CH704106B1 - Procédé d'isolation et de purification de monsialoganglioside GM1 pour un usage medical. - Google Patents

Abstract

La présente invention met à disposition un procédé pour préparer le monosialoganglioside GM1 pur sous la forme de son sel de sodium. On met à disposition un procédé pour l’isolation et la purification du ganglioside GM1, comprenant (a) la séparation de GM1 à partir d’un mélange lipidique contenant le monosialoganglioside GM1 en tant que composant ganglioside principal par chromatographie sur colonne échangeuse d’ions utilisant un éluant comprenant des ions potassium ou césium, (b) la récupération du soluté à partir de la solution éluée, (c) la diafiltration d’une solution aqueuse du soluté récupéré, et (d) une deuxième diafiltration après l’addition de NaCl 1 M, et la récupération de GM1. La pureté du GM1 obtenu est supérieure à 99,0%.

Description

[0001] La présente invention concerne le monosialoganglioside GM1, plus particulièrement des procédés pour obtenir et purifier le monosialoganglioside GM1.

Contexte

[0002] Les gangliosides constituent une classe de glycosphingolipides, ayant un ou plusieurs résidus d’acide sialique, que l’on trouve en abondance dans le tissu cérébral et nerveux des humains et des animaux. Le monosialoganglioside GM1 est connu pour un certain nombre d’applications pharmaceutiques, en particulier dans la réparation et le traitement de troubles des systèmes nerveux central et périphérique.

[0003] Les gangliosides sont commodément extraits à partir de tissu cérébral de bovin ou de porcin conformément au document US 4 849 413. Afin de convenir à des applications pharmaceutiques, le monosialoganglioside GM1 doit ensuite être isolé et purifié.

[0004] On sait traiter le mélange lipidique extrait par des procédés chimiques ou enzymatiques pour transformer d’autres composants gangliosides en le monosialoganglioside GM1, afin d’augmenter le rendement en monosialoganglioside GM1. Ces procédés comprennent une hydrolyse acide avec un acide faible, telle que décrite dans le document CN 1 353 112, ou une hydrolyse enzymatique utilisant une sialidase, par exemple telle que décrite dans le document US 5 296 360.

[0005] Une purification supplémentaire de ce mélange lipidique enrichi en GM1 par chromatographie par exclusion utilisant comme éluant du chloroforme/méthanol/eau 60/30/4,5 est décrite dans le document EP 0 150 712. Le document EP 0 489 352 décrit la purification d’un mélange lipidique enrichi en GM1 par ultrafiltration d’une solution du mélange lipidique avec de l’α-cyclodextrine, suivie d’une extraction de GM1 par extraction au solvant avec de l’éthanol. Il est rapporté que le GM1 peut être obtenu avec une pureté de 95%.

[0006] Ces procédés se sont antérieurement avérés avoir des inconvénients en ce qui concerne la pureté en GM1 et son rendement, et en ce qui concerne le coût, le rendement économique et l’efficacité quand ils sont appliqués à l’échelle industrielle.

[0007] Pour des applications pharmaceutiques, il est nécessaire de produire le ganglioside GM1 avec une pureté élevée. Par conséquent, on a encore besoin de procédés pour obtenir le ganglioside GM1 avec une pureté élevée.

[0008] Les inventeurs de la présente demande ont trouvé, de façon surprenante, que le ganglioside GM1 peut être efficacement séparé des autres gangliosides par un procédé basé sur une chromatographie par échange d’ions.

[0009] Conformément à la présente invention, on a trouvé que le ganglioside GM1 peut être préparé avec une pureté élevée par un procédé dans lequel GM1 est séparé à partir d’un mélange lipidique contenant le monosialoganglioside GM1 en tant que composant ganglioside principal par chromatographie sur colonne échangeuse d’ions utilisant un éluant comprenant des ions potassium ou césium.

[0010] Conformément à la présente invention, on met à disposition un procédé pour l’isolation et la purification du ganglioside GM1, selon la revendication 1.

[0011] Conformément à un mode de réalisation préféré de la présente invention, on met à disposition un procédé comprenant les étapes générales suivantes: (a) séparation de GM1 à partir d’un mélange lipidique contenant le monosialoganglioside GM1 en tant que composant ganglioside principal par chromatographie sur colonne échangeuse d’ions utilisant un éluant comprenant des ions potassium ou césium, (b) récupération du soluté à partir de la solution éluée, (c) diafiltration d’une solution aqueuse du soluté récupéré, (d) addition d’un sel de sodium et diafiltration de la solution résultante, et (e) récupération de GM1.

[0012] Avantageusement, le procédé de la présente invention permet la préparation du monoganglioside GM1 avec une pureté élevée. Conformément à la présente invention, le monosialoganglioside GM1 peut être préparé avec une pureté supérieure à 98%, même supérieure à 99,0% et même de 99,9%.

[0013] En outre, le procédé de la présente invention utilise avantageusement des étapes simples, est économiquement rentable, et convient pour une application à l’échelle industrielle.

[0014] D’autres objets et avantages de la présente invention apparaîtront de façon évidente à partir des revendications et à partir de la description détaillée qui suit et des exemples.

Description détaillée

[0015] La présente invention met à disposition un procédé pour la purification du monoganglioside GM1, dans lequel le GM1 est séparé d’un mélange lipidique contenant le monosialoganglioside GM1 en tant que composant ganglioside principal par chromatographie sur colonne échangeuse d’ions utilisant un éluant comprenant des ions potassium ou césium.

[0016] Dans un mode de réalisation préféré, on met à disposition un procédé pour préparer le monosialoganglioside GM1 avec une pureté élevée, comprenant les étapes suivantes: (a) séparation de GM1 à partir d’un mélange lipidique contenant le monosialoganglioside GM1 en tant que composant ganglioside principal par chromatographie sur colonne échangeuse d’ions utilisant un éluant comprenant des ions potassium ou césium, (b) récupération du soluté à partir de la solution éluée de l’étape (a), (c) diafiltration d’une solution aqueuse du soluté récupéré de l’étape (b), afin d’éliminer les sels de potassium ou de césium résiduels, (d) addition d’ions sodium, de préférence sous la forme d’un sel de sodium convenable, afin de déplacer les ions potassium ou césium liés à GM1, et diafiltration de la solution aqueuse, afin d’éliminer le sel de sodium résiduel, et (e) récupération de GM1 sous la forme de son sel de sodium.

[0017] Le mélange lipidique peut être préparé à partir d’extrait lipidique brut de tissu cérébral de bovin, d’ovin, d’équin ou de porcin.

[0018] Avantageusement, le mélange lipidique contenant le monoganglioside GM1 en tant que composant ganglioside principal peut être préparé à partir d’un extrait lipidique contenant au moins 30%, de préférence au moins 50% et mieux encore au moins 70% d’un mélange de gangliosides. Le reste de l’extrait lipidique peut généralement être composé de sulfatides, de cérébrosides, d’acides gras et de protéines.

[0019] L’extrait lipidique peut avantageusement être d’abord soumis à une diafiltration sur une membrane ayant une taille de pores de 10 000 à 100 000 Daltons, de préférence d’environ 50 000 Daltons, servant à dessaler la solution. Pour la diafiltration, on peut utiliser n’importe quelle membrane de dialyse conventionnelle. Avantageusement, on peut utiliser des cassettes filtrantes, par exemple les cassettes de type polysulfone SARTOCON<®> (Sartorius), par exemple avec une séparation à environ 50 000 Daltons.

[0020] De préférence, l’extrait lipidique est soumis à un traitement d’hydrolyse destiné à transformer d’autres composants gangliosides majeurs, tels que GT1b, GD1a, et GD1b, en GM1 afin que la teneur en GM1 soit augmentée.

[0021] L’hydrolyse peut être mise en œuvre par des procédés conventionnels. Avantageusement, l’hydrolyse peut être mise en œuvre par utilisation de l’un ou l’autre de deux procédés généraux d’hydrolyse de gangliosides, connus dans la littérature, à savoir l’hydrolyse acide ou l’hydrolyse enzymatique.

[0022] L’hydrolyse acide peut être mise en œuvre, par exemple, au moyen d’un acide minéral dilué, tel que l’acide chlorhydrique, l’acide sulfurique ou l’acide nitrique dilué. L’hydrolyse acide peut être effectuée par ajustement du pH d’une solution aqueuse de l’extrait lipidique à un pH compris entre 3,5 et 5, de préférence d’environ 4,0, et chauffage de la solution à une température de préférence comprise entre 90 °C et 100 °C pendant le temps nécessaire pour que la conversion des autres composants gangliosides majeurs en GM1 soit complétée. Le temps nécessaire pour hydrolyser les gangliosides majeurs en GM1 dépend du pH et de la température choisis. En général, le temps requis pour terminer l’hydrolyse est d’autant plus long que le pH est élevé, et le temps requis pour terminer l’hydrolyse est d’autant plus court que la température réactionnelle est élevée. La réaction d’hydrolyse peut généralement être effectuée sur 2 à 5 heures. Par exemple, lorsque l’hydrolyse est effectuée à pH 4,0 et à 95 °C, le temps requis pour terminer la réaction d’hydrolyse est d’environ 3 heures.

[0023] L’hydrolyse enzymatique peut être mise en œuvre par utilisation de n’importe quelle sialidase convenable. On peut de préférence utiliser la souche S de sialidase d’Arthrobacter ureafaciens ou la sialidase de Vibrio cholerae. Avantageusement, la souche S de sialidase d’Arthrobacter ureafaciens et la sialidase de Vibrio cholerae sont actives sur GT1a, GD2a, GD1b mais pas sur GM1. L’hydrolyse enzymatique peut être mise en œuvre, par exemple, par ajustement du pH d’une solution aqueuse de l’extrait lipidique à un pH auquel l’enzyme utilisée a une activité optimale, par exemple entre pH 4 et pH 6, par exemple à un pH d’environ 5, par addition d’un tampon convenable, tel qu’un tampon acétate, addition d’ions Ca<2+>dans le cas où la sialidase est une sialidase de Vibrio cholerae, et chauffage de la solution à une température à laquelle l’enzyme utilisée a une activité optimale, par exemple environ 37 °C, pendant le temps nécessaire pour que la transformation soit terminée. L’hydrolyse peut généralement être effectuée sur 12–24 heures, en fonction des unités enzymatiques ajoutées.

[0024] L’hydrolyse acide est moins préférée, puisqu’il s’agit d’un procédé d’hydrolyse non spécifique, et donne généralement un moindre rendement en GM1 du fait d’une conversion en d’autres gangliosides. En outre, le procédé d’hydrolyse acide conduit à la formation d’impuretés asialo-GM1.

[0025] Les procédés d’hydrolyse enzymatique sont préférés parce qu’ils donnent généralement un meilleur rendement en GM1 du fait de la spécificité élevée de la transformation chimique. Pour l’hydrolyse enzymatique, on préfère la sialidase d’Arthrobacter ureafaciens parce qu’elle ne requiert pas l’addition d’ions Ca<2+> pour son activité. En outre, du fait de son poids moléculaire de 52 000 Daltons (comparé aux 82 000 Daltons de la sialidase de Vibrio cholerae), elle peut avantageusement être chassée par diafiltration.

[0026] Afin de récupérer le mélange lipidique ainsi produit ayant une teneur amplifiée en le monosialoganglioside GM1 à partir de la solution réactionnelle, on peut avantageusement soumettre la solution réactionnelle à une diafiltration, par exemple à travers une membrane ayant une taille de pores de 10 000 à 100 000 Daltons, de préférence d’environ 50 000 Daltons. Pour la diafiltration, on peut utiliser n’importe quelle membrane de dialyse conventionnelle. Avantageusement, on peut utiliser des cassettes filtrantes, par exemple les cassettes de polysulfone SARTOCON<®> (Sartorius), de préférence avec une séparation à environ 50 000 Daltons. On peut ensuite sécher le perméat pour obtenir une poudre du mélange lipidique contenant le monosialoganglioside GM1 en tant que composant ganglioside principal. Le séchage peut être réalisé par des procédés conventionnels. Avantageusement, le séchage peut être réalisé par séchage par pulvérisation ou par séchage sous vide.

[0027] Le mélange lipidique peut généralement avoir une concentration de GM1 de 10 à 200 g/l et de préférence d’au moins 100 g/l.

[0028] Conformément au procédé de la présente invention, le ganglioside GM1 est séparé des autres gangliosides dans le mélange lipidique au moyen d’une chromatographie par échange d’ions.

[0029] On a trouvé de façon surprenante que lorsqu’on utilise un éluant contenant des ions césium ou potassium, il est possible de séparer avec succès le GM1 des autres monosialogangliosides.

[0030] Les techniques d’échange d’ions classiquement utilisées s’avèrent généralement ne pas permettre une séparation efficace du GM1 à partir des autres monosialogangliosides. On note en particulier le monosialoganglioside fucosyl-GM1, qui est présent en tant qu’impureté ganglioside majeure dans le mélange lipidique de porcin produit par les traitements d’hydrolyse connus.

[0031] Les deux molécules de GM1 et de fucosyl-GM1 ont des propriétés physiques très similaires. Les deux ont une seule charge négative, conférée par le groupe carboxyle de l’acide sialique, et ont des masses moléculaires similaires, de 1558 et 1704 respectivement. Par conséquent, quand elles sont chargées sur une colonne échangeuse d’ions pré-équilibrée, la force de liaison des deux gangliosides avec la résine est identique.

[0032] On a observé que lorsque l’on ajoute de l’acétate de sodium à l’éluant afin d’augmenter la force ionique de l’éluant, et obtenir des conditions pour le déplacement des gangliosides, tant le GM1 que le fucosyl-GM1 sont élués en même temps avec la même force ionique. On ne peut obtenir aucune séparation des deux monosialogangliosides.

[0033] Cependant les présents inventeurs ont trouvé, de façon surprenante, que lorsqu’on utilise des ions césium ou potassium, par exemple par l’addition de potassium méthanolique ou d’acétate de césium, le GM1 et le fucosyl-GM1 sont élués séparément, le fucosyl-GM1 étant élué en premier. La séparation est complète, et chacun des gangliosides GM1 et fucosyl-GM1 peut être isolé.

[0034] Sans vouloir être liés par une théorie quelconque, les inventeurs de la présente invention considèrent que la séparation observée peut être attribuée au fait que, contrairement à la théorie d’échange d’ions conventionnelle, les solutés de GM1 et fucosyl-GM1 sont libérés dans la colonne non seulement dans l’ordre de leur force de liaison avec la résine, mais aussi dans l’ordre de leur affinité pour le contre-ion auquel ils doivent se lier afin d’être détachés du gel. Par conséquent, suivant cette théorie, si l’un des deux solutés a une affinité différente pour le contre-ion, alors les solutés vont être libérés avec deux forces ioniques différentes, et une purification peut avoir lieu.

[0035] Les présents inventeurs ont trouvé, de façon surprenante, que les monosialogangliosides GM1 et Fuc-GM1 ont la même affinité pour le sodium mais n’ont pas la même affinité pour le potassium ou le césium, en dépit du fait que tous les trois métaux appartiennent au même groupe. Les présents inventeurs ont trouvé que Fuc-GM1 a une plus forte affinité que GM1 pour le potassium et le césium, et est élué en premier.

[0036] Le procédé de chromatographie par échange d’ions de la présente invention permet avantageusement de séparer efficacement le GM1 du fucosyl-GM1. En outre, le procédé de la présente invention permet aussi avantageusement de séparer le GM1 d’acides gras correspondants, les acides gras ayant la même charge que le ganglioside, mais une plus forte affinité pour les ions césium ou potassium.

[0037] Pour la chromatographie par échange d’ions, on peut utiliser n’importe quelle résine convenable. Avantageusement, on peut utiliser une résine ayant un groupe amino quaternaire, par exemple FRACTOGEL<®> EMD TMAE (S) ou des résines Sepharose, par exemple des résines Q-Sepharose HP.

[0038] Dans une première étape, la résine est équilibrée avec un solvant convenable. Des solvants convenables comprennent l’éthanol, le méthanol ou un mélange de méthanol et de chloroforme. De préférence le solvant est le méthanol, parce qu’il s’agit d’un solvant dans lequel les gangliosides et les sels de potassium et de césium sont solubles.

[0039] La colonne peut ensuite être chargée avec une solution du mélange lipidique dans un solvant d’élution convenable. Le solvant d’élution devrait contenir les mêmes composants solvants que le solvant utilisé pour l’équilibrage de la résine. De préférence le solvant choisi est le méthanol. Une élution préliminaire avec le solvant d’élution permet l’élution de substances non liées, par exemple les cérébrosides.

[0040] Des ions potassium ou césium sont ensuite ajoutés au solvant d’élution. Les ions potassium ou césium sont de préférence apportés sous la forme d’une solution méthanolique d’acétate, formiate, propionate de potassium ou césium, ou sous la forme d’un sel d’un autre acide organique. On préfère une solution méthanolique d’acétate de sodium ou de potassium. Avantageusement l’acétate de potassium ou de césium peut être présent dans l’éluant en une quantité suffisante pour conférer à l’éluant une conductivité de 1100 à 1400 µS/cm, de préférence une conductivité de 1200–1300 µS/cm. Cette solution d’éluant contenant un sel de sodium ou de potassium peut traverser la colonne de manière isocratique à n’importe quel débit convenable, par exemple à un débit compris entre 100 ml/h et 140 ml/h.

[0041] Quand on effectue la séparation en utilisant le procédé de chromatographie par échange d’ions selon la présente invention, les acides gras et le Fuc-GM1 sont élués avant le GM1, tandis que les sulfatides qui restent liés à la colonne peuvent être éluée durant le lavage de la colonne.

[0042] L’éluant contenant le GM1 est collecté et, avantageusement, le solvant d’élution élué à partir de la colonne peut être récupéré par distillation.

[0043] On peut récupérer le soluté contenant le GM1 en séchant la solution d’éluant pour produire une poudre contenant le GM1. Le séchage peut être effectué par des procédés conventionnels, par exemple par séchage par pulvérisation ou par séchage sous vide.

[0044] Le soluté contenant le GM1 peut ensuite être purifié par diafiltration d’une solution aqueuse de celui-ci sur une membrane ayant une taille de pores de 10 000 à 100 000 Daltons, de préférence d’environ 50 000 Daltons, afin que soient éliminés les sels de potassium ou de césium résiduels.

[0045] On peut éventuellement ajouter à la solution un acide minéral, tel qu’une solution aqueuse d’acide sulfurique, d’acide nitrique ou de préférence d’acide chlorhydrique, pour ajuster le pH entre 6 et 8, de préférence à environ 7, avant la diafiltration.

[0046] On peut ensuite ajouter des ions sodium, convenablement sous la forme d’une solution aqueuse d’un sel de sodium, de préférence NaCl, afin de déplacer les ions potassium ou césium liés à GM1, et d’obtenir le GM1 sous la forme du sel de sodium physiologique. On peut ensuite soumettre la solution à une deuxième diafiltration afin d’éliminer le sel résiduel (par exemple NaCl) en utilisant une membrane ayant une taille de pores de 10 000 à 100 000 Daltons, de préférence d’environ 50 000 Daltons. Avantageusement, on peut utiliser des cassettes filtrantes, par exemple les cassettes de type polysulfone SARTOCON<®> (Sartorius), de préférence avec une séparation à environ 50 000 Daltons.

[0047] On peut ensuite sécher la solution pour récupérer le GM1 sous la forme d’une poudre. Le séchage peut être effectué par des procédés conventionnels. Avantageusement, le séchage peut être effectué par séchage par pulvérisation ou par séchage sous vide.

[0048] Le GM1 obtenu conformément à la présente invention a un degré de pureté de 98% ou plus, généralement d’environ 99,0 à 99,9%. Le GM1 obtenu conformément au procédé de la présente invention contient moins de 0,1% d’impureté fucosyl-GM1.

[0049] Le procédé de la présente invention permet de séparer efficacement le GM1 des autres monosialogangliosides. En particulier, le procédé de la présente invention permet de séparer le GM1 de l’impureté fucosyl-GM1.

[0050] Avantageusement, le procédé de la présente invention permet la préparation du monosialoganglioside GM1 avec un bon rendement et une pureté élevée.

[0051] Le GM1 purifié conformément au procédé de la présente invention peut être utilisé dans le traitement de sujets humains ou animaux. En particulier, le GM1 purifié selon la présente invention est envisagé pour le traitement d’humains ou de mammifères, en particulier pour la réparation et le traitement de troubles et maladies des systèmes nerveux central et périphérique, y compris un accident cérébro-vasculaire, la maladie de Parkinson, les lésions de la moelle épinière, la maladie d’Alzheimer, la dyskinésie tardive, la sclérose latérale amyotrophique, les neuropathies périphériques et les neuropathies du système autonome.

[0052] La présente invention est davantage illustrée par les exemples qui suivent.

Exemples

Exemple 1

Préparation d’un mélange lipidique contenant le monosialoganglioside GM1 en tant que ganglioside principal

[0053] On dissout un extrait lipidique, contenant un mélange de gangliosides ayant une pureté de 70%, dans de l’eau purifiée à une concentration d’environ 25 g/l. On soumet ensuite cette solution à une diafiltration sur des cassettes filtrantes en polysulfone SARTOCON<®> (Sartorius) ayant une séparation à 50 000 Daltons.

[0054] On équilibre ensuite 200 litres de la solution à pH 5,5 en ajoutant du tampon acétate 50 mM et du chlorure de calcium 4 mM. On ajoute 30 000 U de sialidase de Vibrio cholerae et on chauffe la solution à 37 °C pendant 12 heures pour compléter la transformation d’autres gangliosides majeurs (GT1b, GD1a, GD1b) en GM1. La solution résultante a une concentration de GM1 de 14–15 g/l.

[0055] Après l’hydrolyse enzymatique, on soumet la solution à une diafiltration sur des cassettes filtrantes ayant une séparation à 50 000 Daltons. On ajoute ensuite du NaCl 1 M au rétentat et on soumet la solution à une deuxième diafiltration. Après la deuxième diafiltration, on concentre le rétentat à une concentration de GM1 de 100 g/l en laissant le perméat s’écouler sans aucun remplacement d’eau. Ensuite, on sèche la solution sous vide, et l’on obtient environ 3200 g d’une poudre ayant une concentration de GM1, mesurée par CLHP, de 85%.

Purification de GM1 à partir d’un mélange lipidique contenant le monosialoganglioside GM1 en tant que ganglioside principal

[0056] On prépare une solution méthanolique à une concentration de 10 g/l en utilisant la poudre obtenue dans l’étape précédente, et on filtre la solution sur un filtre à cartouche Sartopore de 0,22 µm (fabriqué par Sartorius AG).

[0057] Pour chaque cycle, on charge ensuite 7 litres de la solution filtrée sur une colonne de CLFP contenant 20 litres de résine Fractogel<®> EMD TMAE (S) équilibrée dans du méthanol. On élué ensuite la colonne avec une solution méthanolique de méthanol/acétate de potassium ayant une conductivité de 1200–1300 µs/cm, à un débit de 120 litres/heure. On répète les cycles jusqu’à la fin de la solution de GM1.

[0058] On concentre l’éluat (environ 60–70 litres) par distillation en continu, puis on le sèche pour obtenir une poudre, et on récupère le méthanol. La poudre ainsi obtenue est un mélange de GM1 pur et d’acétate de potassium.

[0059] On dissout la poudre ainsi obtenue dans de l’eau purifiée à une concentration de 25 g/l, et on l’équilibre à pH 7 par l’addition de HCl à 18%. On soumet la solution à une diafiltration sur des cassettes filtrantes ayant une séparation à 50 000 Daltons. Puis on ajoute du NaCl 1 M et on soumet de nouveau la solution à une diafiltration sur des cassettes filtrantes ayant une séparation à 50 000 Daltons. Après cette deuxième diafiltration, on concentre le rétentat à 100–120 g/l en laissant le perméat s’écouler sans aucun remplacement d’eau.

[0060] Puis on filtre la solution concentrée sur un filtre de 0,22 µm et on sèche par séchage par pulvérisation, et l’on obtient environ 2700 g d’une poudre blanche à blanc-beige de GM1, identifié par CCM, cette poudre de GM1 ayant une pureté, mesurée par CLHP, de 99,8%. La poudre de GM1 résultante a une teneur en Fuc-GM1, mesurée par CLHP, inférieure à 0,1%.

Exemple comparatif

[0061] On met en œuvre le procédé pour préparer et purifier le GM1 comme dans l’éxemple 1 ci-dessus, sauf que, dans la chromatographie sur colonne, on remplace la solution méthanolique de méthanol/acétate de potassium par une solution méthanolique de méthanol/acétate de sodium.

[0062] On obtient 3100 g d’une poudre de GM1 contenant 91% de GM1 et 8% de Fuc-GM1, mesurés par CLHP.

[0063] D’après les exemples ci-dessus, on peut voir qu’on obtient une pureté de GM1 bien inférieure quand on utilise de l’acétate de sodium pour l’élution de GM1. Ceci peut être attribué au fait que le contre-ion sodium ne fait aucune différence entre GM1 et Fuc-GM1 dans le processus d’élution, par comparaison avec les contre-ions potassium ou césium qui, au contraire, séparent complètement les deux pics.

[0064] Bien entendu, l’invention n’est pas limitée aux exemples de réalisation ci-dessus décrits et représentés, à partir desquels on pourra prévoir d’autres modes et d’autres formes de réalisation, sans pour autant sortir du cadre des revendications.

Claims (17)

1. Procédé pour l’isolation et la purification de monosialoganglioside GM1, caractérisé en ce qu’il comprend la séparation du monosialoganglioside GM1 à partir d’un mélange lipidique contenant le monosialoganglioside GM1 en tant que composant ganglioside principal, par chromatographie sur colonne échangeuse d’ions utilisant un éluant comprenant des ions potassium ou césium.

2. Procédé pour l’isolation et la purification de monosialoganglioside GM1 selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes: (a) séparation de GM1 à partir d’un mélange lipidique contenant le monosialoganglioside GM1 en tant que composant ganglioside principal par chromatographie sur colonne échangeuse d’ions utilisant un éluant comprenant des ions potassium ou césium, (b) récupération du soluté à partir de la solution éluée, (c) diafiltration d’une solution aqueuse du soluté récupéré de l’étape (b), (d) addition d’un sel de sodium et diafiltration de la solution aqueuse résultante, (e) récupération de GM1 sous la forme de son sel de sodium.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l’éluant comprend de l’acétate de potassium ou de césium.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l’éluant est une solution méthanolique d’acétate de potassium ou de césium.

5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la colonne échangeuse d’ions contient une résine ayant un groupe amino quaternaire.

6. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la colonne échangeuse d’ions est d’abord équilibrée avec du méthanol.

7. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que du NaCl est ajouté dans l’étape (d).

8. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la diafiltration est mise en œuvre au moyen d’une membrane ayant une taille de pores de 10 000 à 100 000 Daltons.

9. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la récupération de GM1 dans l’étape (e) comprend le séchage de la solution de perméat par séchage par pulvérisation ou séchage sous vide pour produire une poudre.

10. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de purification préliminaire avant la séparation de GM1 par chromatographie par échange d’ions, ladite étape de purification comprenant: (a) la diafiltration d’une solution aqueuse d’un mélange lipidique contenant le monosialoganglioside GM1 en tant que composant ganglioside principal sur une membrane ayant une taille de pores de 10 000 à 100 000 Daltons, (b) la concentration du perméat et la récupération du mélange lipidique du soluté comprenant GM1.

11. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le mélange lipidique contenant le monosialoganglioside GM1 en tant que composant ganglioside principal est obtenu par hydrolyse d’un extrait lipidique contenant un mélange de gangliosides ayant une pureté d’au moins 50%.

12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l’hydrolyse est effectuée par traitement de l’extrait lipidique avec la souche S de sialidase d’Arthrobacter ureafaciens ou la sialidase de Vibrio cholerae.

13. Monosialoganglioside GM1, produit conformément au procédé de la revendication 2, caractérisé en ce qu’il a une pureté de 99,0% ou plus.

14. Monosialoganglioside GM1 selon la revendication 13, caractérisé en ce qu’il contient moins de 0,1% de Fuc-GM1.

15. Monosialoganglioside GM1 selon la revendication 13, caractérisé en ce qu’il est destiné à être utilisé en tant que médicament, pour le traitement de troubles et des maladies des systèmes nerveux central et périphérique.

16. Utilisation du monoganglioside GM1 selon la revendication 13 pour la fabrication d’une composition pharmaceutique pour le traitement de troubles et des maladies des systèmes nerveux central et périphérique.

17. Utilisation du monoganglioside GM1 selon la revendication 16, caractérisé en ce que le trouble ou la maladie du système nerveux central ou périphérique est choisi dans le groupe constitué par un accident cérébro-vasculaire, la maladie de Parkinson, une lésion de la moelle épinière, la maladie d’Alzheimer, la dyskinésie tardive, la sclérose latérale amyotrophique, les neuropathies périphériques et les neuropathies du système autonome.