgt. Weitere Untersuchungen haben ergeben, daß das von diesem neuen Stamm gebildete Polysaccharid ein neues Polysaccharid ist, das als ein Cholesterin verminderndes Mittel geeignet ist.

Morphologische Eigenschaften des neuen Stammes Pseudomonas polysaccharogenes M-30 (nachfolgend häufig als M-30 bezeichnet) , die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung eine Rolle spielen, werden nachfolgend angegeben. Dieser neue Stamm ist beim Technical Research Institute of Microbial Industry, Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, hinterlegt worden und ist dort der Sammlung von Mikroorganismen einverleibt worden und hat die Hinterlegungsnummer 4054 erhalten.

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I. Morphologische Eigenschaften Beobachtet bei einer stationären Kulturbrühe in einem Bouillon-Methanol-Medium (0,5 v/v %) bei 3O°C während 48 Stunden.

(1) Form und Größe der Zellen: Bazillenförmig, 0,3 - 0,5 χ 1,0 - 2,5 pm.

(2) Kolonie: Gewöhnlich einzeln, jedoch häufig zweifach.

(3) Motolität: Beweglich mit einem Flagellum

(4) Sporen: Keine

(5) Gram-Färbung: Negativ

(6) Säureresistenz: Negativ

II. Wachstumseigenschaften in verschiedenen Medien (1) Bouillonkultur: Wächst

(i) Flüssige, stationäre Bouillonkultur (bei 30⁰C) während fünf Tagen) starkes Wachstum, keine Bildung von Filmen, es wurde ein Niederschlag beobachtet, und auch eine Trübung.

(ii) Bouillon-Agar-Kultur (30⁰C, 10 Tage) starkes Wachstum, Form: fadenförmig, Oberfläche: glatt, glänzend; Umfang: wellenförmig;
Transparenze: Opaque; Farbe: orange, (iii) Bouillon-Agar-Plattenkultur (30°C, 21 Tage) Form: ziemlich unregelmäßig; Peripherie: wellenförmig; Oberfläche: flach und glatt

(iv) Bouillon-Agar-Stabkultur (30°C, während 7 Tagen) Wachstum: über die Oberfläche und entlang des oberen Stabes;

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(2) Bouillon-Methanol (0,5 ν/ν %)-Agar-Plattenkultur (30⁰C während 30 Tagen)
Form: rund;

Peripherie: wellenförmig; Form der Oberfläche: flach und glatt; Färbung: tief-orange.

(3) Synthetisches flüssiges Methanolmedium (0,5 g Kaliumnitrat, 1 g Kalium-dihydrogenphosphat, 0,5 g Magnesiumsulfat·7 Hydrat, 10 mg Eisen(II)-sulfat·7 Hydrat, 0,1 g Hefeextrakt und Methanol 1 v/v %, gelöst in 1 1 reinem Wasser, eingestellt auf einen pH 7,0) ( bei 30⁰C während 5 Tagen): Wachtum: s tark;
Niederschlag: beobachtet;
Trübung: beobachtet;
keine Filmbildung.

III. Physiologische Eigenschaften

(1) Nitratreduktion : positiv

(2) Denitrifizierung: negativ

(3) MR (Methylrot) Test: negativ

(4) VP (Voges-Proskauer) Test: negativ

(5) Indolbildung: negativ

(6) Schwefelwasserstoffbildung: negativ

(7) Stärkehydrolyse: negativ

(8) Verwendung von anorganischen Stickstoffquellen:

es werden nur Ammoniumsalze und Nitrate als Stickstoffquellen verwendet

(9) Pigmentbildung: keine

(10) Urease: positiv

(11) Oxidase: positiv

(12) Catalase: positiv

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(13) Sauerstofferfordernis: Aerobisch

(14) Gelatineverflüssigung: negativ

(15) Lakmusmilch: rotgefärbt, peptonisiert

(16) Wachsturnstemperatur: 10 - 37°C, optimale Wachsturnstemperatur 26 - 31 C

(17) Wachsturns-pH: pH 5 - 10, optimaler pH 6 - 8

(18) Verwendung von Methylamin: nein

(19) Bildung von Säuren (Gas) aus Zuckern: Arabinose, Adonit, Insosit, Galactose, Xylose, Glucose, Saccharose, Dulcit, Sorbit, Trehalose, Maltose, Mannit, Mannose, Lactose, Rhamnose, Raffinose, Fructose, Stärke und Glyzerin: Alle negativ

(20) Verwendung von Kohlenstoffquellen:

(i) Verwendung von Zuckern:

Arabinose, Inosit, Galactose, Xylose, Saccharose, Sorbit, Trehalose, Maltose, Mannit, Mannose, Lactose, Rhamnose, Raffinose, Fructuose, Stärke, Dextrin, Inulin,oLr-Methylglucosid, Ribose, Sorbose, Fucose, Cellobiose, Melebiose und Glyzerin: Alle negativ
Glukose: positiv
(ii) Verwendung von Alkohol:
Methanol: positiv

Äthanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, η-Amylalkohol, Isoamylalkohol, 1,2-propandiol, 1,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, 2,3-Butandiol, 1,5-pentandiol, 1,6-Hexandiol, 2,5-Hexandiol, Äthylenglykol, Diäthylenglykol, 4-Methylcyclohexan: Alle negativ
(iii) Verwendung von organischen Säuren:

Ameisensäure, Essigsäure, Fumarsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Pyruvinsäure, Isozitronensäure, Ketoglutarsäure, Bernsteinsäure, Apfelsäure, Oxalessigsäure, Glycolsäure, Glyoxylsäure,

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Glyconsäure: Alle negativ

Beim Suchen nach einem geeigneten Genus mit den vorgenannten morphologischen Eigenschaften in dem Nachschlagewerk "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. Ausgabe, R.E. Buchanon & N.E. Gibbons, Williams & Wilkins Co., 1974, wurde festgestellt, daß der vorliegende Stamm zum Genus Pseudomonas gehört, weil er gramnegativ ist, bezillenförmig ist, beweglich mit einem Flagellum ist und aerob ist, und weil er oxidativ Glucose zersetzt. Obwohl ein Vergleich dieses Stammes mit speziellen Klassen des vorgenannten Genus gemacht wurde, konnte keine Beschreibung gefunden werden, die ausreicht, um diesen Stamm genau zu identifizieren.

Darüber hinaus haben Methanol-verwendbare Bakterien im allgemeinen in ihren Kolonien Farbtöne, die vorwiegend rosa oder ähnlich gefärbt sind, während der vorliegende Stamm einen orangen Farbton in seiner Kolonie aufweist und weder Methan noch Äthanol verwendet und eine merkliche Menge an einem Polysaccharid aus Methanol bildet und eine unterschiedliche Produktivität an Säuren aus verschiedenen Kohlenstoffquellen aufweist. Man nimmt daher an, daß der vorliegende Stamm unterschiedlich ist von solchen bekannten Spezien wie Pseudomonas Methanica, Pseudomonas Methylotropha, Pseudomonas Rosea, Pseudomonas Methyloxidans M-59, Pseudomonas Aerogenes, Pseudomonas Insueta, Pseudomonas PRL-W4, Pseudomonas AM-1, Pseudomonas M-27, Pseudomonas C und dergl.

Andererseits stellt man beim Vergleich mit Stämmen, die Methanol verwerten und Polysaccharide bilden, fest, daß der vorliegende Stamm unterschiedlich ist von Methylomonas Mucosa und Methanomonas Polysaccharogenes bei der Verwendung von Glucose und auch von Pseudomonas SP S46-B1 hinsichtlich der Färbung der Kolonie und der Bildung von Säuren aus verschiedenen Zuckern.

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Bei einem Vergleich von M-30 mit einer verhältnismäßig ähnlichen, bekannten Spezies, Methanomonas Polysaccharogenes 26, unterscheidet sich M-30 deutlich vom letzteren hinsichtlich der LakmusmiIchreaktion und der Schwefelwasserstoff bildung und man kann daher annehmen, daß es sich um verschiedene Spezies handelt.

Deshalb kann man den vorliegenden Stamm als eine neue Spezies ansehen, der zu dem Genus Pseudomonas gehört und der deshalb Pseudomonas Polysaccharogenes M-30 genannt wird.

Bei der Durchführung des fermentativen Verfahrens gemäß der Erfindung wird die Kultivierung unter aeroben Bedingungen in einem Methanol als alleinige oder Hauptkohlenstoff quelle enthaltenden Medium durchgeführt.

Die Menge an dem Medium zuzugebenden Methanol liegt wünschenswerterweise bei nicht mehr als 4 v/v %. Gibt man Methanol kontinuierlich einem Medium zu, so ist es wünschenswert, den Methanolgehalt in dem Medium auf nicht mehr als 1 v/v % aufrecht zu erhalten.

Als anorganische Stickstoffquellen können Ammoniumnitrat, Kaliumnitrat, Ammonniumsulfat und dgl. und Hefeextrakt, Pepton und dgl. als natürliche Stickstoffquellen verwendet werden. Andere anorganische Komponenten außer den Stickstoff quellen, die verwendet werden können, schließen beispielsweise ein Dxkaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Eisensulfat, Calciumchlorid, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Natriumchlorid und dgl.

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Vitamine werden nicht extra benötigt, aber Biotin, Thiamin , Hefeextrakt, Maismaische und dgl. können, falls erforderlich, zugegeben werden.

Die Kultivierung wird im allgemeinen und vorzugsweise unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Beispielsweise kann die Kultivierung befriedigend durchgeführt werden bei einer Kultivierungstemperatur von 10 bis 37 C, vorzugsweise 28 bis 32°C, unter Schütteln oder Rühren unter Belüftung. Der pH der Kultivierung liegt im Bereich von 5 bis 10, vorzugsweise 6 bis 8, und ganz besonders bevorzugt bei 6,5 bis 7,5, und als Kultivierungszeit reichen 24 Stunden oder mehr aus, wobei 48 bis 72 Stunden bevorzugt sind.

Nach Beendigung der Kultivierung wird die Kulturbrühe auf das 10- bis 20-fache Volumen verdünnt und Mycele und andere Feststoffe werden durch kontinuierliche Zentrifugierung entfernt, beispielsweise bei 15 000-facher Schwerkraft bei einer Behandlungsmenge von 20 l/h. oder durch diskontinuierliche Zentrifugierung, beispielsweise mit 10 000-facher Schwerkraft während 60 Minuten. Dann gibt man ein organisches Lösungsmittel wie Methanol, Äthanol oder Azeton in etwa der zweifachen Volumenmenge oder ein quaternäres Ammoniumsalz zu der zentrifugierten Brühe zur fraktionierten Ausfällung hinzu, wobei sich ein weißes fadenförmiges rohes Polysaccharid bildet.

Das so gebildete rohe Polysaccharid wird in etwa dem 5- bis 15-fachen Volumen an Wasser gelöst und die erhaltene Lösung wird einer Deproteinisierung unterworfen, beispielsweise durch Erhitzen auf 70 bis 100⁰C, Behandeln mit einer Mischung aus Chloroform und Amylalkohol (beispielsweise 3:2) oder durch Behandeln mit Trichloressigsäure, einer

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kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Zentrifugierung in gleicher Weise wie vorher bei den rohen Polysacchariden zur Entfernung der Proteine, worauf man dann annähernd das 2-fache Volumen an Methanol, Äthanol oder Azeton zu der erhaltenen überstehenden Lösung gibt. Der so abgetrennte Niederschlag wird gründlich mit Äther oder Äthanol gewaschen, nochmals in der 5- bis 15-fachen Volumenmenge Wasser gelöst und durch Dialyse gegen fließendes Wasser, Behandlung mit einem Ionenaustauscher oder Gel-Filtration demineralisiert, worauf man anschließend gefriertrocknet und ein gereinigtes Polysaccharid als weißes schwammförmiges Produkt erhält.

Die physiko-chemisehen Eigenschaften des so erhaltenen Polysaccharides werden nachfolgend angegeben.

(a) Optische Drehung: M^⁰ = +48,4° + 3,3°(0,1 w/v % wäßrige Lösung)

(b) Zahlendurchschnittsmolekulargewicht: 2,0 χ 10 2,0 χ 10 . Das Molekulargewicht variiert je nach der Fermentationszeit.

(c) Elementaranalyse: C, 37,7% + 3,0 %; H, 5,8 % + 0,5 %.

(d) Farbreaktion: Positiv bei der Anthronreaktion und Phenolschwefelsäurereaktion.

(e) Bestimmung der Basizität, Acidität oder Neutralität: saures Polysaccharid

(f) Infrarot-Absorptionsspektrum: Charakteristische Absorptionsbanden (cm~¹) bei 3450 (S), 2940 (M), 1620 (M), 1400 (M), 1040 (S) und 890 (W).

(g) Löslichkeit: Löslich in Wasser, 1 n-Chlorwasserstoff-

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säure, 1η-Schwefelsäure und 1n-wäßrigem Ammoniak. Unlöslich in Äthanol, Äther, Azeton, Chloroform und Dimethylsulfoxyd.

(h) Viskosität: 1000 - 3000 cps, gemessen in 1,0 w/v %-iger wäßriger Lösung bei 20°C mittels eines BL-Typ-Viskometer (hergestellt von Tokyo Keiki K.K., Japan)

(i) Zuckereinheiten:Flecken von Glucose und Mannose bei der Papierchromatographie nach der Hydrolyse und ein Zuckereinheitenverhältnis von Glucose zu Mannose von 3 : 2 mittels GasChromatographie.

(j) Farbe und Form: weiß und amorph als solches und farblos als wäßrige Lösung.

Aus den vorerwähnten Eigenschaften kann man schließen, daß das aus der Kulturbrühe des neuen Stammes Pseudomonas PoIysaccharoges M-30 isolierte Polysaccharid eine neue Substanz ist und deshalb wurde diese als Polysaccharjä M-30-C bezeichnet.

Das Polysaccharid M-30-C ist in wäßriger Lösung hochviskos und zeigt keine verminderte Viskosität in Gegenwart eines Salzes, beispielsweise von KCl, MgCl-, AlCl₃, (NH₄J₂SO₄ oder NaCl. Die Viskosität der wäßrigen Lösung ändert sich nicht erheblich bei einer Veränderung des pH-Wertes. Deshalb ist das Polysaccharid M-30-C als Nahrungszusatz wertvoll, als Träger für Arzneimittel und Kosmetika oder als Industriechemikalie, beispielsweise als Schmieröl bei Bohrungen.

Bei der medizinischen Anwendung des Polysaccharids M-30-C wurde festgestellt, daß das Polysaccharid ein wirkungsvolles Hypocholesterinmittel aufgrund seiner Cholesterin-vermin-

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dernden Aktivität ist.

Die Hypocholesterinwirkung des Polysaccharide M-3O-C wird nachfolgend anhand zahlreicher Versuche erläutert:

Die LD des Polysaccharids M-3O-C beträgt bei oraler Verabreichung an männlichen oder weiblichen Mäusen vom ICR-JCL-Stamm und bei männlichen und weiblichen Ratten vom Wistar-Stamm nicht weniger als 5 g/kg und die ED,-q hinsichtlich der Inhibierung der Erhöhung des Blutcholesterinniveaus beträgt nicht mehr als 5 mg/kg bei mittels Triton induzierter Hyperlipämie. Die Sicherheitszone (LDr^/EDr^.) des Polysaccharids liegt deshalb bei 1000 und darüber. Hinsichtlich der subakuten Toxizität bei 1-monatiger Verabreichung wurden keine Abnormlitäten hinsichtlich des Körpergewichtes, des Blutes und der Organe bei kontinuierlicher Verabreichung von 500 mg/kg/Tag beobachtet und die maximale Sicherheitsdosis liegt bei 500 mg/kg hinsichtlich der subakuten Toxizität. Deshalb zeigt das Polysaccharid eine hohe Sicherheit bei seiner Verwendung als Arzneimittel und kann als Medikament zur Verbesserung in Fettmetabolismus und zur Verhinderung von Atherogenesis verwendet werden.

Das Polysaccharid kann oral, intravenös, sublingual, intramuskulär oder intrarektal verabreicht werden, aber besonders bevorzugt wird die orale Verabreichung, gewöhnlich als Einzeldosis von 10 bis 1000 mg bei 1- bis 6-maliger täglicher Verabreichung beim Erwachsenen. In einigen Fällen kann das Polysaccharid nach geeigneter Spaltung oder Sulfatisierung verabreicht werden.

Das Polysaccharid kann als Arzneimittel zur Verbesserung des Fettmetabolismus zur Vermeidung von Atherosclerosis, Herzinfarkten, Angina pectoris, Hirnerweichung, Gehirnblutungen, Hochdruck oder Hypercholesterämie in Verbindung

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mit Diabetes angewendet werden.

Bei der oralen Verabreichung kann es verwendet werden in Zubereitungen wie Kapseln, Tabletten oder Granulaten und in einigen Fällen als Pulver, Sirup oder in Form von wäßrigen Lösungen.

Das Polysaccharid M-3O-C hat darüber hinaus den weiteren Vorteil, daß es im Vergleich zu bekannten Cholesterin senkenden Mitteln in niedrigeren Dosen wirksam ist, daß es einen großen Sicherheitsbereich aufweist und daß keine Hepatotoxizität, welche eine typische Nebenwirkung ist, auftritt.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher beschrieben.

Beispiel 1

1 g Kaliumdihydrogenphosphat, 1 g Kaliumnitrat, 0,5 g Magnesiumsulfat · 7 Hydrat, 0,5 g Kaliumchlorid, 0,1 g Hefeextrakt, 10 mg Eisen(II)sulfat·7Hydrat, 2 mg Calciumchloriddihydrat, 2 mg Natriumchlorid und 32 g Methanol wurden in 1 1 reinem Wasser zur Herstellung des Mediums gelöst. Es wurden 7 1 dieses Mediums hergestellt, der pH wurde auf 7,0 eingestellt und das Ganze wurde in einen Fermentierkolben mit einem Volumen von 10 1 gegeben, der dann 10 Min. bei 120°C sterilisiert wurde.

Pseudomonas Polysaccharogenes M-30, das in einem Medium der gleichen Zusammensetzung, wie vorher angegeben, in einem Sakaguchi-Kolben gezüchtet worden war, wurde in dem Fermentationsapparat inokuliert und die Kultivierung wurde

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bei einer KuItivierungstemperatur von 30 C und mit einer Belüftung von 0,5 VYM durchgeführt.

Nach 72-stündiger Kultivierung wurde zu der Kulturbrühe Wasser bis zu einer Menge von 100 1 zugegeben und die Myzelen wurden durch kontinuierliche Zentrifugierung mit 20 000 Umdrehungen/Min, und 7 l/h mittels einer Zentrifuge entfernt. Anschließend wurde die in der Zentrifuge gewonnene überstehende Flüssigkeit auf 80 C während 15 Min. erhitzt und mit Chlorwasserstoffsäure auf einen pH von 3,5 bis 4,5 eingestellt, wobei Proteine beim isoelektrischen Punkt ausfielen und dann durch Zentrifugieren entfernt wurden. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf einen pH von 7,0 eingestellt, auf 25 1 konzentriert, mit Chloroform/ Amylalkohol (3:2) zum Deproteinisieren behandelt und dann wurden 50 1 Azeton zugegeben, wobei man eine Viskosesubstanz in Form einer fasrigen Masse erhielt. Die Substanz wurde abfiltriert, gründlich mit Äther und dann mit Alkohol gewaschen, wieder in Wasser gelöst und dialysiert. Dann wurde zur Abtrennung des Polysaccharids die zweifache Volumenmenge Azeton zugegeben. Das Polysaccharid wurde in 2 1 reinem Wasser gelöst und anschließend gefriergetrocknet, wobei man 98 g des gereinigten Polysaccharids M-30-C erhielt. Die Produktivität betrug 14,0 g/l der Kulturbrühe.

Die physiko-chemischen Eigenschaften des so hergestellten Polysaccharids sind nachfolgend angegeben:

(a) Optische Drehung:[A]^⁰ = +48,4° (0,1 w/v % wäßrige Lösung) .

(b) Durchschnitts-Molekulargewicht: 1 800 000 durch Gel-Filtration und 1 200 000 durch Lichtstreuung.

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(c) Elementaranalyse: C, 37,7 %; H, 5,8 %.

(d) Farbreaktion: Positive Anthronreaktion und Phenolschwefelsäurereaktion.

(e) Bestimmung der Basizität, Acidität oder Neutralität: Man erhält einen weißen Niederschlag bei Zugabe von Cetyltrimethylammoniumbromid oder Cetylpyridiniumchlorid zu einer wäßrigen Lösung des Polysaccharide M-30-C. Daher ist das Polysaccharid M-3O-C ein saures Polysaccharid .

(f) Infrarot-Absorptionsspektrum: Die charakteristischen Absorptionsbanden ausgedrückt durch die Wellenzahl (cm ) sind nachfolgend angegeben. 3450 (S), 2940 (M), 1620 (M), 1400 (M), 1040 (S) und 890 (W)(worin S eine starke Absorption, M eine mäßige Absorption und W eine schwache Absorption bedeutet) (s. auch Fig. 1).

(g) Löslichkeit: Löslich in Wasser, 1n-Chlorwasserstoffsäure, 1n-Schwefelsäure und 1n-wäßrigen Ammoniak. Unlöslich in Äthanol, Äther, Aceton, Chloroform und Dimethylsulfoxyd.

(h) Viskosität: 1000 bis 3000 cps, gemessen in einer 1,0 w/v %-igen wäßrigen Lösung des Polysaccharids M-30-C bei 20°C und einem BL-Typ-Viskometer, das mit 60 Umdrehungen/Min, betrieben wird.

(i) Veränderung der Viskosität mit Veränderung des pH-Wertes der wäßrigen Lösung: Im pH-Bereich von 2 bis 11 wird eine etwas höhere Viskosität um den Neutralpunkt beobachtet. Die Viskosität bei pH 2 ist 930 cps, die Viskosität bei pH 7 ist 1250 cps und bei pH 11 1100 cps (es wurde ein BL-Typ-Viskometer mit einem HM-3 Adapter für geringe Mengen verwendet, und die Meßbedingungen waren 20°C, 0,25 w/v % wäßrige Lösung und 6 Umdrehungen/Min, (s. auch Fig. 3).

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(j) Änderung der Viskosität einer wäßrigen Lösung mit der Temperatur: Innerhalb von 20 bis 80⁰C wird die Viskosität mit Zunahme der Temperatur etwas niedriger. Die Viskosität beträgt bei 20⁰C 13 500 cps und bei 80°C 11 100 cps, wobei das gleiche Viskosimeter und die gleichen Bedingungen wie bei (h) angewendet wurden, mit der Ausnahme, daß die Rotationsgeschwindigkeit 6 Umdrehungen/ Min. betrugen (s. auch Fig. 4).

(k) Änderung der Viskosität einer wäßrigen Lösung mit der Konzentration: Die Konzentration einer wäßrigen Lösung des Polysaccharids M-30-C wurde im Bereich von 0,2 w/v % bis 1,0 w/v % variiert. Je höher die Konzentration umso höher wird die Viskosität, wie deutlich zum Ausdruck kommt, daß bei 0,2 % die Viskosität 500 cps betrug und bei 1,0 % 13 500 cps bei einer Temperatur von 20⁰C, wobei das gleiche Viskosimeter und die gleichen Bedingungen (Umdrehungen/Min.) wie in (j) angewendet wurden (s. auch Fig. 5).

(m) Änderung der Viskosität einer wäßrigen Lösung durch Salz: Es wird keine Verminderung der Viskosität einer wäßrigen Lösung des Polysaccharids in einer 5 w/v % wäßrigen Lösung von Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, Aluminiumchlorid und Ammoniumsulfat oder einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid beobachtet·

(n) Zuckereinheiten: Das Polysaccharid M-30-C wird mit 2n-Schwefelsäure in einem versiegelten Rohr bei 100⁰C während 9 Stunden hydrolisiert. Das Reaktionsprodukt wird mit Bariumhydroxid zur Entfernung der Schwefelsäure behandelt und dann durch eine Säule mit einem Ionenaustausch-Harz Dowex 50 (H-Form)

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(erhältlich von der Dow Chemical Co., USA) zur Entfernung der überschüssigen Bariumionen und der feinen Teilchen aus Bariumsulfat gegeben. Das Ausfließende wird unter vermindertem Druck konzentriert. Das Konzentrat wird unter Verwendung von Butanol: Essigsäure: Wasser (4:1:5) als Entwicklungslösungsmittel einer Papierchromatographie unterworfen, wobei man Flecken für Glucose und Mannose erhält. Das Konzentrat wird weiter zur Trockne eingedampft und in das entsprechende Trimethylsilyl-Derivat überführt. Die Gaschromatographie zeigt ein Verhältnis von Glucose zu Mannose von 3:2.

(o) Farbe und Form: Das Polysaccharid M-30-C ist weiß und amorph und dessen wäßrige Lösung ist farblos.

(p) Geschmack und Geruch: Das Polysaccharid M-30-C und dessen wäßrige Lösung ist geschmacklos und geruchlos.

(q) Vergleich der Viskosität: Das Polysaccharid M-30-C hat eine höhere VisKOsität, verglichen mit Xanthanharz. Die Vergleichsbedingungen waren 20⁰C, eine 1,0 w/v %-ige Lösung, 60 Umdrehungen/Min, und es wurde das gleiche Viskosimeter wie bei (h) verwendet. Das Polysaccharid M-30-C hat eine Viskosität von 2100 cps und das Xanthanharz eine Viskosität von 1000 cps.

(r) Thixotropisehe Eigenschaft: Das Polysaccharid M-30-C zeigt thixotropische Eigenschaften in Form einer wäßrigen Lösung (s. "Rheology", Kakutaro Nakagawa et al, Seiten 97-98, veröffentlicht als eines der Iwanami Complete Books). Die Beziehung zwischen der

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Drehungszahl in einem Viskosimeter und den Viskositäten wird in Fig. 2 gezeigt. Das gleiche Viskosimeter und die gleichen Bedingungen wie in (h) wurden hier verwendet.

(s) Fadenziehen: Das Polysaccharid M-30-C zieht keine Fäden als wäßrige Lösung.

(t) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: Eine schwache Absorption wird bei etwa 280 mum beobachtet, wie aus Fig. 6 hervorgeht.

(u) Schmelzpunkt: Unbestimmt, zersetzt sich beim Erhitzen und verkohlt.

Beispiel

Die Kultivierung wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt, wobei man eine Kulturbrühe erhielt, welche das Polysaccharid M-30-C enthielt. Die Kulturbrühe wurde mit Wasser-Methanol (1:1) auf 100 1 verdünnt und dann 15 Min. auf 80⁰C erhitzt. Dann wurden Myzele durch kontinuierliche Zentrifugierung mittels einer Zentrifuge unter Bedingungen von 7 l/h entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit Chlorwasserstoffsäure auf pH 3,5 bis 4,5 eingestellt, wobei Proteine am isoelektrischen Punkt ausfielen, die durch Zentrifugieren entfernt wurden. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf pH 7 eingestellt, und dazu wurde eine wäßrige Lösung von Calciumchlorid gegeben in einer Menge, die ausreichte, um die Konzentration auf 0,02 w/v % zu bringen. Bei einer weiteren Zentrifugierung erhielt man ein pastenartiges Polysaccharid. Dieses Produkt wurde in 20 1 Methanol behandelt und gründlich zur Entfernung der Salze gerührt, filtriert und das Methanol wurde entfernt, wobei man das Polysaccharid als Paste erhielt. Es wurde dann

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in reinem Wasser aufgelöst und gefriergetrocknet, wobei man 84 g des gereinigten Polysaccharids M-3O-C erhielt. Die Produktivität betrug 12,0 g/l der Kulturbrühe.

Zum Nachweis der pharmakologischen Eigenschaften des neuen Polysaccharids M-3O-C wurden folgende Versuche durchgeführt.

Versuch 1

Männliche Mäuse vom Typ ICR-JCL-Stamm, wobei jede Gruppe aus 10 Tieren bestand, wurden verwendet und wurden intravenös mit Triton in einer Menge von 800 mg/kg behandelt. Nach 20 bis 24 Stunden nach der Verabreichung wurde eine Höchstmenge an Blutlipid festgestellt und anschließend wurde eine Hyperlipämie über 20 Stunden oder länger in den Tieren aufrechterhalten. Auf diese Weise erhielt man Versuchstiere, die eine durch Triton erzeugte Hyperlipämie aufwiesen.

Die Versuchsprobe (M-30-C) wurde in destilliertem Wasser gelöst und den Tieren zweimal oral verabreicht, nämlich einmal unmittelbar nach der Tritonverabreichung und dann nach 20 bis 24 Stunden. Nach 24 Stunden nach der letzten Verabreichung wurde das Cholesterinniveau im Serum bestimmt.

Versuch 2

Männliche Mäuse vom ICR-JCL-Stamm, wobei jede Gruppe aus 6 Tieren bestand, wurden hier verwendet und wurden intravenös mit Streptozotocin in einer Menge von 200 mg/kg behandelt. 7 Tage nach der Verabreichung wurde eine Hyperlipämie über 14 Tage oder länger aufrechterhalten und auf diese Weise erhielt man Versuchstiere mit einer durch Streptozotocin verursachten endogenen Hyperlipämie.

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Die Versuchsprobe (M-3O-C) wurde in destilliertem Wasser gelöst und den Tieren in einer einzigen täglichen Dosis von 50 mg/kg während 5 Tage bis 7 Tage nach der Streptozotocin-Verabreichung verabreicht. 24 Stunden nach der letzten Verabreichung wurde das Cholesterinniveau im Serum bestimmt.

Versuch 3

Es wurden männlich Wistar-Ratten verwendet, von denen jede Gruppe aus 10 Tieren bestand, und es wurden 3 Gruppen,

wie sie nachfolgend beschrieben werden, eingesetzt.

"Normale Gruppe" (normale Kontrolle) enthielt die Tiere, welche ein übliches Kraftfutter erhielten. "Cholesterin-Kontrollgruppe" (positive Kontrolle) enthielt die Tiere, die mit einem Kraftfutter gefüttert worden waren, das 0,5 % Cholesterin und 0,5 % Gallensäure enthielt. Die mit "Gruppe, die M-30-C erhalten hat" bezeichnete Gruppe enthielt Tiere, die ernährt worden waren mit einer Nahrung entsprechend der Cholesterin-Kontrollgruppe und mit Versuchsproben von M-30-C, wobei letzteres in einer täglichen Dosis von 50 mg pro Versuchstier eingesetzt wurde. Das Cholesterinniveau im Plasma wurde bei allen Gruppen gleichzeitig erhöht und die Nahrung wurde in einer Tagesmenge von 10 g pro 100 g Körpergewicht verabreicht. Nach 14-tägigem Füttern wurde das Cholesterinniveau im Serum bestimmt. Bei den Versuchen 1 bis 3 wurde ein handelsübliches Cholesterin-senkendes Mittel (CPIB) für Vergleichszwecke mitverwendet. Die Ergebnisse aus den Beispielen 1 bis 3 werden in der folgenden Tabelle 1 angegeben.

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TABELLE 1

Wirkung von M-3O-C auf Serum Cholesterin

P m α j

	Normale Kontrolle	Positive Kontrolle	Gruppe, die M-30-C erhalten hat	5 mg/kg/ Dosis/ einheit	50 mg/kg"/ Tag	Gruppe, die Clofibrate erhalten hat*3*	300 mg/kg/ Dosisein heit oder Tag
Versuch 1 Hyperlipämie durch Triton induziert	109,0^,O	401,2*18,0	1 mg/kg/ Dosis einheit	247,1*21,7		100 mg/kg/ Dosis einheit	191 ,9*28,8
Versuch 2 Hyperlipämie durch Strepto~ zotocin in duziert	128,2*10,3	200,0*10,3	299,6*24,9	-	163,1*14,4	396,0*23,0	177,4*10,3
Versuch 3 Hyperlipämie durch Ernäh rung mit hohem Chole- steringehalt induziert	72,9*3,0	25O,2±9,9	-	-	191,1-16,7	-	t < ( 384,2-21 ,7
-	-

: mg/dl; ausgedrückt als Mittelwert * Standardfehler : Handelsübliches Hypocholesterinmittel der Formel

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ei—(^_j—o-cj:-cooc₂H₅

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Versuch

Männliche weiße Kaninchen vom Neuseeland-Stamm wurden hier verwendet, wobei jede Gruppe aus 10 bis 14 Tieren bestand.

Tieren, die mit üblichem granulierten Futter gefüttert worden waren, wurden als "Normalgruppe" (Normalkontrolle) bezeichnet, solche die eine übliche Ernährung und Cholesterin in einer Menge von 0,67 % erhalten hatten, wurden als "Cholesterin-Kontrollgruppe" (positive Kontrolle) bezeichnet und solche, die ein Futter entsprechend der positiven Kontrolle und Versuchsproben (M-3O-C) erhalten hatten, wurden als "Gruppe, die die Versuchsproben erhalten hat" bezeichnet. Das Cholesterinniveau im Plasma wurde bei allen Gruppen gleichzeitig erhöht durch eine tägliche Nahrungszufuhr von 40 g/kg Körpergewicht über 20 Wochen.

Während dieser Zeit wurde das Lipid im Serum bestimmt. Nach 20 Wochen wurden alle Tiere ausgeblutet und die dorsale Aorta wurde herausgeschnitten und auf Auswirkungen hinsichtlich Atherosclerosis untersucht.

Die Ergebenisse sind in der nachfolgenden Tabelle 2 gezeigt. Wie aus der Tabelle 2 ersichtlich wird, inhibiert Polysaccharid M-30-C erheblich das Ansteigen des Serumfettgehaltes (gesamtes und freies Cholesterin, Triglyzerid, Phospholipid, Lipotrotein, freie Fettsäure); man sieht insbesondere ein 65,9 %-iges atherosclerotisches Verhältnis in der dorsalen Aorta bei der positiven Kontrollgruppe, während man bei der Gruppe, die M-30-C erhalten hat, eine 30 bis 40-%-ige Inhibierung der Atherosclerose beobachtet. Man nimmt an, daß die Erniedrigung der Serumlipoide durch Polysaccharid M-30-C auf die inhibierende Wirkung auf die Absorption und Biosynthese von Cholesterin zurückzuführen ist.

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Aufgrund dieser Tatsache, wonach eine experimentelle Atherosclerose erheblich vermindert werden kann, kann man das Polysaccharid M-3O-C als ein Mittel ansehen, das zur Verminderung des Lipoidgehaltes im Serum und als Mittel gegen Atherosclerose geeignet ist.

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809846/095*;

TABELLE

	Wochen	Normal- Kontrolle	Positive Kontrolle	Gruppe,welche M-30-C erhalten hat	100 mg/kg/Tag	Gruppe, die Clofi- brate erhalten hat
Cholesterin (mg/dl)	6 12 18	45,5*2,7*** 58,5*4,6*** 41,6*4,7***	1475,4*153,2 2003,8*421,4 1772,1*517,3	30 mg/kg/Tag	947,9* 81,5** 917,9* 119,2** 736,5* 46,1**	100 mg/kg/Tag
Triglycerid (mg/dl)	6 12 18	54,3*6,2*** 75,6±6,6*** 97,0*31,6***	942,6*149,3 721,7*390,0 655,1*187,5	1297,9*174,1 1130,0*142,1* 909,2* 99,0*	293,6* 62,5** 258,0* 77,6** 187,8* 50,2**	916,5*218,2* 1466,8*182,5 1075,7* 59,3
Ätherosclero- se-Verhältnis Inhibierung Prozent (%)	20 20	0 ! 65,9*7,0 0	876,4*239,1 378,1*167,1 455,5*133,6	41,5*8,4* 37,0	326,0*180,3* 343,1* 55,3* 366,9*112,1
45,1*9,4 31 ,6	58,1*7,9 11 ,8

Atherosclerose-Verhältnis

Gesamtfläche(Aorta)

cn

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Claims (4)

PAT E N TANWALTE DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) · DlPL-I NG. W. EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEH N DIPL.-ING. K. FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERNHAUS) · D-8000 MÖNCHEN 81 · TELEFON (089) 9Π087 · TELEX 05-29619 (PATHE) 30 641 o/fi

1. Mitsubishi Petrochemical Company Limited Tokyo , Japan

2. Mitsubishi Yuka Pharmaceutical Co.,Ltd. Tokyo , Japan

Neues Polysaccharid, Verfahren zu dessen Herstellung und Hypocholesterin-Zusammensetzungen, welche diese enthalten

Patentansprüche :

( 1 Λ Ein Polysaccharid mit den folgenden physiko-chemischen Eigenschaften:

(a) Optische Drehung:[(A.] ^⁰ = +48,4° + 3,3° (0,1 w/v % wäßrige Lösung)

in: ,6

(b) Durchschnitts-Molekulargewicht: 2,0 χ 10 -

2,0 χ 10

(c) Elementaranalyse: C, 37,7 % + 3,0 %; H, 5,8 % + 0,5 %.

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(d) Farbreaktion: Positive Anthronreaktion und Phenolschwefelsäurereaktion

(e) Bestimmung der Basizität, Acidität oder Neutralität: Saures Polysaccharid

(f) Infrarot-Absorptionsspektrum: Charakteristische Absorptionsbanden (cm ) bei 3450 (S), 2940 (M), 1620 (M), 1400 (M), 1040 (S) und 890 (W)

(g) Löslichkeit: Löslich in Wasser, 1n-Chlorwasserstoffsäure, 1n-Schwefelsäure und 1n-wäßrigen Ammoniak. Unlöslich in Äthanol, Äther, Azeton, Chloroform und Dimethylsulfoxyd

(h) Viskosität: 1000 - 3000 cps, gemessen an einer 1,0 w/v %-igen wäßrigen Lösung bei 20°C mittels eines BL-Typ-Viskosimeters (hergestellt von Tokyo Keiki K.K., Japan)

(i) Zuckereinheiten: Flecken von Glucose und Mannose bei der Papierchromatographie nach der Hydrolyse und ein Zuckereinheitenverhältnis von Glucose zu Mannose von 3: 2 mittels GasChromatographie

(j) Farbe und Form: Weiß und amorph als solches und farblos als wäßrige Lösung.

2. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids, dadurch gekennzeichnet, daß man Pseudomonas Polysaccharogenes M-30 vom Genus Pseudomonas in einem Medium kultiviert, das Methanol als einzige oder Hauptkohlenstoffquelle enthält, und daß man das Polysaccharid aus der Kulturbrühe isoliert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Kultivierung in einem

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Medium bei einem pH von 6,5 bis 7,5 bei 28 bis 3O°C während 48 bis 72 Stunden vorgenommen wird, daß festes Material aus der Kulturbrühe entfernt wird, daß ein rohes Polysaccharid ausgefällt und abgetrennt wird mit einem Lösungsmittel zum Ausfällen und daß das Polysaccharid dann durch Diprotexnisxerung gereinigt wird.

4. Arzneimittel für die Verminderung von Cholesterin, dadurch gekennzeichnet, daß es als aktives Bestandteil ein Polysaccharid gemäß Anspruch 1 enthält.

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