HU210145B - Process for prepg. a mixture of gangliosides free from contamination by non-conventional viruses and pharmaceutical compn.s contg. them - Google Patents
Process for prepg. a mixture of gangliosides free from contamination by non-conventional viruses and pharmaceutical compn.s contg. them Download PDFInfo
- Publication number
- HU210145B HU210145B HU912391A HU239191A HU210145B HU 210145 B HU210145 B HU 210145B HU 912391 A HU912391 A HU 912391A HU 239191 A HU239191 A HU 239191A HU 210145 B HU210145 B HU 210145B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- mixture
- ganglioside
- raw material
- priority
- acetone
- Prior art date
Links
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 title claims description 105
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 58
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 31
- 238000011109 contamination Methods 0.000 title claims description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 75
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 72
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 68
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 36
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 34
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 32
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 29
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 23
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 19
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 19
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 18
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 18
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 17
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 claims description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 13
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 11
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 11
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 11
- 239000013058 crude material Substances 0.000 claims description 8
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 8
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 8
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 7
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- NEHMKBQYUWJMIP-NJFSPNSNSA-N chloro(114C)methane Chemical compound [14CH3]Cl NEHMKBQYUWJMIP-NJFSPNSNSA-N 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N ganglioside GM1 Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N 0.000 claims 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 40
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 34
- 239000000047 product Substances 0.000 description 26
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 23
- 208000008864 scrapie Diseases 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 208000018756 Variant Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 18
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 14
- 102100025818 Major prion protein Human genes 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 11
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 11
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 7
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 6
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 5
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 5
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 4
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 4
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 4
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 4
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 4
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 4
- 206010008129 cerebral palsy Diseases 0.000 description 4
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 3
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 3
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 229940045641 monobasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 3
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 3
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000006373 Bell palsy Diseases 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 206010029240 Neuritis Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 2
- 108010007288 PrPSc Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 2
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 2
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 2
- XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N Trichloroethylene Chemical group ClC=C(Cl)Cl XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000036826 VIIth nerve paralysis Diseases 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 2
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940036811 bone meal Drugs 0.000 description 2
- 239000002374 bone meal Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 description 2
- 230000003588 decontaminative effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000005171 mammalian brain Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001328 optic nerve Anatomy 0.000 description 2
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 2
- 238000010972 statistical evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 2
- 208000012260 Accidental injury Diseases 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 208000019736 Cranial nerve disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 235000019733 Fish meal Nutrition 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 201000010743 Lambert-Eaton myasthenic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241001233242 Lontra Species 0.000 description 1
- 235000019735 Meat-and-bone meal Nutrition 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 1
- 208000019430 Motor disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 description 1
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 1
- 208000003926 Myelitis Diseases 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 208000036110 Neuroinflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical group N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 208000037169 Retrograde Degeneration Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000012936 Sheep disease Diseases 0.000 description 1
- 102000007365 Sialoglycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010032838 Sialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000009692 acute damage Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 210000003403 autonomic nervous system Anatomy 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- KTUQUZJOVNIKNZ-UHFFFAOYSA-N butan-1-ol;hydrate Chemical compound O.CCCCO KTUQUZJOVNIKNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003181 encephalopathic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003257 excitatory amino acid Substances 0.000 description 1
- 230000002461 excitatory amino acid Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000004467 fishmeal Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- -1 ganglioside GD Chemical class 0.000 description 1
- 239000003502 gasoline Substances 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 150000002339 glycosphingolipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000036732 histological change Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 206010023497 kuru Diseases 0.000 description 1
- 238000011694 lewis rat Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000003818 metabolic dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011206 morphological examination Methods 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 208000004296 neuralgia Diseases 0.000 description 1
- 230000007472 neurodevelopment Effects 0.000 description 1
- 230000003959 neuroinflammation Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 231100000112 neuronotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003168 neuronotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 235000003170 nutritional factors Nutrition 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 238000012335 pathological evaluation Methods 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 208000027232 peripheral nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 235000021025 protein-rich diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 206010044652 trigeminal neuralgia Diseases 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
- C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
- C07H15/10—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical containing unsaturated carbon-to-carbon bonds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/06—Separation; Purification
- C07H1/08—Separation; Purification from natural products
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány tárgya gangliozidok speciális keverékének előállítására szolgáló eljárásra és az ilyen eljárással előállított termékre vonatkozik, amely eljárás szelektíven kiküszöböli a nem szokványos, életet veszélyeztető vírusokkal kapcsolatos szennyezéseket anélkül, hogy az elegy biológiai és farmakológiai jellemzőit a központi és a perifériás idegrendszerre gyakorolt hatásai tekintetében megváltoztatná.
Sziálsavat tartalmazó gangliozidok, glikoszfingolipidek emlősök minden sejtmembránjának normális alkotórészei. Különösen sok van belőlük az idegszövetekben (Ando, S.: Neurochem. Int. 5, 507 /1983/). A Svennerholm szerinti elnevezésű (Svennerholm, L.: J. Neurochem. 10, 613 /1963/) négy gangliozid, GM,, GDla, GDlb és GT,b teszi ki az emlős agyvelő összes gangliozid tartalmának 80—90%-át. A gangliozidok speciálisan a plazma membrán külső rétegében helyezkednek el, ami arra utal, hogy fontos szerepet játszanak számos biológiai folyamatban, például „szenzorként” és/vagy receptorként különféle molekulák számára és az információ átvitelben a sejtmembránokon keresztül (Fiscman és mts.: Science 194, 906 /1976/). Kulcsszerepet játszanak tehát a neuronok fejlődésében és regenerálódásában a központi és a perifériás idegrendszerben.
Valóban rengeteg dokumentum támasztja alá, hogy a gangliozidok képesek kedvezően befolyásolni a perifériás és a központi idegrendszer károsodását követő funkcionális regenerálódást speciális membrán mechanizmusok révén és a neurotrófbiás faktorok kölcsönhatása következtében. Ezt in vitro neurontenyészeteken végzett vizsgálatok tárták fel (Doherty, P. és mts.: J. Neurochem. 44, 1259 /1985/; Skaper, S. és mts.: Molecular Neurobiology 3, 173 /1989/).
Konkrétan azt közölték, hogy a gangliozidok bevitele in vivő megkönnyíti az idegi regenerálódást és a funkciók visszanyerését a perifériás idegrendszerben kóros állapotban. Pozitív hatásokat írtak le sérüléses idegbántalmak (Ceccarelli, B. és mts.: Adv. Exp. Med. Bioi. 71, 275 /1976/, Plenum Press, New York; Gario, A. és mts,: Brain Rés, 7, 236 /1980/; Gario, A. és mts.: Neuroscience 8, 417 /1983/) anyagcsere eredetű idegbántalmak (Norido, F. és mts.: Exp. Neurol. 83, 221 /1984/) és mérgezéses idegbántalmak (Di Gregorio, F. és mts.: Cancer Chemother., Pharmacol. 26, 31 /1990/ modelljein.
Ami a központi idegrendszert illeti, széles körben közöltek pozitív hatásokat a monoszialogangliozid (GMj) okozta regenerálódásra az isémia modelljén (Cuello, A. C. és mts.: Brain Rés. 376, 373 /1986/; Karpiak, S. E. és mts.: CRC Critical Rév. in Neurobiology, 5. köt., 3. szám, 1990), sérüléses károsodás esetén (Toffano, G. és mts.: Brain Rés. 296, 233 /1984/) és neuronotoxikus károsodás esetén (Johnsson, J.: Dev. Brain Rés. 16, 171 /1984/) különböző állatfajok különféle neuronrendszereiben. Újabban kimutatták, hogy a gangliozidok gátolni tudják a protein-kináz C glutamát által okozott transzlokációját és aktiválódását (Vaccarino, F. és mts.: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84, 8707 /1987/). Ez a hatás nagyon fontos isémiás károsodások körülményei között, amikor is ismereteink szerint a serkentő hatású aminosavak, így a glutamát döntő szerepet játszanak, mivel olyan eseménysorozatot indítanak el, amely a neuronok elpusztulásához vezet. Ezzel a mechanizmussal javíthatjuk a neuronok túlélési esélyeit a károsodás körüli területen, megakadályozva a retrográd elfajulásokat és gyorsítva a regenerálódó növekedési választ a helyi táplálkozási tényezőkre.
A kísérleti kutatások eredményeit a gangliozidok klinikai alkalmazói teljes mértékben megerősítették. A gangliozidokat több, mint tíz éve használják gyógyszerként a perifériás idegbántalmak majdnem minden formájának kezelésére, kezdve a mechanikus károsodásból származó bajoktól a mérgezéses eredetűekig, a fertőzéses és gyulladásos rendellenességektől az anyagcsere funkciózavaráig. Ezek a szerek egyaránt hatásosaknak bizonyultak az egy vagy több ideget érintő bántalmak ellen, az érző-mozgató idegek rendellenességei ellen és az autonóm idegrendszert érintő betegségek, így számos, koponyaideget befolyásoló idegbántalom, például a Bell-féle bénulás, a trigeminális neugalgia és az övsömör okozta neuralgia ellen. A gangliozidokat, elsősorban a monogangliozidokat széles körben alkalmazzák minden olyan megbetegedés esetén, amely a központi idegrendszer érrendszeri vagy sérüléses heveny károsodásával kapcsolatos és az ilyen betegségek következményei (agy-isémia, koponya- és gerincsérülés) esetén.
A központi idegrendszerre ható, igazolt regenerálóképességük is alátámasztja alkalmazásukat olyan, krónikus idegkorcsosodások ellen, mint a Parkinson-kór és az Alzheimer-kór. Mivel ezek természettől fogva endogén szerek, vagyis az idegsejt membrán természetes alkotói, a szervezet kiválóan tűri őket, még hosszantartó nagy adagolásuk sem jár mellékhatásokkal, ellentétben a perifériás idegbántalmak néhány szokásos kezelése során gyakori ártalmakkal.
Általában megfelelő gangliozid keverékeknek, például amely 18-24% GMret, 36-44% GDla-t, 12-18% GDlb-t és 16-22% GTjb-t tartalmaz, vagy egyedi gangliozid frakcióknak, elsősorban a GM] monoszialogangliozidnak a fent leírt biológiai aktivitása van. Ezeket a gangliozidokat, akár mint alkalmas keverékeket, akár egyedi frakciókként, elsősorban mint a GM, monoszialogangliozidot, emlősök agyvelejéből extrahálják. Szükségszerű tehát a fent ismertetett különleges biológiai funkciójuk és gyógyászati alkalmazásuk miatt a perifériás és a központi idegrendszer kezelésében, hogy olyan tisztítási módszereket alkalmaztunk, amelyek tökéletesen tiszta, biológiai és kémiai szennyezésektől mentes végterméket biztosítanak.
Hosszú ideje ismeretes, hogy kutatási szinten ki lehet nyerni a gangliozidok keverékeit (Tettamanti és mts.: Biochim. Biophys. Acta 296, 160 /1973/; Trams és mts.: Biochim. Biophys. Acta 60, 350 /1962/; Bogoch és mts.: Brit. J. Pharm. 18, 625 /1962/; Wiegandt és mts.: Angew. Chem. 80, 89 /1968/; 3 436 413. USAbeli szabadalmi leírás; Chemical Abstracts 61, 9851c és 9895d), de az említett módszerek egyike sem fordított figyelmet annak bemutatására, hogy kiküszöbölték
HU 210 145 Β és elbontották volna a nem szokványos vírusokkal kapcsolatos komponenseket. Ennek egyik oka az, hogy abban az időben még nem ismerték azokat a betegségeket, amelyekben az agy velejük extrahálására használt emlős fajok szenvedhettek. A másik ok az. hogy nem álltak rendelkezésre olyan reagensek, amelyek ezen esetleg veszélyes komponensek specifikus azonosítására alkalmasak lettek volna. Ma azonban már kifejlesztettek ilyen reagenseket, újabban szerzett ismeretek alapján kidolgozott eljárásokkal, amelyek a molekuláris biológiai módszerek tudományos fejlődésén alapulnak.
Sokszor adódnak olyan kóros esetek, amikor a kórokozó vagy kórokozók nem azonosíthatók. Egy ilyen kóreset a szarvasmarha szivacsszerű elváltozást okozó agyvelőbántalma (BSE), amelyet először Angliában írtak le 1986-ban (Wells, G. és mts.: Vet Record 419 /1986/). A nevét onnan kapta, hogy a benne szenvedő állatok agyszövete szivacsos megjelenésűvé válik. Ha a szövet metszeteit mikroszkóp alatt vizsgáljuk, a fő károsodás az idegsejtekben lévő vakuólák elszaporodása.
Minden rendelkezésünkre álló bizonyíték azt támasztja alá, hogy a BSE a központi idegrendszer elfajulásos agyvelőbántalmainak kategóriájába tartozik, amely menthetetlenül halálos, és amelyet a nem szokványos fertőzőanyagok csoportjába tartozó kórokozó idéz elő (Fraser és mts.: Vet. Record 123, 472 /1988/; Hope és mts.: Natúré 336, 390 /1988/). Ebbe a csoportba tartozik a juhok és kecskék „scrapie” betegsége, a fogságban tartott őzek krónikus sorvadása, vidratenyészetek állatainak fertőzéses agyvelőbántalma és két emberi betegség, a kuru és a Creutzfeldt-Jacob kór. E betegségek által okozott szövetkórtani károsodások mindegyik esetben hasonlóak, és összevethetők a BSEvel is. Számos elmélet született már ezeknek a kórokozóknak a természetére vonatkozóan, amelyek nem is baktériumok, és nem is vírusok, különböznek minden más szervezettől, ezért nem szokványos vírusoknak nevezték el őket. Hosszú lappangási idejük következtében, amely a fertőzés pillanatától a tünetek megjelenéséig eltelik, ezeket a vírusokat „lassú vírusoknak” is nevezik.
Az 1986-ban észlelt néhány eset óta a betegség elterjedt, és járványos méreteket öltött Nagy-Britanniában, ahol mintegy 14 000 szarvasmarha betegedett meg, és az esetek száma folyamatosan nő, hetenként mintegy 250-300-zal. A fertőzött szarvasmarhák évekig nem mutatják a betegség semmijeiét (a lappangási idő 4-5 év), de amikor a tünetek megjelennek, az állat gyorsan leromlik és elpusztul.
A Brit Mezőgazdasági Minisztérium Központi Állatorvosi Laboratóriuma által végzett járványtani vizsgálat (Wilesmith és mts.: Vet. Record, 123, 638 /1988/) szerint a fertőzés forrása a takarmány, amelyet más kérődzők teteméből dolgoznak fel és húsliszt vagy csontliszt formában hoznak forgalomba. Mivel az agyvelőbántalmak igen sokféle állatfajba átvihetők, ésszerűnek tűnik az a feltételezés, hogy a BSE-t annak a kórokozónak a fertőzése okozza, amely a „scrapie” betegségért is felelős, és amely e szennyezett táplálékkal kerül át a juhokból a marhákba (Morgan, K. L.: Vet. Record 122, 445 /1988/).
E vizsgálatok eredményei alapján a brit kormány 1988. július 18-án hatályba lépett rendeletével megtiltotta kérődzőkből származó állati fehérjét tartalmazó állattakarmányok árusítását és alkalmazását.
Általános vélemény szerint sok tényező együttesen eredményezte a BSE hirtelen fellépését Angliában (Cherfas, J.: Science 1990. febr., 523).
Először is a juhok száma igen rohamosan nőtt Nagy-Britanniában a 70-es évek végén és a 80-as évek elején. Ezzel nőtt a „scrapie” betegség előfordulása is, amely különben 250 éve ismert, szórványos juhbetegség Európában (Pattison és mts.: Vet. Record 90, 465 /1972/). Ugyanakkor az olajválság hatására az állattakarmányokat gyártó vállalatok megváltoztatták a tetemfeldolgozási módszereiket, áttérve alacsonyabb hőmérsékletű technológiákra, amelyek valószínűleg kevésbé hatásosan bontották le az igen ellenálló kórokozót. Egy kivételével mindegyik ilyen takarmánygyártó elhagyta az oldószert (benzolt, hexánt, triklór-etilént), amellyel a fölösleges zsírt a szójalisztből és a csontlisztból eltávolította. De talán mind között a leglényegesebb az volt, hogy következetesen elhagyták a termék kimelegítését a gyártás utolsó stádiumában az oldószerek eltávolítása céljából, mivel ez valóban igen magas hőmérsékletet igényel.
Ráadásul a kormány állandóan serkentette az állattenyésztőket a nagyobb tejtermelésre. Ezért a borjakat korán elválasztották, és fehérjedús táplálékon tartották. Ezek gyakran silány minőségűek voltak, mivel a húsliszt és a csontliszt olcsóbb, mint a szójaliszt és a halliszt, amelyek pedig biztonságosabb fehérjeforrások. A betegségátvitel módjának kutatása alapvető a BSE megismerése szempontjából. E vizsgálatok legfontosabb pontja a fajok azon körének meghatározása, amelyen belül a kórokozó átvihető, és a BSE fertőzés veszélye fennáll. Fraser és mts. (Vet. Record 123, 472 /1988/) kimutatta, hogy a betegség szarvasmarháról egérre is átvihető. BSE-ben elpusztult marha agyvelőkivonatát beoltotta egér agyvelőbe, ahol is a betegség ez után kifejlődött. Később Barlow és mts. (Vet. Record 1990. febr. úgy is átvitte a betegséget egerekbe, hogy fertőzött agyvelővel táplálta őőket. Ez volt az első bizonyíték arra, hogy a BSE terjeszthető a fertőzött anyaggal való táplálás útján is. A betegségben szenvedő állatok semmilyen más szövetével (lép, gerincvelő, nyirokszövetek, tej stb.) nem lehetett a betegséget egerekben előidézni.
Bizonyíték van arra is, hogy a „scrapie” betegség a juh anyáról átvihető a kölykére, de arra még nincs, hogy a BSE kórokozója szarvasmarhában terjedhet-e egyeneságon vagy oldalágon.
E félheveny, fertőzéses agyvelőbántalmakat okozó anyagok rendkívül ellenállók a szokásos szennyezésmentesítő eljárásokkal szemben. Ilyen adatok legnagyobbrészt a „scrapie” betegség és a Creutzfeldt-Jacob kór kórokozóinak hatástalanítására vonatkozó vizsgálatokból származnak. A „scrapie” kórokozója igen el3
HU 210 145 Β lenálló a hőmérséklet változásaival szemben. 80 °C-ig a fertőzőképessége csak kis mértékben csökken; ennél magasabb hőmérsékleten azonban jelentősen gyengül (Hunter és mts.: J. Gén. Microbiol. 37, 251 /1964/). De kis mennyiségű, fertőző „vírus” néha még akkor is megmarad, ha a fertőzött anyagot 1 órát 100 °C-on vagy 10 percig 118 °C-on melegítik.
Újabban felmerült annak igénye, hogy e fertőző anyagok nagynyomású gőzzel autoklávban végzett sterilizálására vonatkozó szabványokat felújítsák. Jelenleg az Egyesült Államokban a Creutzfeldt-Jacob kór elleni sterilizálás autoklávozásának szabványa 1 órás 132 °C-os kezelést ír elő (Rosenberg és mts.: Annals of Neurology 19, 75 /1986/). Angliában a Creutzfeldt-Jacob kór elleni autoklávos fertőtlenítés szabványa 134— 138 ’C-os melegítést tartalmaz 18 percig, Kimberlin és mts. (J. Neurol. Sci. 59, 355 /1983/) valamint mások vizsgálatai alapján. Sajnos a szarvasmarha szivacsszerű elváltozást okozó agyvelőbántalmának (BSE) kórokozói igen ellenállók a szokásos kémiai és fizikai kezelésekkel szemben. Extrahálásukra olyan oldószereket alkalmaznak, mint benzol, hexán, benzin és triklór-etilén, de ezek hatásáról vagy hatástalanságáról keveset tudunk. A fertőző anyag kémiai hatástalanításáról csak kevés adat áll rendelkezésünkre, főleg azért, mert a vizsgálatok nagyszámú állatot és hosszú megfigyelési időt tesznek szükségessé. Nátrium-hipoklorit 0,3 és 2,5% közötti koncentrációban nagy mértékben csökkenti a fertőzőképességet, de többnyire nem küszöböli ki Walker és mts. (Am. J. Publ. Health 73, 661 /1983/) biológiai vizsgálatai szerint. 0,25 N nátriumhidroxidos kezelésére vonatkozó adatok igen változatosak; 1 N feletti koncentrációkban azonban az összes vizsgált közül ez bizonyult a leghatásosabb vegyszernek. 6-8 M karbamidos kezelésről szóló közlemények igen változatos eredményekről számolnak be.
E szennyezésmentesítő vizsgálatok eredményei tehát azt mutatják, hogy bár a fertőző anyagok túlnyomó része gyorsan megsemmisül számos, különféle fizikai és kémiai eljárás során, az ellenálló fertőző anyagok kis részpopulációinak megmaradása miatt a szennyezett anyagok sterilizálása a gyakorlatban igen nehéz.
Miután a BSE-t „scrapie”-szerű betegségként azonosították, járványtan! és analitikai szempontból egyaránt felmerül a kérdés, hogyan azonosítható a fertőzéssel kapcsolatba hozható anyag. A kórokozóhoz kapcsolódó nukleinsavak meghatározására azonban minden eddigi erőfeszítés eredménytelen maradt. Az egyetlen olyan elkülönített komponens, amely egyértelműen összefüggésben van a fertőzési folyamattal, a „scrapie prion protein”-nek (PrSc) nevezett szialoglikoprotein.
E fehérje későbbi genetikai vizsgálatai meglepő tapasztalatokat szolgáltattak. E fehérje szekvenciák Nterminális alaján szintetizált bizonyos DNS próbákkal ki lehetett mutatni olyan egyedi kromoszómái is gén kópia jelenlétét, amelynek mind az egészséges állatok, mind a fertőzött állatok agy velejében azonos restrikciós mintázata volt. Ez a gén, amely igen különböző állatfajokban is megőrződik, kódolja a sejtbeli prion proteinnek (PrPc) nevezett fehérjét, amelynek látszólagos móltömege 33-35-ezer dalton, ez viszont határozott különbségeket mutat a PrPsc-hez képest:
1) A PrPc emészthető a proteázzal, míg a PrPSc ellenáll vele szemben. Konkréztan míg a PrPc teljesen lebomlik a proteináz K enzim hatására, a PrPSc N-terminális szinten hidrolizálódik mintegy 5000 daltonos töredékre, és PrP27_30-nak nevezett fehérjét eredményez. Ez a forma a fertőzőképesség kísérője marad, és a legfőbb komponense a fertőző anyag készítményének.
2) Mind a PrPc, mind a PrPSc membránfehérje, de míg az előbbi detergens kezelés hatására oldhatóvá válik, addig az utóbbi polimerizációra hajlamos, és szálas amiloid szerkezetté alakul át. Hasonló szerkezeteket (SAF, scrapie-vel kapcsolatos rostok) találtak fertőzött agyban, sót ez jellegzetes volt az ilyen típusú fertőzések esetén. E fertőző fehérje ellenállóképessége az inaktiválással szemben szokatlan: ugyanis érzékeny például tömény lúgos oldatokra vagy 120 ’C feletti hókezelésre és ezek kombinációira vagy ezek együttes alkalmazására denaturálószerekkel. Következésképpen a szivacsszerű elváltozást okozó agyvelőbántalmak egyértelmű azonosítására az egyetlen diagnosztikai módszer a SAP jelenlétének igazolása a fertőzött agyszövetben, illetve a PrP27_30 fehérje extrahálása és immunkémiai azonosítása. Ezek a módszerek azonban csak a kórbonctani eljárás során alkalmazhatók.
A SAF-ot azonosították fertőzött marha agyvelőben, majd izolálták a PrPSc homológját is, amely reakcióképes volt az egerek SAF elleni szérumával. Az N-terminális első 12 aminosavjának szekvenciája 100%-os homológiát mutatott a PrPSc-vel juhok esetében, míg egérnél, hörcsögnél és embernél egy glicin beiktatódása a különbség. Amint ezt megállapították, a BSE-t „scrapie”-típusú betegségként sorolták be, és fontos járványtant és analitikai problémákat vetettek fel, utóbbiakat elsősorban a fertőzőképességgel összefüggésbe hozható fehérje azonosításra vonatkozóan.
A BSE váratlan felbukkanása és az összes többi, egyelőre megmagyarázhatatlan neurológiai rendellenesség szükségessé tette, hogy e problémával behatóan foglalkozzanak, különösen azok, akik érdekeltek szarvasmarha eredetű termékek előállításában.
Sőt élelmezési célokra engedélyezett nyersanyagok használata sem elégséges, ha gyógyszerészeti vegyületeket vagy azok keverékeit állítjuk elő. Olyan előállítási módszereket kell tehát kidolgozni, amelyekben az extrakciós eljárások szavatolják a fertőzőképességgel kapcsolatos feltétjének és magának a fertőzőképességnek a kiküszöbölését. Nyilvánvaló, hogy a fertőzőképes frakció extrakciós eljárása ugyanakkor meg kell, hogy őrizze a végterméktől elvárt biológiai aktivitást.
A másik veszély fonást jelentő fehérje emberre nézve ebben az előállításban a gerincvelő bázikus fehérjéje (MBP).
Ennek a fehérjének a móltömege emberben és a legtöbb gerincesben mintegy 19,5 kilodalton (Da). Az
HU 210 145 Β emberi gerincvelőben háromféle molekuláris alakban van jelen, egérben hatfélében. Egyetlen gén kódolja, amely a 18. kromoszómán helyezkedik el, és a gerincvelő összes fehéijetartalmának mintegy 30%-át teszi ki. Pontos topográfiája még nem ismeretes egyértelműen. Az oligodendrociták citoplazmájában csak a velőhüvelyképződés pillanatában észlelhető. Ezzel azonosnak tekintett fehérje van a perifériás idegrendszerben is (pl. fehérje), amely képessé teszi a perifériás velőhüvelyt mesterséges allergiás agyvelő- és gerincvelőgyulladás előidézésére (EAE).
Nem az egész MBP molekula okozza az agyvelőgyulladást, hanem csak egy része, amely állatfajonként különböző: nyulak esetében az agyvelőgyulladást okozó rész a 64-73. aminosavtöredék, Lewis patkányban a 71-85, tengerimalacban a 113-121, SJL/J egérben a 89-169. aminosavszakasz. Az EAE tipikus sejtfüggő, autoimmun betegség. Valóban átvihető egyik állatról a másikra érzékenyített T-limfociták infúziójával, de nem vihető át szérum infúzióval. Ebben az esetben a betegséget a transzfundált limfociták hordozzák, nem pedig a recipienséi. Másik sejtfüggő autoimmun jelenség a mesterséges allergiás ideggyulladás (EAN). Ez is kiváltható a magasabbrendű gerincesek minden fajánál, ha a perifériás gerincvelő nyers homogenizátumát teljes Freud-féle adjuvánsban beadjuk. Azt tartják, hogy főként az antigén felelős ezért az autoimunizációért, amely nem más, mint a perifériás idegrendszerben jelen lévő, 12,0 kDa móltömegű P2 fehérje.
Másik figyelembe veendő szennyezője e készítményeknek a szarvasmarhában lévő genomiális DNS. Gyógyszerként használható, biológiailag aktív fehérjék előállításának lehetősége rekombináns DNS-technikával szükségessé teszi a végtermékek analízisét a DNS maradványok jelenlétére vonatkozóan, amelyek a kívánt fehérjét megjelenítő sejthez tartoznak. DNS töredékek jelenléte emberen használt gyógyszerkészítményekben annak a veszélyét rejti magában, hogy e töredékek beépülnek a genomba egy esetleges ellenőrizetlen genetikai információátvitel kíséretében. Még ha gangliozidokat nem is lehet rekombináns DNS-technikával előállítani, ilyen típusú analitikai ellenőrzés akkor is szükséges az extrakciós termékeken, amennyiben állati eredetű nyersanyagot használunk.
Végül az in vitro és in vivő vizsgálatokhoz használt gangliozidoknak egyéb olyan vegyületektől is menteseknek kell lenniük, mint az aszialogangliozidok és a glikocerebrozidok. Ezek az anyagok, ha nagy koncentrációban vannak jelen, fontos immunológiai következményekkel járhatnak, és hibás kísérleti következtetésekhez vezethetnek.
A BSE hirtelen kitörése és az összes egyéb, eddig még nem tisztázott jelenség e neurológiai rendellenességekkel kapcsolatban komoly megfontolásokat tesz szükségessé, különösen azok számára, akik szarvasmarha eredetű termékek előállításával foglalkoznak.
A korábbi eljárások gangliozidok előállítására, beleértve a fent idézetteket is, a termékektől megkívánják, hogy gyógyszerészetileg elfogadható legyen, ne tartalmazzon olyan biológiai szennyezőanyagokat, amelyekről az adott időpontban tudnivaló, hogy az egészségre ártalmas lehet. De a femt említett betegség későbbi kitörése felnőtt szarvasmarhákon aktívabb szemléletet tesz szükségessé, amely szerint biztosítani kell a nem szokványos vírusaanyagoktól való mentességet a fenti gyógyszerészeti tulajdonságok elvesztése nélkül, ami úgy érhető el, hogy speciális eljárásokkal biztosítják e nem szokványos vírusanyagok inaktiválását, a fertőzőképesség teljes megszüntetését és olyan speciális eljárások alkalmazását, amelyekkel az ilyen anyagok azonosíthatók. Valóban nem elegendő, ha a használt nyersanyagokkal kapcsolatban tanúsítják, hogy fogyasztásra alkalmasak, ahhoz, hogy vegyületeket vagy azok keverékeit gyógyászati célokra előállítsunk. A BSE kitörését nyilvánvalóan tekintetbe kell venni, figyelemmel az in vivő biológiai hatására, és az ellenőrzést ki kell terjeszteni az eljárás különböző fázisaira, és nem csak a végeredményt vizsgálni. A biológiai hatásnak ez az in vivő analízise azért szükséges, mert a kutatók még nem jutottak egyezségre abban, hogy a fertőzést bizonyos fehérjékkel, így a PrP27_30-cal hozzák összefüggésbe. Nyilvánvaló, hogy az az extrakciós eljárás, amely a fertőző hatást kiküszöböli, ugyanakkor érintetlenül kell, hogy hagyja a hatóanyag biológiai aktivitását, mivel ez szükséges a gyógyszerészeti alkalmazáshoz. (Ad hoc biotechnológiai/gyógyszerészeti munkacsoport: A vírus eltávolítás és inaktiválás eljárásának validálása. Európai Közösségek Bizottsága, 1990 március). Egyrészt a tudományos kutatás már szolgáltatott olyan módszereket, amelyek biztosítják, hogy a gangliozidok megfelelő keverékei vagy egyedi frakciói fehérjéktől és más kémiai vagy biológiai szennyezőktől mentesen előállíthatok. Másrészt vannak ugyan módszerek, amelyek hatásosnak bizonyultak a lassú vírusokkal kapcsolatos fertőzőképesség megszüntetésében, de olyan eljárás nem ismeretes, amely ipari méretekben is lehetővé teszi kívánság szerint olyan termékek előállítását, amelyek tiszták, gyógyszerészetileg aktívak, és mentesek a lassú vírusokként meghatározott kórokozókkal kapcsolatos fertőzőképességtől.
A rajzok ismertetése:
1. ábra: A hisztológiai elváltozások gyakoriságának értékelése.
2. ábra: Anti-PrP27_30 antitest alkalmazásával és Western Biot technikával kapott eredmények a találmány szerinti eljárás közti szakaszaiban vett minták analíziséből.
3. ábra: Genomiális szarvasmarha DNS analíziseredményei a találmány szerinti eljárás közti szakaszaiban vett mintákkal.
4. ábra: Anti-MBP antitest alkalmazásával és Western
Biot technikával kapott eredmények a találmány szerinti eljárás közti szakaszaiban vett minták analíziséből.
HU 210 145 Β
5. ábra: A találmány szerinti eljárással előállított gangliozid keverék szilikagél-kromatográfiás analízisének eredményei.
6. ábra: A találmány szerinti eljárással előállított gangliozid elegy biológiai aktivitása.
7. ábra: A találmány szerinti eljárás közti szakaszaiban vett minták anti-PrP27_3o antitestjeinek immunokémiai analízise.
A találmány célja a nem-konvencionális vírusszennyeződéstől mentes gangliozidelegy előállítása gangliozid-tartalmú állati szövetekből, főként szarvasmarha-agyszövetből, ipari méretekben is jól kivitelezhető eljárási műveletekkel. Az általában fagyasztott és megőrölt állati szövetekből kiinduló eljárás a következő lényeges lépésekből áll:
i) a gangliozid-tartalmú szövetet lipidmentesítésnek vetjük alá acetonnal;
ii) a kapott acetonos csapadékot egy a hidrofób anyagoknak a hidrofil anyagtól való elkülönítésére alkalmas első oldószerelegyben, előnyösen diklórmetán, metanol és valamely bázis elegyében szuszpendáljuk, a szuszpenziót melegítjük, majd centrifugáljuk;
iii) az így kezelt szuszpenzióból a szilárd részeket szűréssel eltávolítjuk, ív) a szűrletként kapott első folyadékfázist, amely a ii) lépésben alkalmazott első oldószerelegyben oldott gangliozid-tartalmú anyagot tartalmazza, ez utóbbinak kicsapására alkalmas oldószer hozzáadásával precipitációnak vetjük alá és a csapadékot (első nyersanyag) elkülönítjük.
v) a kapott első nyersanyagot oldatba visszük és az oldatot lúgos, előnyösen 12-es pH-értéken melegítjük;
vi) az így előkezelt első nyersanyagot egy második oldószeres megosztásnak vetjük alá valamely, a hidrofób anyagoknak a hidrofil anyagoktól való elkülönítésére alkalmas oldószereleggyel (második oldószerelegy), előnyösen víz, butanol és kloroform keverékével;
vii) a második oldószereleggyel kapott keverékből eltávolítjuk a szerves oldószeres fázist és megtartjuk a vizes fázist;
viii) a kapott vizes fázist ismét precipitációnak vetjük alá és a csapadékot (második nyersanyag) elkülönítjük, ix) a kapott második nyersanyagot oldatba visszük, majd hűtéssel ismét leválasztjuk,
x) a kapott szilárd részt (harmadik nyersanyag) valamely bázisban oldjuk;
xi) a harmadik nyersanyag így kapott oldatát semlegesítjük;
xii) a semlegesített oldatot dializáljuk egy 10 kD móltömeg áteresztési határú membránnal, xiii) és kívánt esetben a dializált oldatból a végterméket leválasztjuk és megszárítjuk, vagy xiv) kívánt esetben a végterméket pufferoldatban szuszpendáljuk és sterilizáljuk; vagy xv) kívánt esetben a kapott gangliozidelegy et szétválasztjuk az egyes gangliozid-komponensekre.
A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi előállítási példák szemléltetik.
1. ELŐÁLLÍTÁSI PÉLDA
A kiindulási anyag a szivacsszerű elváltozást okozó agyvelőbántalommal fertőzött szarvasmarha-agyvelő, amelyen a hisztológiai vizsgálat szerint a fertőzött állatoktól származó szövetekre jellemző fibrillák mutathatók ki.
Az eljárás folyamat-vázlata:
Fagyasztott agy szövet (I) porítás lipidek eltávolítása centrifugálás
-► folyadékfázis (2)
Nedves acetonos por (3) kezelés CH2C12 + CH3OH + NaOH elegyével centrifugálás szűrés
-► szilárd anyag (4)
Folyadékfázis lecsapás CaCl2 + acetonnal centrifugálás szárítás
Első gangliozid-nyersanyag (5) oldás és melegítés CH30H + NaOH oldattal semlegesítés megosztás víz és C4H9OH + CHC13 között -► szerves bázis (4a)
Vizes fázis + közbülső fázis lecsapás NaCl + acetonnal centrifugálás
-►folyadék fázis szárítás
Második gangliozid-nyersanyag oldás centrifugálás
-► szilárd anyag (6) hűtés centrifugálás
-► folyadékfázis (6a) szántás
Harmadik gangliozid-nyersanyag oldás NaOH-oldatban semlegesítés dialízis lecsapás —--►folyadékfázis (6b) szárítás
Végtermék (7) újraszuszpendálás foszfát pufferben sterilizálás hővel, autoklávban
Sterilizált végtermék (8)
Az eljárás menete:
1000 g fertőzött marha agy velőt megőrlünk és
HU 210 145 Β desztillált vízben szuszpendálunk, a szuszpenzióhoz 300-600 cm3 acetont (1:5 tömeg/térfogat arány) adunk és szobahőmérsékleten 3 óra hosszat keverjük.
Az elegyet ezután 6000 g-vel centrifugáljuk 4-7 °C hőmérsékleten, amíg a leválás teljessé nem válik. A folyadékfázist (2) eltávolítjuk és a kapott nedves acetonos porhoz (3) diklór-metán, metanol és nátrium-hidroxid elegyét adjuk, majd mágneses keverővei 30-35 °C hőmérsékleten legalább 3 óra hosszat keverjük. Ezután az elegyet lehűlni hagyjuk és +10 °C hőmérsékleten 6000 g-vel 20 percig centrifugáljuk. A szilárd anyagot (4) eltávolítjuk, a szupernatáns folyadékot szűrőtölcséren, 4 °C hőmérsékleten leszűijük. A szűrlethez megfelelő mennyiségű kalcium-kloridot és acetont adunk, az elegyet 30 percig keverjük, majd +10 °C hőmérsékleten 6000 g-vel centrifugáljuk. A folyadékfázist eltávolítjuk, a csapadékként kapott első gangliozid-nyersanyagot (5) éjjelen át száradni hagyjuk, majd további 5 óra hosszat nagy vákuumban szárítjuk.
A kapott első gangliozid-tartalmú nyersanyagot víz, kloroform és metanol elegyének 10-18 ml-jében szuszpendáljuk, majd a szuszpenzió pH-értékét 5 N nátrium-hidroxid oldattal 12-re állítjuk be és ezt az elegyet 38-43 °C hőmérsékleten 4-8 óra hosszat keverjük, majd lehűlni hagyjuk, 6 n sósavoldattal semlegesítjük, és a szükséges mennyiségű víz/n-butanol/kloroform elegy hozzáadásával 15-30 percig keverjük, azután 2-4 óra hosszat állni hagyjuk. A fázisok szétválása után az alsó, szerves oldószeres fázist (4a) eltávolítjuk, a visszamaradó vizes fázishoz acetont és nátrium-kloridot adunk és 30 percig keverjük, majd 15 °C hőmérsékleten 6000 g-vel 20 percig centrifugáljuk. A szupernatáns folyadékot eltávolítjuk, a csapadékot nagyvákuumban megszárítjuk; így a második gangliozid-tartalmú nyersanyagot kapjuk.
A kapott második gangliozid-tartalmú nyersanyagot 6-15 ml abszolút metanolban szuszpendáljuk és két óra hosszat melegítjük, időnkénti keverés közben, majd gyorsan centrifugáljuk 6000 g-vel. A szilárd csapadékot (6) eltávolítjuk, a szupernatáns folyadékot pedig hűtőszekrényben 2 óra hosszat állni hagyjuk. Az opalizáló fehér folyadékot 0 °C hőmérsékleten 600 gvel centrifugáljuk; a folyadékfázist (6b) eltávolítjuk, és a csapadékot nagy vákuumban megszárítjuk; így a harmadik gangliozid-tartalmú anyagot kapjuk.
A harmadik gangliozid-tartalmú nyersanyagot 1 N nátrium-hidroxid oldattal szobahőmérsékleten egy óra hosszat állni hagyjuk, majd a szuszpenzió pH-értékét 9-re állítjuk be és 10 kDa áteresztési móltömeg-határú membránnak dializáljuk desztillált vízzel szemben. A dializátumhoz megfelelő mennyiségű nátrium-kloridot és acetont adunk és 5 °C hőmérsékleten 6000 g-vel centrifugáljuk. A folyadékfázist (6b) eltávolítjuk, és a szilárd terméket nagyvákuumban megszárítjuk; így a nem-konvencionális vírusszennyeződéstől mentes gangliozid végterméket kapunk, amelynek összetétele (a kiindulási anyag minőségétől függően): 18-24 t% GM„ 36-44 t% GdIa, 12-18 t% GD,b és 16-22 t% GTlb.
Ezt a végterméket 10 mM foszfát-pufferoldatban (pH = 7,2) szuszpendáljuk és autoklávban 121 °C hőmérsékleten 30 percig sterilizáljuk, amikoris steril gangliozid végterméket kapunk.
2. ELŐÁLLÍTÁSI PÉLDA
GM\ gangliozid elkülönítése
Az 1. példa szerint előállított száraz, nem-konvencionális vírusszennyeződéstől mentes gangliozidelegyet, amely 18-24 t% GM, gangliozidot tartalmaz GDla, GDlb és GTlb különböző mennyiségei mellett, nagyteljesítményű folyadék-kromatográfiai módszerrel két lépésben kromatografálva, az elméleti mennyiség 75%-ának megfelelő hozammal kapunk tiszta GM, gangliozidot.
A kapott terméket 1 N nátrium-hidroxid oldattal szobahőmérsékleten 1 óra hosszat állni hagyjuk, az oldatot az 1. példában leírt módon dializáljuk, majd a terméket nátrium-kloriddal és acetonnal leválasztjuk, centrifugálással elkülönítjük.
A fenti magyarázat értelmében a találmány szerinti eljárás fontos tényezője az, hogy nemkívánatos szenynyezésektől mentes gangliozid terméket szolgáltat, különös tekintettel a nem szokványos vírusoktól való mentességre. Az eljárás értékelésére a folyamat különböző stádiumaiból vett mintákat vizsgálunk a lehetséges szennyezésekre vonatkozóan.
A biológiai/klinikai vizsgálatok módszerei és eredményei a következők:
Biológiai vizsgálata „scrapie” fertőzésre:
A kísérletekhez szír aranyhörcsögöket (LVG/Lak) alkalmazunk. A fertőzés vizsgálatát 4 elválasztott nőstény kölyökből álló csoporton végezzük. Az állatokat intracerebrálisan beoltjuk 0,05 cm3 steril PBS-sel tízszeresére hígított vizsgálati anyaggal. Az intracerebrális oltást gyakorlott személyek végzik 26G jelű, eldobható üvegfecskendővel és 0,95 cm-es, azaz 3/8 hüvelyes steril tűvel.
A 20-szorosan töményített, sterilizált végterméket végig a következőképpen alkalmazzuk:
- 4,0 cm3-t fecskendezünk be intracerebrálisan 40 állatba.
- 3,0 cm3 1:20 arányban hígított anyagot hígítatlanul befecskendezünk intracerebrálisan 50 állatba és 2,5 cm3 intraperitoneálisan 22 állatba.
Az állatokat legalább kétszer hetente vizsgáljuk 12 hónapig, hogy megjelennek-e a jellegzetes neurológiai klinikai tüneteik. Az első tünetek megjelenését állatonként feljegyezzük. Ha már a betegség kellően kifejlődött, az állatot leöljük, agyvelejét kettéosztjuk, az egyik felét 10%-os formaiinba áztatjuk, a másikat -70 °C-on konzerváljuk. A betegséget diagnosztizáljuk minden olyan állat esetében, amely a gyanított ok következtében pusztult el, vagy amely neurológiai rendellenességek jeleit mutatják. A megfigyelési időszak végén mindegyik túlélő állatot leöljük, és agyvelejüket kórtani értékelésnek vetjük alá.
A fertőzési titert az „utolsó végpontnál” számítjuk Reed és Munch módszerével, és 10 g LD5O/cm3-ben fejezzük ki.
HU 210 145 Β
A vizsgált mintákat az 1. ábrán feltüntetett elnevezésekkel az alábbiakban soroljuk fel.
Mindegyik mintát steril PBS-ben szuszpendáltatunk a megadott térfogatban, amelyet úgy számítunk, hogy térfogategységenként homogén titerük legyen a kiindulási anyag homogenizátumának 16,7 tömeg/térfogat%-ához képest:
Porítc2t(ág)o%lB6,7%-os hígítatlan homogenizátum
1. nyersanyag 5,4 cm3 hígítatlan
2. nyersanyag 9,7 cm3 hígítatlan
Végtermék 14.4 cm3 hígítatlan
Sterilizást végterméB cm3 20-szorosan töményített
A biológiai/klinikai vizsgálatok eredményeit az 1. táblázat mutatja.
A „scrapie” betegség PrP fehérjéjének meghatározását poliklonális antitestekkel végezzük, amelyek specifikusak a rágcsálók agyvelejéből származó, tisztított fehérjeanalógra, és keresztreakciót mutat a szarvasmarha eredetű scrapie PrP-vel. A meghatározásra a Western Biot módszert alkalmazuk. A scrapie PrP jelenlétét különböző móltömegű sztenderdekkel való összehasonlítással értékeljük.
Az MBP fehérje meghatározását olyan poliklonális antitestekkel végezzük, amelyek specifikusak a marha agyszövetből származó, tisztított fehérjeanalógra. A meghatározást Western Biot módszerrel végezzük. Az MBP jelenlétét különböző móltömegű fehérje sztenderdekkel való összehasonlítással értékeljük.
7. táblázat
BIOLÓGIAI VIZSGÁLATI ÉS KLINIKAI ÉRTÉKELÉS (inaktiválási kísérlet)
| Minta hígítás | 16,7%-os agy homogenizátum | Beteg | 1. nyersanyag | Beteg | 2. nyersanyag | Beteg | Végter- mék | Beteg | Sterilizált végtermék | Beteg |
| 20-szoros töményí- tés | 40-20232 | 0/28 | ||||||||
| Hígítatlan | 4-20216 | 0/3 | 4-20222 | 0/3 | 4-20227 | 0/4 | 50-20233 (ic) | 0/35 | ||
| 101 | 4-20217 | 1/3 | 4-20223 | 0/0 | 4-20228 | 0/4 | ||||
| 10-2 | 4-20218 | 0/1 | 4-20224 | 0/4 | 4-20229 | 0/4 | ||||
| 10'3 | 4-20219 | 0/3 | 4-20225 | 0/4 | 4-20230 | 0/4 | ||||
| 104 | 4-20210 | 4/4 | 4-20220 | 0/2 | 4-20226 | 0/4 | 4-20231 | 0/2 | ||
| 10’5 | 4-20211 | 4/4 | 4-20221 | 0/3 | ||||||
| 10-6 | 4-20212 | 3/3 | ||||||||
| 10-7 | 4-20213 | 3/3 | ||||||||
| 10'8 | 4-20214 | 1/4 | ||||||||
| 10-9 | 4-20215 | 0/1 | ||||||||
| Összes | 24 | 15/19 | 24 | 1/15 | 20 | 0/15 | 20 | 0/18 | 90 | 0/63 |
Az 1. táblázat kísérőszövege: A vizsgálatban minden olyan állat szerepel, a „scrapie” betegség klinikai jeleit mutatta, és minden olyan állat, amely az egy éves megfigyelési időszakot túlélte. Nem szerepelnek azonban mindazok az állatok, amelyeket baleset és/vagy rossz 45 egészségi állapot miatt elvesztettünk, amelyek a „scrapie” betegséggel nem kapcsolatos okokból elpusztultak, illetve amelyeket húsuk miatt leöltek, és a betegség semmilyen klinikai tünetét nem mutatták.
A minták oszlopaiban az első szám a kísérlet elején beoltott állatok számát adja meg, kötőjellel kapcsolva a ketrec sorszámához, amely utóbbi különbözteti meg az egyes mintákat és hígításokat. A „beteg” oszlopok a „scrapie” betegség klinikai tüneteit mutató állatok számát adja meg az értékelt állatok számához viszonyít- 55 va; ez utóbbi a beoltott állatok száma, mínusz azon állatok száma, amelyek a scrapie-val nem kapcsolatos okokból elpusztultak.
A szarvasmarhák genomiális DNS-ét a DÓT BLOT módszerrel határozzuk meg az eljárás különböző fázisai- 60 ból vett mintákon. A módszer a jártas szakemberek előtt ismert. A minta hitelességének értékeléséhez a heterológ DNS helyzetében lévő foltokat nem szabad regisztrálni. A foltok hiánya a minta radiográfiás értékelése során azt mutatja, hogy szarvasmarha genomiális DNS nincs jelen.
A 2. ábra mutatja az anti-PrP27_3o antitestekkel kapott immunokémiai analízisek eredményeit a gangliozid előállítási és tisztítási eljárásának egyes közti stádiumaiból nyert mintákon. Az analizált minták kódszá50 mai megfelelnek az 1. előállítási példa folyamat-diagramjában zárójelben megadott számokkal:
| csík: | 1. kódszámú minta |
| csík: | 2. kódszámú minta |
| csík: | 3. kódszámú minta |
| csík: | 4. kódszámú minta |
| csík: | 5. kódszámú minta |
| csík: | végtermék |
| csík: | sztenderd móltömegű fehérje (a móltömegek fölülről lefelé: 97,4; 66,2; 45,0; 31,0; 21,5 kDa. |
HU 210 145 Β
A csillaggal jelzett sávok nemspecifikus keresztreakciókat jeleznek, amelyek a vizsgálati rendszer kiterjesztésének tulajdoníthatók.
A 3. ábra a szarvasmarha genomiális DNS-ének analízisét mutatja DÓT BLOT eljárással, a folyamat különböző stádiumaiból vett mintákon.
A betűk és számok kombinációinak jelentése a következő:
| Standard görbék: | |
| 1A-7A: | 1 mg szarvasmarha DNS |
| 1B-7B: | 1 ng szarvasmarha DNS |
| 1C-7C: | 100 g szarvasmarha DNS |
| 1D-7D: | 10 pg szarvasmarha DNS |
| 1E-7E: | 1 pg szarvasmarha DNS |
| 1F-7F: | 0 pg szarvasmarha DNS |
| Vizsgálati minták: | |
| 2A-2F: | 1. kódszámú minta |
| 2B: | 2. kódszámú minta |
| 2C: | 3. kódszámú minta |
| 2D: | 5. kódszámú minta |
| 2E: | 6. kódszámú minta |
| 3A: | 3. kódszámú nyers minta |
| 3B: | végtermék |
| 3C: | sterilizált végtermék |
| A standard görbe pontjait és az analizált mintákat |
két ismétléssel mérjük.
A 4. ábra az anti-MBP antitestekkel végzett immunkémiai analízisek eredményeit adja meg az előállítási és tisztítási eljárás egyes közti stádiumaiból nyert mintákon. A minták kódszámai megfelelnek az 1. ábra tisztítási diagramján látható számoknak:
| Lesik: | 1. kódszámú minta |
| 2. csík: | 2. kódszámú minta |
| 3. csík: | 3. kódszámú minta |
| 4. csík: | 4. kódszámú minta |
| 5. csík: | 5. kódszámú minta (1. nyersanyag) |
| 6. csík: | 2. kódszámú nyers minta |
| 7. csík: | 6. kódszámú minta |
| 8. csík: | 3. kódszámú nyersminta |
| 9. csík: | végtermék |
| 10. csík: | sterilizált végtermék. |
A poliklonális antitestekkel felismert MBP különböző formái zárójelben szerepelnek.
Az 5. ábra az alábbi minták szilikagél-kromatográfiás eredményeit mutatja (szintén az 1. ábrán vázolt eljárás szerint)
1. csík: sterilizált végtermék
2. csík: végtermék
3. csík: GTlb triszialogangliozid standard
4. csík: GDIb diszialogangliozid standard
5. csík: GD (a diszialogangliozid standard
6. csík: GMi monoszialogangliozid standard
A 6. ábra példaképpeni fényképet mutat a találmány szerinti eljárással készült gangliozid elegy biológiai aktivitására a perifériás idegekre (a csírázást a nyíl mutatja).
A 7. ábra az anti-PrP27_30 antitestekkel végzett immunokémiai analízis eredményeit mutatja az előállítási és tisztítási eljárás egyes közti stádiumaiból nyert mintákon. Az analizált minták kódszámai megfelelnek az 1. ábra tisztítási diagramján feltüntetett számoknak:
1. csík: az 1. nyersanyag oldata, amelyhez
1,5 pg/cm3 PrP27_30-at adtunk
2. csík: a nyersanyag 2. kódszámú mintája
3. csík: 6. kódszámú minta
4. csík: a nyersanyag 3. kódszámú mintája
5. csík: végtermék
6. csík: sterilizált végtermék.
3. ELŐÁLLÍTÁSI PÉLDA
Átlátszóvá tett homogenizátum előállítása fertőzött hörcsög agyvelőből:
Néyg hörcsög 263 K jelű „scrapie” törzzsel megfertőzött agyvelejét (nettó tömege 3,9 g) 10 cm3 desztillált vízzel homogenizálunk, majd térfogatát 15,5 cm3-re töltjük fel, hogy a homogenizátum koncentrációja 25 vegyes% legyen. A szuszpenziót 40 percig 4 °C-on 1800 g-vel centrifugáljuk. 7,5 cm3 felülúszót nyerünk ki, amelyet két aliquot részre osztunk, és felhasználásig -70 °C-on tárolunk.
A minták előállítása:
g acetonnal kimosott és porított marha agy velőhöz hozzáadunk 5 cm3 fertőzött homogenizátumot, 120 cm3 metanol/metilén-klorid elegyet és 0,71 cm3 5,7 N nátrium-hidroxidot. Ezek az arányok azt célozzák, hogy a vizes fázis össztérfogata az oldószerben állandó maradjon, és a legmegfelelőbb műveleti körülémyeket biztosítsuk. A kiindulási oldat végső titere így 1 vegyes% (tömeg/térfogat). A szuszpenziót 33 ’C-on 3 órát keverjük mágneses keverővei, majd lehűtjük, és 10 ’C-on 20 percig 6000 g-vel centrifugáljuk. A folyadékfázist G3-as üvegszűrőn átszűrjük +4 ’C-on, miközben hagyjuk az oldószert elpárologni. E művelet végén 78 cm3 folyadékot nyerünk ki. Ennek 2 cm3-es aliquot részét vetjük alá biológiai vizsgálatnak. Két aliquothoz megfelelő mennyiségű kalcium-kloridot és acetont adunk, szobahőmérsékleten mintegy 30 percig keverjük mágneses keverővei, majd 10 ’C-on 10 percig 6000 g-vel centrifugáljuk. A szilárd fázist (1. nyersanyag) légelszívó alatt egy éjszakán át, majd nagyvákuumban 2 órát szárítjuk. Az egyik aliquotot -70 ’C-on tároljuk a biológiai vizsgálat céljára.
A reakcióedényből kinyert 925 mg 1. nyersanyagot újraszuszpendáljuk 18,5 cm3 kloroform/metanol/víz elegyben és 0,74 cm3 homogenizátumban úgy, hogy a titere 1 vegyes% legyen. 5 N NaOH-dal körülbelül
12-re állítjuk be a pH-t (indikátorpapírral ellenőrizve), és az elegyet 40 ’C-on 6 órát mágneses keverővei keverjük. Ezután lehűtjük szobahőmérsékletre, 6 N sósavval semlegesítjük, és egy 250 mm3-es aliquot félreteszünk a biológiai vizsgálat céljára.
Mindkét aliquothoz megfelelő mennyiségű n-butanol/kloroform/víz elegyet adunk, 15 percig keverjük, majd 4 órán át állni hagyjuk. Az alsó, szerves fázist eltávolítjuk, a vizes fázishoz nátrium-kloridot és acetont adunk, szobahőmérsékleten mintegy 30 percig keverjük mágneses keverővei, végül 15 ’C-on 10 percig 6000 g-vel centrifugáljuk (2. nyersanyag).
Ezt a terméket nagyvákuumban kiszárítjuk, és a biológiai vizsgálathoz félretett aliquot részét -70 ’C-on
HU 210 145 Β tároljuk. A többi anyagot újra szuszpendáljuk 6,5 cm3 abszolút metanolban, és 50 °C-on 2 órát állni hagyjuk, időnkénti keverés mellett. A szuszpenziót gyorsan, 6000 g-vel lecentrifugáljuk, a felülúszót 2 órára - 20 °C-os hűtőszekrénybe tesszük. A fehér, opálos oldatot hidegen, 0 °C-on, 5 percig 6000 g-vel centrifugáljuk. A csapadékot nagyvákuumban megszárítjuk, így 6 mg anyagot kapunk. Ezt 500 mm3 nátrium-hidroxid, 460 mm3 desztillált víz és 40 mm3 homogenizátum elegyében újraszuszpendáljuk, és egy órát szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ekkor a szuszpenzió pH-ját körülbelül 9-re állítjuk be (indikátorpapírral ellenőrizve), és 20 000-szeres térfogat desztillált vízzel szemben dializáljuk, olyan membránon keresztül, amelynek áteresztési móltömeghatára 10 kDa. Dialízis után a végtérfogat 980 mm3. Ezt egy 500 és egy 480 mm3-es aliquotra osztjuk. Az előbbihez szükséges mennyiségű nátrium-kloridot és acetont adunk, 5 °C-on 10 percig 6000 g-vel centrifugáljuk, végül nagy vákuumban kiszárítjuk (végtermék).
Az utóbbihoz 20 mm3 homogenizátumot és 50 mm3 PBS lOx-et adunk, és 121 °C-on 30 percig sterilizáljuk (sterilizált végtermék).
Mint az 1. előállítási példában leírtuk, az eljárás különböző fázisaiból vett mintákat vizsgálunk az esetleges szennyezések jelenlétére.
A vizsgált minták és eredményeik a következők:
Mindegyik mintát az alábbi térfogatú, steril PBSbe gyűjtöttük össze. A térfogatokat úgy számítjuk ki, hogy térfogategységre számítva azonos titert kapjunk, mint az 1 vegyes%-os homogenizátum mint kiindulási anyag:
Agy velő homogenizátum hígítatlan szuszp.
vegyes%-os hígítva 1 %-osra
1. nyersanyag
2, nyersanyag Végtermék Sterilizást végtermék
3,2 cm3 hígítatlan 1,0 cm3 hígítatlan 0,5 cm3 hígítatlan 0,5 cm3 hígítatlan
2. táblázat
BIOLÓGIAI VIZSGÁLATI SÉMA ÉS KLINIKAI ÉRTÉKELÉSE (hozzáadott fertőző anyaggal végzett kísérlet)
| Minta hígítás | 1%-os agyvelő homoge- nizátum | Beteg | 1. nyersanyag | Beteg | 2. nyersanyag | Beteg | Végter- mék | Beteg | Sterilizált végtermék | Beteg |
| Hígítatlan | 4-20450 | 0/4 | 4-20456 | 0/3 | 4-20462 | 2/3 | 4-20468 | 4/4 | ||
| io-‘ | 4-20451 | 0/4 | 4-20457 | 0/3 | 4-20463 | 0/3 | 4-20469 | 4/4 | ||
| 1(T2 | 4-20452 | 0/3 | 4-20458 | 0/2 | 4-20464 | 0/3 | 4-20470 | 3/3 | ||
| 10'3 | 4-20453 | 0/4 | 4-20459 | 0/3 | 4-20465 | 0/3 | 4-20471 | 0/2 | ||
| 10-4 | 4-20444 | 4/4 | 4-20454 | 0/3 | 4-20460 | 0/3 | 4-20466 | 0/0 | 4-20472 | 0/3 |
| 10’5 | 4-20445 | 4/4 | 4-20455 | 0/1 | 4-20461 | 0/3 | 4-20467 | 0/3 | 4-20473 | 0/3 |
| 10’6 | 4-20446 | 2/3 | ||||||||
| 10-7 | 4-20447 | 0/0 | ||||||||
| 10’8 | 4-20448 | 0/3 | ||||||||
| 109 | 4-20449 | 0/2 | ||||||||
| Összesen | 24 | 10/16 | 24 | 0/19 | 24 | 0/17 | 24 | 2/15 | 24 | 11/19 |
A 2. táblázat mutatja a biológiai vizsgálatokból nyert eredményeket.
A vizsgálatban minden olyan állat szerepel, amely a „scrapie” betegség klinikai jeleit mutatta, és minden olyan állat, amely az egy éves megfigyelési időszakot túlélte. Nem szerepelnek azonban mindazok az állatok, amelyeket baleset és/vagy rossz egészségi állapot miatt elvesztettünk, amelyek a „scrapie” betegséggel nem kapcsolatos okokból elpusztultak, illetve amelyeket húsuk miatt leöltek, és a betegség semmilyen klinikai tünetét nem mutatták.
A minták oszlopaiban az első számjegy a kísérlet kezdetén beoltott állatok számát adja meg, kötőjellel kapcsolva a ketrec sorszámához, amely utóbbi az egyes minták és hígítások megkülönböztetését szolgálja. A „beteg” oszlopok a „scrapie” betegség klinikai tüneteit mutató számát adja meg az értékelt állatok számához viszonyítva; ez utóbbi érték a beoltott állatok számánál annyival kevesebb, ahányan a „scrapie”-val nem kapcsolatos okokból elpusztultak.
4. ELŐÁLLÍTÁSI PÉLDA
1000 g „scrapie”-fertőzéses juh agyvelőt megőrlünk és desztillált vízben szuszpendálunk, a szuszpenzióhoz 300-660 ml acetont (1:5 tömeg/térfogat arány) adunk és szobahőmérsékleten 3 óra hosszat keverjük.
Az elegyet ezután 6000 g-vel centrifugáljuk 4-7 °C hőmérsékleten, amíg a leválás teljessé nem válik. A folyadékfázist eltávolítjuk és a kapott nedves acetonos porhoz diklór-metán, metanol és nátrium-hidroxid elegyét adjuk, majd mágneses keverővei 30-35 °C hőmérsékleten legalább 3 óra hosszat keverjük. Ezután az elegyet lehűlni hagyjuk és +10 °C hőmérsékleten 6000 g-vel 20 percig centrifugáljuk, folyadékfázist elkülönítjük és szűrőtölcséren keresztül, 4 °C hőmérsékleten leszűrjük, majd a szűrlethez kalcium-kloridot és
HU 210 145 Β acetont adunk, és ezt az elegyet 30 percig keverjük, aztuán 10 ’C-on 6000 g-vel centrifugáljuk. Az így kapott csapadékot éjjelen át száradni hagyjuk, és végül 5 óra hosszat nagy vákuumban megszárítjuk.
A kapott első nyersterméket víz, kloroform és metanol 10-18 ml elegyében újból szuszpendáljuk, a szuszpenziő pH-értékét 5 N nátrium-hidroxid oldattal 12-re állítjuk be. Az elegyet 38-43 ’C-ra melegítjük, és ezen a hőmérsékleten 4-8 óra hosszat keverjük. Az így kezek elegyet lehűlni hagyjuk, 6 N sósavoldattal semlegesítjük, majd víz, n-butanol és kloroform elegyét adjuk hozzá megfelelő mennyiségben. Ezt az elegyet 15-30 percig keverjük, majd 2-4 óra hosszat állni hagyjuk. Ezután a fázisokat szétválasztjuk, az alsó (szerves) fázist kiöntjük, a vizes fázishoz acetont és nátrium-kloridot adunk, 30 percig keverjük, azután 20 percig centrifugáljuk 6000 g-vel. Csapadékként a második nyers terméket kapjuk.
A fenti módon kapott második nyers terméket nagy vákuumban megszárítjuk, 6-15 ml abszolút metanolban szuszpendáljuk, a szuszpenziót időnkénti keverés mellett 2 óra hosszat melegítjük, azután rögtön centrifugáljak 6000 g-vel. A szupematáns folyadékot hűtőszekrényben 2 óra hosszat állni hagyjuk. A kapott fehéren opalizáló oldatot 0 °C hőmérsékleten 600 g-vel centrifugáljuk és az így kapott csapadékot nagyvákuumban megszárítjuk. A csapadékot elkülönítjük, 1 N nátrium-hidroxid oldatban szuszpendáljuk és a szuszpenziót szobahőmérsékleten legalább egy óra hosszat állni hagyjuk. Végül az elegy pH-értékét 9-re állítjuk be és az elegyet egy 10 kDa áteresztési határú membránnal megfelelő térfogatú vízzel szemben dializáljuk. A dializátomhoz megfelelő mennyiségű nátrium-kloridot adunk és 5 ’C hőmérsékleten 6000 g-vel centrifugáljuk. A csapadékot nagy vákuumban megszárítva a végterméket, nem-konvencionális vírusszennyeződésektől mentes gangliozidelegyet kapunk.
A végtermék mintáját 10 mmól/liter foszfát-pufferoldatban (pH = 7,2) szuszpendáljuk és autoklávban 121 ’C-on 20 percig sterilizáljuk.
5. ELŐÁLLÍTÁSI PÉLDA
100 g kísérleti célra fertőzött hörcsög agy velőt megőrlünk és desztillált vízben szuszpendálunk, a szuszpenzióhoz 3ÍP60 ml acetont (1:5 tömeg/térfogat arány) adunk és szobahőmérsékleten 3 óra hosszat keverjük.
Az elegyet ezután 6000 g-vel centrifugáljuk 4-7 ’C hőmérsékleten, amíg a leválás teljessé nem válik. A folyadékfázist eltávolítjuk és a kapott nedves acetonos porhoz diklór-metán, metanol és nátrium-hidroxid elegyét adjuk, majd mágneses keverővei 30-35 ’C hőmérsékleten legalább 3 óra hosszat keverjük. Ezután az elegyet lehűlni hagyjuk és +10 ’C hőmérsékleten 6000 g-vel 20 percig centrifugáljuk, folyadékfázist elkülönítjük és szűrőtölcséren keresztül, 4 ’C hőmérsékleten leszűrjük, majd a szűrlethez kalcium-kloridot és acetont adunk, és ezt az elegyet 30 percig keverjük, aztuán 10 ’C-on 6000 g-vel centrifugáljuk. Az így kapott csapadékot éjjelen át száradni hagyjuk, és végül 5 óra hosszat nagy vákuumban megszárítjuk.
A kapott első nyers terméket víz, kloroform és metanol 1-2 ml elegyében újból szuszpendáljuk, a szuszpenzió pH-értékét 5 N nátrium-hidroxid oldattal 12-re állítjuk be. Az elegyet 38-43 ’C-ra melegítjük, és ezen a hőmérsékleten 4-8 óra hosszat keveijük. Az így kezelt elegyet lehűlni hagyjuk, 6 N sósavoldattal semlegesítjük, majd víz, n-butanol és kloroform elegyét adjuk hozzá megfelelő mennyiségben. Ezt az elegyet 15-30 percig keverjük, majd 2-4 óra hosszat állni hagyjuk. Ezután a fázisokat szétválasztjuk, az alsó (szerves) fázist kiöntjük, a vizes fázishoz acetont és nátrium-kloridot adunk, 30 percig keveijük, azután 20 percig centrifugáljuk 6000 g-vel. Csapadékként a második nyers terméket kapjuk.
A fenti módon kapott második nyers terméket nagy vákuumban megszárítjuk, 6-15 ml abszolút metanolban szuszpendáljuk, a szuszpenziót időnkénti keverés mellett 2 óra hosszat melegítjük, azután rögtön centrifugáljuk 6000 g-vel. A szupematáns folyadékot hűtőszekrényben 2 óra hosszat állni hagyjuk. A kapott fehéren opalizáló oldatot 0 ’C hőmérsékleten 600 g-vel centrifugáljuk és az így kapott csapadékot nagyvákuumban megszárítjuk. A csapadékot elkülönítjük, 1 N nátrium-hidroxid oldatban szuszpendáljuk és a szuszpenziót szobahőmérsékleten legalább egy óra hosszat állni hagyjuk. Végül az elegy pH-értékét 9-re állítjuk be és az elegyet egy 10 kDa áteresztési határú membránnal megfelelő térfogatú vízzel szemben dializáljuk. A dializátumhoz megfelelő mennyiségű nátrium-kloridot adunk és 5 ’C hőmérsékleten 6000 g-vel centrifugáljuk. A csapadékot nagy vákuumban megszárítva a végterméket, nem-konvencionális vírusszennyeződésektől mentes gangliozidelegyet kapunk.
A végtermék mintáját 10 mmól/liter foszfát-pufferoldatban (pH = 7,2) szuszpendáljuk és autoklávban 121 ’C-on 20 percig sterilizáljuk.
6. ELŐÁLLÍTÁSI PÉLDA
Hét fertőzött sertés agy velőt (megfelel 1000 g-nak) megőrlünk és desztillált vízben szuszpendálunk, a szuszpenzióhoz 300-600 ml acetont (1:5 tömeg/térfogat arány) adunk és szobahőmérsékleten 3 óra hosszat keveijük.
Az elegyet ezután 6000 g-vel centrifugáljuk 47 ’C hőmérsékleten, amíg a leválás teljessé nem válik. A folyadékfázist eltávolítjuk és a kapott nedves acetonos porhoz diklór-metán, metanol és nátriumhidroxid elegyét adjuk, majd mágneses keverővei 3035 ’C hőmérsékleten legalább 3 óra hosszat keverjük. Ezután az elegyet lehűlni hagyjuk és +10 ’C hőmérsékleten 6000 g-vel 20 percig centrifugáljuk. A folyadékfázist elkülönítjük és szűrőtölcséren keresztül, 4 ’C hőmérsékleten leszűrjük, majd a szűrlethez kalcium-kloridot és acetont adunk, és ezt az elegyet 30 percig keverjük, aztuán 10 ’C-on 6000 g-vel centrifugáljuk. Az így kapott csapadékot éjjelen át száradni hagyjuk, és végül 5 óra hosszat nagyvákuumban megszárítjuk.
A kapott első nyers terméket víz, kloroform és metanol 10-18 ml elegyében újból szuszpendáljuk, a
HU 210 145 Β szuszpenzió pH-értékét 5 N nátrium-hidroxid oldattal 12-re állítjuk be. Az elegyet 38-43 °C-ra melegítjük, és ezen a hőmérsékleten 4-8 óra hosszat keverjük. Az így kezelt elegyet lehűlni hagyjuk, 6 N sósavoldattal semlegesítjük, majd víz, n-butanol és kloroform elegyét adjuk hozzá megfelelő mennyiségben. Ezt az elegyet 15-30 percig keverjük, majd 2-4 óra hosszat állni hagyjuk. Ezután a fázisokat szétválasztjuk, az alsó (szerves) fázist kiöntjük, a vizes fázishoz acetont és nátrium-kloridot adunk, 30 percig keverjük, azután 20 percig centrifugáljuk 6000 g-vel. Csapadékként a második nyers terméket kapjuk.
A fenti módon kapott második nyers terméket nagyvákuumban megszárítjuk, 6-15 ml abszolút metanolban szuszpendáljuk, a szuszpenziót időnkénti keverés mellett 2 óra hosszat melegítjük, azután rögtön centrifugáljuk 6000 g-vel. A szupernatáns folyadékot hűtőszekrényben 2 óra hosszat állni hagyjuk. A kapott fehéren opalizáló oldatot 0 ’C hőmérsékleten 600 g-vel centrifugáljuk és az így kapott csapadékot nagyvákuumban megszárítjuk. A csapadékot elkülönítjük, 1 N nátrium-hidroxid oldatban szuszpendáljuk és a szuszpenziót szobahőmérsékleten legalább egy óra hosszat állni hagyjuk. Végül az elegy pH-értékét 9-re állítjuk be és az elegyet egy 10 kDa áteresztési határú membránnal megfelelő térfogatú vízzel szemben dializáljuk. A dializátumhoz megfelelő mennyiségű nátrium-kloridot adunk és 5 °C hőmérsékleten 6000 g-vel centrifugáljuk. A csapadékot nagyvákuumban megszárítva a végterméket, nem-konvencionális vírusszennyeződésektől mentes gangliozidelegyet kapunk.
A végtermék mintáját 10 mmól/liter foszfát-pufferoldatban (pH = 7,2) szuszpendáljuk és autoklávban 121 ’C-on 20 percig sterilizáljuk.
Gangliozid keverékek biológiai aktivitása
In vitro kísérletsorozatot végzünk annak igazolására, hogy a fenti eljárással kapott gangliozid keveréknek van-e olyan biológiai aktivitása, amely gyógyszerként való alkalmazásakor várhatóan gyógyítja a perifériás idegrendszer és a központi idegrendszer betegségeit. Különösen a gangliozidok idegnyúlványképző hatását vizsgáljuk in vitro, neuroblasztoma (N2A) sejtek tenyészetében. Mint az irodalomból ismeretes (Denis - Donini és mts.: Neuronal Development, II. rész, 323-348 - Academic Press, New York, 1980; León és mts.: Dev. Neurosci. 5, 108 /1982/), ezek a sejtek bizonyos körülmények kiválthatják az érett idegsejtekre jellemző, különböző funkciók kifejeződését, ami lehetővé teszi azoknak a biokémiai paramétereknek a minőségi és mennyiségi analízisét, amelyek kifejlődésük minden egyes stádiumával összefüggésben vannak.
E modell szerinti meghatározások tehát (idegnyúlvánnyal rendelkező sejtek %-os előfordulása, az idegnyúlványok hossza és relatív elágazottsága) hiteles eszközök egy hatóanyag terápiás alkalmazási lehetőségeinek vizsgálatára az idegrendszer funkcionális regenerálásához.
Anyagok és módszerek
Sejttenyészetek
Az America Cell Type Collection (Bethesda, Maryland) által szolgáltatott C 1300 jelű egérsejteket és N2A kiónt lemezre viszünk, lyukanként 10 000 sejt töménységben, 24-es elosztópipettával, Dulbecco-féle módosított Eagle-közeg (DMEM) jelenlétében, amelyben 100 penicillin-egység/cm3-nyi P/G és 10% fötális borjúszérum (FCS a Seromedtől, termékszáma: 4-C04) van.
Másnap a tenyészközeget kicseréljük azonos térfogatú, gangliozidokat tartalmazó, friss közegre (lásd alább). A tenyészeteket 37 °C-on 5% CO2-ot tartalmazó nedves levegőn tartjuk (Haereus inkubátorban), majd 24 órával később a tenyészeteket 2%-os glutár-aldehiddel fixáljuk.
A termék vizsgálati oldatainak előállítása különböző menetben nyert gangliozid keveréket (1., 2. és 3. sz.) feloldunk 2:1 arányú kloroform/metanol elegyben, nitrogén áramban szárazra pároljuk, visszaszuszpendáljuk DMEM + P/G + 10% FCS rendszerrel, a kívánt koncentráció eléréséig.
A vizsgált koncentrációk: 1 · 10'4 M, 5 · 10'5 M, 1 · ΙΟ'5 M.
Az alábbi négy különböző kísérletet végezzük el:
- 3 kísérlet a gangliozid keverék (1. vagy 2. sz.) hatásának meghatározására 1 · 10'4 M koncentrációban;
- 1 kísérlet a vizsgált gangliozid keverék (3. sz.) különböző koncentrációinak (1 · ΙΟ-4 M, 5 · 10' 5 M és 1 · 10'5 M) dózis válasz hatásaira.
Eljárás
A lyukakból kiszívjuk a közeget, és helyette DMEM + P/G + 10% FCS ± vizsgált termék (a fenti koncentrációkban) rendszerből 350 mm3-t viszünk be.
A kontroll tenyészeteket ugyanilyen módon kezeljük, de gangliozid keveréket nem adunk hozzájuk. A tenyészeteket inkubátorban tartjuk 24 órát, majd a sejteket 2%-os glutár-aldehiddel fixáljuk, és mikroszkóp alatt megvizsgáljuk.
Paraméterek
A morfológiai vizsgálatokkal megállapítjuk:
- az idegnyúlvánnyal rendelkező sejtek %-os előfordulását;
- az idegnyúlványok hosszát és relatív elágazottságát.
Eredmények
Mint a 3. táblázatban látható, a vizsgált termékek egyértelműen hatásosak (1 · 104 M) idegnyúlványok előidézésére az N2A sejtekben.
A gangliozid keverék hatása dózisfüggő. Maximális hatása 1 · ΙΟ4 M koncentrációban van (4. táblázat).
3. táblázat
A gangliozid keverék (1. és 2. sz. termék) hatása az
HU 210 145 Β idegnyúlványok képződésére egér N2A neuroblasztoma sejtjeiben.
Mindegyik terméket 1 ΙΟ4 M végkoncentrációban alkalmazzuk, a morfológiai értékelést 24 órával később végezzük.
| Termék | Idegnyúlvánnyal rendelkező sejtek előfordulási %-a | ||
| 1. kísérlet | . kísérlet | 2. kísérlet | |
| Kontrol | 2±1 | 1±1 | 2±2 |
| GA(1) | 29 + 6 | 27±6 | 24±5 |
| Ga (2) | 25±4 | 25 ±2 | 25±5 |
(Zárójelben a termékszámok)
4. táblázat
A gangliozid keverék (3. sz. termék) különböző koncentrációinak hatása az idegnyúlványok képződésére egér N2A neuroblasztóma sejtjeiben; dózishatás válasz.
| Termék | Koncentráció | Idegnyúlvánnyal rendelkező sejtek előfordulási %-a |
| Kontrol | 3±2 | |
| GA(3) | i io-4m | 35±6 |
| GA(3) | 5 105M | 17±5 |
| GA(3) | 1 10'5M | 4 + 2 |
(Zárójelben a termék száma)
A biológiai aktivitás in vitro adatainak statisztikai értékelése azt mutatja, hogy a különböző menetekben nyert gangliozid keverékek között nincs szignifikáns eltérés.
Az 1. ábra adatai:
A teljes adatsor statisztikai értékelése az 1. és 2. sz. termék esetén. A közölt értékek 9 független vizsgálat középértékez ± standard deviáció.
Ezen túlmenően az idegnyúlványok morfológiai értékelése azt mutatja, hogy a gangliozid keverékekkel kezelt sejtek hosszú, jelentősen elágazott idegnyúlványokat mutatnak (azaz markáns elágazásokat).
A fenti megfigyelések tehát megerősítik, hogy a vizsgált gangliozid keverékeknek valóban van biológiai aktivitása. A kapott termék, amely a különleges tulajdonságok megtartását biztosító eljárással készült, ki tudja váltani az idegnyúlványok képződését N2A sejtekben. Ez azt mutatja, hogy a termék hatásos a perifériás és a központi idegrendszer regenerálódási folyamatában. A leírtak szerint kapott gangliozid keverék mentes azoktól a szennyeződésektől, amelyek az esetlegesen veszélyes, nem szokványos vírusokkal kapcsolatosak, és használható a gangliozid keverékek vagy egyedi komponenseinek, így a GM! monoszialogangliozidnak az előállítására is.
A fenti farmakológiai tulajdonságok fényében a gangliozid keverék általában használható számos, különböző kóroktani eredetű betegség elleni hatóanyagként mind a perifériás, mind a központi idegrendszerben. A következő speciális esetek kezelhetők: szemgolyó mögötti látóideggyulladás, a szemmozgató idegek paralízise, trigeminális neuralgia, arcideg paralízis, Bell-féle bénulás, Garcin-szindróma, ideggyökérgyulladás, perifériás idegek baleseti sérülései, cukorbajból és alkoholizmusból eredő polineuritisz, szülési paralízis, paralitikus isiász, mozgatóideg betegségek, izomsorvadásos féloldali szklerózis, gerincagyi eredetű izomsorvadás, előrehaladott nyúltagyi paralízis, súlyos izomgyengeség és Lambert Eaton szindróma, izom disztrófia, a szinaptikus idegátvitel károsodása a központi és perifériás idegrendszerben, tudatzavarok, így zavarodottság, agyrázkódás, trombózis, agyembólia, agy- és gerincsérülés.
A szert általában injekció formájában adjuk be, intramuszkulárisan, szubkután vagy intravénásán, illetve transzdermálisan, pulmonárisan vagy szájon át; előnyösen megfelelően pufferolt vizes oldatban. A gyógyszer biztonságos tárolása érdekében az oldatot ampullába készítjük be, alkalmasint más segédanyagokkal együtt, az alábbiakban megadott gyógyszerkészítési példák szerint. Gyógyító vagy esetleg megelőző alkalmazás esetén, a fenti parenterális beadagolásokhoz a dózis a hatóanyagra számítva előnyösen 10 és 100 mg/nap között mozog.
Csupán szemléltetésül, nem korlátozásképpen, az alábbi példákat adjuk meg a találmány szerinti gyógyszerkészítmények összetételére.
1. PÉLDA
Egy ampulla összetétele a következő:
Hatóanyag
- gangliozidok nátrium-só alakjában 10,0 mg
- monoszialo-tetrahexozil-gangliozid (GM])
- diszialo-tetrahexozil-gangliozid (GDia)
- diszialo-tetrahexozil-gangliozid (GDib)
- triszialo-tetrahexozil-gangliozid (GDlb)
Egyéb komponensek:
- kétbázisú nátrium-foszfát · 12H2O 6,0 mg
- egybázisú nátrium-foszfát · 2H2O 0,5 mg
- nátrium-klorid 16,0 mg
- injekciós minőségű víz 2,0 cm3-re
2. PÉLDA
Egy ampulla összetétele a következő:
Hatóanyag
- gangliozidok nátrium-só alajában 20,0 mg
- monoszialo-tetrahexozil-gangliozid (GM!)
- diszialo-tetrahexozil-gangliozid (GD]a)
- diszialo-tetrahexozil-gangliozid (GD]b)
- triszialo-tetrahexozil-gangliozid (GD]b)
Más komponensek:
- kétbázisú nátrium-foszfát · 12H2O 6,0 mg
- egybázisú nátrium-foszfát · 2H2O 0,5 mg
- nátrium-klorid 16,0 mg
- injekciós minőségű víz 2,0 cm3-re
3. PÉLDA
Egy ampulla összetétele a következő:
Hatóanyag
- gangliozidok nátrium-só alakjában 100,0 mg
HU 210 145 Β
- monoszialo-tetrahexozil-gangliozid (GM])
- diszialo-tetrahexozil-gangliozid (GDla)
- diszialo-tetrahexozii-gangliozid (GD]b)
- triszialo-tetrahexozil-gangliozid (GD]b)
Egyéb komponensek:
- kétbázisú nátrium-foszfát 12H2O 12,0 mg
- egybázisú nátrium-foszfát · 2H2O 1,0 mg
- nátrium-klorid 32,0 mg
- injekciós minőségű víz 4,0 cm3-re
Claims (14)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás nem-konvencionális vírusszennyeződéstől mentes gangliozidelegy előállítása, azzal jellemezve, hogyi) a gangliozid-tartalmú szövetet lipidmentesítésnek vetünk alá acetonnal:ii) a kapott acetonos csapadékot egy a hidrofób anyagoknak a hidrofil anyagtól való elkülönítésére alkalmas első oldószerelegyben, előnyösen diklórmetán, metanol és valamely bázis elegyében szuszpendáljuk, a szuszpenziót melegítjük, majd centrifugáljuk;iii) az így kezelt szuszpenzióból a szilárd részeket szűréssel eltávolítjuk, iv) a szűrletként kapott első folyadékfázist, amely a ii) lépésben alkalmazott első oldószerelegyben oldott gangliozid-tartalmú anyagot tartalmazza, ez utóbbinak kicsapására alkalmas oldószer hozzáadásával precipitációnak vetjük alá és a csapadékot (első nyersanyag) elkülönítjük.v) a kapott első nyersanyagot oldatba visszük és az oldatot lúgos, előnyösen 12-es pH-értéken melegítjük;vi) az így előkezelt első nyersanyagot egy második oldószeres megosztásnak vetjük alá valamely, a hidrofób anyagoknak a hidrofil anyagoktól való elkülönítésére alkalmas oldószereleggyel (második oldószerelegy), előnyösen víz, butanol és kloroform keverékével;vii) a második oldószereleggyel kapott keverékből eltávolítjuk a szerves oldószeres fázist és megtartjuk a vizes fázist;viii) a kapott vizes fázist ismét precipitációnak vetjük alá és a csapadékot (második nyersanyag) elkülönítjük, ix) a kapott második nyersanyagot oldatba visszük, majd hűtéssel ismét leválasztjuk,x) a kapott szilárd részt (harmadik nyersanyag) valamely bázisban oldjuk;xi) a harmadik nyersanyag így kapott oldatát semlegesítjük;xii) a semlegesített oldatot dializáljuk egy 10 kD móltömeg áteresztési határú membránnal, xiii) és kívánt esetben a dializált oldatból a végterméket leválasztjuk és megszárítjuk, vagy xiv) kívánt esetben a végterméket pufferoldatban szuszpendáljuk és sterilizáljuk; vagy xv) kívánt esetben a kapott gangliozidelegyet szétválasztjuk az egyes gangliozid-komponensekre. (Elsőbbsége: 1989. 11. 17.)
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ii) lépésben első oldószerelegyként metil-klorid, metanol és nátrium-hidroxid oldat elegyét alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1989. 11. 17.)
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ii) lépésben alkalmazott első oldószerelegyet tartalmazó említett acetonos csapadékot 30-35 °C-on legalább 3 órát melegítjük. (Elsőbbsége: 1989. 11. 17.)
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a iv9 lépésben az első nyersanyag kicsapását kalcium-klorid és aceton hozzáadásával végezzük. (Elsőbbsége: 1989. 11. 17.)
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az v) lépésben az első nyersanyag említett melegítését 38-43 °C-on 4-8 órán át végezzük. (Elsőbbsége: 1989. 11. 17.)
- 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az v) lépésben az első nyersanyagot víz, kloroform és metanol elegyében oldjuk fel, és melegítés után a vi) lépésben második oldószerelegyként vízből, kloroformból és n-butanolból álló oldószerelegyet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1989.11.17.)
- 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a viii) lépésben a második nyersanyagot aceton és nátrium-klorid hozzáadásával csapjuk ki. (Elsőbbsége: 1989. 11. 17.)
- 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ix) lépésben a második nyersanyag metanolban oldjuk fel. (Elsőbbsége: 1989.11.17.)
- 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a x) lépésben a harmadik nyersanyagot 1 N nátrium-hidroxiddal visszük oldatba. (Elsőbbsége: 1989. 11. 17.)
- 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gangliozid-tartalmú szövetként szarvasmarha agyszövetet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1989. 11. 17.)
- 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy- gangliozid-tartalmú szövetként szarvasmarha agyszövetet alkalmazunk,- a ii) lépésben első oldószerelegyként diklór-metán, metanol és nátrium-hidroxid oldat elegyét alkalmazzuk,- a iv) lépésben az első nyersanyag lecsapására acetont és kalcium-kloridot alkalmazunk;- az v) lépésben az első nyersanyagot víz, kloroform és metanol keverékében oldjuk és a feloldott első nyersanyagot legalább 4-8 óra hosszat melegítjük 38-43 °C hőmérsékleten;- a vi) lépésben második oldószerelegyként víz, n-butanol és kloroform elegyét alkalmazzuk;- A viii) lépésben a második nyersanyag lecsapására acetont és nátrium-kloridot adunk az oldathoz;- A leválasztott második nyersanyagot a ix) lépésben metanolban melegítjük és centrifugáljuk,- az elkülönített szupematáns oldatból hűtéssel leválasztjuk a harmadik nyersanyagot;- a harmadik nyersanyagot nátrium-hidroxid ol14HU 210 145 Β dattal egy óra hosszat kezelve szolubilizájuk. (Elsőbbsége: 1989. 11. 17.)
- 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a x) lépésben a harmadik nyersanyagot 1 N nátrium-hidroxid oldatban oldjuk. (Elsőbbsége: 1989.11.17.) 5
- 13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapott gangliozidelegy szétválasztása során a GM) gangliozidot különítjük el. (Elsőbbsége: 1989.11. 17.)
- 14. Eljárás perifériás és központi idegrendszer kóros állapotainak kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított, nem-konvencionális vírusszennyezéstől mentes gangliozid-elegyet vagy elkülönített GM] gangliozidot gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyaggal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk. (Elsőbbsége: 1990. 10. 18.)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT4174789A IT1236594B (it) | 1989-11-17 | 1989-11-17 | Metodo per la preparazione e purificazione di una miscela di glicosfingolipidi |
| IT04171690A IT1243295B (it) | 1990-10-18 | 1990-10-18 | Metodo per la preparazione e purificazione di una miscela di glicosfingolipidi priva di contaminanti da virus non convenzionali |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU210145B true HU210145B (en) | 1995-02-28 |
Family
ID=26329145
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU912391A HUT58754A (en) | 1989-11-17 | 1990-11-16 | Process for producing and purifying glycosfingolipide mixtures free of non-conventional virus impurities, and process for producing pharmaceutical compositions containing them |
| HU912391A HU210145B (en) | 1989-11-17 | 1990-11-16 | Process for prepg. a mixture of gangliosides free from contamination by non-conventional viruses and pharmaceutical compn.s contg. them |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU912391A HUT58754A (en) | 1989-11-17 | 1990-11-16 | Process for producing and purifying glycosfingolipide mixtures free of non-conventional virus impurities, and process for producing pharmaceutical compositions containing them |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5521164A (hu) |
| EP (1) | EP0454818B1 (hu) |
| JP (1) | JP3140458B2 (hu) |
| KR (1) | KR0177820B1 (hu) |
| CN (1) | CN1027895C (hu) |
| AT (1) | ATE169926T1 (hu) |
| AU (1) | AU649635B2 (hu) |
| CA (1) | CA2045142C (hu) |
| DE (1) | DE69032578T2 (hu) |
| ES (1) | ES2119747T3 (hu) |
| FI (1) | FI97138C (hu) |
| HK (1) | HK1013294A1 (hu) |
| HU (2) | HUT58754A (hu) |
| IE (1) | IE904135A1 (hu) |
| IL (1) | IL96346A (hu) |
| IN (1) | IN171530B (hu) |
| NO (1) | NO175311C (hu) |
| NZ (1) | NZ236059A (hu) |
| PE (1) | PE25491A1 (hu) |
| PT (1) | PT95917B (hu) |
| WO (1) | WO1991007417A1 (hu) |
| YU (1) | YU218790A (hu) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1235161B (it) * | 1988-12-02 | 1992-06-22 | Fidia Farmaceutici | Derivati di lisogangliosidi |
| EP0539380B1 (en) * | 1991-05-16 | 2000-08-09 | FIDIA S.p.A. | Method for the preparation and purification of a mixture of glycosphingolipids free from contamination by non-conventional viruses |
| IT1260149B (it) * | 1992-04-17 | 1996-03-28 | Fidia Spa | Metodo per la preparazione e purificazione di miscele di fosfolipidi prive di contaminanti da virus non convenzionali |
| US6458761B2 (en) | 1999-11-24 | 2002-10-01 | Lore Maria Klett-Loch | Synthetic, statistic thymic peptide combination and its use as a preparation with immunological and/or endocrinological effect |
| WO2001062305A1 (fr) * | 2000-02-24 | 2001-08-30 | Menicon Co., Ltd. | Procede d'inactivation du prion et solution de traitement a utiliser dans celui-ci |
| JP2005527467A (ja) | 2001-08-29 | 2005-09-15 | ネオーズ テクノロジーズ， インコーポレイテッド | 新規な合成ガングリオシド誘導体およびその組成物 |
| MXPA05009480A (es) | 2003-03-06 | 2006-02-22 | Neose Technologies Inc | Metodos y composiciones para la sintesis enzimatica de gangliosidos. |
| US7066261B2 (en) * | 2004-01-08 | 2006-06-27 | Halliburton Energy Services, Inc. | Perforating system and method |
| WO2010062197A1 (en) * | 2008-11-25 | 2010-06-03 | Eduard Nekrasov | Dairy product and process |
| WO2010111530A1 (en) | 2009-03-25 | 2010-09-30 | Seneb Biosciences, Inc. | Glycolipids as treatment for disease |
| CN101838295B (zh) * | 2010-04-14 | 2015-02-25 | 李桂凤 | 一种利用具有特异识别功能色谱介质快速分离纯化神经节苷脂的工业化生产工艺 |
| US8710385B2 (en) | 2012-05-07 | 2014-04-29 | Robert Butch Sickels | Reliability fire pressure switch |
| CN105111253B (zh) * | 2015-09-18 | 2018-01-12 | 重庆寰瑞生物技术有限公司 | 一种提取分离神经节苷脂的方法 |
| CN109320566B (zh) * | 2018-08-14 | 2022-03-15 | 四川兴杰象药业有限公司 | 一种从猪脑髓中提取神经节苷脂的分离纯化制备方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3346413A (en) * | 1964-10-12 | 1967-10-10 | Hooker Chemical Corp | Method and apparatus for coating wire and solvent recovery |
| ES528692A0 (es) * | 1984-01-04 | 1985-07-01 | Bioiberica | Procedimiento para la obtencion de un complejo glicoesfingolipidico |
| JPS60181019A (ja) * | 1984-02-28 | 1985-09-14 | Mitsui Toatsu Chem Inc | ガングリオシドの抽出方法 |
| IT1177863B (it) * | 1984-07-03 | 1987-08-26 | Fidia Farmaceutici | Una miscela gangliosidica come agente terapeutico capare di eliminare il dolore nele neuropatie periferiche |
| JPS61180719A (ja) * | 1985-02-06 | 1986-08-13 | Mitsui Toatsu Chem Inc | ガングリオシドの取得方法 |
| US4710490A (en) * | 1985-10-01 | 1987-12-01 | Angio Medical Corporation | Compositions containing ganglioside molecules with enhanced angiogenic activity |
| IT1223408B (it) * | 1987-12-09 | 1990-09-19 | Crinos Industria Farmaco | Procedimento per la preparazione di monosialoganglioside |
-
1990
- 1990-11-13 NZ NZ236059A patent/NZ236059A/xx unknown
- 1990-11-13 IN IN952/CAL/90A patent/IN171530B/en unknown
- 1990-11-14 IL IL96346A patent/IL96346A/xx active IP Right Grant
- 1990-11-15 PE PE1990177644A patent/PE25491A1/es not_active Application Discontinuation
- 1990-11-16 DE DE69032578T patent/DE69032578T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-16 HU HU912391A patent/HUT58754A/hu unknown
- 1990-11-16 KR KR1019910700744A patent/KR0177820B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-11-16 PT PT95917A patent/PT95917B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-11-16 ES ES90916737T patent/ES2119747T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-16 HU HU912391A patent/HU210145B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-11-16 EP EP90916737A patent/EP0454818B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-16 JP JP02515353A patent/JP3140458B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-16 IE IE413590A patent/IE904135A1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-11-16 WO PCT/EP1990/001960 patent/WO1991007417A1/en active IP Right Grant
- 1990-11-16 YU YU218790A patent/YU218790A/sh unknown
- 1990-11-16 AT AT90916737T patent/ATE169926T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-11-16 AU AU67275/90A patent/AU649635B2/en not_active Ceased
- 1990-11-16 CA CA002045142A patent/CA2045142C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-17 CN CN90109855A patent/CN1027895C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-07-16 NO NO912780A patent/NO175311C/no not_active IP Right Cessation
- 1991-07-17 FI FI913454A patent/FI97138C/fi active
-
1993
- 1993-09-03 US US08/116,268 patent/US5521164A/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-12-22 HK HK98114612A patent/HK1013294A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU210145B (en) | Process for prepg. a mixture of gangliosides free from contamination by non-conventional viruses and pharmaceutical compn.s contg. them | |
| EP2284190B1 (en) | Transfer factor from birds eggs | |
| DE60225349T2 (de) | Immunstimulierende und regulierende zusammensetzung mit bakteriellen chromosomalen dna-fragmenten und nichttoxischen lipopolysacchariden | |
| EP0385118A2 (en) | Use of compounds containing or binding sialic acid to neutralize bacterial toxins | |
| EP0638083B1 (en) | Method for the preparation and purification of phospholipid mixtures free from contamination by unconventional viruses | |
| EP0539380B1 (en) | Method for the preparation and purification of a mixture of glycosphingolipids free from contamination by non-conventional viruses | |
| CA2087158A1 (en) | Method for the preparation and purification of a mixture of glycosphingolipids free from contamination by non-conventional viruses | |
| CN110559321A (zh) | 一种灵肽口服液及其制备方法 | |
| CN118045161B (zh) | 林蛙抗菌肽浓缩液在制备抗支原体的药物中的应用 | |
| Bessler et al. | Mitogenicity of a lipid-deficient lipoprotein from a mutant Escherichia coli strain | |
| Di Martino et al. | Purification of non-infectious ganglioside preparations from scrapie-infected brain tissue | |
| IT9041716A1 (it) | Metodo per la preparazione e purificazione di una miscela di glicosfingolipidi priva di contaminanti da virus non convenzionali | |
| DE69631528T2 (de) | Serumzusammensetzungen zur hemmung von retroviren und tumorwachstum | |
| Prusiner et al. | Prions causing transmissible neurodegenerative diseases | |
| CN109288823A (zh) | 白皮杉醇在制备治疗朊病毒引起疾病药物中的用途 | |
| JPH06306099A (ja) | 乳分画、その用途及びその製造法 | |
| Transmissible | STANLEY B. PRUSINER AND KAREN K. HSIAO | |
| GB2310212A (en) | Isolation of the sarcocystine toxin from the genus Sarcocystis | |
| CA2505129A1 (en) | Pharmaceutical compositions of marine sponge microciona prolifera |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee | ||
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |