ES2417132T3

ES2417132T3 - Usos y métodos para prevenir y/o tratar caries causadas por mutans Streptococci

Info

Publication number: ES2417132T3
Application number: ES07866245T
Authority: ES
Inventors: Andreas Reindl; Christine Lang; Mewes BÖTTNER; Markus Veen
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2006-12-19
Filing date: 2007-12-18
Publication date: 2013-08-06
Anticipated expiration: 2027-12-18
Also published as: BRPI0719279A2; ZA200904963B; WO2008074473A3; RU2446208C9; AU2007334850C1; WO2008074473A2; CA2671507A1; EP2094830A2; US20100047190A1; RU2009127513A; JP5721765B2; CN101563447A; KR101432336B1; JP2010513350A; EP2094830B1; KR20090096724A; AU2007334850B2; AU2007334850A1; RU2446208C2; BRPI0719279B1

Abstract

Uso de un microorganismo perteneciente al genero Lactobacillus o un mutante o derivado del mismo, caracterizado porque es capaz de unirse especificamente a una bacteria perteneciente al grupo de mutans Streptococci, en donde la union especifica es (i) resistente al tratamiento por calor, en donde dicho tratamiento por calor se lleva a cabo a una temperatura de mas de 95°C durante al menos 20 minutos; y (ii) resistente al tratamiento con proteasa, en donde dicho tratamiento con proteasa es un tratamiento con una proteasa seleccionada del grupo consistente de pronasa E, proteinasa K , tripsina y quimiotripsina; y (iii) dependiente del calcio; y (iv) formado dentro de un rango de pH entre 4.5 y 8.5; y (v) formado en la presencia de saliva, para la preparacion de una composicion anticariogenica para el tratamiento o prevencion de caries causada por Streptococcus sobrinus uniendose a dicho Streptococcus sobrinus, en donde dicho derivado del microorganismo es una forma inactiva de dicho microorganismo o un fragmento de dicho microorganismo, siendo inactivado dicho microorganismo termicamente o liofilizado, en donde dicho fragmento es una fraccion de membrana obtenida mediante la preparacion de una membrana y en donde dicha forma inactivada o dicho fragmento retiene la capacidad de unirse especificamente a una bacteria perteneciente al grupo de mutans Streptococci.

Description

Usos y metodos para prevenir y/o tratar caries causadas por mutans Streptococci.

La presente invencion se relaciona con el uso de un microorganismo que pertenece al genero Lactobacillus o un derivado o derivado del mismo (como se define mas adelante), caracterizado porque es capaz de unirse especificamente a una bacteria que pertenece al grupo de mutans Streptococci en donde las uniones especificas son (i) resistentes al tratamiento por calor, en donde dicho tratamiento por calor se lleva a cabo a una temperatura de mas de 95°C durante al menos 20 minutos; y (ii) resistente al tratamiento con proteasa, en donde dicho tratamiento con proteasa es tratamiento con una proteasa seleccionada del grupo consistente de pronasa E, proteinasa K, tripsina y quimiotripsina; y (iii) dependiente del calcio; y (iv) formada en un rango de pH entre 4.5 y 8.5; y (v) formada en presencia de saliva, para la preparacion de una composicion anticaries para el tratamiento o prevencion de caries causadas por Streptococcus sobrinus.

Preferiblemente, la union especifica puede ser probada como sigue:

(a): hacer crecer dicho microorganismo a la fase estacionaria;

(b): mezclar dicho microorganismo con una bacteria que pertenece al grupo mutans Streptococci el cual ha sido cultivado a la fase estacionaria;

(c): incubar la mezcla obtenida en la etapa (b) bajo condiciones que permiten la formacion de agregados de dicho microorganismo y una bacteria de mutans Streptococci; y

(d): detectar agregados por la presencia de una pella.

Otro aspecto en relacion con la presente invencion es un metodo de profilaxis o tratamiento de caries causadas por mutans Streptococci diferentes a Streptococcus mutans, que comprende administrar un microorganismo que pertenece al grupo de bacterias del acido lactico caracterizado porque dicho microorganismo es capaz de unirse especificamente a una bacteria que pertenece al grupo de mutans Streptococci o un mutante, derivado o fragmento de dicho microorganismo.

Los mutans Streptococci colonizan el anfitrion despues de la primera aparicion de los dientes (Carlson et al., Caries Res. 9 (1975), 333-339. Se localizan en las superficies de los dientes, y su abundancia en la placa es mas alta durante las lesiones iniciales (Duchin and van Houte Arch. Biol. Biol. 23 (1978) 779-786). Su nivel de colonizacion dentro de la placa se incrementa con el consumo de sacarosa (Staat et al., J. Dent. Res. 54 (1975) 872-880). Son capaces de sintetizar ciertas macromoleculas a partir de sacarosa que favorecen su union a los dientes (Tanzer et al., 1nfect. 1mmun. 10 (1974) 197-203). Los mutans Streptococci son productores rapidos de acido a partir de carbohidratos simples, incluyendo sacarosa, y son tolerantes a un pH bajo (Edwardsson, Arch. Biol. 13 (1968) 637646). Adicionalmente, esencialmente siempre se recuperan por cultivo en sitios de lesiones de caries iniciales y establecidas (Littleton et al., Arch. Oral. Biol. 15 (1979) 461-463). El interes en los mismos aumento despues de la demostracion de su alta induccion potente y progresion de las lesiones de las caries en una variedad de animales experimentales, incluyendo gnotobiotes mono-infectados. Su expresion de virulencia esta asociada fuertemente con el consumo de carbohidratos, especialmente sacarosa.

El papel de las especies bacterianas adicionales que estan relacionadas con el desarrollo de la caries como las bacterias del acido lactico o los actinomicetos no es concluyente. Estas bacterias se encuentran frecuentemente en lesiones carioticas, pero solamente en asociacion con mutans Streptococci. De acuerdo con el presente conocimiento la presencia de mutans Streptococci es una condicion indispensable de la cariogenesis (Tanzer et al.,

J. Dent. Educ. 65 (2001) 1028-1037). El grupo de mutans Streptococci ha sido definido por comprender al menos S. mutans, S. sobrinus, S. cricetus, S. ratti, S. ferus y S. macacae (Loesche et al., Microbio. Rev. 50 (4) (1986) 353380). Debido al hecho de que el Streptococcus mutans es el representante mas abundante de los mutans Streptococci en los humanos, la mayor parte de la investigacion microbiologica sobre caries asi como las medidas anticaries se concentren en esta especie especifica.

La union inicial del S. mutans a la superficie de los dientes ocurre a traves de dos mecanismos. El primer mecanismo es el enlazamiento de S. mutans a traves del antigeno de estreptococo 1/11 (SA 1/11) - una proteina de superficie tambien conocida por los sinonimos B, 1F, P1, SR, MSL-1 o PAC - a la pelicula, una capa de proteinas de saliva en la superficie de los dientes. Los anticuerpos contra esta proteina han mostrado evitar la adhesion del S. mutans in vitro.

De acuerdo con lo anterior, el antigeno de estreptococo 1/11 (SA 1/11) es un objetivo de vacunacion. En diferentes combinaciones recombinantes - el antigeno completo, la region de union en la saliva, la proteina acoplada a la toxina del colera o expresada sobre la superficie de una cepa avirulenta de Salmonela - se ha demostrado una inmunizacion exitosa de animales. Esto da como resultado altos titulos de 1gA y la reduccion de la colonizacion de S. mutans (Huang et al., 1nfect. 1mmun. 69 (2001), 2154-2161). Se han alcanzado resultados comparables utilizando una codificacion de vacuna de ADN para SA 1/11 (Fan et al, J. Dent Res 81 (2002), 784 - 787). Se ha logrado inmunidad pasiva por expresion recombinante de anticuerpos anti-SA 1/11 sobre las superficies de las bacterias del acido lactico. Estos lactobacilos se agregan al S. mutans y la administracion de la bacterias a ratas lleva a la reduccion del desarrollo de caries (Krueger et al, Nature Biotechnology 20 (2002), 702 -706).

La WO 06/027265 provee bacterias del acido lactico capaces de unirse a S. mutans con el objetivo de suprimir la adhesion a los dientes.

El asociado de union mas importante del antigeno de estreptococo es la aglutinina salivar, una proteina similar a la glicoproteina de los pulmones gp-340 de la superfamilia rica en cisteina del receptor devorador (Prakobphol et al., J. Biol. Chem. 275 (2000) 39860-39866).

El papel de la aglutinina en la cariogenesis no esta entendido del todo hasta ahora. Puede llevar a la adhesion de S. mutans cuando esta presente unido a las superficies, y puede llevar a una agregacion de S. mutans cuando esta presente en un estado soluble. Este ultimo puede dar como resultado una eliminacion del S. mutans agregado desde la boca mediante el flujo de saliva. Una alta concentracion de aglutinina en la saliva lleva in vitro a un incremento en la adhesion de S. mutans, mientras que in vivo no hay una correlacion clara entre la concentracion de aglutinina en la saliva y el riesgo de caries (Stenudd et al., J. Dent. Res. 80 (2001), 2005-2010).

Los anticuerpos monoclonales contra la aglutinina bloquean completamente la union del S. mutans a la hidroxiapatita cubierta con saliva in vitro y previene la agregacion dependiente de la aglutinina (Carlen und Olsson, J. Dent. Res. 74 (1995), 1040-1047; Carlen et al., J. Dent. Res. 77 (1998), 81-90). Brady et al., 1nfect. 1mmun. 60 (1992), 1008-1017 mostraron que la adhesion en superficie y la agregacion pueden ser inhibidas independientemente por anticuerpos diferentes. Esto indica que diferentes epitopos de la aglutinina son responsables de estos dos efectos.

Otras proteinas de la saliva frecuentemente relacionadas con el desarrollo de la caries son las proteinas ricas en prolina (PRP). Sin embargo, el papel de estas proteinas en la adhesion de bacterias cariogenicas es discutido con controversia. Estas proteinas son codificadas por dos loci del gen (PRH-1 y PRH-2) y se presentan en diferentes variantes que difieren en solamente unos pocos aminoacidos (PRP-1, PRP-2, P1F. Db-banda doble). Estas variantes pueden ser escindidas proteoliticamente, dando como resultado los asi llamados PRP pequefos (PRP-3, PRP-4. P1F-f y Db-f). Los PRP median una fuerte union de comensales tales como Actinomicetos naeslundii o streptococci no mutans. De manera interesante, esta union tiene lugar solamente despues de la adhesion de la proteina a la superficie del diente, dando como resultado un desplazamiento conformacional que hace que los sitios de union sean accesibles. El S. mutans se une solo debilmente. La variante de PRP Db es de relevancia para la union efectiva de S. mutans. Una alta concentracion de Db se correlaciona con una alta adhesion de S. mutans y un fuerte desarrollo de las caries. Una parte reducida de PRP-Db de una concentracion alta total de PRP se correlaciona con un bajo desarrollo de las caries (Stenudd et al., J. Dent. Res. 80 (2001), 2005-2010). Es desconocido si S. mutans se une directamente a los PRP.

La segunda via del S. mutans para adherirse a la superficie del diente es a traves de la adhesion dependiente de sacarosa. El S. mutans expresa tres diferentes glicosiltransferasas (GTF) que son capaces de sintetizar el polimero de azucar glucano. Los glucanos existen en una forma soluble en agua (enlace 1-6 glicosidico) y una forma no soluble llamada mutano (enlace 1-3 glicosidico). El mutano no puede ser degradado ni por bacterias orales ni por enzimas en la saliva. Forma una matriz pegajosa dentro de la placa dental que es la base para la adhesion de S. mutans dependiente de la sacarosa. Las glicosiltransferasas GTFB y GTFC, las enzimas prevalentes responsables de la formacion del mutano, estan localizadas en la superficie celular de S. mutans. En contraste, la glicosiltransferasa GTFD sintetiza el glucano soluble y es secretada por S. mutans. Experimentos utilizando mutantes deficientes en GTF de S. mutans muestran que una interaccion de todas las tres enzimas es necesaria para una adhesion dependiente de la sacarosa (Ooshima et al., J. Dent. Res. 80 (2001), 1672-1677). Las glicosiltransferasas tienen un sitio de enlazamiento de sacarosa en terminal N y un sitio de enlazamiento de glucano en terminal C. Los anticuerpos contra la enzima o contra el sitio de enlazamiento de glucano llevan a una inhibicion de la adhesion dependiente de sacarosa de S. mutans. No ha sido posible bloquear el sitio de enlazamiento de sacarosa de N-terminal utilizando anticuerpos (Yu et al., 1nfect. 1mmun. 65 (1997), 2292-2298).

Una inhibicion de las glicosiltransferasas seguida por una reducida adherencia de S. mutans puede alcanzarse tambien mediante algunos flavonoides o terpenoides (US 2004/0057908) o extractos de propolis (Duarte et al., Biol. Pharmacol. Bull. 26 (2003), 527 - 531).

Se ha encontrado que las bacterias del acido lactico denominadas S11, reducen la formacion del mutano y, por lo tanto la adherencia de S. mutans in vitro. Como se describio anteriormente, la formacion de mutano es esencial para que el S. mutans se adhiera a la superficie del diente. De acuerdo con lo anterior, Chung et al. (Oral Microbiol 1mmunol 19 (2004), 214 - 216) han encontrado celulas de S. mutans desprendidas cuando se incuban con las bacterias de acido lactico de la cepa S11 de las cuales se dice que reduce la formacion de mutano. El enlazamiento de S. mutans al mutano ocurre a traves de proteinas de union bacterianas (proteina de enlazamiento de glucano). El mecanismo exacto del enlazamiento tiene que ser determinado (Sato et al., 1nfect. 1mmun. 65 (1997), 668-675).

Los hongos Tricoderma harzianum y Penicillium purpurogenum producen alfa-1,3-glucanasas homologas (Fuglsang et al., J. Biol. Chem. 275 (2000), 2009-2018). El uso de especies de Enterococcus, Lactobacillus y Lactococcus efectivos contra la produccion de glucano y la produccion de placa esta ya descrito (US 6.036.952). El mecanismo de accion todavia tiene que ser dilucidado.

Una metodologia adicional para inhibir caries es neutralizar el bajo pH en la placa. La urea y la arginina son componentes de la saliva. La urea esta presente en concentraciones de 3 -10 mmol/L sin diferencias mayores entre personas libres de caries y afectadas por caries. La concentracion de la arginina libre difiere entre 4 y 40 Imol/L. Los 1ndividuos libres de caries tienen un promedio mas alto de concentraciones de arginina libre en la saliva que las personas afectadas por caries (van Wuyckhuyse et al., J. Dent Res. 74 (1995), 686-690).

Algunas bacterias de la placa tales como Streptococcus sanguis y Actinomyces naeslundii son capaces de escindir la urea o la arginina dando como resultado la formacion de amoniaco. El amonio alcalino eleva el pH de la placa y por lo tanto reduce las caries (Curran et al., Appl. Environm. Microbiol. 61 (1995), 4494-4496; Morou-Bermudez and Bume, 1nfect. 1mmun. 68 (2000), 6670-6676). De acuerdo con lo anterior se sugiere que se usen estas bacterias para tratar las caries. Otra metodologia sugerida para tratar las caries es que mediante la proteolisis de PRP-1 y PRP-3 se crean peptidos ricos en arginina, los cuales pueden, despues de proteolisis adicional por bacterias orales tales como S. sanguis, S. oralis y S. mitis, llevar a un pH mas alto en la placa. Por aplicacion de una variante recombinante de estos peptidos, el descenso dependiente de la sacarosa del pH es inhibido (Li et al., 1nfect. 1mmun. 68 (2000), 5425-5429). Ademas, se describe que utilizando una goma de mascar que contiene urea despues del consumo de sacarosa la caida del pH puede ser inhibida y, de acuerdo con lo anterior, por ejemplo, el S. mutans puede no contribuir demasiado a las caries.

Sin embargo, es evidente de lo anterior, que la tecnica anterior se concentra en medidas anticaries dirigidas contra Streptococcus mutans. No se describen medidas que permitirian apuntar hacia mutans Streptococci diferentes a Streptococcus mutans a pesar de su posible papel en la cariogenesis. Por lo tanto, hay una necesidad de medios y metodos que satisfagan los criterios deseables antes mencionados y que sean utiles para prevenir y/o tratar caries causadas por bacterias diferentes a Streptococcus mutans.

El problema tecnico subyacente a la presente invencion es asi satisfacer las necesidades antes descritas. La solucion a dicho problema tecnico se logra proveyendo las realizaciones segun se caracterizan en las reivindicaciones.

De acuerdo con lo anterior, en un primer aspecto la presente invencion se relaciona con el uso de un microorganismo que pertenece al genero Lactobacillus o un mutante o derivado del mismo, caracterizado porque es capaz de unirse especificamente a una bacteria que pertenece al grupo de mutans Streptococci, en donde la union especifica es (i) resistente a tratamiento con calor, en donde dicho tratamiento con calor se lleva a cabo a una temperatura de mas de 95°C durante al menos 20 minutos; y (ii) resistente al tratamiento con proteasa, en donde dicho tratamiento con proteasa es un tratamiento con una proteasa seleccionada del grupo consistente de pronasa E, proteinasa K, tripsina y quimiotripsina; y (iii) dependiente de calcio; y (iv) formado en un rango de pH entre 4.5 y 8.5; y (v) formado en la presencia de saliva, para la preparacion de una composicion anticariogenica para el tratamiento o prevencion de caries causadas por Streptococcus sobrinus, en donde dicho derivado del microorganismo es una forma inactivada de dicho microorganismo o un fragmento de dicho microorganismo, siendo dicho microorganismo inactivado termicamente o liofilizado, en donde dicho fragmento es una fraccion de la membrana obtenida por una preparacion de membrana y en donde dicha forma inactivada o dicho fragmento retiene la capacidad de unirse especificamente a una bacteria que pertenece al grupo de mutans Streptococci.

Preferiblemente, la union especifica puede ser probada como sigue:

(a): cultivar dicho microorganismo a la fase estacionaria;

(b): mezclar dicho microorganismo con una bacteria que pertenece al grupo de mutans Streptococci el cual ha sido cultivado en una fase estacionaria;

(c): incubar la muestra obtenida en la etapa (b) bajo condiciones que permiten la formacion de agregados de dicho microorganismo y una bacteria del grupo de mutans Streptococci; y

(d): detectar agregados por la presencia de una pella.

La bacteria que pertenece al grupo de mutans Streptococci utilizada en tal ensayo puede ser Streptococcus mutans.

La union especifica se prueba especificamente como se describe en el Ejemplo 4 mas adelante.

En particular, para una prueba de agregacion de pella de mutans Streptococci tal como se describe en el Ejemplo 4, infra, se mezclan preferiblemente microorganismos que pertenecen al grupo de las bacterias del acido lactico, a saber microorganismos que pertenecen al genero Lactobacillus, con mutans Streptococci en relaciones volumetricas de 3:1 a 60:1 (mutans Streptococci: lactobacillus). Ambos, las bacterias del acido lactico y mutans Streptococci se cultivan en fase estacionaria como se describe en el Ejemplo 1. Preferiblemente, la densidad optica se mide fotometricamente a una longitud de onda de 600 nm. Las relaciones mencionadas corresponden a una relacion de unidades formadoras de colonia de 1:50 a 1:2.5. Preferiblemente, un OD600= 1 en 1 ml se correlaciona con 3 x 108 unidades formadoras de colonia de un mutans Streptococcus. Preferiblemente, un OD600= 1 en 1 ml se correlaciona con 7 x 109 unidades formadoras de colonia de lactobacillus tal como se describe aqui mas adelante. Preferiblemente, para probar la reaccion de agregacion por formacion de pellas, las bacterias estan en un volumen de 2 ml en tubos Falcon de 15 ml. Si es necesario, las suspensiones del cultivo se diluyen con regulador PBS para obtener relaciones volumetricas mencionadas anteriormente, a la vez que se mantiene el volumen final en 2 ml. Preferiblemente, la mezcla se somete a vortex durante aproximadamente 15 segundos y luego se deja sin perturbar durante al menos 5, 10, 15 minutos y mas preferiblemente al menos 20 minutos a temperatura ambiente, esto es, cualquier temperatura entre 16°C y 25°C. Una agregacion es visible en forma de una turbidez inmediata de la suspension y, despues de al menos 20 minutos es visible una agregacion por agregados que se depositan como una pella visible (ejemplo mostrado en la Figura 1, tubo Falcon de la izquierda), mientras que las mezclas de agregacion no mutans Streptococcus permanecen en suspension (ejemplo mostrado en la Figura 1, tubo Falcon de la derecha). Como control, puede probarse la autoagregacion de las respectivas bacterias de acido lactico y la cepa de mutans Streptococcus omitiendo bien sea los mutans Streptococcus o las bacterias de acido lactico.

La agregacion de un lactobacillus y un mutans Streptococcus de acuerdo con la prueba antes descrita puede ser cuantificada separando los agregados formados por centrifugacion, por ejemplo, a 500 x g durante 30 segundos. Subsecuentemente, la cantidad de agregacion puede ser determinada midiendo la cantidad de celulas no agregadas que permanecen en el sobrenadante. La determinacion puede llevarse a cabo por cualquier medio adecuado conocido para la persona experimentada en la tecnica. Preferiblemente, la determinacion se lleva a cabo retirando un cierto volumen del sobrenadante, por ejemplo 1 ml. Subsecuentemente, puede medirse la densidad optica del sobrenadante retirado a una longitud de onda adecuada, conocida para una persona experimentada, por ejemplo a 600 nm. El valor medido despues de la sustraccion de un valor de una prueba de control correspondiente sin lactobacilos representa la cantidad de celulas que no se han agregado.

Alternativamente, con el fin de direccionar el posible problema de autoagregacion puede emplearse una tincion, preferiblemente una tincion fluorescente. La union especifica puede probarse como sigue:

(a): cultivo de dicho microorganismo en fase estacionaria;

(b): mezclar dicho microorganismo con una bacteria que pertenece al grupo de mutans Streptococci el cual ha sido cultivado en fase estacionaria y que ha sido sometido a tincion utilizando una tincion adecuada, preferiblemente una tincion fluorescente;

(c): incubacion de la mezcla obtenida en la etapa (b) bajo condiciones que permitan la formacion de agregados de dicho microorganismo y una bacteria del grupo de mutans Streptococci; y

(d): detectar agregados mediante la deteccion de la tincion, preferiblemente una tincion fluorescente.

La bacteria que pertenece al grupo de mutans Streptococci utilizada como ensayo puede ser Streptococcus mutans. Preferiblemente tal prueba de agregacion puede ser llevada a cabo como se describe en el Ejemplo 5, aqui mas adelante. En particular, para una prueba de agregacion de mutans Streptococci tal como se describe en el Ejemplo 5, mas abajo, tanto las bacterias del acido lactico, a saber microorganismos pertenecientes al genero Lactobacillus y los mutans Streptococci se cultivan en fase estacionaria como se describe en el Ejemplo 1. Preferiblemente, la densidad optica se mide fotometricamente a una longitud de onda de 600 nm. Preferiblemente, un OD600= 1 en 1 ml se correlaciona con 3 x 108 unidades formadoras de colonia de un mutans Streptococcus. Preferiblemente, un OD600= 1 en 1 ml se correlaciona con 7 x 109 unidades formadoras de colonias de lactobacilos segun se describe aqui mas adelante. Subsecuentemente, los mutans Streptococci sufren la tincion. En una realizacion preferida, los lactobacilli son tefidos, mientras que los Streptococci no son tefidos. Como tincion se puede utilizar cualquier tincion adecuada, preferiblemente una tincion fluorescente conocida para las personas experimentadas en la tecnica. Preferiblemente, puede utilizarse una tincion de fluorescencia especifica o no especifica, por ejemplo, CFDA-SE. Especificamente, las celulas son recolectadas, por ejemplo por centrifugacion, preferiblemente a 3200 x g por 5 minutos. Subsecuentemente, la pella obtenida puede ser resuspendida en cualquier regulador adecuado conocido para la persona experimentada en la tecnica, preferiblemente un regulador PBS. La cantidad de regulador puede ser calculado de tal manera que la suspension resultante tenga una OD600 de, por ejemplo, 4.2/ml. Subsecuentemente, la suspension puede ser mezclada con una tincion adecuada, por ejemplo una tincion de fluorescencia, preferiblemente con diacetato de 5,6-carboxifluoresceina, succimidil ester (CFDA-SE), preferiblemente con 2 Il de una solucion de CFDA-SE (1nvitrogen). Subsecuentemente, las celulas pueden ser incubadas durante un periodo adecuado, como lo sabe la persona experimentada en la tecnica, por ejemplo durante 2 horas, a una temperatura adecuada como lo sabe la persona experimentada, por ejemplo a 37°C. En una etapa adicional, las celulas tefidas pueden ser recolectadas, por ejemplo por centrifugacion. Preferiblemente, la centrifugacion se lleva a cabo a 3200 x g durante 5 minutos. Las celulas pueden ser entonces resuspendidas en un regulador adecuado, como lo sabe la persona experimentada en la tecnica, por ejemplo, en 2 ml de un regulador de PBS. Para la agregacion, los microorganismos que pertenecen al grupo de bacterias del acido lactico se mezclan preferiblemente con mutans Streptococci en relaciones volumetricas de 3:1 a 1:3 (mutans Streptococci: lactobacilos). Mas preferiblemente, la relacion volumetrica de la mezcla es 1:1. Las relaciones mencionadas corresponden a una relacion de unidades formadoras de colonia de 1:50 hasta 1:150. Para probar la reaccion de agregacion a traves de la medicion de la tincion, preferiblemente la fluorescencia, los lactobacilos y los mutans Streptococci se utilizan en cualquier volumen adecuado conocido para la persona experimentada, preferiblemente en un volumen de 50 Il. Preferiblemente, la mezcla se lleva a cabo en una placa de microtitulacion, por ejemplo en una placa de microtitulacion de 96 pozos. Subsecuentemente, la mezcla puede ser sometida a vortex, preferiblemente durante 12 minutos a velocidad maxima. Despues de esto, la mezcla puede ser centrifugada, por ejemplo durante 10 segundos a 500 x g. El sobrenadante puede ser retirado entonces y la pella puede ser resuspendida en cualquier regulador adecuado conocido por la persona experimentada en la tecnica, preferiblemente en un regulador PBS en cualquier volumen adecuado, por ejemplo en 100 Il. La tincion de la suspension puede ser medida en la mezcla por cualquier medio adecuado conocido por la persona experimentada. Preferiblemente, en caso de la fluorescencia, la fluorescencia puede ser detectada en un lector de fluorescencia, por ejemplo a una longitud de onda de 495 nm para excitacion y 525 nm para emision. Como controles pueden probarse lactobacilos solos y mutans Streptococci tefidos solos. Cualquier tincion de fondo, por ejemplo fluorescencia, puede ser medida para los mutans Streptococci probados solos y puede ser sustraida preferiblemente del valor para la agregacion con los lactobacilos respectivos. Un efecto de agregacion esta presente si la tincion de fondo, por ejemplo, la fluorescencia, medida como se indica aqui, es sustraida de la tincion medida, por ejemplo fluorescencia, en una muestra que contiene un Lactobacillus como se describe aqui mas arriba y un mutans Streptococcus probado, como se describe aqui a continuacion, y el valor resultante esta al menos por encima de cero. Mas preferiblemente, un efecto de agregacion esta presente si el valor resultante esta reproduciblemente por encima de cero en una serie de pruebas, llevadas a cabo como se describio aqui arriba. Una "serie de experimentos" significa al menos 2, preferiblemente 3, mas preferiblemente 4 y lo mas preferiblemente 5 pruebas.

La union especifica descrita anteriormente no requiere magnesio. Esta caracteristica puede ser probada como se describe en los ejemplos anexos.

Como se muestra en los Ejemplos anexos, se ha encontrado sorprendentemente que las bacterias especificas del acido lactico que originalmente han sido identificadas y aisladas por las pruebas de ensayo antes mencionadas debido a su capacidad para unirse a Streptococcus mutans mientras no se unen a las otras especies de Streptococcus S. salivarius, S. oralis, S.mitis y/o S. sanguinis (vease WO 06127265), muestran la capacidad de agregar diversos otros mutans Streptococci, por ejemplo, Streptococcus sobrinus, Streptococcus cricetus, Streptococcus Ratti, Streptococcus Ferus y Streptococcus macacae. Asi, la identificacion de las bacterias de acido lactico que muestran las caracteristicas de enlazamiento descritas anteriormente en relacion con Streptococcus mutans y en donde el enlazamiento se establece preferiblemente por los ensayos descritos anteriormente provee bacterias del acido lactico que no solamente tienen la capacidad de agregar Streptococcus mutans sino que tambien tienen la capacidad de agregar otros mutans Streptococci, esto es, especies de Streptococcus que tienen las caracteristicas comunes como se describen mas adelante y que tambien han sido puestos en relacion con el desarrollo de la caries. Asi, las bacterias del acido lactico, las cuales muestran las caracteristicas de union anteriormente citadas versus un tipo de bacteria perteneciente al grupo de mutans Streptococci (por ejemplo Streptococcus mutans) han demostrado ser capaces de agregar tambien otras bacterias pertenecientes al grupo de mutans Streptococci y pueden, por lo tanto, ser utilizadas para prevenir y/o tratar caries causadas por tales otras bacterias. Asi, los ensayos identificados mas arriba para probar el enlazamiento de bacterias del acido lactico a una bacteria que pertenece al grupo de mutans Streptococci permiten identificar las bacterias del acido lactico que tambien se unen a/se agregan a otras bacterias del grupo de mutans Streptococci. Asi, la presente invencion provee una mejora importante en la provision de medios y metodos para atacar las caries, las cuales son causadas por mutans Streptococci diferentes a Streptococcus mutans, a saber S. sobrinus.

Como es evidente de lo anterior, todas las caracteristicas antes mencionadas hacen que el microorganismo mencionado mas arriba perteneciente al grupo de bacterias de acido lactico sea un agente adecuado para prevenir y/o tratar caries, en particular caries que son causadas por S. sobrinus. De acuerdo con lo anterior, el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de bacterias del acido lactico del genero Lactobacillus, ejerce un efecto anticariogenico y es asi un agente util para prevenir y/o probar caries, en particular caries causadas por S. sobrinus. "Caries" o "caries dental" o "cavidad" son terminos intercambiables para una enfermedad infecciosa cronica asociada con un area blanda de caida en un diente que progresivamente lleva a la muerte de un diente. Usualmente ocurre en nifos y en adultos jovenes pero puede afectar a cualquier persona. Es la causa mas importante de perdida de dientes en gente mas joven. Las caries pueden ser diagnosticadas por metodos conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Angmar-Mansson and ten Bosch, Adv. Dent.. Res. 7 (1993), 70-79).

El termino "mutans Streptococcus" se refiere a un microorganismo del grupo taxonomico de Streptococcus, el cual se encuentra en la placa en la cavidad oral y el cual fermenta el manitol y el sorbitol. Preferiblemente es un microorganismo con las caracteristicas arriba mencionadas que adicionalmente es capaz de producir glucanos extracelulares a partir de sacarosa. Preferiblemente, dicho microorganismo es cariogenico, en particular en modelos humanos y/o animales. Mas preferiblemente, el termino se relaciona con un microorganismo, el cual muestra todas las caracteristicas antes mencionadas. La fermentacion del sorbitol y el manitol pueden ser comprobadas utilizando cualquier prueba adecuada conocida por las personas experimentadas en la tecnica, por ejemplo, la prueba AP1 20 Strep (Biomerieux, Francia).

Mas preferiblemente, el termino se relaciona con un microorganismo que pertenece a las especies Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Streptococcus cricetus, Streptococcus ratti, Streptococcus ferus o Streptococcus macacae. Aun mas preferiblemente, el termino se relaciona con un microorganismo que pertenece al serotipo c de Streptococcus mutans (DSMZ 20523) serotipo e de Streptococcus mutans (NCTC 10923), serotipo f de Streptococcus mutans (NCTC 11060), Streptococcus sobrinus DSM 20742, Streptococcus Ratti DSM 20564, Streptococcus cricetus DSM 20562, Streptococcus ferus DSM 20646 o Streptococcus macacae DSM 20714. El termino "mutans Streptococci" se refiere a al menos un microorganismo del grupo de mutans Streptococcus, tal como se describe aqui anteriormente. Preferiblemente, el termino se refiere a cualquier combinacion y subgrupo de microorganismos que pertenecen al grupo de mutans Streptococcus tal como se describe aqui anteriormente.

El termino "prevenir caries" incluye profilaxis de las caries. De acuerdo con lo anterior, un sujeto al que nunca se le ha encontrado mutans Streptococci, los agentes causantes de la caries, pero esta en riesgo de que se le encuentre, esto es, infectado con mutans Streptococci se beneficia, por ejemplo, de los usos y metodos de la presente invencion en la medida en tanto dicho sujeto no sufrira de caries. Por lo tanto, los usos y metodos de la presente invencion pueden ser aplicados, por ejemplo, a infantes, nifos o animales jovenes para la profilaxis de caries puesto que la cavidad oral de los infantes o animales jovenes normalmente esta libre de mutans Streptococci. Sin embargo, las composiciones tal como se utilizan de acuerdo con la presente invencion no se limitan a la administracion a infantes, nifos o animales jovenes.

El termino "tratamiento de caries" incluye la administracion de las composiciones tal como se describe aqui a continuacion a un sujeto que sufre de la caries para el proposito de disminuir la cantidad de celulas de mutans Streptococci y/o para eliminar completamente el mutans Streptococci de la boca, en particular de la cavidad oral incluyendo los dientes. Desde luego, despues de haber sido curados de mutans Streptococci, se preve que el sujeto respectivo se beneficia de los usos y metodos de la presente invencion con respecto al efecto anticaries profilactico ejercido sobre mutans Streptococci.

Opcionalmente, el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico es un microorganismo probiotico que ademas de sus efectos anticariogenicos, tiene efectos beneficiosos sobre el organismo anfitrion al cual se administra. Un "probiotico", segun la definicion aceptada en general, es un "suplemento alimenticio microbiano vivo que afecta de manera beneficiosa el animal anfitrion mejorando su balance microbiano intestinal".

Mutans Streptococci se presentan como parte de la flora normal en la boca. Estan involucrados en la causa de la caries dental en humanos y animales, en particular mamiferos. La placa dental se adhiere a las fisuras y recesos de los dientes adyacentes a las encias. Consiste inicialmente de glicoproteina, la cual se precipita y se adsorbe sobre el esmalte dental. Las bacterias orales luego se asocian con la glicoproteina. La sacarosa de la dieta es un contribuyente importante a la produccion de caries, particularmente si la sacarosa esta en la forma de alimentos dulces pegajosos algunos de los cuales pueden permanecer en la boca durante algun tiempo. La sacarosa es asi metabolizada mas completamente por mutans Streptococci para formar acido. Las bebidas que contienen sacarosa son tragadas y asi la sacarosa pasa menos tiempo en la boca. Es esencial que la placa dental sea controla mediante el uso regular de cepillado dental y el uso de palillos e hilo dental. La adicion de 1 ppm de fluoruro al agua para beber ha demostrado ser muy efectiva en la reduccion de las caries. Sin embargo, la posibilidad de utilizar una vacuna contra Streptococcus mutans fue contemplada en la comunidad cientifica. Asi, ademas de los esquemas generales de higiene oral, que afectan la mayor parte de las bacterias en la cavidad oral, la tecnica anterior casi completamente se enfoca en medidas especificas contra Streptococcus mutans. Sin embargo, debido al hallazgo sorprendente de la presente invencion de que microorganismos de origen natural que pertenecientes al grupo de las bacterias del acido lactico, especificamente al genero de Lactobacillus, los cuales han sido identificados por su capacidad para unirse a Streptococcus mutans, tienen tambien la capacidad de enlazar cepas de mutans Streptococci, como por ejemplo, Streptococcus sobrinus, Streptococcus cricetus, Streptococcus ratti, Streptococcus ferus o Streptococcus macacae, es posible ahora prevenir y/o tratar efectivamente las caries causadas por mutans Streptococci diferentes a Streptococcus mutans, en particular S. sobrinus, puesto que los microorganismos antes mencionados pertenecientes al grupo de las bacterias del acido lactico son capaces de agregarse y arrastrar mutans Streptococci tales como, por ejemplo Streptococcus sobrinus, Streptococcus cricetus, Streptococcus ratti, Streptococcus ferus o Streptococcus macacae. De acuerdo con lo anterior, la presente invencion provee el uso de bacterias facilmente administrables, las cuales son organismos grado alimenticio que pueden, ademas de sus propiedades anticariogenicas, ser utiles como probioticos.

En particular, cuando se analizan microorganismos pertenecientes al grupo de las bacterias del acido lactico, especificamente al genero Lactobacillus, los cuales han sido identificados originalmente por su capacidad de unirse a Streptococcus mutans pero no a Streptococcus salivarius, Streptococcus oralis, Streptococcus mitis y Streptococcus sanguinis, se ha encontrado sorprendentemente que dichos microorganismos no solamente son capaces de unirse a Streptococcus mutans, sino que tambien se pueden unir a otras especies de mutans Streptococci, tales como, por ejemplo, Streptococcus sobrinus, Streptococcus cricetus, Streptococcus ratti, Streptococcus ferus o Streptococcus macacae, los cuales son los agentes causantes de la caries. Al unirse a estos mutans Streptococci, el microorganismo perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico, especificamente al genero de Lactobacillus tal como se describe aqui, inter alia, se unen y agregan a mutans Streptococcus y asi, en consecuencia, arrastra mutans Streptococcus por el flujo natural de la saliva, evitando y/o tratando por lo tanto la caries. Ademas de esto, los microorganismos antes mencionados pertenecientes al grupo de bacterias del acido lactico preferiblemente no se unen a otros microorganismos que no pertenecen al grupo de mutans Streptococci, presentes en la cavidad oral tal como se describe aqui y en particular en el Ejemplo 6 aqui mas adelante. Asi, el microambiente de la cavidad oral no es perturbado puesto que solamente los mutans Streptococci como agentes causantes de caries son eliminados. Para mejor conocimiento, los mutans Streptococci no tienen ningun efecto beneficioso en la cavidad oral y, asi, su perdida no tiene efectos adversos para el anfitrion respectivo.

De manera muy llamativa, la union especifica del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico, especialmente de la especie Lactobacillus descrita aqui, a mutans Streptococci es resistente a tratamiento por calor y/o resistente al tratamiento con proteasa. Ademas, la union especifica depende del calcio y/o es independiente de magnesio y es estable en un punto de acidez de 4.5 y ocurre en la presencia de saliva lo que lo hace particularmente adecuado para el uso en la forma de aplicaciones orales o como aditivo para alimentos, comidas o bebidas que pueden contener concentraciones mas altas de calcio, tales como leche. De manera notable, derivados termicamente inactivados o liofilizados o fragmentos de dichos microorganismos divulgados aqui son aun capaces de unirse especificamente a mutans Streptococci. Este efecto sorprendente es ventajoso para usar dichos fragmentos de dichos microorganismos asi como mutantes o derivados de los mismos en composiciones para uso en animales, preferiblemente humanos o mamiferos, para prevenir y/o tratar caries. En particular dichos derivados o fragmentos pueden ser agregados facilmente a cualquier composicion, por ejemplo una composicion cosmetica o farmaceutica, alimento o productos alimenticios o bebidas y similares. Adicionalmente, la produccion de tales derivados o fragmentos es barata y facil y pueden ser almacenadas durante periodos prolongados de tiempo sin perder su capacidad de unirse especificamente a mutans Streptococci. Una ventaja adicional del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico es que retiene su capacidad para unirse especificamente a mutans Streptococci si es liofilizado o secado por aspersion o secado. Esto lo convierte en un ingrediente favorable para uso en las composiciones descritas aqui.

Otras ventajas de la invencion se definen en parte en la descripcion aqui, y en parte, pueden ser obvias a partir de la descripcion, o pueden ser aprendidas a partir de la practica de la invencion.

Antes de que la presente invencion sea descrita en detalle, se debe entender que esta invencion no esta limitada a la metodologia particular, protocolos, bacterias, vectores y reactivos, etc., descritos aqui en la medida en que estos pueden variar. Tambien debe entenderse que la terminologia usada aqui es para el proposito de describir realizaciones particulares unicamente, y no pretende limitar el alcance de la presente invencion, la cual sera limitada solamente por las reivindicaciones anexas. A menos que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientificos utilizados aqui tienen los mismos significados segun se entienden comunmente por una persona de experiencia normal en la tecnica.

Preferiblemente, los terminos utilizados aqui se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (1UPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel. B. and K6lbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland). A lo largo de esta especificacion y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprenden" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entiende como implicando la inclusion de un entero establecido o paso o grupo de enteros o pasos pero no la exclusion de ningun otro entero o paso o grupo de enteros o pasos.

Debe anotarse que tal como se utilizan aqui y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una" y "el, la", incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente otra cosa. Asi, por ejemplo, la referencia a "un reactivo" incluye uno o mas de tales diferentes reactivos, y referencia a "el metodo" incluye referencia a etapas y metodos equivalentes conocidos para las personas experimentadas en la tecnica que podrian ser modificados o sustituidos por los metodos descritos aqui.

Cuando se utiliza en el contexto de la presente invencion, el termino "microorganismo que pertenece al grupo de las bacterias del acido lactico" abarca microorganismos que pertenecen a bacterias, en particular pertenecientes a las eubacterias fermentadoras gram-positivas, mas particularmente pertenecientes a la familia de las lactobacteriaceae incluyendo las bacterias del acido lactico. Ademas, dicho termino tambien abarca derivados o mutantes o fragmentos, tales como fracciones de las membranas tal como se describen aqui, de dichos microorganismos, que retienen la capacidad de unirse especificamente a mutans Streptococci. Los terminos "derivado", "mutantes" y "fragmentos" se describen aqui en diversos lugares. Las bacterias del acido lactico estan divididas desde un punto de vista taxonomico en las subdivisiones de Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus y Lactobacillus. El microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico es preferiblemente una especie de Lactobacillus. Los miembros del grupo de bacterias del acido lactico carecen normalmente de porfirinas y citocromos, no llevan a cabo fosforilacion con transporte de electrones y por lo tanto obtienen energia solamente por fosforilacion a nivel de sustrato. Esto es en las bacterias del acido lactico el ATP sintetizado a traves de la fermentacion de carbohidratos. Todas las bacterias del acido lactico crecen anaerobicamente, sin embargo, a diferencia de muchos anaerobios, la mayor parte de las bacterias del acido lactico no son sensibles al oxigeno y asi pueden crecer en su presencia tanto como en su ausencia. De acuerdo con lo anterior, los microorganismos antes mencionados pertenecientes al grupo de las bacterias del acido lactico son preferiblemente bacterias del acido lactico anaerobicas aerotolerantes, preferiblemente pertenecientes al genero de Lactobacillus. Tal como se describio anteriormente, los microorganismos usados de acuerdo con la presente invencion tal como se describe en las reivindicaciones pertenecen al genero Lactobacillus.

Las bacterias del acido lactico antes mencionadas son preferiblemente en forma de barra o esfericas, variando desde barras largas y esbeltas hasta cortas y gruesas y son preferiblemente inmoviles y/o asporogenas y producen acido lactico como producto principal o unico del metabolismo fermentado. El genero Lactobacillus al cual pertenece el microorganismo antes mencionado esta dividido segun las siguientes caracteristicas en tres subgrupos principales, con lo cual se preve que la especie de Lactobacillus antes mencionada pueden pertenecer a cada uno de los tres subgrupos principales:

(a): lactobacilos homofermentadores

(i): producen acido lactico, preferiblemente el isomero L-, D- o DL- del acido lactico en una cantidad de al menos 85% a partir de glucosa a traves de la ruta Embden-Meyerhof;

(ii): crece a temperatura de 45°C, pero no a temperatura de 15°C;

(iii) son de forma de barra larga; y

(iv): tienen acido glicerol teicoico en la pared celular;

(b): lactobacilos homofermentadores

(i): producen acido lactico, preferiblemente los isomeros L- o DL- del acido lactico a traves de la ruta Embden-Meyerhof;

(ii): crecen a una temperatura de 15°C, mostrando crecimiento variable a una temperatura de 45°C;

(iii) son de forma de barra corta y corineformes; y

(iv): tienen acido ribitol y/o glicerol teicoico en su pared celular;

(c): lactobacilos heterofermentadores

(i): producen acido lactico, preferiblemente el isomero DL- del acido lactico en una cantidad de al menos 50% a partir de glucosa a traves de la ruta pentosa-fosfato;

(ii): producen dioxido de carbono y etanol

(iii) muestran crecimiento variable a una temperatura de 15°C o 45°C;

(iv): tienen forma de barra larga o corta; y

(v): tienen acido glicerol teicoico en su pared celular.

Con base en las caracteristicas descritas mas arriba, los microorganismos antes mencionados pueden ser clasificados por la pertenencia al grupo de las bacterias del acido lactico, particularmente al genero de Lactobacillus. Utilizando sistemas clasicos, por ejemplo con referencia a las descripciones pertinentes en "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" (Williams & Wilkins Co.,1984), puede determinarse que un microorganismo pertenece al genero de Lactobacillus. Alternativamente, puede clasificarse que los microorganismos pertenecen al genero de Lactobacillus por metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, por su huella metabolica, esto es, una revision comparable de la capacidad de tal microorganismo para metabolizar azucares o por otros metodos descritos, por ejemplo, en Schleifer et al., System. Appl. Microb., 18 (1995). 461-467 o Ludwig et al., System. Appl. Microb., 15 (1992), 487-501. Los microorganismos antes mencionados son capaces de metabolizar fuentes de azucar, las cuales son tipicas y conocidas en la tecnica para microorganismos que pertenecen al genero de los Lactobacillus. Preferiblemente, sin embargo, el microorganismo antes mencionado tiene una huella metabolica seleccionada del grupo consistente de:

(i): metaboliza D-lactosa, pero no L-sorbosa y/o D-sacarosa y/o D-inulina,

(ii): metaboliza inulina,

(iii) metaboliza L-sorbosa, pero no D-lactosa y/o D-sacarosa y/o inulina, y

(iv): metaboliza L-sorbosa, D-lactosa e inulina.

Preferiblemente el microorganismo antes mencionado tiene una huella metabolica seleccionada del grupo consistente de:

(i): metaboliza D-lactosa, pero no L-sorbosa, D-sacarosa e inulina,

(ii): metaboliza L-sorbosa, D-lactosa e inulina, pero no D-sacarosa,

(iii) metaboliza L-sorbosa, pero no D-lactosa, D-sacarosa e inulina, y

(iv) metaboliza L-sorbosa, D-lactosa, D-sacarosa, pero no inulina.

Desde luego, el microorganismo antes mencionado no esta limitado a la metabolizacion de los azucares mencionados en el patron de huellas metabolicas antes mencionado, pero puede ser capaz de metabolizar azucares adicionales que son metabolizados comunmente por especies de Lactobacillus.

La afiliacion de los microorganismos antes mencionados al genero de Lactobacillus tambien puede ser caracterizada utilizando otros metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, utilizando electroforesis en gel SDS-PAGE de proteina total de las especies que van a ser determinadas y comparando con cepas conocidas y ya caracterizadas del genero Lactobacillus. Las tecnicas para preparar un perfil de proteina total como se describe mas arriba, asi como el analisis numerico de tales perfiles, son bien conocidos para una persona experimentada en el arte. Sin embargo, los resultados solamente son confiables en tanto cada etapa del proceso sea estandarizada suficientemente. Enfrentado con el requerimiento de exactitud cuando se determina la union de un microorganismo al genero de Lactobacillus, los procedimientos estandarizados se hacen regularmente disponibles al publico por sus autores tales como el de Pot et al., tal como fue presentado durante un "taller" organizado por la Union Europea, en la Universidad de Gante, en Belgica, del 12 al 16 de septiembre 1994 (Fingerprinting techniques for classification and identification of bacteria, SOS-PAGE of whole cell protein). El software usado en la tecnica para analizar la electroforesis en gel en SDS-PAGE es de crucial importancia puesto que el grado de correlacion entre las especies depende de los parametros y algoritmos utilizados por este software. Sin entrar en los detalles teoricos, la comparacion cuantitativa de las bandas medidas mediante un densitometro y normalizadas mediante un ordenador se hace preferiblemente con el coeficiente de correlacion de Pearson. La matriz de similitud asi obtenida puede ser organizada con la ayuda del algoritmo UPGMA (metodo de grupo de pares no sopesado utilizando uniones promedio) que no solamente hace posible agrupar juntos los perfiles mas similares, sino tambien construir dendogramas (vease Kersters, Numerical methods in the classification and identification of bacteria by electrophoresis, in Computer-assisted Bacterial Systematics, 337-368, M. Goodfellow, A. G. O'Donnell Ed., John Wiley and Sons Ltd, 1985).

Alternativamente, la afiliacion de dichos microorganismos al genero de Lactobacillus puede ser caracterizado con respecto al ARN ribosomico en el asi llamado Riboprinter.RTM. Mas preferiblemente, la afiliacion de la especie antes mencionada al genero Lactobacillus se demuestra comparando la secuencia de nucleotidos del ARN ribosomico 16S de dichas bacterias, o de su ADN genomico que codifica para el ARN ribosomico 16S, con los de otros generos y especies de bacterias de acido lactico conocidas hasta la fecha. Otra alternativa preferida para determinar la union de las especies al genero Lactobacillus es el uso de cebadores de PCR especificos de la especie que apuntan a la region espaciadora de ARNr 16S-23S. Otra alternativa preferida es RAPD-PCR (Niaatu et al. in Antonie van Leenwenhoek (79), 1-6, 2001), en virtud de que se genera un patron de ADN especifico de una cepa el cual permite determinar la afiliacion de un microorganismo identificado al genero de Lactobacillus. Tecnicas adicionales utiles para determinar la afiliacion de un microorganismo al genero de Lactobacillus son el polimorfismo de longitud de fragmento de restriccion (RFLP) (Giraffa et al., 1nt. J. Food Microbiol. 82 (2003), 163-172), seguimiento de ollas de elementos repetitivos (Gevers et al., FEMS Microbiol. Lett. 205 (2001) 31-36) o analisis del patron de ester metilico de acidos grasos (FAME) de celulas bacterianas (Heyman et al., FEMS Microbiol. Lett. 181 (1991), 55-62). Alternativamente, los lactobacilos pueden ser determinados por tipificacion de lectina (Annuk et al., J. Med. Microbiol. 50 (2001), 1069-1074) o por analisis de las proteinas de su pared celular (Gatti et al., Lett. Appl. Microbiol. 25 (1997), 345-348.

Los microorganismos antes mencionados son preferiblemente bacterias del acido lactico pertenecientes al genero de Lactobacillus, mas preferiblemente especies de Lactobacillus como las descritas aqui. Aun mas preferiblemente dicho Lactobacillus es Lactobacillus paracasei o Lactobacillus rhamnosus. Sin embargo, las especies de Lactobacillus no estan limitadas a estos. Como se describio anteriormente, los microorganismos usados de acuerdo con la presente invencion tal como se describe en las reivindicaciones pertenecen al genero Lactobacillus. Los microorganismos antes mencionados pueden ser preferiblemente "aislados" o "purificados". El termino "aislado" significa que el material es retirado de su ambiente original, por ejemplo el ambiente natural si es de origen natural. Por ejemplo, un microorganismo de origen natural, preferiblemente una especie de Lactobacillus, separado de alguno o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, es aislado. Tal microorganismo podria ser parte de una composicion, y debe verse aun como aislado en cuanto a la composicion no sea parte de su ambiente natural.

El termino "purificado" no requiere pureza absoluta, mas bien, pretende ser una definicion relativa. Los microorganismos individuales obtenidos a partir de una biblioteca han sido purificados convencionalmente hasta una homogeneidad microbiologica, esto es, crecen como colonias individuales cuando se siembran sobre placas de agar por metodos conocidos en la tecnica. Preferiblemente, las placas de agar que se utilizan para este proposito son selectivas para especies de Lactobacillus. Tales placas de agar selectiva son conocidas en el arte.

Mas preferiblemente, el microorganismo mencionado anteriormente que pertenece al grupo de las bacterias del acido lactico se selecciona del grupo consistente de Lactobacillus paracasei o Lactobacillus rhamnosus que tiene el numero de acceso DSMZ DSM 16667 (L paracasei ssp. paracasei Lb-Ob-K1), numero de acceso DSMZ DSM 16668

(L. paracasei ssp. paracasei Lb Ob-K2), Numero de acceso DMSZ, DSM 16669 (L. paracasei ssp. paracasei Lb-Ob-K3), Numero de acceso DMSZ, DSM 16670 (L. paracasei ssp. paracasei Lb-Ob-K4), Numero de acceso DMSZ, DSM 16671 (L. paracasei ssp. paracasei Lb-Ob-K5), Numero de acceso DMSZ, DSM 16672 (L. rhamnosus Lb-Ob-K6) y Numero de acceso DMS, DSM 16673 (L. rhamnosus Lb-Ob-K7) o un mutante o derivado del mismo, donde dicho mutante o derivado retiene la capacidad de unirse especificamente a mutans Streptococci. El termino "Lactobacillus paracasei o Lactobacillus rhamnosus que tiene numero de acceso DSMZ" se relaciona con celulas de un microorganismo que pertenece a la especie Lactobacillus paracasei o Latobacillus rhamnosus depositada con el Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH ("DSMZ") en el 26 de Agosto de 2004 y que tiene los siguientes numeros de deposito DSM 16667, 16668, 16669, 16670, 16671, 16672 o 16673. El DSMZ esta localizado en el Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany. Los depositos DSMZ antes mencionados fueron hechos con conformidad de los terminos del tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del deposito de microorganismos para propositos de procedimientos de patentes.

"Un mutante o derivado" del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico, preferiblemente de las celulas de Lactobacillus paracasei o Lactobacillus rhamnosus depositadas tiene preferiblemente las mismas caracteristicas que las cepas respectivas depositadas, esto es, retiene la capacidad de enlazarse especificamente a mutans Streptococci, preferiblemente con las caracteristicas de union tal como se describen aqui mas arriba. Por ejemplo, dicho derivado puede ser manipulado geneticamente. En el contexto de la presente invencion el termino "manipulado geneticamente" se utiliza en su sentido mas amplio para metodos conocidos para la persona experimentada en la tecnica para modificar acidos nucleicos deseados in vitro e in vivo de tal manera que se afectan las modificaciones geneticas y los genes se alteran por la tecnologia de ADN recombinante. De acuerdo con lo anterior, se prefiere que dichos metodos comprendan clonacion, secuenciamiento y transformacion de acidos nucleicos recombinantes. Para este proposito se usan vectores apropiados que incluyen vectores de expresion para especies de Lactobacillus tales como, por ejemplo, los descritos en EP-B1 506 789, EP-B1 316 677, EP-B1 251 064, EP-B1 218 230, EP-B1 133 046 o WO 89/01970.

Cebadores, enzimas, celulas anfitrionas adicionales para clonar constructos intermedios y similares pueden utilizarse y son conocidas por las personas experimentadas en la tecnica. Preferiblemente, los mutantes geneticamente manipulados comprenden celulas del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico, preferiblemente de la especie Lactobacillus depositada que acoge acidos nucleicos recombinantes bien sea comprendidos en su cromosoma bacteriano o un plasmido o plasmidos o comprendido en su cromosoma bacteriano y/o un o unos plasmidos. Dichos acidos nucleicos recombinantes son preferiblemente foraneos para el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico. Por "foraneo" se entiende que la molecula de polinucleotido o acido nucleico es heterologa con respecto a la celula anfitriona, esto significa derivada de una celula u organismo con un fondo genomico diferente, o es homologa con respecto a la celula anfitriona, pero localizada en un ambiente genomico diferente que la contraparte de origen natural de dicha molecula de acido nucleico. Esto significa que, si la molecula de acido nucleico es homologa con respecto a la celula anfitriona, no se localiza en su localizacion natural en el genoma de dicha celula anfitriona, en particular esta rodeada por genes diferentes. En este caso el polinucleotido puede estar bien sea bajo el control de su propio promotor o bajo el control de un promotor heterologo. El vector o molecula de acido nucleico antes descritos, los cuales estan presente en la celula anfitriona pueden ser integrados en el genoma de la celula anfitriona

o pueden ser mantenidos de alguna manera extracromosomicamente. En este aspecto, debe entenderse que la molecula de acido nucleico antes descrita puede ser utilizada para restaurar o crear un gen mutante a traves de recombinacion homologa. Los plasmidos pueden ser plasmidos de numero de copias bajo, medio o alto. Dichos mutantes geneticamente manipulados pueden acoger acidos nucleicos que codifican una glucanasa o mutanasa la cual es capaz de degradar el enlace 1,3-glicosidico especifico de mutano de las subunidades de sacarosa. Las glucanasas fungicas estan descritas por ejemplo, en Fuglsang et al., J. Biol. Chem. 275 (2000), 2009-2018. Tambien se preve que mutantes geneticamente manipulados comprenden celulas que acogen acidos nucleicos recombinantes que codifican anticuerpos los cuales son preferiblemente secretados o anclados en la pared celular bacteriana. El termino "anticuerpo" abarca anticuerpos intactos asi como fragmentos de anticuerpos de los mismos, tales como cadenas livianas y pesadas separadas, Fab, Fab/c, Fv, Fab', F(ab')2. El termino "anticuerpo" tambien comprende anticuerpos humanizados, anticuerpos bifuncionales y constructos de anticuerpos, como cadena Fvs (scFv) o proteinas de fusion anticuerpos. Tambien se preve en el contexto de esta invencion que el termino "anticuerpos" comprende constructos de anticuerpos que pueden ser expresados en celulas del derivado del microorganismo antes mencionado, por ejemplo, constructos de anticuerpos que pueden ser transformados a traves de, entre otros, vectores por metodos conocidos en el arte. En particular se preve que tales constructos de anticuerpos reconocen especificamente, por ejemplo, el antigeno 1/11 de estreptococos. Tal metodologia esta descrita por ejemplo, en Krueger et al., Nat. Biotechnol. 20 (2002). 702-706 o Shiroza, Biochim Biophys Acta 1626 (2003). 57-64.

La secrecion del anticuerpo expresado se alcanza preferiblemente mediante enlazamiento operativo del acido nucleico que codifica un anticuerpo a una secuencia de sefal de secrecion. El anclaje en la pared celular de la bacteria puede lograrse haciendo uso del mecanismo de la enzima sortasa. A saber, las proteinas de superficie de las bacterias gran positivas estan enlazadas a la pared celular bacteriana por un mecanismo que involucra la escision de un motivo conservado Leu-Pro-X-Thr-Gly (LPXTG) y que se presenta durante el ensamblaje de la pared celular de peptidoglicano. De acuerdo con lo anterior, la molecula de acido nucleico que codifica un anticuerpo puede ser fusionada a una secuencia que codifica el motivo conservado antes mencionado, el cual es utilizado por la sortasa para anclar las proteinas en la pared celular bacteriana.

Tambien se preve que el microorganismo mencionado anteriormente perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico, preferiblemente la especie de Lactobacillus depositada sea geneticamente modificada para acoger una molecula de acido nucleico que codifica reuterina la cual es una sustancia antimicrobiana efectiva, entre otras, contra Streptococcus mutans. La reuterina, por ejemplo, esta descrita en Talarico et al., Chemother. 33 (1989), 674

679.

Un mutante del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias de acido lactico, preferiblemente un mutante de las cepas de Lactobacillus depositadas se hace mutar preferiblemente de manera artificial. De acuerdo con la presente invencion, el termino "mutado" significa una o unas modificaciones permanentes del material genetico, esto es, acidos nucleicos, causada, por ejemplo, naturalmente o por medios fisicos o compuestos/sustancias/agentes quimicos, tales como EMS o ENU. Dichas modificaciones incluyen mutaciones puntuales, tales como transiciones o transversiones, eliminacion/insercion/adicion de una o mas bases dentro de un acido nucleico/gen/cromosoma modificando por tanto el acido nucleico/gen/cromosoma que puede causar, entre otros, una expresion/transcripcion/traslacion aberrante del gen o productos geneticos inactivos, productos geneticos activos/inactivos constitutivos que llevan a, por ejemplo, efectos negativos dominantes. Preferiblemente, una mutacion lleva a una capacidad incrementada de unirse especificamente a mutans Streptococci. Asi, tambien se prefiere que las celulas mutantes del microorganismo depositado que acoge una o unas mutaciones en un gen o genes deseados en el cual una o unas mutaciones en un gen o genes deseados es inducida por metodos conocidos para una persona experimentada en la tecnica. Tambien se sabe de la tecnica anterior que las celulas bacterianas mutadas o manipuladas geneticamente pueden ser seleccionadas por cualquier metodo/fenotipo adecuado. En el contexto de la presente invencion, un mutante que tiene una capacidad incrementada para enlazarse especificamente a mutans Streptococci puede ser probado de acuerdo con los metodos descritos en los ejemplos anexos. El termino "mutante", sin embargo, incluye tambien celulas del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico, preferiblemente celulas del microorganismo depositado, que acogen mutaciones espontaneas de origen natural en su genoma, esto es, cromosoma bacteriano. "Mutaciones espontaneas" son mutaciones que surgen naturalmente, esto es, sin manipulacion genetica directa por el hombre, o por exposicion a un mutageno. La seleccion de un mutante espontaneo puede ser lograda cultivando la cepa y seleccionando las variantes deseadas, por ejemplo, mediante, la capacidad de la bacteria variable de mostrar una union mejorada a mutans Streptococci. Metodos para la seleccion de mutantes espontaneos son bien conocidos en el arte (vease por ejemplo, Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology". Green Publishing Associates and Wiley 1nterscience, N.Y. (1989)). Por ejemplo, tales mutaciones pueden ocurrir durante el cultivo, por ejemplo, durante el proceso de division celular normal acoplado con la replicacion de ADN o durante el paso y/o impedimento del mutante del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de bacterias del acido lactico.

La cavidad oral es hogar de muchas especies diferentes de estreptococos y no es sorprendente, considerando que comparten el mismo habitat, que puedan tener muchas caracteristicas en comun. Asi, es preferible que el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de bacterias del acido lactico se una especificamente a mutans Streptococci. De acuerdo con lo anterior, el termino "unirse especificamente" en el contexto de la presente invencion significa que el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico, preferiblemente un microorganismo perteneciente al genero de Lactobacillus se une a mutans Streptococcus, en particular Streptococcus mutans, pero no se une a la mayoria de los otros, preferiblemente no a otras especies que pertenecen al genero Streptococcus, en donde otras especies pertenecientes al genero de Streptococcus son aquellas descritas en el Ejemplo 6. A saber, los microorganismos antes mencionados pertenecientes al grupo de bacterias del acido lactico preferiblemente no se unen a bacterias pertenecientes a las especies de Streptococcus salivarius, preferiblemente perteneciente a la subespecie thermophilus, a la especie Streptococcus oralis, a la especie Streptococcus mitis y/o a la especie Streptococcus sanguinis. Mas preferiblemente, no se une a Streptococcus salivarius ssp. thermophilus (identificada por AP1 50 CH (Biomerieux, Francia), Streptococcus oralis (DSMZ 20066), Streptococcus oralis (DSMZ 20395), Streptococcus oralis (DSMZ 20627), Streptococcus mitis (DSMZ 12643) y/o Streptococcus sanguinis (DSMZ 20567). Ademas, dicho microorganismo preferiblemente no se une a bacterias pertenecientes a los generos diferentes a Streptococcus, por ejemplo, pertenecientes al genero de Staphylococcus. Mas preferiblemente, no se une a bacterias pertenecientes a las especies Staphylococcus epidermidis. Lo mas preferiblemente, no se une a Staphylococcus epidermidis (DSMZ 1798) y/o Staphylococcus epidermidis (DSMZ 20044).

Como ya se menciono anteriormente, se ha encontrado sorprendentemente que las bacterias de acido lactico se seleccionan por su union a Streptococcus mutans mientras que no se unen a las otras especies de Streptococcus. Streptococcus salivarius, Streptococcus oralis, Streptococcus mitis y/o Streptococcus sanguinis, muestran la capacidad tambien de unirse a otros mutans Streptococci, esto es, otras especies de Streptococcus, que muestran las caracteristicas comunes antes mencionadas y que de los cuales tambien se sospecha que son agentes causantes de la caries. Asi, las bacterias del acido lactico que muestran las caracteristicas de union especificas antes mencionadas para Streptococcus mutans muestran la capacidad de ser usadas tambien en relacion con la profilaxis o tratamiento de caries producida por mutans Streptococci diferentes a Streptococcus mutans, en particular

S. sobrinus. Asi, en una realizacion preferida las bacterias del acido lactico se caracterizan porque despliegan las caracteristicas de union antes descritas (esto es, (i) resistencia al tratamiento por calor; y (ii) resistencia al tratamiento con proteasa; y (iii) dependencia de calcio; y (iv) formacion de la union dentro de un rango de pH entre

4.5 y 8.5: y (v) formacion de la union en presencia de saliva) en relacion con Streptococcus mutans y la union se prueba en un ensayo tal como el que se describe aqui anteriormente en el cual se utiliza Streptococcus mutans como bacteria perteneciente al grupo de mutans Streptococci.

Para la prueba de union especifica, preferiblemente cada una de las bacterias orales antes mencionadas se mezclan preferiblemente en una relacion volumetrica de 3:1 con cultivos de Lactobacillus tal como se describe aqui anteriormente y se ensaya la agregacion tal como se describe aqui y por ejemplo en el Ejemplo 4 o Ejemplo 5, preferiblemente como se describe en el Ejemplo 5.

Se demostro que el antes mencionado Lactobacillus paracasei, preferiblemente L. paracasei ssp. paracasei no se agrega a ninguna de las bacterias orales antes mencionadas pertenecientes al genero de Streptococcus y no se une a las bacterias pertenecientes al genero de Staphylococcus mencionados aqui anteriormente. Las cepas antes mencionadas de Lactobacillus rhamnosus no mostraron agregacion a todas las especies antes mencionadas de Streptococcus y Staphylococcus, aparte de Streptococcus salivarius ssp. thermophilus. Preferiblemente el termino "union especificamente" tambien significa que el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias de acido lactico se une a tales cepas de mutans Streptococci que tienen la capacidad de ser un patogeno cariogenico dental.

La reaccion de union especifica comprende la union y, preferiblemente, la agregacion de celulas de mutans Streptococcus como se describe aqui mediante el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico en la boca. Esta union especifica lleva, en consecuencia, a arrastrar las celulas de mutans Streptococcus por ejemplo, por el flujo salival o por un enjuague bucal o lavado bucal y similares tal como se describe aqui. La boca define la cavidad oral de los mamiferos, preferiblemente humanos o animales tales como mascotas, compuesta por mucosa oral (encias, labios, mejillas, paladar y piso de la boca), la lengua y los dientes (incluyendo estructuras artificiales). Preferiblemente, la reaccion de union especifica del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias de acido lactico a mutans Streptococci evita que las celulas de mutans Streptococci se unan a la superficie de un diente o dientes (o que mientras no esten unidas en teoria puedan llevar a desprendimiento de celulas de mutans Streptococcus de la superficie de un diente o dientes). En consecuencia la reaccion de union especifica da como resultado el arrastre de celulas de mutans Streptococcus fuera de la boca, disminuyendo por lo tanto el agente causante de la caries y, asi, prevenir y/o tratar la caries.

Se cree que los microorganismos antes mencionados pertenecientes al grupo de las bacterias del acido lactico pueden unirse especificamente al antigeno de estreptococos 1/11 el cual tambien es conocido como antigeno B, 1F, P1, SR, MSL-1 o PAc. Sin embargo, el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico puede unirse a cualquier otra proteina o estructura de superficie de mutans Streptococci, por lo tanto agregarse a mutans Streptococci y arrastrarlos fuera de la cavidad oral tal como se describe aqui. Es sabido que Streptococcus mutans se une a traves de dicho antigeno de estreptococo 1/11 a la pelicula. De acuerdo con lo anterior, cuando el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico puede unirse, por ejemplo, a dicho antigeno de estreptococos 1/11, Streptococcus mutans, asi como otros microorganismos pertenecientes al grupo de mutans Streptococci son impedidos de unirse a la superficie de los dientes lo cual ayuda asi a prevenir y/o tratar caries.

La pelicula es un recubrimiento claro, delgado que contiene proteinas y lipidos (grasas) encontrados en la saliva. Se forma en segundos despues de que se limpia la superficie de un diente. La formacion de pelicula es la primera etapa en la formacion de placa dental. La placa dental es un deposito blando que se acumula sobre los dientes. La placa puede ser definida como una comunidad microbiana compleja, con mas de 1010 bacterias por miligramo. Se ha estimado que hasta 400 especies bacterianas distintas pueden encontrarse en la placa. Ademas de las celulas bacterianas, la placa contiene un pequefo numero de celulas epiteliales, leucocitos y macrofagos. Las celulas estan contenidas dentro de una matriz extracelular, la cual se forma a partir de productos bacterianos y saliva. La matriz extracelular contiene proteina, polisacaridos y lipidos. Una de las proteinas presentes en la saliva es la aglutinina la cual es por un lado la que se cree lleva a una eliminacion parcial de Streptococcus mutans de la boca, sin embargo, por otro lado se sospecha que facilita la adhesion de Streptococcus mutans a la superficie de los dientes, facilitando por lo tanto la union inicial de Streptococcus mutans a los dientes y, asi, la aparicion de las caries.

El hecho de que el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias de acido lactico se una especificamente a mutans Streptococci tal como se define aqui anteriormente puede ser probado facilmente, entre otros, comparando la reaccion de dicho microorganismo con celulas de mutans Streptococcus con un microorganismo que tambien pertenece al genero de Lactobacillus que, sin embargo, no se une especificamente a mutans Streptococci empleando preferiblemente el metodo tal como se describe aqui mas arriba y en los ejemplos anexos aqui mas adelante.

Preferiblemente, el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico es capaz de unirse especificamente a Streptococcus mutans serotipo c (DSMZ 20523) y/o serotipo e (NCTC 10923) y/o serotipo f (NCTC 11060) y/o Streptococcus sobrinus DSM 20742 y/o Streptococcus Ratti DSM 20564 y/o Streptococcus cricetus DSM 20562 y/o Streptococcus ferus DSM 20646 y/o Streptococcus macacae DSM 20714.

Esto significa que el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico se une preferiblemente a al menos un microorganismo seleccionado del grupo consistente de Streptococcus mutans serotipo c (DSMZ 20523), serotipo e (NCTC 10923), serotipo f (NCTC 11060), Streptococcus sobrinus. DSM 20742, Streptococcus ratti DSM 20564, Streptococcus cricetus DSM 20562, Streptococcus ferus DSM 20646 y Streptococcus macacae DSM 20714. Mas preferiblemente, el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico se une a cualquier combinacion, agrupamiento o subagrupamiento de las bacterias antes mencionadas. Aun mas preferiblemente, el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico se une a todas las bacterias antes mencionadas. De acuerdo con la presente invencion un "serotipo" es una propiedad antigenica de una celula bacteriana, preferiblemente de una celula de Streptococcus mutans o Streptococcus sobrinus identificada por metodos serologicos conocidos en el arte.

Como se describio anteriormente, el enlazamiento especifico del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico a mutans Streptococci es resistente al tratamiento con calor. De acuerdo con lo anterior, el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico son tratadas con calor, por ejemplo, a una temperatura por encima de 15°C o 37°C. Mas preferiblemente las celulas se incuban a una temperatura de mas de 55°C, aun mas preferiblemente de mas de 65°C, particularmente de manera preferible de mas de 95°C y lo mas preferido a 121°C. Despues del enfriamiento, la capacidad del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico para unirse especificamente a mutans Streptococci se determina como se describe aqui.

La temperatura correspondiente puede depender de la especie especifica de Lactobacillus pero puede ser determinada facilmente por la persona experimentada mediante experimentacion de rutina, por ejemplo, incubando las celulas correspondientes a diferentes temperaturas y determinando la cantidad de celulas de Lactobacillus las cuales son aun capaces de unirse especificamente a mutans Streptococci utilizando metodos como los descritos en los ejemplos aqui.

En general, el tratamiento por calor deberia durar un periodo de tiempo de al menos 1 minuto. Preferiblemente, el tratamiento por calor dura durante un periodo de tiempo de al menos n minutos, en donde n es un entero en el rango de 2 a 60, siendo n = 20 particularmente preferido. En relacion con el uso de la presente invencion tal como se describe en las reivindicaciones, el tratamiento por calor se lleva a cabo a temperatura de mas de 95°C a al menos 20 minutos. Sin embargo, en principio no hay limite superior para el tiempo de incubacion. Sin embargo, preferiblemente no es mayor de 4, 3, 2 o 1 horas. El tratamiento con calor mas preferido es al menos 20 minutos a una temperatura de 121°C en vapor saturado que tiene una presion atmosferica de 2 bar. El tratamiento por calor mas preferido se considera como causante de la anulacion de cualquier funcion de una proteina y de cualquier vitalidad de las celulas, lo que asi distingue el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido de otro microorganismo en que es capaz aun de unirse especificamente al mutans Streptococci. Por lo tanto, es muy util para el uso en cualquier alimento, producto alimenticio, bebida o composicion en el contexto de la presente invencion si se desea que el microorganismo no sea similar.

Preferiblemente, el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico, que ha sido sometido a un tratamiento por calor como se describe aqui anteriormente, tiene una capacidad incrementada de unirse especificamente a una bacteria perteneciente al grupo de mutans Streptococci. El termino "capacidad incrementada" significa un aumento de la union, segun es medible, mediante un ensayo tal como se describe aqui anteriormente, preferiblemente como se describe en el Ejemplo 5, en al menos 5%, preferiblemente al menos 10%, mas preferiblemente al menos 20% y lo mas preferiblemente al menos 30%. En una realizacion preferida, un microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico, que tiene una capacidad incrementada de unirse especificamente a una bacteria perteneciente al grupo de mutans Streptococci al haber sido sometido a un tratamiento por calor pertenece a la especie Lactobacillus paracasei, mas preferiblemente a L. paracasei ssp. paracasei y lo mas preferiblemente a L. paracasei ssp. paracasei Lb-Ob-K5 (DSM 16671).

La union especifica del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico, especificamente del genero Lactobacillus, se caracteriza adicionalmente por su resistencia al tratamiento con proteasa el cual es un tratamiento con una proteasa seleccionada del grupo consistente de pronasa E, proteinasa K, tripsina y quimiotripsina. Estas proteinasas y proteasas no muestran especificidad y, asi, se consideran como degradadoras de cualquier proteina que este en la superficie celular de un microorganismo. Otras proteasas, que son conocidas por tener preferencias para ciertos patrones de residuos de aminoacidos son elastasa, trombina, aminopeptidasa 1, carboxipeptidasa, dostripaina, endoproteinasa, papaina, pepsina o proteasas. Estas ultimas proteasas tambien podrian ser utilizadas para probar si la union especifica del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico a mutans Streptococci es resistente a estas ultimas proteasas mas especificas. Asi, despues del tratamiento con proteasa, el cual se describe en los ejemplos anexos, el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico aun es capaz de unirse especificamente a mutans Streptococci.

Ademas, la union especifica del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico se caracteriza adicionalmente por su dependencia del calcio. Preferiblemente, la union especifica tiene lugar en la presencia de una concentracion de iones calcio entre 0.05 mM y 500 mM, preferiblemente entre 1 mM y 100 mM. Se prefiere particularmente la concentracion de calcio entre 2 mM y 30 mM. La dependencia de la union especifica en el calcio puede probarse segun se describe en los ejemplos anexos.

Ademas, la union especifica al microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico se mantiene en un rango de pH entre 4.0 y 9.0, preferiblemente entre 4.0 y 7.0. En particular, el valor de pH al cual tiene a un lugar la union especifica es preferiblemente 4.5. El ensayo del mantenimiento de la union especifica a lo largo del rango de pH descrito anteriormente se muestra en los ejemplos anexos. Adicionalmente, el enlazamiento especifico es independiente del magnesio. Asi, no es necesario que iones magnesio o sales de magnesio esten presentes lo cual se demuestra en los ejemplos anexos.

Una caracteristica aun adicional de la union especifica es su ocurrencia en la presencia de saliva. La saliva es una secrecion exogena que es sintetizada por las glandulas salivares. Es un liquido complejo que contiene, ademas de aproximadamente 99% de agua una multiplicidad de compuestos organicos e inorganicos. Los ingredientes fisiologicos de la saliva son, entre otro, enzimas, por ejemplo, amilasas, carboanhidrasas, lisozima, peroxidasas o proteinas, por ejemplo, mucinas, lactoferrina, proteinas ricas en prolina, cistatinas, histatinas o estaterinas o 1gA soluble. Asi, aunque hay presente en la saliva una variedad de sustancias potencialmente interferentes, la union especifica de los microorganismos antes mencionados pertenecientes al grupo de las bacterias del acido lactico no fue perturbada o impedida. Para probar la union especifica en presencia de saliva, se prefiere que la saliva utilizada contenga preferiblemente las especies de Streptococcus descritas en el Ejemplo 6 y/o las especies de Staphylococcus del Ejemplo 6. Sin embargo, la especie Lactobacillus rhamnosus tal como se describio anteriormente se probo en cuanto a su union especifica a mutans Streptococci en presencia de saliva, prefiriendose que se omitan Streptococcus salivarius ssp. thermophilus. La union especifica se prueba como se describe aqui.

Las caracteristicas antes mencionadas del microorganismo arriba antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico lo hacen un agente robusto y efectivo para evitar y/o tratar caries puesto que se administra principalmente en diversas formas a la boca incluyendo la cavidad oral y los dientes en donde, entre otros, esta presente la saliva que incluye ciertas proteasas y valores bajos de pH despues de la ingestion de alimentos que contienen carbohidratos. Ademas, la resistencia al calor tiene efectos beneficos para agregar el microorganismo antes mencionado al grupo de bacterias del acido lactico como aditivo a alimentos durante la preparacion de dicho producto alimenticio. A saber, el producto alimenticio frecuentemente es esterilizado por calor, precocido, pasteurizado y similares lo cual es nocivo para la viabilidad de los microorganismos.

En otro aspecto de la presente invencion se emplea un derivado del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico en el uso descrito. El termino "derivado del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico" significa una forma inactivada o fragmento del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico, el cual se inactiva termicamente o liofiliza, en donde dicha forma inactivada o fragmento retiene la capacidad de unirse especificamente a mutans Streptococci.

De acuerdo con la presente invencion el termino "forma inactivada del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico" incluye una celula muerta o inactivada del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico, preferiblemente de la especie Lactobacillus divulgada aqui la cual no es mas capaz de formar una colonia individual sobre una placa especifica para microorganismos que pertenecen al genero de Lactobacillus. Dicha celula muerta o inactivada puede tener una membrana celular intacta o rota. Los metodos para matar o inactivar celulas del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico son conocidos en la tecnica. E1-Nezami et al., J. Food Prot. 61 (1998), 466-468 describe un metodo para inactivar especies de Lactobacillus por radiacion UV. Preferiblemente, las celulas de los microorganismos antes mencionados pertenecientes al grupo de las bacterias del acido lactico son inactivadas termicamente o liofilizadas como se describe en los ejemplos anexos. La liofilizacion de las celulas tal como se describe anteriormente tiene la ventaja de que pueden ser almacenadas y manipuladas facilmente a la vez que retiene su capacidad de unirse especificamente a mutans Streptococci. Ademas, las celulas liofilizadas pueden cultivarse de nuevo cuando se aplican bajo condiciones conocidas en la tecnica a medios liquidos o solidos apropiados. La liofilizacion se hace por metodos conocidos en la tecnica. Preferiblemente, se lleva a cabo durante al menos 2 horas a temperatura ambiente, esto es cualquier temperatura entre 16°C y 25°C. Ademas, las celulas liofilizadas del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico son estables durante al menos 4 semanas a una temperatura de 4°C de manera que aun se pueden unir especificamente a mutans Streptococci como se muestra en el Ejemplo 7 u 8 aqui mas adelante. La inactivacion termica puede lograrse incubando las celulas del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico durante al menos 2 horas a una temperatura de 170°C. Aun asi, la inactivacion termica se logra preferiblemente sometiendo dichas celulas al autoclave a una temperatura de 121°C durante al menos 20 minutos en la presencia de vapor saturado a una presion atmosferica de 2 bar. En la alternativa, la inactivacion, termica de las celulas del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico se alcanza congelando dichas celulas durante al menos 4 semanas, 3 semanas, 2 semanas, 1 semana, 12 horas, 6 horas, 2 horas o 1 hora a -20°C. Se prefiere que al menos 70%, 75% u 80%, mas preferiblemente 85%, 90% o 95% y particularmente de manera preferible al menos el 97%, 98%, 99% y mas particularmente de preferencia 99.1%, 99.2%, 99.3 %, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99,8% o 99.9% y lo mas particularmente preferido el 100% de las celulas del analogo del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico esten muertas o inactivadas, sin embargo, teniendo aun la capacidad de unirse especificamente a mutans Streptococci. Si la forma inactivada, analogo o fragmento del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico esta en efecto muerta o inactivada puede probarse por metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, mediante una prueba de viabilidad.

El termino "forma inactivada del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico" tambien describe lisados, fracciones o extractos del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico, preferiblemente de la especie Lactobacillus divulgada aqui, en donde dichos lisados, fracciones o extractos son preferiblemente capaces de unirse especificamente a una bacteria perteneciente al grupo de mutans Streptococci. Esta capacidad de union puede probarse tal como se describe aqui y se describe en particular en los ejemplos anexos. En un caso, un lisado, fraccion o extracto de un microorganismo tal como se describio anteriormente, puede no unirse especificamente a una bacteria perteneciente al grupo de mutans Streptococci, luego la persona experimentada puede, por ejemplo, purificar adicionalmente dicho lisado, fraccion o extracto por metodos conocidos en el arte, los cuales se ejemplifican aqui mas adelante, de tal manera que se retiren sustancias que inhiban la union. Despues de esto la persona experimentada en la tecnica puede de nuevo probar dicho lisado, fraccion o extracto en cuanto a si se une especificamente a una bacteria perteneciente al grupo de mutans Streptococci.

El termino "lisado" significa una solucion o suspension en un medio acuoso de celulas del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico que estan rotas. Sin embargo, el termino no deberia ser considerado limitante de manera alguna. La celula lisada comprende, por ejemplo, macromoleculas, tales como ADN, ARN, proteinas, peptidos, carbohidratos, lipidos y similares y/o micromoleculas, tales como aminoacidos, azucares, acidos lipidicos y similares, o fracciones de los mismos. Adicionalmente, dicho lisado comprende residuos de celulas que pueden ser de estructura suave o granular. Preferiblemente, dicho lisado comprende la pared celular o la membrana celular o ambas o porciones o fragmentos de la pared celular o de la membrana celular o ambos. Los metodos para preparar lisados de celulas de microorganismos son conocidos en la tecnica, por ejemplo, utilizando una prensa French, un molino de celulas utilizando perlas de vidrio o hierro o lisis celular enzimatica y similares. Ademas, las celulas en lisis se relacionan con diversos metodos conocidos en la tecnica para abrir/destruir celulas. El metodo de lisado de una celula no es importante y puede emplearse cualquier metodo que pueda alcanzar la lisis de las celulas del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico. Uno apropiado puede escogerse por la persona experimentada en la tecnica, por ejemplo, la apertura/destruccion de las celulas puede hacerse enzimaticamente, quimicamente o fisicamente. Ejemplos no limitantes de enzimas y cocteles de enzimas son proteasas, como la proteinasa K, lipasas o glicosidasas; ejemplos no limitantes de agentes quimicos son ionoforos, detergentes, tales como dodecil sulfato de sodio, acidos o bases; y ejemplos no limitantes de medios fisicos son alta presion, como la presion French, osmolaridad, temperatura, como calor o frio. Adicionalmente, tambien puede utilizarse un metodo que emplea una combinacion apropiada de una enzima diferente a la enzima proteolitica, un acido, una base y similares. Por ejemplo, las celulas del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico son sometidas a lisis por congelacion y descongelacion, mas preferiblemente congelacion a temperaturas por debajo de -70°C y descongelacion a temperaturas de mas de 30°C, el congelamiento se prefiere particularmente a temperaturas por debajo de -75°C y el descongelamiento se prefiere a temperaturas de mas de 35°C y lo mas preferido son temperaturas de congelamiento por debajo de -80°C por debajo de -80°C y temperaturas de descongelamiento de mas de 37°C. Tambien se prefiere que dicho congelamiento/descongelamiento se repita durante al menos 1 vez, mas preferiblemente durante al menos 2 veces, aun se prefiere mas durante al menos 3 veces, particularmente se prefiere durante al menos 4 veces y lo mas preferido durante al menos 5 veces.

De acuerdo con lo anterior, las personas experimentadas en la tecnica pueden preparar los lisados deseados haciendo referencia a las explicaciones generales anteriores, y modificando o alterando apropiadamente estos metodos, si es necesario. Preferiblemente, el medio acuoso usado para los lisados tal como se describe es agua, solucion salina fisiologica, o una solucion reguladora. Una ventaja del lisado celular bacteriano es que puede ser producido facilmente y almacenado con eficiencia de costes puesto que se requieren instalaciones menos tecnicas.

Preferiblemente, el termino "extracto" significa un componente subcelular del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de bacterias del acido lactico, por ejemplo, una macromolecula, como una proteina, ADN, ARN, un peptido, un carbohidrato, un lipido y similares y/o una micromolecula como un aminoacido, un azucar, un acido lipidico y similares o cualquier otro compuesto o molecula organicos, o una combinacion de dichas macromoleculas y/o micromoleculas o cualquier fraccion de ellas, en donde dicho extracto retiene la capacidad de unirse especificamente a una bacteria perteneciente al grupo de mutans Streptococci. Esta union especifica puede probarse segun se describe aqui y en particular como se describe en los ejemplos anexos. Preferiblemente, dicho extracto comprende la pared celular o la membrana celular o ambas o porciones o fragmentos de la pared celular o la membrana celular o de ambas. Mas preferiblemente, el termino "extracto" se refiere a cualquiera de los componentes subcelulares antes descritos en un medio libre de celulas.

Un extracto puede ser obtenido sometiendo celulas a lisis de acuerdo con diversos metodos conocidos en la tecnica para abrir/destruir las celulas, tal como se describe aqui anteriormente y/o como sobrenadante de un procedimiento de centrifugacion de un cultivo del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico en cualquier liquido, medio o regulador apropiado conocido para la persona experimentada en la tecnica o de un lisado de tal cultivo o cualquier otra suspension celular adecuada. Mas preferiblemente, el extracto puede ser un lisado purificado o sobrenadante de cultivo celular o cualquier fraccion o subporcion de los mismos, en donde dicho lisado o sobrenadante de cultivo celular o cualquier fraccion o subporcion de los mismos purificados retienen la capacidad de unirse especificamente a una bacteria perteneciente al grupo de mutans Streptococci. Esta union puede ser probada tal como se describe aqui y en particular como se describe en los ejemplos anexos. Metodos adecuados para fraccionamiento y purificacion de un lisado, sobrenadante de un cultivo o un extracto son conocidos para la persona experimentada en la tecnica y comprenden, por ejemplo, cromatografia de afinidad, cromatografia de intercambio ionico, cromatografia de exclusion por tamafo, cromatografia en fase reversa, y cromatografia con otro material cromatografico en columna o metodos por lotes, otros metodos de fraccionamiento, por ejemplo metodos de filtracion, por ejemplo ultrafiltracion, dialisis, dialisis y concentracion con exclusion por tamafo en centrifugacion, centrifugacion en gradientes de densidad o matrices por etapas, precipitacion, por ejemplo precipitaciones por afinidad, salificacion o desalificacion (precipitacion con sulfato de amonio), precipitaciones alcoholicas o cualquier otro metodo adecuado proteinoquimico, de biologia molecular, bioquimico, inmunologico, quimico o fisico.

Los lisados tambien son preparaciones de fracciones de moleculas de los lisados antes mencionados. Estas fracciones pueden ser obtenida por metodos conocidos por los experimentados en la tecnica, por ejemplo, cromatografia, incluyendo por ejemplo cromatografia de afinidad, cromatografia de intercambio ionico, cromatografia de exclusion por tamafo, cromatografia en fase reversa y cromatografia con otro material cromatografico en columna o en metodos por lotes, otros metodos de fraccionamiento, por ejemplo metodos de filtracion, por ejemplo, ultrafiltracion, dialisis, dialisis y concentracion con exclusion por tamafo en centrifugacion, centrifugacion en gradientes de densidad o matrices por etapas, precipitacion, por ejemplo, precipitaciones por afinidad, salificacion o desalificacion (precipitacion con sulfato de amonio), precipitaciones alcoholicas u otros metodos proteinoquimicos, de biologia molecular, bioquimicos, inmunologicos, quimicos o fisicos para separar los componentes anteriores de los lisados. En una realizacion preferida se prefieren aquellas fracciones que son mas inmunogenicas que otras. Los experimentados en la tecnica son capaces de seleccionar un metodo adecuado y determinar su potencial inmunogenico haciendo referencia a las explicaciones generales anteriores y explicaciones especificas en los ejemplos aqui y modificando o alterando apropiadamente estos metodos, si es necesario.

De acuerdo con lo anterior, el termino "forma inactivada del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico" describe tambien filtrados de un microorganismo tal como describen aqui anteriormente, preferiblemente de la especie Lactobacillus divulgada aqui, en donde dichos filtrados retienen preferiblemente la capacidad de unirse especificamente a una bacteria perteneciente al grupo de mutans Streptococci. Esta union puede ser probada como se describe aqui y en particular como se describe en los ejemplos anexos. En un caso, un filtrado del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico, tal como se describe aqui anteriormente, puede no especificamente unirse a una bacteria perteneciente al grupo de mutans Streptococci, luego la persona experimentada en la tecnica puede, por ejemplo, purificar adicionalmente dicho filtrado por metodos conocidos en la tecnica, los cuales se ejemplifican aqui mas adelante, de tal manera que retiren sustancias que inhiben la union. Despues de esto la persona experimentada en la tecnica puede de nuevo probar dicho filtrado acerca de si especificamente se une a una bacteria perteneciente al grupo de mutans Streptococci.

El termino "filtrado" significa una solucion o suspension libre de celulas de un microorganismo tal como se describe aqui anteriormente las cuales han sido obtenidas como sobrenadantes de un procedimiento de centrifugacion de un cultivo del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico en cualquier liquido, medio o regulador apropiado conocido para la persona experimentada en la tecnica. Sin embargo, el termino no deberia ser considerado de ninguna manera limitante. El filtrado comprende, por ejemplo, macromoleculas, como ADN, ARN, proteinas, peptidos, carbohidratos, lipidos y similares y/o micromoleculas, como aminoacidos, azucares, acidos lipidicos y similares, o fracciones de ellos. Los metodos para preparar filtrados de microorganismos son conocidos en la tecnica. Ademas, "filtrado" se relaciona con diversos metodos conocidos en la tecnica. El metodo exacto no es importante y puede emplearse cualquier metodo que pueda lograr la filtracion de las celulas del microorganismo de la invencion, tal como se describio aqui mas arriba.

"Un fragmento del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico" describe cualquier parte de las celulas del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico. De acuerdo con la invencion dicho fragmento es una fraccion de membrana obtenida por preparacion de membrana y retiene la capacidad de unirse especificamente al grupo de mutans Streptococci. Las preparaciones de membrana de los microorganismos pertenecientes al genero de Lactobatillus pueden obtenerse por metodos conocidos en el arte, por ejemplo, empleando el metodo descrito en Rollan et al., 1nt. J. Food Microbiol. 70 (2001), 303-307, Matsuguchi et al., Clin. Diagn. Lab. 1mmunol. 10 (2003), 259-266 o Stentz et al., Appl. Environ. Microbiol. 66 (2000), 4272-4278 o Varmanen et al., J. Bacteriology 182 (2000), 146-154. Alternativamente, tambien se preve una preparacion de celulas enteras. Preferiblemente, el derivado o fragmento aqui descritos del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico retiene la capacidad de unirse especificamente a mutans Streptococci lo cual se describe en detalle aqui.

Tal como se define en las reivindicaciones, en caso de que se use un derivado de acuerdo con la presente invencion, dicho derivado del microorganismo es una forma inactivada de dicho microorganismo o un fragmento de dicho microorganismo, siendo dicho microorganismo inactivado termicamente o liofilizado, en donde dicho fragmento es una fraccion de membrana obtenida mediante una preparacion de membrana y donde dicha forma inactivada o dicho fragmento retiene la capacidad de unirse especificamente a una bacteria perteneciente al grupo de mutans Streptococci.

Un aspecto en relacion con la presente invencion se relaciona con el uso del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico, un derivado o mutante o un analogo o un fragmento del mismo para la preparacion de una composicion anticariogenica, preferiblemente una composicion farmaceutica o cosmetica, para el tratamiento o prevencion de caries causada por mutans Streptococci diferentes a Streptococcus mutans. Preferiblemente, la composicion comprende un microorganismo perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico, el cual es capaz de unirse especificamente a mutans Streptococci o a un mutante, derivado o fragmento de este microorganismo. Mas preferiblemente, este microorganismo es un microorganismo depositado tal como se describio aqui anteriormente o un mutante o derivado del mismo o un analogo o fragmento de dicho microorganismo. En una realizacion preferida, dicha composicion comprende un microorganismo tal como se describio anteriormente en una cantidad de 102 hasta 1012 celulas, preferiblemente 103 hasta 108 celulas por mg en una forma solida de la composicion. En caso de una forma liquida de las composiciones, la cantidad de microorganismos esta entre 102 hasta 1013 celulas por ml. Sin embargo, para composiciones especificas la cantidad del microorganismo puede ser diferente a la descrita aqui. Una composicion anticariogenica preferida de la presente invencion no contiene lactosa en un rango entre 1% (p/p) y 6% (p/p). Tambien se prefiere que la composicion contenga no mas de 1% (p/p) de lactosa, por ejemplo contiene menos de 1%, preferiblemente menos de 0.9% (p/p), 0.8% (p/p) de lactosa, etc., o que la composicion contenga mas de 6%, 7%, 8%, etc. (p/p) de lactosa. Alternativamente, pero tambien preferido es que la composicion no contenga lactosa.

En un aspecto adicional en relacion con la presente invencion, tal composicion anticariogenica puede ser producida comprendiendo las etapas de formular un microorganismo que pertenece al grupo de las bacterias del acido lactico que es capaz de unirse especificamente a mutans Streptococci o a un mutante, derivado, analogo o fragmento de este microorganismo con un vehiculo o excipiente cosmetica, oral o farmaceuticamente aceptable. Preferiblemente, este microorganismo es un microorganismo depositado como se describio aqui anteriormente o un mutante, derivado o fragmento del mismo. Una composicion anticariogenica preferida como la usada de acuerdo con la presente invencion no contiene lactosa en un rango entre 1% (p/p) y 6% (p/p). Tambien se prefiere que la composicion contenga no mas de 1% (p/p) de lactosa, por ejemplo contenga menos de 1%, preferiblemente menos de 0.9% (p/p), 0.8% (p/p) de lactosa, etc., o que la composicion anticariogenica contenga mas de 6%, 7%, 8%, etc. (p/p) de lactosa. Alternativamente, pero tambien preferido es que la composicion anticariogenica no contenga lactosa.

El termino "composicion", tal como se utiliza de acuerdo con la presente invencion se relaciona con composiciones que comprenden al menos un microorganismo o mutantes o derivados como se describio anteriormente, preferiblemente un microorganismo depositado tal como se describio anteriormente o un analogo o un fragmento de dicho microorganismo. Se preve que las composiciones tal como se utilizan de acuerdo con la presente invencion, los cuales estan descritos aqui mas adelante comprenden los ingredientes antes mencionados en cualquier combinacion. Opcionalmente, puede comprender al menos un ingrediente adicional adecuado para prevenir y/o tratar caries. De acuerdo con lo anterior, puede comprender opcionalmente cualquier combinacion de los ingredientes adicionales descritos aqui mas adelante. El termino "ingredientes adecuados para prevenir y/o tratar caries" abarca compuestos o composiciones y/o combinaciones de los mismos los cuales bien inhiben la union de mutans Streptococci a la superficie de los dientes, a peliculas y/o los cuales inactivan mutans Streptococci. Mas preferiblemente, dicho termino abarca compuestos o composiciones y/o combinaciones de los mismos que pueden inhibir la adhesion de mutans Streptococci a la superficie de los dientes, inhiben la actividad de glicosiltransferasas de mutans Streptococci, inhiben o inactivan mutans Streptococci, inhiben la union dependiente de aglutinina de mutans Streptococci y/o inhiben la union dependiente de sacarosa de mutans Streptococci tal como sera descrito mas adelante.

En particular, se preve que la composicion comprende de manera adicional opcionalmente compuestos que inhiben la adhesion de mutans Streptococci a la superficie del diente. De acuerdo con lo anterior, se preve que tal compuesto es un inhibidor del peptido de sefal de competencia (CSP) de Streptococcus mutans. Dicho inhibidor esta descrito en CA 2,302,861 como un derivado o un fragmento de dicho CSP, el cual inhibe competitivamente la union de dicho CSP a su receptor natural, un receptor de histidina quinasa, o el cual es un anticuerpo contra dicho CSP. Dicho inhibidor previene el desarrollo de un ambiente de biopelicula de placa dental sobre la superficie del diente y, asi, evita el enlazamiento de mutans Streptococci. Alternativamente, la composicion tal como se usa de acuerdo con la presente invencion puede comprender adicionalmente de manera opcional fragmentos de polipeptidos del antigeno de Streptococcus mutans 1/11 que son utiles en el tratamiento y/o prevencion de la caries dental. Tales fragmentos de polipeptido estan descritos en US 6,500,433. A saber, dichos fragmentos de polipeptidos pueden tener la capacidad de adherirse a la superficie de los dientes de los mamiferos uniendose a la aglutinina de manera competitiva con el antigeno 1/11 de Streptococcus mutans de origen natural, previniendo o disminuyendo asi la adhesion de S. mutans al diente. Algunos de los peptidos de US 6,500,433 han demostrado inhibir la adhesion de S. mutans a un modelo de superficie de diente (saliva humana entera adsorbida a los pozos de placas de adhesion de poliestireno o perlas de hidroxiapatita). De acuerdo con lo anterior, la US 6,500,433 describe estos peptidos para comprender uno o mas sitios de adhesion y se adheriran a los dientes de los mamiferos de manera competitiva con el SA 1/11 de origen natural. Otro ingrediente opcional de la composicion tal como se usa de acuerdo con la presente invencion es una proteina de adhesion asociada fimbrial de Streptococus mutans, smaA, o un fragmento de la misma tal como se describe en WO 00/66616. La proteina SmaA es una proteina de adhesion de las fimbrias de S. mutans que media la union de la bacteria a la pelicula salival, lo que se cree sucede a traves del enlazamiento de la proteina salival de 52 kd, la amilasa. La proteina SmaA madura tiene un peso molecular de aproximadamente 65 kilodaltons (kd) medido sobre un gel de poliacrilamida reductor, exhibe la capacidad de unirse a la amilasa, y es la principal proteina fimbrial inmunodominante de S. mutans. De acuerdo con lo anterior, se cree que la SmaA compite con mutans Streptococci por los sitios de adhesion sobre la superficie de los dientes.

Tal como se describio anteriormente, se preve que los compuestos que inhiben la actividad de la glicosiltransferasa de mutans Streptococci estan comprendidos adicionalmente de manera opcional en una composicion tal como se utiliza de acuerdo con la presente invencion. Por ejemplo, la US 2004/0057908 describe una mezcla de terpenoides y flavonoides que inhiben la actividad de dichas glicosiltransferasas. Duarte et al., Biol. Pharm. Bull. 26 (2003), 527531 describe un tipo novedoso de propolis y sus fracciones quimicas sobre las glicosiltransferasas y sobre el crecimiento y adherencia de Streptococcus mutans. De acuerdo con lo anterior, dicho tipo novedoso de popolis y sus fracciones quimicas se contemplan como un ingrediente adicional opcional de la composicion tal como se utiliza de acuerdo con la presente invencion. Koo et al., J. Antimicrob. Chemother. 52 (2003), 782-789 describe que la apigenina y el tt-farnesol inhiben la acumulacion de biopelicula de Streptococcus mutans y la produccion de polisacaridos. Por lo tanto, la apigeneina y el tt-farnesol se contemplan como opcionalmente comprendidos en la composicion tal como se utiliza de acuerdo con la presente invencion. Puesto que los esteres de carbohidratos de acidos grasos estan descritos en Devulapalle et al., Carbohydr. Res. 339 (2004), 1029-1034 para afectar la actividad de la glicosiltransferasa, dichos esteres de carbohidrato de acidos grasos estan contemplados como comprendidos opcionalmente en la composicion tal como se usan de acuerdo con la presente invencion.

La inhibicion directa de Streptococcus mutans esta descrita, por ejemplo, en WO 2004/000222. A saber, los bacteriofagos geneticamente modificados especificos para Streptococcus mutans se utilizan para tratar caries bacterianas causadas por Streptococcus mutans. La WO 2004/017988 describe una composicion de proteasa biologicamente activa y al menos una glicosidasa biologicamente activa que se utiliza para tatar caries bacteriana. 1mazato et al., Biomaterials 24 (2003), 3605-3609 describe que el bromuro de metacriloiloxidodecilpiridinio (MDPB) se utiliza para inhibir el crecimiento de Streptococcus mutans. De acuerdo con lo anterior, se preve que los compuestos antes mencionados pueden estar comprendidos opcionalmente de manera adicional en la composicion tal como se utiliza de acuerdo con la presente invencion.

La lactoferrina de leche bovina descrita por Mitoma et al., J. Biol. Chem. 276 (2001), 18060-18065 o extractos de Helichrysum italicum descrito por Nostro et al., Lett. Appl. Microbiol. 38 (2004), 423-427 que inhiben la union de Streptococcus mutans dependiente de aglutinina o dependiente de sacarosa se contemplan como comprendidos opcionalmente de manera adicional en la composicion tal como se utiliza de acuerdo con la presente invencion. Ademas, la composicion tal como se utiliza de acuerdo con la presente invencion puede comprender adicionalmente de forma opcional una mutanasa (1,3-glucanasa) la cual, por ejemplo, es descrita en DE 2152620 o Fuglsang (2000), loc. cit. o un antibiotico contra Streptococcus mutans, por ejemplo, los descritos en US 6,342,385; US 5,932,469; US 5,872,001 o US 5,833,958. Ademas, se anota que la composicion tal como se utiliza de acuerdo con la presente invencion puede comprender opcionalmente uno o mas de los ingredientes opcionales antes mencionados los cuales son adecuados para prevenir y/o tratar caries. Asi, dicha composicion puede contener al menos dos, tres, cuatro, cinco, etc., esto es "n" ingredientes opcionales, en donde "n" es un entero mayor que 2 el cual no esta limitado. Dichos ingredientes opcionales pueden ser combinados en cualquier combinacion posible.

La composicion puede estar en forma solida, liquida o gaseosa y puede estar, entre otros, en la forma de polvos, tabletas, preparaciones en pelicula, soluciones, aerosoles, granulos, pildoras, suspensiones, emulsiones, capsulas, jarabes, liquidos, elixires, extractos, tinturas o extractos fluidos o en una forma que sea particularmente adecuada para administracion oral.

Las preparaciones liquidas adecuadas para administracion oral, por ejemplo jarabes pueden prepararse utilizando agua, sacaridos convencionales tales como sacarosa, sorbitol y fructosa, glicoles tales como polietilen glicol y propilen glicol, aceites tales como aceite de semilla de sesamo, aceite de oliva y aceite de soja, antisepticos tales como p-hidroxibenzoato ester, conservantes tales como derivados de p-hidroxibenzoato, por ejemplo phidroxibenzoato de metilo y benzoato de sodio, y otros materiales tales como sabores, por ejemplo sabores de fresa

o yerbabuena.

Adicionalmente, las preparaciones adecuadas para administracion oral, por ejemplo tabletas, polvos y granulos pueden ser producidos, utilizando sacaridos convencionales, tales como sacarosa, glucosa, manitol y sorbitol, almidones tales como almidon de patata, trigo y maiz, materiales inorganicos tales como carbonato de calcio, sulfato de calcio, hidrogeno carbonato de sodio y cloruro de sodio, polvos vegetales tales como celulosa en cristal, polvo de regaliz y polvo de genciana, excipientes tales como pinedex, desintegrantes tales como almidon, agar, polvo de gelatina, celulosa en cristal, carmelosa de sodio, carmelosa de calcio, carbonato de calcio, hidrogeno carbonato de sodio y alginato de sodio, lubricantes tales como estearato de magnesio, talco, aceites vegetales hidrogenados, macrogol y aceite de silicona, aglomerantes tales como alcohol polivinilico, hidroxipropil celulosa, metil celulosa, etil celulosa, carmelosa, gelatina y fluido de goma de almidon, surfactantes tales como esteres de acidos grasos, y plastificantes tales como glicerina. Una preparacion de una pelicula puede ser preparada por metodos conocidos en la tecnica. Un ejemplo para la preparacion de una pelicula se da en el Ejemplo 27 aqui.

En el caso de administracion oral ordinaria, la dosis del microorganismo antes descrito o su analogo o fragmento puede ser (en peso seco) como se describe aqui anteriormente con respecto al numero de celulas o con respecto a la masa, por ejemplo, 1 Ig a 50 g, 1 Ig a 10 g, 1 Ig a 5 mg, 1 Ig a 1 mg o cualquier otro peso por sujeto por dia o en varias porciones diariamente. En el caso de dosificacion a animales no humanos, adicionalmente, la dosis varia dependiendo de la edad y especies de un animal y la naturaleza o severidad del sintoma en el mismo. Sin ninguna limitacion especifica, la dosis para animales es 0.1 mg a 10 g por 1 kg de peso corporal, preferiblemente 1 mg a 1 g por 1 kg de peso corporal una vez al dia o en varias porciones al dia. Sin embargo, estas dosis y el numero de dosificaciones varia dependiendo de las condiciones individuales.

Preferiblemente, la composicion anticariogenica tal como se utiliza de acuerdo con la presente invencion es una composicion cosmetica que comprende adicionalmente un vehiculo o excipiente cosmeticamente aceptable. Mas preferiblemente, dicha composicion cosmetica es un dentifrico, goma de mascar, tableta, enjuague bucal, enjuague en espuma, hilo dental o cinta dental que tiene una actividad contra el mutans Streptococci. Una composicion cosmetica preferida que se utiliza de acuerdo con la presente invencion no contiene lactosa en un rango entre 1% (p/p) y 6% (p/p). Tambien se prefiere que la composicion cosmetica contenga no mas de 1% (p/p) de lactosa, por ejemplo, que contenga menos de 1%, preferiblemente menos de 0.9% (p/p), 0.8% (p/p) de lactosa, etc., o que la composicion cosmetica contenga mas de 6%, 7%, 8%, etc. (p/p) de lactosa. Alternativamente pero tambien preferido es que la composicion cosmetica no contenga lactosa.

La composicion cosmetica tal como se utiliza de acuerdo con la presente invencion comprende el microorganismo, mutante, derivado, analogo o fragmento del mismo tal como se describe anteriormente en relacion con la composicion de la invencion y adicionalmente un vehiculo cosmetica u oralmente aceptable. Preferiblemente, como se menciono en relacion con la composicion tal como se usa de acuerdo con la presente invencion el microorganismo, mutante, derivado, analogo o fragmento del mismo es un microorganismo, mutante, derivado o fragmento tal como se describio aqui anteriormente. Preferiblemente la composicion cosmetica tal como se utiliza de acuerdo con la presente invencion es para uso en aplicaciones orales. De acuerdo con lo anterior, puede estar en la forma de una pasta dental, dentifrico, polvo dental, gel oral topico, enjuague bucal, producto para dentaduras, aspersion bucal, tableta, tableta oral, goma de mascar, hilo dental o cinta dental.

El termino "vehiculo oral o cosmeticamente aceptable" tal como se utiliza aqui significa un vehiculo adecuado, el cual puede ser utilizado para aplicar las presentes composiciones a la cavidad oral de una manera segura y efectiva. Tal vehiculo puede incluir materiales tales como fuentes de ion fluoruro, agentes adicionales anticalculos, reguladores, otros materiales abrasivos, fuentes de peroxido, sales de bicarbonato de metales alcalinos, materiales aglomerantes, humectantes, agua, surfactantes, dioxido de titanio, sistemas saborizantes, agentes endulzantes, xilitol, agentes colorantes y mezclas de los mismos. El termino "cantidad segura y efectiva" tal como se utiliza aqui, significa una cantidad suficiente para limpiar los dientes y reducir manchas/placa/gingivitis/calculos sin poner en riesgo los tejidos y estructuras de la cavidad oral.

El pH de las composiciones presentes aqui descritas varia preferiblemente desde aproximadamente 3.0 hasta aproximadamente 9.0, siendo el pH preferido desde aproximadamente 5.5 hasta aproximadamente 9.0 y siendo el pH mas preferido 7.0 hasta aproximadamente 8.5 o 9.0.

La composicion cosmetica es un producto, en el cual en el curso ordinario de uso, no se traga intencionalmente para propositos de administracion sistemica de agentes terapeuticos particulares, sino que se retiene principalmente en la cavidad oral durante un tiempo suficiente para poner en contacto sustancialmente todas las superficies dentales y/o tejidos orales para propositos de actividad oral. La composicion oral puede ser una composicion oral en fase sencilla

o puede ser una combinacion de dos o mas composiciones orales.

El termino "dentifrico", tal como se utiliza aqui, significa pasta, gel o formulaciones liquidas a menos que se especifique otra cosa. La composicion dentifrica puede estar en cualquier forma deseada, tal como en bandas en profundidad, bandas en superficie, capas multiples, con el gel alrededor de la pasta, o cualquier combinacion de los anteriores. La composicion dentifrica puede estar contenida en un compartimento fisicamente separado de un dispensador y ser dispensada lado a lado. La composiciones dentifricas estan descritas, por ejemplo, en EP-B1 0 617 608.

Las composiciones dentifricas preferidas estan descritas en los Ejemplos 21 a 24. Ademas de los componentes antes descritos, las composiciones dentifricas de esta invencion pueden contener una variedad de ingredientes dentifricos opcionales algunos de los cuales han sido descritas anteriormente. 1ngredientes opcionales incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, adhesivos, agentes espumantes, agentes saborizantes, agentes endulzantes, agentes antiplaca adicionales, abrasivos adicionales y agentes colorantes. Estos y otros componentes opcionales estan descritos adicionalmente, por ejemplo, en US 5,004,597; US 4,885,155; US 3,959,458; y US 3,937,807.

Por ejemplo, la pasta dental puede incluir surfactantes, agentes quelantes, fuentes de fluoruro, agentes activos para blanqueo de dientes y sustancias modificadoras del color de los dientes, agentes aglomerantes, humectantes, agentes saborizantes y endulzantes, sales de bicarbonato de metales alcalinos, vehiculos miscelaneos y/o otros agentes activos.

Uno de los agentes opcionales preferidos tal como se utilizan de acuerdo con la presente invencion es un surfactante, preferiblemente uno seleccionado del grupo consistente de surfactantes de sarcosinato, surfactantes de isetionato y surfactantes de taurato. Se prefieren para uso aqui sales de metales alcalinos o de amonio de estos surfactantes. Los mas preferidos aqui son las sales de sodio y potasio de los siguientes: sarcosinato de lauroilo, sarcosinato de miristoilo, sarcosinato de palmitoilo, sarcosinato de estearoilo y sarcosinato de oleoilo.

Otro agente opcional preferido es un agente quelante tal como acido tartarico y sales farmaceuticamente aceptables del mismo, acido citrico y citratos de metales alcalinos, y mezclas de los mismos. Agentes quelantes son capaces de complejar el calcio encontrado en las paredes celulares de las bacterias. Los agentes quelantes tambien pueden perturbar la placa retirando el calcio de los puentes de calcio, los cuales ayudan a mantener su biomasa intacta.

Es comun tener un compuesto adicional de fluoruro soluble en agua presente en dentifricos y otras composiciones orales en una cantidad suficiente para dar una concentracion de ion fluoruro en la composicion a 25°C, y/o cuando se utiliza desde aproximadamente 0.0025% hasta aproximadamente 5.0% en peso, preferiblemente desde aproximadamente 0.005% hasta aproximadamente 2.0% en peso, para proveer efectividad anticaries adicional. Una variedad amplia de materiales productores de ion fluoruro puede emplearse como fuente de fluoruro soluble en las composiciones presentes. Ejemplos de materiales productores de ion fluoruro se encuentran en la US 3,535,421 y US 3,678,154. Las fuentes de ion fluoruro representativas incluyen fluoruro estannoso, fluoruro de sodio, fluoruro de potasio, monofluorofosfato de sodio y muchos otros. El fluoruro estannoso y el fluoruro de sodio son preferidos en particular, asi como mezclas de los mismos.

Las composiciones de cuidado oral de acuerdo con la presente invencion pueden comprender tambien agentes activos blanqueadores de dientes, incluyendo agentes decolorantes u oxidantes tales como peroxidos, perboratos, percarbonatos, peroxiacidos, persulfatos, cloritos metalicos y combinaciones de los mismos. Compuestos de peroxido adecuados incluyen peroxido de hidrogeno, peroxido de urea, peroxido de calcio y mezclas de los mismos. Un percarbonato preferido es percarbonato de sodio. Otros agentes blanqueadores incluyen persulfatos y perborato mono y tetrahidratados de potasio, amonio, sodio y litio, y peroxihidratado pirofosfato de sodio. Cloritos metalicos adecuados incluyen clorito de calcio, clorito de bario, clorito de magnesio, clorito de litio, clorito de sodio y clorito de potasio. El clorito preferido es clorito de sodio. Agentes blanqueadores activos adicionales pueden ser hipoclorito y dioxido de cloro.

Ademas de los agentes decolorantes como agentes blanqueadores de dientes, pueden considerarse sustancias modificadoras del color de los dientes entre los agentes activos para cuidado oral utiles en la presente invencion. Estas sustancias son adecuadas para modificar el color de los dientes para satisfacer al consumidor. Estas sustancias comprenden particulas que cuando se aplican a la superficie del diente modifican la superficie en terminos de absorcion y/o reflexion de la luz. Tales particulas proveen una apariencia beneficiosa cuando una pelicula que contiene tales particulas se aplica sobre las superficies de un diente o dientes.

En la preparacion de pasta dental o geles, es necesario agregar algun material aglomerante para proveer una consistencia deseable de la composicion, para proveer caracteristicas de liberacion de agente deseables con el uso, para proveer estabilidad de la vida util, y para proveer estabilidad de la composicion, etc. Agentes aglomerantes preferidos son polimeros de carboxivinilo, carragenano, hidroxietil celulosa, laponita y sales solubles en agua de eteres de celulosa tales como carboximetilcelulosa de sodio y carboximetil hidroxietil celulosa de sodio. Tambien pueden utilizarse gomas naturales tales como goma de karaya, goma de xantano, goma arabiga y goma tragacanto. Puede utilizarse silicato de magnesio y aluminio coloidal o silica finamente dividida como parte del agente aglomerante para mejorar adicionalmente la textura.

Otro componente opcional de los vehiculos topicos orales de las composiciones de la presente invencion es un humectante. El humectante sirve para proteger las composiciones de la pasta dental del endurecimiento por exposicion al aire, para dar a las composiciones una sensacion humeda en la boca, y, para humectantes particulares, para impartir dulzura o sabor deseable a las composiciones de pasta de dientes. El humectante, sobre una base de humectante puro, comprende en general desde aproximadamente 0% hasta aproximadamente 70%, preferiblemente desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 25%, en peso de las composiciones presentes. Los humectantes adecuados para uso en las composiciones de la presente invencion incluyen alcoholes polihidricos comestibles tales como glicerina, sorbitol, xilitol, butilen glicol, polietilen glicol y propilen glicol, especialmente sorbitol y glicerina.

Tambien pueden agregarse agentes saborizantes y endulzantes a las composiciones. Agentes saborizantes adecuados incluyen aceite de gaulteria, aceite de menta, aceite de menta verde, aceite de brote de clavo, mentol, anetol, salicilato de metilo, eucaliptol, cassia, acetato de 1-mentilo, salvia, eugenol, aceite de perejil, oxanona, alfa irisona, mejorana, limon, naranja, propenil guaetol, canela, vainillina, timol, linalol, cinamaldehido glicerol acetal conocido como CGA, y mezclas de los mismos. Los agentes saborizantes se usan generalmente en las composiciones en niveles que van desde aproximadamente 0.001% hasta aproximadamente 5% en peso de la composicion.

Los agentes endulzantes que pueden ser utilizados incluyen sacarosa, glucosa, sacarina, dextrosa, levulosa, lactosa como se describio aqui anteriormente, manitol, sorbitol, fructosa, maltosa, xilitol, sales de sacarina, taumatina, aspartame, D-triptofano, dihidrochalconas, acesulfame y sales de ciclamato, especialmente ciclamato de sodio y sacarina de sodio y mezclas de los mismos. Una composicion contiene preferiblemente desde aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 10% de estos agentes, preferiblemente desde aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 1% en peso de la composicion.

La presente invencion tambien puede incluir una sal de bicarbonato de metales alcalinos. Las sales de bicarbonato de metales alcalinos son solubles en agua y a menos que se estabilicen, tienden a liberar dioxido de carbono en un sistema acuoso. El bicarbonato de sodio, tambien conocido como soda de hornear, es la sal de bicarbonato de metal alcalino preferida. La presente composicion puede contener desde aproximadamente 0.5% hasta aproximadamente 30%, preferiblemente desde aproximadamente 0.5% hasta aproximadamente 15%, y lo mas preferiblemente desde aproximadamente 0.5% hasta aproximadamente 5% de una sal de bicarbonato de un metal alcalino.

El agua empleada en la preparacion de las composiciones orales comercialmente adecuadas deberia ser preferiblemente de bajo contenido ionico y libre de impurezas organicas. El agua generalmente comprende desde aproximadamente 10% hasta aproximadamente 50%, y preferiblemente desde aproximadamente 20% a aproximadamente 40%, en peso de las composiciones de pasta dental acuosas presentes. Estas cantidades de agua incluyen el agua libre que se agrega ademas de la que es introducida con otros materiales, tales como el sorbitol. El dioxido de titanio tambien puede ser agregado a la presente composicion. El dioxido de titanio es un polvo blanco, que agrega opacidad a las composiciones. El dioxido de titanio comprende en general desde aproximadamente 0.25% hasta aproximadamente 5% en peso de las composiciones dentifricas.

El pH de la presente composicion se ajusta preferiblemente a traves del uso de agentes reguladores. Agentes reguladores, tal como se utiliza aqui, se refiere a agentes que pueden ser utilizados para ajustar el pH de la composicion a un rango de aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 9.5. Los agentes reguladores incluyen fosfato de monosodio, fosfato de trisodio, hidroxido de sodio, carbonato de sodio, pirofosfato acido de sodio, acido citrico y citrato de sodio. Los agentes reguladores pueden ser administrados a un nivel desde aproximadamente 0.5% hasta aproximadamente 10% en peso de las presentes composiciones. El pH de las composiciones dentifricas se mide en una suspension acuosa 3:1 de dentifrico, por ejemplo, 3 partes de agua a 1 parte de pasta dental.

Otros agentes opcionales que pueden ser utilizados en las presentes composiciones incluyen copolioles de dimeticona seleccionados entre copolioles de alquilo y alcoxi dimeticona, tales como copolioles de C12 a C20 alquil dimeticona y mezclas de los mismos. Se prefiere principalmente el copoliol de cetil dimeticona comercializado bajo el nombre comercial Abil EM90. Este copoliol de dimeticona esta presente en general en un nivel desde aproximadamente 0.01% hasta aproximadamente 25%, preferiblemente desde aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 5%, mas preferiblemente desde aproximadamente 0.5% hasta aproximadamente 1.5% en peso. Los copolioles de dimeticona ayudan en proveer beneficios de sensacion positiva en los dientes. Otros vehiculos utiles incluyen formulaciones dentifricas bifasicas tales como las divulgadas en US 5,213,790; US 5,145,666; US 5,281,410; US 4,849,213 y US 4,528,180

Las composiciones cosmeticas presentes tambien pueden incluir otros agentes activos, tales como agentes antimicrobianos. 1ncluidos entre tales agentes estan agentes antimicrobianos no cationicos insolubles en agua tales como difenil eter halogenados, compuestos fenolicos incluyendo fenol y sus homologos, halofenoles mono y polialquilo y aromaticos, resorcinol y sus derivados, compuestos bisfenolicos y salicilanilidas halogenadas, esteres benzoicos, y carbanilidas halogenadas. Los antimicrobianos solubles en agua incluyen sales de amonio cuaternarias y sales de bis-biquanida, entre otros. El monofosfato de triclosan es un agente antimicrobiano adicional soluble en agua. Los agentes de amonio cuaternario incluyen aquellos en los cuales uno o dos de los sustitutos en el nitrogeno cuaternario tienen una longitud de cadena de carbono (tipicamente un grupo alquilo) desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 20, tipicamente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 18 atomos de carbono mientras que los sustitutos restantes (tipicamente grupos alquilo o bencilo) tienen un numero menor de atomos de carbono, tales como desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 7 atomos de carbono, tipicamente grupos metilo o etilo. El bromuro de dodecil trimetil amonio, cloruro de tetradecilpiridinio, bromuro de domifen, N-tetradecil-4etilo piridinio cloruro, dodecilo dimetilo (2-fenoxietil) amonio bromuro, bencilo dimetilstearilo amonio cloruro, cloruro

de cetil piridinio, 5-amino-1,3-bis(2-etil-hexil)-5-metilo hexa hidropirimidina cuaternizado, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio y cloruro de metil bencetonio son ejemplos de agentes antibacterianos de amonio cuaternario tipicos. Otros compuestos son bis[4-(R-amino)-1-piridinio] alcanos tal como se divulgan en US 4,206,215. Tambien pueden ser incluidos otros antimicrobianos tales como bisglicinato de cobre, glicinato de cobre, citrato de zinc y lactato de zinc. Las enzimas son otro tipo de agente activo que puede ser utilizado en las presentes composiciones. Enzimas utiles incluyen las que pertenecen a la categoria de las proteasas, enzimas liticas, inhibidores de la matriz de placa y oxidasas: Las proteasas incluyen papaina, pepsina, tripsina, ficina, bromelina; enzimas liticas de las paredes celulares incluyen lisozima; inhibidores de matriz de placa incluyen dextranasas, mutanasas; y las oxidasas incluyen glucosa oxidasa, lactato oxidasa, galactosa oxidasa, oxidasa del acido urico, peroxidasas que incluyen peroxidasa de rabano, mieloperoxidasa, lactoperoxidasa, cloroperoxidasa. Las oxidasas tambien tienen actividad blanqueadora/limpiadora, ademas de propiedades antimicrobianas. Tales agentes se divulgan en US 2,946,725 y en US 4,051,234. Otros agentes antimicrobianos incluyen clorhexidina, triclosan, monofosfato de triclosan, y aceites saborizantes tales como timol. El triclosan y otros agentes de este tipo estan divulgados en US 5,015,466 y US 4,894,220. Estos agentes, que proveen beneficios antiplaca, pueden estar presentes en niveles que van desde aproximadamente 0.01% hasta aproximadamente 5.0%, en peso de la composicion dentifrica.

El termino "goma de mascar" tal como se define aqui indica una composicion de confiteria que es adecuada para masticar y comprende cualquier cantidad adecuada de elastomero conocido por la persona experimentada en la tecnica, preferiblemente una cantidad de 2% o mas, en peso de la composicion. Componentes adecuados de tabletas y goma de mascar estan divulgadas, por ejemplo, en US 4,083,955; US 6,770,264 o US 6,270,781. Tabletas preferidas son las descritas en los Ejemplos 19 y 20. Una composicion de goma de mascar preferida se describe en el Ejemplo 25.

Las composiciones que se usan de acuerdo con la presente invencion comprenden preferiblemente un elastomero, o mezcla de varios diferentes elastomeros. Los materiales elastomericos son conocidos en general en la tecnica pero ejemplos ilustrativos incluyen goma de estireno-butadieno (SBR); gomas sinteticas; copolimeros de poliisobutileno e isobutileno-isopreno; gomas naturales; chicle; goma natural; jelutong; balata; gutapercha; lechi caspi; sorva; y mezclas de las mismas. Las composiciones tal como se utilizan de acuerdo con la presente invencion comprenden preferiblemente desde aproximadamente 2% hasta aproximadamente 30%, mas preferiblemente desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 25%, en peso, de elastomero. Estos niveles se determinan por la textura final deseada de la goma de mascar puesto que cuando el nivel total de elastomero esta por debajo de aproximadamente 2% la composicion de base carece de elasticidad, textura de masticado y cohesividad mientras que en niveles por encima de aproximadamente 30% la formulacion es dura, gomosa y mantiene una masticacion apretada. Los solventes de elastomeros tambien estan presentes preferiblemente en composiciones tal como se utilizan de acuerdo con la presente invencion puesto que ayudan a ablandar el componente elastomerico. Ejemplos preferidos de solventes para elastomeros para uso aqui incluyen el ester de pentaeritritol de rosina de madera parcialmente hidrogenada, ester de pentaeritritol de rosina de madera, ester de glicerol de rosina de madera parcialmente dimerizada, ester de glicerol de rosina polimerizada, ester de glicerol de tallol, rosina de madera o goma, ester de glicerol de rosina parcialmente hidrogenada, ester metilico de rosina parcialmente hidrogenada, y mezclas de los mismos. Las composiciones tal como se utilizan de acuerdo con la presente invencion comprenden preferiblemente desde aproximadamente 2% hasta aproximadamente 50%, mas preferiblemente desde aproximadamente 10% hasta aproximadamente 35%, en peso, del solvente elastomerico.

Las tabletas para uso de acuerdo con esta invencion pueden ser preparadas, por ejemplo, mediante tecnicas reconocidas en el arte para formar tabletas comprimidas en donde el disacarido se dispersa en un vehiculo solido compresible, combinado opcionalmente con cualquier auxiliar de formacion de tabletas apropiado tal como lubricante (por ejemplo, estearato de magnesio) y se comprime en tabletas. El componente vehiculo solido para tales formulaciones para tabletas puede ser un solido soluble en saliva, tal como almidon soluble en agua fria o un monosacarido, de tal manera que la tableta se disuelva facilmente en la boca para liberar el acido disacarido contenido en solucion en saliva para contacto con y absorcion por la mucosa oral/faringea cuando la tableta es mantenida en la boca. El pH de las formulaciones antes descritas puede variar desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 8.5.

Las tabletas para uso de acuerdo con la presente invencion tambien pueden prepararse utilizando otras tecnicas de formulacion de dosificaciones unitarias solidas reconocidas en el arte.

Un lavado bucal o un enjuague bucal tal como se utiliza de acuerdo como la presente invencion podria ser preferiblemente como sigue:

A: Olium menthae 1.2 partes

Tinctura Amicae: 3.0 partes

Tinctura Myrrhae: 3.0 partes

Tween: 5.0 partes

B: Spiritus 90% 50.0 partes

C: Benzoato de Sodio 0.2 partes

Agente endulzante (por ejemplo aspartame) Agua destilata ad 100,: 0.02 partes

Se mezcla bien A, B se agrega bajo agitacion y C se agrega subsecuentemente. El liquido claro resultante se filtra dentro de las 48 horas despues de la preparacion. Otro lavado bucal preferido se describe en el Ejemplo 26.

1ndependientemente de la forma de dosificacion, liquida o solida, en una realizacion preferida de la presente invencion la forma de dosificacion se mantiene en la boca del paciente durante un periodo de tiempo para promover el contacto del microorganismo o analogo o fragmento de un microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico con la cavidad oral del paciente.

Los terminos "hilo dental" y "cinta dental" tal como se utilizan aqui se refieren a un material para desalojar y remover material alimenticio descompuesto que se acumula en las superficies interproximal y subgingival y para desalojar y retirar bacterias, placa y/o calculo que se acumula en la cavidad oral. El hilo dental o la cinta dental pueden contener adicionalmente, ademas de los microorganismos de acuerdo con la presente invencion tal como se describe aqui, limpiadores, abrasivos, ingredientes para el control del tartaro, blanqueadores, surfactantes y/o ingredientes activos tales como fluoruros, antimicrobianos, agentes quimioterapeuticos o antibioticos. Agentes adicionales posteriores son agentes antiplaca, agentes saborizantes y agentes colorantes. El hilo dental o cinta dental puede estar en cualquier forma adecuada, conocida para la persona experimentada en la tecnica, por ejemplo en la forma de hilos dentales de PTFE (teflon) como se describe, por ejemplo, en US 3,664,915 US 3,953,566, US 3,962,153 US 4,096,227, US 4,187,390, US 4,256,806, US 4,385,093, US 4,478,665, US 4,776,358, US 5,033,488, US 5,209,251, US 5,220,932, US 5,518,012, US 5,718,251, US 5,765,576 o US 5,911,228, en la forma de dispositivos interproximales monofilamento como los que se describen, por ejemplo, en US 3,800,812, US 4,974,615, US 5,760,117, US 5,433,226, US 5,479,952, US 5,503,842, US 5,755,243, US 5,884,639, US 6,003,525 o US 6,027,592, o en la forma de cintas con biocomponentes. Preferiblemente, el hilo dental o cinta dental puede estar en la forma de un monofilamento elastomerico recubierto tal como se describe por ejemplo, en US 20050226820 o en la forma de una cinta dental basada en un termoplastico orientado tal como se describe, por ejemplo, en US 20020144704.

Las composiciones cosmeticas anticariogenicas tal como se describen aqui arriba pueden ser utilizadas en el ambito de la administracion oral humana asi como del ambito de la administracion oral veterinaria, preferiblemente para mamiferos no humanos, mas preferiblemente para mascotas. Si la composicion cosmetica anticariogenica se utiliza en el ambito de la administracion oral veterinaria, la composicion puede contener ingredientes adicionales adecuados para tal administracion, tal como los conoce una persona experimentada en la tecnica.

En otro aspecto la presente invencion se relaciona con el uso de un microorganismo que pertenece al grupo de bacterias del acido lactico tal como se define en las reivindicaciones, el cual es capaz de unirse especificamente a una bacteria perteneciente al grupo de mutans Streptococci tal como se define en la reivindicaciones, para la preparacion de una composicion farmaceutica para el tratamiento o profilaxis de caries causadas por mutans Streptococci diferentes a Streptococcus mutans, a saber S. sobrinus. Preferiblemente, tal composicion farmaceutica comprende un microorganismo o un derivado o mutante o fragmento del mismo tal como se describe anteriormente. Mas preferiblemente, una composicion farmaceutica comprende adicionalmente un vehiculo o excipiente farmaceuticamente aceptable.

Las composiciones farmaceuticas incluyen una cantidad terapeuticamente efectiva del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico o un derivado, mutante o fragmento de dicho microorganismo descrito en conexion con la composicion tal como se usa de acuerdo con la presente invencion y puede formularse en varias formas, por ejemplo, en forma solida, liquida, en polvo, acuosa, liofilizada.

La composicion farmaceutica puede ser administrada a un paciente con un vehiculo farmaceuticamente aceptable, tal como se describe aqui. En una realizacion especifica, el termino "farmaceuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora u otra farmacopea reconocida en general para uso en animales, y mas particularmente en humanos. Una composicion farmaceutica preferida tal como se usa de acuerdo con la presente invencion no contiene lactosa en un rango entre 1% (p/p) y 6% (p/p). Tambien se prefiere que la composicion farmaceutica contenga no mas de 1% (p/p) de lactosa, por ejemplo, que contenga menos de 1%, preferiblemente menos de 0.9% (p/p), 0.8% (p/p) de lactosa, etc., o que la composicion farmaceutica contenga mas de 6%, 7%, 8%, etc. (p/p) de lactosa. Alternativamente, pero tambien preferido es que la composicion farmaceutica no contenga lactosa.

El termino "vehiculo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehiculo con el cual se administra el agente terapeutico. Tal vehiculo es farmaceuticamente aceptable, esto es, es no toxico para un receptor en la dosificacion y concentracion empleadas. Es preferiblemente isotonico, hipotonico o debilmente hipertonico y tiene una fuerza ionica relativamente baja, tal como la provista por una solucion de sacarosa. Tales vehiculos farmaceuticos pueden ser liquidos esteriles, tales como agua y aceites, incluyendo los de petroleo, animales, vegetales o de origen sintetico, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo y similares. Las soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol tambien pueden ser empleadas como vehiculos liquidos, particularmente para soluciones inyectables. Excipientes farmaceuticos adecuados incluyen almidon, glucosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, silica gel, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, ion sodio, leche en polvo descremada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares . El excipiente puede contener lactosa tal como se describio anteriormente, lo mas preferiblemente es libre de lactosa. La composicion si se desea tambien puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsificantes, agentes reguladores del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, capsulas, polvos, formulaciones de liberacion sostenida y similares. La formulacion oral puede incluir vehiculos estandar tales como grados farmaceuticos de manitol, almidon, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de vehiculos farmaceuticos adecuados son descritos en "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin. Tambien pueden emplearse leche descremada, leche en polvo descremada, productos no lacteos o sin lactosa. La leche en polvo descremada se suspende convencionalmente en solucion salina regulada con fosfato (PBS), se somete a autoclave o se filtra para erradicar contaminantes proteinaceos y vivientes, luego se seca por congelacion, se seca por calor, se seca al vacio o se liofiliza. Algunos otros ejemplos de sustancias que pueden servir como vehiculos farmaceuticos son azucares, tales como glucosa y sacarosa; almidones tales como almidon de maiz y almidon de patata; celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetatos de celulosa; tragacanto pulverizado; malta; gelatina; talco; acidos estearicos; estearato de magnesio; sulfato de calcio; carbonato de calcio; aceites vegetales, tales como aceites de mani, aceite de semilla de algodon, aceite de sesamo, aceite de oliva, aceite de maiz y aceite de teobroma; polioles tales como propilen glicol, glicerina, sorbitol, manitol y polietilen glicol; agar, acidos alginicos; agua libre de pirogenos; solucion salina isotonica; arandano, extractos y solucion reguladora de fosfato; leche en polvo descremada, asi como otras sustancias compatibles no toxicas usadas en formulaciones farmaceuticas tales como vitamina C, estrogeno y equinacea, por ejemplo. Tambien pueden estar presentes agentes humectantes y lubricantes tales como lauril sulfato de sodio, asi como agentes colorantes, agentes saborizantes, lubricantes, excipientes, agentes para formacion de tabletas, estabilizantes, antioxidantes y conservantes.

Preferiblemente, la formulacion oral contiene lactosa tal como se describe aqui y es lo mas preferiblemente libre de lactosa. Diversos vehiculos y/o excipientes adecuados para administracion oral que son bien conocidos en la tecnica pueden ser usados para el proposito de esta invencion. La composicion no cariogenica si se desea, puede contener diversos aditivos conocidos tales como, por ejemplo, conservantes, agentes de endurecimiento, lubricantes, emulsificantes, estabilizadores, esencias y similares. Tales composiciones contendran una cantidad terapeuticamente efectiva de los compuestos antes mencionados, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehiculo de tal manera que provean la forma para administracion apropiada al paciente. La formulacion deberia adecuarse al modo de administracion.

Generalmente, los ingredientes se suministran bien sea separadamente o mezclados entre si en una forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, un polvo liofilizado seco o un concentrado libre de agua en un contenedor hermeticamente sellado tal como una ampolla o un saquito indicando la cantidad de agente activo. Cuando la composicion se administra por infusion, puede ser dispensada con una botella de infusion que contiene agua o solucion salina grado farmaceutico esteril.

La composicion farmaceutica de la invencion puede ser formulada como formas neutras o salinas. Sales farmaceuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones tales como los derivados de los acidos clorhidrico, fosforico, acetico, oxalico, tartarico, etc. Y los formados con cationes tales como los derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidroxidos ferricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaina, etc.

Pueden emplearse opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar los rangos de dosificacion optimos. La dosis precisa que se debe emplear en la formulacion tambien dependera de la ruta de administracion, y la seriedad de la enfermedad o trastorno, y debe decidirse de acuerdo con el juicio del medico y las circunstancias de cada paciente. Las dosis efectivas pueden extrapolarse a partir de las curvas dosis-respuesta derivadas de sistemas modelo in vitro o animales. Preferiblemente, la composicion farmaceutica se administra directamente o en combinacion con un adyuvante. Los adyuvantes pueden ser seleccionados del grupo consistente de una cloroquina, compuestos polares proticos, tales como propilen glicol, polietilen glicol, glicerol, EtOH, 1-metil L-2-pirrolidona o sus derivados, o compuestos polares aproticos tales como dimetilsulfoxido (DMSO), dietilsulfoxido, di-n-propilsulfoxido, dimetilsulfona, sulfolano, dimetilformamida, dimetilacetamida, tetrametilurea, acetonitrilo o sus derivados. Estos compuestos se agregan en condiciones que respetan las limitaciones de pH. La composicion tal como se usa de acuerdo con la presente invencion puede ser administrada a un vertebrado. "Vertebrado" tal como se utiliza aqui pretende tener el mismo significado que se entiende comunmente por parte de una persona experimentada en la tecnica. De forma particular, "vertebrado" abarca mamiferos, y mas particularmente humanos.

El termino "administrado" significa administracion de una dosis terapeuticamente efectiva de la composicion antes mencionada. Por "cantidad terapeuticamente efectiva" se entiende una dosis que produce los efectos para los cuales se administra, preferiblemente este efecto es anticariogenico. La dosis exacta dependera del proposito del tratamiento, y se podra establecer por parte de una persona experimentada en la tecnica utilizando tecnicas conocidas. Como es conocido en la tecnica y que esta descrito anteriormente, los ajustes para administracion sistemica versus localizada, edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administracion, interaccion de farmacos y la severidad de la condicion pueden ser necesarios, y se estableceran mediante experimentacion de rutina por las personas experimentadas en la tecnica.

Los metodos son aplicables tanto a aplicaciones de terapia humana como veterinaria. Los compuestos descritos aqui que tienen la actividad terapeutica deseada pueden ser administrados a un paciente en un vehiculo fisiologicamente aceptable, tal como se describe aqui. Dependiendo de la forma de introduccion, los compuestos pueden ser formulados en una variedad de formas tal como se discute mas adelante. La concentracion de compuesto terapeuticamente activo en la formulacion puede variar desde aproximadamente 0.1-100% en peso. Los agentes pueden ser administrados solos o en combinacion con otros tratamientos.

La administracion de la composicion farmaceutica puede hacerse en una variedad de formas tal como se discutio anteriormente, incluyendo, pero no limitandose a, oral, subcutanea, intravenosa, intraarterial, intranodal, intramedular, intratecal, intraventricular, intranasal, intrabronquial, transdermica, intranodal, intrarrectal, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal, o intraocular.

Preferiblemente la administracion es oral o bucal. El medico a cargo y los factores clinicos determinaran el regimen de dosificacion. Como es bien sabido en las artes medicas, las dosificaciones para un paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamafo del paciente, area superficial corporal, edad, el compuesto particular que se va a administrar, sexo, tiempo y ruta de administracion, salud general y otros farmacos que estan siendo administrados concurrentemente. Una dosis tipica puede estar, por ejemplo, en el rango de 0.001 a 1000 Ig, sin embargo, las dosis por debajo o encima de este rango de ejemplo estan previstas, especialmente considerando los factores antes mencionados.

Las dosificaciones se dan preferiblemente una vez a la semana, sin embargo, durante la progresion del tratamiento las dosificaciones pueden darse en intervalos de tiempo mucho mas largos y en caso necesario pueden ser dados en intervalos de tiempo mucho mas cortos, por ejemplo, diariamente. En un caso preferido la respuesta inmune se monitorea utilizando metodos descritos aqui y metodos adicionales conocidos por las personas experimentadas en la tecnica y se optimizan las dosificaciones, por ejemplo, en tiempo, cantidad y/o composicion. El progreso puede ser monitoreado por mediciones periodicas. La composicion farmaceutica de la invencion puede ser administrada localmente o sistemicamente. Tambien se preve que las composiciones farmaceuticas se empleen en metodologias de coterapia, esto es, en coadministracion con otros medicamentos o farmacos, por ejemplo otros farmacos para prevenir, tratar o mejorar la caries, los cuales se describen aqui.

En otra realizacion preferida de la presente invencion se relaciona con el uso de un microorganismo perteneciente al grupo de bacterias del acido lactico tal como se define en las reivindicaciones, los cuales son capaces de unirse especificamente a una bacteria que pertenece al grupo de mutans Streptococci tal como se define en las reivindicaciones, para la preparacion de una composicion anticariogenica para el tratamiento o profilaxis de caries causada por mutans Streptococci diferentes a Streptococcus mutans, a saber S. sobrinus, en donde la composicion anticariogenica es un producto alimenticio o un producto de pienso. Preferiblemente una composicion anticariogenica en la forma de un producto alimenticio o pienso es un alimento o composicion de pienso que comprende un microorganismo, mutante, derivado o fragmento del mismo tal como se describe anteriormente y comprende adicionalmente un vehiculo o excipiente oralmente aceptable. Mas preferiblemente, el microorganismo, mutante, derivado o fragmento del mismo es un microorganismo depositado tal como se describio aqui anteriormente, o un mutante, derivado o fragmento del mismo.

"Alimento" o "pienso" comprende cualquier producto comestible, palatable y/o bebible para mamiferos, por ejemplo humanos o animales, por ejemplo mascotas tal como se describe aqui. Los alimentos y los piensos se describen aqui en diversos lugares. Un "vehiculo oralmente aceptable" se describio aqui anteriormente y preferiblemente es no toxico y es de grado alimenticio y/o de pienso. Todavia, este termino tambien abarca los vehiculos mencionados en relacion con la composicion farmaceutica tal como se utiliza de acuerdo con la presente invencion. Una composicion de alimento o pienso tal como se utiliza de acuerdo con la presente invencion no contiene lactosa en un rango entre 1% (p/p) y 6% (p/p). Tambien se prefiere que las composicion de alimento o pienso contengan no mas de 1% (p/p) de lactosa, por ejemplo, contenga al menos de 1%, preferiblemente menos de 0.9% (p/p), 0.8% (p/p) de lactosa, etc., o que la composicion de alimento o pienso contenga mas de 6%, 7%, 8%, etc. (p/p) de lactosa. Alternativamente, pero tambien preferido es que la composicion de alimento o pienso no contenga lactosa.

De acuerdo con la presente invencion, el termino "producto alimenticio" abarca todos los alimentos y bebidas comestibles y bebibles. De acuerdo con lo anterior, el microorganismo, derivado, analogo o fragmento del mismo puede estar incluido en un alimento o bebida. Estos son, por ejemplo, gomas, aspersiones, bebidas, dulces, formulas infantiles, crema de helado, postres congelados, aderezos dulces para ensalada, preparaciones lacteas, queso, quark, yogur libre de lactosa, leche acidificada, crema de cafe o crema batida y similares.

Los productos basados en leche se preven dentro del marco de la invencion. La leche sin embargo se entiende que implica la de origen animal, tal como vaca, cabra, oveja, bufalo, cebra, caballo, asno o camello y similares. La leche puede estar en su estado nativo, una leche reconstituida, una leche descremada o una leche suplementada con compuestos necesarios para el crecimiento de las bacterias o para el procesamiento subsecuente de la leche fermentada, tales como grasa, proteinas de un extracto de levadura, peptona y/o un surfactante, por ejemplo. El termino leche tambien se aplica a lo que se denomina comunmente leche vegetal, es decir extractos de material vegetal que han sido tratados o de alguna otras manera, tales como plantas leguminosas (soja, garbanzo, lenteja y similares) o semillas oleaginosas (colza, soja, sesamo, algodon y similares), cuyos extractos contienen proteinas en solucion o en suspension coloidal, y que son coagulables por accion quimica, por fermentacion acida y/o por calor. Finalmente, la palabra leche tambien denota mezclas de leches animales y de leches vegetales.

Cuando el microorganismo de esta invencion o su derivado analogo o un fragmento del mismo se agregan a yogur y similares con contenidos similares, es suficiente agregar el microorganismo de esta invencion en una concentracion de aproximadamente 105 -107 celulas/ml. En tal caso, es posible prevenir o inhibir completamente la caries dental inducida por las cepas cariogenicas de mutans Streptococci sin efectos colaterales significativos sobre la calidad de la bebida per se.

Tal alimento, bebida o pienso pueden ser producidos mediante un metodo general para producir alimentos y bebidas

o piensos, incluyendo la adicion del ingrediente activo a un material crudo o cocido del alimento, bebida o pienso. El alimento, bebida o pienso de acuerdo con la presente invencion puede ser moldeado y granulado en la misma manera usada en general para alimentos, bebidas o piensos. El metodo de moldeado y granulacion incluye metodos de granulacion tales como granulacion en capa fluida, granulacion por agitacion, granulacion por extrusion, granulacion por enrollamiento, granulacion con corriente de gas, granulacion por compactacion por moldeo, granulacion por ruptura, granulacion por aspersion y granulacion por inyeccion, metodos de recubrimiento tales como recubrimiento en placa, recubrimiento en capa fluida y recubrimiento en seco, secado expansivo, metodo de vapor en exceso, metodo de base de espuma, metodos de expansion tales como metodo de incubacion por microondas y metodos de extrusion con maquinas y extrusoras de granulacion por extrusion.

El alimento, bebida o pienso que se va a utilizar en la presente invencion incluye cualquier alimento, bebida o pienso que comprenda los microorganismos de la invencion, derivados o fragmentos de los mismos como ingrediente activo. El ingrediente activo en el alimento, bebida o pienso no esta limitado especificamente a ninguna concentracion en tanto el alimento, bebida o pienso resultantes puedan ejercer su actividad para unirse especificamente a mutans Streptococci. La concentracion del ingrediente activo preferiblemente va de 0.001 a 100% en peso, mas preferiblemente de 0.01 a 100% en peso y lo mas preferiblemente de 0.1 a 100% en peso del alimento, bebida o pienso que comprende tal ingrediente activo o con respecto al numero de celulas descritas aqui.

Alimentos o bebidas especificos, a los cuales se agrega el ingrediente activo, incluyen, por ejemplo, jugos, bebidas refrescantes, sopas, tes, bebidas de leche agria, productos lacteos tales como leches fermentadas, helados, mantequilla, queso, leche procesada y leche descremada, productos carnicos tales como tocino, salchicha y hamburguesas, productos de torta de carne de pescado, productos hechos a partir de huevos tales como rollos de huevos sazonados y cuajo de huevo, confiterias tales como galletas, gelatinas, tentempies, y goma de mascar, panes, pastas, encurtidos, productos ahumados, pescados secos y aderezos. La forma del alimento o bebida incluye, por ejemplo, alimentos en polvo, alimentos en laminas, alimentos embotellados, alimentos enlatados, alimentos en retortas, alimentos en capsulas, alimentos en tabletas y alimentos fluidos.

El alimento o bebida con una actividad para unirse especificamente a mutans Streptococci para ser ingerido por infantes, son preferiblemente composiciones nutritivas para infantes. Tales composiciones nutritivas para infantes incluyen leche modificada preparada para infantes, leche con proteina descompuesta, leche modificada nutricionalmente especifica o alimentos para bebes y alimentos preparados para nifos pequefos. La forma de la composicion nutritiva para infantes incluye pero no se limita especificamente a leches en polvo secas y pulverizadas y alimentos para bebes y tambien incluye alimentos generales tales como crema de helado, leche fermentada y gelatina para ingestion infantil.

La composicion nutritiva para infantes de acuerdo con la presente invencion esta compuesta principalmente de proteina, lipidos, sacaridos, vitaminas y/o minerales. En la composicion nutritiva, el ingrediente activo esta mezclado con estos componentes.

La proteina incluye proteinas de leche tales como leche descremada, caseina, suero de queso, concentrado de proteina de suero y aislados de proteina de suero y sus fracciones, tales como alfa s -caseina, beta-caseina, alfalactoalbumina y beta-lactoalbumina. Adicionalmente pueden usarse proteina de huevo tal como proteina de yema de huevo, proteina de clara de huevo y ovalbumina, o proteina de soja tal como proteina de soja desengrasada, proteina de soja separada, y proteina de soja concentrada. Ademas de estas, pueden usarse tambien satisfactoriamente proteinas tales como gluten de trigo, proteina de torta de pescado, proteina de carne vacuna y colageno. Adicionalmente pueden usarse tambien satisfactoriamente fracciones de estas proteinas, peptidos del tratamiento acido o enzimatico de las mismas, o aminoacidos libres. Los aminoacidos libres pueden servir como fuentes de nitrogeno y pueden usarse adicionalmente para dar acciones fisiologicas especificas. Tales aminoacidos libres incluyen, por ejemplo, taurina, arginina, cisteina, cistina y glutamina. Los lipidos incluye grasas y aceites animales tales como grasa de leche, cebo, grasa de res y aceite de pescado, aceites vegetales tales como aceite de soja, aceite de colza, aceite de maiz, aceite de coco, aceite de palma, aceite de semilla de palma, aceite de cartamo, aceite de perilla, aceite de lino, aceite de onagra, trigliceridos de acidos grasos de cadena media, y aceite de algodon, grasas y aceites generados por via bacteriana y aceites fraccionados de los mismos, aceites hidrogenados de los mismos, y aceites con intercambio de esteres de los mismos. La cantidad de lipidos que se va a mezclar varia dependiendo del uso.

Los sacaridos incluyen por ejemplo, uno o mas de almidon, polisacaridos solubles, dextrina, monosacaridos, tales como sacarosa, lactosa tal como se describe aqui, maltosa, glucosa y fructosa y otros oligosacaridos. La cantidad total de tal sacarido es preferiblemente 40 a 80% en peso del solido total en la composicion nutritiva. Adicionalmente, pueden utilizarse satisfactoriamente endulzantes artificiales. La cantidad de un endulzante artificial es apropiadamente de 0.05 a 1.0% en peso de solidos totales en la composicion nutritiva.

Las vitaminas incluyen, pero no se limitan a, licopeno como un componente esencial y adicionalmente incluyen, por ejemplo, vitaminas tales como vitamina A, grupo de vitaminas B, vitaminas C, D, y E y grupo de las vitaminas K, acido folico, acido pantotenico, nicotinamida, carnitina, colina, inositol y biotina en tanto tales vitaminas puedan ser administradas a infantes. Tales vitaminas van preferiblemente de 10 mg a 5 g por peso del solido total en la composicion nutritiva para infantes.

Adicionalmente, los minerales incluyen calcio, magnesio, potasio, sodio, hierro, cobre, zinc, fosforo, cloro, manganeso, selenio y yodo. Tales minerales estan preferiblemente de 1 mg a 5 g en peso del solido total en la composicion nutritiva para infantes.

Ademas de estos componentes descritos anteriormente, la composicion nutritiva para infantes tal como se utiliza de acuerdo con la presente invencion puede ser mezclada con cualquier componente mezclado deseablemente en composiciones nutritivas, por ejemplo, fibra de dieta, nucleotidos, acidos nucleicos, sabores y colorantes.

El alimento o bebida tal como se utiliza de acuerdo con la presente invencion puede ser utilizado como alimento o bebida saludables o un alimento o bebida funcionales para prevenir y/o tratar la caries causadas por mutans Streptococci diferentes a Streptococcus mutans.

Cuando el alimento o bebida de acuerdo con la presente invencion es ingerido, la cantidad que se debe ingerir no esta limitada especificamente. La cantidad que se debe ingerir va generalmente de 0.1 a 50 g, preferiblemente de

0.5 g a 20 g diariamente, con base en la cantidad total de ingrediente activo. El alimento o bebida se ingiere de manera continua en esta cantidad durante un periodo de tiempo desde un solo dia hasta 5 afos, preferiblemente desde 2 semanas a un afo. Aqui, la cantidad ingerida puede ser ajustada hasta un rango apropiado dependiendo de la severidad del sintoma o de la ingestion individual del alimento o bebida, la edad y el peso corporal del mismo, y similares.

El pienso tal como se utiliza de acuerdo con la presente invencion puede ser cualquier pienso que comprende el ingrediente activo. El pienso incluye, por ejemplo, piensos para mascotas para perros, gatos y ratas, piensos para ganado para vacas y cerdos, piensos para aves para pollos y pavos, y piensos para cultivo de peces para sargo y atun de aleta amarilla.

El pienso puede ser producido mediante mezcla apropiada del ingrediente activo tal como se describio aqui anteriormente con un material de pienso crudo incluyendo, por ejemplo, cereales, salvados, tortas de semillas oleaginosas, materiales de pienso crudos derivados de animales, otros materiales para pienso crudos y productos purificados.

Los cereales incluyen, por ejemplo, millo, trigo, cebada, avena, centeno, arroz integral, alforfon, millo de cola de zorra, millo chino, grama del deccan, maiz y soja.

Los salvados incluyen, por ejemplo, salvado de arroz, salvado de arroz desengrasado, harina de grado bajo, germen de trigo, salvado de cebada, pellas de tamizado, salvado de maiz y germen de maiz.

Las tortas de semillas oleaginosas incluyen, por ejemplo, torta de soja, polvo de soja, torta de linaza, torta de algodon, torta de cacahuete, torta de cartamo, torta de coco, torta de palma, torta de sesamo, torta de girasol, torta de colza, torta de kapok y torta de mostaza. Los materiales de pienso crudo derivados de animales incluyen, por ejemplo, polvo de pescado, torta importada, torta entera, y torta costera, pescado soluble, polvo de carne, polvo de carne y hueso, polvo de sangre, pelo descompuesto, polvo de hueso, subproductos de carniceria, torta de plumas, pupas de gusano de seda, leche descremada, caseina, suero seco y krill.

Otros materiales de pienso crudos incluyen, por ejemplo, tallos y hojas de plantas tales como alfalfa, cubo de heno, torta de hojas de alfalfa y polvo de hojas de algarrobo, subproductos de industrias de procesamiento del maiz, tales como torta de gluten de maiz, pienso de gluten de maiz y licor de maiz, almidon, azucar, levadura, subproductos de la industria de la fermentacion tales como residuos de cerveza, raiz de malta, residuos de licor y residuos de salsa de soja, subproductos agricolas tales residuos procesados de citricos, residuos de cuajo de soja, residuos de cafe, residuos de cacao, casaba, haba, torta de guar, algas, espirulina y clorela.

Los productos purificados incluyen, por ejemplo, proteinas tales como caseina y albumina, aminoacidos, almidon, celulosa, sacaridos tales como sacarosa y glucosa, minerales y vitaminas.

En caso de proveer a los animales el pienso de acuerdo con la presente invencion, la cantidad del pienso que va a ser ingerida no esta limitada especificamente pero preferiblemente, por ejemplo, de 0.1 mg a 50 g por un kilogramo de peso corporal por dia, preferiblemente 0.5 mg a 20 g por 1 kg de peso corporal por dia, con base en la cantidad del ingrediente activo. El pienso se ingiere continuamente en esta cantidad durante un periodo desde un solo dia hasta 5 afos, preferiblemente desde 2 semanas a un afo. De nuevo, la cantidad ingerida puede ser ajustada a un rango apropiado dependiendo de las especies, edad y peso corporal del animal que esta ingiriendo el pienso, y similares.

En una realizacion adicional, la presente invencion se relaciona con el uso de un microorganismo que pertenece al grupo de las bacterias del acido lactico a saber como se define en las reivindicaciones, el cual es capaz de unirse especificamente a una bacteria perteneciente al grupo de mutans Streptococci tal como define en las reivindicaciones, para la preparacion de una composicion anticariogenica para el tratamiento o profilaxis de caries causada por mutans Streptococci diferentes a Streptococcus mutan, a saber S. sobrinus, en donde la composicion anticariogenica es un aditivo para alimentos, bebidas y piensos. Preferiblemente, el aditivo para alimentos, bebidas y piensos, debido a la presencia de un microorganismo o derivado o mutante o fragmento del mismo tal como se describio aqui es, entre otros, capaz de unirse especificamente a mutans Streptococci de tal manera que previene y/o trata la caries causada por mutans Streptococci diferentes a Streptococcus mutans, especificamente S. sobrinus. Preferiblemente, el microorganismo, mutante, derivado o fragmento del mismo es un microorganismo depositado tal como se describio aqui anteriormente, o un mutante, derivado o fragmento del mismo. El aditivo para alimentos o bebidas incluye el aditivo para composiciones nutritivas para infantes.

El aditivo para alimentos puede ser producido por un metodo general para la produccion de aditivos para alimentos, bebidas o piensos. Si es necesario, los aditivos para uso general en alimentos, bebidas o piensos, por ejemplo, los aditivos descritos en Food Additive Handbook (The Japan Food Additives Association; editado el 6 de enero de 1997) puede ser agregado satisfactoriamente, incluyendo endulzantes, colorantes, conservantes, espesantes y estabilizadores, antioxidantes, agentes para la fijacion del color, blanqueadores, antisepticos, bases de goma, amargos, enzimas, agentes abrillantadores, acidificantes, sazonadores, emulsificadores, potenciadores, agentes para la manufactura, sabores y extractos de especias. Adicionalmente, pueden agregarse satisfactoriamente sacaridos convencionales, almidon, materiales inorganicos, polvos de plantas, excipientes, desintegradores, lubricantes, aglomerantes, surfactantes y plastificantes mencionados previamente para las tabletas farmaceuticas.

Los aditivos incluyen uno de los siguientes aditivos.

Los endulzantes incluyen aspartame, licoris, estevia, xilosa y rakanka (fruta de la momordica grosvenon). Los colorantes incluyen carotenoides y oleorresinas de curcuma, flavonoides, color caramelo, color de espirulina, clorofila, color de patata dulce purpura, color de fame purpura, color de perilla y color de arandanos.

Los conservantes incluyen, por ejemplo, sulfito de sodio, benzoatos, extracto de benzoina, sorbatos y propionatos. Los espesantes y estabilizadores incluyen, por ejemplo, gomas tales como goma arabiga y goma de xantano, alginatos, quitina, quitosano, extracto de aloe, goma guar, hidroxipropil celulosa, caseina de sodio, almidon de maiz, carboximetilcelulosa, gelatina, agar, dextrina, metil celulosa, alcohol polivinilico, microfibra de celulosa, celulosa microcristalina, celulosa de algas, poliacrilato de sodio, polifosfato de sodio, carragenano o paredes de celulas de levadura.

Los antioxidantes incluyen, por ejemplo, el grupo de vitaminas C, etilendiaminotetraacetato de sodio, etilendiaminotetraacetato de calcio, acido eritorbico, orizanol, catequina, quercetina, extracto de clavo, rutina tratada con enzimas, extracto de manzana, extracto de semilla de sesamo, dibutilhidroxitolueno, extracto de hinojo, extracto de rabano, extracto de apio de agua, extracto de te, tocoferoles, extracto de colza, extracto de grano de cafe, extracto de semilla de girasol, acido ferulico, butilhidroxianisol, extracto de hoja de arandanos, extracto de propoleo, extracto de pimienta, extracto de balsamo de jardin, acido galico, extracto de eucalipto y extracto de romero.

Los agentes fijadores de color incluyen, por ejemplo, nitrito de sodio. Los blanqueadores incluyen, por ejemplo, sulfito de sodio.

Los antisepticos incluyen, por ejemplo, o-fenil fenol. La base de goma incluye, por ejemplo, acetil ricinooleato de metilo, cera de urushi, goma ester, resina elemi, cera de urucury, goma de kauri, cera de carnauba, esteres de acidos grasos de glicerina, cera de espermaceti, balsamo de copaiba, resina de copal, goma, cera de salvado de arroz, cera de cafa, shellac, jelutong, esteres de acidos grasos de sacarosa, goma natural despolimerizada, cera de parafina, balsamo de abeto, esteres de acidos grasos de propilen glicol, pulpa pulverizada, cascara de arroz pulverizada, aceite de jojoba, poliisobutileno, polibuteno, cera microcristalina, goma de masticar, cera de abejas y fosfato de calcio. Los agentes de amargo incluyen por ejemplo, acido iso-alfa-amargo, cafeina, extracto de kawaratake (Coriolus versieolor), extracto de corteza roja de sinchona, extracto de corteza de feladendron, extracto de raiz de genciana, extractos de especias, naringina modificada enzimaticamente, extracto de casia de Jamaica, teobromina, naringina, extracto de cassia, extracto de absent, extracto de isodonis, te de oliva, extracto de naranja amarga (Citrus aurantium), extracto de lupulo y extracto de ajenjo.

Las enzimas incluyen, por ejemplo, amilasa, tripsina o rennet.

Los agentes abrillantadores incluyen, por ejemplo, cera de urushi y cera japonesa. Los acidificantes incluyen, por ejemplo, acido adipico, acido itaconico, acidos citricos, acidos succinicos, acetato de sodio, acidos tartaricos, dioxido de carbono, acido lactico, acido fitico, acido fumarico, acido malico y acido fosforico. Los aderezos incluyen por ejemplo aminoacidos tales como asparagina, acido aspartico, acido glutamico, glutamina, alanina, isoleucina, glicina, serina, cistina, tirosina, leucina, y pralina, acidos nucleicos tales como inosinato de sodio, uridinato de sodio, guanilato de sodio, citidilato de sodio, ribonucleotido de calcio y ribonucleotido de sodio, acidos organicos tales como acido citrico y acido succinico, cloruro de potasio, salmuera disminuida en cloruro de sodio, cloruro de potasio crudo, sal de suero, fosfato de tripotasio, hidrogeno fosfato de dipotasio, dihidrogeno fosfato de potasio, hidrogeno fosfato de disodio, dihidrogeno fosfato de sodio, fosfato trisodico y extracto de clorela.

Los potenciadores incluyen, por ejemplo, sales de zinc, el grupo de la vitamina C, diversos aminoacidos, acido 5adenilico, cloruro de hierro, hespiridina, diversos calcios calcinados, diversos calcios no calcinados, dibenzoiltiamina, hidroxido de calcio, carbonato de calcio, tiamina-sal de clorhidrato, Dunallella. Oaroteno, tocoferol, acido nicotinico, caroteno de zanahoria, caroteno de aceite de palma, pantotenato de calcio, vitamina A, hidroxiprolina, dihidrogeno fosfato de calcio, pirofosfato ferroso, pirofosfato ferrico, ferritina, hierro heme, menaquinona, acido folico y riboflavina.

Los agentes para manufactura incluyen, por ejemplo, auxiliares del procesamiento tales como acetona y resinas de intercambio ionico. Los sabores incluyen, por ejemplo, esencia de vainilla y extractos de especias que incluyen, por ejemplo, extracto de capsicum.

Estos diversos aditivos pueden ser agregados al ingrediente activo, teniendo en consideracion el modo de administracion, de acuerdo con la presente invencion. La composicion anticariogenica tal como se utiliza de acuerdo con la presente invencion abarca una cantidad del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico o un derivado o mutante de los mismos o un analogo o fragmento de los mismos. Preferiblemente, el microorganismo, mutante, derivado o fragmento del mismo es un microorganismo depositado tal como se describio aqui anteriormente, o un mutante derivado o fragmento del mismo. Se preve que las composiciones y en particular la composicion anticariogenica comprenden los microorganismos antes mencionados pertenecientes al grupo de las bacterias del acido lactico en la forma de un microorganismo probiotico. A saber, ademas del efecto probiotico, el microorganismo probiotico antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico es util para tratar y/o prevenir la caries causada por mutans Streptococci diferentes a Streptococcus mutans. La cantidad de dicho microorganismo probiotico es suficientemente alta para modificar positivamente de manera significativa la condicion que se va a tratar, preferiblemente la caries, pero lo suficientemente bajo como para evitar efectos colaterales serios (en una relacion beneficio/riesgo razonable), dentro del alcance de un juicio medico profundo. Una cantidad efectiva de dichos microorganismos probioticos variara con la meta particular que se pretende alcanzar, la edad y condicion fisica del paciente que esta siendo tratado, la severidad de la enfermedad subyacente, la duracion del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente y el microorganismo especifico empleado. La cantidad efectiva de dicho microorganismo probiotico sera asi la minima cantidad que provea el efecto deseado de union a mutans Streptococci. La presencia de, por ejemplo, 1 x 109 bacterias, como celulas enteras viables o no viables, en 0.05 ml de solucion de solucion salina regulada con fosfato,

o en 0.05 ml de suspension de agar, o el peso seco equivalente de fragmentos de paredes celulares, es efectivo cuando se administra en cantidades que van desde aproximadamente 0.05 ml hasta aproximadamente 20 ml.

Una ventaja practica decidida es que el organismo probiotico puede ser administrado de manera conveniente tal como una ruta oral. Dependiendo de la ruta de administracion, los ingredientes activos que comprenden dichos organismos probioticos pueden requerir un recubrimiento en un material para proteger dichos organismos de la accion de enzimas, acidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar dichos organismos. Con el fin de administrar organismos probioticos por una administracion diferente a la parenteral, deben ser recubiertos por, o administrados con, un material para evitar la inactivacion. Por ejemplo, los organismos probioticos pueden ser coadministrados con inhibidores enzimaticos o en liposomas. Los inhibidores enzimaticos incluyen inhibidores de la tripsina pancreatica, diisopropil fluorofosfato (DFP) y trasilol. Los liposomas incluyen emulsiones P40 de agua en aceite en agua asi como liposomas convencionales y especificamente disefados que transportan lactobacilos o sus subproductos a la superficie urogenital. Las dispersiones tambien pueden ser preparadas por ejemplo, en glicerol, polietilen glicoles liquidos y mezclas de los mismos, y en aceites. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos organismos probioticos esterilizados en un vehiculo esteril que contiene el medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones esteriles inyectables, los metodos preferidos de preparacion son secado al vacio y la tecnica de secado por congelacion que produce un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente deseado adicional de una solucion previamente esterilizada por filtracion de los mismos. Metodos preferidos adicionales de preparacion incluyen pero no se limitan a liofilizacion y secado por calor.

La composicion anticariogenica tambien abarca productos que pretenden ser administrados oralmente, o por via bucal, los cuales comprenden un vehiculo farmaceutico aceptable tal como se describe aqui al cual, o sobre el cual, se agregan las celulas del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico en forma fresca, concentrada o seca, por ejemplo. Desde luego, puede agregarse tambien un derivado o analogo o fragmento de dicho microorganismo o cualquier combinacion de dicho microorganismo, derivado y/o fragmento del mismo los cuales se divulgan aqui. Estos productos pueden proveerse en la forma de una suspension ingerible, un gel, un difusor, una capsula, una capsula de gelatina dura, un jarabe, o en cualquier otra forma galenica conocida para las personas experimentadas en la tecnica.

Cuando los organismos probioticos estan protegidos adecuadamente como se describe anteriormente, el compuesto activo puede ser administrado por via oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vehiculo comestible asimilable, o puede ser incluido en una capsula de gelatina dura o blanda, o puede comprimirse en tabletas disefadas para pasar a traves del estomago (por ejemplo, con recubrimiento enterico), o puede incorporarse directamente en la comida de la dieta. Para administracion terapeutica oral, los organismos probioticos pueden ser incorporados con excipientes y utilizados en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, comprimidos, capsulas, elixires, suspensiones, jarabes, galletas y similares. Las composiciones o preparaciones de acuerdo con la presente invencion se preparan de tal manera que una forma de dosificacion unitaria oral contiene, por ejemplo, aproximadamente 1 x 109 lactobacilos viables o no viables por mililitro por ejemplo. El organismo probiotico es combinado para una administracion conveniente y efectiva en cantidades efectivas con un vehiculo adecuado farmaceutica o aceptable como alimento en una forma de dosificacion unitaria como se describe aqui anteriormente. Una forma de dosificacion unitaria puede contener, por ejemplo, el compuesto activo principal en una cantidad de aproximadamente 109 lactobacilos por ejemplo, viables o no viables, por ml. En el caso de composiciones que contienen ingredientes suplementarios tales como prebioticos, las dosificaciones se determinan con referencia a la dosis usual y a la forma de administracion de los dichos ingredientes

Otro aspecto en conexion con la presente invencion se relaciona con un metodo de profilaxis o tratamiento de caries causadas por mutans Streptococci diferentes a Streptococcus mutans. Preferiblemente el metodo de profilaxis o tratamiento comprende la administracion a un sujeto de un microorganismo que pertenece al grupo de las bacterias del acido lactico, caracterizado porque dicho microorganismo es capaz de unirse especificamente a una bacteria que pertenece al grupo de mutans Streptococci o un mutante, derivado o fragmento de dicho microorganismo tal como se describe aqui anteriormente. Mas preferiblemente, el microorganismo es un microorganismo tal como se describio aqui anteriormente, incluso mas preferiblemente, el microorganismo es un lactobacillus depositado en el DSMZ, tal como se describio aqui anteriormente.

El derivado o fragmento del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico puede ser cualquier derivado o fragmento tal como se describio aqui anteriormente.

Preferiblemente, el sujeto que se va a tratar es un animal. Mas preferiblemente, el animal es un mamifero, incluso mas preferiblemente el mamifero es un mamifero de mascota. En una realizacion preferida, la mascota es un perro, un gato, un hamster, un mono, una rata o un raton. En otra realizacion preferida el animal es ganado, un caballo, un cerdo, un asno, una oveja o una cabra. En otra realizacion preferida el mamifero es un ser humano.

Preferiblemente, un mutans Streptococcus es un microorganismo que pertenece a la especie Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Streptococcus cricetus, Streptococcus Ratti, Streptococcus ferus o Streptococcus macacae. 1ncluso mas preferiblemente, un mutans Streptococcus se relaciona con un microorganismo perteneciente al serotipo c de Streptococcus mutans (DSMZ 20523), serotipo e de Streptococcus mutans (NCTC 10923) serotipo f de Streptococcus mutans (NCTC 11060), Streptococcus sobrinus DSM 20742 Streptococcus ratti DSM 20564, Streptococcus cricetus DSM 20562, Streptococcus ferus DSM 20646 o Streptococcus macacae DSM 20714. La caries que se va a tratar o prevenir es causada por mutans Streptococci diferentes a Streptococcus mutans, preferiblemente, la caries es causada por al menos una bacteria seleccionada del grupo consistente de Streptococcus sobrinus, Streptococcus cricatus, Streptococcus ratti, Streptococcus ferus y Streptococcus macacae. La administracion de un microorganismo que pertenece al grupo de bacterias del acido lactico tal como se describe anteriormente en el contexto del metodo de tratamiento o profilaxis en conexion con la presente invencion puede llevarse a cabo de cualquier manera adecuada conocida para la persona experimentada en la tecnica. Preferiblemente, la administracion abarca el uso y aplicacion de composiciones tal como se describe aqui anteriormente, las cuales pueden contener opcionalmente, por ejemplo, vehiculos farmaceuticos o cosmeticos tal como se describieron aqui anteriormente. La dosificacion y transcurso del tiempo de la administracion puede establecerse de acuerdo con una informacion adecuada conocida para la persona experimentada en la tecnica. Preferiblemente, dicha dosificacion y transcurso del tiempo pueden establecer como se describio aqui anteriormente.

La invencion se ilustra mediante las Figuras 1 a 3 tal como se describe en lo que sigue:

La Figura 1 muestra la agregacion de Streptococcus mutans por especies de Lactobacillus. En particular, la figura representa una mezcla de un Lactobacillus que se agrega con S. mutans (tubo izquierdo) en comparacion con una mezcla de Lactobacillus que no se agrega con S. mutans (tubo de la derecha). El experimento ha sido llevado a cabo como se describe en el Ejemplo 4 y los tubos se dejaron sin perturbacion durante 20 minutos para permitir que los agregados se depositen.

La Figura 2 muestra una imagen microscopica del agregado entre Lactobacillus y S. mutans mostrado en la Figura 1 (tubo de la izquierda). La imagen fue tomada con una magnificacion de 1000 veces utilizando un microscopio de contraste de fases.

La Figura 3 muestra la agregacion de diferentes mutans Streptococci por lactobacilos. El ensayo fue llevado a cabo como se describio en el Ejemplo 5. En resumen, los mutans Streptococci fueron tefidos utilizando una tincion con fluorescencia. Despues de la agregacion de los Streptococci por parte de los lactobacilos, las pellas resultantes fueron separadas por centrifugacion. La cantidad de fluorescencia de las pellas fue tomada como una medida de la cantidad de mutans Streptococci agregados.

Un mejor entendimiento de la presente invencion y de sus principales ventajas se obtendra a partir de los siguientes ejemplos, ofrecidos solamente para propositos de ilustracion.

Ejemplo�1

Almacenamiento y crecimiento

El almacenamiento y crecimiento de cepas puede ocurrir de acuerdo con procedimientos ordinarios. Por ejemplo, las cepas pueden ser almacenadas en reservas congeladas a -80°C. 1 ml de un cultivo puede cultivarse en una fase estacionaria (OD600/mL 4 -8) en medio MRS y mezclado con 500 Il de una solucion de glicerina esteril al 50% y congelarse. Los cultivos de mutans Streptococci pueden cultivarse en medio TSY en fase estacionaria (OD600/mL 1-2) y tratarse como se menciono anteriormente.

El cultivo de mutans Streptococci (S. mutans, S. sobrinus, S. ratti, S. cricetus, S. ferus o S. macacae) asi como el cultivo de lactobacilos puede hacerse en 5 ml en tubos Falcon cerrados a 37°C sin agitacion durante la noche.

En particular, las cepas usadas en la presente solicitud fueron almacenadas como reservas congeladas a -80°C. 1 ml de un cultivo cultivado en fase estacionaria (OD600/mL 4 -8) en caldo MRS se mezclo con 500 Il de una solucion de glicerol esteril al 50% y se congelo.

En particular, los cultivos de mutans Streptococci fueron cultivados en caldo TSY en fase estacionaria (OD600/mL 12) y tratados como se menciono anteriormente.

El cultivo de mutans Streptococci (S. mutans (DSM 20523, serotipo c; NCTC 10923, serotipo e; NCTC 11060, serotipo f), S. sobrinus DSM 20742, S. ratti DSM 20564, S. cricetus DSM 20562, S. ferus DSM 20646 o S. macacae DSM 20714) y el cultivo de lactobacilos se hizo en 5 ml en tubos Falcon cerrados a 37°C sin agitacion durante la noche. Para los ensayos de fluorescencia como se describen en el Ejemplo 5, se uso S. mutans DSM 20523.

Para un ensayo de agregacion los lactobacilos fueron cultivados en medio MRS. Se inocularon 5 ml de medio MRS con 10 Il de la reserva y se incubo durante 3 dias a 37°C bajo condiciones aerobicas. Se midio la densidad optica del cultivo a 600 nm (OD600). El cultivo fue diluido entonces hasta un OD600 de 2 utilizando regulador de PBS. Los mutans Streptococci fueron cultivados en 7 ml de medio TSY. Se inocularon 7 ml de medio TSY con 10 Il de la reserva y se incubaron a 37°C bajo condiciones anaerobicas.

Ejemplo�2

Clasificacion taxonomica de las cepas

La clasificacion taxonomica de las cepas se hizo de acuerdo con su patron de fermentacion de carbohidratos. Este se determino utilizando el sistema AP1 50 CH (bioMerieux, Francia) y analizado utilizando el software AP1LAB PLUS version 3.3.3 (bioMerieux, Francia).

Ejemplo�3

Tincion de las celulas

Despues de que los lactobacilos y el mutans Streptococci fueron cultivados como se describio en el Ejemplo 1, los mutans Streptococci fueron tefidos utilizando una tincion con fluorescencia. Para esto, se midio el OD600 del cultivo. El cultivo fue recolectado por centrifugacion a 3200 x g durante 5 minutos. La pella fue resuspendida en regulador de PBS. La cantidad de regulador fue calculada de tal manera que la suspension resultante tenia un OD600 de 4.2 ml de esa suspension que fue mezclada con 2 Il de una solucion de CFDA-SE (1nvitrogen, USA) que fue preparada de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La tincion de las celulas fue llevada a cabo incubando la mezcla durante 2 horas a 37°C. Las celulas tefidas fueron recolectadas por centrifugacion a 3200 x g durante 5 minutos. Las celulas fueron resuspendidas subsecuentemente en 2 ml de regulador PBS.

Ejemplo�4

Ensayo de agregacion de pellas de mutans Streptococci

Para el ensayo, la mezcla de lactobacilos y mutans Streptococci se hizo en relaciones volumetricas de 3:1 a 60:1 (mutans Streptococci: lactobacilos), correspondiendo esto a una relacion de unidades formadoras de colonia de 1:50 a 1:2.5.

Una densidad optica medida a una longitud de onda de 600 nm en 1 ml significa preferiblemente para mutans Streptococci 3 x 108 unidades formadoras de colonia y para lactobacilos preferiblemente 7 x 109 unidades formadoras de colonia. La mezcla se hizo en un volumen de 2 ml en tubos Falcon de 15 ml. Las suspensiones de cultivo fueron diluidas con regulador de PBS para obtener las relaciones volumetricas mencionadas anteriormente a la vez que se mantenia el volumen final en 2 ml. La mezcla se sometio a vortex durante 15 segundos. Una agregacion es visible como una turbidez inmediata de la suspension. Los tubos se dejaron sin perturbacion durante 20 minutos, periodo despues de tiempo despues del cual los agregados se depositan como pellas visibles mientras que las mezclas no agregantes permanecen en suspension.

Los agregados formados fueron separados por centrifugacion a 500 x g durante 30 segundos. Despues de esto, la cantidad de agregacion fue cuantificada midiendo la cantidad de celulas no agregadas que permanecieron en el sobrenadante. De manera correspondientemente, se retiro 1 ml del sobrenadante cuidadosamente para medir la densidad optica. La densidad optica fue medida a 600 nm. El valor despues de la sustraccion del experimento de control respectivo sin lactobacilos representa la cantidad de celulas que no se han agregado.

Como control, se investiga siempre la autoagregacion de las respectivas cepas de Lactobacillus y de las cepas de mutans Streptococcus llevando a cabo la prueba con solamente el Lactobacillus o la cepa de mutans Streptococcus agregada al tubo. Una agregacion de S. mutans por Lactobacillus se muestra en las Figuras 1 (tubo izquierdo) y 2.

Las cepas de lactobacilos tal como se describen aqui anteriormente, en particular aquellas que se depositan con el DSMZ, exhibieron una agregacion de todos los tipos de S. mutans sin mostrar un comportamiento de autoagregacion.

Medios:

Caldo��RS:

Mezcla MRS (Difco, EEUU) 55 g/L

pH: 6.5

Caldo TSY:

Mezcla TSY (Difco, EEUU) 30 g/L

Caldo��RS:

Extracto de levadura (Deutsche Hefewerke, 3 g/LAlemania)

Regulador:

Regulador de PBS:

Na2HPO4 2H20: 1.5 g/L

KH2PO4: 0.2 g/L

NaCl: 8.8 g/L

pH ajustado con HCl

Ejemplo 5

Ensayo de agregacion de fluorescencia de mutans Streptococci

Para el ensayo, se mezclaron una suspension del lactobacillus respectivo y de mutans Streptococcus tefido respectivo (S. mutans DSM 20523 con Lb-OB-K1 (DSM 16667), S. mutans DSM 20523 con Lb-OB-K2 (DSM 16668),

S. mutans DSM 20523 con Lb-OB-K3 (DSM 16669), S. mutans DSM 20523 con Lb-OB-K4 (DSM 16670), S. mutans DSM 20523 con Lb-OB-K5 (DSM 16671), S. mutans DSM 20523 con Lb-OB-K6 (DSM 16672), S. mutans DSM 20523 con Lb-OB-K7 (DSM 16673);

S. sobrinus DSM 20742 con Lb-OB-K1 (DSM 16667), S. sobrinus DSM 20742 con Lb-OB-K2 (DSM 16668), S. sobrinus DSM 20742 con Lb-OB-K3 (DSM 16669), S. sobrinus DSM 20742 con Lb-OB-K4 (DSM 16670), S. sobrinus DSM 20742 con Lb-OB-K5 (DSM 16671), S. sobrinus DSM 20742 con Lb-OB-K6 (DSM 16672), S. sobrinus DSM 20742 con Lb-OB-K7 (DSM 16673);

S. cricetus DSM 20562 con Lb-OB-K1 (DSM 16667), S. cricetus DSM 20562 con Lb-OB-K2 (DSM 16668), S. cricetus DSM 20562 con Lb-OB-K3 (DSM 16669), S. cricetus, DSM 20562 con Lb-OB-K4 (DSM 16670), S. cricetus DSM 20562 con Lb-OB-K5 (DSM 16671), S. cricetus DSM 20562 con Lb-OB-K6 (DSM 16672), S. cricetus DSM 20562 con Lb-OBK7 (DSM 16673);

S. ratti DSM 20564 con Lb-OB-K1 (DSM 16667), S. ratti DSM 20564 con Lb-OB-K2 (DSM 16668), S. ratti DSM 20564 con Lb-OB-K3 (DSM 16669), S. ratti DSM 20564 con Lb-OB-K4 (DSM 16670), S. ratti DSM 20564 con Lb-OB-K5 (DSM 16671), S. ratti DSM 20564 con Lb-OB-K6 (DSM 16672), S. ratti DSM 20564 con Lb-OB-K7 (DSM 16673);

S. ferus DSM 20646 con Lb-OB-K1 (DSM 16667), S. ferus DSM 20646 con Lb-OB- K2 K2 (DSM 16668), S. ferus DSM 20646 con Lb-OB-K3 (DSM 16669), S. ferus DSM 20646 con Lb-OB-K4 (DSM 16670), S. ferus DSM 20646 con Lb-OB-K5 (DSM 16671), S. ferus DSM 20646 con Lb-OB-K6 (DSM 16672), S. ferus DSM 20646 con Lb-OB-K7 (DSM 16673);

S. macacae DSM 20724 con Lb-OB-K1 (DSM 16667), S. macacae DSM 20724 con Lb-OB-K2 (DSM 16668), S. macacae DSM 20724 con Lb-OB-K3 (DSM 16669), S. macacae DSM 20724 con Lb-OB-K4 (DSM 16670), S. macacae DSM 20724 con Lb-OB-K5 (DSM 16671), S. macacae DSM 20724 con Lb-OB-K6 (DSM 16672) and S. macacae DSM 20724 con Lb-OB-K7 (DSM 16673)). Se agregaron 50 Il de la suspension de lactobacillus a 50 Il de mutans Streptococci tefidos en una placa de microtitulacion de 96 pozos. La placa fue sometida a vortex a velocidad total durante 12 minutos. Despues de esto la placa fue centrifugada a 500 xg durante 10 segundos. El sobrenadante fue retirado cuidadosamente y descartado. La pella fue resuspendida en 100 Il de regulador de PBS.

La fluorescencia de la suspension fue medida en un lector de fluorescencia de placa de microtitulacion a una longitud de onda de 495 nm para excitacion y 525 para emision.

Como control se trataron lactobacilos solos asi como mutans Streptococci tefidos y se midieron como se describe. La fluorescencia de fondo medida para los mutans Streptococci respectivos solos fue sustraida del valor medido para la agregacion con el lactobacillus respectivo. Todas las mediciones fueron hechas por triplicado. Los mutans Streptococci fueron agregados por todos los lactobacilos probados (vease Figura 3).

Medios:

Caldo MRS:

Mezcla MRS (Difco, EEUU) pH: Caldo TSY:: 55 g/L 6.5

Mezcla TSY (Difco, EEUU) Extracto de levadura (Deutsche Hefewerke, Alemania): 30 g/L 3 g/L

Regulador:

Regulador de PBS:

Na2HPO4 2H2O 1.5 g/L

KH2PO4 0.2 g/L

NaCl 8.8 g/L

pH ajustado con HCl

Ejemplo 6

Especificidad de la agregacion hacia miembros tipicos de la flora oral

Los cultivos de lactobacilos fueron cultivados como se describe en el Ejemplo 1.

Las bacterias orales -a saber: Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (aislado por OrganoBalance, identificado por AP1 50 CH (Biomerieux, Francia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante); Streptococcus oralis (DSMZ 20066); Streptococcus oralis (DSMZ 20395); Streptococcus oralis (DSMZ 20627); Staphylococcus epidermidis (DSMZ 1798); Staphylococcus epidermidis (DSMZ 20044); Streptococcus mitis (DSMZ 12643); Streptococcus sanguinis (DSMZ 20567) - fueron cultivados en 5 ml de medio BH1 en tubos Falcon cerrados de 15 ml

a 37°C durante la noche. Cada una de las bacterias orales antes mencionadas se mezclo preferiblemente en una relacion volumetrica de 3:1 con cultivos de Lactobacillus y la agregacion se ensayo como en el Ejemplo 4. Para cada prueba de agregacion/no agregacion se utiliza preferiblemente solo una de las bacterias antes mencionadas para determinar inmediatamente el resultado de la prueba.

Como control, se investigo siempre una autoagregacion de la respectiva bacteria oral asi como de las cepas de Lactobacillus probados ejecutando la prueba solamente con los lactobacilos o con las cepas de flora oral agregadas al tubo.

Las cepas L. paracasei ssp. paracasei strains Lb-OB-K1 (DSM 16667), Lb-OB-K2 (DSM 16668), Lb-OB-K3 (DSM 16669), Lb-OB-K4 (DSM 16670), Lb-OB-K5 (DSM 16671), no agregaron las bacterias orales mencionadas anteriormente. Las cepas L. rhamnosus Lb-OB-K6 (DSM 16672) y Lb-OB-K7 (DSM 16673) agregaron el Streptococcus salivarius subespecie thermophilus.

Caldo BH1:

Mezcla BH1 (Difco, EEUU): 37 g/L

pH:: 7.2

Ejemplo 7

Resistencia a la temperatura de la capacidad de agregacion de los lactobacilos

Las bacterias fueron cultivadas como en el Ejemplo 1.

Los cultivos de lactobacilos crecidos fueron incubados a 121°C a 2 bar en vapor saturado durante 20 minutos (sometidos a autoclave). Despues de enfriamiento de los cultivos sometidos a autoclave hasta temperatura ambiente, los lactobacilos fueron mezclados en una relacion volumetrica de 1:3 con cultivos de S. mutans y se probo la agregacion como en el Ejemplo 4 incluyendo los experimentos de control. La agregacion tambien se probo utilizando las bacterias orales como se delineo en el Ejemplo 6.

Se encontro que el comportamiento de agregacion de los lactobacilos no cambio por los procedimiento de sometimiento a autoclave frente a los serotipos de S. mutans o hacia las bacterias orales probados.

Ejemplo 8

Agregacion por lactobacilos inactivados por calor

Los lactobacilos fueron cultivados como se describe en el Ejemplo 1. Los mutans Streptococci fueron cultivados y tefidos como se describe en los Ejemplos 1 y 3. Los cultivos de lactobacilos cultivados se ajustaron a un OD600 de 2 como se describe en el Ejemplo 1. Se incubo 1 ml de esa suspension a 121°C a 2 bar durante 20 minutos (sometido a autoclave). Despues de enfriamiento de los cultivos sometidos a autoclave hasta temperatura ambiente, la agregacion se midio como se describe en el Ejemplo 5 incluyendo experimentos de control. Los lactobacilos inactivados por calor aun agregaron todos los mutans Streptococci.

Ejemplo 9

Dependencia de la agregacion en el valor de pH

Las bacterias fueron cultivadas como en el Ejemplo 1. Se recolectaron 0.5 ml de los lactobacilos y 1.5 ml de S. mutans por centrifugacion a 3200 g durante 10 minutos y se descarto el sobrenadante. Las celulas fueron resuspendidas en su volumen original (0.5 ml y 1.5 ml, respectivamente) en diferentes reguladores de PBS ajustados a diferentes valores de pH. Los valores de pH de los reguladores fueron ajustados a valores de 7.0 hasta

3.0 en etapas de 0.5 unidades de pH. Los cultivos fueron resuspendidos en reguladores del valor de pH respectivo que se utilizo para el ensayo del comportamiento de agregacion.

Despues de esto los lactobacilos fueron mezclados preferiblemente en una relacion volumetrica de 1:3 con cultivos de S. mutans y la agregacion fue probada como en el Ejemplo 4 incluyendo los experimentos de control. No ocurrio agregacion visible de S. mutans por los lactobacilos a valores de pH inferiores a 4.5.

Ejemplo 10

Dependencia de la agregacion en el valor de pH

Los lactobacilos fueron cultivados como se describe en el Ejemplo 1. Los mutans Streptococci fueron cultivados y tefidos como se describe en los Ejemplos 1 y 3. Despues de lo anterior la agregacion fue probada en diferentes valores de pH. Para este proposito se resuspendieron lactobacilos asi como estreptococos en regulador de acetato ajustado al respectivo pH. Los valores de pH probados fueron 4.0, 4.5 y 5.0. La agregacion fue probada como se describe en el Ejemplo 5. No ocurrio agregacion de mutans Streptococci a valores de pH inferiores a 4.5.

Ejemplo 11

Sensibilidad del comportamiento de la agregacion a la liofilizacion

Las bacterias fueron cultivadas como en el Ejemplo 1.

Se cultivaron alicuotas de 1 ml de cultivos de lactobacilos por centrifugacion a 3200 g durante 10 minutos. El sobrenadante fue descartado y las pellas fueron liofilizadas a temperatura ambiente bajo vacio durante dos horas. Las pellas secas resultantes de cada cepa de Lactobacillus probada fueron almacenadas a temperatura ambiente y a 4°C, respectivamente, durante 1 dia, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas y 4 semanas. Despues del tiempo de almacenamiento, las pellas liofilizadas fueron resuspendidas en 1 ml de regulador de PBS, pH 7.0. Los lactobacilos resuspendidos fueron mezclados en una relacion volumetrica de 1:3 con cultivos de S. mutans recien cultivados y se probo la agregacion como en el Ejemplo 4 incluyendo los experimentos de control. El comportamiento de agregacion de los lactobacilos mencionados hacia S. mutans no cambio por la liofilizacion o por los procedimientos de almacenamiento.

Ejemplo 12

Sensibilidad del comportamiento de agregacion a la liofilizacion

Los lactobacilos fueron cultivados como se describe en el Ejemplo 1. Los mutans Streptococci fueron cultivados y tefidos como se describe en los Ejemplos 1 y 3. Los cultivos de lactobacilos cultivados fueron ajustados a un OD600 de 2 como se describe en el Ejemplo 1. 1 mililitro de esa suspension fue liofilizado a temperatura ambiente bajo vacio durante dos horas. Despues de esto, las pellas liofilizadas fueron resuspendidas en 1 ml de regulador PBS. La agregacion fue medida como se describe en el Ejemplo 5, incluyendo experimentos de control. El comportamiento de agregacion de los lactobacilos mencionados hacia mutans Streptococci no cambio con la liofilizacion.

Ejemplo 13

Prueba sobre la resistencia a proteasa

Las bacterias fueron cultivadas como en el Ejemplo 1.

Las proteasas usadas fueron pronasa E, proteinasa K, tripsina, quimotripsina (todas obtenidos de Sigma, Alemania). Se lavaron alicuotas de 1 ml de los lactobacilos en regulador de PBS recolectando las celulas por centrifugacion a 3200 g durante 10 minutos y resuspendiendo la pella en 1 ml de regulador de PBS (pH 7.0). Despues esto las celulas fueron recolectadas de nuevo como se describio anteriormente y resuspendidas en regulador de PBS (pH 7.0) que contenia la proteasa respectiva a una concentracion final de 2.5 mg/ml. La suspension fue incubada durante 1 hora a 37°C. Despues de esto las celulas fueron lavadas y resuspendidas en regulador de PBS (pH 7.0) como se describio anteriormente.

La agregacion fue probada como en el Ejemplo 3 incluyendo los experimentos de control. El comportamiento de agregacion de los lactobacilos mencionados hacia S. mutans no cambio por el tratamiento con ninguna de las proteasas mencionadas.

Ejemplo 14

Susceptibilidad a la proteasa del comportamiento de agregacion de los lactobacilos

Los lactobacilos fueron cultivados como se describio en el Ejemplo 1. Los mutans Streptococci fueron cultivados y tefidos como se describe en los Ejemplos 1 y 3. Las proteasas usadas fueron pronasa E, proteinasa K, tripsina, quimotripsina (todas obtenidas de Sigma, Alemania). Se lavaron alicuotas de 1 ml de los lactobacilos en regulador de PBS recolectando las celulas por centrifugacion a 3200 x g durante 10 minutos y resuspendiendo la pella en 1 ml de regulador de PBS (pH 7.0). Despues de esto las celulas fueron recolectadas de nuevo como se describio anteriormente y resuspendidas en regulador de PBS (pH 7.0) que contenia la proteasa respectiva a una concentracion final de 2.5 mg/ml. La suspension fue incubada durante 1 hora a 37°C. Despues de esto, las celulas fueron lavadas y resuspendidas en regulador de PBS (pH 7.0) como se describio anteriormente. La agregacion fue probada como se describe en el Ejemplo 5 incluyendo experimentos de control. El comportamiento de agregacion de los lactobacilos hacia mutans Streptococci no fue cambiado por el tratamiento con ninguna de las proteasas mencionadas.

Ejemplo 15

Dependencia frente a los iones del comportamiento de agregacion

Las bacterias fueron cultivadas como en el Ejemplo 1.

Se lavaron alicuotas de 1 ml de los lactobacilos en 1 ml de solucion de EDTA 200 mM dos veces como se describio anteriormente. Despues de esto las celulas fueron recolectadas y resuspendidas en 1 ml de regulador de PBS (pH 7.0). La agregacion fue probada como en el Ejemplo 4 y se observo una perdida completa de la capacidad de agregacion. La resuspension de los lactobacilos en 1 ml de una solucion de calcio 2 mM despues del lavado de dos veces en solucion de EDTA 200 mM restauro la capacidad de agregar S. mutans. La resuspension de las celulas lavadas de EDTA en solucion de magnesio hasta 100 mM no restauro la capacidad para agregar S. mutans.

Ejemplo 16

Dependencia frente a iones del comportamiento de agregacion

Los lactobacilos fueron cultivados como se describe en el Ejemplo 1. Los mutans Streptococci fueron cultivados y tefidos como se describe en los Ejemplos 1 y 3. Se lavaron alicuotas de 1 ml de los lactobacilos en 1 ml de solucion de EDTA 200 mM dos veces como se describio anteriormente. Despues de esto las celulas fueron recolectadas y resuspendidas en 1 ml de regulador de PBS (pH 7.0).

La agregacion fue probada como se describe en el Ejemplo 5 y se observo la perdida completa de la capacidad de agregacion. La resuspension de los lactobacilos en 1 ml de una solucion de calcio 2 mM despues del lavado dos veces en solucion de EDTA 200 mM restauro la capacidad de agregar S. mutans. La resuspension de las celulas lavadas de EDTA en solucion de magnesio hasta 100 mM no restauro la capacidad para agregar mutans Streptococci.

Ejemplo 17

Prueba de agregacion en presencia de saliva

Las bacterias fueron cultivadas como en el Ejemplo 1. Se recolectaron alicuotas de 2 ml de cultivos de S. mutans tal como se describio anteriormente y se resuspendieron en 2 ml de saliva. La saliva fue provista por dos voluntarios y usada inmediatamente despues la obtencion. La agregacion fue probada como en el Ejemplo 4.

El comportamiento de agregacion de los lactobacilos mencionados hacia S. mutans no cambio en presencia de saliva.

Ejemplo 18

Agregacion de mutans Streptococci en presencia de saliva

Se tomo una muestra de saliva fresca de voluntarios. El flujo de saliva fue inducido masticando goma de mascar libre de azucar. Los voluntarios recolectaron 15 ml de saliva con cada muestra. La saliva recien recolectada fue diluida 1:2 con regulador de PBS para el procedimiento de ensayo. Los lactobacilos y los mutans Streptococci fueron cultivados como se describe en el Ejemplo 1. Los mutans Streptococci fueron tefidos como se describe en el Ejemplo 3, excepto que despues del procedimiento de tincion las celulas tefidas fueron resuspendidas en saliva, en vez de regulador PBS. La agregacion se midio como se describe en el Ejemplo 5 incluyendo experimentos de control. La presencia de la saliva no inhibio la agregacion.

Ejemplo 19

Composicion para tableta (1)

La composicion para tableta se prepara preferiblemente como se describe en el Ejemplo 4 de la pagina 8 de DE-C2 36 45 147, en donde, ademas de los ingredientes mencionados en dicho Ejemplo 4, el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico se agrega en una cantidad de 102 hasta 1012, preferiblemente 103 hasta 108 celulas por mg de la tableta.

Ejemplo 20

Composicion para tableta (11)

La composicion para tableta se prepara preferiblemente como se describe en el Ejemplo 5 en la pagina 8 de DE-C2 36 45 147, en donde, ademas de los ingredientes mencionados en dicho Ejemplo 5, el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico se agrega en una cantidad de 102 hasta 1012, preferiblemente 103 hasta 108 celulas por mg de la tableta.

Ejemplo 21

Composicion dentifrica

La composicion dentifrica se prepara preferiblemente como se describe en el Ejemplo 3 de la pagina 8 de DE-C2 36 45 147, en donde, ademas de los ingredientes mencionados en dicho Ejemplo 3, el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico se agrega en una cantidad de 102 hasta 1012, preferiblemente 103 hasta 108 celulas por mg del dentifrico.

Ejemplo 22

Composicion dentifrica basada en tiza

La composicion dentifrica basada en tiza se prepara preferiblemente como se describe en el capitulo 7.1.4.4 "Rezepturbeispiel" en la pagina 205 del libro de texto "Kosmetik", W. Umbach (editor), 2nd edition, Thierne Verlag, 1995, en donde ademas de los ingredientes mencionados en dicho capitulo de la pagina 205, el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico se agrega en una cantidad de 102 hasta 1012, preferiblemente 103 hasta 108 celulas por mg de dentifrico basado en tiza.

Ejemplo 23

Dentifrico en gel sobre la base de acido silicico/fluoruro de sodio

El dentifrico en gel sobre la base de una composicion dentifrica de acido silicico/fluoruro de sodio se prepara preferiblemente como se describe en el capitulo 7.1.4.4 " Rezepturbeispiel" en la pagina 205 del libro de texto "Kosmetik", W. Umbach (editor), 2nd edition, Thieme Verlag. 1995, en donde, ademas de los ingredientes mencionados en dicho capitulo en la pagina 205, el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico se agrega en una cantidad de 102 a 1012, preferiblemente 103 hasta 108 celulas por mg del dentifrico en gel con base de acido silicico/fluoruro de sodio.

Ejemplo 24

Composicion dentifrica contra tartaro

La composicion dentifrica contra tartaro se prepara preferiblemente como se describe en el capitulo 7.1.4.4 "Rezepturbeispiel" en la pagina 206 del libro de texto "Kosmetik", W. Umbach (editor), 2nd edition, Thieme Verlag, 1995, en donde, ademas de los ingredientes mencionados en dicho capitulo en la pagina 206, el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico se agrega en una cantidad de 102 hasta 1012, preferiblemente 103 hasta 108 celulas por mg del dentifrico contra tartaro.

Ejemplo 25

Composicion de goma de mascar

La composicion de goma de mascar se prepara preferiblemente como se describe en el Ejemplo 6 en la pagina 9 de DE-C2 36 45 147, en donde, ademas de los ingredientes mencionados en dicho Ejemplo 6, el microorganismo mencionado anteriormente pertenecientes al grupo de las bacterias de acido lactico se agregan en una cantidad de 102 hasta 1012, preferiblemente 103 hasta 108 celulas por mg de la goma de mascar.

Ejemplo 26

Composicion concentrada para lavado bucal

La composicion concentrada para lavado bucal se prepara preferiblemente como se describe en el capitulo 7.1.4.4 "Rezepturbeispiel" de la pagina 206 del libro de texto "Kosmetik", W. Umbach (editor), 2nd edition, Thieme Verlag, 1995, en donde, ademas de los ingredientes mencionados en dicho capitulo en la pagina 206, el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico se agrega en una cantidad de 102 hasta 1013 celulas por ml de la composicion concentrada para lavado bucal.

Ejemplo 27

Preparacion de pelicula Preparacion de peliculas:

1. fase acuosa

-: calentar agua a 60°C

-: aspartame (endulzante) se agrega bajo agitacion

-: el aspartame se disuelve completamente

-: se agregan un formador de pelicula polimerico soluble en agua, como, por ejemplo, Kollicoat 1R (polietilen glicol o polivinil alcohol) o PVP (polivinilpirrolidona) o polimeros naturales tales como alginatos bajo agitacion hasta que se disuelven

-: despues de 10 minutos, se retira el resto de la espuma

-: el microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico puede agregarse en una cantidad de 102 hasta 1012, preferiblemente 103 hasta 108 celulas por pelicula de aroma final se agrega despues de enfriar la mezcla; alternativamente, el mutante o derivado del microorganismo antes mencionado perteneciente al

5 grupo de las bacterias del acido lactico o un analogo o fragmento del microorganismo antes mencionado perteneciente al grupo de las bacterias del acido lactico.

2. fase oleosa

-: se disuelve mentol en aceite de menta

-: se agrega polisorbato 80 a la mezcla aceite de menta - mentol - bajo agitacion 10 - esta mezcla se agrega a propilen glicol bajo agitacion

-: pueden agregarse colorantes opcionales (tales como pigmentos, escamas)

3.

-: bajo agitacion la fase oleosa se mezcla lentamente con la fase acuosa

4.

15 - las peliculas se generan mecanicamente utilizando un dispositivo de corte Formulaciones de muestra:

formulacion 1: formulacion 11

peso [g]: Composicion en pelicula [%] peso [g] Composicion en pelicula [%]

FaseI aspartame Kollicoat 1R acido ascorbico sabor de cereza agua desmineralizada: 0.7 35.0 -85.0 1.4 68.5 -- 0.7 25.0 1.0 6.0 80.0 1.8 65.8 2.6 15.8

Fase�II mentol aceite de menta polisorbat 80 propilen glicol escamas verdes escamas de azorrubina: 1.4 5.6 0.7 7.0 0.7 - 2.7 11.0 1.4 13.7 1.4 - ---5.0 -0.3 13.2 0.8

peso [g]: Composicion en pelicula [%] peso [g] Composicion en pelicula [%]

Suma Contenido de solidos: 136.1 51.1 100.0 118.0 38.0 100.0

Se entiende que la especificacion y ejemplos deben considerarse a manera de ejemplo solamente con el alcance verdadero de la invencion indicado por las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de un microorganismo perteneciente al genero Lactobacillus o un mutante o derivado del mismo, caracterizado porque es capaz de unirse especificamente a una bacteria perteneciente al grupo de mutans Streptococci, en donde la union especifica es

(i)

resistente al tratamiento por calor, en donde dicho tratamiento por calor se lleva a cabo a una temperatura de mas de 95°C durante al menos 20 minutos; y

(ii)

resistente al tratamiento con proteasa, en donde dicho tratamiento con proteasa es un tratamiento con una proteasa seleccionada del grupo consistente de pronasa E, proteinasa K , tripsina y quimiotripsina; y

(iii) dependiente del calcio; y

(iv)

formado dentro de un rango de pH entre 4.5 y 8.5; y

(v)

formado en la presencia de saliva,

para la preparacion de una composicion anticariogenica para el tratamiento o prevencion de caries causada por Streptococcus sobrinus uniendose a dicho Streptococcus sobrinus,

en donde dicho derivado del microorganismo es una forma inactiva de dicho microorganismo o un fragmento de dicho microorganismo, siendo inactivado dicho microorganismo termicamente o liofilizado, en donde dicho fragmento es una fraccion de membrana obtenida mediante la preparacion de una membrana y en donde dicha forma inactivada o dicho fragmento retiene la capacidad de unirse especificamente a una bacteria perteneciente al grupo de mutans Streptococci.
2. El uso de la reivindicacion 1, en donde la union especifica puede probarse como sigue:

(a)

cultivar dicho microorganismo en una fase estacionaria;

(b)

mezclar dicho microorganismo con una bacteria perteneciente al grupo de mutans Streptococci la cual ha sido cultivada en fase estacionaria;

(c)

incubar la mezcla obtenida en la etapa (b) bajo condiciones que permiten la formacion de agregados de dicho microorganismo y una bacteria del grupo de mutans Streptococci; y

(d)

detectar agregados mediante la presencia de una pella.
3.

El uso de la reivindicacion 1 o 2, en donde dicho microorganismo es un Lactobacillus paracasei seleccionado del grupo consistente de Lactobacillus paracasei que tiene numero de acceso DSMZ DSM 16667, numero de acceso DSMZ DSM 16668, numero de acceso DSMZ DSM 16669, numero de acceso DSMZ DSM 16670 y numero de acceso DSMZ DSM 16671, o un mutante o derivado del mismo, en donde dicho mutante o derivado retiene la capacidad de unirse a una bacteria perteneciente al grupo de mutans Streptococci, o en donde dicho Lactobacillus es un Lactobacillus rhamnosus seleccionado del grupo consistente de Lactobacillus rhamnosus que tiene un numero de acceso DSMZ DSM 16672 y numero de acceso DSMZ DSM 16673 o un mutante o derivado del mismo, en donde dicho mutante o derivado retiene la capacidad de unirse a una bacteria que pertenece al grupo de mutans Streptococci.
4.

El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho microorganismo es capaz de unirse a al menos una bacteria seleccionada del grupo consistente de Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Streptococcus cricatus, Streptococcus ratti, Streptococcus ferus y Streptococcus macacae.
5.

El uso de la reivindicacion 4, en donde dicho microorganismo es capaz de unirse a

(a)

Streptococcus mutans serotipo c (DSMZ 20523) y/o serotipo e (NCTC 10923) y serotipo f (NCTC 11060), o

(b)

Streptococcus sobrinus DSM 20742, o

(c)

Streptococcus ratti DSM 20564, o

(d)

Streptococcus cricetus DSM 20562, o

(e)

Streptococcus ferus DSM 20646, o

(f)

Streptococcus macacae DSM 20714.
6.

El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha composicion anticariogenica es una composicion cosmetica o farmaceutica, la cual adicionalmente comprende un vehiculo o excipiente farmaceutica u oralmente aceptable.
7.

El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en dicha composicion anticariogenica es un dentifrico, goma de mascar, tableta, lavado bucal, enjuague bucal, hilo dental o cinta dental, o es un producto alimenticio o de pienso anticariogenico, o es un aditivo para alimento, pienso o bebidas.

Figura 1

Figura 2

Figura 3