FI97138B - Menetelmä sellaisen glykosfingolipidien seoksen valmistamiseksi ja puhdistamiseksi, joka on vapaa ei-tavanomaisten virusten aiheuttamista epäpuhtauksista - Google Patents

Description

97138

Menetelmä sellaisen glykosfingolipidien seoksen valmistamiseksi ja puhdistamiseksi, joka on vapaa ei-tavanomaisten virusten aiheuttamista epäpuhtauksista Tämä keksintö koskee menetelmää gangliosidien erityisen seoksen valmistamiseksi sekä tällaisella menetelmällä valmistettua tuotetta, joka saadaan menetelmällä, joka eliminoi selektiivisesti epäpuhtaudet, jotka liittyvät ei-tavanomai-siin, elämää uhkaaviin viruksiin, muuttamatta seoksen biologisia ja farmakologisia ominaisuuksia sen vaikutusten suhteen keskus- ja perifeeriseen hermostoon.

Gangliosidit, sialihappoa sisältävät glykosfingolipidit ovat nisäkkäiden kaikkien solukelmujen normaaleja aineosia ja niitä on runsaasti hermokudoksessa (Ando S.: Neurochem. int. 5:507, 1983). Neljä gangliosidiä, GMX, GDla, GDxb ja GTib (nimistö: Svennerholm L., J. Neurochem., 10:613, 1963) muodostavat 80 - 90 % nisäkkään aivojen koko gangliosidipi-toisuudesta. Gangliosidit sijaitsevat erityisesti plasmakal-von ulkokerroksessa, mikä viittaa siihen, että niillä on tärkeä merkitys useissa biologisissa aktiivisuuksissa, esimerkiksi eri molekyylien "sensorina" ja/tai reseptorina ja informaation siirrossa solukelmujen läpi (Fishman et ai.: Science 194:906, 1976). Niillä on siten avainmerkitys neuro-naalisen kehityksen säätelyssä ja keskus- ja perifeerisen hermoston korjauksessa.

On itse asiassa olemassa laajoja dokumentteja, että gangliosidit pystyvät vaikuttamaan edullisesti toiminnalliseen palautumiseen perifeerisen hermoston (PNS) ja keskushermoston (CNS) vaurion jälkeen vaikuttamalla spesifiseen kelmumeka-nismiin ja vuorovaikutuksella neurotrofisten tekijöiden ·. kanssa, kuten on todettu iji vitro-tutkimuksissa hermosolu- viljelmissä (Doherty P. et ai., J. Neurochem. 44:1259, 1985; Skaper S. et ai., Molecular Neurobiology, 3:173, 1989).

Etenkin on selostettu, että gangliosidien antaminen in vivo helpottaa hermoregeneroitumista ja PNS:n toiminnallista pa- 2 97138 lautumista patologisissa tiloissa: positiivisia vaikutuksia on esitetty traumaattisten neuropatioiden (Ceccarelli B. et ai.. Adv. Exp. Med. Biol. 71:275, Plenum Press, New York, 1976; Gorio A. et ai., Brain Res. 7:236, 1980; Gario A. et ai., Neuroscience 8:417, 1983), metabolisten neuropatioiden (Norido F. et ai., Exp. Neurol. 83:221, 1984) ja toksisten neuropatioiden malleissa (Di Gregorio F. et ai., Cancer Che-mother., Pharmacol. 26:31, 1990).

CNS:n suhteen on selostettu laajalti monosialogangliosidillä GMi indusoituja positiivisia palautumisvaikutuksia iskemian (Cuello A. C. et ai., Brain Res. 376:373, 1986; Karpiak S.

E. et ai., CRC Critical Rev. in Neurobiology, Voi. 5, Issue 3, 1990), traumaattisen vamman (Toffano G. et ai., Brain Res. 296:233, 1984) ja neuronotoksisen vamman malleissa (Johnsson J., Dev. Brain Res., 16:171, 1984) eri eläinlajien erilaisissa neuronaalisissa järjestelmissä. Hiljattain on todettu, että gangliosidit voivat inhiboida proteiinikinaasi C:n glutamaatilla indusoidun translokaation ja aktivoinnin (Vaccarino F. et ai., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 84:8707, *. 1987). Tämä vaikutus on erittäin tärkeä iskeemisen vaurion tiloissa, joissa on selostettu eksitatoristen aminohappojen, kuten glutamaatin ratkaisevasta merkityksestä, jotka laukaisevat neuronaaliseen kuolemaan johtavan tapahtumien ryöpyn. Tämä mekanismi voisi edistää neuronien (hermosolujen) eloon-jääntiä vamman ympärillä olevalla alueella, estää taantuvan degeneroitumisen ja nopeuttaa korjaavaa kasvureaktiota paikallisten trofisten tekijöiden suhteen.

Kokeellisen tutkimuksen tulokset on vahvistettu laajalti gangliosidien kliinisestä käytöstä saaduilla tuloksilla. Yli kymmenen vuoden ajan gangliosidejä on käytetty terapeuttisina aineina perifeerisen neuropatian lähes kaikissa muodoissa, niistä muodoista, jotka syntyvät mekaanisesta vauriosta, niihin muotoihin, jotka aiheutuvat toksisten tekijöiden tai puutteiden johdosta, infektioosista ja inflammatorisista sairauksista metabolisiin toimintahäiriöihin. Nämä lääkeaineet ovat osoittautuneet yhtä tehokkaiksi mono- ja 3 97138 polyneuropatioissa, sensomotorisissa sairauksissa ja patologioissa, jotka vaikuttavat autonomiseen hermostoon, kuten useissa neuropatioissa, jotka vaikuttavat kraniaalisiin hermoihin, esimerkiksi Bellin halvauksessa, trigeminaalisessa neuralgiassa ja neuralgiassa, jonka on aiheuttanut herpes zoster. Gangliosidejä ja etenkin monosialogangliosidejä voidaan käyttää laajalti kaikissa patologioissa, jotka liittyvät CNS:n vaskulaaris- tai traumaattistyyppisiin akuutteihin vammoihin, ja tällaisten patologioiden seurauksissa (sereb-raalinen iskemia, kraniaalinen ja spinaalinen trauma).

Niiden osoitettu korjaava aktiivisuus CNS:ssä tukee myös niiden käyttöä kroonisissa neurodegeneratiivisissä patologioissa, kuten Parkinsonin taudissa ja Alzheimerin taudissa. Se seikka, että ne ovat luonteeltaan "endokoideja" (endogee-nisiä lääkeaineita) ja ovat hermosolukelmujen luonnollisia komponentteja, selittää niiden erinomaisen siedettävyyden ja sivuvaikutusten puuttumisen, jopa käsiteltäessä pitkään korkeilla annoksilla, joita sivuvaikutuksia esiintyy niin usein joissakin perifeeristen neuropatioiden tavanomaisissa tera-pioissa.

Yleensä sopivat gangliosidiseokset, esimerkiksi seuraavanlainen valmiste: GM]. 18 - 24 %, GDia 36 - 44 %, GD^b 12 - 18 %, GTib 16 - 22 %, tai yksittäiset gangliosidifraktiot, etenkin monosialogangliosidi GMi tarjoavat esitetyn tyyppisiä biologisia aktiivisuuksia. Nämä gangliosidit, kuten sopivat seokset tai yksittäiset fraktiot, etenkin monosialogangliosidi GMi uutetaan nisäkkään aivoista ja siten on tarpeen, kun tunnetaan niiden erityinen biologinen toiminta ja niiden edellä perifeerisen ja keskushermoston suhteen esitetty terapeuttinen käyttö, käyttää puhdistusmenetelmiä, jotka takaavat lopullisen tuotteen, joka on ehdottoman puhdas ja vapaa biologisista ja kemiallisista epäpuhtauksista.

On pitkään ollut tunnettua, että on mahdollista uuttaa tut-kimustasolla gangliosidien seoksia (Tettamanti et ai., Bio-chim. e Biophys. Acta, 296:160, 1973; Trams et ai., Biochim.

4 97138 e Biophys. Acta, 60:350, 1962; Bogoch et ai., British J. Pharm., 18:625, 1962; Wiegandt et ai., Angew. Chem. 80:89, 1968; US-patentti n:o 3,436,413; ja C.A. 61, 9851C, 9895d), mutta mitään näistä edellä mainituista menetelmistä ei ole kehitetty ottaen huomioon ei-tavanomaisiin viruksiin liittyvien komponenttien eliminointi ja hävittäminen. Eräänä syynä tähän on se, että tuolloin sellaiset sairaudet, jotka vaikuttavat eläinlajeihin, joille uuttamiseen käytetyt aivot kuuluvat, olivat vielä tuntemattomia. Eräänä toisena syynä on se, että mitään reagensseja ei ole ollut käytettävissä potentiaalisesti vaarallisten komponenttien identifioimiseksi spesifisesti, kun taas nykyisin tällaiset reagenssit ovat käytettävissä spesifisten metodologioiden avulla, jotka on kehitetty äskettäin saadun, molekyylibiologiatekniikkojen tieteellisestä kehityksestä kerätyn tiedon perusteella.

Toisinaan voi syntyä patologistyyppisiä tilanteita, joissa patogeenistä ainetta tai aineita ei voida identifioida. Erästä tällaista patologista tilannetta kutsutaan naudan sienimäiseksi enkefalopatiaksi (aivotauti) (BSE), joka on raportoitu ensiksi Englannissa 1986 (Wells G. et ai., Vet.

t

Record, 419, 1986). Tämä nimi johtuu sairastavien eläinten aivokudoksen sienimäisestä ulkonäöstä. Kun kudoksen leikkeitä analysoidaan mikroskoopilla, pääasialliset vammat koostuvat laajoista neuronaalisista vakuoleista (hermosolurakku-loista).

Kaikki käytettävissä oleva todistusaineisto osoittaa siihen seikkaan, että BSE kuuluu keskushermoston degeneratiivisten enkefalopatioiden ryhmään, jotka johtavat lopuksi poikkeuksetta kuolemaan ja joita aiheuttaa ei-tavanomaisten, infek-tioosisten aineiden ryhmä (Fraser et ai., Vet. Record 123:472, 1988; Hope et ai., Nature 336:390, 1988). Tämä ryhmää käsittää myös lampaiden ja vuohien kutkataudin, minkki-farmien minkin infektioosisen enkefalopatian ja ihmisen kaksi sairautta: kuru (krooninen keskushermoston sairaus) ja Creutzfeldt-Jacobin tauti. Näiden tautien aivoissa aiheuttamat histopatologiset vammat ovat samanlaisia kaikissa ta- S 97138 pauksissa ja niitä voidaan verrata BSE:n aiheuttamiin vammoihin. On esitetty useita teorioita näiden etiologisten aineiden luonteesta, jotka eivät ole bakteereita eivätkä viruksia, poikkeavat muista tunnetuista organismeista ja siten tunnetaan ei-tavanomaisina viruksina. Niiden pitkien inku-baatioaikojen johdosta, alkaen infektoitumishetkestä sympto-mien puhkeamiseen, nämä virukset tunnetaan myös "hitaina viruksina".

Muutamien vuonna 1986 havaittujen tapausten jälkeen tauti on levinnyt ja se on saavuttanut epideemisiä suhteita Britanniassa vahingoittaen noin 14.000 nautaeläintä ja kasvaen jatkuvasti n. 250 - 300 tapauksella joka viikko. Infektoituneessa karjassa ei esiinny mitään taudin merkkejä useiden vuosien aikana (inkubaatioaika 4-5 vuotta), mutta kun symptomit ovat puhjenneet, eläimet heikkenevät nopeasti ja kuolevat.

Britannian maanviljelysministeriön Veterinäärisen keskuslaboratorion epidemiologinen tutkimus (Wilesmith et ai., Vet. Record. 123:638, 1988) on osoittanut, että infektion lähde on eläinten rehu, joka on valmistettu muiden märehtijöiden käsitellyistä ruhoista ja joka myydään jauhetun lihan tai luun muodossa. Koska enkefalopatia voi siirtyä useisiin eläinlajeihin, näyttää olevan järkevältä olettaa, että BSE on kutkataudista vastaavan etiologisen aineen infektion tulos, joka siirtyy lampaasta näiden saastuneiden ruoka-aineiden kautta (Morgan KL, Vet. Record 122:445, 1988).

Tämän tutkimuksen tulosten perusteella Britannian hallitus on kieltänyt päätöksellä, joka astui voimaan 18.7.1988, eläinten ruoka-aineiden myynnin ja jakelun, jotka sisältävät märehtijöistä johdettuja eläinproteiineja.

• ·

Yleisenä mielipiteenä on, että useat tekijät ovat vaikuttaneet yhdessä BSE:n äkilliseen esiintymiseen Britanniassa (Cherfas J., Science, helmik. 1990, 523).

Ensinnäkin lampaiden määrä kasvoi Iso-Britanniassa nopeasti 70-luvun lopulla ja 80-luvun alussa ja tämän myötä kutkatau- 6 97138 din, lampaiden endeemisen taudin esiintyminen Euroopassa yli 250 vuoteen (Pattison et ai., Vet. Record 90:465, 1972). Samanaikaisesti öljykriisin vanavedessä eläinrehua valmistavat tehtaat muuttivat ruhojen käsittelymenetelmiään alhaisemman lämpötilan omaavaan järjestelmään, joka on luultavasti vähemmän tehokas erittäin kestävän kutkatautiaineen hävittämisessä. Kaikki näiden ruoka-aineiden valmistajat lukuunottamatta yhtä luopuivat liuottimien, kuten bentseenin, heksaa-nin ja trikloorietyleenin käytöstä ylimääräisten rasvojen poistamiseksi soija- ja luujauhosta. Ehkä merkittävintä oli kuitenkin se, että tuotteiden kuumentamisen lopullinen vaihe liuottimien poistamiseksi jätettiin siten pois: itse asiassa tämä vaihe tarvitsi erittäin korkeita lämpötiloja.

Lisäksi hallituksen politiikka rohkaisi kasvattajia tuottamaan enemmän maitoa ja vieroittamaan vasikat aikaisin ruokkimalla niitä proteiinirikkailla ruokavalioilla. Nämä olivat usein heikkoja laadullisesti, vaikka lihasta ja luusta valmistettu jauho oli halvempaa kuin tuotteet, jotka oli valmistettu soijapavusta ja kalasta, jotka ovat varmempia pro-·; teiinin lähteitä. Tutkimukset sen löytämiseksi, miten tauti siirtyy, ovat olennaisia BSE-tutkimukselle. Näiden kokeiden tärkein näkökohta on se, että identifioimalla lajien välisten sulkujen rajat patogeenisen aineen siirtymiselle, on mahdollista analysoida BSE-infektion vaara toisiin lajeihin. Fraser et ai. (Vet. Record, 123:472, 1988) ovat osoittaneet, että tauti voi kulkeutua karjasta hiiriin. He inokuloivat BSE:hen kuolleen karjan aivojen uutteita hiirien aivoihin, jotka tämän jälkeen kehittivät taudin. Myöhemmin Barlow et ai. (Vet. Record, 3. helmik. 1990) ovat siirtäneet taudin hiiriin ruokkimalla niitä infektoiduilla aivoilla. Tämä oli ensimmäinen osoitus, että BSE voidaan saada syömällä infek-. toitunutta materiaalia. Mikään muu sairastuneiden eläinten kudos (perna, selkäydin, lymfakudokset, maito jne.) eivät pystyneet tuottamaan tautia hiirissä.

On osoitettu, että kutkatauti voi siirtyä karitsoihin niiden emojen kautta, mutta tähän asti ei ole tullut esiin mitään 7 97138 osoitusta BSE:n etiologisen aineen mahdollisesta pystysuorasta tai vaakasuorasta siirtymisestä karjassa.

Aineet, jotka aiheuttavat subakuutteja infektioosisia enke-falopatioita, ovat erittäin resistenttejä vakioiden puhdistusmenetelmien suhteen. Tästä käytettävissä olevat tiedot ovat useimmiten peräisin kutkataudin ja Creutzfeldt-Jacobin taudin inaktivointiaineiden tutkimuksista. Kutkataudin etio-loginen aine on erittäin resistentti lämpötilan muutoksen suhteen. Alistettaessa ne 80*C:een lämpötiloihin niiden infektiivisyys vähenee ainoastaan hieman. Korkeammat lämpötilat vähentävät kuitenkin huomattavasti infektiivisyyttä (Hunter et ai., J. Gen. Microbiol. 37:251, 1964). Pieni määrä infektioosisia "viruksia" säilyy toisinaan kuumennettaessa infektoituneen materiaalin suspensioita 100eC:ssa tunnin ajan tai H8eC:ssa 10 minuutin ajan.

Hiljattain todettiin tarpeelliseksi jatkaa näiden infektioo-sisten aineiden sterilointistandardeja korkeassa höyryn paineessa autoklaaveissa. Nykyisissä standardeissa, jotka kos-. kevät autoklaavikäsittelyä USA:ssa Creutzfeldt-Jacobin tau din steriloimiseksi, käytetään käsittelyä 132eC:ssa tunnin ajan (Rosenberg et ai., Annals of Neurology 19:75, 1986) ja ne perustuvat tutkimuksiin, jotka on suoritettu kutkatauti-tai Creutzfeldt-Jacob-aineita sisältävillä aivohomogenaa-teilla (Brown et ai., J. of Infectious Diseases 153:1145, 1986). Britanniassa nykyisessä autoklaavikäsittelystandar-dissa Creutzfeldt-Jacobin taudin steriloimiseksi käsitellään autoklaavissa 134 - 138eC:ssa 18 minuutin ajan perustuen muutamiin tutkimuksiin, jotka käsittävät Kimberlin'in tutkimuksen (Kimberlin et ai., Journal of Neurological Sciences 59:355, 1983). Valitettavasti naudan sienimäisen enkefalopa-tian aineet ovat hyvin resistenttejä jopa tavallisten kemiallisten käsittelyjen samoin kuin fysikaalisten käsittelyjen suhteen. Liuottimia, kuten bentseeniä, heksaania, bensiiniä ja trikloorietyleeniä on käytetty uuttoliuottimina, mutta tiedetään vähän niiden vaikutuksista infektiivisyy-teen. Ainoastaan pieni määrä tietoja on käytettävissä infek- β 97138 tiivisten aineiden kemiallisesta inaktivoinnista, pääasiassa, koska tutkimukset vaativat suuria määriä eläimiä ja pitkiä tarkkailuaikoja. Natriumhypokloriitin 0,3 - 2,5 %:n kon-sentraatiot vähensivät suuresti tarttuvuutta käytetyissä biologisissa analyyseissä, mutta ne eivät kuitenkaan eliminoineet sitä täysin (Walker et ai., Am. J. Pubi. Health 73:661, 1983). Arvot, jotka koskevat käsittelyä 0,25 N nat-riumhydroksidilla, ovat hyvin vaihtelevia. Yli 1 N:n kon-sentraatioissa se näyttää kuitenkin olevan tehokkain kemiallinen aine kaikista tutkituista aineista. Käsittely 6 - 8 M urealla on myös erittäin vaihtelevaa.

Steriloinnin tutkimustulokset osoittavat siten, että vaikkakin suurin osa infektiivisyydestä hävitetään nopeasti useilla erilaisilla fysikaalisilla ja kemiallisilla prosesseilla, resistenttien infektioosisten aineiden pienien alapopulaa-tioiden olemassaolon johdosta saastuneiden materiaalien sterilointi on käytännössä erittäin vaikeaa.

Sen jälkeen, kun BSE oli identifioitu "kutkatautimaiseksi" taudiksi, alettiin kysyä tärkeitä kysymyksiä epidemiologisella ja analyyttisellä tasolla, jolloin viimeksi mainitut kohdistettiin etenkin infektiivisyyteen liittyvän aineen identifioimiseen. Kuitenkin kaikki tähänastiset yritykset identifioida etiologiseen aineeseen liittyvät nukleiinihapot ovat olleet hedelmättömiä. Ainoa eristetty komponentti, joka liittyy selvästi infektiiviseen toimintaan, on sialoglyko-proteiini, jota kutsutaan kutkatautiprioniproteiiniksi (PrpSC).

Tällä proteiinilla tämän jälkeen suoritetut geneettiset tutkimukset osoittivat joitakin yllättäviä tietoja. Muutamat proteiinin N-pään sekvenssin mukaisesti syntetisoidut DNA-·, koettimet ovat mahdollistaneet kromisomigeenin läsnäolon osoittamisen yksilöllisessä kopiossa, jolla on sama restrik-tiomalli sekä terveiden eläinten aivoissa että infektoituneiden eläinten avoissa. Tämä geeni, joka säilyy jopa hyvin erilaisissa lajeissa, koodaa proteiinin, jotka kutsutaan

Il I > ' (-»'» IM< ltl.1 < 9 97138 sellulaariseksi prioniproteiiniksi (PrPc) ja jonka ilmeinen molekyylipaino on 33 - 35,0 kilodaltonia (kd) ja jolla on erityisen selviä eroja PrpS>c:n suhteen: 1) PrPc on altis proteaasille, kun taas PrPSc on resistentti. Etenkin PrPc pilkkoutuu kokonaan proteinaasi K-entsyymin toimesta, kun taas PrPSc hydrolysoituu N-pään tasolla n.

5 kd:n fragmentin verran ja tuottaa proteiinin, jota kutsutaan nimellä PrP27-3o* Tämä muoto puhdistuu samanaikaisesti infektiivisyyden kanssa ja se on runsain komponentti, joka saadaan infektiivisen materiaalin valmisteissa.

2) Sekä PrPc että PrPSc ovat kelmuproteiineja, mutta ensimmäinen tehdään liukenevaksi käsittelemällä detergenteillä, kun taas toinen pyrkii polymeroitumaan kuitumaisiksi amyloi-dirakenteiksi. Samanlaisia rakenteita (kutkatautiin liittyviä fibrillejä, SAF) on havaittu infektoituneissa aivoissa ja ne ovat luonteenomaisia tämän tyyppiselle infektiolle. Tämän infektiivisen proteiinin resistenssi inaktivoinnin suhteen on epätavallinen: se on herkkä esimerkiksi konsentroiduilla aikalisillä liuoksilla tai yli 120eC:n lämpötiloissa suoritettujen käsittelyjen ja niiden yhdistelmien tai erilaisten denaturointiaineiden kanssa muodostettujen yhdistelmien suhteen. Siten ainoat diagnostiset menetelmät, jotka ovat käytettävissä näiden sienimäisten enkefalopatioiden identifioimiseksi selvästi, ovat SAF:n läsnäolon toteaminen infektoituneissa aivokudoksissa, proteiinin PrP27-30 uuttaminen ja immunokemiallinen identifioiminen, metodologiat, joita voidaan soveltaa ainoastaan patologisen anatomian aikana.

SAF on identifioitu infektoituneissa naudan aivoissa, sitten PrpSOjn homlogi eristettiin ja sillä oli reaktiivisuus see-.. rumin kanssa, joka oli saatu hiiren SAF:ää vastaan. Edelleen ensimmäisen 12 aminohapon N-pään sekvenssillä oli 100 %:n homologia lampaan PrPSc:n kanssa ja erotus hiiren, hamsterin ja ihmisen PrPSc:n suhteen glysiinin yksi ainoa väliinkyt-kentä. Heti, kun oli todettu, että BSE on "kutkatautimainen" 10 97138 tauti, syntyi joitakin tärkeitä kysymyksiä epidemiologisella ja analyyttisellä tasolla, jotka viimeksi mainitut kohdistuivat etenkin infektiivisyyteen liittyvän proteiinin identifiointiin.

BSE:n odottamaton ilmaantuminen ja kaikki näiden neurologisten sairauksien suhteen vielä selitettävät näkökohdat ovat saaneet aikaan sen, että on annettu tarpeellinen merkitys ongelmalle, etenkin niiden toimesta, jotka valmistavat tuotteita, jotka koostuvat nautamateriaalista.

Itse asiassa ei riitä, että käytetään farmaseuttisesti mielenkiintoisten yhdisteiden tai niiden seosten valmistamiseksi raaka-ainetta, joka on varmistettu ravintokäyttöön. Siten on tarpeen kehittää menetelmä kyseessä olevien tuotteiden valmistamiseksi käyttämällä uuttometodologioita, jotka takaavat infektiivisyyteen liittyvän proteiinin ja itse in-fektiivisyyden eliminoimisen. On selvää, että infektiivises-ti aktiivisen fraktion uuttamismenetelmän tulisi samanaikaisesti säilyttää lopulliseen tuotteeseen haluttujen aktiivisten aineosien biologinen aktiivisuus.

•

Toinen potentiaalisesti vaarallinen proteiini näiden valmisteiden tasolla ihmisen suhteen on myeliiniemäsproteiini (MBP).

Se on proteiini, jolla on ihmisessä ja useimmissa selkärankaisissa n. 19,5 kd:n molekyylipaino. Sitä on läsnä kolmessa molekyylimuodossa ihmisen myeliinissä ja kuudessa muodossa hiiren myeliinissä ja se koodaa yhden ainoan geenin, joka sijaitsee kromosomissa 18 ja se muodostaa n. 30 % koko mye-liiniproteiinista. Sen tarkka topografinen sijainti ei ole vielä varma. Sitä on havaittu oligodendrosyyttien sytoplas-.. massa ainoastaan myelinisoitumishetkellä. Erästä identtisenä pidettyä proteiinia on läsnä perifeerisessä hermostossa (proteiini P1) ja perifeerisen myeliinin kyky indusoida kokeellisia allergisia enkefalomyeliittejä (EAE) (aivo-selkä-ydintulehduksia) laboratorioeläimissä johtuu siitä.

11 97138 MBP:n koko molekyyli ei ole enkefalitogeeninen, vaan ainoastaan osa, joka vaihtelee lajista toiseen: kaniinissa enkefalitogeeninen osa on aminohappofragmentti 64 - 73, Lewis-ro-tassa 71 - 85, marsussa 113 - 121, SJL/J-hiiressä 89 - 169. EAE on tyypillinen solusta riippuvainen autoimmuunisairaus: itse asiassa se on siirrettävissä eläimestä toiseen herkistettyjen T-lymfosyyttien infuusiolla eikä ainoastaan seerumin infuusiolla. Tässä tapauksessa tautia tukevat transfu-soidut lymfosyytit eivätkä vastaanottajan lymfosyytit. Eräs toinen solusta riippuvainen autoimmuunimuoto on allerginen kokeellinen neuriitti (EAN). Se voidaan myös indusoida korkeampien selkärankaisten kaikissa lajeissa inokuloimalla perifeerisen myeliinin raaka homogenaatti täydellisen Freundin adjuvanttiin. Ollaan sitä mieltä, että antigeeni, joka pääasiassa vastaa tästä autoimmunisoinnista, on proteiini P2, jonka molekyylipaino on 12,0 kd ja jota on läsnä perifeerisessä hermostossa.

Eräs toinen epäpuhtaus, joka on otettava huomioon näissä valmisteissa, on naudan genominen DNA. Mahdollisuus, että voidaan valmistaa yhdistelmä-DNA-teknologialla biologisesti aktiivisia proteiineja, joita voidaan käyttää farmaseuttisina aineina, on tehnyt tarpeelliseksi analysoida lopulliset tuotteet DNA-tähteiden läsnäolon suhteen, jotka kuuluvat soluun, jossa haluttu proteiini ekspressoidaan. DNA-fragment-tien läsnäololla ihmisessä käytettävissä farmaseuttisissa ’. valmisteissa on ongelmana se vaara, että näiden fragmenttien genomeihin liittyy geneettistyyppisen informaation mahdollinen kontrolloimaton siirto, vaikkakaan ei ole vielä mahdollista valmistaa gangliosidejä yhdistelmä-DNA-teknologialla, on tarpeen soveltaa tämän tyyppistä analyyttistä kontrolli-teknologiaa uuttamistuotteisiin, jotka käyttävät eläinperäistä raaka-ainetta.

Lopuksi iji vitro- ja in vivo-tutkimuksessa käytettävien gangliosidien tulisi olla vapaita muista yhdisteistä, kuten asialogangliosideistä ja glykoserebrosideistä. Näillä aineilla voi olla, mikäli niitä on läsnä korkeissa konsentraa- 97138 12 tioissa, tärkeitä immunologisia seuraamuksia ja ne voivat myös johtaa virheellisiin kokeellisiin näkökohtiin.

BSE:n äkillinen ilmaantuminen ja kaikki muut näiden neurologisten sairauksien suhteen vielä selvitettävät näkökohdat ovat aiheuttaneet sen, että on annettu tarpeellista huomiota ongelmalle, etenkin niiden toimesta, jotka valmistavat nau-tamateriaalista koostuvia tuotteita.

Aikaisemmat menetelmät gangliosidien valmistamiseksi, kuten yllä on esitetty, ovat vaatineet, että tuote on farmaseuttisesti hyväksyttävä, vapaa niistä biologisista epäpuhtauksista, joiden tiedetään tällä hetkellä olevan mahdollisesti vaarallisia terveydelle. Mutta selvästi edellä mainitun patologian myöhempi puhkeaminen täysikasvuisessa karjassa on tehnyt tarpeelliseksi saada aikaan aktiivinen aineosa, jolle sen menettämättä edellä mainittuja terapeuttisia ominaisuuksia on luonteenomaista ei-tavanomaisten viraalisten aineiden varmistettu puuttuminen, käyttämällä erityisiä menetelmiä, jotka takaavat näiden ei-tavanomaisten viraalisten aineiden inaktivoitumisen ja infektiivisyyden täydellisen eliminoinnin, ja käyttämällä erityisiä metodologioita, joilla identifioidaan tällaiset aineet. Itse asiassa ei riitä, että käytetään raaka-ainetta, joka on varmistettu ravinnoksi kelpaa-vaksi, yhdisteiden tai seosten valmistamiseksi siitä farmaseuttisia tarkoituksia varten. Ilmeisesti BSE:n puhkeaminen on analysoitava ottamalla huomioon sen biologinen toiminta in vivo, jota on pidettävä esimerkkinä prosessin erilaisten vaiheiden toteamisesta, mutta ei sen yhteenvetona. Tämä biologisen in vivo-toiminnan analyysi on tarpeen, koska tiedemiehet eivät ole vielä yhtä mieltä infektion liittymisestä määrättyihin proteiineihin, kuten PrP27_30:een. Selvästi uuttamisprosessin, joka eliminoi infektioosisen aktiivisuuden, on samanaikaisesti jätettävä aktiivisen aineosan biologinen aktiivisuus koskemattomaksi, koska tämä on olennainen sen terapeuttiselle käytölle. (Tätä erityistä tehtävää varten bioteknologian/farmasian työryhmä: Viruksen poisto- ja inaktivointimenetelmän vahvistaminen. (Validation of virus il !. . aa.t i.iu « . * ·» - · n 97138 removal and Inactivation process) Euroopan yhteisön komissio, maaliskuu 1990). Tieteellinen tutkimus on tuottanut toisaalta menetelmiä, jotka takaavat gangliosidien sopivien seosten tai niiden yksittäisten fraktioiden tuottamisen proteiineista, kemiallisista ja biologisista epäpuhtauksista vapaissa muodoissa, ja toisaalta menetelmiä, jotka hävittävät tehokkaasti infektiivisyyden, joka liittyy hitaisiin viruksiin, mutta ei tunneta mitään menetelmää, jolla on mahdollista saada aikaan myös teollisuusmittakaavassa haluttu, samalla tavalla tuntematon tuotetulos, puhdas, farmakologisesti aktiivinen tuote, joka on vapaa infektiivisyydestä, joka liittyy patogeenisiin aineisiin, jotka voidaan määrittää hitaiksi viruksiksi.

Piirustuksissa kuvio 1 on kaaviomainen kaavio keksinnön menetelmästä, kuvio 2 on valokuva, joka esittää tuloksia, jotka on saatu käyttämällä anti-Prp27-30“vasta-aineita Western Blot-teknii-kalla joidenkin näytteiden analysoimiseksi, jotka on otettu keksinnön mukaisen menetelmän välivaiheista, kuvio 3 on valokuva, joka esittää naudan genomisen DNA:n analyysin tuloksia joistakin näytteistä, jotka on otettu keksinnön mukaisen menetelmän eri vaiheista, • kuvio 4 on valokuva tuloksista, jotka saatiin käytettäessä anti-MBP-vasta-aineita western Blot-tekniikassa joidenkin näytteiden analysoimiseksi, jotka otettiin keksinnön mukaisen menetelmän välivaiheista, kuvio 5 on valokuva keksinnön menetelmän mukaisesti valmistetun gangliosidiseoksen piihappogeelikromatografia-analyy-sin tuloksista, kuvio 6 on valokuva, joka esittää keksinnön mukaisesti valmistetun gangliosidiseoksen biologisesta aktiivisuudesta, ja kuvio 7 on valokuva, joka esittää keksinnön mukaisen menetelmän välivaiheista otettujen näytteiden immunokemiallisen 14 97138 analyysin tuloksia anti-PrP27-3o-vasta-aineilla.

Tämän keksinnön tehtävänä on saada aikaan tuote, jolle on luonteenomaista hitaiden virusten puuttuminen ja joka saadaan edullisella menetelmällä, jota voidaan soveltaa teolliseen tuotantoon, ja menetelmä, jonka uutuus on sen erilaisten uuttovaiheiden sopivassa peräkkäisjärjestyksessä. Tämä menetelmä, joka eliminoi sen eri vaiheiden aikana hitaisiin viruksiin, kuten naudan sienimäiseen enkefalopatiaan liitettävät infektioosiset epäpuhtaudet, mahdollistaa seoksen aktiivisuuden, joka muodostaa itse tuotteen terapeuttisen aktiivisuuden, säilymisen muuttumattomana. Tästä menetelmästä johdettu tuote muodostuu gangliosidien tai yksittäisten fraktioiden tarkasta seoksesta, jotka saadaan naudan aivoista tai niiden osista.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä muodostuu yllä olevista syistä seuraavista päävaiheista: a) naudan aivokudos alistetaan lipidieliminointiin asetonissa, b) asetonisakan suspensio metyleenikloridin, metanolin ja natriumhydroksidin seoksessa alistetaan 30 - 35eC:n lämpötilassa vähintään 3 tunnin ajaksi hydrofobisten ja hydrofii-listen aineiden erotukseen, c) sakka tehdään liukenevaksi vesi/kloroformi/metanoli-seok-sella ja natriumhydroksidilla (pH 12) kuumentamalla 38 -43eC:ssa 4-8 tunnin ajan, d) sakka tehdään liukenevaksi natriumhydroksidilla, 1 N, huoneen lämpötilassa vähintään tunnin kuluessa, ja e) neutraloidaan ja dialysoidaan gangliosidiseosta sisältävä liuos kalvon läpi, jonka molekyylipainosulku on 10 kd.

Tämän jälkeen selitetään havainnollistavia, mutta ei rajoittavia esimerkkejä valmisteista, jotka on valmistettu infektoituneista naudan aivoista, joissa havaittiin sienimäinen 1| : I* I un I I t «· 15 97138 enkefalopatia, tai proteiiniraaka-aineista, jotka oli saatu infektoitumattomista naudan aivoista ja joihin oli lisätty vakiot määrät infektoitunutta materiaalia 263K-kutkatauti-kannasta.

Materiaalit ja menetelmät

Naudan aivoja käytettiin menetelmässä esitetyn gangliosidi-seoksen uuttamiseksi, histologisessa analyysissä fibrille-jä, jotka ovat tyypillisiä kudoksille, jotka kuuluvat infektoituneista eläimistä saatuihin materiaaleihin.

Valmistusesimerkkej ä

Esimerkki 1

Valmistusprosessin kaavio on esitetty kuviossa 1.

1000 g infektoituneita naudan aivoja, jotka oli jauhettu ja suspendoitu tislattuun veteen, annettiin olla kosketuksissa asetonin 300 - 600 ml:n kanssa (suhde 1:5 paino/tilavuus) n. 3 tunnin ajan huoneen lämpötilassa sekoittaen. Liuosta sent-rifugoitiin sitten 6000 x g:ssä 7 - 4eC:n lämpötilassa, kunnes saostuminen oli täydellinen. Liuotin eliminoitiin sitten ja sopivaan lasiastiaan sijoitettuun märkään jauheeseen lisättiin 180 - 350 ml metyleenikloridin, metanolin ja nat-riumhydroksidin seosta ja annettiin sitten olla magneettise-koituksessa vähintään kolmen tunnin ajan 30 - 35*C:n lämpötilassa. Lopuksi tämän annettiin sitten jäähtyä ja sentrifu-goitiin sitten 20 minuutin ajan 6000 x g:ssä +10eC:ssa. Nestefaasi suodatettiin suodatussuppilon läpi +4*C:n lämpötilassa. Nesteeseen lisättiin sopiva määrä kalsiumkloridia ja asetonia, sekoitettiin n. 30 minuutin ajan ja sentrifugoi-tiin 6000 x g:ssä +10eC:ssa. Sakan (raaka-aine 1) annettiin lopuksi kuivua yön yli ja sitten 5 tunnin ajan suurtyhjössä. Talteenotettu raaka-aine 1 suspendoitiin uudelleen 10 - 18 ml:aan veden, kloroformin ja metanolin seosta. pH säädettiin arvoon n. 12 5N NaOHtlla. Tätä kaikkea kuumennettiin 38 -43eC:ssa 4-8 tunnin ajan ja sekoitettiin. Lopuksi jäähty- 16 97138 misen jälkeen neutraloitiin 6N HCl:llä ja lisättiin tarvittu määrä veden, n-butanolin ja kloroformin seosta. Sekoitettiin 15 - 30 minuutin ajan ja annettiin seistä 2-4 tunnin ajan. Lopuksi alempi orgaaninen faasi hylättiin, jäljelle jääviin vesifaaseihin lisättiin asetonia ja natriumkloridia, sekoitettiin n. 30 minuutin ajan ja sentrifugoitiin 20 minuutin ajan 6000 x g:ssä +15eC:ssa (raaka-aine 2).

Tuote kuivatettiin suurtyhjössä, suspendoitiin uudelleen 6 -15 ml:aan absoluuttista metanolia ja sitten pidettiin kuumana n. 2 tunnin ajan sekoittaen liuosta silloin tällöin. Suspensiota sentrifugoitiin sitten nopeasti 6000 x g:ssä ja su-pernatantti laitettiin pakastimeen n. 2 tunniksi. Opalisoi-vaa valkoista liuosta sentrifugoitiin sitten 0°C:ssa 600 x g:ssä ja sakka kuivatettiin suurtyhjössä. Tuote otettiin IN natriumhydroksidiin ja sen annettiin olla kosketuksissa liuoksen kanssa vähintään tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Lopuksi suspension pH säädettiin suunnilleen arvoon 9 ja dialysoitiin kalvolla, jonka molekyylipainosulku oli 10 kd, tislatun veden sopivaa määrää vastaan. Lisättiin natriumklo-ridin ja asetonin sopiva määrä ja sentrifugoitiin +5°C:ssa 6000 x g:ssä ja kuivatettiin sitten suurtyhjössä (valmis tuote). Näyte otettiin 10 mM:iin fosfaattipuskuria, pH 7,2, ja steriloitiin +121*C:ssa 30 minuutin ajan (valmis, steriloitu tuote).

Menetelmän arviointi:

Kuten edellä selitettiin, keksinnön mukaisen menetelmän tärkeä aspekti on gangliosidituotteen aikaansaaminen, joka on vapaa ei-toivotuista epäpuhtauksista, etenkin vapaa ei-ta-vanomaisista viruksista. Menetelmän arvioimiseksi menetelmän eri vaiheiden näytteitä testattiin mahdollisen epäpuhtauden suhteen.

Biologis/kliinisen testauksen menetelmä ja tulokset ovat seuraavat: w 97138

Biologinen testi kutkataudin suhteen: Näissä kokeissa käytetyt eläimet olivat Golden Syrian-hams-tereita (LVG/Lak). Infektiotestit suoritettiin neljän vieroitetun naaraspuolisen eläimen ryhmissä, jotka olivat saaneet intraserebraalisesti (i.c.) inokuloinnln 0,05 ml:11a näytteitä, jotka oli laimennettu 10 kertaa steriilissä PBS:ssä. Intraserebraaliset inokuloinnit saatiin aikaan koulutetun henkilökunnan toimesta käyttämällä kertakäyttölasi-ruiskuja, joissa oli 26G, 3/8-tuuman steriilit neulat.

Lopullinen, steriloitu tuote, joka oli konsentroitu 20-ker-taisesti, käytettiin kokonaan seuraavasti: 4.0 ml injektoitiin intraserebraalisesti 40 eläimeen.

3.0 ml laimennettiin suhteessa 1:20 ja injektoitiin, laimen-tamattomana, intraserebraalisesti 50 eläimeen ja i.p. 22 eläimeen, i.p. injektoitu määrä oli 2,5 ml.

Eläimet tutkittiin kahdesti viikossa tai useammin 12 kuukauden ajan luonteenomaisten neurologisten, kliinisten sympto-mien puhkeamisen suhteen. Varhaisten symptomien puhkeaminen jokaisessa eläimessä rekisteröitiin ja eläimet tapettiin, kun tauti oli täysin puhjennut. Niiden aivot jaettiin kahteen puoliskoon, toinen kiinnitettiin l0%:isessa formaliinissa ja toinen säilytettiin -70°C:ssa. Patologinen diagnoo-. si tehtiin kaikissa eläimissä, jotka kuolivat epäillystä '* syystä, ja niissä, joissa oli esiintynyt merkkejä neurologi sista sairauksista. Tarkkailuajan lopussa kaikki elossa olevat eläimet tapettiin ja niiden aivot arvioitiin patologisesti.

Infektiivinen tiitteri laskettiin "lopullisessa päätepisteessä" Reedin ja Munchin menetelmän mukaisesti ja ilmaistiin arvolla log LDso/ml.

Testatut näytteet olivat seuraavat käytettäessä kuviossa l esitettyjä tuotteiden nimiä: 18 97138

Kaikki näytteet suspendoitiin uudelleen steriiliin PBS:ään seuraavina määrinä laskettuina siten, että varmistetaan homogeeninen tiitteri määrää kohden verrattuna lähtöaineena käytettyyn 16,7%:iseen (w/v) homogenaattiin: jauhetut aivot ml 2,0 aivohomogenaatti, 16,7 % w/v, laimentamaton raaka-aine 1 ml 5,4 laimentamaton raaka-aine 2 ml 9,7 laimentamaton valmis tuote ml 14,4 laimentamaton valmis steriili tuote ml 7,0 konsentroitu 20 kertaa

Biologisten/kliinisten testien tulokset on esitetty taulukossa 1.

19 97138 ) :10

« L 4J 4J

«ft Φ (O c «ft w <n ·- < CD ID O C *- >* *“ r; i: *2 c +- o v> * t-H CN CO vD · o V) β Φ < \ \ >- ^ JC ^ :a QC /«iri O 44 «- O O (0 44

m OO « β 3 V) M

< > JC > 10 -r*

00 _ C — E

·— *- c o :o O 10 IQ « ·*—> +» 4-» £ 4-» 44

_ <0 -S*. *- · :<G

ΊΤ .* «o o e e _ __ “ +»*->+>!«?, z p w o a jc u 44

Ui ►— Λ, *-» C 44 Φ :«o 4J

set* I ΰ n ο φ 4J ^ :<o *-* Ο X · ·»- Φ CE — -J -J CM <NJ ON 44 (ft +J w- I— J h IU I Ο Ο Φ M c 3 K h 1 rsi <^ s a w «o © e SUiOiI 3 i- JC 4J *- ►- => A O :#o e 3 4-» c —I i/> ►— O ^ Ο © O *- 44 rr φ 44 44 *-> :«0 a 4-> *— m

«p· Φ * « φ 4J

< JC C .— :<0 (0

H- JC C o !*0 C <X

" TJ> 'T tj< <N eo Τ' ° .b; .£ "ti 2 \ \ \ \ \ ζ S a S IS Ξ 3 - ooooo o « £ Ο ε Έ *j to η Φ c φ 4-> φ a > • Φ ^ 4t Φ ^ «CLIOC4J — 44 O 4-»«^· 4-» o co O O »“ 12 ^ *2 Έ 5

I rs»csicMfOfO τϊ — US S

N A m M N N N M -. ^ - m ® a * C ? μ. OOOOO O 2 ft ϋ e ° 3 5 42 N 5 ° >,§, 2 o 3 2 3 2 " Ξ S ° £J 4> +J :io ^- >M 3 O 4-> c <0 · jc *-> «ft L :« /S' ·*- :© «*- u

Pm < :« · E :io Φ :φ < £~ ro ο m r? ti !9 1i " :2

*2 V V V V V *— φ φ 4) 4> I K

< \ \ n \ \ g 4« «- 2 k OOOOO o .* :a «* e c S ·-* i- HQ E Φ JC €) S < φ - ^ Φ 4>

5¾ Λ «Λ B φ 4-* « L_ C

lj ui 4·· Φ Λ □ 5J .„ uo ** +- 4J t/> :© 5ζ Ο ω Φ «- >* ,- Γ] J* 2C «ft Φ !(0 * φ ΓΊ -r- 2 fsi ro 4T m ΙΟ 7 £ #- 5 t! «

M JJ > CM CM CM «Μ CM _ C >» C S Φ M

*JlT- 1 *u CM CM CM CM CM O 44 .»- «ft g

n C OOOOO CSJ *- »— «*- ® JC C

K ** « CM CM CM CM CM *— J(0 44 JC 3 ·*- Q S )1111 JC «ft 3 «0 C *- <1: 5 ^ «0* *ί* ηϊ* *0* Φ L C 8 >0C V N V V «ft 44 (Ο φ *- >1 β V) g :«

*4 JJ 44 44 JC

Jr <t> n ·-< co m <n — > a « " :8 p δ o .h o o o o - e +»”-isc t? C © *D Φ >H< Φ Φ Φ 3 44 44

«ft Φ *- <0 Φ C

«ft W «- 4J Φ f- jc o 44 :«0 ,., O 3 3 Jft) 4-4 *— π ö Ä r> 6 Ji η >ι Φ ttf* +- m r«. co ο ο — *-φ:φ ' . 2 CM CM „ ·> JC 44 ^c C 3 < CSJ CM CM CM CM CM M 4 4 A ^ 4 ts » OOOOOO fsj ®3>U^-i- H CM CM CM CM CM CM β )Z φ 1. ft W 2 1(1111 ^ Z»S®44 5 if 7 Tf TJ :<o · o ^ lj 5 -—to :β « Φ Γί* Φ3«α·^«στ3 O -M ji m +J c 0 *r „—*·** »- ** ·»- 2 cvjiaocp·^ W *2 'J' ’V ro ro tj· -H ^ i£o^*^e5 2 S s. \ \ \ X \ ° . ^ ® tl gS rr^rororso ^ c “S *** 5 5 cotftcoa v' «ft «*» :«o io jc m uo 44 44 40 44 * (0

- 44 ^-> *— ^- «0 JC

ω I · a · B

α n H CM CM CM CM CM CM

< OOOOOO »—»JC «r-> C 3 .(0 sQ J ScmSSScm :φ jc c ^ ,55 11(1(1 CM «ft i- « 44 -r- φ

m S m 04 (O «9 C JC JC

^ fS<C3 rj> ΤΓ TT rr -<τ MC CCOM£« /*v c o β ® ό β ε si JL (Ο ΐζ » 1- O ·; ·Π !Λ 5 m e S ^ *? *"> β t;

Pm 3 . in 3 0 « « Γϊ z *j *3 rSBacee-r- Γί oj z T- C H ^.>ey»iec M I I I I φ , — T5 to H *“ Τ3 >. Σ e'-rMrowulvOf'COOv M D « >1·· 3 f *T5 .¾ Ä , ^ I 1 il 1 1 1 t ( p a .* ® o — ·— 51* 2 < ΟβΟΟΟΟΟΟΟΟΟ P h >1 > »1 * J< 20 97138

Ylimääräiset arvioinnit:

Kutkatautiproteiinin PrP määritys suoritettiin polyklonaali-silla vasta-aineilla, jotka olivat spesifisiä puhdistetun proteiinin suhteen, joka vastasi hiiren aivoista peräisin olevaa proteiinia, ja jotka ristireagoivat naudan kutkatau-ti-PrP:n kanssa. Määritykseen käytettiin Western Blot-mene-telmää. Kutkatauti-PrP:n läsnäolo arvioitiin vertaamalla erilaisia molekyylipainoja omaavien proteiinien standardeihin.

MBP-proteiinin määritys suoritettiin polyklonaalisilla vasta-aineilla, jotka olivat spesifisiä puhdistetulle proteiinille, joka vastasi naudan aivokudoksesta saatua proteiinia. Määritykseen käytettiin Western Blot-menetelmää. MBP:n läsnäolo arvioitiin vertaamalla erilaisia molekyylipainoja omaavien proteiinien standardiin.

Naudan genomisen DNA:n määritys suoritettiin DOT BLOT-tekniikalla näytteistä, jotka oli otettu käsittelyn eri vaiheissa alan ammattihenkilön tunteman menetelmän mukaisesti. Jotta näyte olisi pätevä, täplien läsnäoloa ei tulisi ottaa huomioon heterologisen DNA:n saostumissa. Radioautografiällä tutkituissa näytteissä esiintyvien täplien puuttuminen osoittaa naudan genomisen DNA:n puuttumisen.

Kuvio 2 esittää tulokset, jotka on määritetty näytteiden im-• munokemiallisella analyysillä anti-PrP27_3o-vasta-aineilla, jotka näytteet on otettu gangliosidin valmistus- ja puhdistusprosessin jossakin välivaiheessa. Analysoitujen näytteiden numerokoodit vastaavat kuvion 1 puhdistuskaaviossa suluissa esitettyjä numeroita:

Kaista 1: koodin 1 näyte Kaista 2: koodin 2 näyte Kaista 3: koodin 3 näyte Kaista 4: koodin 4 näyte Kaista 5: koodin 5 näyte Kaista 6: valmis tuote 21 97138

Kaista 7: proteiini, jolla on standardimolekyylipaino (alaspäin kd:t ovat seuraavat: 97,4, 66,2, 45,0, 31,0, 21,5).

Tähdellä merkityt kaistat koskevat ei-spesifisiä ristireak-tioita, jotka johtuvat analyysin laajennusjärjestelmästä.

Kuvio 3 esittää naudan genomisen DNA:n analyysiä DOT BLOT-tekniikalla näytteissä, jotka on otettu menetelmän eri vaiheista.

Kirjainten leikkaus numeroiden kanssa osoittaa:

Standardlkäyrät 1A-7A naudan DNA (1 mg) 1B-7B naudan DNA (1 ng) 1C-7C naudan DNA (100 pg) 1D-7D naudan DNA (10 pg) 1E-7E naudan DNA (1 pg) 1F-7F naudan DNA (0 pg)

Tutkitut näytteet 2A-2F koodin 1 näyte 2B koodin 2 näyte 2C koodin 3 näyte 2D koodin 5 näyte 2E koodin 6 näyte 3A raaka 3-näyte 3B valmis tuote 3C valmis, steriloitu tuote

Standardikäyrän pisteet ja analysoidut näytteet on esitetty kahtena kappaleena.

Kuvio 4 esittää valmistus- ja puhdistusprosessin joidenkin välivaiheiden näytteiden immunokemiallisen analyysin tuloksia anti-MBP-vasta-aineilla. Näytteiden koodi vastaa kuvion 1 puhdistuskaaviossa esitettyjä numeroita.

Kaista 1: koodin 1 näyte

Kaista 2: koodin 2 näyte „ 97158 22

Kaista 3: koodin 3 näyte

Kaista 4: koodin 4 näyte

Kaista 5: koodin 5 näyte (raaka-aine 1)

Kaista 6: raaka 2-näyte

Kaista 7: koodin 6 näyte

Kaista 8: raaka koodin 3 näyte

Kaista 9: valmis tuote

Kaista 10: valmis, steriloitu tuote Käytetyillä polyklonaalisilla vasta-aineilla tunnistetut MBP:n erilaiset muodot on esitetty suluissa.

Kuvio 5 esittää piihappogeelikromatografian tulokset seuraa-vista näytteistä (samoin kuviossa l esitetyn menetelmän mukaisesti ):

Kaista 1: valmis, steriloitu tuote Kaista 2: valmis tuote

Kaista 3: trisialogangliosidin GTib standardi Kaista 4: disialogangliosidin GDib standardi Kaista 5: disialogangliosidin GDia standardi Kaista 6: monosialogangliosidin GM^ standardi

Kuvio 6 esittää esimerkkivalokuvaa keksinnön mukaisesti valmistetun gangliosidiseoksen biologisesta aktiivisuudesta (nuolet osoittavat versomista) perifeerisessä hermossa.

Kuvio 7 esittää näytteiden immunokemiallisen analyysin tuloksia anti-PrP27_3o-vasta-aineilla, jotka näytteet on otettu gangliosidin puhdistus- ja valmistusprosessien joistakin välivaiheista. Analysoitujen näytteiden koodi vastaa kuvion 1 puhdistuskaaviossa esitettyjä numeroita.

Kaista 1: raaka-aineen 1 liuos, johon on lisätty 1,5 mikro-grammaa/ml PrP27-30;tä Kaista 2: raaka-aineen 2 koodinäyte Kaista 3: koodin 6 näyte Kaista 4: raaka-aineen 3 koodinäyte Kaista 5: valmis tuote Kaista 6: valmis, steriloitu tuote 23 97138

Esimerkki 2

Selkeytetyn homoqenaatln valmistus Infektoiduista aivoista

Neljän hamsterin aivot, jotka oli infektoitu 263 K kutkatau-tikannalla ja vastasivat 3,9 g:n nettopainoa, homogenoitiin 10 ml:ssa tislattua vettä. Määrä saatettiin sitten 15,5 ml:aan 25%:isen (w/v) homogenaatin aikaansaamiseksi. Suspensiota sentrifugoitiin 40 minuutin ajan 1800 x g:ssä 4*C:ssa: 7,5 ml supernatanttia otettiin talteen, jaettiin määräeriin ja pidettiin -70*C:ssa käyttöön asti.

Näytteiden valmistus 5 ml infektoitua homogenaattia, 120 ml metanoii/metyleeni-kloridia ja 0,71 ml 5,7 N natriumhydroksidia lisättiin 10 g:aan naudan aivojen asetonijauheeseen. Tämä lisäys suoritettiin vesifaasin koko määrän pitämiseksi liuottimessa vakiona ja sopivimpien toimintaolosuhteiden aikaansaamiseksi. Lähtöliuoksen lopullinen tiitteri oli 1 % w/v. Suspensiota sekoitettiin magneettisesti 3 tunnin ajan 33eC:n lämpötilassa. Sitten se jäähdytettiin ja sitä sentrifugoitiin 20 minuutin ajan 6000 x g:ssä 10*C:ssa. Nestefaasi suodatettiin Gooch-suppilon läpi (huokoskoko n:o 3) +4eC:n lämpötilassa liuottimien haihtumisen välttämiseksi. Tämän vaiheen lopussa otettiin talteen 78 ml nestefaasia. 2 ml:n määräerä säilytettiin biologisia analyysejä varten. Molempiin määräeriin lisättiin sopiva määrä kalsiumkloridia ja asetonia, sekoi-\ tettiin magneettisesti n. 30 minuutin ajan huoneen lämpöti lassa ja sitten näytteitä sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 6000 x g:ssä 10eC:ssa. Sakka (raaka-aine 1) kuivatettiin kuvussa yön aikana ja sitten 2 tunnin ajan suurtyhjössä. yksi määräerä pidettiin -70eC:ssa biologista analyysiä varten.

925 mg raaka-ainetta 1, joka oli otettu talteen reaktioas-tiasta, suspendoitiin uudelleen 18,5 ml:aan kloroformin, me-tanolin ja veden seosta ja 0,74 ml:aan homogenaattia, jotta tiitteriksi saatiin 1 % w/v. pH säädettiin suunnilleen arvoon 12 (analysoitu lakmuspaperilla) lisäämällä 5N NaOH:ta 24 97138 ja seosta sekoitettiin magneettisesti 40*C:ssa 6 tunnin ajan. Jäähdytettiin huoneen lämpötilaan ja sitten liuos neutraloitiin 6N HCl:llä ja 250 μ1:η määräerä varattiin biologista analyysiä varten.

Molemmat määräerät käsiteltiin sopivalla määrällä n-butano-lin, kloroformin ja veden seosta, sekoitettiin 15 minuutin ajan ja sitten annettiin seistä 4 tunnin ajan. Lopuksi alemmat orgaaniset faasit heitettiin pois. Jäljelle jääviin ve-sifaaseihin lisättiin natriumkloridia ja asetonia, sekoitettiin magneettisesti huoneen lämpötilassa n. 30 minuutin ajan ja sitten niitä sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 6000 x g:ssä 15eC:ssa (raaka-aine 3).

Tämä tuote kuivattiin suurtyhjössä ja määräerä, joka laitettiin sivuun biologista analyysiä varten, säilytettiin -70®C:ssa. Jäljelle jäävä materiaali suspendoitiin uudelleen 6,5 ml:aan absoluuttista metanolia ja pidettiin 50eC:ssa 2 tunnin ajan ja sekoitettiin silloin tällöin. Suspensio sentrifugoitiin nopeasti 6000 x g:ssä ja supernatantti laitettiin pakastimeen -20eC:ssa 2 tunnin ajaksi. Kylmää, valkoista, opalisoivaa liuosta sentrifugoitiin 0°C:ssa 6000 x g:ssä 5 minuutin ajan ja sakka kuivattiin suurtyhjössä. Saanto oli tässä kohdassa 6 mg tuotetta. Tämä suspendoitiin sitten uudelleen 500 ul:aan natriumhydroksidia, 460 yl:aan tislattua vettä ja 40 yl:aan homogenaattia ja annettiin olla kosketuk-; sissa tämän liuoksen kanssa tunnin ajan huoneen lämpötilas sa. Lopuksi suspension pH säädettiin suunnilleen arvoon 9 (analysoitu lakmuspaperilla) ja dialysoitiin kalvolla, jonka molekyylipainosulku oli 10 kd, 4 tunnin ajan tislatun veden 20000 määrää vastaan. Lopullinen määrä dialyysin jälkeen oli 980 μΐ. Se jaettiin kahteen määräerään, 500 μΐ ja vast. 480 μΐ. Ensimmäiseen erään lisättiin tarvittu määrä natriumkloridia ja asetonia ja sitä sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 6000 x g:ssä 5eC:ssa. Tämä näyte kuivattiin suurtyhjössä (lopullinen tuote).

Toiseen määräerään lisättiin 20 μΐ homogenaattia ja 50 μΐ PBS:ää lOx ja se steriloitiin l21*C:ssa 30 minuutin ajan 25 97138 (lopullinen, steriloitu tuote).

Menetelmän arviointi

Kuten yllä esimerkissä 1 esitettiin, näytteet, jotka oli otettu menetelmän eri vaiheissa, testattiin epäpuhtauksien potentiaalisen läsnäolon suhteen.

Testatut näytteet ja tulokset ovat seuraavat:

Kaikki näytteet otettiin steriiliin PBSrään seuraavina määrinä, siten laskettuina, että varmistettiin homogeeninen tiitteri määrää kohden verrattuna lähtöaineena käytettyyn l%:iseen homogenaattiin (w/v): aivohomogenaatti laimentamaton susp.

25 % w/v laimennettu 1 %:iin raaka-aine 1 ml 3,2 laimentamaton raaka-aine 2 ml 1,0 laimentamaton valmis tuote ml 0,5 laimentamaton valmis, steriloitu ml 0,5 laimentamaton tuote

Taulukossa 2 on esitetty biologisesta analyysistä saadut tulokset. 1 · 26 97138 I t I ^ vt «•-0 3*-:© ® 3 *- v> <j £ > * *- ί 'Γ'ΤΜίΝΓΟη *>-»-cc«- 5 - >5£ 8: 2 t Tr m o o o _ *j ^ ^

» ^ β β ^ O

< > *1 ^ f :«

(/) *“ 3 >» 4J

— C 4-» C +* l* ο © 4-» *- c «-*-©«*·· «^ >»

10 M 4i 4J w> M

^ M v M

3 β Ο Φ :« Z O 3 L. +J 4-»

Ui D eo Oi © *- cvj <*> —, *-> E 3 © <* 2 Η Λ \D N N N N “ o Ο Φ M w

M M (Si · 4i 4J »5 V» E

_j O oooooo 4-i +J c — :o J J N N N N N N O O ^ ^ ο ΐ

See llllll *- e o © :©

111 — ;© O J* * E

_I >— HI 'T ^ ^ Φ 4i C >t CO I— © 3 ,* O :<0 -*j © +* +* *-j L. +* 5 «*- -M O :« ·- £ ·- i 5 -* m :g n

< CiTCvVV £ * g. « !2 C C

- es o o o o o ~ e - * 1 i I

(/) *“> «^ 4^ _ 3 «— v) C :© © • O ^ Φ F— 4-» 10 >i -L» © © •Μ 10 V) c ^

Hrg m t* m O r- J2 ^ ΓΞ 2 *tf so so so so so in ^ *io .io w 3 - I ^ ^ ^ ^ O 4J «- 4-> .* P 3 OOOOOO ^ 3 Ή © 4->

Z O. Ui cj fu fn n <s< n f\J (O +J

s cl. h- llllll 4J · E :<0 Ο β π O Q V ^ ^ v e ♦> so so w > O -J 3 ^ .K φ +J +> O *- M I— -M 6 +> +» — n 3 ¥· :<o f- i o > ^ E «) <o a

Pj < i« Φ *1 * £ "“ uf ►— CO CO CN CO CO Γ0 r* >n io « ^ «-* \ \ \ \ \ V F- Φ ^ T Φ k.

N N N > V J/ 0 _ Oj . Jj Z 2 OOOOOO o .* Φ .— >> © o W*4 ·* L C »0 ΙΛ «π < © >» e C a to E *-> — * -

H 0> to SIO «I © ^ L

Z O UI ^ m a io :io E %s X *» «·- « « l :io

M “ m SO fs. 00 O' O »— ** Vf 1» L (O E

H TT < m tn m m so so c © © to i ** » v v ^ tt rr 1» ji to c

Me < n oooooo rsi ^- :© 4-» · φ

S/ ^ V N N N N N eg N r- > 3 . +i 4J

** n < llllll .X «- .* © Φ C

o I ^ ^ ^ ^ ^

Zz t- >1 C © «·- 3 f- O JJ 4> φ ® Ό C Φ , . * f— CO ^ CO M en Vi ^ 10 O ui M<0 M \ v \ v. s. v — » J< O 4J E 3 £ = 2 OOOOOO Ϊ3 S 1 3 :« « £

xw< © .* 4J Φ E

^ (/) V) «I (0 ^ (O

M w 3 > Λ6 5© -d* ·*“ I— ·«- L. &.

• S Ο ^ φ 4J :iq «35 ui *-> · O E © :© z © *- cm co m © φ e ^ nh m m m m m m __ «310:10 4-»

< TT «e TT Τί ΤΓ ΤΓ 4-i ^ 4J C

Z I OOOOOO rM Φ 4-> +> V> >» Φ

S <·-· CSJ^CNICSICNIINI tN E 3 O -r- :io -M

m 2 llllll *- Q. *-> C C C

HS Φ 4-> f- L. .— fO C Φ .* Φ Φ X *· O w U < M «*· C IQ 3 *J £ -r· v m o cn oj £ - « ™ IS ™ ^ O < Nn.X'v.'s'v ^ — +j *j 0 H 2 ΤΓ ^ <N Ο Ο Ο Ξ Si Si PQ < c β φ «/» ·- e n »5 ^ '-l >>. « c *-· JC i: Ji T- *» 1- » >» 0 ^ β λ ta +> «-» <0 Λ _ O-inusr^ooo' >L ti ^ « ti ssssss «siipi 5*5 M N N N <M (SI ’5 w Λ ® Ik 2 K> 2 ...... <s J2 5 °,_ g 5

(n, ^ < 0 -^r rr -c 't tt ·σ " § c « gS

C > φ (0 «*» 4-»

Oc · *- Ό W ^ 3 O ^ · a h w ^ 1/ ’g 5 ·* .* Φ «- :<o SÖS 2 3 1-^-»^-, *-5 2 fi □ e o o o Φ •~i ... 5 ti n*-v»4J©*->^< 1 1 UJ Z C pH a) m £s t ©'-rsjo-i^. m sO r-« 00 O' Pm «M O C « L.

..M >1 5 ε I « 1 1 1 I 1 I I H 3«-O*-<0©

• * < S 5 *5000000000 <| h Φ Ji VI VI S

J .j M rH «Ή #—I f—H »—I #-H r—( «Η 27 97138

Esimerkki 3

Ganqliosidiseoksen biologinen aktiivisuus

Suoritettiin useita kokeita in vitro sen osoittamiseksi, oliko gangliosidiseoksella (valmistettu edellä esitetyn menetelmän mukaisesti) mitään biologista aktiivisuutta, joka ennustaisi sen terapeuttisesta soveltumisesta perifeerisen hermoston (PNS) ja keskushermoston (CNS) patologioiden hoitamiseksi. Etenkin gangliosidien aktiivisuus testattiin in vitro neuriittien muodostumisen arvioimiseksi neuroblastoo-masolujen (N2A) viljelmissä. Nämä solut, kuten on esitetty kirjallisuudessa (Denis - Donini et ai., Neuronal Development, osa II, 323:348 - Academic Press, NY 1980; Leon et ai., Dev. Neurosci. 5:108, 1982) voivat indusoida määrätyissä olosuhteissa täysin kehittyneille neuroneille ominaisten erilaisten toimintojen ekspression mahdollistaen siten biokemiallisten parametrien kvalitatiivisen ja kvantitatiivisen analyysin, jotka on korreloitu kehityksen jokaiseen vaiheeseen.

Siten tässä mallissa suoritetut arvioinnit (% soluista, joissa on neuriittien muodostumista, neuriittipituus ja suhteellinen haaroittuminen) ovat päteviä instrumentteja tutkittaessa lääkeaineen mahdollista terapeuttista käyttöä hermoston toiminnallisessa palauttamisessa.

Materiaalit 1a menetelmät • —1,1

Soluviljelyt

Hiiren C 1300-solut, klooni N2A, jotka toimitti America Cell Type Collection (Bethesda, Maryland), päällystettiin 10.000 solun konsentraatiossa syvennystä kohden (24-castor ) Dul-beccon modifioidun Eagle-alustan (DMEM) läsnäollessa, joka sisälsi P/G:tä (100 yksikköä penisilliiniä/ml) ja 10 % fe-taalista vasikan seerumia (FCS, Seromed, erä 4-C04).

Seuraavana päivänä viljelyalusta vaihdettiin samaan määrään tuoretta alustaa, joka sisälsi gangliosidejä (ks. myöhemmin). Viljelmiä pidettiin 37eC:ssa 5%:isessa CC^issa kostu- 28 97138 tetussa atmosfäärissä (Haerus-inkubaattori). Viljelmät kiinnitettiin sitten 2%:isella glutaraldehydillä määrättynä aikana (24 tuntia myöhemmin).

Tuotteen testilluosten valmistus

Gangliosidiseos (3 erilaista erää, n:o 1, 2, 3) liuotettiin kloroformin ja metanolin 2:1-seokseen, kuivatettiin typpi-virrassa, suspendoitiin uudelleen seokseen DMEM + P/G + 10%:nen FCS, kunnes saatiin aikaan halutut konsentraatiot.

Tutkitut konsentraatiot: 1 x 10-4 M, 5 x 10“5 M ja 1 x 10-5 M.

Suoritettiin neljä erilaista koetta seuraavasti: - 3 koetta gangliosidiseoksen (erät n:o 1 ja 2) vaikutuksen analysoimiseksi 1 x 10"4 M-konsentraatiossa, - 1 koe tutkittavan gangliosidiseoksen (erä n:o 3) eri kon-sentraatioiden (l x 10-4, 5 x 10-5 ja l x 10“5 M) annosta vastaavan vaikutuksen analysoimiseksi.

Menetelmä

Alusta poistettiin syvennyksistä ja korvattiin 350 yl:lla DMEM + P/G + 10%:nen PCS ± tutkittava tuote (edellä mainituissa konsentraatioissa).

. Kontrolliviljelmät käsiteltiin samalla tavalla lisäämättä gangliosidiseosta. Viljelmiä pidettiin sitten inkubaattoris-sa 24 tunnin ajan, minkä jälkeen solut kiinnitettiin 2%:isella glutaraldehydillä ja niitä tutkittiin mikroskoopilla.

Parametrit

Morfologinen tutkimus suoritettiin - neuriitteja sisältävien solujen prosenttimäärän (%) ja - neuriittien pituuden ja suhteellisen haarautumisen analysoimiseksi.

<1 i Stt = i MU I I i SI

29 97138

Tulokset

Kuten taulukossa 3 on esitetty, on selvää, että tutkittavat tuotteet ovat tehokkaita (1 x 10"4 M) neuriittien muodostumisen indusoimiseksi N2A-soluissa.

Gangliosidiseoksen vaikutus on annoksesta riippuvainen maksimaalisen tehokkuuden ollessa annoksessa 1 x 10“4 M (taulukko 4).

Taulukko 3

Gangliosidiseoksen (erät 1, 2) vaikutus neuriittien muodostumiseen hiiren neuroblastooma-N2A-soluissa

Kaikki tuotteet lisättiin soluihin 1 x 10-4 M:n lopullisessa konsentraatiossa, morfologiset arvioinnit suoritettiin 24 tunnin kuluttua.

% neuriitteja sisältäviä soluja Tuote_1. koe_2. koe_3. koe_ kontrolli 2 ± 1 l±l 2±2 GA (1) 29 ± 6 27 ± 6 24 ± 5 GA (2) 25 ± 4 25 ± 2 25 ± 5 (erä n:o suluissa) • « 30 97138

Taulukko 4

Gangliosidiseoksen (erä n:o 3) eri konsentraatioiden vaikutus neuriittien muodostumiseen hiiren neuroblastooma-N2A-so-luissa, annoksesta riippuvainen vaikutus.

Tuote_Konsentraatio % neuriitte~)a sisältäviä soluja kontrolli 3 ± 2 GA (3) 1 X 1(T4 35 ± 6 GA (3) 5 X 10“5 17 ± 5 GA (3) 1 x 10-5 4 ± 2 (erä n:o suluissa)

Biologisen in vitro-aktiivisuuden arvojen statistinen arviointi osoittaa, että ei ole mitään merkitsevää eroa gangliosidiseoksen eri erien välillä (taulukko 5).

< £ 50,000 c U) w 40,000..

> ^ 30,000..

w _ w - — m — w 20,000..

<

K

^ 10,000..

M

Ki _ g oooo]__i_____ z o» C 12

• NÄYTE

Taulukko 5

Erillä 1 ja 2 saatujen arvojen statistinen kokonaisarviointi. Esitetyt arvot ovat 9 itsenäisen testin keskiarvoja ± S.D.

31 97138

Lisäksi neurilttien morfologinen arviointi osoittaa, että gangliosidiseoksella käsitellyt solut muodostavat pitkiä, merkittävästi haarautuneita neuriitteja (s.o. huomattavaa haarautumista).

Johtopäätökset

Edellä esitetyt havainnot vahvistavat siten, että tutkittavalla gangliosidiseoksella on biologinen aktiivisuus, itse asiassa tuote, joka saadaan menetelmällä, joka takaa sen erityiset ominaisuudet, voi indusoida neurilttien muodostumisen N2A-soluissa. Tämä seikka osoittaa, että tuote korjaa tehokkaasti perifeerisen ja keskushermoston ilmiöitä. Gang-liosidien seosta, joka saadaan edellä esitetyllä tavalla ja joka on vapaa potentiaalisesti vaarallisiin ei-tavanomaisiin viruksiin liittyvistä epäpuhtauksista, voidaan käyttää myös yksittäisten komponenttien tai gangliosidiseoksen, kuten mo-nosialogangliosidin GMi valmistamiseksi.

Yllä esitettyjen farmakologisten ominaisuuksien suhteen gangliosidiseosta voidaan käyttää yleensä lääkeaineena useissa sekä perifeerisen että keskushermoston patologioissa (joissa on erilaisia etiopatogeenisiä syitä). Erityisiä tiloja, joita voidaan hoitaa, ovat: silmämunantäkäinen näkö-hermotulehdus, silmän liikehermon paralyysi, trigeminaalinen neuralgia, kasvohermon paralyysi ja Bellin halvaus, Garcinin syndrooma, radikuliitti (hermojuuren tulehdus), perifeeristen hermojen traumaattiset vammat, diabeettinen ja alkoholi-peräinen polyneuriitti, obstetrinen paralyysi, paralyyttinen lonkkahermotulehdus, liikehermosolujen sairaudet, amyotrofi-nen lateraalinen skleroosi, myelopatinen lihasatrofia, progressiivinen ydinjatkosparalyysi, halvausmainen lihasheikkous ja Lambert Eatonin syndrooma, lihasdystrofia, CNS:n ja « · PNS:n synaptisen hermosiirron huonontuminen, tajunnan puutokset, kuten sekavuus, tärähdys, tromboosi, aivoembolia, aivo- ja spinaalinen trauma.

Anto suoritetaan tavallisesti injektiolla, intramuskulaari-sesti, subkutaanisesti tai intravenoosisesti, tai transder- 32 9 7 1 38 maalisesti, pulmonaarisesti tai oraalisesti, edullisesti sopivasti puskuroiduissa vesiliuoksissa. Farmaseuttisen aineen turvallinen varastointi voidaan varmistaa valmistamalla se pienpullojen muodossa, jotka sisältävät tuotteen liuoksia, mahdollisesti yhdessä muiden apuaineiden kanssa, kuten on esitetty seuraavissa farmaseuttisten valmisteiden esimerkeissä. Terapeuttisesti tai mahdollisesti myös ennaltaehkäisevästi parenteraaliset annokset ovat 10 mg - 100 mg/päivä aktiivista ainetta.

Seuraavat tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen farmaseuttisten koostumusten esimerkit ovat pelkästään havainnollistavia eivätkä mitenkään rajoittavia.

Esimerkki 1 1 pienpullon koostumus:

Aktiivista aineosaa: - gangliosidejä natriumsuoloina 10,0 mg - monosialotetraheksosyyligangliosidiä (GM^) - disialotetraheksosyyligangliosidiä (GDia) - disialotetraheksosyyligangliosidiä (GD^b) - trisialotetraheksosyyligangliosidiä (GT^b)

Multa aineosia: - kaksiemäksistä natriumfosfaattia 12 H2O 6,0 mg - yksiemäksistä natriumfosfaattia 2 H2O 0,5 mg • - natriumkloridia 16,0 mg - vettä injektioon ad 2,0 ml

Esimerkki 2 1 pienpullon koostumus:

Aktiivista aineosaa: - gangliosidejä natriumsuoloina 20,0 mg - monosialotetraheksosyyligangliosidiä (GMi) - disialotetraheksosyyligangliosidiä (GDia) - disialotetraheksosyyligangliosidiä (GDib) - trisialotetraheksosyyligangliosidiä (GTib) 33 97138

Multa aineosia; - kaksiemäksistä natriumfosfaattia 12 H2O 6,0 mg - yksiemäksistä natriumfosfaattia 2 H2O 0,5 mg - natriumkloridia 16,0 mg - vettä injektioon ad 2,0 ml

Esimerkki 3 1 pienpullon koostumus:

Aktiivista aineosaa: - gangliosidejä natriumsuoloina 100,0 mg - monosialotetraheksosyyligangliosidiä (GMi) - disialotetraheksosyyligangliosidiä (GDia) - disialotetraheksosyyligangliosidiä (GD15) - trisialotetraheksosyyligangliosidiä (GTib)

Multa aineosia: - kaksiemäksistä natriumfosfaattia 12 H2O 12,0 mg - yksiemäksistä natriumfosfaattia 2 H2O 1,0 mg - natriumkloridia 32,0 mg - vettä injektioon ad 4,0 ml

Selitettyä keksintöä voidaan tietenkin muuntaa monin tavoin. Tällaisia muunnelmia ei tule pitää poikkeamina keksinnön hengestä ja puitteista ja kaikki tällaiset muunnelmat, kuten lienee selvää alan ammattihenkilölle, kuuluvat seuraavien patenttivaatimusten puitteisiin.

• · # ·

Claims (14)

1. 97138
2. 1. Menetelmä gangliosidien seoksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) gangliosidiä sisältävä kudos alistetaan lipidieliminoin-tiin asetonissa asetonisakan muodostamiseksi, b) asetonisakka suspendoidaan ensimmäiseen metyleeni-kloridin, metanolin ja natriumhydroksidin muodostamaan liuotinseokseen, joka pystyy erottamaan hydrofobiset aineet hydrofiilisistä aineista, c) erotusseos suodatetaan ensimmäisen nestefaasin muodostamiseksi , d) ensimmäinen nestefaasi alistetaan kalsiumkloridilla ja asetonilla suoritettavaan saostukseen ensimmäisen raaka-aineen muodostamiseksi, e) ensimmäinen raaka-aine tehdään liukenevaksi veden, kloroformin ja metanolin seoksella ja liukenevaksi tehtyä ensimmäistä raaka-ainetta kuumennetaan suunnilleen pH-ar-vossa 12, f) kuumennettu, liukenevaksi tehty ensimmäinen raaka-aine alistetaan toiseen erotukseen toisessa liuotinseoksessa, joka pystyy erottamaan hydrofobiset aineet hydrofiilisistä aineista, g) toinen erotusseos erotetaan orgaanisen faasin poistamiseksi ja vesifaasin säilyttämiseksi, h) vesifaasi alistetaan kalsiumkloridilla ja asetonilla suoritettavaan saostukseen toisen raaka-aineen muodostamiseksi, i) toinen raaka-aine kuumennetaan ja tehdään liukenevaksi metanolissa, joka jäähdytetään kolmannen raaka-aineen muodostamiseksi, j) kolmas raaka-aine tehdään liukenevaksi emäksessä, k) liukenevaksi tehty kolmas raaka-aine neutraloidaan, ja l) neutraloitu liukenevaksi tehty kolmas raaka-aine dia-lysoidaan sellaisen kalvon läpi, jonka molekyylipainosul-ku on 10 kd, gangliosidiseoksen valmistamiseksi.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 97138 siitä, että ensimmäistä liuotinseosta, joka sisältää ase-tonisakan, kuumennetaan noin 30 - 35 °C:ssa vähintään noin 3 tunnin ajan.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liukenevaksi tehtyä ensimmäistä raaka-ainetta kuumennetaan noin 38-43 °C:ssa noin 4-8 tunnin ajan.
5. 4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäisen raaka-aineen kuumentamisen jälkeen lisätään toinen liuotinseos, joka käsittää veden, kloroformin ja n-butanolin seoksen.
6. 5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kolmas raaka-aine tehdään liukenevaksi IN natriumhydroksidissa.
7. 6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että gangliosidiä sisältävä kudos on naudan aivokudosta.
8. 7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistettu gangliosidiseos kuivatetaan valmiin gangliosidiseostuotteen valmistamiseksi.
9. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmis gangliosidituote suspendoidaan puskuriin ja steriloidaan valmiin, steriloidun gangliosidiseostuotteen valmistamiseksi. 1 Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että e-vaiheessa kuumennetaan liukenevaksi tehtyä ensimmäistä raaka-ainetta suunnilleen pH-arvossa 12 n. 38 - 43 °C:n lämpötilassa vähintään n. 4 - 8 tunnin ajan, f-vaiheessa kuumennettu liukenevaksi tehty ensimmäinen raaka-aine erotetaan toisen kerran veden, n-butanolin ja kloro- 97138 formin seoksessa, ja 1-vaiheessa kolmas raaka-aine tehdään liukenevaksi natriumhy-droksidissa n. 1 tunnin kuluessa.
10. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kolmas raaka-aine tehdään liukenevaksi IN nat-riumhydroksidissa.
11. 11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että gangliosidiä sisältävä kudos on naudan aivokudosta.
12. 12. Jonkin patenttivaatimuksen 10 - 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistettu gangliosidiseos kuivatetaan valmiin gangliosidiseostuotteen valmistamiseksi.
13. 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että valmis gangliosidituote suspendoidaan puskuriin ja steriloidaan valmiin, steriloidun gangliosidiseostuotteen valmistamiseksi.
14. 14. Jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että edelleen erotetaan gangliosidiseos yksittäisiksi gangliosidikomponenteiksi. • 15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että gangliosidi GMX erotetaan gangliosi-diseoksesta. 97138 P&tentkrav: