CN110559321A

CN110559321A - 一种灵肽口服液及其制备方法

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Publication number: CN110559321A
Application number: CN201910860507.7A
Authority: CN
Inventors: 杨胜利
Original assignee: Lianlong Industrial Group Co Ltd
Current assignee: Lianlong Industrial Group Co Ltd
Priority date: 2019-09-11
Filing date: 2019-09-11
Publication date: 2019-12-13

Abstract

本发明涉及医药领域，具体涉及一种灵肽口服液及其制备方法，由灵芝萃取物和淮山羊胎盘多肽悬浮液配制而成，所述的灵肽口服液，由灵芝萃取物与淮山羊胎盘多肽悬浮液按照1:100（w/v）比例配制而成，所述的灵肽口服液的制备方法，包括如下步骤：1）制备淮山羊胎盘多肽悬浮液；2）制备灵芝萃取物；3）将步骤1）的淮山羊胎盘多肽悬浮液与步骤2）的灵芝萃取物按比例混合，配制成灵肽口服液；本发明用热水萃取法制备灵芝萃取物，用超滤法制备淮山羊胎盘多肽，并由此制备灵肽口服液，用免疫器官指数测算法和淋巴细胞免疫功能检测法观察灵肽口服液免疫活化效应，该口服液具有明显的提高免疫作用。

Description

一种灵肽口服液及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种灵肽口服液及其制备方法。

背景技术

机体许多疾病和亚健康状态与免疫反应密切相关，免疫反应是机体对环境有害因素和内在疾病的正常生理反应，在免疫反应过程中，任何一个环节出现问题都可导致免疫无能。研究发现免疫缺陷具有异质性。如不同病人表现都是免疫低下，但每一患者(如肿瘤患者)的发病机制可能是不一样的。因此，在没有清楚免疫缺陷的机制时，“盲目”的免疫治疗并不能使病人受益。基于这一策略，人们提出了“免疫检查点分子（immune checkpointmolecules）”这一概念，重点研发疾病的“精准”免疫治疗。但是，由于免疫缺陷异质性，目前免疫治疗前对每一患者免疫缺陷进行全面分析在临床上显然是不现实的。这就需要有种能够对不同患者存在的不同免疫缺陷同时均能发挥免疫修饰作用的制剂。

发明内容

为解决现有技术的问题，本发明提供了一种灵肽口服液及其制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种灵肽口服液，由灵芝萃取物和淮山羊胎盘多肽悬浮液配制而成。

所述的灵肽口服液，由灵芝萃取物与淮山羊胎盘多肽悬浮液按照1:100（w/v）比例配制而成。

所述的灵肽口服液的制备方法，包括如下步骤：

1）制备淮山羊胎盘多肽悬浮液；

2）制备灵芝萃取物；

3）将步骤1）的淮山羊胎盘多肽悬浮液与步骤2）的灵芝萃取物按比例混合，配制成灵肽口服液。

优选的所述的灵肽口服液的制备方法，所述淮山羊胎盘多肽悬浮液的制备方法包括如下步骤：

1）胎盘来源及其处理：选择健康初产母羊，在分娩前1个月在养圈内进行人工隔离圈养，养圈要定期清理和消毒，严格观察健康状况，如有异常，立即剔除，以相对无菌程序获取自然分娩的胎盘；胎盘置4℃冷链运输保存，2h内用于淮山羊胎盘多肽悬浮液的制备；

2）淮山羊胎盘多肽悬浮液的制备：取步骤1）中的新鲜胎盘，用4℃的无菌蒸馏水充分冲洗，去除血液, 用75%医用酒精消毒，再用0.9% NaCL盐水充分冲洗；取胎盘子叶, 剪碎，加适量4℃生理盐水高速组织匀浆机匀浆；-40℃反复物理冰冻裂解；在每分钟转数为3000rpm的状态下离心20min，取上层液超滤，截留分子量10000Da，滤出液再次微滤，即为制备的淮山羊胎盘多肽悬浮液。

优选的所述的灵肽口服液的制备方法，将淮山羊胎盘多肽悬浮液在40℃处储存备用。

优选的所述的灵肽口服液的制备方法，灵芝萃取物制备方法包括如下步骤：

取适量的灵芝子实体，研磨为100目的细粉，以1：20的质量浓度加入加入100℃的热水，在磁力搅拌器中搅拌浸泡1h，后3000r/min离心10min，收获上层液C，沉淀物再加90℃热水搅拌浸泡1h，离心10 min，如此提取3次，将3次收获的上层液合并形成上层液D，减压浓缩至1/10-1/15体积时，以比例为1:3的体积百分浓度加入95%乙醇悬浮液，在室温时静置10h，在每分钟转数为3000r/min状态下离心20min，后沉淀物加入75%的乙醇离心洗涤3次，后将提取物E低温真空干燥,得到干粉F,所获得干粉F即为灵芝萃取物，。

优选的所述的灵肽口服液的制备方法，灵芝萃取物溶液配制方法，还包括如下步骤：将灵芝萃取物以1:100（w/v）比例用生理盐水配成溶液备用。

与现有技术相比，发明的有益效果是：本发明用热水萃取法制备灵芝萃取物，用超滤法制备淮山羊胎盘多肽，并由此制备灵肽口服液，用免疫器官指数测算法和淋巴细胞免疫功能检测法观察灵肽口服液免疫活化效应，结果成功构建灵肽口服液，灵肽口服液可明显提高受试动物脾脏和胸腺指数及T细胞和B细胞刺激指数，该口服液具有明显的提高免疫作用。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明,实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例：一种灵肽口服液，包括灵芝萃取物和淮山羊胎盘多肽悬浮液，灵芝萃取物与淮山羊胎盘多肽悬浮液的质量浓度为1:100；肉眼观察为黄褐色悬浮液。

一种灵肽口服液的制备方法，包括如下步骤：

1）制备淮山羊胎盘多肽悬浮液；

2）制备灵芝萃取物；

3）将步骤1）的淮山羊胎盘多肽悬浮液与步骤2）的灵芝萃取物按比例混合，配制成灵肽口服液；

其中淮山羊胎盘多肽（huai goat Placental peptides， HGPPs）悬浮液的制备方法包括如下步骤：

1）胎盘来源及其处理：淮山羊是由绿金公司注册的、我国传统的优质山羊。选择无布氏杆菌病和结核菌感染的健康初产母羊，在分娩前1个月在养圈内进行人工隔离圈养，期间，严格遵照母羊饮食的营养和卫生标准进行饲养。养圈要定期清理和消毒，严格观察健康状况，如有异常，立即剔除，以相对无菌程序获取自然分娩的胎盘；胎盘置4℃冷链运输保存，2h内用于淮山羊胎盘多肽悬浮液的制备；

优选的将淮山羊胎盘多肽悬浮液在40℃处储存备用。

优选的本制品全部制备过程严格在8℃以下及无菌环境中完成。

其中灵芝萃取物制备方法包括如下步骤：

取适量的灵芝子实体，研磨为100目的细粉，以1：20（w/v）的质量浓度加入加入100℃的热水，在磁力搅拌器中搅拌浸泡1h，后3000r/min离心10min，收获上层液C，沉淀物再加90℃热水搅拌浸泡1h，离心10 min，如此提取3次，将3次收获的上层液合并形成上层液D，减压浓缩至1/10-1/15体积时，以比例为1:3的体积百分浓度（v/v）加入95%乙醇悬浮液，在室温时静置10h，在每分钟转数为3000r/min状态下离心20min，后沉淀物加入75%的乙醇离心洗涤3次，以去除沉淀物中的小分子单糖和寡糖。得到提取物E，后将提取物E低温真空干燥,得到干粉F,所获得干粉F即为灵芝萃取物，其主要成分为灵芝多糖。

优选的灵芝萃取物溶液配制方法，包括如下步骤：将灵芝萃取物以1:100（w/v）比例用生理盐水配成溶液备用。依据本课题组前期观察有关剂量效应结果，以灵芝萃取物与HGPPs悬浮液1:100（w/v）比例配制成溶液，并微滤，即为灵肽口服液。

灵肽口服液制备及其免疫学功效研究：

1 材料与方法

1.1主要材料及设备

1.1.1 主要实验材料

实验动物：BALB/c小鼠，由河南省动物中心提供；羊胎盘：由河南绿金公司提供；灵芝：由仲景医药公司提供；刀豆蛋白（ConA）：sigma公司产品；脂多糖（LPS）：sigma公司产品；四甲基偶氮唑盐（MTT）上海研生实业有限公司产品；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司产品；RPMI1640培养基干粉：Hyclone公司产品．

1.1.2主要设备

超低温冰箱（ CryoCube 740） Eppendorf公司产品；高压灭菌器（Sx-700）为TOMY 公司产品；超细研磨机(MF10)为IKA 公司产品；高速匀浆机（T65D）为IKA 公司产品；切向流超滤系统为PALL 公司产品；高压液相色谱仪为H Class/TQD waters 公司产品；真空冷冻干燥机TF-LFD-1上海田枫实业有限公司产品。

1.2 方法

1.1.1 淮山羊胎盘多肽（huai goat Placental peptides， HGPPs）制备

1.1.1.1胎盘来源及其处理

淮山羊是由绿金公司注册的、我国传统的优质山羊。选择无布氏杆菌病和结核菌感染的健康初产母羊，在分娩前1个月行人工隔离圈养。期间，严格遵照母羊饮食的营养和卫生标准进行饲养。养圈要定期清理和消毒。严格观察健康状况，如有异常，立即剔除。以相对无菌程序获取自然分娩的胎盘。胎盘置4⁰C冷链运输保存。2h内用于HGPPs制备。

2.1.2 HGPPs制备

取新鲜胎盘，用4⁰C的无菌蒸馏水充分冲洗，去除血液, 75%医用酒精消毒，再用0.9%NaCL盐水充分冲洗；取胎盘子叶, 剪碎，加适量4⁰C生理盐水高速组织匀浆机匀浆；-40⁰C反复物理冰冻裂解；3000rpm离心20min，取上层液；沉淀物加生物酶水解后离心，收获上层液，将两次获得的上层液合并混匀后超滤，截留分子量10000Da。滤出液再次微滤，即为制备的HGPPs悬浮液。4⁰C处储存备用。本制品全部制备过程严格在8⁰C以下及无菌环境中完成。

1.2灵芝萃取物制备

1.2.1取适量的灵芝子实体，研磨为100目的细粉，以1：20（w/v）质量浓度，比例加入1000C的热水在磁力搅拌器中搅拌浸泡1h，后3000r/min离心10min，收获上层液。沉淀物再加90⁰C热水搅拌浸泡1h、离心。如此提取3次。将3次收获的上层液合并，减压浓缩至十到十五分之一体积时，以1:3（v/v）比例加入95%乙醇悬浮，室温静置10h，3000r/min离心20min，后沉淀物加入75%的乙醇离心洗涤3次，以去除提取物中的小分子单糖和寡糖。后提取物低温真空干燥。所获得干粉即为灵芝萃取物，其主要成分为灵芝多糖。

1.2.2灵芝萃取物溶液配制将灵芝萃取物以1:100（w/v）比例用生理盐水配成溶液备用。

1.3灵肽口服液配制

依据本课题组前期观察有关剂量效应结果，以灵芝萃取物与HGPPs悬浮液1:100（w/v）比例配制成灵肽口服液。肉眼观察为黄褐色悬浮液。

2. 灵肽口服液免疫学效应观察

2．1 试验动物分组及给药方法

取20g重成年BALB/c小鼠40只(雌雄各半)，随机分为4组,每组小鼠10只,分别为：HGPPs组（0.3ml/天/只），灵芝萃取物溶液组（0.3ml/天/只），灵肽口服液组（0.3ml/天/只），生理盐水对照组（NS）（0.3ml/天/只）。每天灌胃给药，连续20天。各组灌胃制剂灌胃前恢复室温。灵芝萃取物溶液和灵肽口服液灌胃前应充分摇匀。灵肽口服液有时有少量沉淀，摇匀后不影响使用。受试小鼠自由饮食，定期更换垫料，保持环境清洁，每天观察并记录其状况。

2.2免疫器官指数的测算

最后一次给药后禁食12h，将小鼠放血处死后，分别称体重。75%酒精消毒，在无菌环境下常规取出脾脏和胸腺，去除周围脂肪组织，生理盐水冲洗，用滤纸吸干器官表面水分，分别称重，并依据下面公式测算脾脏和胸腺指数。

脾脏指数=脾脏质量（mg）／体重（g）×l00％

胸腺指数=胸腺质量（mg）／体重（g）×100％

2．3 淋巴细胞细胞免疫功能检测

2.3.1.T淋巴细胞刺激指数(SI)检测

T淋巴细胞增殖试验采用MTT法。无菌程序取脾，无菌生理盐水冲洗，剪为约lm³小块，加适量RPMIl640培养液，通过1ml针筒缓缓反复抽打分散为脾细胞悬液，后2000 r／min离心2min；弃上清液，加适量无菌蒸馏水溶解红细胞，30s后加18g／L NaCl溶液1．O ml恢复等渗终止溶解。2000 r／min，离心2min，弃上清液，加含10%胎牛血清的的RPMIl640培养液，镜下计数，并将脾细胞悬液调整细胞数为5×10⁶个细胞／ml。在96孔板上加脾细胞悬液100μl／孔，1式3份，同时设3个空白对照孔；再加20μg/ml 的ConA 50μl，空白对照孔加RPMIl640培养液50μl。每孔用含10％胎牛血请的RPMIl64O培养液加至200μl，置37℃ CO₂培养箱中培养66h，分别加浓度为5mg/ml的 MTT lOμl，混匀，继续培养6h时，加DMSO(二甲基亚砜)100μl，混匀，用酶标仪检测波长为570 nm处的OD值，以下列公式测算出 SI： SI=试验孔OD均值／对照孔OD均值)。 SI表示T淋巴细胞增殖水平。

2.3.2 B淋巴细胞刺激指数(SI)检测

脾细胞处理及其悬液制备方法同3．2．1。后在96孔板上加脾细胞悬液100μl／孔，l式3份，同时设3个空白对照孔。再加入浓度为20μg /ml的 LPS100μl作为刺激剂。空白对照孔加入RPMIl640培养液100μl，置于37℃ C0₂孵箱中培养66h，加浓度为 5mg/ml的 MTT溶液 lOμl，继续培养6h，再各加 DMS0 l00μl，酶标仪检测波长570nm处的 OD值，以下列公式测算出SI： SI=试验孔OD均值／对照孔OD均值)。 SI表示B淋巴细胞增殖水平。

2.4 统计学处理

计量数据以±s表示，采用SPSS（16.0）软件。多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA）.以P﹤0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 成功制备出灵肽口服液

3.2灵肽口服液对小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响

无论是脾脏指数或胸腺指数，HGPPs组和灵芝萃取物溶液组与对照组比较均P< 0 .05；灵肽口服液与对照组比较P< 0 .01，与HGPPs组和灵芝萃取物溶液组比较均P< 0 .05。见表1.

3.3 灵肽口服液对受试动物淋巴细胞增殖的影响

HGPPs组和溶灵芝萃取物液组与NS组比较,无论是T细胞SI或是B细胞SI，均 P< 0 .05，而灵肽口服液组与NS组比较，则均P< 0 .01；灵肽口服液组与HGPPs组和溶灵芝萃取物液组比较，无论是T细胞SI或是B细胞SI，均 P< 0 .01。

4结论

本研究制备的灵芝萃取物主要成分是多糖。HGPAFs和灵芝萃取物是具有不同生物活性的复合物，具有明显的激活免疫效应，可刺激B细胞增殖活化，促进T细胞释放多种细胞因子，活化DC细胞，促进巨噬细胞分化和成熟，敏化NK细胞介导的细胞毒作用等。本研究首次用HGPAFs和灵芝萃取物配制的肽灵口服液，体内外结合检测其免疫效应。结果显示，灵肽口服液无论是在增加免疫器官指数方面或是在促进免疫细胞增殖方面，均优于单一的HGPAFs和灵芝萃取物。本课题制备的HGPAFs是小分子物质，进入体内可直接经肠道吸收，快速作用于生物靶点从而激活免疫应答。而灵芝萃取物为大分子复合物，须在肠道分解后才被吸收。但研究发现，多糖活性与其分子量大小成正相关关系。因此，认为多糖可能是分解前通过肠系膜免疫反应发挥免疫调节作用。上述表明HGPAF和灵芝萃取物作用靶点及其机制可能不一样。本研究结果提示灵肽口服液在受试动物体内可通过不同作用靶点和机制，产生二者效应的互补和协同，从而进一步提高机体免疫反应。灵肽口服液有望成为一种作用广泛、效果明显的新型免疫制剂，具有重要的研发价值。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种灵肽口服液，其特征在于：由灵芝萃取物和淮山羊胎盘多肽悬浮液配制而成。

2.根据权利要求1所述的灵肽口服液，其特征在于：由灵芝萃取物与淮山羊胎盘多肽悬浮液按照1:100（w/v）比例配制而成。

3.一种根据权利要求1或2任一项所述的灵肽口服液的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）制备淮山羊胎盘多肽悬浮液；

2）制备灵芝萃取物；

4.根据权利要求3所述的灵肽口服液的制备方法，其特征在于：所述淮山羊胎盘多肽悬浮液的制备方法包括如下步骤：1）胎盘来源及其处理：选择健康初产母羊，在分娩前1个月在养圈内进行人工隔离圈养，养圈要定期清理和消毒，严格观察健康状况，如有异常，立即剔除，以相对无菌程序获取自然分娩的胎盘；胎盘置4℃冷链运输保存，2h内用于淮山羊胎盘多肽悬浮液的制备；

5.根据权利要求4所述的灵肽口服液的制备方法，其特征在于：将淮山羊胎盘多肽悬浮液在40℃处储存备用。

6.根据权利要求4所述的灵肽口服液的制备方法，其特征在于：灵芝萃取物制备方法包括如下步骤：

取适量的灵芝子实体，研磨为100目的细粉，以1：20的质量浓度加入加入100℃的热水，在磁力搅拌器中搅拌浸泡1h，后3000r/min离心10min，收获上层液C，沉淀物再加90℃热水搅拌浸泡1h，离心10 min，如此提取3次，将3次收获的上层液合并形成上层液D，减压浓缩至1/10-1/15体积时，以比例为1:3的体积百分浓度加入95%乙醇悬浮液，在室温时静置10h，在每分钟转数为3000r/min状态下离心20min，后沉淀物加入75%的乙醇离心洗涤3次，后将提取物E低温真空干燥,得到干粉F,所获得干粉F即为灵芝萃取物。

7.根据权利要求6所述的灵肽口服液的制备方法，其特征在于：灵芝萃取物溶液配制方法，还包括如下步骤：将灵芝萃取物以1:100（w/v）比例用生理盐水配成溶液微滤备用。