KR101432336B1 - 뮤탄스 연쇄상구균에 의해 유발된 우식증의 예방 및/또는 치료를 위한 용도 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스트렙토코커스 뮤탄스 이외의 뮤탄스 연쇄상구균에 의해 유발된 우식증의 치료 또는 예방용 항우식성 조성물의 제조를 위한, 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하며, 여기서 특이적 결합은 (i) 열 처리에 내성이고/거나; (ii) 프로테아제 처리에 내성이고/거나; (iii) 칼슘-의존적이고/거나; (iv) 4.5 내지 8.5의 pH 범위 내에서 형성되고/거나; (v) 타액의 존재하에 형성되는 것인, 젖산균 군에 속한 미생물 또는 이들의 돌연변이체 또는 유도체의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 특이적 결합은 아래와 같이 검정될 수 있다: (a) 상기 미생물을 정지기로 성장시키고; (b) 정지기로 성장된 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균과 상기 미생물을 혼합하고; (c) 상기 미생물 및 뮤탄스 연쇄상구균 군의 세균의 응집체를 형성시키는 조건하에, 단계 (b)에서 얻은 혼합물을 인큐베이션하고; (d) 펠렛의 발생에 의해 응집체를 검출한다. 본 발명의 다른 측면은 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 젖산균 군에 속한 미생물 또는 상기 미생물의 돌연변이체, 유도체, 유사체 또는 단편을 투여하는 것을 포함하는, 스트렙토코커스 뮤탄스 이외의 뮤탄스 연쇄상구균에 의해 유발된 우식증의 예방 또는 치료 방법이다.

젖산균, 스트렙토코커스 뮤탄스, 뮤탄스 연쇄상구균, 우식증

Description

뮤탄스 연쇄상구균에 의해 유발된 우식증의 예방 및/또는 치료를 위한 용도 및 방법 {USES AND METHODS FOR PREVENTING AND/OR TREATING CARIES CAUSED BY MUTANTS STREPTOCOCCI}

본 발명은 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하며, 여기서 특이적 결합은 (i) 열 처리에 내성이고/거나; (ii) 프로테아제 처리에 내성이고/거나; (iii) 칼슘-의존적이고/거나; (iv) 4.5 내지 8.5의 pH 범위 내에서 형성되고/거나; (v) 타액의 존재하에 형성되는 것인, 젖산균 군에 속한 미생물 또는 이들의 돌연변이체 또는 유도체의 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 이외의 뮤탄스 연쇄상구균에 의해 유발된 우식증의 치료 또는 예방용 항우식성 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.

바람직하게는, 특이적 결합은 아래와 같이 검정될 수 있다:

(a) 상기 미생물을 정지기로 성장시키고;

(b) 정지기로 성장된 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균과 상기 미생물을 혼합하고;

(c) 상기 미생물 및 뮤탄스 연쇄상구균 군의 세균의 응집체를 형성시키는 조건하에, 단계 (b)에서 얻은 혼합물을 인큐베이션하고;

(d) 펠렛의 발생에 의해 응집체를 검출한다.

본 발명의 다른 측면은 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 젖산균 군에 속한 미생물 또는 상기 미생물의 돌연변이체, 유도체, 유사체 또는 단편을 투여하는 것을 포함하는, 스트렙토코커스 뮤탄스 이외의 뮤탄스 연쇄상구균에 의해 유발된 우식증의 예방 또는 치료 방법이다.

뮤탄스 연쇄상구균은 첫니가 난 후에 숙주에서 콜로니를 형성한다 (문헌 [Carlson et al., Caries Res. 9 (1975), 333-339]). 이는 치아 표면에 집중되고, 플라크에서의 그의 존재량은 초기 병소에 걸쳐 가장 많다 (문헌 [Duchin and van Houte Arch. Biol. Biol. 23 (1978) 779-786]). 플라크 내의 콜로니형성의 그의 수준은 수크로스 소비에 의해 증가된다 (문헌 [Staat et al., J. Dent. Res. 54 (1975) 872-880]). 이는 치아로의 그의 부착을 촉진하는 수크로스로부터 특정 거대분자를 합성할 수 있다 (문헌 [Tanzer et al., Infect. Immun. 10 (1974) 197-203]). 뮤탄스 연쇄상구균은 수크로스를 포함한 간단한 탄수화물로부터의 산의 신속 생성자이고, 낮은 pH에서 견딘다 (문헌 [Edwardsson. Arch. Biol. 13 (1968) 637-646]). 나아가, 이는 초기 및 확립된 우식증 병소 부위의 배양시 본질적으로 항상 회복된다 (문헌 [Littleton et al., Arch. Oral. Biol. 15 (1979) 461-463]). 이에 대한 관심은 단일-감염된 노토비오트를 포함한 다양한 실험 동물에서 그의 강력한 유도 및 우식증 병소의 진행의 증명후 증가되었다. 그의 균력 발현은 탄수화물, 특히 수크로스의 소비와 강하게 관련되어 있다.

젖산균 또는 방선균과 같은 우식증 발병과 관련된 추가 세균 종의 역할은 확실하지 않다. 이들 세균은 종종 우식증 병소에서 발견되나, 뮤탄스 연쇄상구균과 관련되어서만 발견된다. 현재 지식에 따라, 뮤탄스 연쇄상구균의 존재는 우식생성의 필요 불가결한 조건이다 (문헌 [Tanzer et al., J. Dent. Educ. 65 (2001) 1028-1037]). 뮤탄스 연쇄상구균 군은 적어도 스트렙토코커스 뮤탄스, 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 스트렙토코커스 크리세투스(Streptococcus cricetus), 스트렙토코커스 라티(Streptococcus ratti), 스트렙토코커스 페루스(Streptococcus ferus) 및 스트렙토코커스 마카카에(Streptococcus macacae)를 포함하는 것으로 정의되었다 (문헌 [Loesche et al., Microbio. Rev. 50 (4) (1986) 353-380]). 스트렙토코커스 뮤탄스가 인간에서 뮤탄스 연쇄상구균의 가장 풍부한 대표라는 사실로 인해, 대부분의 미생물학적 우식증 연구 뿐만 아니라 항-우식성 수단은 이 특정 종에 집중한다.

치아 표면으로의 스트렙토코커스 뮤탄스의 초기 결합은 두가지 메카니즘을 통해 발생한다. 첫번째 메카니즘은 연쇄상구균 항원 I/II (SA I/II) (또한 동의어 B, IF, P1, SR, MSL-1 또는 PAc로 공지된 표면 단백질)를 통한 펠리클 (치아 표면 상의 타액 단백질 층)로의 스트렙토코커스 뮤탄스의 결합이다. 이 단백질에 대한 항체는 스트렙토코커스 뮤탄스의 시험관내 접착을 방지하는 것으로 나타났다.

따라서, 연쇄상구균 항원 I/II (SA I/II)는 예방접종에 대한 표적이다. 상이한 재조합 조합물 (완전 항원, 타액 결합 영역, 콜레라 독소에 커플링하거나 비병원성 살모넬라(Salmonella) 균주의 표면 상에서 발현되는 단백질)에서, 동물의 성공적인 면역화가 나타났다. 이는 높은 IgA 역가 및 스트렙토코커스 뮤탄스 콜로니형성의 감소를 야기하였다 (문헌 [Huang et al., Infect. Immun. 69 (2001), 2154-2161]). SA I/II를 코딩하는 DNA-백신을 이용하여 동등한 결과를 달성하였다 (문헌 [Fan et al., J. Dent. Res. 81 (2002), 784 - 787]). 젖산균 표면 상에서 항-SA I/II 항체의 재조합 발현에 의해 수동적 면역성이 달성되었다. 이들 락토바실리는 스트렙토코커스 뮤탄스를 응집시키고, 래트로의 세균의 투여는 우식증 발생의 감소를 야기하였다 (문헌 [Krueger et al., Nature Biotechnology 20 (2002), 702 - 706]).

제WO 06/027265호는 치아로의 접착을 억제하기 위한 목적으로 스트렙토코커스 뮤탄스에 결합할 수 있는 젖산균을 제공한다.

연쇄상구균 항원의 가장 중요한 결합 파트너는 스캐빈저 수용체 시스테인-풍부 거대족으로부터의 폐 당단백질 gp-340과 유사한 단백질인 타액 응집소이다 (문헌 [Prakobphol et al., J. Biol. Chem. 275 (2000) 39860-39866]).

우식생성에서의 응집소의 역할은 완전히 이해되지 않았다. 이는 표면에 결합된 스트렙토코커스 뮤탄스 (존재하는 경우)의 접착을 야기할 수 있고, 가용성 상태의 스트렙토코커스 뮤탄스 (존재하는 경우)의 응집을 야기할 수 있다. 후자는 타액 흐름에 의해 입으로부터 응집된 스트렙토코커스 뮤탄스의 제거를 야기할 수 있다. 타액 중 고농도의 응집소는 스트렙토코커스 뮤탄스의 시험관내 접착의 증가를 야기하는 반면, 생체내에서 타액 중 응집소 농도와 우식증에 대한 위험 간의 명확한 상관관계는 존재하지 않는다 (문헌 [Stenudd et al., J. Dent. Res. 80 (2001), 2005-2010]). 응집소에 대한 모노클로날 항체는 타액-코팅된 히드록시아파타이트로의 스트렙토코커스 뮤탄스의 시험관내 결합을 완전히 차단하고, 응집소 의존적 응집을 방지한다 (문헌 [Carlen und Olsson, J. Dent. Res. 74 (1995), 1040-1047]; [Carlen et al., J. Dent. Res. 77 (1998), 81-90]). 문헌 [Brady et al., Infect. Immun. 60 (1992), 1008-1017]은 표면 접착 및 응집이 상이한 항체에 의해 독립적으로 억제될 수 있다는 것을 나타내었다. 이는 응집소의 상이한 에피토프가 이들 두 효과의 원인이 된다는 것을 나타낸다.

우식증의 발생과 종종 연관된 다른 타액 단백질은 프롤린-풍부 단백질 (PRP)이다. 그러나, 우식원성 세균의 접착에서의 이들 단백질의 역할은 논쟁의 대상이 된다. 이들 단백질은 2개의 유전자좌 (PRH-1 및 PRH-2)에 의해 코딩되고, 오직 수개의 아미노산만이 다른 상이한 변이체 (PRP-1, PRP-2, PIF, Db-이중 밴드)에서 발생한다. 이들 변이체는 단백질분해로 절단되어, 소위 작은 PRP (PRP-3, PRP-4. PIF-f 및 Db-f)를 야기할 수 있다. PRP는 악티노미세스 나에슬룬디이(Actinomyces naeslundii) 또는 비-뮤탄스 연쇄상구균과 같은 공생생물의 강한 결합을 매개한다. 흥미롭게, 이 결합은 치아 표면으로의 단백질의 접착 후에만 생성되며, 이는 결합 부위를 접근가능하게 하는 형태 이동을 야기한다. 스트렙토코커스 뮤탄스는 오직 약하게 결합된다. PRP-변이체 Db는 스트렙토코커스 뮤탄스의 효과적인 결합과 관련이 있다. Db의 고농도는 스트렙토코커스 뮤탄스의 강한 접착 및 강한 우식증 발생과 상관관계가 있다. 총 PRP 고농도의 PRP-Db의 감소된 부분은 낮은 우식증 발생과 상관관계가 있다 (문헌 [Stenudd et al., J. Dent. Res. 80 (2001), 2005- 2010]). 스트렙토코커스 뮤탄스가 PRP에 직접 결합하는가는 공지되어 있지 않다.

스트렙토코커스 뮤탄스가 치아 표면에 접착하는 두번째 방법은 수크로스 의존적 접착을 통한 것이다. 스트렙토코커스 뮤탄스는 당 폴리머 글루칸을 합성할 수 있는 3종의 상이한 글리코실트랜스퍼라제 (GTF)를 발현한다. 글루칸은 수용성 형태 (1-6 글리코시드 연결) 및 뮤탄이라고 불리는 불용성 형태 (1-3 글리코시드 연결)로 존재한다. 뮤탄은 구강 세균 또는 타액에 있는 효소에 의해 분해될 수 없다. 이는 스트렙토코커스 뮤탄스의 수크로스 의존적 접착을 기초로 하는 치아 플라크내 점착성 매트릭스를 형성한다. 뮤탄 형성의 원인인 우세한 효소인 글리코실트랜스퍼라제 GTFB 및 GTFC는 스트렙토코커스 뮤탄스의 세포 표면 상에 위치한다. 대조적으로, 글리코실트랜스퍼라제 GTFD는 가용성 글루칸을 합성하고, 스트렙토코커스 뮤탄스에 의해 분비된다. 스트렙토코커스 뮤탄스의 GTF 결핍된 돌연변이체를 사용하는 실험은 3종의 효소 모두의 상호작용이 수크로스 의존적 접착에 필수적이라는 것을 나타낸다 (문헌 [Ooshima et al., J. Dent. Res. 80 (2001), 1672-1677]). 글리코실트랜스퍼라제는 N-말단 수크로스 결합 부위 및 C-말단 글루칸 결합 부위를 갖는다. 효소에 대한 항체 또는 글루칸 결합 부위에 대한 항체는 스트렙토코커스 뮤탄스의 수크로스 의존적 접착의 억제를 초래한다. 항체를 이용하여 N-말단 수크로스 결합 부위를 차단하는 것은 가능하지 않았다 (문헌 [Yu et al., Infect. Immun. 65 (1997), 2292-2298]).

글리코실트랜스퍼라제의 억제, 이어서 스트렙토코커스 뮤탄스의 감소된 접착은 또한 몇몇 플라보노이드 또는 테르페노이드 (제US 2004/0057908호) 또는 프로폴 리스 추출물 (문헌 [Duarte et al., Biol. Pharmacol. Bull. 26 (2003), 527 - 531])에 의해 달성될 수 있다.

S11이라고 명명된 젖산균은 시험관내에서 뮤탄 형성을 감소시켜, 스트렙토코커스 뮤탄스의 접착을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 상기 기재된 바와 같이, 뮤탄 형성은 스트렙토코커스 뮤탄스가 치아 표면에 접착하는데 필수적이다. 따라서, 문헌 [Chung et al. (Oral Microbiol. Immunol. 19 (2004), 214 - 216)]은 뮤탄 형성을 감소시키는 균주 S11의 젖산균과 인큐베이션하는 경우 스트렙토코커스 뮤탄스 세포가 박리된다는 것을 밝혀내었다. 뮤탄으로의 스트렙토코커스 뮤탄스의 결합은 세균 결합 단백질 (글루칸 결합 단백질)을 통해 발생한다. 이 결합의 정확한 메카니즘은 결정되어야 한다 (문헌 [Sato et al., Infect. Immun. 65 (1997), 668-675]).

진균 트리코데르마 하르지아눔(Trichoderma harzianum) 및 페니실리움 푸르푸로게눔(Penicillium purpurogenum)은 상동성 알파-1,3-글루카나제를 생성한다 (문헌 [Fuglsanq et al., J. Biol. Chem. 275 (2000), 2009-2018]). 글루칸 생성 및 플라크 형성에 대해 효과적인 엔테로코쿠스(Enterococcus), 락토바실러스(Lactobacillus) 및 락토코쿠스(Lactococcus) 종의 사용은 기재되어 있다 (제US 6,036,952호). 작용 메카니즘은 해명되어야 한다.

우식증을 억제하기 위한 추가 접근법은 플라크에서의 낮은 pH를 중화시키는 것이다. 우레아 및 아르기닌은 타액의 성분이다. 우레아는 우식증이 없는 사람과 우식증이 있는 사람 간에 주요 차이 없이 3 내지 10 mmol/L의 농도로 존재한다. 유리 아르기닌의 농도는 4 내지 40 μmol/L로 다양하다. 우식증이 없는 개인은 우식증이 있는 사람보다 더 높은 평균의 타액 중 유리 아르기닌 농도를 갖는다 (문헌 [van Wuyckhuyse et al., J. Dent. Res. 74 (1995), 686-690]).

스트렙토코커스 상기스(Streptococcus sanguis) 및 악티노미세스 나에슬룬디이와 같은 몇몇 플라크 세균은 우레아 또는 아르기닌을 절단하여, 암모니아의 형성을 초래할 수 있다. 알칼리성 암모늄은 플라크의 pH를 상승시켜, 우식증을 감소시킨다 (문헌 [Curran et al., Appl. Environm. Microbiol. 61 (1995), 4494-4496]; [Morou-Bermudez and Burne. Infect. Immun. 68 (2000), 6670-6676]). 따라서, 이들 세균은 우식증 치료를 위해 사용되는 것으로 제안된다. 우식증 치료를 위해 제안된 다른 접근법은 PRP-1 및 PRP-3의 단백질분해에 의해, 스트렙토코커스 상기스, 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis) 및 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis)와 같은 구강 세균에 의해 추가로 단백질분해 후 플라크에서 더 높은 pH를 야기할 수 있는 아르기닌 풍부 펩티드를 생성하는 것이다. 이들 펩티드의 재조합 변이체의 적용에 의해, pH의 수크로스 의존적 감소는 억제된다 (문헌 [Li et al., Infect. Immun. 68 (2000), 5425-5429]). 또한, 수크로스 섭취후 우레아 함유 추잉검을 사용함으로써 pH의 강하가 억제될 수 있으며, 따라서 예를 들어, 스트렙토코커스 뮤탄스가 우식증에 많이 기여할 수 없다고 기재되어 있다.

그러나, 상기로부터 입증된 바와 같이, 선행기술은 스트렙토코커스 뮤탄스에 대해 지시된 항-우식성 수단에 집중한다. 우식생성에서의 가능한 역할에도 불구하 고, 스트렙토코커스 뮤탄스 이외의 뮤탄스 연쇄상구균을 표적으로 하는 수단은 기재되어 있지 않다. 그러므로, 상기 언급된 바람직한 기준을 실행하고, 스트렙토코커스 뮤탄스 이외의 세균에 의해 유발된 우식증의 예방 및/또는 치료에 유용한 방법 및 수단에 대한 필요성이 존재한다.

따라서, 본 발명의 기초를 이루는 기술적 문제점은 상기 기재된 필요성과 일치한다. 상기 기술적 문제점에 대한 해결책은 청구항에서 특징화된 바와 같은 실시양태를 제공함으로써 달성된다.

따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하며, 여기서 특이적 결합은 (i) 열 처리에 내성이고/거나; (ii) 프로테아제 처리에 내성이고/거나; (iii) 칼슘-의존적이고/거나; (iv) 4.5 내지 8.5의 pH 범위 내에서 형성되고/거나; (v) 타액의 존재하에 형성되는 것인, 젖산균 군에 속한 미생물 또는 이들의 돌연변이체 또는 유도체의 스트렙토코커스 뮤탄스 이외의 뮤탄스 연쇄상구균에 의해 유발된 우식증의 치료 또는 예방용 항우식성 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.

바람직하게는, 특이적 결합은 아래와 같이 검정될 수 있다:

(a) 상기 미생물을 정지기로 성장시키고;

(b) 정지기로 성장된 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균과 상기 미생물을 혼합하고;

(c) 상기 미생물 및 뮤탄스 연쇄상구균 군의 세균의 응집체를 형성시키는 조건하에, 단계 (b)에서 얻은 혼합물을 인큐베이션하고;

(d) 펠렛의 발생에 의해 응집체를 검출한다.

바람직한 실시양태에서, 이러한 검정법에서 사용되는 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균은 스트렙토코커스 뮤탄스이다.

특이적 결합은 바람직하게는 하기 실시예 4에 기재된 바와 같이 검정된다. 구체적으로, 하기 실시예 4에 기재된 바와 같은 뮤탄스 연쇄상구균의 펠렛화 응집 검정법에 대해, 젖산균 군에 속한 미생물을 바람직하게는 뮤탄스 연쇄상구균과 3:1 내지 60:1 (뮤탄스 연쇄상구균:락토바실리)의 부피비로 혼합한다. 젖산균 및 뮤탄스 연쇄상구균을 실시예 1에 기재된 바와 같이 정지기로 성장시킨다. 바람직하게는, 광학 밀도를 600 nm의 파장에서 광학측정으로 측정한다. 언급된 비는 1:50 내지 1:2.5의 콜로니 형성 단위의 비에 상응한다. 바람직하게는, 1 ml 중 OD₆₀₀ = 1은 뮤탄스 연쇄상구균의 콜로니 형성 단위 3 × 10⁸개와 상관관계가 있다. 바람직하게는, 1 ml 중 OD₆₀₀ = 1은 하기 기재된 락토바실리의 콜로니 형성 단위 7 × 10⁹개와 상관관계가 있다. 바람직하게는, 펠렛화에 의해 응집 반응을 검정하기 위해, 세균을 15 ml 팔콘 튜브에서 부피 2 ml에 둔다. 필요하다면, 최종 부피를 2 ml로 유지시키면서 상기 언급된 부피비를 얻기 위해 배양 현탁액을 PBS-완충액으로 희석시킨다. 바람직하게는, 혼합물을 약 15초 동안 볼텍싱한 후, 5, 10, 15분 이상 및 보다 바람직하게는 20분 이상 동안 실온, 즉 16℃ 내지 25℃의 임의의 온도에서 교란되지 않은 상태로 둔다. 응집은 현탁액의 즉시 탁도로서 육안으로 확인가능하고, 20분 이상 후, 응집은 육안으로 확인가능한 펠렛으로서 침강하는 응집체에 의해 육안으로 확인가능한 반면 (예시적으로 도 1에 나타냄, 왼쪽 팔콘 튜브), 비-뮤탄스 연쇄상구균 응집 혼합물은 현탁액에 남는다 (예시적으로 도 1에 나타냄, 오른쪽 팔콘 튜브). 대조군으로서, 젖산균 및 뮤탄스 연쇄상구균 균주 각각의 자가-응집은 뮤탄스 연쇄상구균 또는 젖산균을 생략함으로써 검정할 수 있다.

상기 기재된 검정법에 따른 락토바실러스 및 뮤탄스 연쇄상구균의 응집은 형성된 응집체를 원심분리 (예를 들어 500 x g에서 30초 동안)에 의해 분리함으로써 정량될 수 있다. 후속적으로, 응집의 양은 상등액에 남은 응집되지 않은 세포의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다. 결정은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 결정은 특정 부피의 상등액, 예를 들어 1 ml를 제거함으로써 수행된다. 후속적으로, 제거된 상등액의 광학 밀도는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 파장, 예를 들어 600 nm에서 측정될 수 있다. 락토바실리 없이 상응하는 대조군 시험의 값을 공제한 후 측정된 값은 응집되지 않은 세포의 양을 나타낸다.

대안으로, 자가-응집의 가능한 문제점을 해결하기 위해, 염색, 바람직하게는 형광 염색이 사용될 수 있다. 따라서, 보다 바람직한 실시양태에서, 특이적 결합은 아래와 같이 검정될 수 있다:

(a) 상기 미생물을 정지기로 성장시키고;

(b) 정지기로 성장되고 적합한 염색, 바람직하게는 형광 염색약을 사용하여 염색된 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균과 상기 미생물을 혼합하고;

(c) 상기 미생물 및 뮤탄스 연쇄상구균 군의 세균의 응집체를 형성시키는 조건하에, 단계 (b)에서 얻은 혼합물을 인큐베이션하고;

(d) 염색, 바람직하게는 형광 염색의 검출에 의해 응집체를 검출한다.

다시, 바람직한 실시양태에서, 이러한 검정법에서 사용되는 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균은 스트렙토코커스 뮤탄스이다. 바람직하게는, 이러한 응집 검정법은 하기 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 구체적으로, 하기 실시예 5에 기재된 바와 같은 뮤탄스 연쇄상구균의 응집 검정법을 위해, 젖산균 및 뮤탄스 연쇄상구균을 실시예 1에 기재된 바와 같이 정지기로 성장시킨다. 바람직하게는, 광학 밀도는 광학측정으로 600 nm의 파장에서 측정한다. 바람직하게는, 1 ml 중 OD₆₀₀ = 1은 뮤탄스 연쇄상구균의 콜로니 형성 단위 3 × 10⁸개와 상관관계가 있다. 바람직하게는, 1 ml 중 OD₆₀₀ = 1은 하기 기재된 락토바실리의 콜로니 형성 단위 7 × 10⁹개와 상관관계가 있다. 후속적으로, 뮤탄스 연쇄상구균을 염색한다. 추가 바람직한 실시양태에서, 락토바실리는 염색되나, 연쇄상구균은 염색되지 않는다. 염색약으로서 임의의 적합한 염색약을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 당업자에게 공지된 형광 염색약을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 특이적 또는 비특이적 형광 염색약, 예를 들어 CFDA-SE를 사용할 수 있다. 특이적으로, 세포를 예를 들어 원심분리에 의해, 바람직하게는 3200 x g에서 5분 동안 원심분리에 의해 수확한다. 후속적으로, 수득된 펠렛을 당업자에게 공지된 임의의 적합한 완충액, 바람직하게는 PBS-완충액에서 재현탁할 수 있다. 완충액의 양은 얻어진 현탁액이 예를 들어, 4.2/ml의 OD₆₀₀을 갖도록 계산할 수 있다. 후속적으로, 현탁액을 적합한 염색약, 예를 들어 형광 염색약, 바람직하게는 5,6-카르복시플루오레세인 디아세테이트, 숙신이미딜 에스테르 (CFDA-SE)와, 보다 바람직하게는 CFDA-SE 용액 (인비트로젠(Invitrogen)) 2 ㎕와 혼합할 수 있다. 후속적으로, 세포를 당업자에게 공지된 적합한 시간 동안, 예를 들어 2시간 동안 당업자에게 공지된 적합한 온도에서, 예를 들어 37℃에서 인큐베이션할 수 있다. 추가 단계에서, 염색된 세포를 예를 들어 원심분리에 의해 수확할 수 있다. 바람직하게는, 3200 x g에서 5분 동안 원심분리를 수행한다. 그 후, 세포를 당업자에게 공지된 적합한 완충액, 예를 들어 PBS-완충액 2 ml에서 재현탁할 수 있다. 응집을 위해, 젖산균 군에 속한 미생물을 바람직하게는 뮤탄스 연쇄상구균과 3:1 내지 1:3 (뮤탄스 연쇄상구균:락토바실리)의 부피비로 혼합한다. 보다 바람직하게는, 혼합물의 부피비는 1:1이다. 언급된 비는 1:50 내지 1:150의 콜로니 형성 단위의 비에 상응한다. 염색, 바람직하게는 형광의 측정을 통한 응집 반응의 검정을 위해, 락토바실리 및 뮤탄스 연쇄상구균을 당업자에게 공지된 임의의 적합한 부피, 바람직하게는 50 ㎕의 부피로 사용한다. 바람직하게는, 미량역가 플레이트, 예를 들어 96 웰 미량역가 플레이트에서 혼합한다. 후속적으로, 혼합물을 바람직하게는 12분 동안 전속력으로 볼텍싱할 수 있다. 그 후, 혼합물을 예를 들어 10초 동안 500 x g에서 원심분리할 수 있다. 그 후, 상등액을 제거하고, 펠렛을 당업자에게 공지된 임의의 적합한 완충제, 바람직하게는 PBS-완충액에서 임의의 적합한 부피, 예를 들어 100 ㎕로 재현탁할 수 있다. 현탁액의 염색을 혼합물에서 당업자에게 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 측정할 수 있다. 바람직하게는, 형광의 경우, 형광 판독기에서, 예를 들어 495 nm (여기) 및 525 nm (방출)의 파장에서 형광을 검출할 수 있다. 대조군으로서, 락토바실리 단독 및 염색된 뮤탄스 연쇄상구균 단독을 검정할 수 있다. 임의의 배경 염색, 예를 들어 형광을 시험된 뮤탄스 연쇄상구균 단독에 대해 측정할 수 있고, 바람직하게는 락토바실러스 각각에 의한 응집에 대한 값에서 공제될 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이 측정된 배경 염색, 예를 들어 형광을, 상기 기재된 락토바실러스 및 상기 기재된 시험된 뮤탄스 연쇄상구균을 함유하는 샘플에서의 측정된 염색, 예를 들어 형광에서 공제한 후 얻어진 값이 0 초과인 경우, 응집 효과가 존재한다. 보다 바람직하게는, 상기 기재된 바와 같이 수행된 일련의 시험에서 얻어진 값이 재현가능하게 0 초과인 경우 응집 효과가 존재한다. "일련의 실험"은 적어도 2개, 바람직하게는 3개, 보다 바람직하게는 4개, 가장 바람직하게는 5개의 시험을 의미한다.

상기 기재된 특이적 결합은 마그네슘을 필요로 하지 않는다. 이 특징은 첨부된 실시예에 기재된 바와 같이 시험할 수 있다.

첨부된 실시예에 나타낸 바와 같이, 놀랍게도 상기 언급된 결합 검정법에 의해 본래에 확인되고 단리된 젖산균이, 스트렙토코커스 뮤탄스에는 결합하나 다른 스트렙토코커스 종인 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius), 스트렙토코커스 오랄리스, 스트렙토코커스 미티스 및/또는 스트렙토코커스 상기니스(Streptococcus sanguinis)에는 결합하지 않는 능력으로 인해 (제WO 06/27265호), 다양한 다른 뮤탄스 연쇄상구균, 예를 들어 스트렙토코커스 소브리누스, 스트렙토코커스 크리세투스, 스트렙토코커스 라티, 스트렙토코커스 페루스 및 스트렙토코커스 마카카에를 응집시키는 능력을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 스트렙토코커스 뮤탄스와 관련된 상기 기재된 결합 특징을 나타내는 젖산균의 확인 (여기서, 결합은 바람직하게는 상기 기재된 검정법에 의해 검정됨)은 스트렙토코커스 뮤탄스를 응집시키는 능력도 갖고 다른 뮤탄스 연쇄상구균, 즉 하기 추가로 기재된 바와 같은 공통 특징을 갖고 또한 우식증 발생과 관련된 스트렙토코커스 종을 응집시키는 능력도 갖는 젖산균을 제공한다. 따라서, 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균 중 한 유형 (예를 들어, 스트렙토코커스 뮤탄스)에 대한 상기 인용된 결합 특징을 나타내는 젖산균은 또한 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 다른 세균을 응집시킬 수 있는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 이는 이러한 다른 세균에 의해 유발된 우식증의 예방 및/또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 따라서, 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 한 세균으로의 젖산균의 결합 시험을 위한 상기 확인된 검정법은 또한 뮤탄스 연쇄상구균 군의 다른 세균에 결합/이를 응집시키는 젖산균을 확인한다. 따라서, 본 발명은 스트렙토코커스 뮤탄스 이외의 뮤탄스 연쇄상구균에 의해 유발된 우식증에 초점을 맞춘 수단 및 방법의 제공에서 중요한 개선을 제공한다.

상기로부터 명백한 바와 같이, 모든 상기 언급된 특징은 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물이 우식증, 구체적으로 스트렙토코커스 뮤탄스 이외의 뮤탄스 연쇄상구균에 의해 유발된 우식증의 예방 및/또는 치료를 위한 적합한 작용제가 되게 한다. 따라서, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물은 항우식성 효과를 발휘하므로, 이는 우식증, 구체적으로 스트렙토코커스 뮤탄스 이외의 뮤탄스 연쇄상구균에 의해 유발된 우식증의 예방 및/또는 치료를 위한 유용한 작용제이다. "우식증" 또는 "치아 우식증" 또는 "공동(cavity)"은 점진적으로 치아 사멸을 초래하는 치아에서 연질 썩은 영역과 관련된 만성 감염성 질환에 대한 상호교환가능한 용어이다. 이는 통상적으로 어린이 및 젊은 성인에서 발생하나, 임의의 사람에서 발병할 수 있다. 이는 더 어린 사람에서 치아 손실의 가장 중요한 원인이다. 우식증은 당분야에 공지된 방법에 의해 진단될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Angmar-Mansson and ten Bosch. Adv. Dent. Res. 7 (1993), 70-79] 참조).

용어 "뮤탄스 연쇄상구균"은 구강의 플라크에서 발견되고 만니톨 및 소르비톨을 발효시키는 스트렙토코커스의 분류학적 군의 미생물을 지칭한다. 바람직하게는, 이는 상기 언급된 특징을 갖고 또한 수크로스로부터 세포외 글루칸을 생성할 수 있는 미생물이다. 바람직하게는, 상기 미생물은 구체적으로 인간 및/또는 동물 모델에서 우식원성이다. 보다 바람직하게는, 상기 용어는 상기 언급된 모든 특징을 나타내는 미생물에 관한 것이다. 소르비톨 및 만니톨의 발효는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 시험, 예를 들어 API 20 스트렙(Strep) 시험 (바이오메리에욱스(bioMerieux), 프랑스)을 이용함으로써 시험될 수 있다.

보다 바람직하게는, 상기 용어는 스트렙토코커스 뮤탄스, 스트렙토코커스 소브리누스, 스트렙토코커스 크리세투스, 스트렙토코커스 라티, 스트렙토코커스 페루스 또는 스트렙토코커스 마카카에 종에 속한 미생물에 관한 것이다. 보다 더 바람직하게는, 상기 용어는 스트렙토코커스 뮤탄스 혈청형 c (DSMZ 20523), 스트렙토코커스 뮤탄스 혈청형 e (NCTC 10923), 스트렙토코커스 뮤탄스 혈청형 f (NCTC 11060), 스트렙토코커스 소브리누스 DSM 20742, 스트렙토코커스 라티 DSM 20564, 스트렙토코커스 크리세투스 DSM 20562, 스트렙토코커스 페루스 DSM 20646 또는 스트렙토코커스 마카카에 DSM 20714에 속한 미생물에 관한 것이다. 용어 "뮤탄스 연쇄상구균"은 상기 기재된 뮤탄스 연쇄상구균 군의 1종 이상의 미생물을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 용어는 상기 기재된 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 미생물의 임의의 조합 및 하위군을 지칭한다.

용어 "우식증의 방지"는 우식증의 예방을 포함한다. 따라서, 우식증의 원인물질인 뮤탄스 연쇄상구균과 접한 적은 없으나, 뮤탄스 연쇄상구균과 접할 위험이 있는, 즉 뮤탄스 연쇄상구균으로 감염될 위험이 있는 대상체는 예를 들어 본 발명의 용도 및 방법으로부터 이익을 얻는다 (상기 대상체가 우식증을 앓지 않는 한). 그러므로, 본 발명의 용도 및 방법은 예를 들어 우식증 예방을 위해 유아, 어린이 또는 어린 동물에게 적용될 수 있으며, 이는 유아 또는 어린 동물의 구강에는 통상적으로 뮤탄스 연쇄상구균이 없기 때문이다. 그러나, 본 발명에 따라 사용되는 조성물은 유아, 어린이 또는 어린 동물에게 투여하는 것에 제한되지 않는다.

용어 "우식증의 치료"는 뮤탄스 연쇄상구균 세포의 양을 감쇠시키고/거나 입, 구체적으로 치아를 포함한 구강으로부터 뮤탄스 연쇄상구균을 완전히 고갈시키기 위해, 하기 기재된 바와 같이 조성물을 우식증을 앓는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 물론, 뮤탄스 연쇄상구균으로부터 치유된 후, 각각의 대상체는 뮤탄스 연쇄상구균에 대해 발휘된 예방적 항-우식성 효과와 관련하여 본 발명의 용도 및 방법으로부터 이익을 받는 것으로 고려된다.

임의로, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물은 항우식성 효과 이외에 투여받는 숙주 유기체에 대해 이로운 효과를 갖는 프로바이오틱 미생물이다. 일반적으로 용인되는 정의에 의해 "프로바이오틱"은 "장관 미생물 균형의 개선에 의해 숙주 동물에게 이로운 영향을 미치는 살아있는 미생물 공급 보충물"이다.

뮤탄스 연쇄상구균은 입안의 정상적인 세균총의 일부로서 발생한다. 이는 인간 및 동물, 구체적으로 포유동물에서 치아 우식증의 원인과 관련된다. 치아 플라크는 잇몸에 인접한 치아의 틈새 및 구멍에 접착한다. 이는 초기에는 치아 에나멜 상에 침전되고 흡착된 당단백질로 구성된다. 그 후, 구강 세균이 당단백질과 회합된다. 식이 수크로스는 특히 일부가 일정 시간 동안 입안에 남아있을 수 있는 점착성 단맛 식품 형태인 경우에 우식생성의 중요한 원인이다. 따라서, 수크로스는 뮤탄스 연쇄상구균에 의해 더 완전히 대사되어 산을 형성한다. 수크로스를 함유하는 음료를 삼키면, 수크로스는 입안에서 더 적은 시간 동안 머문다. 치아 플라크를 규칙적 치아-칫솔짓의 사용 및 이쑤시개 및 치실의 사용에 의해 제어하는 것이 필수적이다. 음료수에 플루오라이드 1 ppm을 첨가하는 것은 우식증 감소에 매우 효과적인 것으로 증명되었다. 또한, 과학 사회에서 스트렙토코커스 뮤탄스에 대한 백신의 사용 가능성이 고려되었다. 따라서, 구강 안의 대부분의 세균에 영향을 미치는 구강 위생의 일반적 계획 이외에, 선행기술은 거의 모두가 스트렙토코커스 뮤탄스에 대한 특정 수단에 집중한다. 그러나, 스트렙토코커스 뮤탄스에 결합할 수 있는 능력에 의해 확인된 천연 젖산균 군, 바람직하게는 락토바실러스 속에 속한 미생물이 또한 뮤탄스 연쇄상구균 균주, 예를 들어 스트렙토코커스 소브리누스, 스트렙토코커스 크리세투스, 스트렙토코커스 라티, 스트렙토코커스 페루스 또는 스트렙토코커스 마카카에에 결합할 수 있는 능력을 갖는다는, 본 발명의 놀라운 발견에 의해, 본 발명에 이르러 스트렙토코커스 뮤탄스 이외의 뮤탄스 연쇄상구균에 의해 유발된 우식증을 효과적으로 예방하고/거나 치료할 수 있게 되었는데, 이는 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물이 뮤탄스 연쇄상구균, 예를 들어 스트렙토코커스 소브리누스, 스트렙토코커스 크리세투스, 스트렙토코커스 라티, 스트렙토코커스 페루스 또는 스트렙토코커스 마카카에를 응집시키고 씻어 내릴 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명은 항우식성 특성 이외에 프로바이오틱으로서 유용할 수 있는 식품-등급 유기체인 용이하게 투여가능한 세균의 용도를 제공한다.

구체적으로, 스트렙토코커스 뮤탄스에는 결합하나, 스트렙토코커스 살리바리우스, 스트렙토코커스 오랄리스, 스트렙토코커스 미티스 및 스트렙토코커스 상기니스에는 결합하지 않는 능력으로 인해 최초로 확인된, 젖산균 군, 바람직하게는 락토바실러스 속에 속한 미생물을 분석하여, 놀랍게도 상기 미생물이 스트렙토코커스 뮤탄스에도 결합할 수 있고, 또한 우식증의 원인물질인 다른 뮤탄스 연쇄상구균 종, 예를 들어 스트렙토코커스 소브리누스, 스트렙토코커스 크리세투스, 스트렙토코커스 라티, 스트렙토코커스 페루스 또는 스트렙토코커스 마카카에에도 결합할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이들 뮤탄스 연쇄상구균으로의 결합에 의해, 본원에 기재된 젖산균 군, 바람직하게는 락토바실러스 속에 속한 미생물은 특히 뮤탄스 연쇄상구균에 결합하고 이를 응집시켜서, 결과적으로 타액의 자연적 흐름에 의해 뮤탄스 연쇄상구균을 씻어 내리고, 이에 의해 우식증을 예방하고/거나 치료한다. 이에 더하여, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물은 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같이, 구체적으로 하기 실시예 6에 기재된 바와 같이 구강에 존재하는 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속하지 않는 다른 미생물에 결합하지 않는다. 따라서, 우식증의 원인물질로서 뮤탄스 연쇄상구균만이 고갈되기 때문에 구강의 미세환경은 교란되지 않는다. 알고 있는 바로는 뮤탄스 연쇄상구균은 구강에 대한 어떠한 이로운 효과도 갖지 않으며, 따라서 그의 손실은 각각의 숙주에 대해 불리한 효과를 갖지 않는다.

현저하게, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물, 구체적으로 본원에 기재된 락토바실러스 종의 뮤탄스 연쇄상구균으로의 특이적 결합은 열 처리에 내성이고/거나 프로테아제 처리에 내성이이다. 또한, 특이적 결합은 칼슘에 의존적이고/거나, 마그네슘에 독립적이고, 4.5의 산성에서 안정하고, 구강 적용 형태로 또는 더 높은 농도의 칼슘을 함유할 수 있는 식품, 사료 또는 음료, 예컨대 우유용 첨가제로서 사용하기에 특히 적합하게 하는 타액의 존재하에 발생한다. 두드러지게, 본원에 개시된 상기 미생물의 열 불활성화된 또는 동결건조된 유사체, 유도체 또는 단편(들)은 여전히 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 놀라운 효과는 우식증의 예방 및/또는 치료를 위해, 동물, 바람직하게는 인간 또는 포유동물에서 사용하기 위한 조성물에서 상기 미생물 뿐만 아니라 그의 돌연변이체 또는 유도체의 상기 유사체(들) 또는 단편(들)을 사용하는데 있어서 이롭다. 구체적으로, 상기 유사체 또는 단편은 임의의 조성물, 예를 들어 미용 또는 제약 조성물, 식품 또는 사료 또는 음료 등에 용이하게 첨가될 수 있다. 또한, 이러한 유사체 또는 단편의 제조는 저렴하고 용이하며, 이는 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합할 수 있는 능력의 손실 없이 연장된 기간 동안 저장될 수 있다. 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 추가 장점은 동결건조되거나 분무-건조되거나 건조되는 경우에도 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 유지하는 것이다. 이는 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물을 본원에 기재된 조성물에서 사용하기에 유리한 성분으로 만든다.

본 발명의 다른 실시양태 및 장점은 부분적으로 본원의 상세한 설명에 기재되어 있고, 부분적으로 상세한 설명으로부터 명백할 수 있거나, 본 발명의 실행으로부터 학습될 수 있다.

본 발명을 상세히 기재하기 전에, 본 발명은 본원에 기재된 특정 방법, 프로토콜, 세균, 벡터 및 시약 등으로 제한되지 않으며, 이는 이들이 다양할 수 있기 때문인 것으로 이해된다. 또한, 본원에서 사용되는 용어는 특정 실시양태만을 기재하기 위한 것이고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 제한되는 것으로 이해된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.

바람직하게는, 본원에서 사용되는 용어는 문헌 ["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W. Nagel, B. and Koelbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland]에 기재된 바와 같이 정의된다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에 걸쳐, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 용어 "포함하다" 및 "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 변형체는 언급된 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 군을 포함하나 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 베재하지 않는 것을 함축하는 것으로 이해될 것이다.

여러 문헌이 본 명세서의 본문에 걸쳐 인용된다. 상기 또는 하기 본원에 인용된 문헌 (모든 특허, 특허 출원, 과학 공개물, 제조자의 세부사항, 지시사항 등 포함) 각각은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 본원에서는 아무것도 본 발명이 선행 발명에 의한 이러한 개시를 선행하는 것으로 자격이 부여지지 않은 승인으로서 해석되지 않는다.

문맥에서 명확히 다른 지시가 없는 한, 본원 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 복수 대상물을 포함한다는 것에 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어 "시약"에 대한 언급은 이러한 상이한 시약 1종 이상을 포함하고, "방법"에 대한 언급은 본원에 기재된 방법에 대해 변형되거나 치환될 수 있는, 당업자에게 공지된 동등한 단계 및 방법에 대한 언급을 포함한다.

본 발명의 맥락에서 사용되는 경우, 용어 "젖산균 군에 속한 미생물"은 세균에 속한, 구체적으로 그람-양성 발효성 진정세균에 속한, 보다 구체적으로 젖산균을 포함한 락토박테리아세아에(Lactobacteriaceae) 과에 속한 미생물(들)을 포함한다. 또한, 상기 용어는 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 상기 미생물(들)의 유도체 또는 돌연변이체 또는 유사체 또는 단편, 예컨대 본원에 기재된 막 분획물도 포함한다. 용어 "유도체", "돌연변이체", "유사체" 및 "단편"은 본원에 기재되어 있다. 젖산균은 스트렙토코커스, 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코쿠스(Pediococcus) 및 락토바실러스의 세부로 나뉜 분류학적 관점으로부터 유래된다. 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물은 바람직하게는 락토바실러스 종이다. 젖산균 군의 구성원은 통상적으로 포르피린 및 시토크롬이 결핍되어 있으며, 전자-전달 인산화를 수행하지 않으므로, 기질-수준 인산화에 의해서만 에너지를 얻는다. 즉, 젖산균에서 ATP는 탄수화물의 발효를 통해 합성된다. 모든 젖산균은 혐기조건에서 성장하나, 많은 혐기균과 달리, 대부분의 젖산균은 산소에 민감하지 않으므로, 산소의 존재시 뿐만 아니라 산소의 부재시에도 성장할 수 있다. 따라서, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물은 바람직하게는 내기성 혐기 젖산균이며, 바람직하게는 락토바실러스 속에 속한다.

상기 언급된 젖산균은 바람직하게는 길고 얇은 막대 내지 짧고 굽은 막대로 다양한, 막대-형태 또는 구형이고, 보다 바람직하게는 부동성이고/거나 무홀씨성이고, 발효 대사의 주요한 또는 단독 생성물로서 락트산을 생성한다. 상기 언급된 미생물이 속한 락토바실러스 속은 하기 특징에 의해 3개의 주요 하위군으로 나뉘며, 이에 의해 상기 언급된 락토바실러스 종이 3개의 주요 하위군 각각에 속할 수 있는 것으로 고려된다:

(a) 동종발효성 락토바실리

(i) 엠브덴-메이어호프(Embden-Meyerhof) 경로를 통해 글루코스로부터 85％ 이상의 양으로 락트산, 바람직하게는 락트산의 L-, D- 또는 DL-이성질체(들)를 생성하고;

(ii) 45℃의 온도 (15℃의 온도는 제외)에서 성장하고;

(iii) 긴 막대 형태이고;

(iv) 세포벽에 글리세롤 테이코산을 갖음;

(b) 동종발효성 락토바실리

(i) 엠브덴-메이어호프 경로를 통해 락트산, 바람직하게는 락트산의 L- 또는 DL-이성질체(들)를 생성하고;

(ii) 15℃의 온도에서 성장하고, 45℃의 온도에서 다양한 성장을 나타내고;

(iii) 짧은 막대 형태 또는 곤봉형이고;

(iv) 세포벽에 리비톨 및/또는 글리세롤 테이코산을 갖음;

(c) 이종발효성 락토바실리

(i) 펜토스-포스페이트 경로를 통해 글루코스로부터 50％ 이상의 양으로 락트산, 바람직하게는 락트산의 DL-이성질체를 생성하고;

(ii) 이산화탄소 및 에탄올을 생성하고;

(iii) 15℃ 또는 45℃의 온도에서 다양한 성장을 나타내고;

(iv) 길거나 짧은 막대 형태이고;

(v) 세포벽에 글리세롤 테이코산을 갖음.

상기 기재된 특징을 기초로 하여, 상기 언급된 미생물은 젖산균 군, 구체적으로 락토바실러스 속에 속한 미생물로 분류될 수 있다. 전통적 분류법을 이용함으로써, 예를 들어 문헌 ["Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" (Williams & Wilkins Co., 1984)]의 관련 기재를 참고로 하여, 미생물은 락토바실러스 속에 속하는 것으로 결정될 수 있다. 대안으로, 미생물은 당분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 그의 대사 지문, 즉 당을 대사할 수 있는 이러한 미생물(들)의 능력의 비교가능한 개관에 의해, 또는 예를 들어 문헌 [Schleifer et al., System. Appl. Microb., 18 (1995), 461-467] 또는 [Ludwig et al., System. Appl. Microb., 15 (1992), 487-501]에 기재된 다른 방법에 의해 락토바실러스 속에 속한 것으로 분류될 수 있다. 상기 언급된 미생물은 당 공급원을 대사할 수 있으며, 이는 락토바실러스 속에 속한 미생물에 대해 전형적이고 당분야에 공지된 것이다. 바람직하게는, 그러나, 상기 언급된 미생물은 하기로 이루어진 군에서 선택된 대사 지문을 갖는다:

(i) D-락토스를 대사하나, L-소르보스 및/또는 D-사카로스 및/또는 D-이눌린을 대사하지 않고,

(ii) 이눌린을 대사하고,

(iii) L-소르보스를 대사하나, D-락토스 및/또는 D-사카로스 및/또는 이눌린을 대사하지 않고,

(iv) L-소르보스, D-락토스 및 이눌린을 대사한다.

바람직하게는, 상기 언급된 미생물은 하기로 이루어진 군에서 선택된 대사 지문을 갖는다:

(i) D-락토스를 대사하나, L-소르보스, D-사카로스 및 이눌린을 대사하지 않고,

(ii) L-소르보스, D-락토스 및 이눌린을 대사하나, D-사카로스를 대사하지 않고,

(iii) L-소르보스를 대사하나, D-락토스, D-사카로스 및 이눌린을 대사하지 않고,

(iv) L-소르보스, D-락토스, D-사카로스를 대사하나, 이눌린을 대사하지 않는다.

물론, 상기 언급된 미생물은 상기 언급된 대사 지문 패턴에 언급된 당의 대사에 제한되지 않으나, 통상적으로 락토바실러스 종에 의해 대사되는 당을 추가로 대사할 수 있다.

락토바실러스 속으로의 상기 언급된 미생물의 가입은 또한 당분야에 공지된 다른 방법, 예를 들어 결정될 종의 총 단백질의 SDS-PAGE 겔 전기영동을 이용하고, 이를 락토바실러스 속의 공지되고 이미 특징화된 균주와 비교함으로써 특징화될 수 있다. 상기 기재된 총 단백질 프로파일의 제조 기술, 뿐만 아니라 이러한 프로파일의 수많은 분석법은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 그러나, 결과는 오직 방법의 단계 각각이 충분히 표준화된 경우에만 믿을 수 있다. 락토바실러스 속으로의 미생물의 부착을 결정시 정확성의 요구에 직면하여, 표준화된 절차는 1994년 9월 12일 내지 16일에 벨기에 소재의 겐트대학교에서 유럽연합에 의해 조직된 "워크샵" 중에 발표된 포트 등 (Pot et al.)과 같은 저자에 의해 공중에게 규칙적으로 이용가능하게 된다 (세균의 분류 및 확인을 위한 지문분석 기술, 온전한 세포 단백질의 SDS-PAGE). SDS-PAGE 전기영동 겔의 분석 기술에서 사용되는 소프트웨어는 종 간의 상관관계의 정도가 이 소프트웨어에 의해 사용되는 파라미터 및 알고리즘에 의존하기 때문에 결정적으로 중요하다. 이론적 세부사항을 언급하지 않고, 농도계에서 측정되고 컴퓨터에 의해 표준화된 밴드의 정량 비교는 바람직하게는 피어슨 상관계수에 의해 이루어진다. 이렇게 얻은 유사성 매트릭스는 가장 유사한 프로파일을 함께 그룹화하고 또한 수형도를 제작할 수 있는 UPGMA (평균 연결을 이용하는 비가중 짝 그룹 방법) 알고리즘의 보조에 의해 조직화될 수 있다 (문헌 [Kersters, Numerical methods in the classification and identification of bacteria by electrophoresis, in Computer-assisted Bacterial Systematics, 337-368, M. Goodfellow, A. G. O'Donnell Ed., John Wiley and Sons Ltd, 1985] 참조).

대안으로, 락토바실러스 속으로의 상기 미생물의 가입은 소위 Riboprinter.RTM에서 리보솜 RNA와 관련하여 특징화될 수 있다. 보다 바람직하게는, 락토바실러스 속으로의 상기 언급된 종의 가입은 상기 세균의 16S 리보솜 RNA의 뉴클레오티드 서열 또는 16S 리보솜 RNA를 코딩하는 게놈 DNA의 뉴클레오티드 서열을 현재까지 공지된 젖산균의 다른 속 및 종의 것과 비교함으로써 증명된다. 락토바실러스 속으로의 종의 부착을 결정하기 위한 다른 바람직한 대안은 16S-23S rRNA 스페이서 영역을 표적으로 하는 종-특이적 PCR 프라이머의 사용이다. 다른 바람직한 대안은 균주 특이적 DNA 패턴이 생성되는 것에 의해 락토바실러스 속으로의 확인된 미생물의 가입을 결정하는 RAPD-PCR (문헌 [Nigatu et al. in Antonie van Leenwenhoek (79), 1-6, 2001])이다. 락토바실러스 속으로의 미생물의 가입의 결정에 유용한 추가 기술은 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) (문헌 [Giraffa et al., Int. J. Food Microbiol. 82 (2003), 163-172]), 반복 요소의 지문분석 (문헌 [Gevers et al., FEMS Microbiol. Lett. 205 (2001) 31-36]) 또는 세균 세포의 지방산 메틸 에스테르 (FAME) 패턴의 분석 (문헌 [Heyrman et al., FEMS Microbiol. Lett. 181 (1991), 55-62])이다. 대안으로, 락토바실리는 렉틴 타이핑 (문헌 [Annuk et al., J. Med. Microbiol. 50 (2001), 1069-1074])에 의해 또는 그의 세포벽 단백질의 분석 (문헌 [Gatti et al., Lett. Appl. Microbiol. 25 (1997), 345-348])에 의해 결정될 수 있다.

상기 언급된 미생물은 바람직하게는 본원에 기재된 락토바실러스 속, 보다 바람직하게는 락토바실러스 종에 속하는 젖산균이다. 보다 더 바람직하게는, 상기 락토바실러스는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 또는 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus)이다. 그러나, 락토바실러스 종은 이에 제한되지 않는다. 상기 언급된 미생물은 바람직하게는 "단리"되거나 "정제"될 수 있다. 용어 "단리된"은 물질이 그의 최초 환경으로부터, 예를 들어 천연 유래인 경우 자연 환경으로부터 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 자연계에 공존하는 물질 중 일부 또는 모두로부터 분리된 천연 미생물, 바람직하게는 락토바실러스 종은 단리된다. 이러한 미생물은 조성물의 일부일 수 있고, 조성물이 자연 환경의 일부가 아닌 단리된 것으로 간주된다.

용어 "정제된"은 절대 순도를 필요로 하지 않고, 오히려 상대적 정의로서 의도된다. 라이브러리로부터 얻은 개별 미생물은 통상적으로 미생물학적 균질성으로 정제된다, 즉 이는 당분야에 공지된 방법에 의해 한천 플레이트 상에서 스트리킹하는 경우 단일 콜로니로서 성장한다. 바람직하게는, 이 목적을 위해 사용되는 한천 플레이트는 락토바실러스 종에 대해 선택적이다. 이러한 선택적 한천 플레이트는 당분야에 공지되어 있다.

보다 바람직하게는, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물은 DSMZ 관리 번호 DSM 16667 (락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 Lb-Ob-K1), DSMZ 관리 번호 DSM 16668 (락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 Lb-Ob-K2), DSMZ 관리 번호 DSM 16669 (락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 Lb-Ob-K3), DSMZ 관리 번호 DSM 16670 (락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 Lb-Ob-K4), DSMZ 관리 번호 DSM 16671 (락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 Lb-Ob-K5), DSMZ 관리 번호 DSM 16672 (락토바실러스 람노수스 Lb-Ob-K6) 및 DSM 관리 번호 DSM 16673 (락토바실러스 람노수스 Lb-Ob-K7)을 갖는 락토바실러스 파라카세이 또는 락토바실러스 람노수스 또는 이들의 돌연변이체 또는 유도체로 이루어진 군에서 선택되며, 여기서 상기 돌연변이체 또는 유도체는 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유한다. 용어 "DSMZ 관리 번호를 갖는 락토바실러스 파라카세이 또는 락토바실러스 람노수스"는 2004년 8월 26일에 도이치 잠룽 퓌르 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하("DSMZ")에 기탁된 락토바실러스 파라카세이 또는 락토바실러스 람노수스 종에 속하고 기탁 번호 DSM 16667, 16668, 16669, 16670, 16671, 16672 또는 16673을 갖는 미생물의 세포에 관한 것이다. DSMZ는 독일 데-38124 브라운슈바익 마쉐로더 벡 1베에 위치한다. 상기 언급된 DSMZ 기탁은 특허 절차를 위해 미생물의 기탁의 국제 인정에 대한 부다페스트 조약의 조항과 관련하여 이루어졌다.

상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물, 바람직하게는 기탁된 락토바실러스 파라카세이 또는 락토바실러스 람노수스 세포의 "돌연변이체 또는 유도체"는 바람직하게는 각각의 기탁된 균주와 동일한 특징을 갖는다, 즉 이는 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을, 바람직하게는 상기 기재된 결합 특징과 함께 보유한다. 예를 들어, 상기 유도체는 유전자 조작될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "유전자 조작된"은 유전자 변형이 영향을 받고 유전자가 재조합 DNA 기술에 의해 변형되도록, 시험관내에서 및 생체내에서 바람직한 핵산을 변형하는 당업자에게 공지된 방법과 관련하여 가장 넓은 의미로 사용된다. 따라서, 상기 방법은 재조합 핵산의 클로닝, 서열분석 및 형질전환을 포함하는 것이 바람직하다. 이 목적을 위해, 락토바실러스 종을 위한 발현 벡터를 포함한 적절한 벡터는 예를 들어 제EP-B1 506 789호, 제EP-B1 316 677호, 제EP-B1 251 064호, 제EP-B1 218 230호, 제EP-B1 133 046호 또는 제WO 89/01970호에 기재되어 있다.

중간체 구조물 등의 클로닝을 위한 프라이머, 효소, 추가 숙주 세포 등이 사용될 수 있고, 이는 당업자에게 공지되어 있다. 바람직하게는, 유전자 조작된 돌연변이체는 그의 세균 염색체에 또는 플라스미드(들) 상에 포함되거나 그의 세균 염색체 및/또는 플라스미드(들)에 포함된 재조합 핵산을 보유하는, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 세포, 바람직하게는 기탁된 락토바실러스 종의 세포를 포함한다. 상기 재조합 핵산은 바람직하게는 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물에 대해 외래이다. "외래"는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자가 숙주 세포와 관련하여 이종이라는 것을 의미하며, 이는 상이한 게놈 배경을 갖는 세포 또는 유기체로부터 유래되거나, 또는 상기 핵산 분자의 천연 대응부 이외에 상이한 게놈 환경에 위치되었으나 숙주 세포와 관련하여 상동성인 것을 의미한다. 이는 핵산 분자가 숙주 세포와 관련하여 상동성인 경우, 상기 숙주 세포의 게놈에서의 그의 천연 위치에 위치하지 않고, 구체적으로 상이한 유전자에 의해 둘러싸여 있는 것을 의미한다. 이 경우, 폴리뉴클레오티드는 그 자신의 프로모터의 제어하에 또는 이종 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 숙주 세포에 존재하는 상기 기재된 벡터 또는 핵산 분자는 숙주 세포의 게놈으로 통합되거나, 염색체외에서 몇몇 형태로 유지될 수 있다. 이와 관련하여, 또한 상기 기재된 핵산 분자가 상동성 재조합을 통해 돌연변이체 유전자를 저장하거나 생성하는데 사용될 수 있는 것으로 이해된다.

플라스미드는 적은, 중간 또는 많은 복제 개수 플라스미드일 수 있다. 상기 유전자 조작된 돌연변이체는 사카로스 서브유닛의 뮤탄 특이적 1,3-글리코시드 결합을 분해할 수 있는 글루카나제 또는 뮤타나제를 코딩하는 핵산을 보유할 수 있다. 진균 글루카나제는 예를 들어 문헌 [Fuglsang et al., J. Biol. Chem. 275 (2000), 2009-2018]에 기재되어 있다. 또한, 유전자 조작된 돌연변이체는 바람직하게는 세균 세포벽에서 분비되거나 앵커링된 항체를 코딩하는 재조합 핵산을 보유하는 세포를 포함하는 것으로 고려된다. 용어 "항체"는 무손상 항체 뿐만 아니라 그의 항체 단편, 예컨대 분리된 경쇄 및 중쇄, Fab, Fab/c, Fv, Fab', F(ab')₂를 포함한다. 용어 "항체"는 또한 인간화 항체, 이관능성 항체 및 항체 구조물, 예컨대 단일 사슬 Fvs (scFv) 또는 항체-융합 단백질을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "항체"는 상기 언급된 기탁된 미생물의 유도체의 세포에서 발현될 수 있는 항체 구조물, 예를 들어 특히 벡터를 통해 당분야에 공지된 방법에 의해 형질전환될 수 있는 항체 구조물을 포함하는 것으로 또한 고려된다. 구체적으로, 이러한 항체 구조물은 예를 들어 연쇄상구균 항원 I/II를 특이적으로 인식하는 것으로 고려된다. 이러한 접근법은 예를 들어 문헌 [Krueger et al., Nat. Biotechnol. 20 (2002), 702-706] 또는 문헌 [Shiroza, Biochim Biophys Acta 1626 (2003), 57-64]에 기재되어 있다.

발현된 항체의 분비는 바람직하게는 항체를 코딩하는 핵산을 분비 신호 서열에 작동가능하게 연결함으로써 달성된다. 세균 세포벽에서의 앵커링은 효소 소르타제의 메카니즘을 이용함으로써 달성될 수 있다. 즉, 그람-양성 세균의 표면 단백질은 보존된 Leu-Pro-X-Thr-Gly (LPXTG) 모티프의 절단을 포함하고, 펩티도글리칸 세포벽의 어셈블리 중에 발생하는 메카니즘에 의해 세균 세포벽에 연결된다. 따라서, 항체를 코딩하는 핵산 분자는 세균 세포벽에서 단백질을 앵커링하는데 소르타제에 의해 사용되는 상기 언급된 보존된 모티프를 코딩하는 서열에 융합될 수 있다.

또한, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물, 바람직하게는 기탁된 락토바실러스 종은 항미생물 물질 (특히, 스트렙토코커스 뮤탄스에 대해 효과적인 항미생물 물질)인 류테린을 코딩하는 핵산 분자를 보유하도록 유전자 변형된 것으로 고려된다. 류테린은 예를 들어 문헌 [Talarico et al., Chemother. 33 (1989), 674-679]에 기재되어 있다.

상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 돌연변이체, 바람직하게는 기탁된 락토바실러스 균주의 돌연변이체는 바람직하게는 인공으로 돌연변이된다. 본 발명에 따라, 용어 "돌연변이된"은 예를 들어 자연적으로 또는 물리적 수단에 의해 또는 화학적 화합물/물질/작용제, 예컨대 EMS 또는 ENU에 의해 유발된 유전 물질, 즉 핵산의 영구 변형(들)을 의미한다. 상기 변형에는 점 돌연변이, 예컨대 천이 또는 전환, 핵산/유전자/염색체 내의 1개 이상의 염기의 결실/삽입/첨가가 포함되며, 이에 의해 핵산/유전자/염색체가 변형되어, 특히 비정상적 유전자 발현/전사/번역 또는 불활성 유전자 생성물, 구성적 활성/불활성 유전자 생성물을 야기할 수 있고, 예를 들어 우성-부정적 효과를 초래한다. 바람직하게는, 돌연변이는 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합할 수 있는 증가된 능력을 초래한다. 따라서, 기탁된 미생물의 돌연변이체 세포가 바람직한 유전자(들)에 돌연변이(들)를 보유하거나, 바람직한 유전자(들)의 돌연변이(들)가 당업자에게 공지된 방법에 의해 유도되는 것이 또한 바람직하다. 돌연변이된 또는 유전자 조작된 세균 세포가 임의의 적합한 방법/표현형에 의해 선택될 수 있다는 것이 선행기술에 또한 공지되어 있다. 본 발명의 맥락에서, 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합할 수 있는 증가된 능력을 갖는 돌연변이체는 첨부된 실시예에 기재된 방법에 따라 시험될 수 있다. 그러나, 용어 "돌연변이체"는 또한 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 세포, 바람직하게는 그의 게놈, 즉 세균 염색체에 천연의 자연 돌연변이를 보유하는 기탁된 미생물의 세포를 포함한다. "자연 돌연변이"는 자연적으로, 즉 인간에 의한 또는 돌연변이유발원으로의 노출에 의한 직접 유전자 조작 없이 발생하는 돌여변이이다. 자연 돌연변이체의 선택은 균주를 배양하고, 바람직한 변이체를, 예를 들어 뮤탄스 연쇄상구균으로의 개선된 결합을 나타내는 변이체 세균의 능력에 의해 선택함으로써 달성될 수 있다. 자연 돌연변이체의 선택 방법은 당분야에 익히 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook. Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001)]; [Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)] 참조). 예를 들어, 이러한 돌연변이는 배양 중에, 예를 들어 DNA 복제와 커플링된 정상적인 세포 분열 프로세스 중에 또는 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 돌연변이체의 통과 및/또는 보존 중에 발생할 수 있다.

구강은 연쇄상구균의 많은 상이한 종에 대한 본거지이고, 이들이 동일한 서식지를 공유하고, 많은 특성을 공통적으로 갖는다는 것을 고려하면 이는 놀라운 것이 아니다. 따라서, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물이 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 용어 "특이적으로 결합하는"은 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물, 바람직하게는 락토바실러스 속에 속한 미생물이 뮤탄스 연쇄상구균, 구체적으로 스트렙토코커스 뮤탄스에는 결합하나, 대부분의 다른 종, 바람직하게는 스트렙토코커스 속에 속한 다른 종에는 결합하지 않는 것을 의미하며, 여기서 스트렙토코커스 속에 속한 다른 종은 실시예 6에 기재되어 있다. 즉, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물은 바람직하게는 스트렙토코커스 살리바리우스 종, 바람직하게는 테르모필루스(thermophilus) 아종, 스트렙토코커스 오랄리스 종, 스트렙토코커스 미티스 종 및/또는 스트렙토코커스 상기니스 종에 속한 세균에 결합하지 않는다. 보다 바람직하게는, 이는 스트렙토코커스 살리바리우스 아종 테르모필루스 (API 50 CH에 의해 확인됨 (바이오메리에욱스, 프랑스), 스트렙토코커스 오랄리스 (DSMZ 20066), 스트렙토코커스 오랄리스 (DSMZ 20395), 스트렙토코커스 오랄리스 (DSMZ 20627), 스트렙토코커스 미티스 (DSMZ 12643) 및/또는 스트렙토코커스 상기니스 (DSMZ 20567)에 결합하지 않는다. 또한, 상기 미생물은 바람직하게는 스트렙토코커스 이외의 속에 속한 세균, 예를 들어 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속에 속한 세균에 결합하지 않는다. 보다 바람직하게는, 이는 스타필로코쿠스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis) 종에 속한 세균에 결합하지 않는다. 가장 바람직하게는, 이는 스타필로코쿠스 에피데르미디스 (DSMZ 1798) 및/또는 스타필로코쿠스 에피데르미디스 (DSMZ 20044)에 결합하지 않는다.

상기 이미 언급된 바와 같이, 놀랍게도, 스트렙토코커스 뮤탄스에 결합하나 다른 스트렙토코커스 종인 스트렙토코커스 살리바리우스, 스트렙토코커스 오랄리스, 스트렙토코커스 미티스 및/또는 스트렙토코커스 상기니스에 결합하지 않는 것에 대해 선택된 젖산균이, 상기 언급된 공통 특징을 나타내고 또한 우식증에 대한 원인물질로서 의심되는 다른 뮤탄스 연쇄상구균, 즉 다른 스트렙토코커스 종에 또한 결합할 수 있는 능력을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 스트렙토코커스 뮤탄스에 대한 상기 언급된 특이적 결합 특징을 나타내는 젖산균은 스트렙토코커스 뮤탄스 이외의 뮤탄스 연쇄상구균에 의해 유발된 우식증의 예방 또는 치료와 관련하여 또한 사용될 수 있는 능력을 나타낸다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 젖산균은 스트렙토코커스 뮤탄스와 관련하여 상기 기재된 결합 특징 (즉, (i) 열 처리에 내성이고/거나; (ii) 프로테아제 처리에 내성이고/거나; (iii) 칼슘-의존적이고/거나; (iv) 4.5 내지 8.5의 pH 범위 내에서 형성되고/거나; (v) 타액의 존재하에 형성됨)을 나타내는 것을 특징으로 하고, 결합은 상기 기재된 검정법으로 시험되고, 여기서 스트렙토코커스 뮤탄스가 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균으로서 사용된다.

특이적 결합의 시험을 위해, 바람직하게는 상기 언급된 구강 세균 각각을 바람직하게는 3:1의 부피비로 상기 기재된 락토바실러스 배양액과 혼합하고, 응집을 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 실시예 4 또는 실시예 5, 바람직하게는 실시예 5에 기재된 바와 같이 검정한다.

상기 언급된 락토바실러스 파라카세이, 바람직하게는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이는 상기 언급된 스트렙토코커스 속에 속한 임의의 구강 세균을 응집시키지 않고, 상기 언급된 스타필로코쿠스 속에 속한 세균에 결합하지 않는 것으로 나타났다. 상기 언급된 락토바실러스 람노수스 균주는 스트렙토코커스 살리바리우스 아종 테르모필루스 이외에 상기 언급된 모든 스트렙토코커스 및 스타필로코쿠스 종을 응집시키지 않는 것으로 나타났다. 바람직하게는 용어 "특이적으로 결합하는"은 또한 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물이 우식원성 치아 병원체일 수 있는 능력을 갖는 이러한 뮤탄스 연쇄상구균 균주에 결합하는 것을 의미한다.

특이적 결합 반응은 입에서 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물에 의해 본원에 기재된 뮤탄스 연쇄상구균 세포에 결합하고 바람직하게는 응집시키는 것을 포함한다. 결과로서, 이 특이적 결합은 예를 들어 타액 흐름에 의해 또는 본원에 기재된 세구제 또는 구강세정제 등에 의해 뮤탄스 연쇄상구균 세포를 씻어 내린다. 입은 구강 점막 (잇몸, 입술, 볼, 입천장 및 입바닥), 혀 및 치아 (인공 구조물 포함)에 의해 구성되는, 포유동물, 바람직하게는 인간 또는 동물, 예컨대 애완동물의 구강을 한정한다. 바람직하게는, 뮤탄스 연쇄상구균에 대한 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 특이적 결합 반응은 뮤탄스 연쇄상구균 세포가 치아 또는 치아들의 표면에 부착하는 것을 방지한다 (또는, 이론에 얽매이지 않고, 치아 또는 치아들의 표면으로부터 뮤탄스 연쇄상구균 세포의 박리를 유발할 수 있음). 결과로서, 특이적 결합 반응은 입 밖으로 뮤탄스 연쇄상구균 세포를 씻어 내려서, 이에 의해 우식증의 원인물질을 감쇠시키고, 따라서 우식증을 예방하고/거나 치료한다.

상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물은 항원 B, IF, P1, SR, MSL-1 또는 PAc라고도 공지된 연쇄상구균 항원 I/II에 특이적으로 결합할 수 있다고 여겨진다. 그러나, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물은 뮤탄스 연쇄상구균의 임의의 다른 단백질 또는 표면 구조에 결합하여, 이에 의해 뮤탄스 연쇄상구균을 응집시키고, 본원에 기재된 바와 같이 이를 구강 밖으로 씻어 내릴 수 있다. 스트렙토코커스 뮤탄스가 상기 연쇄상구균 항원 I/II를 통해 펠리클에 결합한다는 것이 공지되어 있다. 따라서, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물이 예를 들어 상기 연쇄상구균 항원 I/II에 결합할 수 있는 경우, 스트렙토코커스 뮤탄스 뿐만 아니라 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 다른 미생물은 치아 표면에 결합하는 것이 방해되어, 따라서 우식증의 예방 및/또는 치료를 돕는다.

펠리클은 타액에서 발견되는 단백질 및 지질 (지방)을 함유하는 투명하고 얇은 외피이다. 이는 치아 표면이 세정된 후 수초내에 형성된다. 펠리클 형성은 치아 플라크 형성의 제1 단계이다. 치아 플라크는 치아 상에 축적되는 연질 침착물이다. 플라크는 1 밀리그람 당 10¹⁰개 초과의 세균을 함유하는 복잡한 미생물계로서 정의될 수 있다. 400종 만큼 많은 독특한 세균 종들이 플라크에서 발견될 수 있다고 추정되었다. 플라크는 세균 세포 이외에 소수의 상피 세포, 백혈구 및 마크로파지를 함유한다. 세포는 세균 생성물 및 타액으로부터 형성된 세포외 매트릭스 내에 함유된다. 세포외 매트릭스는 단백질, 다당류 및 지질을 함유한다. 타액에 존재하는 단백질 중 하나는, 한편 입으로부터 스트렙토코커스 뮤탄스의 부분적 제거를 초래하는 것으로 여겨지나, 다른 한편 치아 표면으로의 스트렙토코커스 뮤탄스의 접착을 용이하게 함으로써, 치아로의 스트렙토코커스 뮤탄스의 초기 부착을 용이하게 하여, 우식증 발병을 용이하게 하는 것을 의심되는 응집소이다.

상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물이 상기 정의된 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합하는가는 특히, 뮤탄스 연쇄상구균 세포와, 또한 락토바실러스 속에 속하나 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합하지 않는 미생물과 상기 미생물의 반응을 비교함으로써, 바람직하게는 상기 기재되고 하기 첨부된 실시예에 기재된 방법을 이용함으로써 용이하게 시험될 수 있다.

바람직하게는, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물은 스트렙토코커스 뮤탄스 혈청형 c (DSMZ 20523) 및/또는 혈청형 e (NCTC 10923) 및/또는 혈청형 f (NCTC 11060) 및/또는 스트렙토코커스 소브리누스 DSM 20742 및/또는 스트렙토코커스 라티 DSM 20564 및/또는 스트렙토코커스 크리세투스 DSM 20562 및/또는 스트렙토코커스 페루스 DSM 20646 및/또는 스트렙토코커스 마카카에 DSM 20714에 특이적으로 결합할 수 있다.

이는 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물이 바람직하게는 스트렙토코커스 뮤탄스 혈청형 c (DSMZ 20523), 혈청형 e (NCTC 10923), 혈청형 f (NCTC 11060), 스트렙토코커스 소브리누스 DSM 20742, 스트렙토코커스 라티 DSM 20564, 스트렙토코커스 크리세투스 DSM 20562, 스트렙토코커스 페루스 DSM 20646 및 스트렙토코커스 마카카에 DSM 20714로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물에 결합한다는 것을 의미한다. 보다 바람직하게는, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물은 상기 언급된 세균의 하위군의 임의의 조합 군에 결합한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물은 상기 언급된 모든 세균에 결합한다. 본 발명에 따라, "혈청형"은 당분야에 공지된 혈청학적 방법에 의해 확인된 세균 세포, 바람직하게는 스트렙토코커스 뮤탄스 세포 또는 스트렙토코커스 소브리누스 세포의 항원성 특성이다.

상기 기재된 바와 같이, 뮤탄스 연쇄상구균으로의 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 특이적 결합은 열 처리에 내성이다. 따라서, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물은 열에 의해, 예를 들어 15℃ 또는 37℃ 초과의 온도에서 처리된다. 보다 바람직하게는, 세포는 55℃ 초과, 보다 더 바람직하게는 65℃ 초과, 특히 바람직하게는 95℃ 초과, 가장 바람직하게는 121℃의 온도에서 인큐베이션된다. 냉각후, 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합할 수 있는 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 능력은 본원에 기재된 바와 같이 결정된다.

상응하는 온도는 특이적 락토바실러스 종에 의존할 수 있으나, 통상적인 실험에 의해, 예를 들어 상이한 온도에서 상응하는 세포를 인큐베이션하고, 본원의 실시예에 기재된 방법을 이용함으로써 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합할 수 있는 락토바실러스 세포의 양을 결정함으로써, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

일반적으로, 열 처리는 1분 이상의 기간 동안 지속되어야 한다. 바람직하게는, 열 처리는 n 분 이상의 기간 동안 지속된다 (여기서, n은 2 내지 60 범위의 정수이고, n이 20인 것이 특히 바람직함). 그러나, 원칙적으로 인큐베이션 시간에 대한 상한은 없다. 그러나, 이는 바람직하게는 4, 3, 2 또는 1시간(들)보다 길지 않다. 가장 바람직한 열 처리는 2 bar의 대기압을 갖는 포화된 스팀에서 121℃의 온도에서 20분 이상이다. 가장 바람직한 열 처리는 단백질의 임의의 기능 및 세포의 임의의 활력도를 파괴하는 것으로 간주되고, 따라서 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합할 수 있다는 점에서 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물을 다른 미생물과 구별한다. 그러므로, 미생물이 살아있지 않아야 하는 것이 바람직한 경우, 이는 본 발명의 맥락에서 임의의 식품, 사료, 음료 또는 조성물에서 사용하기에 매우 유용하다.

바람직하게는, 상기 기재된 바와 같이 열 처리로 처리된, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물은 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 특이적으로 결합할 수 있는 증가된 능력을 갖는다. 용어 "증가된 능력"은 예를 들어, 상기 기재된, 바람직하게는 실시예 5에 기재된 검정법에 의해 측정가능한, 5％ 이상, 바람직하게는 10％ 이상, 보다 바람직하게는 20％ 이상, 가장 바람직하게는 30％ 이상만큼의 결합의 증가를 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 열 처리로 처리시 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 특이적으로 결합할 수 있는 증가된 능력을 갖는, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물은 락토바실러스 파라카세이 종, 보다 바람직하게는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이, 가장 바람직하게는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 Lb-Ob-K5 (DSM 16671)에 속한다.

상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 특이적 결합은 프로나제 E, 프로테이나제 K, 트립신 및 키모트립신으로 이루어진 군에서 선택된 프로테아제에 의한 처리인 프로테아제 처리에 대한 내성을 추가로 특징으로 한다. 이들 프로테이나제는 특이성을 나타내지 않는 프로테아제이며, 따라서 미생물의 세포 표면 상에 있는 임의의 단백질을 분해하는 것으로서 고려된다. 아미노산 잔기의 특정 패턴을 선택하는 것으로 공지된 다른 프로테아제는 엘라스타제, 트롬빈, 아미노펩티다제 I, 카르복시펩티다제, 도스트리파인, 엔도프로테이나제, 파파인, 펩신 또는 프로테아제이다. 마지막 프로테아제는 또한 뮤탄스 연쇄상구균으로의 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 특이적 결합이 마지막 보다 특이적 프로테아제에 대해 내성인가를 시험하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 첨부된 실시예에 기재된 프로테아제 처리후, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물은 뮤탄스 연쇄상구균에 여전히 특이적으로 결합할 수 있다.

또한, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 특이적 결합은 칼슘에 대한 그의 의존성을 추가로 특징으로 한다. 바람직하게는, 특이적 결합은 0.05 mM 내지 500 mM, 바람직하게는 1 mM 내지 100 mM의 칼슘 이온 농도의 존재하에 발생한다. 특히 바람직하게는, 칼슘 농도는 2 mM 내지 30 mM이다. 칼슘에 대한 특이적 결합의 의존성은 첨부된 실시예에 기재된 바와 같이 시험될 수 있다.

또한, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 특이적 결합은 4.0 내지 9.0, 바람직하게는 4.0 및 7.0의 pH 범위에 걸쳐 유지된다. 구체적으로, 특이적 결합이 발생하는 pH 값은 바람직하게는 4.5이다. 상기 기재된 pH 범위에 걸친 특이적 결합의 유지에 대한 검정은 첨부된 실시예에 나타낸다.

나아가, 특이적 결합은 마그네슘에 대해 독립적이다. 따라서, 첨부된 실시예에서 증명된 바와 같이 마그네슘 이온 또는 마그네슘 염의 존재는 필요하지 않다.

특이적 결합의 추가 특징은 타액의 존재하에 그의 발생이다. 타액은 타액선에 의해 합성되는 외인성 분비물이다. 이는 약 99％ 물 이외에 다수의 유기 및 무기 화합물을 함유하는 복잡한 액체이다. 타액의 생리적 성분은 특히, 효소, 예를 들어 아밀라제, 탄산탈수효소, 리소자임, 퍼옥시다제 또는 단백질, 예를 들어 뮤신, 락토페린, 프롤린-풍부 단백질, 시스타틴, 히스타틴 또는 스타테린 또는 가용성 IgA이다. 따라서, 다양한 잠재적으로 방해하는 물질이 타액에 존재하지만, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 특이적 결합은 교란되거나 방해되지 않는다. 타액의 존재하 특이적 결합의 시험을 위해, 바람직하게는 실시예 6에 기재된 스트렙토코커스 종 및/또는 실시예 6의 스타필로코쿠스 종을 함유하는 타액을 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 상기 기재된 락토바실러스 람노수스 종을 타액의 존재하에 뮤탄스 연쇄상구균으로의 특이적 결합에 대해 시험하는 경우, 스트렙토코커스 살리바리우스 아종 테르모필루스를 생략하는 것이 바람직하다. 특이적 결합은 본원에 기재된 바와 같이 검정된다.

상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 상기 언급된 특징은 상기 미생물이 특히 탄수화물 함유 식료품의 섭취후 특정 프로테아제 및 낮은 pH 값을 포함하는 타액이 존재하는 구강 및 치아를 포함한 입으로 다양한 형태로 주로 투여되기 때문에, 우식증의 예방 및/또는 치료를 위한 강건하고 효과적인 작용제가 되게 한다. 또한, 열에 대한 내성은 상기 식료품의 제조 중에 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물을 첨가제로서 식료품에 첨가하는 것에 대해 이로운 효과를 갖는다. 즉, 식료품은 종종 열 멸균, 예비요리, 저온살균되며, 이는 미생물의 생존력에 대해 해롭다.

본 발명의 다른 측면에서, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 유도체는 기재된 용도로 사용된다. 용어 "상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 유도체"는 열 불활성화되거나 동결건조된, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 불활성화된 형태 또는 유사체 또는 단편을 의미하며, 여기서 상기 불활성화된 형태, 유사체 또는 단편은 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유한다.

본 발명에 따라, 용어 "상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 불활성화된 형태 또는 유사체"는 락토바실러스 속에 속한 미생물에 대해 특이적인 플레이트 상에 단일 콜로니를 더이상 형성할 수 없는, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물, 바람직하게는 본원에 개시된 락토바실러스 종의 사멸되거나 불활성화된 세포를 포함한다. 상기 사멸되거나 불활성화된 세포는 무손상 또는 파손된 세포막을 가질 수 있다. 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 세포를 사멸하거나 불활성화시키는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 문헌 [El-Nezami et al., J. Food Prot. 61 (1998), 466-468]에는 UV-조사에 의해 락토바실러스 종을 불활성화시키는 방법이 기재되어 있다. 바람직하게는, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 세포는 첨부된 실시예에 기재된 바와 같이 열 불활성화되거나 동결건조된다. 상기 기재된 세포의 동결건조는 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하면서 용이하게 저장되고 취급될 수 있는 장점을 갖는다. 또한, 동결건조된 세포는 당분야에 공지된 조건하에 적절한 액체 또는 고체 배지에 적용시 다시 성장될 수 있다. 동결건조는 당분야에 공지된 방법에 의해 수행된다. 바람직하게는, 이는 2시간 이상 동안 실온에서, 즉 16℃ 내지 25℃의 임의의 온도에서 수행된다. 또한, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 동결건조된 세포는 하기 실시예 7 또는 8에 나타낸 바와 같이 뮤탄스 연쇄상구균에 더 특이적으로 결합하도록 4주 이상 동안 4℃의 온도에서 안정하다. 열 불활성화는 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 세포를 2시간 이상 동안 170℃의 온도에서 인큐베이션함으로써 달성될 수 있다. 또한, 열 불활성화는 바람직하게는 상기 세포를 121℃의 온도에서 20분 이상 동안 포화된 스팀의 존재하에 2 bar의 대기압에서 오토클레이브함으로써 달성된다. 대안으로, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 세포의 열 불활성화는 상기 세포를 4주, 3주, 2주, 1주, 12시간, 6시간, 2시간 또는 1시간 이상 동안 -20℃에서 동결시킴으로써 달성된다. 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 유사체의 세포의 70％, 75％ 또는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 85％, 90％ 또는 95％, 특히 바람직하게는 97％, 98％, 99％ 이상, 보다 특히 바람직하게는 99.1％, 99.2％, 99.3％, 99.4％, 99.5％, 99.6％, 99.7％, 99.8％ 또는 99.9％ 이상, 가장 특히 바람직하게는 100％가 사멸되거나 불활성화되나, 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 여전히 보유하는 것이 바람직하다. 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 불활성화된 형태, 유사체 또는 단편이 정말 사멸되거나 불활성화되었는가는 당분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 생존력에 대한 시험에 의해 시험될 수 있다.

용어 "상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 불활성화된 형태 또는 유사체"는 또한 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물, 바람직하게는 본원에 개시된 락토바실러스 종의 용균물, 분획물 또는 추출물을 포함하며, 상기 용균물, 분획물 또는 추출물은 바람직하게는 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 특이적으로 결합할 수 있다. 이 결합 능력은 본원에 기재된 바와 같이, 구체적으로 첨부된 실시예에 기재된 바와 같이 시험될 수 있다. 이 경우, 상기 기재된 본 발명의 측면 (i)에 따른 미생물의 용균물, 분획물 또는 추출물은 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 특이적으로 결합하지 않을 수 있고, 그러면, 당업자는 예를 들어 결합을 억제하는 물질을 제거하기 위해 하기 예시된 당분야에 공지된 방법에 의해 상기 용균물, 분획물 또는 추출물을 추가로 정제할 수 있다. 그 후, 당업자는 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 특이적으로 결합하는가에 대해 상기 용균물, 분획물 또는 추출물을 다시 시험할 수 있다.

본 발명에 따라 용어 "용균물"은 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 파손된 세포의 수성 배지 중 용액 또는 현탁액을 의미한다. 그러나, 상기 용어는 어떠한 제한으로도 해석되어서는 안된다. 세포 용균물은 예를 들어 거대분자, 예컨대 DNA, RNA, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질 등 및/또는 미세분자, 예컨대 아미노산, 당, 지방산 등, 또는 그의 분획물을 포함한다. 또한, 상기 용균물은 평활한 또는 과립상 구조일 수 있는 세포 잔해를 포함한다. 바람직하게는, 상기 용균물은 세포벽 또는 세포막 또는 둘 모두, 또는 세포벽 또는 세포막 또는 둘 모두의 부분 또는 단편을 포함한다. 예를 들어, 프렌치 가압기, 유리 또는 철 비드를 사용한 세포 밀 또는 효소적 세포 용균 등을 사용하는, 미생물의 세포 용균물의 제조 방법은 당분야에 공지되어 있다. 또한, 세포 용균은 세포를 개방/파괴하기 위한 당분야에 공지된 다양한 방법에 관한 것이다. 세포의 용균 방법은 중요하지 않고, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 세포의 용균을 달성할 수 있는 임의의 방법이 이용될 수 있다. 적절한 방법이 당업자에 의해 선택될 수 있고, 예를 들어 세포의 개방/파괴는 효소적으로, 화학적으로 또는 물리적으로 수행될 수 있다. 효소 및 효소 칵테일에 대한 비제한적 예는 프로테아제, 예컨대 프로테이나제 K, 리파제 또는 글리코시다제이고; 화학물질에 대한 비제한적 예는 이오노포어, 세제, 예컨대 나트륨 도데실 술페이트, 산 또는 염기이고; 물리적 수단의 비제한적 예는 고압, 예컨대 프렌치-가압, 삼투압, 온도, 예컨대 가열 또는 냉각이다. 또한, 단백질분해효소 이외의 효소, 산, 염기 등의 적절한 조합을 사용하는 방법이 또한 이용될 수 있다. 예를 들어, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 세포는 동결 및 해동에 의해, 보다 바람직하게는 -70℃ 미만의 온도에서의 동결 및 30℃ 초과의 온도에서의 해동에 의해 용균되며, 특히 -75℃ 미만의 온도에서의 동결이 바람직하고, 35℃ 초과의 온도에서의 해동이 바람직하고, -80℃ 미만의 동결 온도 및 37℃ 초과의 해동 온도가 가장 바람직하다. 또한, 상기 동결/해동을 1회 이상, 보다 바람직하게는 2회 이상, 보다 더 바람직하게는 3회 이상, 특히 바람직하게는 4회 이상, 가장 바람직하게는 5회 이상 반복하는 것이 바람직하다.

따라서, 당업자는 상기 개관적인 설명을 참고하고 필요하다면 상기 방법을 적절하게 변형시키거나 변화시킴으로써 바람직한 용균물을 제조할 수 있다. 바람직하게는, 기재된 용균물을 위해 사용되는 수성 배지는 물, 생리식염수 또는 완충 용액이다. 세균 세포 용균물의 장점은 덜 기술적인 설비가 필요하기 때문에 용이하게 제조되고 비용 효율적으로 저장될 수 있다는 것이다.

바람직하게는, 용어 "추출물"은 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 세포이하 성분, 예를 들어 거대분자, 예컨대 단백질, DNA, RNA, 펩티드, 탄수화물, 지질 등 및/또는 미세분자, 예컨대 아미노산, 당, 지방산 등, 또는 임의의 다른 유기 화합물 또는 분자, 또는 상기 거대분자 및/또는 미세분자의 조합물 또는 그의 임의의 분획물을 의미하며, 여기서 상기 추출물은 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유한다. 이 특이적 결합은 본원에 기재된 바와 같이, 구체적으로 첨부된 실시예에 기재된 바와 같이 시험될 수 있다. 바람직하게는, 상기 추출물은 세포벽 또는 세포막 또는 둘 모두, 또는 세포벽 또는 세포막 또는 둘 모두의 부분 또는 단편을 포함한다. 보다 바람직하게는, 용어 "추출물"은 세포-비함유 배지 중 상기 기재된 임의의 세포이하 성분을 지칭한다.

추가 바람직한 실시양태에서, 추출물은 상기 기재된 세포의 개방/파괴를 위한 당분야에 공지된 다양한 방법에 따라 세포의 용균에 의해, 및/또는 당업자에게 공지된 임의의 적절한 액체, 배지 또는 완충액 중 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 배양액의 원심분리 절차의 상등액으로서, 또는 이러한 배양액 또는 임의의 다른 적합한 세포 현탁액의 용균물로서 수득될 수 있다. 보다 바람직하게는, 추출물은 정제된 용균물 또는 세포 배양 상등액 또는 그의 임의의 분획물 또는 하위부분일 수 있으며, 상기 정제된 용균물 또는 세포 배양 상등액 또는 그의 임의의 분획물 또는 하위부분은 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유한다. 이 결합은 본원에 기재된 바와 같이, 구체적으로 첨부된 실시예에 기재된 바와 같이 시험될 수 있다. 용균물, 배양 상등액 또는 추출물의 적합한 분획 및 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 친화성 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 역상-크로마토그래피, 및 컬럼 또는 배치 방법에서 다른 크로마토그래피 물질에 의한 크로마토그래피, 다른 분획 방법, 예를 들어 여과 방법, 예를 들어 한외여과, 투석, 원심분리에서 크기-배제에 의한 투석 및 농축, 밀도-기울기 또는 단계 매트릭스에서 원심분리, 침전, 예를 들어 친화성 침전, 염용 또는 염석 (황산암모늄-침전), 알콜 침전 또는 임의의 다른 적합한 단백질화학적, 분자 생물학적, 생화학적, 면역학적, 화학적 또는 물리적 방법을 포함한다.

본 발명에 따라, 용균물은 또한 상기 언급된 용균물로부터의 분자의 분획물의 제제이다. 이들 분획물은 용균물의 상기 성분을 분리하기 위한 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 크로마토그래피, 예를 들어 친화성 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 역상-크로마토그래피, 및 컬럼 또는 배치(batch) 방법에서 다른 크로마토그래피 물질에 의한 크로마토그래피, 다른 분획 방법, 예를 들어 여과 방법, 예를 들어 한외여과, 투석, 원심분리에서 크기-배제에 의한 투석 및 농축, 밀도-기울기 또는 단계 매트릭스에서 원심분리, 침전, 예를 들어 친화성 침전, 염용 또는 염석 (황산암모늄-침전), 알콜 침전 또는 임의의 다른 적합한 단백질화학적, 분자 생물학적, 생화학적, 면역학적, 화학적 또는 물리적 방법에 의해 수득될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 다른 것보다 더 면역원성인 상기 분획물이 바람직하다. 당업자는 상기 개괄적인 설명 및 본원의 실시예의 구체적인 설명을 참조하고, 필요하다면 상기 방법을 적절하게 변형하거나 변화시킴으로써, 적합한 방법을 선택하고, 그의 면역원성 잠재성을 결정할 수 있다.

따라서, 용어 "상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 불활성화된 형태 또는 유사체"는 또한 상기 기재된 본 발명의 미생물, 바람직하게는 본원에 개시된 락토바실러스 종의 여과물을 포함하며, 여기서 상기 여과물은 바람직하게는 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유한다. 이 결합은 본원에 기재된 바와 같이, 구체적으로 첨부된 실시예에 기재된 바와 같이 시험될 수 있다. 이 경우, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 여과물 (상기 기재됨)은 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 특이적으로 결합하지 않을 수 있고, 그러면, 당업자는 예를 들어 결합을 억제하는 물질을 제거하기 위해 하기 예시된 당분야에 공지된 방법에 의해 상기 여과물을 추가로 정제할 수 있다. 그 후, 당업자는 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 특이적으로 결합하는가에 대해 상기 여과물을 다시 시험할 수 있다.

용어 "여과물"은 당업자에게 공지된 임의의 적절한 액체, 배지 또는 완충액 중 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 배양액의 원심분리 절차의 상등액으로서 수득된, 상기 기재된 본 발명의 미생물의 세포-비함유 용액 또는 현탁액을 의미한다. 그러나, 상기 용어는 어떠한 제한으로도 해석되어서는 안된다. 여과물은 예를 들어 거대분자, 예컨대 DNA, RNA, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질 등 및/또는 미세분자, 예컨대 아미노산, 당, 지방산 등, 또는 그의 분획물을 포함한다. 미생물의 여과물의 제조 방법은 당분야에 공지되어 있다. 또한, "여과물"은 당분야에 공지된 다양한 방법에 관한 것이다. 정확한 방법은 중요하지 않고, 상기 기재된 본 발명의 미생물의 세포의 여과를 달성할 수 있는 임의의 방법이 이용될 수 있다.

"상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 단편"은 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 세포의 임의의 부분을 포함한다. 바람직하게는, 상기 단편은 막-제제에 의해 수득된 막 분획물이다. 락토바실러스 속에 속한 미생물의 막 제제는 당분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 문헌 [Rollan et al., Int. J. Food Microbiol. 70 (2001), 303-307], [Matsuguchi et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10 (2003), 259-266] 또는 [Stentz et al., Appl. Environ. Microbiol. 66 (2000), 4272-4278] 또는 [Varmanen et al., J. Bacteriology 182 (2000), 146-154]에 기재된 방법을 이용함으로써 수득될 수 있다. 대안으로, 온전한 세포 제제가 또한 고려된다. 바람직하게는, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 본원에 기재된 유도체 또는 단편은, 본원에 상세히 기재되어 있는 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유한다.

한 측면에서, 본 발명은 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물, 그의 유도체 또는 돌연변이체 또는 유사체 또는 단편의, 스트렙토코커스 뮤탄스 이외의 뮤탄스 연쇄상구균에 의해 유발된 우식증의 치료 또는 예방용 항우식성 조성물, 바람직하게는 제약 또는 미용 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 조성물은 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합할 수 있는 젖산균 군에 속한 미생물, 또는 이 미생물의 돌연변이체, 유도체, 유사체 또는 단편을 포함한다. 보다 바람직하게는, 이 미생물은 상기 기재된 기탁된 미생물 또는 이들의 돌연변이체 또는 유도체 또는 상기 미생물의 유사체 또는 단편이다. 추가 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 상기 기재된 미생물을 조성물의 고체 형태로 1 mg 당 10² 내지 10¹²개의 세포, 바람직하게는 10³ 내지 10⁸개의 세포의 양으로 포함한다. 조성물의 액체 형태의 경우, 미생물의 양은 1 ml 당 10² 내지 10¹³개의 세포이다. 그러나, 특정 조성물에 대해, 미생물의 양은 본원에 기재된 바와 같이 상이할 수 있다. 본 발명의 바람직한 항우식성 조성물은 1％ (w/w) 내지 6％ (w/w)의 범위의 락토스를 함유하지 않는다. 조성물이 1％ (w/w) 이하의 락토스, 예를 들어 1％ (w/w) 미만, 바람직하게는 0.9％ (w/w) 미만, 0.8％ (w/w) 미만 등의 락토스를 함유하거나, 제약 조성물이 6％, 7％, 8％ (w/w) 초과 등의 락토스를 함유하는 것이 또한 바람직하다. 그러나, 대안으로, 조성물이 락토스를 함유하지 않는 것이 또한 바람직하다.

추가 측면에서, 이러한 항우식성 조성물은 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합할 수 있는 젖산균 군에 속한 미생물 또는 이 미생물의 돌연변이체, 유도체, 유사체 또는 단편을 미용상, 경구 또는 제약상 허용되는 담체 또는 부형제에 의해 제제화하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 이 미생물은 상기 기재된 기탁된 미생물 또는 이들의 돌연변이체, 유도체, 유사체 또는 단편이다. 본 발명에 따라 사용되는 바람직한 항우식성 조성물은 1％ (w/w) 내지 6％ (w/w)의 범위의 락토스를 함유하지 않는다. 조성물이 1％ (w/w) 이하의 락토스, 예를 들어 1％ (w/w) 미만, 바람직하게는 0.9％ (w/w) 미만, 0.8％ (w/w) 미만 등의 락토스를 함유하거나, 항우식성 조성물이 6％, 7％, 8％ (w/w) 초과 등의 락토스를 함유하는 것이 또한 바람직하다. 그러나, 대안으로, 항우식성 조성물이 락토스를 함유하지 않는 것이 또한 바람직하다.

본 발명에 따라 사용되는 용어 "조성물"은 상기 기재된 1종 이상의 미생물 또는 돌연변이체 또는 유도체, 바람직하게는 상기 기재된 기탁된 미생물 또는 상기 미생물의 유사체 또는 단편을 포함하는 조성물(들)에 관한 것이다. 하기 기재된 본 발명에 따라 사용되는 조성물은 상기 언급된 성분들을 임의의 조합으로 포함하는 것으로 고려된다. 이는 우식증의 예방 및/또는 치료에 적합한 1종 이상의 추가 성분을 임의로 포함할 수 있다. 따라서, 이는 하기 기재된 추가 성분들의 임의의 조합물을 임의로 포함할 수 있다. 용어 "우식증의 예방 및/또는 치료에 적합한 성분"은 치아 표면으로의, 펠리클로의 뮤탄스 연쇄상구균의 결합을 억제하고/거나 뮤탄스 연쇄상구균을 불활성화시키는 화합물 또는 그의 조성물 및/또는 조합물물을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 용어는 하기 기재된 바와 같이, 치아 표면으로의 뮤탄스 연쇄상구균의 접착을 억제하고/거나, 뮤탄스 연쇄상구균의 글리코실트랜스퍼라제의 활성을 억제하고/거나, 뮤탄스 연쇄상구균을 억제하거나 불활성화시키고/거나, 뮤탄스 연쇄상구균의 응집소-의존적 결합을 억제하고/거나, 뮤탄스 연쇄상구균의 사카로스-의존적 결합을 억제할 수 있는 화합물 또는 그의 조성물 및/또는 조합물을 포함한다.

특히, 조성물은 치아 표면으로의 뮤탄스 연쇄상구균의 접착을 억제하는 화합물을 임의로 추가로 포함하는 것으로 고려된다. 따라서, 이러한 화합물은 스트렙토코커스 뮤탄스의 적격성 신호 펩티드 (CSP)의 억제제인 것으로 고려된다. 상기 억제제는 천연 수용체인 히스티딘 키나제 수용체로의 상기 CSP의 결합을 경쟁적으로 억제하거나 상기 CSP에 대한 항체인, 상기 CSP의 유도체 또는 단편인 것으로 제CA 2,302,861호에 기재되어 있다. 상기 억제제는 치아 표면 상의 치아 플라크의 생물막 환경의 발생을 방지하고, 따라서, 뮤탄스 연쇄상구균의 결합을 방지한다. 대안으로, 본 발명에 따라 사용되는 조성물은 치아 우식증의 치료 및/또는 예방에 유용한 스트렙토코커스 뮤탄스 I/II 항원의 폴리펩티드 단편을 임의로 추가로 포함할 수 있다. 이러한 폴리펩티드 단편은 제US 6,500,433호에 기재되어 있다. 즉, 상기 폴리펩티드 단편은 천연 스트렙토코커스 뮤탄스 항원 I/II와 경쟁적 방식으로 응집소에 결합함으로써 포유동물 치아 표면에 접착할 수 있는 능력을 가지므로, 따라서 치아로의 스트렙토코커스 뮤탄스의 접착을 방지하거나 감쇠시킬 수 있다. 제US 6,500,433호의 몇몇 펩티드는 치아 표면 모델 (폴리스티렌 미량역가 플레이트의 웰 또는 히드록시아파타이트 비드에 흡착된 온전한 인간 타액)로의 스트렙토코커스 뮤탄스의 접착을 억제하는 것으로 나타났다. 따라서, 제US 6,500,433호에는 이들 펩티드가 1개 이상의 접착 부위를 포함하고 천연 SA I/II와 경쟁적 방식으로 포유동물 치아에 접착할 것이라고 기재되어 있다. 본 발명에 따라 사용되는 조성물의 다른 임의의 성분은 제WO 00/66616호에 기재된 바와 같이 스트렙토코커스 뮤탄스로부터의 섬모-관련 접착 단백질인 SmaA 또는 그의 단편이다. SmaA 단백질은 타액 펠리클로의 세균의 부착을 매개하는 스트렙토코커스 뮤탄스의 섬모로부터의 접착 단백질이며, 이는 52 kd 타액 단백질인 아밀라제로의 결합을 통한 것이라고 여겨진다. 성숙 SmaA 단백질은 환원성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 측정시 약 65 킬로달톤 (kd)의 분자량을 갖고, 아밀라제에 결합할 수 있는 능력을 나타내고, 스트렙토코커스 뮤탄스의 주요 면역우성 섬모 단백질이다. 따라서, SmaA는 치아 표면 상의 접착 부위에 대해 뮤탄스 연쇄상구균과 경쟁하는 것으로 여겨진다.

상기 기재된 바와 같이, 뮤탄스 연쇄상구균 글리코실트랜스퍼라제 활성을 억제하는 화합물이 본 발명에 따라 사용되는 조성물에 임의로 추가로 포함되는 것으로 고려된다. 예를 들어, 제US 2004/0057908호에는 상기 글리코실트랜스퍼라제의 활성을 억제하는 테르페노이드 및 플라보노이드의 혼합물이 기재되어 있다. 문헌 [Duarte et al., Biol. Pharm. Bull. 26 (2003), 527-531]에는 글리코실트랜스퍼라제 및 스트렙토코커스 뮤탄스의 성장 및 접착에 대한 신규 유형의 프로폴리스 및 그의 화학적 분획물이 기재되어 있다. 따라서, 상기 신규 유형의 프로폴리스 및 그의 화학적 분획물은 본 발명에 따라 사용되는 조성물의 임의의 추가 성분으로 고려된다. 문헌 [Koo et al., J. Antimicrob. Chemother. 52 (2003), 782-789]에는 아피제닌 및 tt-파네솔이 스트렙토코커스 뮤탄스 생물막 축적 및 다당류 생성을 억제한다고 기재되어 있다. 그러므로, 아피제닌 및 tt-파네솔은 본 발명에 따라 사용되는 조성물에 임의로 포함되는 것으로 고려된다. 탄수화물 지방산 에스테르가 문헌 [Devulapalle et al., Carbohydr. Res. 339 (2004), 1029-1034]에 글리코실트랜스퍼라제 활성을 수행하는 것으로 기재되어 있기 때문에, 상기 탄수화물 지방산 에스테르는 본 발명에 따라 사용되는 조성물에 임의로 포함되는 것으로 고려된다.

스트렙토코커스 뮤탄스의 직접 억제는 예를 들어 제WO 2004/000222호에 기재되어 있다. 즉, 스트렙토코커스 뮤탄스에 대해 특이적인 유전자 변형된 박테리오파지가 스트렙토코커스 뮤탄스에 의해 유발된 세균 우식증의 치료를 위해 사용된다. 제WO 2004/017988호에는 세균 우식증의 치료를 위해 사용되는 생물학적 활성 프로테아제 및 1종 이상의 생물학적 활성 글리코시다제의 조성물이 기재되어 있다. 문헌 [Imazato et al., Biomaterials 24 (2003), 3605-3609]에는 메타크릴로일옥시도데실피리디늄 브로마이드 (MDPB)가 스트렙토코커스 뮤탄스의 성장 억제에 유용하다고 기재되어 있다. 따라서, 상기 언급된 화합물이 본 발명에 따라 사용되는 조성물에 임의로 추가로 포함될 수 있는 것으로 고려된다.

스트렙토코커스 뮤탄스의 응집소-의존적 또는 사카로스-의존적 결합을 억제하는, 우유 락토페린 (문헌 [Mitoma et al., J. Biol. Chem. 276 (2001), 18060-18065]에 기재됨) 또는 헬리크리숨 이탈리쿰(Helichrysum italicum)의 추출물 (문헌 [Nostro et al., Lett. Appl. Microbiol. 38 (2004), 423-427]에 기재됨)은 본 발명에 따라 사용되는 조성물에 임의로 추가로 포함되는 것으로 고려된다.

또한, 본 발명에 따라 사용되는 조성물은 뮤타나제 (1,3-글루카나제) (예를 들어, 제DE 2152620호 또는 상기 인용 문헌 [Fuglsang (2000)]에 기재됨) 또는 스트렙토코커스 뮤탄스에 대한 항생제 (예를 들어, 제US 6,342,385호, 제US 5,932,469호, 제US 5,872,001호 또는 제US 5,833,958호에 기재됨)를 임의로 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 사용되는 조성물이 우식증의 예방 및/또는 치료에 적합한 상기 언급된 1종 이상의 임의의 성분을 임의로 포함할 수 있다는 것이 주목된다. 따라서, 상기 조성물은 2종, 3종, 4종, 5종 이상 등, 즉 "n"종의 임의의 성분을 함유할 수 있으며, 여기서 "n"은 제한되지 않는 2 초과의 정수이다. 상기 임의의 성분은 임의의 가능한 조합으로 조합될 수 있다.

조성물은 고체, 액체 또는 기체 형태일 수 있고, 특히 산제(들), 정제(들), 필름 제제(들), 용액(들), 에어로졸(들), 과립, 환제, 현탁액, 에멀젼, 캡슐, 시럽, 액체, 엘릭시르, 추출물, 팅크제 또는 유동 추출물의 형태 또는 구강 투여에 특히 적합한 형태일 수 있다.

구강 투여에 적합한 액체 제제, 예를 들어 시럽은 물, 통상적인 사카라이드, 예컨대 수크로스, 소르비톨 및 프룩토스, 글리콜 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜, 오일, 예컨대 참기름, 올리브유 및 대두유, 방부제, 예컨대 p-히드록시벤조에이트 에스테르, 보존제 예컨대 p-히드록시벤조에이트 유도체, 예를 들어 p-히드록시벤조에이트 메틸 및 벤조산나트륨, 및 기타 물질, 예컨대 향미제, 예를 들어 딸기 향미제 또는 박하를 사용하여 제조될 수 있다.

또한, 구강 투여에 적합한 제제, 예를 들어 정제, 산제 및 과립은 통상적인 사카라이드, 예컨대 수크로스, 글루코스, 만니톨 및 소르비톨, 전분, 예컨대 감자, 밀 및 옥수수, 무기 물질, 예컨대 탄산칼슘, 황산칼슘, 탄산수소나트륨 및 염화나트륨, 식물 분말, 예컨대 결정 셀룰로스, 감초 분말 및 용담 분말, 부형제, 예컨대 파인덱스, 붕해제 예컨대 전분, 한천, 젤라틴 분말, 결정 셀룰로스, 카르멜로스 나트륨, 카르멜로스 칼슘, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨 및 알긴산나트륨, 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 탈크, 수소화된 식물성유, 마크로골 및 실리콘 오일, 결합제, 예컨대 폴리비닐 알콜, 히드록시프로필 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 카르멜로스, 젤라틴, 및 전분 접착액, 계면활성제, 예컨대 지방산 에스테르, 및 가소제 예컨대 글리세린을 사용하여 제조될 수 있다. 필름 제제(들)는 당분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 필름 제제에 대한 예는 본원 실시예 27에 제공된다.

통상적인 구강 투여의 경우, 상기 기재된 미생물 또는 유사체 또는 단편의 용량은 상기 기재된 바와 같이 세포수에 대한 것 또는 질량에 대한 것, 예를 들어 1일 당 대상체 당 1 ㎍ 내지 50 g, 1 ㎍ 내지 10 g, 1 ㎍ 내지 5 mg, 1 ㎍ 내지 1 mg 또는 임의의 다른 중량 또는 1일 수회일 수 있다 (건조 중량). 비-인간 동물의 투여의 경우, 용량은 또한 동물의 연령 및 종, 및 그의 증상의 성질 또는 중증도에 의존하여 다양하다. 어떠한 특정 제한 없이, 동물에 대한 용량은 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 10 g, 바람직하게는 체중 1 kg 당 1 mg 내지 1 g, 1일마다 1회 또는 1일마다 수회이다. 그러나, 이들 용량 및 투여 횟수는 개인 상태에 의존하여 다양하다.

바람직하게는, 본 발명에 따라 사용되는 항우식성 조성물은 미용상 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 미용 조성물이다. 보다 바람직하게는, 상기 미용 조성물은 뮤탄스 연쇄상구균에 대해 활성을 갖는, 치제, 추잉검, 로젠지제, 구강세정제, 세구제, 치실 또는 치과용 테이프이다. 본 발명에 따라 사용되는 바람직한 미용 조성물은 1％ (w/w) 내지 6％ (w/w)의 범위의 락토스를 함유하지 않는다. 미용 조성물이 1％ (w/w) 이하의 락토스, 예를 들어 1％ (w/w) 미만, 바람직하게는 0.9％ (w/w) 미만, 0.8％ (w/w) 미만 등의 락토스를 함유하거나, 미용 조성물이 6％, 7％, 8％ (w/w) 초과 등의 락토스를 함유하는 것이 또한 바람직하다. 그러나, 대안으로, 미용 조성물이 락토스를 함유하지 않는 것이 또한 바람직하다.

본 발명에 따라 사용되는 미용 조성물은 본 발명의 조성물과 관련하여 상기 기재된 미생물, 그의 돌연변이체, 유도체, 유사체 또는 단편, 및 추가로 미용상 또는 경구 허용되는 담체를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용되는 조성물과 관련하여 언급된 바와 같이, 미생물, 그의 돌연변이체, 유도체, 유사체 또는 단편은 상기 기재된 미생물, 돌연변이체, 유도체, 유사체 또는 단편이다. 바람직하게는 본 발명에 따라 사용되는 미용 조성물은 구강 용도로 사용하기 위한 것이다. 따라서, 이는 치약, 치제, 치아 분말, 국소 구강 겔, 세구제, 의치용 제품, 구강 스프레이, 로젠지제, 구강 정제, 추잉검, 치실 또는 치과용 테이프의 형태일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "경구 또는 미용상 허용되는 담체"는 본 조성물을 안전하고 효과적인 방식으로 경구 적용하기 위해 사용될 수 있는 적합한 비히클을 의미한다. 이러한 비히클에는 플루오라이드 이온 공급원, 추가 치석 형성 억제제, 완충제, 다른 연마제, 퍼옥시드 공급원, 알칼리 금속 중탄산염, 증점제, 보습제, 물, 계면활성제, 이산화티타늄, 향미제 시스템, 감미제, 크실리톨, 착색제, 및 이들의 혼합물과 같은 물질이 포함될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "안전하고 효과적인 양"은 구강의 조직 및 구조에 대한 유해한 작용 없이, 치아를 세정하고 염색/플라크/치은염/치석을 감소시키는데 충분한 양을 의미한다.

본원에 기재된 본 조성물의 pH는 바람직하게는 약 3.0 내지 약 9.0의 범위이고, 바람직한 pH는 약 5.5 내지 약 9.0이고, 가장 바람직한 pH는 7.0 내지 약 8.5 또는 9.0이다.

미용 조성물은 통상적인 사용 방법으로 사용되고, 특정 치료제의 전신 투여 목적을 위해 의도적으로 삼키지는 않으나, 구강 활성 목적을 위해 실질적으로 모든 치아 표면 및/또는 구강 조직에 접촉하기에 충분한 시간 동안 구강 내에서 유지되는 생성물이다. 구강 조성물은 단일상 구강 조성물이거나, 2종 이상의 구강 조성물의 조합물일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "치제"는 달리 특정되지 않는 한 페이스트, 겔 또는 액체 제형을 의미한다. 치제 조성물은 임의의 바람직한 형태, 예컨대 깊은 줄무늬, 표면 줄무늬, 페이스트를 둘러싼 겔을 갖는 다층, 또는 임의의 이들의 조합의 형태일 수 있다. 치제 조성물은 분배기의 물리적으로 분리된 구획에 함유되고, 나란히 분배될 수 있다. 치제 조성물은 예를 들어 제EP-B1 0 617 608호에 기재되어 있다.

바람직한 치제 조성물은 실시예 21 내지 24에 기재되어 있다. 본 발명의 치제 조성물은 상기 기재된 성분 이외에 다양한 임의의 치제 성분들을 함유할 수 있으며, 이들 중 몇몇은 하기 기재되어 있다. 임의의 성분에는 예를 들어 접착제, 발포제, 향미제, 감미제, 추가 플라크 형성 억제제, 추가 연마제 및 착색제가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 이들 및 다른 임의의 성분은 예를 들어 제US 5,004,597호, 제US 4,885,155호, 제US 3,959,458호 및 제US 3,937,807호에 추가로 기재되어 있다.

예를 들어, 치약은 계면활성제, 킬레이팅제, 플루오라이드 공급원, 치아 미백제 및 치아색 변형 물질, 증점제, 보습제, 향미제 및 감미제, 알칼리 금속 중탄산염, 잡다한 담체 및/또는 다른 활성제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 바람직한 임의의 작용제 중 하나는 계면활성제이고, 바람직하게는 사르코시네이트 계면활성제, 이세티오네이트 계면활성제 및 타우레이트 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된다. 이들 계면활성제의 알칼리 금속 또는 암모늄 염이 본원에서 사용하기에 바람직하다. 라우로일 사르코시네이트, 미리스토일 사르코시네이트, 팔미토일 사르코시네이트, 스테아로일 사르코시네이트 및 올레오일 사르코시네이트의 나트륨 및 칼륨 염이 본원에서 가장 바람직하다.

다른 바람직한 임의의 작용제는 킬레이팅제, 예컨대 타르타르산 및 그의 제약상 허용되는 염, 시트르산 및 알칼리 금속 시트레이트 및 이들의 혼합물이다. 킬레이팅제는 세균의 세포벽에서 발견되는 칼슘과 착물을 형성할 수 있다. 킬레이팅제는 또한 이러한 생물집단을 무손상으로 유지하는 것을 돕는, 칼슘 브릿지로부터 칼슘을 제거함으로써 플라크를 붕괴시킬 수 있다.

추가 항우식성 효율성을 제공하기 위해 25℃에서 조성물 중 플루오라이드 이온 농도를 제공하기에 충분한 양으로 및/또는 사용시 약 0.0025 중량％ 내지 약 5.0 중량％, 바람직하게는 약 0.005 중량％ 내지 약 2.0 중량％의 양으로 치제 및 다른 구강 조성물에 존재하는 추가 수용성 플루오라이드 화합물을 갖는 것이 통상적이다. 다양한 플루오라이드 이온-제공 물질은 본 조성물에서 가용성 플루오라이드의 공급원으로서 사용될 수 있다. 적합한 플루오라이드 이온-제공 물질의 예는 제US 3,535,421호 및 제US 3,678,154호에 기재되어 있다. 대표적인 플루오라이드 이온 공급원에는 불화제1주석, 불화나트륨, 불화칼륨, 일불소인산나트륨 등이 포함된다. 불화제1주석 및 불화나트륨, 뿐만 아니라 이들의 혼합물이 특히 바람직하다.

본 발명에 따라 사용되는 구강 관리 조성물은 또한 치아 미백제, 예를 들어 표백제 또는 산화제, 예컨대 퍼옥시드, 퍼보레이트, 퍼카르보네이트, 퍼옥시산, 퍼술페이트, 금속 클로라이트 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 적합한 퍼옥시드 화합물에는 수소 퍼옥시드, 우레아 퍼옥시드, 칼슘 퍼옥시드 및 이들의 혼합물이 포함된다. 바람직한 퍼카르보네이트는 나트륨 퍼카르보네이트이다. 다른 적합한 미백제에는 칼륨, 암모늄, 나트륨 및 리튬 퍼술페이트 및 퍼보레이트 모노- 및 테트라히드레이트, 및 나트륨 피로포스페이트 퍼옥시히드레이트가 포함된다. 적합한 금속 클로라이트에는 칼슘 클로라이트, 바륨 클로라이트, 마그네슘 클로라이트, 리튬 클로라이트, 나트륨 클로라이트 및 칼륨 클로라이트가 포함된다. 바람직한 클로라이트는 나트륨 클로라이트이다. 추가 미백 활성제는 하이포클로라이트 및 이산화염소일 수 있다.

치아 미백제로서 표백제 이외에, 치아색 변형 물질이 본 발명에 유용한 구강 관리 활성제 중에서 고려될 수 있다. 이들 물질은 소비자를 만족시키기 위해 치아색을 변형시키기에 적합하다. 이들 물질은 치아 표면에 적용시 빛의 흡수 및/또는 반사와 관련하여 표면을 변형시키는 입자를 포함한다. 이러한 입자는 이러한 입자를 함유하는 필름을 치아 또는 치아들의 표면에 적용시 외관상 이익을 제공한다.

치약 또는 겔의 제조에서, 조성물의 바람직한 점조도를 제공하고, 사용시 바람직한 활성제 방출 특징을 제공하고, 저장 안정성을 제공하고, 조성물의 안정성을 제공하는 몇몇 증점제 등을 첨가하는 것이 필수적이다. 바람직한 증점제는 카르복시비닐 폴리머, 카라게난, 히드록시에틸 셀룰로스, 라포나이트(LAPONITE^®: 록우드 어디티브스 리미티드(Rockwood Additives Limited)에서 제조됨) 및 셀룰로스 에테르의 수용성 염, 예컨대 나트륨 카르복시메틸셀룰로스 및 나트륨 카르복시메틸 히드록시에틸 셀룰로스이다. 천연 검, 예컨대 카라야 검, 크산탄 검, 아라비안 검 및 트라가칸트 검이 또한 사용될 수 있다. 콜로이드상 마그네슘 알루미늄 실리케이트 또는 미분 실리카가 질감을 추가로 개선하기 위해 증점제의 일부로서 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 국소 구강 담체의 다른 임의의 성분은 보습제이다. 보습제는 공기에 노출시 치약 조성물이 경화되는 것을 방지하고, 입에 대한 촉촉한 감을 조성물에 제공하고, 특정 보습제의 경우, 향미제의 바람직한 단맛을 치약 조성물에 부여한다. 보습제는 순수한 보습제를 기준으로 일반적으로 조성물의 약 0 중량％ 내지 약 70 중량％, 바람직하게는 약 5 중량％ 내지 약 25 중량％를 차지한다. 본 발명의 조성물에서 사용하기에 적합한 보습제에는 식용 다가 알콜, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 크실리톨, 부틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜, 특히 소르비톨 및 글리세린이 포함된다.

향미제 및 감미제가 또한 조성물에 첨가될 수 있다. 적합한 향미제에는 윈터그린 오일, 박하유, 스피어민트 오일, 클로브 버드 오일, 멘톨, 아네톨, 메틸 살리실레이트, 유칼리프톨, 계피, 1-멘틸 아세테이트, 세이지, 유제놀, 파슬리유, 옥사논, 알파-이리손, 마조람, 레몬, 오렌지, 프로페닐 구에톨, 시나몬, 바닐린, 티몰, 리날로올, 신남알데히드 글리세롤 아세탈 (CGA라고 공지됨), 및 이들의 혼합물이 포함된다. 향미제는 일반적으로 조성물의 약 0.001 중량％ 내지 약 5 중량％의 수준으로 조성물에서 사용된다.

사용될 수 있는 감미제에는 수크로스, 글루코스, 사카린, 덱스트로스, 레불로스, 락토스 (상기 기재됨), 만니톨, 소르비톨, 프룩토스, 말토스, 크실리톨, 사카린 염, 타우마틴, 아스파르탐, D-트립토판, 디히드로칼콘, 아세술팜 및 시클라메이트 염, 특히 나트륨 시클라메이트 및 나트륨 사카린, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 조성물은 바람직하게는 이들 작용제를 조성물의 약 0.1 중량％ 내지 약 10 중량％, 바람직하게는 약 0.1 중량％ 내지 약 1 중량％로 함유한다.

본 발명은 또한 알칼리 금속 중탄산염을 포함할 수 있다. 알칼리 금속 중탄산염은 수용성이고, 안정화되지 않는 한 수성계에서 이산화탄소를 방출하는 경향이 있다. 중탄산나트륨 (또한 베이킹 소다라고 공지됨)은 바람직한 알칼리 금속 중탄산염이다. 본 조성물은 알칼리 금속 중탄산염을 약 0.5％ 내지 약 30％, 바람직하게는 약 0.5％ 내지 약 15％, 가장 바람직하게는 약 0.5％ 내지 약 5％로 함유할 수 있다.

상업적으로 적합한 구강 조성물의 제조에서 사용되는 물은 바람직하게는 이온 함량이 낮고 유기 불순물이 없어야 한다. 물은 일반적으로 수성 치약 조성물의 약 10 중량％ 내지 약 50 중량％, 바람직하게는 약 20 중량％ 내지 약 40 중량％를 차지한다. 이들 양의 물은 자유수, 및 다른 물질, 예컨대 소르비톨이 도입된 물을 포함한다. 이산화티타늄이 또한 본 조성물에 첨가될 수 있다. 이산화티타늄은 조성물에 불투명도를 부여하는 백색 분말이다. 이산화티타늄은 일반적으로 치제 조성물의 약 0.25 중량％ 내지 약 5 중량％를 차지한다.

본 조성물의 pH는 바람직하게는 완충제를 사용하여 조절된다. 본원에서 사용되는 완충제는 조성물의 pH를 약 4.5 내지 약 9.5 범위로 조절하기 위해 사용될 수 있는 작용제를 지칭한다. 완충제에는 인산일나트륨, 인산삼나트륨, 수산화나트륨, 탄산나트륨, 피로인산나트륨, 시트르산 및 시트르산나트륨이 포함된다. 완충제는 본 조성물의 약 0.5 중량％ 내지 약 10 중량％의 수준으로 투여될 수 있다. 치제 조성물의 pH는 3:1 치제의 수성 슬러리, 예를 들어 물 3부 대 치약 1부로부터 측정된다.

본 조성물에서 사용될 수 있는 다른 임의의 작용제에는 알킬- 및 알콕시-디메티콘 코폴리올, 예컨대 C12 내지 C20 알킬 디메티콘 코폴리올 및 이들의 혼합물에서 선택된 디메티콘 코폴리올이 포함된다. 상표명 아빌(Abil) EM90로 시판되는 세틸 디메티콘 코폴리올이 매우 바람직하다. 디메티콘 코폴리올은 일반적으로 약 0.01 중량％ 내지 약 25 중량％, 바람직하게는 약 0.1 중량％ 내지 약 5 중량％, 보다 바람직하게는 약 0.5 중량％ 내지 약 1.5 중량％의 수준으로 존재한다. 디메티콘 코폴리올은 긍정적인 치아감 이익의 제공을 돕는다. 다른 유용한 담체에는 제US 5,213,790호, 제US 5,145,666호, 제US 5,281,410호, 제US 4,849,213호 및 제US 4,528,180호에 개시된 바와 같은 2상 치제 제형이 포함된다.

본 미용 조성물은 또한 다른 활성제, 예컨대 항미생물제를 포함할 수 있다. 이러한 항미생물제에는 수불용성 비-양이온 항미생물제, 예컨대 할로겐화된 디페닐 에테르, 페놀성 화합물, 예를 들어 페놀 및 그의 상동체, 모노 및 폴리-알킬 및 방향족 할로페놀, 레소르시놀 및 그의 유도체, 비스페놀 화합물 및 할로겐화된 살리실아닐리드, 벤조산 에스테르 및 할로겐화된 카르바닐리드가 포함된다. 수용성 항미생물에는 4급 암모늄 염 및 비스-바이쿠아니드 염 등이 포함된다. 트리클로산 모노포스페이트는 추가 수용성 항미생물제이다. 4급 암모늄 항미생물제는, 4급 질소 상의 1 또는 2개의 치환기는 약 8 내지 약 20개, 전형적으로 약 10 내지 약 18개의 탄소 원자의 탄소 사슬 길이 (전형적으로 알킬기)를 가지나, 나머지 치환기 (전형적으로 알킬 또는 벤질 기)는 더 적은 탄소 원자, 예컨대 약 1 내지 약 7개의 탄소 원자, 전형적으로 메틸 또는 에틸 기를 갖는 것을 포함한다. 도데실 트리메틸 암모늄 브로마이드, 테트라데실피리디늄 클로라이드, 도미펜 브로마이드, N-테트라데실-4-에틸 피리디늄 클로라이드, 도데실 디메틸 (2-페녹시에틸) 암모늄 브로마이드, 벤질 디메틸스테아릴 암모늄 클로라이드, 세틸 피리디늄 클로라이드, 4급화 5-아미노-1,3-비스(2-에틸-헥실)-5-메틸 헥사 히드로피리미딘, 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드 및 메틸 벤제토늄 클로라이드가 전형적인 4급 암모늄 항세균제의 예이다. 다른 화합물은 제US 4,206,215호에 개시된 비스[4-(R-아미노)-1-피리디늄]알칸이다. 다른 항미생물제, 예컨대 구리 비스글리시네이트, 구리 글리시네이트, 아연 시트레이트 및 아연 락테이트가 또한 포함될 수 있다. 효소는 본 조성물에서 사용될 수 있는 다른 유형의 활성제이다. 유용한 효소에는 프로테아제, 용균 효소, 플라크 매트릭스 억제제 및 옥시다제의 종류에 속하는 효소가 포함된다. 프로테아제에는 파파인, 펩신, 트립신, 피신, 브로멜린이 포함되고; 세포벽 용균 효소에는 리소자임이 포함되고; 플라크 매트릭스 억제제에는 덱스트란제, 뮤타나제가 포함되고; 옥시다제에는 글루코스 옥시다제, 락테이트 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 요산 옥시다제, 퍼옥시다제, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제, 미엘로퍼옥시다제, 락토퍼옥시다제, 클로로퍼옥시다제가 포함된다. 옥시다제는 또한 항미생물 특성 이외에 미백/세정 활성을 갖는다. 이러한 작용제는 제US 2,946,725호 및 제US 4,051,234호에 기재되어 있다. 다른 항미생물제에는 클로르헥시딘, 트리클로산, 트리클로산 모노포스페이트 및 향미제 오일, 예컨대 티몰이 포함된다. 트리클로산 및 이 유형의 다른 작용제는 제US 5,015,466호 및 제US 4,894,220호에 개시되어 있다. 항-플라크 이익을 제공하는 이들 작용제는 치제 조성물의 약 0.01 중량％ 내지 약 5.0 중량％의 수준으로 존재할 수 있다.

본원에서 정의된 용어 "추잉검"은 씹기 적합하고 당업자에게 공지된 임의의 적합한 양, 바람직하게는 조성물의 2 중량％ 이상의 양의 엘라스토머를 포함하는 제과 조성물을 의미한다. 적합한 로젠지제 및 추잉검 성분은 예를 들어 제US 4,083,955호, 제US 6,770,264호 또는 제US 6,270,781호에 개시되어 있다. 바람직한 로젠지제는 실시예 19 및 20에 기재되어 있다. 바람직한 추잉검 조성물은 실시예 25에 기재되어 있다.

본 발명에 따라 사용되는 조성물은 바람직하게는 엘라스토머 또는 여러 상이한 엘라스토머들의 혼합물을 포함한다. 엘라스토머성 물질은 일반적으로 당분야에 공지되어 있으나, 예시적 예로는 스티렌-부타디엔 고무 (SBR); 합성 검; 폴리이소부틸렌 및 이소부틸렌-이소프렌 공중합체; 천연 검; 치클; 천연 고무; 젤루통; 발라타; 구타페르카; 레키 카스피; 소르바 및 이들의 혼합물이 포함된다. 본 발명에 따라 사용되는 조성물은 엘라스토머를 바람직하게는 약 2 중량％ 내지 약 30 중량％, 보다 바람직하게는 약 5 중량％ 내지 약 25 중량％로 포함한다. 이들 수준은 추잉검의 바람직한 최종 질감에 의해 결정되는데, 이는 엘라스토머의 총 수준이 약 2％ 미만인 경우, 베이스 조성물이 탄성, 씹는 질감 및 응집성이 결핍되나, 약 30％ 초과 수준에서는 제형이 단단한 고무같이 되고, 단단한 씹는감을 유지하기 때문이다. 엘라스토머 용매는 엘라스토머 성분의 연화를 돕기 때문에 또한 바람직하게는 본 발명에 따라 사용되는 조성물에 존재한다. 본원에서 사용하기 위한 엘라스토머 용매의 바람직한 예에는 부분적으로 수소화된 우드 로진의 펜타에리트리톨 에스테르, 우드 로진의 펜타에리트리톨 에스테르, 부분적으로 이량체화된 로진의 글리세롤 에스테르, 중합된 로진의 글리세롤 에스테르, 톨유, 목재 또는 검 로진의 글리세롤 에스테르, 부분적으로 수소화된 로진의 글리세롤 에스테르, 부분적으로 수소화된 로진의 메틸 에스테르, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 본 발명에 따라 사용되는 조성물은 엘라스토머 용매를 바람직하게는 약 2 중량％ 내지 약 50 중량％, 보다 바람직하게는 약 10 중량％ 내지 약 35 중량％로 포함한다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 로젠지제는 예를 들어 이당류를 압축성 고체 담체 상에 분산시키고, 임의로 윤활제 (예를 들어, 스테아르산마그네슘)와 같은 임의의 적절한 타정 보조제와 합하고, 정제로 압축하는, 당분야에서 인정된 압축 정제의 제조 기술에 의해 제조될 수 있다. 이러한 정제 제제화를 위한 고체 담체 성분은, 로젠지제가 입에서 유지되는 경우 구강/인두 점막과 접촉 및 흡수를 위해 로젠지제가 입에서 용이하게 용해되어 함유된 이당류 산을 타액 용액에서 방출시키도록, 타액-가용성 고체, 예컨대 냉각 수용성 전분 또는 단당류일 수 있다. 상기 기재된 제형의 pH는 약 4 내지 약 8.5의 범위일 수 있다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 로젠지제는 또한 다른 분야에서 인정된 고체 단위 투여량 제제화 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 구강세정제 또는 세구제는 바람직하게는 아래와 같을 수 있다:

A 박하유 1.2 부

아르니카 틴트 3.0 부

몰약 틴트 3.0 부

트윈 5.0 부

B 스피리투스 90％ 50.0 부

C 벤조산나트륨 0.2 부

감미제 (예를 들어 아스파르탄) 0.02 부

증류수 100 까지

A를 잘 혼합하고, B를 교반하면서 첨가하고, 후속적으로 C를 첨가한다. 제조후 48시간 내에 얻어진 투명한 액체를 여과한다. 다른 바람직한 구강세정제는 실시예 26에 기재되어 있다.

투여 형태 (액체 또는 고체)와 상관없이, 본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, 투여 형태는 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물 또는 상기 미생물의 유사체 또는 단편이 환자의 구강과 접촉하는 것을 촉진하기 위해 일정 시간 동안 환자의 입에서 유지된다.

본원에서 사용되는 용어 "치실" 및 "치과용 테이프"는 치간 및 치은하 표면에서 축적된 분해되는 식품 물질을 몰아내고 제거하고, 구강에 축적된 세균, 플라크 및/또는 치석을 몰아내고 제거하는 물질을 지칭한다. 치실 또는 치과용 테이프는 본 발명에 따른 상기 기재된 미생물 이외에, 세정제, 연마제, 타르타르 제어 성분, 미백제, 계면활성제 및/또는 활성 성분, 예컨대 플루오라이드, 항미생물제, 화학요법제 또는 항생제를 추가로 함유할 수 있다. 추가 첨가제는 플라크 형성 억제제, 향미제 및 착색제이다. 치실 또는 치과용 테이프는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 형태, 예를 들어 PTFE (테플론(Teflon)) 치실 형태 (예를 들어, 제US 3,664,915호, 제US 3,953,566호, 제US 3,962,153호, 제US 4,096,227호, 제US 4,187,390호, 제US 4,256,806호, 제US 4,385,093호, 제US 4,478,665호, 제US 4,776,358호, 제US 5,033,488호, 제US 5,209,251호, 제US 5,220,932호, 제US 5,518,012호, 제US 5,718,251호, 제US 5,765,576호 또는 제US 5,911,228호에 기재됨), 단사 치간 디바이스 형태 (예를 들어, 제US 3,800,812호, 제US 4,974,615호, 제US 5,760,117호, 제US 5,433,226호, 제US 5,479,952호, 제US 5,503,842호, 제US 5,755,243호, 제US 5,884,639호, 제US 6,003,525호 또는 제US 6,027,592호에 기재됨) 또는 생체성분 테이프 형태일 수 있다. 바람직하게는, 치실 또는 치과용 테이프는 엘라스토머성 코팅된 단사 형태 (예를 들어, 제US 20050226820호에 기재됨) 또는 배향된 열가소성 기재 치과용 테이프 형태 (예를 들어, 제US 20020144704호에 기재됨)일 수 있다.

상기 기재된 항우식성 미용 조성물은 인간 구강 투여의 범위, 뿐만 아니라 수의 구강 투여, 바람직하게는 비-인간 포유동물, 보다 바람직하게는 애완동물의 구강 투여의 범위로 사용될 수 있다. 항우식성 미용 조성물이 수의 구강 투여의 범위로 사용되는 경우, 조성물은 당업자에 의해 공지된 바와 같은 이러한 투여에 적합한 추가 성분을 함유할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 특이적으로 결합할 수 있는 젖산균 군에 속한 미생물의, 스트렙토코커스 뮤탄스 이외의 뮤탄스 연쇄상구균에 의해 유발된 우식증의 치료 또는 예방용 제약 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 이러한 제약 조성물은 상기 기재된 바와 같은 미생물 또는 그의 유도체 또는 돌연변이체 또는 유사체 또는 단편을 포함한다. 보다 바람직하게는, 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다.

제약 조성물은 본 발명에 따라 사용되는 조성물과 관련하여 기재된 치료 유효량의 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물, 또는 상기 미생물의 유도체, 돌연변이체 또는 유사체 또는 단편을 포함하고, 다양한 형태, 예를 들어 고체, 액체, 분말, 수성, 동결건조된 형태로 제제화될 수 있다.

제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 제약상 허용되는 담체와 함께 환자에게 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 용어 "제약상 허용되는"은 동물 및 보다 구체적으로 인간에서 사용하기 위해 규제 기관 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에 의해 승인된 것을 의미한다. 본 발명에 따라 사용되는 바람직한 제약 조성물은 1％ (w/w) 내지 6％ (w/w)의 범위의 락토스를 함유하지 않는다. 제약 조성물이 1％ (w/w) 이하의 락토스, 예를 들어 1％ (w/w) 미만, 바람직하게는 0.9％ (w/w) 미만, 0.8％ (w/w) 미만 등의 락토스를 함유하거나, 제약 조성물이 6％, 7％, 8％ (w/w) 초과 등의 락토스를 함유하는 것이 또한 바람직하다. 그러나, 대안으로, 제약 조성물이 락토스를 함유하지 않는 것이 또한 바람직하다.

용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 아쥬반트, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 담체는 제약상 허용된다, 즉 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이다. 이는 바람직하게는 등장성, 저장성 또는 약간 고장성이고, 상대적으로 낮은 이온 강도 (예컨대, 수크로스 용액에 의해 제공됨)를 갖는다. 이러한 제약 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및 오일 (석유, 동물, 식물 또는 합성 유래의 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함함)일 수 있다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체, 구체적으로 주사가능한 용액으로 사용될 수 있다. 적합한 제약 부형제에는 전분, 글루코스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 곡분, 백악, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 나트륨 이온, 건조된 탈지유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 부형제는 상기 기재된 바와 같이 락토스를 함유할 수 있으며, 가장 바람직하게는 락토스를 함유하지 않는다. 필요하다면, 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 산제, 서방형 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 구강 제형은 표준 담체, 예컨대 제약 등급의 만니톨, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다. 적합한 제약 담체의 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin]에 기재되어 있다. 탈지유, 탈지유 분말, 비-우유 또는 비-락토스 함유 생성물이 또한 사용될 수 있다. 탈지유 분말은 통상적으로 포스페이트 완충된 염수 (PBS)에 현탁되고, 단백질성 및 살아있는 오염물질을 박멸하기 위해 오토클레이브되거나 또는 여과된 후, 동결 건조, 열 건조, 진공 건조 또는 동결건조된다. 제약 담체로서 작용할 수 있는 물질의 몇몇 다른 예는 당, 예컨대 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 탈크; 스테아르산; 스테아르산마그네슘; 황산칼슘; 탄산칼슘; 식물성유, 예컨대 땅콩유, 면실유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 테오브로마 오일; 폴리올, 예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 한천; 알긴산; 발열원-비함유 물; 등장성 염수; 크랜베리 추출물 및 포스페이트 완충 용액; 탈지유 분말; 뿐만 아니라 제약 제형에서 사용되는 다른 비독성 상용성 물질, 예컨대 비타민 C, 에스트로겐 및 에키나시아이다. 습윤제 및 윤활제, 예컨대 나트륨 라우릴 술페이트, 뿐만 아니라 착색제, 향미제, 윤활제, 부형제, 타정제, 안정화제, 항산화제 및 보존제가 또한 존재할 수 있다.

바람직하게는, 구강 제형은 본원에 기재된 바와 같이 락토스를 함유하고, 가장 바람직하게는 락토스를 함유하지 않는다. 당분야에 익히 공지된 구강 투여에 적합한 다양한 담체 및/또는 부형제는 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 필요하다면, 비-우식원성 조성물은 다양한 공지된 첨가제, 예를 들어 보존제, 경화제, 윤활제, 윤화제, 안정화제, 에센스 등을 추가로 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적절한 투여 형태를 제공하기 위해 치료 유효량의 상기 언급된 화합물 (바람직하게는 정제된 형태)을 적합한 양의 담체와 함께 함유할 것이다. 제형은 투여 방식에 맞아야 한다.

일반적으로, 성분은, 단위 투여 형태로, 예를 들어 일정량의 활성제를 나타내는 앰플 또는 사쉐와 같은 기밀 밀봉된 용기에 건조 동결건조된 분말 또는 물-비함유 농축물로서 개별적으로 또는 함께 혼합되어 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 이는 멸균 제약 등급 물 또는 염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 중성 또는 염 형태로서 제제화될 수 있다. 제약상 허용되는 염에는 음이온과 함께 형성된 염, 예컨대 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 것, 및 양이온과 함께 형성된 염, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로케인 등으로부터 유래된 것이 포함된다.

시험관내 검정법이 최적 투여량 범위의 확인을 돕기 위해 임의로 이용될 수 있다. 제형에서 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질환 또는 장애의 중증도에 의존할 것이고, 전문인의 판단 및 각 환자의 환경에 따라 결정되어야 한다. 유효량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다. 바람직하게는, 제약 조성물은 직접 또는 아쥬반트와 조합되어 투여된다. 아쥬반트는 클로로퀸, 양자성 극성 화합물, 예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤, EtOH, 1-메틸 L-2-피롤리돈 또는 그의 유도체, 또는 비양자성 극성 화합물, 예컨대 디메틸술폭시드 (DMSO), 디에틸술폭시드, 디-n-프로필술폭시드, 디메틸술폰, 술폴란, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, 테트라메틸우레아, 아세토니트릴 또는 그의 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 이들 화합물은 pH 제한과 관련된 조건하에 첨가된다. 본 발명에 따라 사용되는 조성물은 척추동물에게 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 "척추동물"은 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 구체적으로, "척추동물"은 포유동물, 및 보다 구체적으로 인간을 포함한다.

용어 "투여되는"은 치료 유효량의 상기 언급된 조성물의 투여를 의미한다. "치료 유효량"은 조성물을 투여하는 목적인 효과를 생성하는 용량을 의미하며, 바람직하게는 이 효과는 항우식성이다. 정확한 용량은 치료 목적에 의존할 것이고, 공지된 기술을 이용하여 당업자에 의해 확인될 수 있을 것이다. 당분야에 공지되고 상기 기재된 바와 같이, 전신 대 국소 전달, 연령, 체중, 전반적 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 약물 상호작용 및 상태의 중증도에 대한 조절이 필요할 수 있고, 당업자에 의해 통상적인 실험으로 확인될 수 있는 것일 것이다.

상기 방법은 인간 치료 및 수의적 용도에 적용가능하다. 바람직한 치료적 활성을 갖는 본원에 기재된 화합물은 본원에 기재된 바와 같이 환자에게 생리학상 허용되는 담체로 투여될 수 있다. 도입 방법에 의존하여, 화합물은 하기 논의된 다양한 방법으로 제제화될 수 있다. 제형 중 치료 활성 화합물의 농도는 약 0.1 내지 100 중량％로 다양할 수 있다. 작용제는 단독으로 또는 다른 치료제와 조합되어 투여될 수 있다.

제약 조성물의 투여는 상기 논의된 다양한 방법 (구강, 피하, 정맥내, 동맥내, 결절내, 골수내, 경막내, 심실내, 비강내, 기관지내, 경피, 결절내, 직장내, 복강내, 근육내, 폐내, 질내, 직장내 또는 안내를 포함하나 이에 제한되지 않음)으로 수행될 수 있다.

바람직하게는, 투여는 구강 또는 협측 투여이다. 담당 의사 및 임상 인자가 투여 요법을 결정할 것이다. 의료 분야에 익히 공지된 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 환자의 크기, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 전반적 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물을 포함한 많은 인자에 의존한다. 전형적인 용량은 예를 들어 0.001 내지 1000 ㎍의 범위일 수 있으나, 이러한 예시적 범위 미만 또는 초과의 용량이 특히 상기 언급된 인자를 고려하여 고려된다.

투여량은 바람직하게는 1주 1회 제공되나, 치료의 진행 중에 투여량은 훨씬 더 긴 간격으로 제공되고, 필요에 따라 훨씬 더 짧은 간격으로, 예를 들어 1일마다 제공될 수 있다. 바람직한 경우, 면역 반응은 본원에 기재된 방법 및 당업자에게 공지된 추가 방법을 이용하여 모니터링되고, 투여량은 예를 들어 시간, 양 및/또는 조성물로 최적화된다. 진행은 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 국소로 또는 전신으로 투여될 수 있다. 제약 조성물이 공동-치료 접근법, 즉 다른 의약 또는 약물, 예를 들어 우식증의 예방, 치료 또는 완화를 위한 다른 약물 (본원에 기재됨)과 공동-투여로 사용되는 것이 또한 고려된다.

다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 상기 기재된 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 특이적으로 결합할 수 있는 젖산균 군에 속한 미생물의, 스트렙토코커스 뮤탄스 이외의 뮤탄스 연쇄상구균에 의해 유발된 우식증의 치료 또는 예방을 위한 식료품 또는 사료인 항우식성 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 식료품 또는 사료 형태의 항우식성 조성물은 경구 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는, 상기 기재된 미생물, 그의 돌연변이체, 유도체, 유사체 또는 단편을 포함하는 식품 또는 사료 조성물이다. 보다 바람직하게는, 미생물, 그의 돌연변이체, 유도체, 유사체 또는 단편은 상기 기재된 기탁된 미생물, 또는 이들의 돌연변이체, 유도체 또는 단편이다.

"식품" 또는 "사료"는 포유동물, 예를 들어 인간 또는 동물, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 애완동물을 위한 임의의 맛좋은 및/또는 마실수 있는 재료를 포함한다. 식품 및 사료는 본원에 기재되어 있다. "경구 허용되는 담체"는 상기 기재되어 있으며, 바람직하게는 비독성이고 식품 및/또는 사료 등급이다. 또한, 이 용어는 본 발명에 따라 사용되는 제약 조성물과 관련하여 언급된 담체를 또한 포함한다. 본 발명에 따라 사용되는 바람직한 식품 또는 사료 조성물은 1％ (w/w) 내지 6％ (w/w)의 범위의 락토스를 함유하지 않는다. 또한, 식품 또는 사료 조성물은 1％ (w/w) 이하의 락토스를 함유하는 것이 바람직하고, 예를 들어 식품 또는 사료 조성물은 1％ (w/w) 미만, 바람직하게는 0.9％ (w/w) 미만, 0.8％ (w/w) 미만의 락토스 등을 함유하거나, 식품 또는 사료 조성물은 6％, 7％, 8％ (w/w) 초과의 락토스를 함유한다. 대안으로, 식품 또는 사료 조성물이 락토스를 함유하지 않는 것이 또한 바람직하다.

본 발명에 따라, 용어 "식료품"은 먹을 수 있고 마실수 있는 모든 식품 및 음료를 포함한다. 따라서, 미생물, 그의 유도체, 유사체 또는 단편은 식품 또는 음료에 포함될 수 있다. 이들은 예를 들어, 검, 스프레이, 음료, 캔디, 조제 분유, 아이스크림, 동결된 디저트, 단맛 샐러드 드레싱, 우유 제제, 치즈, 쿼크, 락토스-비함유 요거트, 산성화 우유, 커피 크림 또는 휘프드 크림 등이다.

우유-기재 생성물은 본 발명의 범위 내에서 고려된다. 그러나, 우유는 동물, 예컨대 소, 염소, 양, 물소, 얼룩말, 말, 당나귀 또는 낙타 등의 유래를 의미하는 것으로 이해된다. 우유는 천연 상태, 환원유, 탈지유, 또는 세균 성장에 필요하거나 발효유의 후속적 가공을 위한 화합물, 예컨대 지방, 효모 추출물의 단백질, 펩톤 및/또는 계면활성제가 보충된 우유일 수 있다. 용어 우유는 또한 통상적으로 식물성 우유라고 불리는 우유, 즉 콩과 식물 (대두, 병아리콩, 렌즈콩 등) 또는 지방 종자 (평지씨, 대두, 참깨, 면화 등)와 같은 식물 물질의 처리되거나 처리되지 않은 추출물에 적용되며, 여기서 추출물은 화학적 작용, 산 발효 및/또는 열에 의해 응고시킬 수 있는 단백질을 용액 또는 콜로이드상 현탁액으로 함유한다. 마지막으로, 용어 우유는 또한 동물성 우유 및 식물성 우유의 혼합물을 나타낸다.

본 발명의 미생물 또는 그의 유도체 또는 유사체 또는 단편이 유사한 함량을 갖는 요거트 등에 첨가되는 경우, 본 발명의 미생물을 약 10⁵ 내지 10⁷개 세포/ml의 농도로 첨가하는 것이 충분하다. 이러한 경우, 음료 그 자체의 품질에 대한 중요한 부작용 없이, 뮤탄스 연쇄상구균의 우식원성 균주에 의해 유도된 치아 우식증을 완전히 예방하거나 억제하는 것이 가능하다.

이러한 식품 음료 또는 사료는 식품, 음료 또는 사료의 원료 또는 조리된 물질에 활성 성분을 첨가하는 것을 포함하는, 식품 및 음료 또는 사료의 일반적 제조 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 식품, 음료 또는 사료는 식품, 음료 또는 사료를 위해 일반적으로 사용되는 바와 동일한 방법으로 성형되고 과립화될 수 있다. 성형 및 과립화 방법에는 과립화 방법, 예컨대 유동층 과립화, 교반 과립화, 압출 과립화, 롤링 과립화, 기류 과립화, 압밀 성형 과립화, 크래킹 과립화, 분무 과립화 및 사출 과립화, 코팅 방법, 예컨대 팬 코팅, 유동층 코팅 및 건조 코팅, 퍼프 건조, 과량 스팀 방법, 발포 매트 방법, 확장 방법, 예컨대 마이크로웨이브 인큐베이션 방법, 및 압출 과립화 기기 및 압출기에 의한 압출 방법이 포함된다.

본 발명에서 사용되는 식품, 음료 또는 사료에는 활성 성분으로서 본 발명의 미생물, 그의 유도체 또는 유사체 또는 단편을 포함하는 임의의 식품, 음료 또는 사료가 포함된다. 식품, 음료 또는 사료 중 활성 성분은 얻어진 식품, 음료 또는 사료가 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합하는 그의 활성을 발휘할 수 있는 한, 임의의 농도로 구체적으로 제한되지 않는다. 활성 성분의 농도는 바람직하게는 본원에 기재된 세포수와 관련하여 또는 이러한 활성 성분을 포함하는 식품, 음료 또는 사료의 0.001 내지 100 중량％, 보다 바람직하게는 0.01 내지 100 중량％, 가장 바람직하게는 0.1 내지 100 중량％이다.

활성 성분이 첨가된 특정 식품 또는 음료에는 예를 들어, 쥬스, 청량 음료, 스프, 차, 산유 음료, 유제품, 예컨대 발효유, 아이스, 완충제, 치즈, 가공유 및 탈지유, 육류 제품, 예컨대 햄, 소세지 및 햄버거, 어묵 제품, 달걀 제품, 예컨대 양념된 에그롤 및 에그커드, 제과류, 예컨대 쿠키, 젤리, 스낵 및 추잉검, 빵, 국수, 피클, 훈연 제품, 건어물 및 양념이 포함된다. 식품 또는 음료의 형태에는 예를 들어, 분말 식품, 시트형 식품, 병 식품, 캔 식품, 레토르트 식품, 캡슐 식품, 정제 식품 및 유동 식품이 포함된다.

뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합하는 활성을 갖는, 유아에 의해 섭취되는 식품 또는 음료는 바람직하게는 유아용 영양 조성물이다. 이러한 유아용 영양 조성물에는 유아를 위해 제조된 변형된 우유, 단백질-분해 우유, 특정 영양학적으로 변형된 우유 또는 이유식 및 토들러용 조리 식품이 포함된다. 유아용 영양 조성물 형태에는 분유, 건조되고 분쇄된 이유식이 포함되나 이에 제한되지 않고, 또한 일반적 식품, 예컨대 아이스크림, 발효유 및 유아 섭취용 젤리가 포함된다.

본 발명에 따른 유아용 영양 조성물은 주로 단백질, 지질, 사카라이드, 비타민 및/또는 미네랄로 구성된다. 영양 조성물에서, 활성 성분이 이들 성분과 블렌딩된다.

단백질에는 우유 단백질, 예컨대 탈지유, 카제인, 유장 치즈, 유장 단백질 농축물 및 유장 단백질 단리물 및 그의 분획물, 예컨대 알파 s-카제인, 베타-카제인, 알파-락토알부민 및 베타-락토글로불린이 포함된다. 또한, 계란 단백질, 예컨대 계란 노른자 단백질, 계란 흰자 단백질 및 난백 알부민, 또는 대두 단백질, 예컨대 탈지 대두 단백질, 분리된 대두 단백질 및 농축된 대두 단백질이 사용될 수 있다. 이들 이외에, 단백질, 예컨대 밀 글루텐, 어육 단백질, 소고기 단백질 및 콜라겐이 또한 만족스럽게 사용될 수 있다. 또한, 이들 단백질의 분획물, 산 또는 효소 처리로부터의 펩티드, 또는 유리 아미노산이 만족스럽게 사용될 수 있다. 유리 아미노산은 질소 공급원으로서 작용할 수 있고, 또한 특정 생리 작용을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 유리 아미노산에는 예를 들어 타우린, 아르기닌, 시스테인, 시스틴 및 글루타민이 포함된다. 지질에는 동물 지방 및 오일, 예컨대 우유 지방, 라드, 소고기 지방 및 어유, 식물성유, 예컨대 대두유, 평지씨유, 옥수수유, 코코넛 오일, 팜유, 팜커넬유, 잇꽃유, 들기름, 아마인유, 달맞이꽃 종자유, 중쇄 지방산 트리글리세리드 및 면실유, 세균 생성 지방 및 오일, 및 그의 분획 오일, 그의 수소화 오일, 및 그의 에스테르 교환 오일이 포함된다. 블렌딩되는 지질의 양은 용도에 의존하여 다양하다.

사카라이드에는 예를 들어, 1종 이상의 전분, 가용성 다당류, 덱스트린, 단당류, 예컨대 수크로스, 락토스 (본원에 기재됨), 말토스, 글루코스 및 프룩토스 및 다른 올리고사카라이드가 포함된다. 이러한 사카라이드의 총량은 영양 조성물 중 총 고체에 대해 바람직하게는 40 내지 80 중량％이다. 또한, 인공 감미제, 예컨대 아스파르탐이 만족스럽게 사용될 수 있다. 인공 감미제의 양은 적절하게는 영양 조성물 중 총 고체 당 0.05 내지 1.0 중량％이다.

비타민에는 필수 성분으로서 리코펜이 포함되나 이에 제한되지 않으며, 또한, 유아에 투여될 수 있는 한, 예를 들어 비타민 A, 비타민 B 군, 비타민 C, D 및 E, 및 비타민 K 군, 엽산, 판토텐산, 니코틴아미드, 카르니틴, 콜린, 이노시톨 및 바이오틴과 같은 비타민이 포함된다. 이러한 비타민은 바람직하게는 유아용 영양 조성물 중 총 고체 당 10 mg 내지 5 g (중량 기준)이다.

또한, 미네랄에는 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 철, 구리, 아연, 인, 염소, 망간, 셀레늄 및 요오드가 포함된다. 이러한 미네랄은 바람직하게는 유아용 영양 조성물 중 총 고체 당 1 mg 내지 5 g (중량 기준)이다.

상기 기재된 성분들 이외에, 본 발명에 따라 사용되는 유아용 영양 조성물은 영양 조성물에 바람직하게 블렌딩되는 임의의 성분, 예를 들어 식이 섬유, 뉴클레오티드, 핵산, 향미제 및 착색제와 함께 블렌딩될 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 식품 또는 음료는 스트렙토코커스 뮤탄스 이외의 뮤탄스 연쇄상구균에 의해 유발된 우식증의 에방 및/또는 치료를 위한 건강 식품 또는 음료 또는 기능성 식품 또는 음료로서 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 식품 또는 음료를 섭취시, 섭취되는 양은 구체적으로 제한되지 않는다. 섭취되는 양은 일반적으로 활성 성분의 총량을 기준으로 1일마다 0.1 내지 50 g, 바람직하게는 0.5 g 내지 20 g이다. 식품 또는 음료는 1일 내지 5년, 바람직하게는 2주 내지 1년의 기간 동안 상기 양으로 연속적으로 섭취된다. 본원에서, 섭취되는 양은 식품 또는 음료를 섭취하는 개인의 증상의 중증도, 그의 연령 및 체중 등에 의존하여 적절한 범위로 조절될 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 사료는 활성 성분을 포함하는 임의의 사료일 수 있다. 사료에는 예를 들어, 개, 고양이 및 래트용 애완동물 사료, 소 및 돼지용 가축 사료, 닭 및 칠면조용 닭 사료, 및 도미류 및 방어류용 어류 양식용 사료가 포함된다.

사료는 예를 들어, 곡물, 겨, 유박류, 동물-유래 사료 원료, 다른 사료 원료 및 정제된 생성물을 포함한 사료 원료에서 상기 기재된 활성 성분을 적절하게 블렌딩함으로써 제조될 수 있다.

곡물에는 예를 들어, 기장, 밀, 보리, 귀리, 호밀, 현미, 메밀, 조, 수수, 피, 옥수수 및 대두가 포함된다.

겨에는 예를 들어, 쌀겨, 탈지 쌀겨, 겨, 최하급 곡분, 맥아, 보리겨, 스크리닝 펠렛, 옥수수겨 및 옥배유가 포함된다.

유박류에는 예를 들어, 대두박, 대두분, 아마인박, 면실박, 땅콩박, 잇꽃박, 코코넛박, 팜박, 참깨박, 해바라기박, 채종박, 케이폭실박 및 겨자박이 포함된다.

동물-유래 사료 원료에는 예를 들어, 어분, 수입분, 전식 및 연안분, 가용성 어류, 육분, 육분 및 골분, 혈분, 분해된 모발, 골분, 도살장으로부터의 부산물, 우모분, 누에고치, 탈지유, 카제인, 건조 유장 및 크릴이 포함된다.

다른 사료 원료에는 예를 들어, 식물 줄기 및 잎, 예컨대 자주개자리, 헤이큐브, 자주개자리 엽분 및 로커스트 엽분, 옥수수 가공 산업으로부터의 부산물, 예컨대 옥수수 글루텐 분, 옥수수 글루텐 사료 및 옥수수 스팁 리커, 전분, 당, 효모, 발효 산업으로부터의 부산물, 예컨대 맥주 잔류물, 맥아근, 술 잔류물 및 간장 잔류물, 및 농산 부산물, 예컨대 감귤 가공 잔류물, 비지, 커피 잔류물 및 코코아 잔류물, 카사바, 잠두콩, 과르박, 해초, 스피룰리나 및 클로렐라가 포함된다.

정제된 생성물은 예를 들어, 단백질, 예컨대 카제인 및 알부민, 아미노산, 전분, 셀룰로스, 사카라이드, 예컨대 수크로스 및 글루코스, 미네랄 및 비타민을 포함한다.

본 발명에 따른 사료를 동물에게 제공하는 경우, 섭취되는 사료의 양은 구체적으로 제한되지 않으나, 바람직하게는, 예를 들어 활성 성분의 양으로 기준으로 1일마다 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 50 g, 바람직하게는 1일마다 체중 1 kg 당 0.5 mg 내지 20 g이다. 사료는 1일 내지 5년, 바람직하게는 2주 내지 1년의 기간 동안 상기 양으로 연속적으로 섭취된다. 다시, 섭취되는 양은 사료를 섭취하는 동물의 종, 연령 및 체중 등에 의존하여 적절한 범위로 조절될 수 있다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 상기 기재된 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 특이적으로 결합할 수 있는 젖산균 군에 속한 미생물의, 스트렙토코커스 뮤탄스 이외의 뮤탄스 연쇄상구균에 의해 유발된 우식증의 치료 또는 예방용 항우식성 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이며, 여기서 항우식성 조성물은 식품, 음료 및 사료용 첨가제이다. 바람직하게는, 식품, 음료 및 사료용 첨가제는 특히 뮤탄스 연쇄상구균에 특이적으로 결합할 수 있는 상기 기재된 미생물 또는 그의 유도체 또는 돌연변이체 또는 유사체 또는 단편의 존재로 인해, 스트렙토코커스 뮤탄스 이외의 뮤탄스 연쇄상구균에 의해 유발된 우식증을 예방하고/거나 치료하기 위한 것이다. 바람직하게는, 미생물, 그의 돌연변이체, 유도체, 유사체 또는 단편은 상기 기재된 기탁된 미생물, 또는 이들의 돌연변이체, 유도체 또는 단편이다. 식품 또는 음료용 첨가제에는 유아용 영양 조성물용 첨가제가 포함된다.

식품용 첨가제는 식품, 음료 또는 사료용 첨가제의 일반적인 제조 방법에 의해 제조될 수 있다. 필요하다면, 식품, 음료 또는 사료에서 일반적으로 사용하기 위한 첨가제, 예를 들어 식품 첨가제 핸드북 (The Japan Food Additives Association; issued on January 6, 1997)에 기재된 첨가제, 예를 들어 감미제, 착색제, 보존제, 증점제 및 안정화제, 항산화제, 색지제, 방부제, 방부제, 검 베이스, 고미제, 효소, 증백제, 산성화제, 양념, 유화제, 증진제, 제조용 첨가제, 향미제 및 향신료 추출물이 만족스럽게 첨가될 수 있다. 또한, 제약 정제에 대해 이미 언급된, 통상적인 사카라이드, 전분, 무기 물질, 식물 분말, 부형제, 붕해제, 윤활제, 결합제, 계면활성제 및 가소제가 만족스럽게 첨가될 수 있다.

첨가제에는 하기 첨가제가 포함된다.

감미제에는 아스파르탐, 감초, 스테비아, 자일로스 및 라칸카 (나한과 열매)가 포함된다. 착색제에는 카로티노이드 및 심황색소, 플라보노이드, 캐러멜 색소, 스피룰리나 색소, 클로로필, 자색 고구마 색소, 자색 참마 색소, 들깨 색소 및 블루베리 색소가 포함된다.

보존제에는 예를 들어 아황산나트륨, 벤조에이트, 벤조인 추출물, 소르베이트 및 프로피오네이트가 포함된다. 증점제 및 안정화제에는 예를 들어 검, 예컨대 아라비아 검 및 크산탄 검, 알기네이트, 키틴, 키토산, 알로에 추출물, 구아 검, 히드록시프로필 셀룰로스, 나트륨 카제인, 옥수수 전분, 카르복시메틸 셀룰로스, 젤라틴, 한천, 덱스트린, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 알콜, 미세섬유 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 해초 셀룰로스, 나트륨 폴리아크릴레이트, 나트륨 폴리포스페이트, 카라게난 또는 효모 세포벽이 포함된다.

항산화제에는 예를 들어 비타민 C 군, 나트륨 에틸렌디아민테트라아세테이트, 칼슘 에틸렌디아민테트라아세테이트, 에리소르빈산, 오리자놀, 카테킨, 퀘르세틴, 클로브 추출물, 효소-처리 루틴, 사과 추출물, 참깨 추출물, 디부틸히드록시톨루엔, 회향 추출물, 양고추냉이 추출물, 미나리 추출물, 차 추출물, 토코페롤, 평지씨 추출물, 커피빈 추출물, 해바라기씨 추출물, 페룰산, 부틸히드록시아니솔, 블루베리 잎 추출물, 프로폴리스 추출물, 후추 추출물, 봉선화 추출물, 갈산, 유칼립투스 추출물 및 로즈메리 추출물이 포함된다.

색지제에는 예를 들어 아질산나트륨이 포함된다. 방부제에는 예를 들어 아황산나트륨이 포함된다.

방부제에는 예를 들어 o-페닐 페놀이 포함된다. 검 베이스에는 예를 들어 아세틸리시놀레에이트 메틸, 우루시 검, 에스테르 검, 엘레미 수지, 우루큐리 왁스, 카우리 검, 카나우바 왁스, 글리세린 지방산 에스테르, 경납, 코파이바발삼, 코팔 수지, 고무, 쌀겨 왁스, 사탕수수 왁스, 쉘락, 젤루통, 수크로스 지방산 에스테르, 탈중합 천연 고무, 파라핀 왁스, 발삼전나무, 프로필렌 글리콜 지방산 에스테르, 분말 펄프, 분말 현미, 호호바 오일, 폴리이소부틸렌, 폴리부텐, 미세결정질 왁스, 유향수지 검, 밀랍 및 인산칼슘이 포함된다.

고미제에는 예를 들어, 이소-알파-고미산, 카페인, 운지 (구름버섯) 추출물, 기나나무 껍질 추출물, 황백 추출물, 용담근 추출물, 향신료 추출물, 효소적으로 변형된 나린진, 자메이카 계피 추출물, 테오브로민, 나린진, 계피 추출물, 압생트 추출물, 연명초 추출물, 올리브차, 광귤 (시트러스 오란티움(Citrus aurantium)) 추출물, 홉 추출물 및 쓴쑥 추출물이 포함된다.

효소에는 예를 들어 아밀라제, 트립신 또는 레닛이 포함된다.

증백제에는 예를 들어 우루시 왁스 및 목랍이 포함된다. 산성화제에는 예를 들어 아디프산, 이타콘산, 시트르산, 숙신산, 아세트산나트륨, 타르타르산, 이산화탄소, 락트산, 피트산, 푸마르산, 말산 및 인산이 포함된다. 양념에는 예를 들어 아미노산, 예컨대 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 알라닌, 이소류신, 글리신, 세린, 시스틴, 티로신, 류신 및 프랄린, 핵산, 예컨대 나트륨 이노시네이트, 나트륨 우리디네이트, 나트륨 구아닐레이트, 나트륨 시티딜레이트, 칼슘 리보뉴클레오티드 및 나트륨 리보뉴클레오티드, 유기산, 예컨대 시트르산 및 숙신산, 염화칼륨, 염화나트륨-감소 염수, 조 염화칼륨, 유장 염, 인산삼칼륨, 인산수소이칼륨, 인산이수소칼륨, 인산수소이나트륨, 인산이수소나트륨, 인산삼나트륨 및 클로렐라 추출물이 포함된다.

증진제에는 예를 들어 아연 염, 비타민 C 군, 다양한 아미노산, 5-아데닐산, 염화철, 헤스페리딘, 다양한 하소된 칼슘, 다양한 비-하소된 칼슘, 디벤조일티아민, 수산화칼슘, 탄산칼슘, 티아민의 히드로클로라이드 염, 두날리엘라 카로틴, 토코페롤, 니코틴산, 당근 카로틴, 팜유 카로틴, 판토텐산칼슘, 비타민 A, 히드록시프롤린, 피로인산이수소칼슘, 피로인산제1철, 피로인산제2철, 페리틴, 헴 철, 메나퀴논, 엽산 및 리보플라빈이 포함된다.

제조용 첨가제에는 예를 들어 가공 보조제, 예컨대 아세톤 및 이온 교환 수지가 포함된다. 향미제에는 예를 들어 바닐라 에센스가 포함되고, 향신료 추출물에는 예를 들어 고추 추출물이 포함된다.

이들 다양한 첨가제는 본 발명에 따라 투여 방식을 고려하여 활성 성분에 첨가될 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 항우식성 조성물은 일정량의 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물 또는 그의 유도체 또는 돌연변이체 또는 유사체 또는 단편을 포함한다. 바람직하게는, 미생물, 그의 돌연변이체, 유도체, 유사체 또는 단편은 상기 기재된 기탁된 미생물, 또는 이들의 돌연변이체, 유도체 또는 단편이다. 조성물 및 구체적으로 항우식성 조성물이 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물을 프로바이오틱 미생물 형태로 포함하는 것이 고려된다.

즉, 프로바이오틱 효과 이외에, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 프로바이오틱 미생물은 스트렙토코커스 뮤탄스 이외의 뮤탄스 연쇄상구균에 의해 유발된 우식증의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 상기 프로바이오틱 미생물의 양은 타당한 의학적 판단 범위 내에서 치료될 상태, 바람직하게는 우식증을 상당히 긍정적으로 변형시키기에 충분히 많으나, 심각한 부작용을 회피하기에 충분히 적다 (적당한 이익/위험 비에서). 상기 프로바이오틱 미생물의 유효량은 달성할 특정 목표, 치료될 환자의 연령 및 물리적 상태, 기저 질환의 중증도, 치료 지속시간, 동시 치료법의 성질 및 사용되는 특정 미생물에 따라 다양할 것이다. 따라서, 상기 프로바이오틱 미생물의 유효량은 뮤탄스 연쇄상구균으로의 바람직한 특이적 결합을 제공하는 최소량일 것이다. 예를 들어, 포스페이트 완충된 염수 용액 0.05 ml 또는 한천 현탁액 0.05 ml 중 생존가능한 또는 비-생존가능한 온전한 세포로서 1 × 10⁹개의 세균, 또는 동등한 건조 중량의 세포벽 단편의 존재는 약 0.05 ml 내지 약 20 ml의 양으로 투여시 효과적이다.

결정된 실용적 장점은 프로바이오틱 유기체가 통상적인 방식, 예컨대 경구 경로로 투여될 수 있다는 것이다. 투여 경로에 의존하여, 상기 프로바이오틱 유기체를 포함하는 활성 성분은 효소, 산 및 상기 유기체를 불활성화시킬 수 있는 기타 자연 조건의 작용으로부터 상기 유기체를 보호하는 물질로 코팅될 필요가 있을 수 있다. 비경구 투여 이외의 투여에 의해 프로바이오틱 유기체를 투여하기 위해, 이는 불활성화를 방지하는 물질로 코팅되거나 상기 물질과 함께 투여되어야 한다. 예를 들어, 프로바이오틱 유기체는 효소 억제제와 함께 또는 리포솜으로 공동투여될 수 있다. 효소 억제제에는 췌장 트립신 억제제, 디이소프로필플루오로포스페이트 (DFP) 및 트라실롤이 포함된다. 리포솜은 락토바실리 또는 그의 부산물을 비뇨생식기 표면으로 전달하는, 수중유중수 P40 에멀젼 뿐만 아니라 통상적인 및 특별히 고안된 리포솜을 포함한다. 분산액은 또한 예를 들어 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물, 및 오일에서 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산액 배지 및 상기 예시된 다른 필수 성분을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균된 프로바이오틱 유기체를 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이미 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가 바람직한 성분의 분말을 수득하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다. 추가 바람직한 제조 방법에는 동결건조 및 열-건조가 포함되나 이에 제한되지 않는다.

항우식성 조성물은 또한 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 세포가 예를 들어 신선한, 농축된 또는 건조된 형태로 첨가된, 본원에 기재된 허용되는 제약 담체를 포함하는 경구 또는 협측으로 투여되도록 의도된 생성물을 포함한다. 물론, 또한 상기 미생물의 유도체 또는 유사체 또는 단편, 또는 본원에 개시된 상기 미생물, 그의 유도체 및/또는 유사체 및/또는 단편의 임의의 조합이 첨가될 수 있다. 이들 생성물은 섭취가능한 현탁액, 겔, 디퓨저, 캡슐, 경질 젤라틴 캡슐, 시럽의 형태로 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 갈레닉 형태로 제공될 수 있다.

프로바이오틱 유기체가 상기 기재된 바와 같이 적합하게 보호된 경우, 활성 화합물은 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 함께 경구로 투여될 수 있거나, 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐에 봉입될 수 있거나, 위를 통해 통과하도록 고안된 정제 (즉, 장용 코팅 정제)로 압축될 수 있거나, 식이 식품과 함께 직접 혼입될 수 있다. 경구 치료적 투여를 위해, 프로바이오틱 유기체는 부형제와 함께 혼입되고, 섭취가능한 정제, 구강정, 트로키제, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물 또는 제제는 경구 투여량 단위 형태가 예를 들어, 1 ml 당 약 1 × 10⁹개의 생존가능한 또는 비-생존가능한 예를 들어 락토바실리를 함유하도록 제조된다. 프로바이오틱 유기체는 유효량으로 적합한 제약상 또는 식품상 허용되는 담체와 함께 상기 개시된 투여량 단위 형태로 통상적이고 효과적인 투여를 위해 제제화된다. 단위 투여 형태는 예를 들어, 1 ml 당 대략 10⁹개의 생존가능한 또는 비-생존가능한 예를 들어 락토바실리의 양으로 주요 활성 화합물을 함유할 수 있다. 프리바이오틱과 같은 보충 성분을 함유하는 조성물의 경우, 투여량은 상기 성분의 통상적인 용량 및 투여 방법을 참고하여 결정된다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 스트렙토코커스 뮤탄스 이외의 뮤탄스 연쇄상구균에 의해 유발된 우식증의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 예방 또는 치료 방법은 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 상기 기재된 젖산균 군에 속한 미생물 또는 상기 미생물의 돌연변이체, 유도체, 유사체 또는 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 보다 바람직하게는, 미생물은 상기 기재된 미생물이고, 보다 더 바람직하게는, 미생물은 상기 기재된 DSMZ에 기탁된 락토바실러스이다.

상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 유사체 또는 단편은 상기 기재된 임의의 유사체 또는 단편일 수 있다.

바람직하게는, 치료될 대상체는 동물이다. 보다 바람직하게는, 동물은 포유동물이고, 보다 더 바람직하게는 포유동물은 애완 포유동물이다. 바람직한 실시양태에서, 애완동물은 개, 고양이, 햄스터, 원숭이, 래트 또는 마우스이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 동물은 소, 말, 돼지, 당나귀, 양 또는 염소이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.

바람직하게는, 뮤탄스 연쇄상구균은 스트렙토코커스 뮤탄스, 스트렙토코커스 소브리누스, 스트렙토코커스 크리세투스, 스트렙토코커스 라티, 스트렙토코커스 페루스 또는 스트렙토코커스 마카카에 종에 속한 미생물이다. 보다 더 바람직하게는, 뮤탄스 연쇄상구균은 스트렙토코커스 뮤탄스 혈청형 c (DSMZ 20523), 스트렙토코커스 뮤탄스 혈청형 e (NCTC 10923), 스트렙토코커스 뮤탄스 혈청형 f (NCTC 11060), 스트렙토코커스 소브리누스 DSM 20742 스트렙토코커스 라티 DSM 20564, 스트렙토코커스 크리세투스 DSM 20562, 스트렙토코커스 페루스 DSM 20646 또는 스트렙토코커스 마카카에 DSM 20714에 속한 미생물과 관련된다.

치료되거나 에방될 우식증은 스트렙토코커스 뮤탄스 이외의 뮤탄스 연쇄상구균에 의해 유발되고, 바람직하게는 우식증은 스트렙토코커스 소브리누스, 스트렙토코커스 크리세투스, 스트렙토코커스 라티, 스트렙토코커스 페루스 및 스트렙토코커스 마카카에로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세균에 의해 유발된다.

본 발명의 치료 또는 예방 방법의 맥락에서 상기 기재된 젖산균 군에 속한 미생물의 투여는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 형태로 수행될 수 있다. 바람직하게는, 투여는 예를 들어 상기 기재된 제약 또는 미용 담체 또는 부형제를 임의로 함유할 수 있는, 상기 기재된 조성물의 사용 및 적용을 포함한다. 투여량 및 투여 시간은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 정보에 따라 확립될 수 있다. 바람직하게는, 상기 투여량 및 투여 시간은 상기 기재된 바와 같이 확립될 수 있다.

본 발명은 하기 기재된 바와 같이 도 1 내지 3에 의해 예시된다.

도 1은 락토바실러스 종에 의한 스트렙토코커스 뮤탄스의 응집을 나타낸다. 구체적으로, 도 1은 스트렙토코커스 뮤탄스와 응집하지 않은 락토바실러스의 혼합물 (오른쪽 튜브)과 비교하여, 스트렙토코커스 뮤탄스와 응집하는 락토바실러스의 혼합물 (왼쪽 튜브)을 나타낸다. 실시예 4에 기재된 바와 같이 실험을 수행하였으며, 튜브를 20분 동안 교란되지 않은 상태로 방치하여, 응집체를 침강시켰다.

도 2는 도 1 (왼쪽 튜브)에 나타낸 락토바실러스 및 스트렙토코커스 뮤탄스 간의 응집체의 현미경 사진을 나타낸다. 위상차 현미경을 이용하여 1000배 확대로 사진을 찍었다.

도 3은 락토바실리에 의한 상이한 뮤탄스 연쇄상구균의 응집을 나타낸다. 실시예 5에 기재된 바와 같이 검정법을 수행하였다. 요약해서, 형광 염색을 이용하여 뮤탄스 연쇄상구균을 염색하였다. 락토바실리에 의한 연쇄상구균의 응집후, 얻어진 펠렛을 원심분리에 의해 분리하였다. 펠렛의 형광의 양을 응집된 뮤탄스 연쇄상구균의 양에 대한 측정치로서 취하였다.

예시 목적으로만 제공되고 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는, 하기 실시예로부터 본 발명 및 그의 많은 장점을 더 쉽게 이해할 것이다.

실시예 1

저장 및 성장

균주의 저장 및 성장을 통상적인 절차에 따라 수행하였다. 예를 들어, 균주를 -80℃에서 동결된 스톡으로서 저장하였다. 배양액 1 ml를 MRS-배지에서 정지기 (OD₆₀₀/mL 4 내지 8)로 성장시키고, 멸균 50％ 글리세린 용액 500 ㎕와 혼합하고, 동결하였다. 뮤탄스 연쇄상구균의 배양액을 TSY-배지에서 정지기 (OD₆₀₀/mL 1 내지 2)로 성장시키고, 상기 언급된 바와 같이 처리하였다.

뮤탄스 연쇄상구균 (스트렙토코커스 뮤탄스, 스트렙토코커스 소브리누스, 스트렙토코커스 라티, 스트렙토코커스 크리세투스, 스트렙토코커스 페루스 또는 스트렙토코커스 마카카에)의 배양 뿐만 아니라 락토바실리의 배양을 밤새 교반 없이 37℃에서 폐쇄된 팔콘 튜브에서 5 ml에서 수행하였다.

구체적으로, 본원에서 사용되는 균주를 동결된 스톡으로서 -80℃에서 저장하였다. MRS-브로쓰에서 정지기 (OD₆₀₀/mL 4 내지 8)로 성장된 배양액 1 ml를 멸균 50％ 글리세린 용액 500 ㎕와 혼합하고, 동결하였다.

구체적으로, 뮤탄스 연쇄상구균의 배양액을 TSY-브로쓰에서 정지기 (OD₆₀₀/mL 1 내지 2)로 성장시키고, 상기 언급된 바와 같이 처리하였다.

뮤탄스 연쇄상구균 (스트렙토코커스 뮤탄스 (DSM 20523, 혈청형 c; NCTC 10923, 혈청형 e; NCTC 11060, 혈청형 f), 스트렙토코커스 소브리누스 DSM 20742, 스트렙토코커스 라티 DSM 20564, 스트렙토코커스 크리세투스 DSM 20562, 스트렙토코커스 페루스 DSM 20646 또는 스트렙토코커스 마카카에 DSM 20714)의 배양, 및 락토바실리의 배양을 밤새 교반 없이 37℃에서 폐쇄된 팔콘 튜브에서 5 ml에서 수행하였다. 실시예 5에 기재된 형광 검정법을 위해, 스트렙토코커스 뮤탄스 DSM 20523을 사용하였다.

응집 검정법을 위해, 락토바실리를 MRS-배지에서 성장시켰다. MRS-배지 5 ml를 스톡 10 ㎕로 접종하고, 3일 동안 37℃에서 호기 조건하에 인큐베이션하였다. 600 nm에서 배양액의 광학 밀도 (OD₆₀₀)를 측정하였다. PBS-완충액를 사용하여 2의 OD₆₀₀로 배양액을 희석하였다. 뮤탄스 연쇄상구균을 TSY-배지 7 ml에서 성장시켰다. TSY-배지 7 ml를 스톡 10 ㎕로 접종하고, 37℃에서 혐기 조건하에 인큐베이션하였다.

실시예 2

균주의 분류학적 분류

균주의 분류학적 분류를 그의 탄수화물 발효 패턴에 따라 수행하였다. 이를 API 50 CH (바이오메리에욱스, 프랑스) 시스템을 이용하여 결정하고, APILAB PLUS 소프트웨어 버젼 3.3.3 (바이오메리에욱스, 프랑스)을 이용하여 분석하였다.

실시예 3

세포의 염색

실시예 1에 기재된 바와 같이 락토바실리 및 뮤탄스 연쇄상구균을 성장시킨 후, 형광 염색약을 사용하여 뮤탄스 연쇄상구균을 염색하였다. 이를 위해, 배양액의 OD₆₀₀을 측정하였다. 3200 x g에서 5분 동안 원심분리에 의해 배양액을 수확하였다. 펠렛을 PBS-완충액에서 재현탁하였다. 얻어진 현탁액이 현탁액 4.2 ml의 OD₆₀₀을 갖도록 완충액의 양을 계산하고, 제조자의 지시사항에 따라 제조된 CFDA-SE 용액 (인비트로젠, USA) 2 ㎕와 혼합하였다. 혼합물을 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션함으로써 세포의 염색을 수행하였다. 3200 x g에서 5분 동안 원심분리에 의 해 염색된 세포를 수확하였다. 후속적으로, 세포를 PBS-완충액 2 ml에서 재현탁하였다.

실시예 4

뮤탄스 연쇄상구균의 펠렛화 응집 검정

검정을 위해, 락토바실리 및 뮤탄스 연쇄상구균의 혼합을 3:1 내지 60:1 (뮤탄스 연쇄상구균:락토바실리)의 부피비로 수행하였으며, 상기 비는 1:50 내지 1:2.5의 콜로니 형성 단위 비에 상응하였다.

1 ml 중 600 nm의 파장에서 측정된 광학 밀도는 뮤탄스 연쇄상구균에 대해 바람직하게는 3 × 10⁸개의 콜로니 형성 단위 및 락토바실리에 대해 바람직하게는 7 × 10⁹개의 콜로니 형성 단위를 의미한다. 혼합을 15 ml 팔콘 튜브에서 부피 2 ml로 수행하였다. 배양 현탁액을 PBS-완충액으로 희석하여, 상기 언급된 부피비를 얻었으며, 최종 부피를 2 ml에서 유지하였다. 혼합물을 15초 동안 볼텍싱하였다. 응집은 현탁액의 즉시 탁도로서 육안으로 확인가능하였다. 튜브를 20분 동안 교란되지 않은 상태로 방치한 후, 응집체는 육안으로 확인가능한 펠렛으로서 침강한 반면, 응집하지 않은 혼합물은 현탁액에 남았다.

형성된 응집체를 500 x g에서 30초 동안 원심분리에 의해 분리하였다. 그 후, 상등액에 남은 응집되지 않은 세포의 양을 측정함으로써 응집의 양을 정량하였다. 상응하게, 광학 밀도를 측정하기 위해 상등액 1 ml를 주의깊게 제거하였다. 광학 밀도를 600 nm에서 측정하였다. 락토바실리가 없는 각 대조군 실험의 공제 후 값은 응집되지 않은 세포의 양을 나타낸다.

대조군으로서, 튜브에 첨가된 락토바실러스 또는 뮤탄스 연쇄상구균 균주만에 의해 시험을 수행함으로써, 락토바실러스 균주 및 뮤탄스 연쇄상구균 균주 각각의 자가-응집을 항상 연구하였다. 락토바실러스에 의한 스트렙토코커스 뮤탄스의 응집은 도 1 (왼쪽 튜브) 및 2에 나타낸다.

상기 기재된 락토바실리 균주 (구체적으로, DSMZ에 기탁됨)는 자가-응집 거동을 나타내지 않고 모든 스트렙토코커스 뮤탄스 혈청형의 응집을 나타내었다.

배지:

MRS-브로쓰:

MRS-혼합물 (디프코(Difco), USA) 55 g/L

pH: 6.5

TSY-브로쓰:

TSY-혼합물 (디프코, USA) 30 g/L

효모 추출물 (도이치 헤페베르케(Deutsche Hefewerke), 독일) 3 g/L

완충액:

PBS-완충액:

Na₂HPO₄*2H₂O 1.5 g/L

KH₂PO₄ 0.2 g/L

NaCl 8.8 g/L

pH HCl에 의해 조절됨

실시예 5

뮤탄스 연쇄상구균의 형광 응집 검정

검정을 위해, 각각의 락토바실러스와 각각의 염색된 뮤탄스 연쇄상구균 (스트렙토코커스 뮤탄스 DSM 20523과 Lb-OB-K1 (DSM 16667), 스트렙토코커스 뮤탄스 DSM 20523과 Lb-OB-K2 (DSM 16668), 스트렙토코커스 뮤탄스 DSM 20523과 Lb-OB-K3 (DSM 16669), 스트렙토코커스 뮤탄스 DSM 20523과 Lb-OB-K4 (DSM 16670), 스트렙토코커스 뮤탄스 DSM 20523과 Lb-OB-K5 (DSM 16671), 스트렙토코커스 뮤탄스 DSM 20523과 Lb-OB-K6 (DSM 16672), 스트렙토코커스 뮤탄스 DSM 20523과 Lb-OB-K7 (DSM 16673);

스트렙토코커스 소브리누스 DSM 20742와 Lb-OB-K1 (DSM 16667), 스트렙토코커스 소브리누스 DSM 20742와 Lb-OB-K2 (DSM 16668), 스트렙토코커스 소브리누스 DSM 20742와 Lb-OB-K3 (DSM 16669), 스트렙토코커스 소브리누스 DSM 20742와 Lb-OB-K4 (DSM 16670), 스트렙토코커스 소브리누스 DSM 20742와 Lb-OB-K5 (DSM 16671), 스트렙토코커스 소브리누스 DSM 20742와 Lb-OB-K6 (DSM 16672), 스트렙토코커스 소브리누스 DSM 20742와 Lb-OB-K7 (DSM 16673);

스트렙토코커스 크리세투스 DSM 20562와 Lb-OB-K1 (DSM 16667), 스트렙토코커스 크리세투스 DSM 20562와 Lb-OB-K2 (DSM 16668), 스트렙토코커스 크리세투스 DSM 20562와 Lb-OB-K3 (DSM 16669), 스트렙토코커스 크리세투스 DSM 20562와 Lb-OB-K4 (DSM 16670), 스트렙토코커스 크리세투스 DSM 20562와 Lb-OB-K5 (DSM 16671), 스트렙토코커스 크리세투스 DSM 20562와 Lb-OB-K6 (DSM 16672), 스트렙토코커스 크리세투스 DSM 20562와 Lb-OB-K7 (DSM 16673);

스트렙토코커스 라티 DSM 20564와 Lb-OB-K1 (DSM 16667), 스트렙토코커스 라티 DSM 20564와 Lb-OB-K2 (DSM 16668), 스트렙토코커스 라티 DSM 20564와 Lb-OB-K3 (DSM 16669), 스트렙토코커스 라티 DSM 20564와 Lb-OB-K4 (DSM 16670), 스트렙토코커스 라티 DSM 20564와 Lb-OB-K5 (DSM 16671), 스트렙토코커스 라티 DSM 20564와 Lb-OB-K6 (DSM 16672), 스트렙토코커스 라티 DSM 20564와 Lb-OB-K7 (DSM 16673);

스트렙토코커스 페루스 DSM 20646과 Lb-OB-K1 (DSM 16667), 스트렙토코커스 페루스 DSM 20646과 Lb-OB-K2 (DSM 16668), 스트렙토코커스 페루스 DSM 20646과 Lb-OB-K3 (DSM 16669), 스트렙토코커스 페루스 DSM 20646과 Lb-OB-K4 (DSM 16670), 스트렙토코커스 페루스 DSM 20646과 Lb-OB-K5 (DSM 16671), 스트렙토코커스 페루스 DSM 20646과 Lb-OB-K6 (DSM 16672), 스트렙토코커스 페루스 DSM 20646과 Lb-OB-K7 (DSM 16673);

스트렙토코커스 마카카에 DSM 20724와 Lb-OB-K1 (DSM 16667), 스트렙토코커스 마카카에 DSM 20724와 Lb-OB-K2 (DSM 16668), 스트렙토코커스 마카카에 DSM 20724와 Lb-OB-K3 (DSM 16669), 스트렙토코커스 마카카에 DSM 20724와 Lb-OB-K4 (DSM 16670), 스트렙토코커스 마카카에 DSM 20724와 Lb-OB-K5 (DSM 16671), 스트렙토코커스 마카카에 DSM 20724와 Lb-OB-K6 (DSM 16672) 및 스트렙토코커스 마카카에 DSM 20724와 Lb-OB-K7 (DSM 16673))의 현탁액을 혼합하였다. 락토바실러스 현탁액 50 ㎕를 96 웰 미량역가 플레이트에서 염색된 뮤탄스 연쇄상구균 50 ㎕에 첨가하였 다. 플레이트를 전속으로 12분 동안 볼텍싱하였다. 그 후, 플레이트를 500 x g에서 10초 동안 원심분리하였다. 상등액을 주의깊게 제거하고 폐기하였다. 펠렛을 PBS-완충액 100 ㎕에서 재현탁하였다.

현탁액의 형광을 495 nm (여기) 및 525 nm (방출)의 파장에서 미량역가 플레이트 형광 판독기에서 측정하였다.

대조군으로서, 락토바실리 단독 뿐만 아니라 염색된 뮤탄스 연쇄상구균을 기재된 바와 같이 처리하고 측정하였다. 각각의 락토바실러스에 의한 응집에 대해 측정된 값으로부터 각각의 뮤탄스 연쇄상구균 단독에 대해 측정된 배경 형광을 공제하였다. 모든 측정을 삼중으로 수행하였다. 뮤탄스 연쇄상구균을 모든 시험된 락토바실리에 의해 응집시켰다 (도 3 참조).

배지:

MRS-브로쓰:

MRS-혼합물 (디프코, USA) 55 g/L

pH: 6.5

TSY-브로쓰:

TSY-혼합물 (디프코, USA) 30 g/L

효모 추출물 (도이치 헤페베르케, 독일) 3 g/L

완충액:

PBS-완충액:

Na₂HPO₄*2H₂O 1.5 g/L

KH₂PO₄ 0.2 g/L

NaCl 8.8 g/L

pH HCl에 의해 조절됨

실시예 6

구강 세균총의 전형적인 구성원을 향한 응집의 특이성

실시예 1에 기재된 바와 같이 락토바실러스 배양액을 성장시켰다.

구강 세균 (즉, 스트렙토코커스 살리바리우스 아종 테르모필루스 (제조자의 지시사항에 따라 오르가노밸런스(OrganoBalance)에 의해 단리되고 API 50 CH (바이오메리에욱스, 프랑스)에 의해 확인됨); 스트렙토코커스 오랄리스 (DSMZ 20066); 스트렙토코커스 오랄리스 (DSMZ 20395); 스트렙토코커스 오랄리스 (DSMZ 20627); 스타필로코쿠스 에피데르미디스 (DSMZ 1798); 스타필로코쿠스 에피데르미디스 (DSMZ 20044); 스트렙토코커스 미티스 (DSMZ 12643); 스트렙토코커스 상기니스 (DSMZ 20567))를 폐쇄된 15 mL 팔콘 튜브에서 37℃에서 밤새 BHI-배지 5 mL에서 성장시켰다. 상기 언급된 구강 세균 각각을 바람직하게는 락토바실러스 배양액과 3:1의 부피비로 혼합하고, 응집을 실시예 4에서와 같이 검정하였다. 응집/비-응집 시험 각각을 위해, 시험의 결과를 즉시 결정하기 위해 바람직하게는 상기 언급된 세균 중 하나만을 사용하였다.

대조군으로서, 튜브에 첨가된 구강 세균총 균주 또는 락토바실리만에 의해 시험을 수행함으로써 각각의 구강 세균 뿐만 아니라 시험된 락토바실러스 균주의 자가-응집을 항상 연구하였다.

락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 균주 Lb-OB-K1 (DSM 16667), Lb-OB-K2 (DSM 16668), Lb-OB-K3 (DSM 16669), Lb-OB-K4 (DSM 16670), Lb-OB-K5 (DSM 16671)는 상기 언급된 구강 세균을 응집시키지 않았다. 락토바실러스 람노수스 균주 Lb-OB-K6 (DSM 16672) 및 Lb-OB-K7 (DSM 16673)은 스트렙토코커스 살리바리우스 아종 테르모필루스를 응집시켰다.

BHI-브로쓰:

BHI-혼합물 (디프코, USA) 37 g/L

pH: 7.2

실시예 7

락토바실리의 응집 능력의 온도 내성

세균을 실시예 1에서와 같이 성장시켰다.

성장된 락토바실리 배양액을 121℃에서 2 bar에서 포화된 스팀에서 20분 동안 인큐베이션하였다 (오토클레이브함). 오토클레이브된 배양액을 실온으로 냉각한 후, 락토바실리를 성장된 스트렙토코커스 뮤탄스 배양액과 1:3의 부피비로 혼합하고, 대조군 실험을 포함한 응집을 실시예 4에서와 같이 검정하였다.

실시예 6에 요약된 바와 같이 구강 세균을 사용하여 응집을 또한 검정하였다.

락토바실리의 응집 거동은 오토클레이브 절차에 의해 시험된 스트렙토코커스 뮤탄스 혈청형을 향해 또는 구강 세균을 향해 변하지 않은 것으로 밝혀졌다.

실시예 8

열-불활성화된 락토바실리에 의한 응집

락토바실리를 실시예 1에 기재된 바와 같이 성장시켰다. 뮤탄스 연쇄상구균을 실시예 1 및 3에 기재된 바와 같이 성장시키고 염색하였다. 성장된 락토바실리 배양액을 실시예 1에 기재된 바와 같이 2의 OD₆₀₀으로 조절하였다. 현탁액 1 ml를 121℃에서 2 bar에서 20분 동안 인큐베이션하였다 (오토클레이브함). 오토클레이브된 배양액을 실온으로 냉각한 후, 대조군 실험을 포함한 응집을 실시예 5에 기재된 바와 같이 측정하였다.

열-불활성화된 락토바실리는 또한 모든 뮤탄스 연쇄상구균을 응집시켰다.

실시예 9

pH-값에 대한 응집의 의존성

세균을 실시예 1에서와 같이 성장시켰다. 락토바실리 0.5 ml 및 스트렙토코커스 뮤탄스 1.5 ml를 3200 x g에서 10분 동안 원심분리에 의해 수확하고, 상등액을 폐기하였다. 세포를 상이한 pH-값으로 조절된 상이한 PBS-완충액에서 그의 최초 부피 (각각 0.5 ml 및 1.5 ml)로 재현탁하였다. 완충액의 pH-값을 0.5 pH-단위의 단계로 7.0으로부터 3.0의 값으로 조절하였다. 배양액을 각각의 pH-값의 완충액에서 재현탁하였으며, 이를 응집 거동 검정을 위해 사용하였다.

그 후, 락토바실리를 바람직하게는 스트렙토코커스 뮤탄스 배양액과 1:3의 부피비로 혼합하고, 대조군 실험을 포함한 응집을 실시예 4에서와 같이 검정하였다. 4.5 미만의 pH 값에서 락토바실리에 의한 스트렙토코커스 뮤탄스의 육안으로 확인가능한 응집은 발생하지 않았다.

실시예 10

pH-값에 대한 응집의 의존성

락토바실리를 실시예 1에 기재된 바와 같이 성장시켰다. 뮤탄스 연쇄상구균을 실시예 1 및 3에 기재된 바와 같이 성장시키고 염색하였다. 그 후, 응집을 상이한 pH-값에서 검정하였다. 이 목적을 위해, 락토바실리 뿐만 아니라 연쇄상구균을 각각의 pH로 조절된 아세테이트 완충액에서 재현탁하였다. 시험된 pH 값은 4.0, 4.5 및 5.0이었다. 응집을 실시예 5에 기재된 바와 같이 검정하였다. 4.5 미만의 pH 값에서 뮤탄스 연쇄상구균의 응집은 발생하지 않았다.

실시예 11

동결건조에 대한 응집 거동의 감수성

세균을 실시예 1에서와 같이 성장시켰다.

락토바실리 배양액의 1 ml 분취액을 3200 x g에서 10분 동안 원심분리에 의해 수확하였다. 상등액을 폐기하고, 펠렛을 실온에서 진공하에 2시간 동안 동결건조시켰다. 각각의 시험된 락토바실러스 균주의 얻어진 건조 펠렛을 실온에서 및 4℃에서 각각 1일, 1주, 2주, 3주 및 4주 동안 저장하였다. 저장 시간 후, 동결건조된 펠렛을 pH 7.0의 PBS-완충액 1 ml에서 재현탁하였다. 재현탁된 락토바실리를 새로 성장된 스트렙토코커스 뮤탄스 배양액과 1:3의 부피비로 혼합하고, 대조군 실 험을 포함한 응집을 실시예 4에서와 같이 검정하였다.

스트렙토코커스 뮤탄스를 향한 언급된 락토바실리의 응집 거동은 동결건조 또는 저장 절차에 의해 변화되지 않았다.

실시예 12

동결건조에 대한 응집 거동의 감수성

락토바실리를 실시예 1에 기재된 바와 같이 성장시켰다. 뮤탄스 연쇄상구균을 실시예 1 및 3에 기재된 바와 같이 성장시키고 염색하였다. 성장된 락토바실리 배양액을 실시예 1에 기재된 바와 같이 2의 OD₆₀₀으로 조절하였다. 현탁액 1 ml를 실온에서 진공하에 2시간 동안 동결건조시켰다. 그 후, 동결건조된 펠렛을 PBS-완충액 1 ml에서 재현탁하였다. 대조군 실험을 포함한 응집을 실시예 5에 기재된 바와 같이 측정하였다.

뮤탄스 연쇄상구균을 향한 언급된 락토바실리의 응집 거동은 동결건조에 의해 변화되지 않았다.

실시예 13

프로테아제 내성에 대한 시험

세균을 실시예 1에서와 같이 성장시켰다.

사용된 프로테아제는 프로나제 E, 프로테이나제 K, 트립신, 키모트립신 (모두 독일 소재의 시그마(Sigma)로부터 수득됨)이었다. 3200 x g에서 10분 동안 원심분리에 의해 세포를 수확하고, PBS-완충액 (pH 7.0) 1 ml에서 펠렛을 재현탁함으 로써, 락토바실리 1 ml 분취액을 PBS-완충액에서 세척하였다. 그 후, 세포를 상기 기재된 바와 같이 다시 수확하고, 2.5 mg/mL의 최종 농도로 각각의 프로테아제를 함유하는 PBS-완충액 (pH 7.0)에서 재현탁하였다. 현탁액을 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 세척하고, 상기 기재된 바와 같이 PBS-완충액 (pH 7.0)에서 재현탁하였다.

대조군 실험을 포함한 응집을 실시예 3에서와 같이 검정하였다.

스트렙토코커스 뮤탄스를 향한 언급된 락토바실리의 응집 거동은 어떠한 언급된 프로테아제에 의한 처리에 의해서도 변하지 않았다.

실시예 14

락토바실리의 응집 거동의 프로테아제 감수성

실시예 1에 기재된 바와 같이 락토바실리를 성장시켰다. 뮤탄스 연쇄상구균을 실시예 1 및 3에 기재된 바와 같이 성장시키고 염색하였다. 사용된 프로테아제는 프로나제 E, 프로테이나제 K, 트립신, 키모트립신 (모두 독일 소재의 시그마로부터 수득됨)이었다. 3200 x g에서 10분 동안 원심분리에 의해 세포를 수확하고, PBS-완충액 (pH 7.0) 1 ml에서 펠렛을 재현탁함으로써, 락토바실리 1 ml 분취액을 PBS-완충액에서 세척하였다. 그 후, 세포를 상기 기재된 바와 같이 다시 수확하고, 2.5 mg/mL의 최종 농도로 각각의 프로테아제를 함유하는 PBS-완충액 (pH 7.0)에서 재현탁하였다. 현탁액을 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 세척하고, 상기 기재된 바와 같이 PBS-완충액 (pH 7.0)에서 재현탁하였다. 대조군 실험을 포함한 응집을 실시예 5에 기재된 바와 같이 검정하였다. 뮤탄스 연쇄상구균을 향한 언급된 락토바실리의 응집 거동은 어떠한 언급된 프로테아제에 의한 처리에 의해서도 변하지 않았다.

실시예 15

응집 거동의 이온 의존성

실시예 1에서와 같이 세균을 성장시켰다.

락토바실리 1 ml 분취액을 200 mM EDTA 용액 1 ml에서 상기 기재된 바와 같이 2회 세척하였다. 그 후, 세포를 수확하고, PBS-완충액 (pH 7.0) 1 ml에서 재현탁하였다.

응집을 실시예 4에서와 같이 검정하고, 응집 능력의 완전한 손실을 관찰하였다. 200 mM EDTA-용액에서 2회 세척한 후, 2 mM 칼슘 용액 1 ml 중 락토바실리의 재현탁액은 스트렙토코커스 뮤탄스를 응집시킬 수 있는 능력을 회복하였다. 최대 100 mM 마그네슘 용액 중 EDTA 세척 세포의 재현탁액은 스트렙토코커스 뮤탄스를 응집시킬 수 있는 능력을 회복하지 못하였다.

실시예 16

응집 거동의 이온 의존성

실시예 1에 기재된 바와 같이 락토바실리를 성장시켰다. 뮤탄스 연쇄상구균을 실시예 1 및 3에 기재된 바와 같이 성장시키고 염색하였다. 락토바실리 1 ml 분취액을 200 mM EDTA 용액 1 ml에서 상기 기재된 바와 같이 2회 세척하였다. 그 후, 세포를 수확하고, PBS-완충액 (pH 7.0) 1 ml에서 재현탁하였다.

응집을 실시예 5에 기재된 바와 같이 검정하고, 응집 능력의 완전한 손실을 관찰하였다. 200 mM EDTA-용액에서 2회 세척한 후, 2 mM 칼슘 용액 1 ml 중 락토바실리의 재현탁액은 스트렙토코커스 뮤탄스를 응집시킬 수 있는 능력을 회복하였다. 최대 100 mM 마그네슘 용액 중 EDTA 세척 세포의 재현탁액은 뮤탄스 연쇄상구균을 응집시킬 수 있는 능력을 회복하지 못하였다.

실시예 17

타액의 존재하에 응집 시험

실시예 1에 기재된 바와 같이 세균을 성장시켰다.

스트렙토코커스 뮤탄스 배양액의 2 ml 분취액을 상기 기재된 바와 같이 수확하고, 타액 2 ml에서 재현탁하였다. 2명의 지원자에 의해 타액을 제공하고, 수득후 즉시 사용하였다.

실시예 4에서와 같이 응집을 검정하였다.

스트렙토코커스 뮤탄스를 향한 언급된 락토바실리의 응집 거동은 타액의 존재하에 변화하지 않았다.

실시예 18

타액의 존재하에 뮤탄스 연쇄상구균의 응집

지원자로부터 신선한 타액을 샘플링하였다. 당-비함유 추잉검을 씹게 하여 타액-흐름을 유도하였다. 지원자는 샘플링 각각에 의해 타액 15 ml를 수집하였다. 신선하게 수집된 타액을 검정 절차를 위해 PBS-완충액에 의해 1:2로 희석하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 락토바실리 및 뮤탄스 연쇄상구균을 배양하였다. 염색 절차후 염색된 세포를 PBS-완충액 대신에 타액에서 재현탁한 것을 제외하고, 실 시예 3에 기재된 바와 같이 뮤탄스 연쇄상구균을 염색하였다. 실시예 5에 기재된 바와 같이 대조군 실험을 포함한 응집을 측정하였다. 타액 존재는 응집을 억제하지 않았다.

실시예 19

로젠지제 조성물 (I)

로젠지제 조성물을 바람직하게는 제DE-C2 36 45 147호의 제8면 실시예 4에 기재된 바와 같이 제조하였으며, 여기서 상기 실시예 4에 언급된 성분 이외에 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물을 로젠지제 mg 당 10² 내지 10¹²개, 바람직하게는 10³ 내지 10⁸개의 세포의 양으로 첨가하였다.

실시예 20

로젠지제 조성물 (II)

로젠지제 조성물을 바람직하게는 제DE-C2 36 45 147호의 제8면 실시예 5에 기재된 바와 같이 제조하였으며, 여기서 상기 실시예 5에 언급된 성분 이외에 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물을 로젠지제 mg 당 10² 내지 10¹²개, 바람직하게는 10³ 내지 10⁸개의 세포의 양으로 첨가하였다.

실시예 21

치제 조성물

치제 조성물을 바람직하게는 제DE-C2 36 45 147호의 제8면 실시예 3에 기재 된 바와 같이 제조하였으며, 여기서 상기 실시예 3에 언급된 성분 이외에 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물을 치제 mg 당 10² 내지 10¹²개, 바람직하게는 10³ 내지 10⁸개의 세포의 양으로 첨가하였다.

실시예 22

백악-기재 치제 조성물

백악-기재 치제 조성물을 바람직하게는 문헌 ["Kosmetik", W. Umbach (editor), 2^nd edition, Thieme Verlag, 1995]의 제205면의 7.1.4.4 "Rezepturbeispiel" 장에 기재된 바와 같이 제조하였으며, 여기서 제205면의 상기 장에 언급된 성분 이외에 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물을 백악-기재 치제 mg 당 10² 내지 10¹²개, 바람직하게는 10³ 내지 10⁸개의 세포의 양으로 첨가하였다.

실시예 23

규산/불화나트륨을 기재로 하는 겔-치제

규산/불화나트륨 치제 조성물을 기재로 하는 겔-치제를 바람직하게는 문헌 ["Kosmetik", W. Umbach (editor), 2^nd edition, Thieme Verlag, 1995]의 제205면의 7.1.4.4 "Rezepturbeispiel" 장에 기재된 바와 같이 제조하였으며, 여기서 제205면의 상기 장에 언급된 성분 이외에 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물을 규산/불화나트륨을 기재로 하는 겔-치제 mg 당 10² 내지 10¹²개, 바람직하게는 10³ 내지 10⁸ 개의 세포의 양으로 첨가하였다.

실시예 24

타르타르에 대한 치제 조성물

타르타르에 대한 치제 조성물을 바람직하게는 문헌 ["Kosmetik", W. Umbach (editor), 2^nd edition, Thieme Verlag, 1995]의 제206면의 7.1.4.4 "Rezepturbeispiel" 장에 기재된 바와 같이 제조하였으며, 여기서 제206면의 상기 장에 언급된 성분 이외에 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물을 타르타르에 대한 치제 mg 당 10² 내지 10¹²개, 바람직하게는 10³ 내지 10⁸개의 세포의 양으로 첨가하였다.

실시예 25

추잉검 조성물

추잉검 조성물을 바람직하게는 제DE-C2 36 45 147호의 제9면의 실시예 6에 기재된 바와 같이 제조하였으며, 여기서 상기 실시예 6에 언급된 성분 이외에 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물을 추잉검 mg 당 10² 내지 10¹²개, 바람직하게는 10³ 내지 10⁸개의 세포의 양으로 첨가하였다.

실시예 26

농축된 구강세정제 조성물

농축된 구강세정제 조성물을 바람직하게는 문헌 ["Kosmetik", W. Umbach (editor), 2^nd edition, Thieme Verlag, 1995]의 제206면의 7.1.4.4 "Rezepturbeispiel" 장에 기재된 바와 같이 제조하였으며, 여기서 제206면의 상기 장에 언급된 성분 이외에 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물을 농축된 구강세정제 조성물 ml 당 10² 내지 10¹³개의 세포의 양으로 첨가하였다.

실시예 27

필름 제조

필름 제조

1. 수상

- 물을 60℃로 가열하고,

- 아스파르탐 (감미제)을 교반하면서 첨가하고,

- 아스파르탐을 완전히 용해시키고,

- 중합체성 수용성 필름 형성제, 예를 들어 콜리코트(Kollicoat) IR (폴리비닐알콜 상 폴리에틸렌글리콜) 또는 PVP (폴리비닐피롤리돈) 또는 천연 폴리머, 예컨대 알기네이트를 용해될 때까지 교반하면서 첨가하고,

- 10분 후 발포체의 나머지를 제거하고,

- 혼합물을 냉각시킨 후 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물을 최종 아로마 필름 당 10² 내지 10¹²개, 바람직하게는 10³ 내지 10⁸개의 세포의 양으로 첨가하였으며, 대안으로, 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 돌연변이체 또는 유도체 또는 상기 언급된 젖산균 군에 속한 미생물의 유사체 또는 단편을 첨가할 수 있 다.

2. 유상

- 멘톨을 박하유에 용해시키고,

- 폴리소르베이트 80을 박하유 - 멘톨 - 혼합물에 교반하면서 첨가하고,

- 그 후, 이 혼합물을 프로필렌글리콜에 교반하면서 첨가하고,

- 임의의 착색제 (예컨대, 안료, 레이크)를 첨가하였다.

3.

- 교반하면서 유상을 천천히 수상과 함께 혼합하였다.

4.

- 절단 장치를 이용하여 얇은 필름을 기계적으로 생성시켰다.

샘플 제형:

본 발명의 다른 실시양태 및 용도는 본원에 개시된 명세서 및 본 발명의 실 행에 대한 고려로부터 당업자에게 명백할 것이다. 모든 공개물, 모든 미국 및 외국 특허 및 모든 미국 및 외국 특허 출원을 포함한 본원에 인용된 모든 문헌은 임의의 이유로 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참고로 구체적으로 도입된다. 명세서 및 실시예는 하기 청구항에 의해 나타낸 본 발명의 진정한 범위 및 취지와 함께 예시로만 고려되는 것으로 의도된다.

Claims (26)

1. 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 특이적으로 결합할 수 있는 락토바실러스(Lactobacillus) 속에 속한 미생물 또는 이들의 돌연변이체 또는 유도체를 포함하는 조성물로서,

   여기서 상기 특이적 결합은

   (i) 95℃ 초과하는 온도로 20분 이상 행하여지는 열 처리에 내성이고;

   (ii) 프로나제 E, 프로테이나제 K, 트립신 및 키모트립신으로 이루어진 군에서 선택된 프로테아제로의 처리에 내성이며;

   (iii) 칼슘-의존적이고;

   (iv) 4.5 내지 8.5의 pH 범위 내에서 형성되며;

   (v) 타액의 존재하에 형성되는 것이고,

   상기 유도체는 상기 미생물의 불활성화된 형태이거나 단편이며, 상기 미생물은 열 불활성화되거나 동결건조된 것이고, 상기 단편은 막-제제에 의해 수득된 막 분획물이고, 상기 불활성화된 형태 또는 단편은 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유한 것인,

   스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus)에 의해 유발된 우식증의 치료 또는 예방용 항우식성 조성물.
2. 제1항에 있어서, 특이적 결합이

   (a) 상기 미생물을 정지기로 성장시키고;

   (b) 정지기로 성장된 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균과 상기 미생물을 혼합하고;

   (c) 상기 미생물 및 뮤탄스 연쇄상구균 군의 세균의 응집체를 형성시키는 조건하에, 단계 (b)에서 얻은 혼합물을 인큐베이션하고;

   (d) 펠렛의 발생에 의해 응집체를 검출하여 검정될 수 있는 것인 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 락토바실러스가 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 또는 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus)인 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 락토바실러스 파라카세이가 DSMZ 관리 번호 DSM 16667, DSMZ 관리 번호 DSM 16668, DSMZ 관리 번호 DSM 16669, DSMZ 관리 번호 DSM 16670 및 DSMZ 관리 번호 DSM 16671을 갖는 락토바실러스 파라카세이 또는 이들의 돌연변이체 또는 유도체로 이루어진 군에서 선택되고, 여기서 상기 돌연변이체 또는 유도체는 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 결합할 수 있는 능력을 보유한 것인 조성물.
5. 제3항에 있어서, 상기 락토바실러스 람노수스가 DSMZ 관리 번호 DSM 16672 및 DSMZ 관리 번호 DSM 16673을 갖는 락토바실러스 람노수스 또는 이들의 돌연변이체 또는 유도체로 이루어진 군에서 선택되고, 여기서 상기 돌연변이체 또는 유도체는 뮤탄스 연쇄상구균 군에 속한 세균에 결합할 수 있는 능력을 보유한 것인 조성물.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미생물이 스트렙토코커스 뮤탄스, 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 스트렙토코커스 크리세투스(Streptococcus cricetus), 스트렙토코커스 라티(Streptococcus ratti), 스트렙토코커스 페루스(Streptococcus ferus) 및 스트렙토코커스 마카카에(Streptococcus macacae)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세균에 결합할 수 있는 것인 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 미생물이

   (a) 스트렙토코커스 뮤탄스 혈청형 c (DSMZ 20523), 혈청형 e (NCTC 10923) 및 혈청형 f (NCTC 11060),

   (b) 스트렙토코커스 소브리누스 DSM 20742,

   (c) 스트렙토코커스 라티 DSM 20564,

   (d) 스트렙토코커스 크리세투스 DSM 20562,

   (e) 스트렙토코커스 페루스 DSM 20646, 또는

   (f) 스트렙토코커스 마카카에 DSM 20714

   에 결합할 수 있는 것인 조성물.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 미용상, 제약상 또는 경구 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 미용 또는 제약 조성물인 조성물.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 치제, 추잉검, 로젠지제, 구강세정제, 세구제, 치실 또는 치과용 테이프인 조성물.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항우식성 식료품 또는 사료인 조성물.
11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 식품, 사료 또는 음료용 첨가제인 조성물.
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