DE2833799A1

DE2833799A1 - Substanz 34129 rp, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende arzneimittel

Info

Publication number: DE2833799A1
Application number: DE19782833799
Authority: DE
Inventors: Jean Florent; Pierre Jolles; Jean Lunel; Denise Mancy; Daniele Migliore-Samour
Original assignee: Agence National de Valorisation de la Recherche ANVAR
Current assignee: Bpifrance Financement SA
Priority date: 1977-08-04
Filing date: 1978-08-02
Publication date: 1979-02-15
Also published as: BE869058A; JPS5427502A; GB2001995A; FR2399437A1; NL7807938A

Description

PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler + 1973

Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selting, Köln

5 KÖLN 1

DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF

1.August 1978 AvK/Ax

Agence Nationale de Valorisation de la Recherche (ANVAR)
13, Rue Madeleine Michelis, Neuilly-sur-Seine, Frankreich

Substanz 34 129 RP, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende Arzneimittel

909807/0948

Ur, m?7U ?14";41 i TpUx: 8883307 doDO d ■ Telegramm- Dompatent Köln

Die Erfindung betrifft eine neue wasserlösliche Substanz, die immunitatssteigernde (immunostimitiulierende) Eigenschaften aufweist, mit der Nr. 34129 RP bezeichnet wird und von Streptomyces stimulosus DS 25 556 (NRRL 5776) extrahiert ist, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende Arzneimittelzubereitungen.

Die neue Substanz gemäß der Erfindung hat die folgenden Merkmale:

Aussehen: cremefarbiges amorphes Pulver (nach Gefriertrocknung);

Zusammensetzung:

a) nach Aminosäuren: Alanin (5 bis 7%), Glutaminsäure (7 bis 10%), Glycin (2,5 bis 4%) und .^,oC-Diaminopimelinsäure (5 bis 8%);

b) nach Aminozuckern: N-Acetylglucosamin (5 bis 10%), Muramsäure (5 bis 10%).

Elementaranalyse:

C 40,4-41,4%; H 6,7-6,9%; N 8,0-10,6%

Infrarotspektrum (bestimmt an Tabletten in Mischung mit KBr): Dieses Spektrum ist in der Abbildung dargestellt, in der als Abszisse die Wellenlängen in _/um (obere Skala) und als Ordinaten die optischen Dichten (untere Skala) aufgetragen sind.

In der folgenden Tabelle I sind die Hauptabsorptionsbanden des Infrarotspektrums für die neue Substanz in Wellenzahlen (cm ) angegeben.

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	-Jr- S	H₂O	I	1320	schwach
	Tabelle	Schulter	1260	mittel
3400	Schulter	1140	Schulter
3300	mittel	1115	mittel
3100	mittel	1075	Schulter
29 70	Schulter	1040	stark
2950	Schulter	975	Schulter
2880	sehr schwach	910	schwach
2600	sehr stark	855	Schulter
2060	sehr stark	770	Schulter
1650	mittel	720	Schulter
1590	stark	690	Schulter
1450
1400

Die immunitätssteigernde (immunostimulierende) Wirkung der neuen Substanz 34129 RP gemäß der Erfindung kann wie folgt nachgewiesen werden:

Die Substanz übt in vitro bei einer Konzentration von 100 ug/ml eine Stickstoffwirkung auf die Lymphozyten der Milz der Maus aus. Bei der Maus erweist sich die Substanz 34129 RP ;je nach den angewendeten Versuchssystemen und der Verabreichung bei Dosen zwischen 1 und 30 mg/kg als wirksam. Beispielsweise steigert die Substanz gemäß der Erfindung bei parenteraler Verabreichung (subkutan, intraperitoneal oder intravenös) die Widerstandsfähigkeit der Maus gegen Infektion durch ein Virus (Enzephalomyokarditis) oder durch eine intrazelluläre Bakterie (Listeria monocytogenes). Diese Steigerung der Widerstandsfähigkeit kommt durch eine Verringerung der Mortalität und/oder eine bedeutend längere Überlebensdauer nach einer Infektion mit den normalerweise zu 100% tödlichen Dosen von virulenten Stämmen dieser Mittel zum Ausdruck.

Bei parenteraler Verabreichung steigert die Substanz 34129 RP gemäß der Erfindung bei der Maus die phagozytäre Wirkung des Retikulo-Endothelialsystems und steigert bei der Ratte die Zahl der Antikörper bildenden Lymphozyten.

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Die neue Substanz 34129 RP übt eine anregende Wirkung auf die Überempfindlichkeitsreaktionen vom verzögerten Typ gegenüber einem bestimmten Antigen aus. Ferner übt sie eine bedeutende hemmende Wirkung auf das Wachstum eines Mäusen eingepflanzten Tumors (Leukosarkomatose) aus.

Beim Meerschweinchen begünstigt die Substanz 34129 RP, die in einer Dosis von 0,5 mg/kg injiziert wird,, zur gleichen Zeit und an der gleichen Stelle wie ein lösliches Antigen, z.B. Eiereiweiß, die Überempfindlichkeitsreaktion und die Bildung von Antikörpern gegen dieses Antigen. Im Gegensatz zu den Beobachtungen bei vielen klassischen Adjuvantien tritt die Wirkung als Adjuvans ein, wenn die Substanz gemäß, der Erfindung und das Antigen in Abwesenheit von Mineralöl (unvollständiges Freund' Adjuvans) verabreicht werden.

15 Bei der Maus liegt die Letaldosis 50% (LD ) der

Substanz 34129 RP gemäß der Erfindung bei intravenöser Verabreichung über 50 mg/kg.

Das Verfahren zur Herstellung der wasserlöslichen Substanz 34129 RP gemäß der Erfindung besteht darin, daß man Zellen von Streptomyces stimulosus DS 25556, die von Lipiden befreit worden sind, wiederholten Autolysen unterwirft und den wasserlöslichen Teil durch Filtration durch Träger mit geeigneter Porosität so fraktioniert, daß Substanzen mit einem Molekulargewicht zwischen 2000 und

25 20.000 erhalten werden.

Der Mikroorganismus Streptomyces stimulosus DS 25556 wurde aus einer in Indien genommenen Bodenprobe isoliert. Die Isolierung erfolgte nach der allgemeinen Methode, die darin besteht, daß man eine kleine Bodenmenge in verschiedenen Konzentrationen in Wasser suspendiert und ein kleines Volumen jeder Verdünnung auf der Oberfläche von Petrischalen ausbreitet, die ein Nährmedium enthalten. Nach Bebrütung für einige Tage bei 26°C, wodurch der Mikroorganismus sich entwickeln kann, werden die Kolonien,

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■-■■■- /r -

die zur weiteren Untersuchung isoliert werden sollen, entnommen und auf Nähragar übertragen, um üppigere Kulturen dieser Mikroorganismen zu erhalten.

Eine Probe dieses Stamms wurde beim Northern Regional Research Laboratory des U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt und dort unter,der Zugangs-Nummer NRRL 5776 registriert. Dieses Laboratorium ist unwiderruflich ermächtigt, diesen Stamm an alle Personen abzugeben, die legal Kenntnis von diesem Dokument haben.

Streptomyces stimulosus DS 25556 bildet zylindrische Sporen einer Größe von 0,6 bis 0,8 um/1,0 bis 1,3 ^m. Die geraden oder leicht gewundenen Sporenketten sind im allgemeinen lang und tragen meistens einige zehn Sporen. Die Sporophoren sind einfach oder zeigen einige Verzweigungen in Traubenform. Durch seine Sporulationsweise ist dieser Stamm in den Abschnitt Rectus-Flexibilis der Klassifizierung von Pridham einzustufen.

Streptomyces stimulosus DS 25556 weist ein sporuliertes Luftmycel von grauer Farbe auf. Es entwickelt sich gut bei 26°C, schlecht bei 37°C und überhaupt nicht bei 50⁰C.

Der Mikroorganismus bildet auf organischen Medien, insbesondere auf dem Spezial-Agar Tyrosin-Hefeextrakt nach Waksman ("Helanin Formation Medium") (siehe die nachstehend

F
genannte Fundstelle), reichlich ein schwarzes Melaninpigment. Ferner bildet er mehr oder weniger reichlich ein lösliches Pigment, das je nach der Acidität des Mediums, dem es seine Farbe verleihen kann, violettblau bis rot ist. Das letztgenannte Pigment wird besonders reichlich auf Calciummalat-Agar gebildet, das eine sehr charakteristische

30 intensive blauviolette Farbe annimmt.

In seinen bei 26°C durchgeführten Kulturen zeigt der Stamm die folgenden biochemischen Merkmale:

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- 7-	Bildung von Melanin:	positiv
Z	Bildung von H S:	positiv
Tyrosinase:	positiv
Verflüssigung von Gelatine:	positiv
Bildung von Nitriten aus
Nitraten:	positiv

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positiv auf synthetischen Medien sowie auf Nitrat-Nährbouillon

Hydrolyse von Stärke: positiv

Kultivierung auf Milch: Peptonisierung ohne Gerinnung, wobei der pH-wert in 1 Monat von 6,3 auf 7,8 steigt. Verwendung von Gllulose positiv

Die Kulturmerkmale von Streptomyces stimulosus DS 25 556 sind in der später folgenden Tabelle zusammengestellt. Dies sind die Merkmale von Kulturen, die, falls nicht anders angegeben, in etwa 2 bis 3 Wochen bei 26°C ein gutes Entwicklungsstadium erreichen. Diese Merkmale wurden auf Nähragarböden und Bouillon-Nährböden beobachtet, die üblicher Weise zur Bestimmung der morphologischen Eigenschaften von Streptomyces-Stämmen verwendet werden. Die Kulturen auf Agar-Nährböden wurden mit Schräg-Agar durchgeführt. Eine gewisse Anzahl der verwendeten Kulturmedien wurde nach der Zusammensetzung hergestellt, die in

25 "The Actinomycetes" von S.A. Waksman,. S. 193-197, -

Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., U.S.A. 1950, angegeben ist. In diesem Fall sind sie mit dem Buchstaben "W" und einer anschließenden Zahl gekennzeichnet, die sie in "The Actinomycetes" erhalten haben. Die Fundstellen

30 bzw. Zusammensetzungen der anderen Kultumedien sind nachstehend genannt.

Fundstelle A: "Hickey and Tresner's Agar" - T.G. Pridham und Mitarbeiter, Antibiotics Annual 1956-1957, S.

Fundstelle B: "Bennett's Agar" - S.A. Waskman, "The Actinomycetes", Bd. 2, S. 331, Nr. 30 - The Williams

and Wilkins Company, Baltimore 1961.

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Fundstelle C: Zusammensetzung W-23 mit Zusatz von 2% Gelöse Fundstelle D: "Yeast extract Agar" - T.B. Pirdham u. Mitarb., Antibiotics Annual 1956-1957, S. 950.

Fundstelle E: "Tomato Paste Oat meal agar" - T.G. Pridham u.Mitarb., Antibiotics Annual 1956-1957, S. 950.

Fundstelle F: "Melanin formation medium" - S.A. Waskman The Actinomycetes, Bd. 2, S. 333, Nr. 42, The Williams and Wilkins Company, Baltimore 1961.

Fundstelle G: W.E. Grundy u.Mitarb. "Antibiotics and Chem. 2 (1952) 401.

Fundstelle H: "Inorganic Salts - Starch Agar" - T.G. Pridham u.Mitarb., Antibiotics Annual 1956-1957, S. 951.

Fundstelle I: "Medium 1 with a mineral source of nitrogen", G.F. Gauze u.Mitarb. "Problems in the classification of Antagonistic Actinomycetes", S. 13 - The American Institute of Biological Sciences, Washington 6, D.C. 1959.

Nährmedium J: entspricht der Zusammensetzung W-1, wobei 30 g Saccharose durch 15 g Glucose ersetzt sind.

Nährmedium K: entspricht der Zusammensetzung W-1, wobei 30 g Saccharose durch 15g Glycerin ersetzt sind.

Fundstelle L: "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" - Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y. - ΙΙ₅₍₎-19.

Zusammensetzung M: entspricht der Zusammensetzung W-18, wobei die Saccharose weggelassen und durch kleine Filterpapierstreifen, die teilweise in die Flüssigkeit tauchen, ersetzt ist.

Fundstelle N: "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria", Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y. -H₅₀-18."

Medium Pr "Plain gelatin", hergestellt nach den Angaben in

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-Jir-

"Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria", Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y. II_5O-18.

Nährmedium Q: Handelsübliches Magermilchpulver, nach den Angaben des Herstellers rekonstituiert.

Nährmedium R: Medium, das für die Untersuchung der Bildung von H₂S. von H.D. Tresner und F. Danga in Journal of Bacteriology 76 (1958) 239-244 angegeben ist.

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	Nährmedium	Entwick	Vegetatives	Luftsystem	Lösliches	Bemerkungen
		lungs	Mycel oder	(Gesamtheit	Pigment	biochemische
		grad	Rückseite	aus Luft—		Eigenschaften
			der Kultur	mycel und
				Sporulation)
	Nährboden (Gelose) nach		Rückseite	dunkelgrau	schwarz,	Zylindrische Sporen
	Hickey und Tresner		schwarz		reichlich	einer Größe von
	(Fundstelle A)	gut	braun			0,6-0,8 um/1,0 bis 1 ^ um '
co						gerade Sporenketten
α						mit einigen zehn
co						Sporen. Sporophoren
OO						einfach oder mit
ο						einigen Verzweigungen
"^						in Traubenform.
O C£>	Bennet-Agar (Gelose)		Rückseite	violettgrau	sehr
**■ cn	(Fundstelle B)	gut	dunkel Iracfani ort.		dunkelbraun

Emerson-Agar (Gelose) (Fundstelle C)

Hefeextrakt-Agar nach Pridham (Fundstelle D)

braun

Rückseite sehr dunkles Gelbbraun

grau

Tomatenpaste-Hafermehlagar nach Pridham (Fundstelle E) gut

Rückseite hellgraudunkelgelb- violett bis braun bis dunkelgrau schwarzbraun

Rückseite dunkelgrau dunkelgelbbraun

schwärzlichbraun

dunkelbraun

Nährmedium

Entwick	Vegetatives	Luftsystem	Lösliches
lungs	Mycel oder	(Gesamtheit	Pigment .
grad	Rückseite	aus Luft—
	der Kultur	mycel und
		Snorulation)
	Rückseite	dunkelgrau	schwarzbraun
gut	schwärzlich
	braun
zieml.	Rückseite	hellgrau	schwärzlich
gut	gelbbraun		braun
zieml.	Rückseite	hellrosa-	schwarz,
gut	schwärzlich	grau	reichlich
	braun
mäßig	Rückseite	grau,	blauviolett,
	violett	mäßig ent	reichlich
		wickelt
schlecht	vegetatives	gräulich;	schwach
	Mycel farb-	im Zustand	orangegrau

Bemerkungen

biochemische

Eigenschaften

Glucose-Peptonagar (W-7)

Nähragar (W-5)

Tyrosinagar-Hefeextrakt zur Bildung von Melanin (Fundstelle F)

Calciummalatagar nach Krainsky (Fundstelle G)

Ovalbumin-Agar (W-12)

Glucose-Asparagin-Agar mäßig (W-2)

Glycerin-Asparagin-Agar zieml, (W-3) gut

Bildung von Melanin: positiv (Ablesungen gemäß den Empfehlungen des Autors)

Löslichmachung des Malats positiv, aber langsam

los bis von Spuren orangegrau. Sehr schlecht entwickelt.

Rückseite orangebraun

weißlich bis
grau, sehr
mäßig entwickelt

weiß-rosa
bis grau,
mäßig
entwickelt

orangerosa,
schwach

bräunlichrot

OO CO CO

Nährmedium

Entwicklungsgrad

Vegetatives Mycel oder Rückseite der Kultur

Luftsystem (Gesamtheit aus Luftmycel und Sporulation)

Lösliches
P igment

Bemerkungen

biochemische

Eigenschaften

	Starke-Mineral salz-Agar nach Pridham (Fundstelle H)	gut	Ruckseite gelbbraun
108606
σ α>
α»	Stärkenitrat-Agar (W-IO)	mittel mäßig	Rückseite gelbbraun bis schwärz lich braun

gelblichgrau

gräulich
gelbbraun

hellgrau braungrau

bis dunkel-'

Hydrolyse von Stärke: positiv

Zylindrische Sporen einer Größe von 0,6 bis 0,8 um/1,0 bis 1,3 um;

Sporenketten gerade mit einigen zehn Sporen.

Sporophoren einfach oder mit einigen Verzweigungen in Traubenform.

Hydrolyse von Stärke positiv

Agar mit mineralischer
Stickstoffauelle nach
Gauze (Nährmedium Ij

Synth. Czapek-Saccharose-Agar (W-I)

Synth. Czapek-Glucoseagar (Nährmedium J)

gut

Rückseite dun- dunkelgrau kelviolett

dunkel gräulich violett

fast null vegetatives Mycel wenig entwickelt

ziemlich Rückseite gut gelbbraun weiß-gräulich
in Form von
Spuren

weißlich bis
grau, mäßig
entwickelt

null

dunkelbraun

to

OO CO ι

Nährmedium	Entwick	Vegetatives	Luftsystem Lösliches	dunkelgrau	lieh, sehr	igment	Bemerkungen	I	<	Bildung von Nitriten:	?κ:
	lungs	Mycel oder	(Gesamtheit P		mäßig ent		biochemische			positiv	OO
	grad	Rückseite	aus Luft-		wickelt		Eigenschaften	I			LO
		der Kultur	mycel und		heilgrau						OJ
			Snorulation)		bis dunkel	dunkles					CD
Synthetisches Czapek-	zieml.	Luftmycel	vcißlich-	leichte Decke, Null	grau,mäßig	oranCTe-		Bildung von Nitriten:	CD
Agar mit Glycerin	gut	dicht und	grnu, sehr	gräulich	entwickelt	braun	positiv
(Fundstelle K)		faltig,	nässig ent	weiß
		rissigwer	wickelt			Bildung von Nitriten:
		dend,organge-			positiv; Verwertung
		braun,	leichte weiß- hellgräu		von Cellulose:
		ziemlich	liche Decke		positiv
		dunkel_?	(Voile)		Bildung von Nitriten:
		Rückseite			positiv
			bräunliche
			Decke	braun, in
Bouillon-Stärkenitrat	gut			geringer
(W-UL9)				Menge aus
		dunkelorange-	der Ober
		braun	fläche
		dichte	Null
Bouillon-Glucosenitrat	mäßig	Decke (Voile
nach Dimmick		Rückseite
		dunkelbraun	Null
Czapek-Cellulosebouillon	mittel
(Fundstelle M)	mäßig

		hellbraun
Nitrathaitige Nährbouillon	mittel
nach Difco	mäßig
(Fundstelle N)

	Nährmedium	Entwick	Vegetatives	Luftsystem	Lösliches	Bemerkungen	I	Verflüssigung:
		lungs	Mycel oder	(Gesamtheit	Pigment	biochemische	■ ^	positiv, gut
		grad	Rückseite	aus Luft-,		Eigenschaften	* ν
			der Kultur	mycel und			ι ·^
				Snorulation)
	Kultur auf Kartoffel	sehr gut	Luftmycel	weißlich	schwarz
	(W-27)		dicht und	bis grau,			Peptonisierung ohne
			faltig, sehr	mäßig ent			Koagulation pH-Wert
			dunkles	wickelt			steigt in 1 Monat von
			Orangebraun				6,3 auf 7,8
co			bis röt			Peptonisierung ohne
O /Γι			lichbraun			Koagulation, pH-Wert ¹^
OO			bis schwärz			steigt in 1 Monat von
O			lich			6,3 auf 8,0. £J
-O!	Reine 12%ige Gelatine	gut	Luftmycel	weißlich	gelbbraun	Bildung von H-S CD
O	(Fundstelle P)		gelbbhaun	bis gräu		positiv (Ablesungen CD
co				lich im		erfolgten gem.den
•ο·-				Zustand von		Empfehlungen der
co				Spuren,		Autoren
	Magermilchpulver
	(Fundstelle Q)	Dbei	gelbbrauner	gräulich
		25⁰C gut	Ring	weiß, in
				Form von
				Spuren
		2) bei	dunkelbrau	Null
		37°C sehr	ner Ring,
		mäßig	schlecht
			entwickelt
	Agar nach Tresner und	gut	Luftmycel	gräulich	schwarz,
	Danga (Fundstelle R)		schwärzlich	weiß, in	reichlich
			braun	Form von
				Spuren

Streptomyces stimulosus DS 25 556 zeigt eine Gesamtheit von Eigenschaften, die mit den Eigenschaften von allen bisher beschriebenen Stämmen nicht zusammenfällt. Aus diesem Grunde muß der Mikroorganismus als neue Spezies angesehen v/erden.

Betrachtet man die Spezies, die in "The Actinomycetes" (Bd. 2, S.A. Waksman r The Williams and Wilkins Company, Baltimore 1961) sowie in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7.Auflage, The Williams and Wilkins Company, Baltimore 1957) beschrieben werden, so kommt der Mikroorganismus den beiden Spezies am nächsten, die in "The Actinomycetes" beschrieben v/erden, nämlich Streptomyces phaeopurpureus und Streptomyces purpureofuscus. Ebenso wie diese bildet S. stimulosus DS 25 556 Melaninpigmente auf organischen Medien, entwickelt auf den meisten Nährböden ein vegetatives Mycel, dessen Farbe von gelbbraun oder dunkelorangebraun bis schwarzbraun geht, und entwickelt auf Kartoffelmedium ein orangebraunes bis rötlich braunes vegetatives Mycel, wobei er ein mäßig entwickeltes Luftmycel von weißlicher bis grauer Farbe zeigt. Der Stamm kann jedoch mit keiner dieser beiden Spezies als identisch erkannt werden, da einerseits S. phaejfopurpureus sphärische bis elliptische Sporen bildet, gutes Wachstum auf synthetischem Czapek-Agar mit Saccharose (Saccharose-

25 Nitratagar) zeigt, keine Cellulose verwertet, Nitrate

nicht reduziert und Rhamnose verwertet, während S.stimulosus DS 25 556 zylindrische Sporen bildet, auf synthetischem Czapek Saccharose-Nitratagar praktisch kein Wachstum zeigt, Cellulose verwertet, Nitrate stark reduziert und keine Rhamnose verwertet. Andererseits zeigt S. purpureofuscus gutes Wachstum auf Czapek-Saccharose-Nitratagar, ein farbloses vegetatives Mycel und ein lösliches rötlichbraunes bis dunkelrotweinbraunes (brun vineux fonce) auf Nähragar, ein purpurfarbenes lösliches Pigment auf

35 Kartoffel, ein gelblich grünes lösliches Pigment auf

Gelatine, bringt Milch zum Gerinnen und verwertet keine

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Cellulose, während S. stimulosus DS 25 556 auf synthetischem Czapek-Saccharose-Nitratagar praktisch kein Wachstum zeigt, auf Nähragar ein gelbbraunes vegetatives Mycel und ein schwärlich braunes lösliches Pigment zeigt, auf Kartoffelmedium kein purpurfarbenes, sondern ein schwärzlich braunes lösliches Pigment, auf Gelatine ein gelbbraunes lösliches Pigment ohne grüne Nuance bildet, Milch nicht zum Gerinnen bringt und Cellulose verwertet.

Betrachtet man ferner die von G.F. Gauze U.Mitarbeitern beschriebenen Spezies (Problems in the classification of Antagonistic Actinomycetes - The American Institute of Biological Sciences, Washington 1959), so stellt man fest, daß S. stimulosus DS 25556 in die Reihe "Violaceus", die durch Bildung eines grauen Luftmycels und eines blauvioletten bis rötlichbraunen vegetativen Mycels auf "Medium mit Mineralstickstoff nach Gauze" gekennzeichnet ist, einzustufen ist. In dieser Reihe sind die beiden Stämme, mit denen man ihn auf Grund der violetten Farbe seines vegetativen Mycels auf "Medium mit Mineralstickstoffquelle nach Gauze" und seiner Sporulationsweise vergleichen könnte, die Stämme Act. violaceorectus und Act. prunicolor. Act. Violaceorectus bildet jedoch auf Stärkeagar ein vegetatives Mycel und ein violettes lösliches Pigment, auf Kartoffelmedium ein vegetatives Mycel und ein lösliches Pigment von rotvioletter Farbe, verwertet Cellulose nicht und reduziert Nitrate nicht, während S. Stimulosus DS 25 556 auf Stärkeagar ein gelbbraunes bis schwärzlich braunes vegetatives Mycel und ein braungraues lösliches Pigment, auf Kartoffel ein orangebraunes bis rötlich braunes vegetatives Mycel und ein schwarzes lösliches Pigment bildet und außerdem Cellulose verwertet und Nitrate stark reduziert. Act. prunicolor verwertet wiederum im Gegensatz zu S. stimulosus DS 25 556 keine Cellulose, reduziert Nitrate nicht und bildet schließlich ein violettes Pigment, das im Agar-Medium nicht löslich ist und demzufolge nicht mit dem durch S. stimulosus DS

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25 556 gebildeten violetten löslichen Pigment vergleichbar ist.

Die Fähigkeit von S.stimulosus DS 25 556, verschiedene Kohlenstoff- und Stickstoffquellen für sein Wachstum zu verwerten, wurde nach dem Prinzip der Methode von Pridham und Gottlieb (J. of Bact. 56 (1948) 107-114) ermittelt. Der Grad des Wachstums wurde auf dem von den Verfassern genannten Grundmedium beobachtet, wobei entweder die Glucose durch die verschiedenen erprobten Kohlenstoffquellen oder das SO (NH.)„ durch die verschiedenen erprobten Stickstoffquellen ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.

Erprobte Kohlen- Verwertung stoffquellen

Erprobte Stickstoffquellen

Verwertung

D-Ribose
D-Xylose
L-Arabinose
L-Rhamnose
D-Glucose

D-Galactose
D-Fructose
D-Mannose
L-Sorbose
Lactose

Waltose

Saccharose

Trehalose

Cellobiose

Raffinose
Dextrin
Inulin
Stärke
Glykogen
Glycerin
Erythrit

negativ

positiv

negativ

positiv

negativ

positiv

negativ

positiv

negativ

positiv

negativ positiv negativ positiv positiv positiv negativ

NaNO₃

NaNO₂

SO₄(NH₄)₂

PO₄H(NH₄)₂

Adenin

Adenosin

Uracil

Harnstoff

L-Asparagin

Glykocoll

Sarcosin

DL-Alanin

DL-Valin

DL-Asparaginsäure

L-Glutarninsäure

L-Arginin

L-Lysin

DL-Serin

DL-Threonin

Taurin

DL-Phenylalanin

positiv

negativ

positiv

negativ

positiv

positiv positiv positiv positiv positiv negativ positiv

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Erprobte Kohlenstoffquellen

Verwertung Erprobte Stick- Verwertung stoffquellen

Adonit	negativ	L-Tyrosin	positiv
Dulcit	Il	DL-Prolin	Il
D-Mannit	11	L-Hydroxyprolin	Il
D-Sorbit	Il	L-Histidin	Il
Inosit	Il	L-Tryptophan	Il
Salicin	positiv	Betain	negativ

Das Verfahren zur Gewinnung von Zellen von Streptomyces stimulosus besteht im wesentlichen darin, daß man Streptomyces stimulosus DS 25 556 (NRRL 5776) in einem Nährmedium unter geeigneten Bedingungen kultiviert und die Zellen, die sich im Verlauf der Züchtung vermehrt haben, abtrennt.

Die Kultivierung von Streptomyces stimulosus DS 25 556 kann nach allen Verfahren der aeroben Oberflächenkultur oder der Submerskultur durchgeführt werden:, jedoch wird die letztgenannte Methode aus Zweckmäßigkeitsgründen bevorzugt. Für dieses Verfahren werden die verschiedenen Apparaturen verwendet, die heute in der Fermentationsindustrie in Gebrauch sind.

Im einzelnen kann der folgende Arbeitsgang für die Durchführung des Verfahrens angewendet werden:

Streptomyces stimulosus DS 25 556 - Vorrat

Φ
Züchtung auf .Agar

Züchtung im Kolben mit Rührer

Züchtung von Impfmaterial im Fermenter

Ψ
Produktionskultivierung im Fermenter

Das Nährmedium muß im wesentlichen eine Quelle von assimilierbarem Stickstoff und assimilierbarem Kohlenstoff, Mineralstoffe, insbesondere Chloride, und gegebenenfalls Wuchsfaktoren enthalten. Alle diese Bestandteile können in Form von wohldefinierten Produkten

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26

oder in komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedener Herkunft findet, zugesetzt werden .

Als Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff können Kohlenhydrate, z.B. Glucose, Maltose, Dextrin, Stärke oder andere kohlenstoffhaltige Stoffe, beispielsweise die Zuckeralkohole (Glycerin) oder gewisse organische Säuren (Milchsäure, Zitronensäure) verwendet werden. Gewisse tierische Öle oder Pflanzenöle, beispielsweise Schmalzöl oder Sojabohnenöl, können vorteilhaft diese verschiedenen Kohlenstoffquellen ersetzen oder sie ergänzen.

Es gibt eine äußerst große Vielzahl geeigneter Quellen von assimilierbarem Stickstoff. Geeignet sind sehr einfache chemische Substanzen, z.B. Mineralsalze oder organische Salze von Ammonium, Harnstoff und gewisse Aminosäuren. Die Stickstoffquellen können auch in Form von komplexen Substanzen, die den Stickstoff hauptsächlich in Form von Eiweißstickstoff enthalten, z.B. Casein, Lactalbumin, Gluten und ihre Hydrolysate, Sojabohnenmehl, Arachidin, Fisch, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Distillers solubles und Getreideinfusionen (insbesondere Maisquellwasser!, zugesetzt werden.

Von den zugesetzten Mineralstoffen können einige, z.B.

die Alkaliphosphate oder Erdalkaliphosphate oder die Calcium- und Magnesiumcarbonate, eine Pufferwirkung oder neutralisierende Wirkung haben. Andere, z.B. die Chloride und Sulfate von Alkali— und Erdalkalimetallen, stellen das für die Entwicklung von Streptomyces stimulosus DS 25 556 notwendige Ionengleichgewicht ein. Schließlich sind gewisse Mineralstoffe speziell -als Aktivatoren der Vermehrung der Zellen wirksam. Dies sind die Salze von Zink, Kobalt, Eisen, Kupfer und Mangan.

Der pH-Wert des Nährmediums zu Beginn der Kultivierung

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muß zwischen 6,0 und 7,8, vorzugsweise wischen 6,5 und 7,8 liegen. Die optimale Temperatur für die Fermentation beträgt 25 bis 30°C, jedoch wird eine befriedigende Produktion bei Temperaturen zwischen 23° und 33°C erzielt. Die Belüftung des Kulturmediums kann innerhalb ziemlich weiter Grenzen variieren. Es wurde jedoch gefunden, daß eine Belüftung mit 0,3 bis 3 1 Luft/1 Kulturmedium pro Minute besonders gut geeignet ist. Die maximale Ausbeute wird nach einer Kultivierungszeit von 2 bis 8 Tagen erreicht. Diese Zeit hängt im wesentlichen vom verwendeten Nährmedium ab.

Die vorstehenden Ausführungen zeigen, daß die allgemeinen Bedingungen der Kultivierung von Streptomyces stimulosus DS 25 556 in einem ziemlich weiten Bereich variieren können und an jede besondere Notwendigkeit angepaßt werden können.

Zellen von Streptomyces stimulosus werden vom Kulturmedium durch Zentrifugieren abgetrennt. Im allgemeinen wird dieser Arbeitsgang kontinuierlich durchgeführt. Die hierbei erhaltenen Zellen können durch aufeinanderfolgende 'Waschbehandlungen mit einem organischen Lösungsmittel, z.B. Methanol, Äthanol oder Äthyläther, oder mit einem Gemisch dieser Lösungsmittel gereinigt werden.

Die Zellen von Streptomyces stimulosus DS 25 556 werden nach üblichen Verfahren, d.h. durch aufeinanderfolgende Waschbehandlungen mit einem organischen Lösungsmittel wie Methylenchlorid, Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff von Lipiden befreit. Im allgemeinen werden die Zellen bei jeder Waschbehandlung in Chloroform 15 bis 35 Stunden bei einer Temperatur von etwa 20°C gerührt. Nach jedem Waschen werden die Zellen filtriert und unter vermindertem Druck bei einer Temperatur zwischen 25 und 45°C getrocknet.

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Die in dieser Weise erhaltenen, von Lipiden befreiten Zellen werden mehreren aufeinanderfolgenden Autolysen bei einer Temperatur von etwa 37°C für eine Dauer von 48 Stunden unterworfen. Es ist besonders vorteilhaft, in Gegenwart eines Mittels zu arbeiten, das parasitäre Fermentationen zu verhindern vermag. Vorzugsweise wird Benzol oder Toluol verwendet.

Jede Autolyse wird unter langsamem Rühren der von Lipiden befreiten, in Wasser suspendierten Zellen durchgeführt. Nach jeder Autolyse wird die klare wäßrige Phase von der festen Phase durch Zentrifugieren abgetrennt. Die anschließende Autolyse wird am Sediment der Zentrifugierung durchgeführt. Im allgemeinen ist es zweckmäßig, zwei bis drei Autolysen durchzuführen.

Die vereinigten klaren wäßrigen Phasen, die die Substanz 34129 RP gemäß der Erfindung enthalten, werden anschliessend durch Filtration durch geeignete Träger so fraktioniert, daß die Produkte mit Molekulargewichten zwischen 2000 und 20.000 nicht gewonnen werden. Für diese Trennung werden Membranen mit geeigneten Poren, z.B. die Membran der Handelsbezeichnung "AMICON UM 20", die die Entfernung von Produkten mit einem Molekulargewicht von mehr als 20.000 ermöglicht, und die Membran "AMICON UM 2", die die Entfernung von Produkten mit einem Molekular-

25 gewicht von weniger als 2000 ermöglicht, verwendet.

Die Ultrafiltration der klaren wäßrigen Phase wird im allgemeinen zuerst mit einer Membran vorgenommen, die die Abtrennung der Produkte von hohem Molekulargewicht ermöglicht. Das erhaltene Retentat wird dann der Ultrafiltration durch eine Membran unterworfen, die die Abtrennung der niedrigmolekularen Produkte ermöglicht. Die Substanz 34129 RP ist im Retentat dieser Ultrafiltration enthalten. Durch Gefriertrocknen dieses Retentats wird die wasserlösliche Substanz 34129 RP gemäß der Erfindung

35 erhalten.

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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1 a) Fermentation

In einen 170 1-Fermenter werden die folgenden Stoffe gegeben:

Pepton 1200 g

Hefeextrakt 600 g

Glucosemonohydrat 1200 g

10 teilhydrolysierte Stärke 2400 g

Stadtwasser zur Auffüllung auf 110 1

Der pH-Wert wird durch Zusatz von 40 ml lOn-Natriumhydroxyd auf 7,30 eingestellt. Das Nährmedium wird sterilisiert, indem man Wasserdampf bei 122⁰C 40 Minuten durchperlen läßt. Nach der Abkühlung hat das Nährmedium auf Grund der Kondensation des Wasserdampfes während der Sterilisation ein Volumen von 120 1 und einen pH-Wert von 7,00. Das Medium wird mit 200 ml einer im Erlenmeyerkolben unter Rühren erhaltenen Kultur von Streptomyces stimulosus DS 25 556 geimpft. Die Kultur wird 23 Stünden bei 30°C unter Rühren und Belüften mit steriler Luft bebrütet. Sie eignet sich dann zum Ansetzen der Produktionskultur.

Die Kultivierung für die Produktion wird in einem 800 1-Fermenter durchgeführt, in den die folgenden Stoffe gegeben werden:

Maisquellwasser (50% Trockensubstanz) 8 kg Sojabohnenöl 6 1

Ammoniumsulfat 0,8 kg

30 Lösung von Kobaltchloridhexahydrat,

Konzentration 20 g/l 0,4 1

Stadtwasser zur Auffüllung auf 360 1 Der pH-Wert wird durch Zusatz von 600 ml lOn-Natrium-

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hydroxyd auf 6,40 eingestellt, worauf 2 kg Calciumcarbonat zugesetzt werden. Das Nährmedium hat nun einen pH-Wert von 6,50. Es wird sterilisiert, indem Wasserdampf bei 122°C 40 Minuten durchgeleitet wird. Nach der Abkühlung hat das Nährmedium auf Grund der Kondensation des Wasserdampfes während der Sterilisation ein Volumen von 390 1. Es wird durch Zusatz von 10 1 einer sterilen wässrigen Lösung, die 4 kg Glucosemonohydrat enthält, auf 400 1 aufgefüllt. Das Medium hat nun einen pH-Wert von 7,00. Es wird mit 40 1 der im vorstehend beschriebenen 170 1-Fermenter erhaltenen Impfkultur geimpft. Die Kultivierung wird 71 Stunden bei 27°C unter Rühren mit einem Turbinenrührer bei 205 UpM und Belüften mit steriler Luft in einer Menge von 20 m /Std. durchgeführt.

Das Kulturmedium hat nun einen pH-Wert von 7,45 und ein Volumen von 380 1.

b) Isolierung der Zellen

100 1 des in der beschriebenen Weise erhaltenen Kulturmediums werden zur Abtrennung der Zellen kontinuierlich zentrifugiert. Hierbei werden 6,4 kg feuchte Zellen erhalten. Die Zellpaste wird mit 20 1 Äthanol verdünnt. Das unlösliche Produkt wird durch Zentrifugieren isoliert. Hierbei werden 2,4 kg feuchte Zellen erhalten, die in einem Gemisch von 7 1 Äthanol und 7 1 Äthyläther aufgenommen werden. Die Suspension wird 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 20⁰C stehen gelassen. Die unlöslichen Bestandteile werden durch Zentrifugieren abgetrennt und dann unter vermindertem Druck bei 35°C getrocknet. In dieser Weise werden 852 g Zellen von

30 Streptomyces stimulosus DS 25 556 isoliert.

c) Abtrennung der Lipide aus den Zellen

750 g getrocknete Zellen von Streptomyces stimulosus

D'25 556 werden in 6 1 Chloroform suspendiert und

Stunden bei einer Temperatur von etwa 20°C gerührt.

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Nach dem Abnutschen auf dem mit Filterpapier versehenen Büchnertrichter wird das Chloroform entfernt. Die Zellen werden anschließend dreimal in der vorstehend beschriebenen Weise behandelt. Die isolierten Zellen werden unter vermindertem Druck (6,65 mbar) bei 35°C getrocknet. Hierbei werden 690 g Zellen von Streptomyces stimulosus DS 25 556, die von Lipiden befreit sind, erhalten.

d) Autolyse der Zellen

30 g der in der beschriebenen Weise von Lipiden befreiten Zellen werden in 500 ml Kasser, das 0,5 ml Toluol enthält, suspendiert. Die Suspension wird 48 Stunden bei 37°C gerührt und dann 30 Minuten bei 15.000 g zentrifugiert. Der Überstand wird für die Nachbehandlung isoliert. Das Sediment wird erneut in 500 ml Wasser und 0,5 ml Toluol suspendiert. Die Suspension wird 48 Stunden bei 37°C gerührt. Der Überstand wird wie vorher isoliert und das Sediment ein drittes Mal der Autolyse unter den gleichen Bedingungen unterworfen, wobei ein dritter Überstand isoliert wird. Die erhaltenen drei Überstände werden nach dem gleichen Prozeß nachbehandelt und können insgesamt oder getrennt verwendet werden.

e) Ultrafiltration

300 ml des in der beschriebenen Weise erhaltenen Überstandes werden der Ultrafiltration durch die Membran der Handelsbezeichnung "AMICON UM 20" unterworfen. Die Lösung wird zunächst auf etwa 100 ml eingeengt und dann gegen 500 ml Wasser dialysiert, wobei das Volumen konstant bei 100 ml gehalten wird. Das erhaltene Retentat wird entfernt und das Permeat der Ultrafiltration durch eine Membran "AMICON UM 2" unterworfen und dann zunächst auf etwa 100 ml eingeengt und anschließend gegen 1000 ml Wasser dialysiert, wobei das Volumen konstant bei 100 ml gehalten wird.

Das Permeat wird entfernt und der Rückstand gefrier-

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getrocknet. Hierbei werden 155 mg der wasserlöslichen Substanz 34129 RP mit folgenden Kennzahlen erhalten:

E lernentaranaIyse:

C 40,4-41,4%; H 6,7-6,9%; N 8,0 - 10,6%.

5 Zusammensetzung:

a) nach Aminosäuren: Alanin ( 5 bis 7%), Glutaminsäure (7 bis 10%), Glycin (2,5 bis 4%), α ,oc-Diaminopimelinsäure (5 bis 8%);

b) nach Aminozuckern: N-Acetylglucosamin (5 bis 10%), Muramsäure (5 bis 10%).

Die Erfindung umfaßt ferner Arzneimittelzubereitungen, die als Wirkstoff die wasserlösliche Substanz 34129 RP in Kombination mit einem oder mehreren verträglichen und pharmazeutisch unbedenklichen Trägern oder Hilfsstoffen und/oder einem oder mehreren Produkten, die selbst therapeutisch wirksam sind, z.B. Antibiotika, enthalten. Diese Arzneimittel werden vorzugsweise oral, parenteral, intranasal oder rektal verabreicht.

Als feste Arzneimittel für die orale Verabreichung können Tabletten, Pillen, Pulver oder Granulat verwendet werden. In diesen Zubereitungen ist der Wirkstoff gemäß der Erfindung mit einem oder mehreren inerten Streckmitteln, z.B. Saccharose, Lactose oder Stärke, gemischt. Diese Zubereitungen können außer· den Streckmitteln auch andere Substanzen, z.B. ein Gleitmittel wie Magnesiumstearat, enthalten

Als flüssige Zubereitungen für die orale Verabreichung können pharmazeutisch unbedenkliche Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe oder Elixiere, die inerte Verdünnungsmittel wie Wasser oder Paraffinöl enthalten, verwendet werden. Diese Zubereitungen können außer den Verdünnungsmitteln weitere Substanzen wie Netzmittel, Süßungsmittel oder aromatisierende Mittel enthalten.

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Als Zubereitungen für die parenterale Verabreichung eignen sich sterile wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Als Träger können in diesen Fällen PoIyäthylenglykol-, Propylenglykol, Pflanzenöle, insbesondere Olivenöl, und injizierbare organische Ester, z.B. Äthyl— oleat, verwendet werden. Diese Zubereitungen können ebenfalls Hilfsstoffe, insbesondere Netzmittel, Emulgatoren oder Dispersionsmittel, enthalten.

Die Sterilisation kann in verschiedener Weise erfolgen, beispielsweise mit Hilfe eines bakteriologischen Filters, durch Zusatz von Sterilisationsmitteln zu der Zubereitung oder durch Erhitzen. Die Zubereitungen können auch ' in Form von festen Präparaten hergestellt werden, die durch Bestrahlung (ß-Strahlen) sterilisiert worden sind und gegebenenfalls zum Zeitpunkt des Gebrauchs in sterilem Wasser gelöst oder in beliebigen anderen injizierbaren sterilen Medien dispergiert werden können.

Als Zubereitungen für die intranasale Verabreichung kommen sterile wässrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen in Frage, die gegebenenfalls mit einem verträglichen Treibmittel kombiniert sind.

Die Zubereitungen für die rektale Verabreichung sind Suppositorien, die außer dem Wirkstoff Hilfsstoffe wie Kakaobutter oder das unter der Bezeichnung "Suppo-cire" bekannte Produkt, enthalten können.

Die Arzneimittelzubereitungen gemäß der Erfindung sind besonders wertvoll in der Humanmedizin oder Veterinärmedizin zur Steigerung der Widerstandsfähigkeit gegenüber Infektionen durch Bakterien, Pilze, Parasiten oder Viren gegebenenfalls in Kombination mit einem speziellen Chemotherapeutikum, zur Verstärkung der natürlichen Abwehrkräfte des Organismus, um die Gesundung zu fördern oder zu beschleunigen, und, durch örtliche Anwendung (intranasal oder oral), zur Verstärkung der Sperren

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gegen Infektionen der Atmungswege und des Verdauungstrakts .

Die Arzneimittel sind ferner in der Lage, die ausreichenden immunologischen Reaktionen bei Personen mit angeborener oder durch Seneszenz oder Behandlungen zur Unterdrückung der Immunreaktion erworbener mangelnder Immunität wiederherzustellen.

Die Arzneimittel gemäß der Erfindung können ferner in der Immuntherapie des Krebses und der Leukämie in Kombination mit einem geeigneten krebshemmenden Chemotherapeutikum oder im Verlauf der durch das letztere ausgelösten Remissionsphase verwendet werden.

Die Arzneimittel gemäß der Erfindung finden ferner Anwendung als Adjuvans (Verstärkung der Immunreaktion) im Falle von speziellen Impfungen gegen infektiöse Mittel oder Tumorzellen.

In der Humanmedizin hängt die Dosis von der gewünschten Wirkung ab. Sie kann für den Erwachsenen zwischen 10 und 500 mg pro Tag liegen.

Das folgende Beispiel veranschaulicht eine Arzneitmittelzubereitung gemäß der Erfindung.

Beispiel 2

Nach dem üblichen Verfahren wird eine Lösung für die intravenöse Injektion mit folgender Zusammensetzung 25 hergestellt:

Wasserlösliche Substanz 34129 RP 50 mg Injizierbares Lösungsmittel 5 ml

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Claims

I)J Wasserlösliche Substanz, die die Bezeichnung 34129 RP hat, immunitätssteigernde (irnmunostimulierende)Eigenschaf ten aufweist, aus Zellen von Streptomyces stimulosus DS 25556 (NRRL 5776) extrahiert und durch die folgenden Merkmale gekennzeichnet ist:

Aussehen: cremefarbiges amorphes Pulver (nach Gefriertrocknung) ;

Zusammensetzung:

a) nach Aminosäuren: Alanin (5 bis 7%), Glutaminsäure (7 bis 10%), Glycin (2,5 bis 4%), α,α-Diaminopimelinsäure (5 bis 8%';

b) nach Aminozuckern: N-Acetylglucosamin (5 bis 10%), Muramsäure (5 bis 10%);

ElernentaranaIyse:

C 40,4 bis 41,1%, H 6,7 bis 6,9%, N 8,0 bis 10,6%;

Infrarotspektrum: charakteristische Hauptabsorptionsbanden bei 3400, 3300, 3100, 2970, 2950, 2880, 2600, 2060, 1650, 1590, 1450, 1400, 1320, '1260, 1140, 1115, 1075, 1040, 975, 910, 855, 770, 720 und 690 cm"¹.
2) Verfahren zur Herstellung der Substanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man von Lipiden befreite Zellen von Streptomyces stimulosus DS 25556 (NRRL 5776) wiederholten Autolysen unterwirft, anschließend den wasserlöslichen Teil durch Ultrafiltration fraktioniert und hierbei Substanzen erhält, deren Molekulargewicht zwischen 2000 und 20.000 liegt, und die hierbei erhaltene wasserlösliche Substanz 34129 RP nach Gefriertrocknung ihrer Lösung isoliert.
3) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die von Lipiden befreiten Zellen von Streptomyces

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ORtGINAL INSPECTED

stimulosus DS 25556 drei aufeinanderfolgenden Autolysen unterwirft, wobei man in Wasser bei einer Temperatur von etwa 37⁰C gegebenenfalls in Gegenwart eines Inhibitors von parasitären Fermentationen arbeitet.
4) Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die aus den Autolysenphasen stammenden klaren wässrigen Phasen einer Ultrafiltration zunächst durch eine Membran, die die Entfernung von Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 20.000 ermöglicht, und dann durch eine Membran, die die Entfernung von Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 2000 ermöglicht, unterwirft.
5) Für die Human- und Veterinärmedizin geeignete Arzneimittelzubereitung, enthaltend die Substanz 34129 RP gemäß Anspruch 1 in Kombination mit einem oder mehreren verträglichen Verdünnungsmitteln oder Hilfsstoffen und gegebenenfalls einem oder mehreren Produkten, die selbst therapeutisch wirksam sind.

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