WO2021090911A1 - タンパク質凝集塊を含有する細胞を選択的に死滅させる方法、そのキット、タンパク質ミスフォールディング病治療薬及び血液製剤からのタンパク質凝集塊除去製剤 - Google Patents

Abstract

タンパク質凝集塊を含有する細胞を選択的に死滅させる方法、そのキット、タンパク質ミスフォールディング病治療薬及び血液製剤からのタンパク質凝集塊除去製剤を提供する。一実施形態に係る細胞を選択的に死滅させる方法は、タンパク質凝集塊を検出する化合物としてフッ素系アルコールを又は下記一般式（１）で示される化合物を含有する分子構造変質剤を細胞に作用させ、タンパク質凝集塊を含有する細胞を選択的に死滅させる。（一般式（１）中、aは０又は１であり、a＝１である場合、R¹が水素原子であり、且つR²が水酸基である、又はR¹が水酸基であり、且つR²が水素原子であり、a＝０である場合、R²は炭素原子と二重結合を形成する酸素原子であり、R³は、CH_lCl_mF_nであり、l、m及びnは１から３までの整数であり、l＋m＋n＝３を満たし、R⁴は、CH_sCl_tF_uであり、s、t及びuは１から３までの整数であり、s＋t＋u＝３を満たす。）

Description

タンパク質凝集塊を含有する細胞を選択的に死滅させる方法、そのキット、タンパク質ミスフォールディング病治療薬及び血液製剤からのタンパク質凝集塊除去製剤

　本発明は、プリオン病などのタンパク質高次構造の変化に起因する疾患群において、それら疾患の病原体となりうるタンパク質を含有する細胞を選択的に死滅させる方法及びそのキットに関する。または、本発明は、タンパク質ミスフォールディング病治療薬に関する。または、本発明は、血液製剤からのタンパク質凝集塊除去製剤に関する。

　タンパク質は、生合成ののち、正しい立体構造を形成してはじめて機能する分子となる。しかしながら、正しい立体構造が形成されなかった場合、タンパク質は線維化や凝集形成を起こすことで、本来の機能を失うか、あるいは新たに毒性を獲得することで、生体のさまざまな代謝経路を阻害し、最終的には死に至らせることもある。こうした疾患はタンパク質ミスフォールディング病と呼ばれており、神経疾患領域においては、プリオン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症などが含まれる。眼科領域においては白内障、加齢性黄斑などが含まれる。全身性の臓器においてはアミロイドーシスが含まれる。

　プリオンタンパク質（Ｐｒｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＰｒＰ）は、神経変性疾患であるプリオン病を引き起こす病原体と考えられている。プリオン病は人獣共通感染症であり、ヒトにおいては孤発性のクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、遺伝性のゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）および致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、感染性の変異型ＣＪＤ（ｖＣＪＤ）が挙げられる。ウシにおいては、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、羊においてはスクレイピー、鹿においてはシカ慢性消耗病（ＣＷＤ）が知られている。また、ネコ、ミンク、チーターなどにもプリオン病が発症する。正常型プリオンタンパク質（ＰｒＰ^ｃ）から異常型プリオンタンパク質（ＰｒＰ^Ｓｃ）へのタンパク質高次構造変化が、ただちにプリオン感染をおこすわけではなく、これらの相関については未だ議論があるものの、プリオン病の発症にＰｒＰ^Ｓｃが関与していることが明らかとなっている。しかし、現在までに根本的な治療法は見出されていない。（非特許文献１、非特許文献２）

　プリオン病では、多くの場合、生体内の特に中枢神経系において、ＰｒＰ^Ｓｃがタンパク質凝集塊として脳内の神経細胞内外に蓄積して、病原性を示すと考えられている。ＰｒＰ^ＳｃはＰｒＰ^Ｃと全く同じアミノ酸配列を持つが、そのタンパク質の立体構造は大きく異なっており、ＰｒＰ^Ｃはα－ヘリックス構造を多く含んでいるが、ＰｒＰ^Ｓｃにはβ－シート構造が多く含まれている。そのためＰｒＰ^Ｓｃは難溶性・難分解性のタンパク質となり、プロテアーゼＫなどのタンパク質分解酵素による分解に対して抵抗性を示す。ＰｒＰ^ＣからＰｒＰ^Ｓｃへの高次構造変換機構は未だ明らかではない。また、立体構造の変化が神経毒性を有して、時間経過につれて神経細胞等を破壊するとされているが、詳細はまだ不明である。アルツハイマー病やパーキンソン病、レビー小体型認知症等も、それぞれタンパク質凝集塊としてアミロイドβタンパク質、タウタンパク質、α－シヌクレインなどが起因しており、プリオン病と同じく、タンパク質の立体構造異常（ミスフォールディング）により引き起こされると考えられている。

　全身性の臓器とは異なり、中枢神経系は分化を終えている細胞群から構成されるため、立体構造異常をおこしたタンパク質群が一旦蓄積すると、代謝されずに神経細胞内に残される。

　そのため、タンパク質ミスフォールディング病の治療法や診断方法、治療方法の研究開発は、生体内に蓄積する難溶性・難分解性のタンパク質凝集塊に焦点をあてた戦略が基本となる。特許文献１にはメチレン鎖を含む芳香環から成る化合物またはその塩を有効成分とするプリオン病予防・治療剤が開示されており、プリオンタンパク質の構造変換を抑制するとされている。特許文献２、特許文献３にはプリオンタンパク質構造変換抑制剤として、芳香環から成る化合物が開示されており、正常型プリオンタンパク質に強固に結合して、感染型プリオンタンパク質への構造変換を阻止する作用があるとされており、これら化合物は有機化学の手法によって化学合成されたものである。特許文献４は発酵茶から抽出された高分子ポリフェノールを有効成分とする天然由来の異常型プリオンタンパク質の形成抑制剤が開示されている。

　また、治療薬の開発戦略において、元来は他の疾患治療薬であったものをプリオン病の治療に応用した臨床研究も展開されており、非特許文献３にはマラリア薬であるキナクリンを用いた例が開示されている。非特許文献４には間質性膀胱炎や関節炎の治療薬であるペントサンポリサルフェート（ヘパリン硫酸）をプリオン病患者の実験的治療に用いた例が開示されている。これらは現時点では明確な治療効果は見出されていない。

　現在までにタンパク質凝集疾患に対する治療薬として承認されたものとしては、トランスサイレチン型アミロイドーシスに対する治療薬（タファミジスメグルミン、ファイザー株式会社製、商品名ビンダケル）がある。この治療薬はタンパク質凝集塊の形成経路を阻害し、症状の進行を遅らせる効果が認められている。

特開２０１８－３５０９９号公報 特開２００９－１３１２６号公報 再公表２０１０－１３１７１７号公報 特開２００９－２９７５２号公報 特開２００９－１６７１２８号公報

水澤英洋、プリオンとプリオン病、Ｐｈａｒｍａ Ｍｅｄｉｃａ　Ｖｏｌ．３５、Ｎｏ．２、６７～６９（２０１７） 佐橋　健太郎、変異タンパク質凝集体への治療的アプローチ、生体の科学、６７巻４号、２９６～３０２（２０１６） 山田辰夫、堂浦克美、クロイツフェルト・ヤコブ病に対するＱｉｎａｃｒｉｎｅ治療、厚生労働省科学研究費補助金　特定疾患対策研究事業　プリオン病及び遅発性ウイルス感染に関する調査研究、平成１５年度研究報告書（２００４）ｐ１１３～１２４ Ｔｓｕｂｏｉ　Ｙ，Ｄｏｈ－Ｕｒａ　Ｋ，Ｙａｍａｄａ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．　Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｉｎｆｕｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅｎｔｓａｎ　ｐｏｌｙｓｕｌｆａｔｅ：ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｔｒｉａｌ　ａｇａｉｎｓｔ　ｐｒｉｏｎ　ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ　２００９；２９：６３２－６３６．

　本発明の一実施形態は、上記を鑑みてなされたものであり、タンパク質凝集塊を含有する細胞に特異的に作用し、タンパク質凝集塊を含有する細胞を選択的に死滅させる方法及びそのキットを提供することを目的とする。または、本発明の一実施形態は、タンパク質ミスフォールディング病治療薬を提供することを目的とする。または、本発明の一実施形態は、血液製剤からのタンパク質凝集塊除去製剤を提供することを目的とする。

　本発明者らが鋭意検討したところ、フッ素系アルコールである１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）をタンパク質凝集塊に接触させると、ＨＦＩＰがタンパク質凝集塊に特異的に作用して、分子構造変質剤として働き、タンパク質凝集塊の立体構造を変化させることを見出した。そして、ＨＦＩＰがタンパク質凝集塊を含有する細胞を選択的に死滅させることを新たに見出した。

　本発明は、以下の態様を含むものである。

［１］　フッ素系アルコール又は下記一般式（１）で示される化合物を含有する分子構造変質剤を細胞に作用させ、
　タンパク質凝集塊を含有する細胞を選択的に死滅させる方法。

（一般式（１）中、aは０又は１であり、
a＝１である場合、R¹が水素原子であり、且つR²が水酸基である、又はR¹が水酸基であり、且つR²が水素原子であり、
a＝０である場合、R²は炭素原子と二重結合を形成する酸素原子であり、
R³は、CH_lCl_mF_nであり、lは０から３までの整数であり、m及びnは１から３までの整数であり、l＋m＋n＝３を満たし、
R⁴は、CH_sCl_tF_uであり、sは０から３までの整数であり、t及びuは１から３までの整数であり、s＋t＋u＝３を満たし、
l＋s＜６を満たす。）

［２］　フッ素系アルコールが、一般式ＲｆＣＨ_２ＯＨ、またはＲｆＲｆ’ＣＨＯＨで示され、Ｒｆ及びＲｆ’は炭素数１～１０のパーフルオロアルキル基を示し、ＲｆとＲｆ’は互いに異なる又は同じである細胞を選択的に死滅させる方法。

［３］　フッ素系アルコールが、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールである細胞を選択的に死滅させる方法。

［４］　細胞に作用させる際のフッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物の濃度が、１０ｐＭから１００ｍＭの範囲内である細胞を選択的に死滅させる方法。

［５］　タンパク質凝集塊を検出する化合物としてフッ素系アルコール又は下記一般式（１）で示される化合物を含有する細胞を選択的に死滅させるキット。

（一般式（１）中、aは０又は１であり、
a＝１である場合、R¹が水素原子であり、且つR²が水酸基である、又はR¹が水酸基であり、且つR²が水素原子であり、
a＝０である場合、R²は炭素原子と二重結合を形成する酸素原子であり、
R³は、CH_lCl_mF_nであり、lは０から３までの整数であり、m及びnは１から３までの整数であり、l＋m＋n＝３を満たし、
R⁴は、CH_sCl_tF_uであり、sは０から３までの整数であり、t及びuは１から３までの整数であり、s＋t＋u＝３を満たし、
l＋s＜６を満たす。）

［６］　細胞を選択的に死滅させるキットの前記フッ素系アルコールが、一般式ＲｆＣＨ_２ＯＨ、またはＲｆＲｆ’ＣＨＯＨで示され、
Ｒｆ及びＲｆ’は炭素数１～１０のパーフルオロアルキル基を示し、
ＲｆとＲｆ’は互いに異なる又は同じである。

［７］　細胞を選択的に死滅させるキットのフッ素系アルコールが、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールである。

［８］　細胞を選択的に死滅させるキットの細胞に作用させる際のフッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物の濃度が、１０ｐＭから１００ｍＭの範囲内である。

［９］　フッ素系アルコール又は下記一般式（１）で示される化合物を含有するタンパク質ミスフォールディング病治療薬。

（前記一般式（１）中、aは０又は１であり、
a＝１である場合、R¹が水素原子であり、且つR²が水酸基である、又はR¹が水酸基であり、且つR²が水素原子であり、
a＝０である場合、R²は炭素原子と二重結合を形成する酸素原子であり、
R³は、CH_lCl_mF_nであり、lは０から３までの整数であり、m及びnは１から３までの整数であり、l＋m＋n＝３を満たし、
R⁴は、CH_sCl_tF_uであり、sは０から３までの整数であり、t及びuは１から３までの整数であり、s＋t＋u＝３を満たし、
l＋s＜６を満たす。）

［１０］　タンパク質ミスフォールディング病治療薬の前記フッ素系アルコールが、一般式ＲｆＣＨ_２ＯＨ、またはＲｆＲｆ’ＣＨＯＨで示され、Ｒｆ及びＲｆ’は炭素数１～１０のパーフルオロアルキル基を示し、ＲｆとＲｆ’は互いに異なる又は同じである。

［１１］　タンパク質ミスフォールディング病治療薬の前記フッ素系アルコールが、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールである。

［１２］　フッ素系アルコール又は下記一般式（１）で示される化合物を含有する、血液製剤からのタンパク質凝集塊除去製剤。

（前記一般式（１）中、aは０又は１であり、
a＝１である場合、R¹が水素原子であり、且つR²が水酸基である、又はR¹が水酸基であり、且つR²が水素原子であり、
a＝０である場合、R²は炭素原子と二重結合を形成する酸素原子であり、
R³は、CH_lCl_mF_nであり、lは０から３までの整数であり、m及びnは１から３までの整数であり、l＋m＋n＝３を満たし、
R⁴は、CH_sCl_tF_uであり、sは０から３までの整数であり、t及びuは１から３までの整数であり、s＋t＋u＝３を満たし、
l＋s＜６を満たす。）

［１３］　血液製剤からのタンパク質凝集塊除去製剤において、前記フッ素系アルコールが、一般式ＲｆＣＨ_２ＯＨ、またはＲｆＲｆ’ＣＨＯＨで示され、Ｒｆ及びＲｆ’は炭素数１～１０のパーフルオロアルキル基を示し、ＲｆとＲｆ’は互いに異なる又は同じである。

［１４］　血液製剤からのタンパク質凝集塊除去製剤において、前記フッ素系アルコールが、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールである。

　本発明の一実施形態によれば、ヒト及び動物に蓄積するタンパク質凝集塊に対してタンパク質立体構造を変質させる分子構造変質剤を用いることにより、タンパク質凝集塊を含有する細胞に特異的に作用し、タンパク質凝集塊を含有する細胞を選択的に死滅させるができる。または、本発明の一実施形態によれば、分子構造変質剤がヒト及び動物に蓄積するタンパク質凝集塊に対してタンパク質立体構造を変質させることにより、タンパク質ミスフォールディング病の治療薬として用いることができる。または、本発明の一実施形態によれば、血液製剤にタンパク質凝集塊が含まれていた場合にも、タンパク質凝集塊を除去して、安全な血液製剤を提供することができる。

マウス神経芽細胞腫由来の培養細胞において、ＰｒＰ^Ｃを産生するＮｅｕｒｏ　２ａ（Ｎ２ａ）細胞とＰｒＰ^Scを産生するＳｃＮｅｕｒｏ　２ａ（ＳｃＮ２ａ）細胞に対するＨＦＩＰの各濃度における感受性を試験した細胞培養プレートの写真である。 ＨＦＩＰ添加有無の条件において、細胞培養後のＮ２ａ細胞とＳｃＮ２ａ細胞のプロテアーゼＫに対する抵抗性をウエスタンブロッティングで評価した結果である。 本発明の一実施形態に係る検査装置１００を示す模式図である。

　本発明のヒト及び動物のタンパク質凝集塊の分子構造を変質する化合物は、フッ素系アルコール又は下記一般式（１）で示される化合物である。

　前記一般式（１）中、aは０又は１であり、a＝１である場合、R¹が水素原子であり、且つR²が水酸基である。または、R¹が水酸基であり、且つR²が水素原子である。また、a＝０である場合、R²は炭素原子と二重結合を形成する酸素原子である。R³は、CH_lCl_mF_nであり、lは０から３までの整数であり、m及びnは１から３までの整数であり、l＋m＋n＝３を満たす。また、R⁴は、CH_sCl_tF_uであり、sは０から３までの整数であり、t及びuは１から３までの整数であり、s＋t＋u＝３を満たす。なお、l＋s＜６を満たす。

　一実施形態において、分子構造変質剤は、有効成分としてフッ素系アルコール又は上記一般式で示される化合物を含有する。本明細書において、「分子構造改質剤」とは、β－シート構造を多く含むタンパク質に特異的に作用して、その分子構造をβ－シート構造からアンフォールディングさせて、α－ヘリックス構造に誘導する化合物を含み、タンパク質凝集塊の検出及び神経変性疾患を含むタンパク質ミスフォールディング病の簡易スクリーニングや診断に好適に利用可能である。一実施形態において、分子構造変質剤は、フッ素系アルコールと上記一般式で示される化合物から選択される二種以上を含有する。

　一実施形態において、上記一般式（１）で示される化合物は、下記化合物１～３で示される化合物群より選択されてもよい。
［化合物群］

　本発明のフッ素系アルコールは、下記一般式（２）又は（３）で示される。
 
　ＲｆＣＨ_２ＯＨ 　・・・（２）
　ＲｆＲｆ’ＣＨＯＨ　　　・・・（３）
 
　一般式において、Ｒｆ，Ｒｆ’は炭素数１～１０のパーフルオロアルキル基を示す。

　一般式（２）又は（３）で示される化合物中でも、特に、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（以下、ＨＦＩＰと表記することがある）、２，２，２－トリフルオロエタノール、２，２，３，３，３－ペンタフルオロ－１－プロパノールを例示することができる。特に、ＨＦＩＰがタンパク質凝集塊の分子構造を変質する化合物として好適である。一実施形態において、分子構造変質剤は、一般式（１）、（２）又は（３）で示される化合物の少なくとも一種と、溶媒を含んでもよい。

　一般式（１）、（２）又は（３）で示される化合物を希釈可能な溶媒としては、水、生理食塩水、リンゲル液、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｔｓ、略称ＰＢＳ）、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、トルエン、ジメチルスルホキシドなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、分子構造変質剤は、一般式（１）、（２）又は（３）で示される化合物と、上記溶媒を含む。例えば、ＨＦＩＰは融点が－３．３℃、沸点が５８．６℃の無色透明の液体であり、ほとんどの溶媒に可溶であるため、溶媒で希釈することにより、ＨＦＩＰは任意の濃度に調整することができる。

　タンパク質凝集塊に作用させる際のフッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物の濃度は、１０ｐＭ以上１００ｍＭ以下が好ましい。なお、フッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物をタンパク質凝集塊に作用させる時間は特に限定されない。

　一実施形態において、フッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物とともに、又は、フッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物の代わりに、フッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物中のヒドロキシ基が保護基で保護された化合物を用いてもよい。この保護基によって、タンパク質凝集塊と作用するまでの過程においてフッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物の分解が抑制され、この化合物はタンパク質凝集塊と作用する際にフッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物に変換されていればよい。このような保護基としては、ヒドロキシ基の保護基として一般的に用いられる官能基（例えば、『Protecting Group Chemistry』Jeremy Robertson著、Oxford University Press出版を参照）、糖鎖、ペプチド等が挙げられる。保護基として用いられる官能基としては、アルコキシアルキル基（例えば、メトキシメチル基、エトキシエチル基）、２－テトラヒドロピラニル基等のアセタール系の官能基、アルカノイル基（例えば、アセチル基）やアロイル基（例えば、ベンジル基等のアリールメチル基、ベンゾイル基）等のアシル系の官能基、アルキルシリル基（例えば、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基）等のシリルエーテル系の官能基を例示することができるが、これらに限定されるものではない。

［タンパク質凝集塊を含有する細胞を選択的に死滅させる方法］
　本発明のフッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物を含む分子構造変質剤は、タンパク質ミスフォールディング病、特に神経変性疾患の患者等のタンパク質凝集塊を含有する細胞を選択的に死滅させることができ、さらに薬学的に許容しうる濃度で有効成分として含有してタンパク質凝集塊を含有する細胞を選択的に死滅させるキットとすることができる。ここで薬学的に許容しうる濃度としては、タンパク質凝集塊の分子構造を変質する濃度と同一であり、具体的には１０ｐＭ以上１００ｍＭが好ましい。一実施形態において、タンパク質凝集塊を含有する細胞を選択的に死滅させるキットは、ＨＦＩＰと、上記溶媒を含む。

　本明細書において、神経系における蛋白質ミスフォールディング病とは、プリオン病では、孤発性のクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、遺伝性のゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、医原性や食による変異型ＣＪＤ（ｖＣＪＤ）、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、羊のスクレイピー、シカ慢性消耗病（ＣＷＤ）、ネコ、ミンク、チーターなどプリオン病を発症し得る動物のプリオン病を例示することができる。その他には、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）のスペクトラムに含まれる神経変性疾患群、筋委縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病、ポリグルタミン病を例示することができる。眼科領域においては白内障、加齢性黄斑などを例示することができる。全身性の臓器においてはアミロイドーシスが含まれる。

　神経変性疾患は生体内の特に中枢神経組織において、正常な立体構造を示すタンパク質が異常な立体構造のタンパク質に高次構造変化を起こし、これがタンパク質凝集塊として脳内の神経細胞内外に蓄積して病原性を示すと考えられている。孤発性および感染性のプリオン病では、この過程において、タンパク質のアミノ酸配列は変化せず、その立体構造だけが変化する。正常なタンパク質は二次構造としてα－ヘリックス構造を多く含んでいるが、異常な立体構造のタンパク質はβ－シート構造が多く含まれており、難溶性・難分解性タンパク質となり、プロテアーゼＫなどのタンパク質分解酵素に対して抵抗性を示す。

　本発明の分子構造変質剤に含まれるフッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物、中でもＨＦＩＰは、タンパク質のβシート構造に特異的に作用して、その分子構造をβ－シート構造からアンフォールディングさせてα－ヘリックス構造に誘導し、神経変性疾患において、生体内の特に中枢神経組織に蓄積されるタンパク質凝集塊に対して有効な分子構造改質剤となりうる。また、ＨＦＩＰは分子量が１６８の低分子化合物であり、血液と脳の組織液との物質交換を制御する脳血液関門を通過することが可能な分子サイズであるため（一般的に分子量５００を超える分子は通過できないとされる）、脳内に移行して分子構造改質剤として機能すると考えられる。

　一実施形態において、本発明のタンパク質凝集塊を含有する細胞としては、タンパク質ミスフォールディング病に感染した疑いがある臓器や生体組織に由来する細胞であり、例えば脳、延髄、扁桃、神経接合部、脾臓、心臓、肝臓、肺、眼球、胎盤、精巣、リンパ組織、筋肉組織など、又は神経細胞、血液細胞、筋肉細胞、並びに血液（血漿、血清の液体成分を含む）、脳脊髄液（髄液）、尿などの体液に由来する細胞であるが、特に限定されない。タンパク質凝集塊を含有する細胞の有無を検出する目的である場合には、血液や脳脊髄髄液などは比較的低侵襲で得られる検体であるため、好ましい。また扁桃、神経接合部などは脳と比較すると採取しやすい組織であり、産業動物の診断には好適である。

　タンパク質ミスフォールディング病に感染した生物学的サンプルには、タンパク質凝集塊を含む細胞が挙げられ、これら細胞とフッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物に対する感受性の違いを利用することで、タンパク質ミスフォールディング病の簡易スクリーニングや診断に用いることができる。一実施形態において、例えばタンパク質ミスフォールディング病に罹患した細胞は、正常な細胞と比較して、フッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物の濃度に依存して細胞死を導く。タンパク質凝集塊の検出感度を上げるために、生体組織から採取した生物学的サンプルは、生体外にて培養してから用いてもよい。検出対象とするタンパク質によってそれぞれ好適な生体サンプルは異なるため、特に限定されない。例えば髄液中にはＰｒＰ^Ｓｃが存在するとされており、アルツハイマー病などのアミロイドベータは血液中にも存在するとされる。

　本発明のタンパク質凝集塊の検出は、タンパク質ミスフォールディング病の簡易スクリーニングや診断以外にも、輸血用血液や血液製剤、髄液、移植用臓器などによる感染防止のための検査に用いることもできる。現在、輸血用血液のプリオン感染の検査は、血液提供者の海外滞在歴や疾患歴等の血液提供者側にて制限を設けているのが現状である。

　本発明のフッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物を用いてタンパク質凝集塊の分子構造を変質する試験は、正常な分子構造のタンパク質と異常な分子構造のタンパク質をそれぞれ評価できる方法であれば特に限定されない。

　一実施形態において、生物学的サンプルとして上記細胞を用いる場合、本発明の分子構造変質剤に対する正常細胞と、タンパク質凝集塊が蓄積した細胞との感受性の差異により、タンパク質凝集塊が蓄積した細胞の有無を検出することができる。例えば、細胞に本発明の分子構造変質剤を所定時間作用させ、その後、細胞染色により、生細胞又は死細胞を評価することにより、タンパク質凝集塊が蓄積した細胞の有無を検出することができる。

　一実施形態において、生物学的サンプルとして上記組織又は細胞を用いる場合、本発明の分子構造変質剤に対する正常な構造のタンパク質と、タンパク質凝集塊とのタンパク質分解酵素に対する感受性の差異により、タンパク質凝集塊が蓄積した組織又は細胞の有無を検出することができる。例えば、細胞溶解液をタンパク質分解酵素で処理した場合、タンパク質凝集塊はタンパク質分解酵素による分解を受けず、電気泳動によりタンパク質凝集塊のバンドが検出される。一方、細胞溶解液を本発明の分子構造変質剤で処理した後にタンパク質分解酵素で処理すると、分子構造変質剤により変質したタンパク質凝集塊はタンパク質分解酵素により分解され、電気泳動によりタンパク質凝集塊のバンドが希薄化又は消失する。したがって、本発明の分子構造変質剤の処理前後でのタンパク質分解酵素に対する感受性の差異により、タンパク質凝集塊が蓄積した組織又は細胞の有無を検出することができる。また、タンパク質凝集塊が形成されるタンパク質が未知の場合であっても、例えばショットガン法による質量分析や２次元電気泳動と質量分析法との組み合わせなどによっても、当該タンパク質を同定することもできる。

［検査装置］
　一実施形態において、上述した本発明に係るフッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物を検出部に含む検査装置を提供することができる。

　図３は、本発明の一実施形態に係る検査装置１００を示す模式図である。検査装置１００は、例えば、入力部１１０、検出部１２０、記憶部１３０、表示部１４０、制御部１５０、演算部１６０、電源装置１７０及び通信部１８０を含むが、これらに限定されるものではない。また、検査装置１００は、ネットワーク２００を介してサーバ３００と接続していてもよい。

　入力部１１０は、例えば、検査装置１００に検査対象や検査条件等の情報を入力するための装置であり、公知のキーボードやマウス、タッチパネル等の入力装置で構成されてもよい。検査対象の情報とは、例えば、上述した細胞や組織の名称、患者名やＩＤ等であってもよい。また、検査条件とは、本発明に係るフッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物の名称や濃度、検査日時、細胞数等の検査に関連する条件であってもよい。

　検出部１２０は、例えば、検査対象となる細胞等に本発明に係るフッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物を添加し、細胞やタンパク質凝集塊の状態を検出する装置である。一実施形態において、検出部１２０は、本発明に係るフッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物を含んでもよい。例えば、検出用の容器に入れられた細胞等に、検出部１２０が本発明に係るフッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物を供給して、細胞やタンパク質凝集塊の状態を検出してもよい。なお、本明細書において、検出部１２０は、本発明に係るフッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物を供給して、細胞やタンパク質凝集塊の状態を検出する一連の処理を行うための手段を示し、本発明に係るフッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物の供給を人が行って、検出部１２０が細胞やタンパク質凝集塊の状態を検出することも含んでもよい。また、検出部１２０は、タンパク質凝集塊の状態を検出するための電気泳動装置を備えてもよい。なお、細胞やタンパク質凝集塊の状態を検出するために、検出部１２０は撮像装置をそなえてもよい。撮像装置としては、例えば、公知のＣＣＤイメージセンサやＣＭＯＳイメージセンサを用いることができるため、詳細な説明は省略する。

　記憶部１３０は、主記憶装置及び補助記憶装置を含む。主記憶装置には、公知のメモリを用いることができるため、詳細な説明は省略する。また、補助記憶装置には、公知のハードディスクやソリッドステートドライブ（ＳＳＤ）等を用いることができるため、詳細な説明は省略する。記憶部１３０は、検査装置１００のためのオペレーティングシステムやアプリケーションソフトウェア、検出結果等のデータを格納することができる。なお、補助記憶装置は必須ではなく、例えば、検査装置１００がネットワーク２００を介してサーバ３００と接続している場合には、アプリケーションソフトウェアや検査結果等のデータはサーバ３００に格納されてもよい。

　表示部１４０は、検査装置１００を操作するための情報や検査結果等を表示するための装置であり、公知のディスプレイを用いることができるため、詳細な説明は省略する。

　制御部１５０は、検査装置１００を制御するための中央処理装置及びプログラムで構成される。制御部１５０は、例えば、オペレーティングシステムやアプリケーションソフトウェア又はモジュールを含む。

　演算部１６０は、入力部１１０から入力された検査対象の情報や検査条件、検出部１２０で取得された細胞やタンパク質凝集塊の状態に基づき、演算を実行し、検査結果を提供する。演算部１６０は、演算に用いるアプリケーションソフトウェア又はモジュールを含む。

　電源装置１７０は、外部から検査装置１００に電源を供給するための装置であり、公知の電源装置やバッテリを用いることができるため、詳細な説明は省略する。

　通信部１８０は、有線又は無線により検査装置１００が外部の機器と通信するための装置である。通信部１８０は、公知のローカル・エリア・ネットワーク（ＬＡＮ）やインターネット等のネットワーク２００を介してサーバ３００や他の装置（図示せず）に接続することができる。

　一実施形態において、検査装置１００は、本発明に係るフッ素系アルコール又は一般式（１）で示される化合物を作用させた後の検査対象の細胞の状態や、タンパク質凝集塊の状態を検出部１２０で検出し、記憶部１３０やサーバ３００に格納された対照データや標準値と比較することにより、タンパク質ミスフォールディング病を発症するリスクや病状の進行度合いを評価してもよい。

　一実施形態において、検査装置１００は、検査時（第１の時点）での検査結果と、記憶部１３０又はサーバ３００に格納された以前（第２の時点）の検査結果を比較して、タンパク質ミスフォールディング病を発症するリスクや病状の進行度合いを評価してもよい。

　一実施形態において、検査装置１００は、記憶部１３０又はサーバ３００に格納された教師データを用いてニューラルネットワークに機械学習処理を実行させ、学習済みニューラルネットワークを用いて、検出部１２０が検出した検査対象のデータに基づいて、タンパク質ミスフォールディング病を発症するリスクや病状の進行度合いを評価してもよい。ここで、教師データは、複数のサンプルから収集した各サンプルに関連する所定の入力データ（検出結果など）と、そのサンプルを採取した生物がタンパク質ミスフォールディング病である可能性を示す出力データとを含む。

　一実施形態において、検査装置１００は、通信部１８０を介して、評価結果をプリンタで出力してもよく、通信部１８０からネットワーク２００を経由して、電子カルテや医療従事者用の端末４００に評価結果を送信してもよい。

［タンパク質ミスフォールディング病治療薬］
　上述した本発明のヒト及び動物のタンパク質凝集塊の分子構造を変質する化合物は、一実施形態において、タンパク質ミスフォールディング病治療薬として用いることができる。タンパク質ミスフォールディング病治療薬は、フッ素系アルコール又は上記一般式（１）で示される化合物を含有する。

　一実施形態において、タンパク質ミスフォールディング病治療薬は、フッ素系アルコール又は上記一般式（１）で示される化合物をコレステロール等の脂質に結合させたものや、リポソームや薬剤徐放材料等のキャリアや担体にフッ素系アルコール又は上記一般式（１）で示される化合物を担持させた製剤を用いて、生体内での薬物動態を制御した形態でもよい。一実施形態において、これらのタンパク質ミスフォールディング病治療薬は、その結合活性を評価するために、タンパク質ミスフォールディング病治療薬を蛍光物質、アイソトープ、酵素等のラベルで標識してもよい。標識した物質の検出には放射線（ＰＥＴ、陽電子放射断層撮影法を含む）、蛍光、発光等の公知の機器、手段を利用することができる。

　一実施形態において、タンパク質ミスフォールディング病治療薬は、人獣共通感染症に罹患する哺乳動物であるヒト、ウシ、羊、鹿等に対して投与することができる。投与の形態は、経口、非経口の何れでもよく、経皮、皮内、皮下、筋肉、腹腔、動脈、静脈、直腸、脊髄、髄腔、鼻腔、目、舌下、脳等を経由した全身又は局所投与を選択することができる。

　例えば、タンパク質ミスフォールディング病治療薬を水（注射用水）、生理食塩水、ブドウ糖溶液、緩衝液等に希釈溶解させた注射剤や輸液として、経皮、皮内、皮下、筋肉、腹腔、動脈、静脈、直腸、眼球、脊髄、延髄、髄腔、硬膜、脳等への注射や点滴等の投与方法により行なうことができる。また、注射剤や輸液に適切な分散剤や懸濁化剤を使用してもよい。

一実施形態において、例えば、タンパク質ミスフォールディング病治療薬を含有させたクリーム、軟膏、エアロゾル、ゲル、点眼剤等や、錠剤、カプセル、顆粒剤、錠剤、座薬、パッチ剤、パップ剤等の固形物や担体に担持させた形態であってもよい。また、カテーテルやプログラミングされた小型ポンプ、浸透圧ポンプ等を哺乳動物の脳組織や疾患部位の体内に留置させ、タンパク質ミスフォールディング病治療薬を局所投与する形態も選択することができる。

　一実施形態において、タンパク質ミスフォールディング病治療薬は、注射剤として提供することができる。

　タンパク質ミスフォールディング病治療薬としては、フッ素系アルコールが、一般式ＲｆＣＨ_２ＯＨ、またはＲｆＲｆ’ＣＨＯＨで示され、Ｒｆ及びＲｆ’は炭素数１～１０のパーフルオロアルキル基を示し、ＲｆとＲｆ’は互いに異なる又は同じである化合物を含むことが好ましい。一実施形態において、タンパク質ミスフォールディング病治療薬は、ＨＦＩＰであることが好ましい。

　一実施形態において、タンパク質ミスフォールディング病治療薬の注射剤は、治療効果を示し、医薬的に許容される範囲で１回当たりの投与量を設定することができ、例えば、１μｇ～１００ｍｇを１バイアルに含むことができる。注射剤は、フッ素系アルコール又は上記一般式（１）で示される化合物のみを含むバイアルで提供されてもよく、医薬的に許容される溶剤で希釈された注射剤として提供されてもよい。または、フッ素系アルコール又は上記一般式（１）で示される化合物と、医薬的に許容される添加剤とを含むバイアルで提供されてもよく、フッ素系アルコール又は上記一般式（１）で示される化合物と、医薬的に許容される添加剤とが溶剤に溶解した注射剤として提供されてもよい。

　医薬的に許容される溶剤としては、例えば、水（注射用水）、生理的食塩水、リンゲル液、ブドウ糖注射液や医学的に許容される有機溶剤等の公知の溶剤を用いることができる。また、医薬的に許容される添加剤としては、例えば、安定剤、賦形剤、滑沢剤、溶解補助剤、乳濁化剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、保存剤、着色剤、各種の塩化合物等を含むことができる。一実施形態において、注射剤はアジュバンド（補助剤）を含んでもよい。

　なお、タンパク質ミスフォールディング病治療薬の製造方法は、特には限定されず、公知の注射剤の製造方法により製造することが可能である。

　投与方法としては、例えば、フッ素系アルコール又は上記一般式（１）で示される化合物が、医薬的に許容される溶剤に溶解した状態で、静注する。一実施形態において、タンパク質ミスフォールディング病治療薬は、ヒト、ウシ、羊、鹿等に対して医学的に許容される濃度で投与することができる。これらは投与する対象の哺乳動物、年齢、体重、症状の時期等によって異なるため、一概に定めることはできないが、例えば１回あたりの投与量として、体重１ｋｇ当たり数μｇから数百ｍｇ、例えば１μｇから１００ｍｇとなるようにタンパク質ミスフォールディング病治療薬の濃度で調製し、臨床経過を観察しながら、１日数回程度から毎週数回投与すればよい。

　フッ素系アルコール又は上記一般式（１）で示される化合物、特に、ＨＦＩＰは、分子量が１６８の低分子化合物であり、静注により投与されると、血液と脳の組織液との物質交換を制御する脳血液関門を通過することが可能な分子サイズであるため（一般的に分子量５００を超える分子は通過できないとされる）、脳内に移行する。フッ素系アルコール又は上記一般式（１）で示される化合物は、中枢神経組織に蓄積されるタンパク質凝集塊のβシート構造に特異的に作用して、その分子構造をβ－シート構造からアンフォールディングさせてα－ヘリックス構造に誘導し、タンパク質ミスフォールディング病に対して、治療効果を示すものと考えられる。

　タンパク質ミスフォールディング病治療薬は、孤発性のクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、遺伝性のゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、医原性や食による変異型ＣＪＤ（ｖＣＪＤ）、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、羊のスクレイピー、シカ慢性消耗病（ＣＷＤ）、ネコ、ミンク、チーターなどプリオン病を発症し得る動物のプリオン病等のプリオン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）のスペクトラムに含まれる神経変性疾患群、筋委縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病、ポリグルタミン病等の疾患、白内障、加齢性黄斑等の眼科領域の疾患、アミロイドーシス等の全身性の臓器の疾患に対して治療効果が期待できる。

　また、一実施形態のタンパク質ミスフォールディング病治療薬は、当該疾患の疑いのある哺乳動物に対して、症状の発症を抑えるために投与してもよく、当該疾患の感染に対する予防措置として用いることもできる。

　また、一実施形態のタンパク質ミスフォールディング病治療薬は、他の薬物と併用して使用することもできる。対象とする疾患は神経系、及び全身性の蛋白質ミスフォールディング病に用いられる薬剤であれば、特に限定されるものではない。例えば、神経系のプリオン病であれば、キナクリン、ペントサンポリサルフェート等を併用してもよい。これらは１種、又は２種以上を組み合わせて投与してもよい。

［血液製剤からのタンパク質凝集塊除去製剤］
　一実施形態において、上述した本発明のヒト及び動物のタンパク質凝集塊の分子構造を変質する化合物を、血液製剤に含まれるタンパク質凝集塊を除去するために用いることができる（タンパク質凝集塊が血液製剤に含まれる可能性を考慮して、当該化合物を予防的に用いる場合も含む）。従来のタンパク質凝集塊であるＰｒＰ^Ｓｃを除去する方法としては、フィルタや担体を用いて、ＰｒＰ^Ｓｃを吸着させることにより除去される方法が提案されていた。例えば、特許文献５には、異型断面繊維不織布と、２０モル％以上４０モル％以下の疎水性重合性モノマー由来のユニットと５モル％以上１３モル％以下の塩基性含窒素部分を含む重合性モノマー由来のユニットと残余がプロトン性中性親水性部分を含む重合性モノマー由来のユニットである３つのユニットから構成されてなるポリマーをコートした担体を有するフィルタが記載されている。しかし、血液製剤に含まれるタンパク質凝集塊を不活化させる方法は、これまで報告されていない。

　一実施形態において、タンパク質凝集塊除去製剤は、フッ素系アルコール又は上記一般式（１）で示される化合物を含有する。例えば、血液製剤中に０．１ｐｐｍ～５０００ｐｐｍの濃度範囲でＨＦＩＰを添加することにより、タンパク質凝集塊を不活化させることができる。このため、タンパク質凝集塊が血液製剤に混入していても、本実施形態に係るタンパク質凝集塊除去製剤により、タンパク質凝集塊が不活化され、感染リスクがない安全な血液製剤を提供することができる。

　一実施形態において、フッ素系アルコール又は上記一般式（１）で示される化合物と、フッ素系アルコール又は上記一般式（１）で示される化合物を保持する支持体とを含む、構造体を用いることにより、タンパク質凝集塊を不活化する方法を提供することができる。例えば、フッ素系アルコール又は上記一般式（１）で示される化合物をフィルタや担体等の支持体に担持若しくは含浸させてなる構造体を、血液製剤と接触させることで、血液製剤中のタンパク質凝集塊を不活化させることができる。支持体に用いるフィルタや担体は、当該技術分野において公知の材質から採用してもよく、例えば、セルロース等の天然高分子、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、テフロン（登録商標）等の合成高分子、シリカ、アルミナ、ゼオライト等の無機物等が一例として挙げられる。また、構造体の形状としては、特に限定されず、例えば、メンブレン（膜）、メッシュ、不織布、中空糸、スポンジ、粉末、微粒子等の形状としてもよい。

　以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。

＜分子構造変質剤＞
　タンパク質凝集塊の分子構造を変質する化合物として、ＨＦＩＰ（セントラル硝子株式会社、純度９９％以上）を用いた。

＜マウス神経芽細胞腫由来細胞＞
　マウス神経芽細胞腫由来の培養細胞において、正常型プリオンタンパク質（ＰｒＰ^Ｃ）を産生するＮｅｕｒｏ　２ａ（Ｎ２ａ）細胞と、異常型プリオンタンパク質（ＰｒＰ^Ｓｃ）を持続産生するＳｃＮｅｕｒｏ　２ａ（ＳｃＮ２ａ）細胞の２種類の細胞株（ＡＴＣＣ）を準備した。２種類の細胞株は、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）および１００　Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むイーグル最小必須培地（Ｅ－ＭＥＭ）（富士フイルム和光純薬株式会社）中で加湿、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。細胞培養容器には細胞培養用ディッシュ（ＡＧＣテクノグラス株式会社）および細胞培養用マイクロプレート（６ウェル又は２４ウェル、ＡＧＣテクノグラス株式会社）を用いた。

　細胞培養用２４ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０^５個の細胞を播種し、Ｎ２ａ細胞及びＳｃＮ２ａ細胞をＥ－ＭＥＭで、各々５％ＣＯ_２中３７℃の条件下で２日間インキュベートした。

［実施例１］
　上述したＨＦＩＰに対する感受性の評価において、培地中のＨＦＩＰの最終濃度がそれぞれ０ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭとなる各種培地を用いて評価した。ここで、「Ｍ」はモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）を示す。これらをＳｃＮ２ａ細胞に添加して、２４時間の細胞培養を行った。

［比較例１］
　使用した細胞をＮ２ａ細胞に変更したこと以外は、実施例１と同様に行った。

＜ＨＦＩＰに対する感受性の評価＞
　各々の細胞のＨＦＩＰに対する感受性の評価は、クリスタルバイオレットを用いた細胞染色によって行った。ここでクリスタルバイオレットは生細胞の細胞膜に結合し、紫色に染める試薬である。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）にて１回洗浄した後、１００％メタノールを添加し、室温で１５分インキュベートすることで細胞を固定した。次いでメタノールを除き、０．０５％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ％）クリスタルバイオレット溶液（富士フイルム和光純薬株式会社）を加え、１５分室温にて静置することで細胞染色を行なった。クリスタルバイオレット溶液をピペットで除いた後、ウェルごとの染色された面積から、生細胞数を評価した。細胞染色後の実施例１のプレート外観写真を図１の下段に示し、比較例１のプレート外観写真を図１の上段に示す。

　図１に示すようにＮ２ａ細胞が生存可能なＨＦＩＰの濃度上限は２５ｍＭ、一方でＳｃＮ２ａ細胞が生存可能なＨＦＩＰの濃度上限は２０ｍＭであった。この結果はＮ２ａ細胞とＳｃＮ２ａ細胞でＨＦＩＰに対する感受性が異なっていることを示している。このようにＨＦＩＰに対する感受性が異なるため、ＨＦＩＰは異常構造をとったプリオンタンパク質の検出に利用可能であることが示された。ゆえに、β－シート構造やアミロイド構造をとるようなタンパク質ミスフォールディング病の簡易スクリーニングや診断に好適に利用可能であることが示された。

＜プロテアーゼ抵抗性の評価＞
　細胞培養用６ウェルプレートに、１ウェルあたり３×１０^５個の細胞を播種し、Ｎ２ａ細胞及びＳｃＮ２ａ細胞をＥ－ＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ_２下にて２日間インキュベートした。

［実施例２］
　ＳｃＮ２ａ細胞の培地をＨＦＩＰの最終濃度が６ｍＭとなる培地に交換して、２４時間インキュベートした。

［比較例２］
　使用した細胞をＮ２ａ細胞に変更したこと以外は、実施例２と同様に行った。

　２４時間インキュベート後に培地を吸引除去し、各々の細胞を冷却したＰＢＳにて洗浄した。次いで冷却したＲＩＰＡバッファー（富士フイルム和光純薬株式会社）を１ウェルあたり５００μＬ添加し、１分間氷上で静置することで細胞を溶解した。細胞溶解液全量を１．５ｍｌチューブ中に回収し、４℃、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。遠心上清のうち２００μＬを新しいチューブに移し、プロテアーゼＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ、ナカライテスク株式会社）を終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃の恒温槽にて３０分間反応させた。次いでＰｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ナカライテスク株式会社）を加え、室温でチューブローターを用いて５分間反応させることでプロテアーゼＫ活性を失活させた。

　次いで４℃、１３０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し、上清をピペットにて除去した。沈降画分に対して、ゲル電気泳動用溶解バッファー（１５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（トリス塩酸バッファー）　ｐＨ６．８、６％　ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、３０％　グリセロール、０．０１％　ＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）、１００ｍＭ　ＤＴＴ（ジチオトレイトール））２０μＬを加え、９５℃で５分間インキュベートし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）に供した。

　プロテアーゼＫ抵抗性のプリオンタンパク質の検出にはウエスタンブロット法を用いた。試料は１５％アクリルアミドゲル（ディー・アール・シー株式会社）を用い、Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ　ＳＤＳ　Ｒｕｎｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ　Ｇｌｙｃｉｎｅ、０．１％　ＳＤＳ）にて、１００Ｖで１５分間泳動し、タンパク質を分子量に応じて分離した。

　泳動後のゲルをＰＶＤＦ膜（ポリフッ化ビニリデン）に転写した。ＰＶＤＦ膜として、ｉＢｌｏｔ２　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｓｔａｃｋｓ、ＰＶＤＦ、ｒｅｇｕｌａｒ　ｓｉｚｅ（Ｃａｔ．ＩＢ２４００１）を使用した。転写にはｉＢｌｏｔ　Ｇｅｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｄｅｖｉｃｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて、２０Ｖで１分間、２３Ｖで４分間、２５Ｖで２分間の計７分通電して行った。転写後のＰＶＤＦ膜は５％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ％）スキムミルクを含有したＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ－Ｔ）にて室温で３０分間処理を行い（ブロッキング）、ＰＢＳ－Ｔにて１０００倍希釈した抗ＰｒＰ抗体（Ｃａｔ．Ａ０３２０７、ＳＰＩ－Ｂｉｏ）をＰＶＤＦ膜に添加し、室温で一晩インキュベートした。１５分で１回、５分で３回、振盪しながらＰＢＳ－ＴにてＰＶＤＦ膜を洗浄した後、ＰＢＳ－Ｔにて５０００倍希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｃａｔ．Ｗ４０２１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、室温で１時間振盪しながらインキュベートした。その後、１５分で１回、５分で３回振盪しながらＰＶＤＦ膜をＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、化学発光試薬（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎウェスタン化学発光ＨＲＰ基質、Ｍｅｒｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をＰＶＤＦ膜に添加し、１分間インキュベートした後、画像解析装置（ＣｈｅｍｉＤｏｃ　Ｔｏｕｃｈ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）にてプロテアーゼＫ抵抗性プリオンタンパク質の検出を行なった。

　実施例２のウエスタンブロッティングの結果を図２の＃５～＃８に示し、比較例２のウエスタンブロッティングの結果を図２の＃１～＃４に示す。

　図２に示すように、比較例２のＮ２ａ細胞から抽出されたタンパク質は、ＨＦＩＰの添加有無に関わらず、プロテアーゼＫで分解されることが示された（＃１～＃４）。しかしながら、実施例２のＳｃＮ２ａ細胞から抽出されたタンパク質は、ＨＦＩＰの添加の有無でプロテアーゼＫに作用させた後のバンドに変化が認められた。これはＨＦＩＰを添加したＳｃＮ２ａ細胞において、プロテアーゼＫに対する抵抗性が低下したことを示している。したがってＨＦＩＰはＳｃＮ２ａ細胞におけるＰｒＰ^Ｓｃの異常構造を緩和させる活性を有することが示唆された。

　本発明におけるタンパク質凝集塊を含有する細胞を選択的に死滅させる方法及びそのキットは、タンパク質ミスフォールディング病の診断用途として有用に用いられる。また、タンパク質ミスフォールディング病の治療にも応用可能である。

１００　検査装置、１１０　入力部、１２０　検出部、１３０　記憶部、１４０　表示部、１５０　制御部、１６０　演算部、１７０　電源装置、１８０　通信部、２００　ネットワーク、３００　サーバ、４００　端末

Claims (14)

1. 　フッ素系アルコール又は下記一般式（１）で示される化合物を含有する分子構造変質剤を細胞に作用させ、
   　タンパク質凝集塊を含有する細胞を選択的に死滅させる方法。
   

   

   
   （前記一般式（１）中、aは０又は１であり、
   a＝１である場合、R¹が水素原子であり、且つR²が水酸基である、又はR¹が水酸基であり、且つR²が水素原子であり、
   a＝０である場合、R²は炭素原子と二重結合を形成する酸素原子であり、
   R³は、CH_lCl_mF_nであり、lは０から３までの整数であり、m及びnは１から３までの整数であり、l＋m＋n＝３を満たし、
   R⁴は、CH_sCl_tF_uであり、sは０から３までの整数であり、t及びuは１から３までの整数であり、s＋t＋u＝３を満たし、
   l＋s＜６を満たす。）
2. 　前記フッ素系アルコールが、一般式ＲｆＣＨ_２ＯＨ、またはＲｆＲｆ’ＣＨＯＨで示され、
   Ｒｆ及びＲｆ’は炭素数１～１０のパーフルオロアルキル基を示し、
   ＲｆとＲｆ’は互いに異なる又は同じである請求項１に記載の細胞を選択的に死滅させる方法。
3. 　前記フッ素系アルコールが、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールである請求項１に記載の細胞を選択的に死滅させる方法。
4. 　前記細胞に作用させる際のフッ素系アルコール又は前記一般式（１）で示される化合物の濃度が、１０ｐＭから１００ｍＭの範囲内である請求項１に記載の細胞を選択的に死滅させる方法。
5. 　フッ素系アルコール又は下記一般式（１）で示される化合物を含有する細胞を選択的に死滅させるキット。
   

   

   
   （前記一般式（１）中、aは０又は１であり、
   a＝１である場合、R¹が水素原子であり、且つR²が水酸基である、又はR¹が水酸基であり、且つR²が水素原子であり、
   a＝０である場合、R²は炭素原子と二重結合を形成する酸素原子であり、
   R³は、CH_lCl_mF_nであり、lは０から３までの整数であり、m及びnは１から３までの整数であり、l＋m＋n＝３を満たし、
   R⁴は、CH_sCl_tF_uであり、sは０から３までの整数であり、t及びuは１から３までの整数であり、s＋t＋u＝３を満たし、
   l＋s＜６を満たす。）
6. 　前記フッ素系アルコールが、一般式ＲｆＣＨ_２ＯＨ、またはＲｆＲｆ’ＣＨＯＨで示され、
   Ｒｆ及びＲｆ’は炭素数１～１０のパーフルオロアルキル基を示し、
   ＲｆとＲｆ’は互いに異なる又は同じである請求項５に記載の細胞を選択的に死滅させるキット。
7. 　前記フッ素系アルコールが、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールである請求項５に記載の細胞を選択的に死滅させるキット。
8. 　前記細胞に作用させる際のフッ素系アルコールの濃度又は前記一般式（１）で示される化合物が、１０ｐＭから１００ｍＭの範囲内である請求項５に記載の細胞を選択的に死滅させるキット。
9. 　フッ素系アルコール又は下記一般式（１）で示される化合物を含有するタンパク質ミスフォールディング病治療薬。
   

   

   
   （前記一般式（１）中、aは０又は１であり、
   a＝１である場合、R¹が水素原子であり、且つR²が水酸基である、又はR¹が水酸基であり、且つR²が水素原子であり、
   a＝０である場合、R²は炭素原子と二重結合を形成する酸素原子であり、
   R³は、CH_lCl_mF_nであり、lは０から３までの整数であり、m及びnは１から３までの整数であり、l＋m＋n＝３を満たし、
   R⁴は、CH_sCl_tF_uであり、sは０から３までの整数であり、t及びuは１から３までの整数であり、s＋t＋u＝３を満たし、
   l＋s＜６を満たす。）
10. 　前記フッ素系アルコールが、一般式ＲｆＣＨ_２ＯＨ、またはＲｆＲｆ’ＣＨＯＨで示され、
    Ｒｆ及びＲｆ’は炭素数１～１０のパーフルオロアルキル基を示し、
    ＲｆとＲｆ’は互いに異なる又は同じである請求項９に記載のタンパク質ミスフォールディング病治療薬。
11. 　前記フッ素系アルコールが、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールである請求項９に記載のタンパク質ミスフォールディング病治療薬。
12. 　フッ素系アルコール又は下記一般式（１）で示される化合物を含有する、血液製剤からのタンパク質凝集塊除去製剤。
    

    

    
    （前記一般式（１）中、aは０又は１であり、
    a＝１である場合、R¹が水素原子であり、且つR²が水酸基である、又はR¹が水酸基であり、且つR²が水素原子であり、
    a＝０である場合、R²は炭素原子と二重結合を形成する酸素原子であり、
    R³は、CH_lCl_mF_nであり、lは０から３までの整数であり、m及びnは１から３までの整数であり、l＋m＋n＝３を満たし、
    R⁴は、CH_sCl_tF_uであり、sは０から３までの整数であり、t及びuは１から３までの整数であり、s＋t＋u＝３を満たし、
    l＋s＜６を満たす。）
13. 　前記フッ素系アルコールが、一般式ＲｆＣＨ_２ＯＨ、またはＲｆＲｆ’ＣＨＯＨで示され、
    Ｒｆ及びＲｆ’は炭素数１～１０のパーフルオロアルキル基を示し、
    ＲｆとＲｆ’は互いに異なる又は同じである請求項１２に記載の血液製剤からのタンパク質凝集塊除去製剤。
14. 　前記フッ素系アルコールが、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールである請求項１２に記載の血液製剤からのタンパク質凝集塊除去製剤。

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