EA010739B1 - Средство, нормализующее функции головного мозга, и способ его получения - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к лекарственному средству и способу его получения из органов животных, в частности к средству, нормализующему функции головного мозга, представляющему собой лекарственную форму для парентерального введения в виде раствора пептидного комплекса с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 72 до 250 Да, с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл, и способу его получения из головного мозга телят не старше 12-месячного возраста или свиней путем экстракции уксусной кислотой в присутствии хлористого цинка; предусматривающему повторное осаждение образовавшегося гомогенизированного осадка двукратными объемами ацетона не менее двух раз и последующее промывание на нутч-фильтре двукратными объемами ацетона; получение водного раствора экстракта в концентрации полипептидов 2,5-2,9 мг/мл; его центрифугирование, фильтрование, с последующей ультрафильтрационной очисткой на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/смчерез материалы с задерживающей способностью 15000 Да и добавлении в ультрафильтрат гликокола до конечной концентрации 10-20 мг/мл при рН 5,6-6,6; и последующую стерилизующую фильтрацию, ампулирование и автоклавирование в течение 8 мин при температуре 120°С и атмосферном давлении 1,1 кгс/см, что обеспечивает стабильность препарата при сохранении терапевтической эффективности.

Description

Группа изобретений относится к лекарственному средству и способу его получения из органов животных, в частности к выделению биологически активного вещества из головного мозга и получению лекарственной формы для парентерального введения, которая может использоваться в медицине как средство, нормализующее функции головного мозга.

Известны способы получения биологически активных веществ и лекарственных средств из животного сырья (патент РФ № 944191, 1994; а.с. 8И № 1112606, 1996; а.с. 8И № 1218521, 1994; а.с. 8И № 1227198, 1986; патент РФ № 1448443, 1994; патент РФ № 1522486, 1993; патент РФ № 2075944, 1997; патент РФ № 2161501, 2001; патент И8 № 4341765, патент СВ № 1161896, 1969; патент ГК № 2583982, 1987).

Известен способ получения препарата, обладающего восстанавливающей активностью при нарушении функции головного мозга (патент РФ № 1298979, 1993), который позволяет выделить из коры головного мозга убойных животных биологически активные полипептиды щелочной природы. Этот препарат получают путем обработки исходного сырья (ткань, содержащая серое вещество полушарий головного мозга) ацетоном при 1=-(10-4)°С и соотношении ткани мозга и ацетона 1:5 в течение 18-30 ч, гомогенизации, экстрагирования гомогената 2-4% раствором уксусной кислоты в течение 48-72 ч при рН 3,5-4,5 в присутствии хлористого цинка в концентрации 0,6-2 г/л и при соотношении гомогената и раствора уксусной кислоты 1:(8-4), центрифугирования, осаждения биологически активных веществ ацетоном при 1=-(3-5)°С и соотношении супернатанта и ацетона 1:(7-5), и ионообменной хроматографии полученного осадка на катионите Биокарб. В результате ионообменной хроматографии получают фракцию, содержащую преимущественно щелочные полипептиды с молекулярной массой от 2000 до 6000 Да.

Необходимо отметить, что способ, описанный в патенте РФ № 1298979, не позволяет извлечь из коры головного мозга кислые и нейтральные полипептиды, а также очистить получаемый продукт от примесей.

Известен способ получения из животного сырья комплекса биологически активных полипептидов, нормализующих функции головного мозга, фармакологическая композиция на его основе (патент РФ № 2104702, 1998), принятый в качестве прототипа предлагаемого средства и способа его получения. Известный способ состоит в том, что кору больших полушарий головного мозга убойных животных замораживают при 1=-40°С с последующим хранением при 1=-(20-22)°С. Сырье подвергают гомогенизации, экстракции гомогената раствором уксусной кислоты при 1=10-15°С в течение 30-48 ч 2-4% раствором уксусной кислоты при рН 3,2-3,8 в присутствии хлористого цинка в концентрации 0,6-1,2 г/л при соотношении гомогената и раствора уксусной кислоты 1:(8-4). Для отделения нерастворимых компонентов проводят фильтрацию. После фильтрации собирают жидкую фазу и обрабатывают ацетоном при 1=-(3-5)°С и при соотношении экстракта и ацетона 1:(7-5). При этом образуется осадок в виде белых хлопьев. Полученный осадок промывают ацетоном и высушивают под воздушной тягой. Полученный после осаждения и высушивания порошок дополнительно экстрагируют водой при рН 5,5-6,5 в течение часа при 1=18-22°С. Нерастворимые компоненты удаляют из экстракта путем центрифугирования. Полученный раствор препарата подвергают мембранной ультрафильтрации и лиофилизируют фильтрат. Целевой продукт представляет собой лиофилизированный порошок белого или белого с желтоватым оттенком цвета и содержит комплекс биологически активных кислых и нейтральных полипептидов с молекулярной массой от 500 до 15000 Да.

К недостаткам известного способа следует отнести извлечение в процессе экстракции из ткани коры больших полушарий головного мозга значительного количества (более 70%) веществ не пептидной природы, которые, являясь примесями, не определяют биологическую активность выделенного активного вещества, а также низкий выход активного вещества.

Настоящим изобретением поставлена и решена задача разработки способа получения средства, нормализующего функции головного мозга, в виде лекарственной формы для парентерального введения, выделенного из головного мозга телят не старше 12-месячного возраста или свиней, техническим результатом которого является оптимальная технология выделения пептидного комплекса с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 72 до 250 Да и получение водного раствора экстракта с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл, позволяющая не только очистить получаемый продукт от примесей, но и увеличить его выход.

Экспериментальная проверка показала, что предлагаемый способ обеспечивает фармацевтическую стабильность, максимальную биологическую ценность и терапевтическую эффективность средства, нормализующего функции головного мозга, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения, что подтверждено результатами экспериментов, приводимыми в примерах, иллюстрирующих изобретение.

Другим аспектом изобретения является средство, нормализующее функции головного мозга, в виде лекарственной формы для парентерального введения, представляющее собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 72 до 250 Да, с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл, технический

- 1 010739 результат которого заключается в том, что выделенное вещество отличается от известных веществ, полученных ранее из головного мозга животных по молекулярной массе входящих в него пептидных компонентов, а также по его нетоксичности и апирогенности за счет полной очистки от примесей.

В ходе исследований в экспериментах на животных выявлено, что полученный водный раствор средства с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл является терапевтически эффективной дозой, что позволяет считать показанным использование средства при различных видах патологии головного мозга. Это подтверждается приводимыми ниже примерами.

В процессе проведения исследований была установлена важность следующих стадий способа получения средства, нормализующего функции головного мозга, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения (далее - препарат):

повторное осаждение образовавшегося гомогенизированного осадка двукратными объемами ацетона не менее двух раз и последующее промывание на нутч-фильтре двукратными объемами ацетона до получения осадка светло-серого цвета, что свидетельствует о полной очистке осадка от примесей, таких как липидные, белковые, фосфолипидные и другие;

получение водного раствора экстракта в концентрации полипептидов 2,5-2,9 мг/мл; его центрифугирование, фильтрование, с последующей ультрафильтрационной очисткой на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см² через материалы с задерживающей способностью 15000 Да и добавлении в ультрафильтрат гликокола до конечной концентрации 10-20 мг/мл при рН 5,6-6,6;

стерилизующая фильтрация, ампулирование и автоклавирование в течение 8 мин при температуре 120°С и атмосферном давлении 1,1 кгс/см², что обеспечивает стабильность препарата при сохранении терапевтической эффективности.

Режим и время автоклавирования были установлены экспериментально.

Необходимо отметить, что предлагаемое средство, нормализующее функции головного мозга, отличается от известных биологически активных веществ, выделенных ранее из головного мозга животных, поскольку представляет собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 72 до 250 Да, выделенных из серого и белого вещества головного мозга, в то время как препарат, полученный способом, описанным в патенте РФ № 2104702, содержит в своем составе преимущественно кислые и нейтральные полипептиды с молекулярной массой от 500 до 15000 Да, выделенные из серого вещества головного мозга, а препарат, полученный способом, описанным в патенте РФ № 1298979, содержит в своем составе преимущественно щелочные полипептиды с молекулярной массой от 2000 до 6000 Да, выделенные из коры головного мозга.

Указанный технический результат достигается тем, что средство, нормализующее функции головного мозга, выполнено в виде лекарственной формы для парентерального введения и представляет собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 72 до 250 Да, с концентрацией полипептидов 2,52,9 мг/мл и получено из головного мозга телят не старше 12-месячного возраста или свиней путем экстракции уксусной кислотой в присутствии хлористого цинка.

Указанный технический результат достигается также тем, что предлагаемый способ получения средства, нормализующего функции головного мозга, характеризуется тем, что головной мозг телят не старше 12-месячного возраста или свиней замораживают при температуре не менее минус 40°С, выдерживают при температуре минус (20-22)°С в течение не менее 2 месяцев, затем измельчают, добавляют 3% раствор уксусной кислоты в объемном соотношении 1:5 при температуре 20±5°С, экстракцию проводят при постоянном перемешивании, после получения однородной взвеси в нее добавляют 1% раствор хлористого цинка в объемном соотношении 50:1, охлаждают при постоянном перемешивании до температуры 7-16°С, затем перемешивают по 1 ч через каждые 4 ч отстаивания в течение 48 ч, экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием, к экстракту добавляют ацетон в объемном соотношении 1:5, выдерживают при температуре 3-5°С в течение 4 ч, образовавшийся гомогенизированный осадок повторно осаждают ацетоном не менее 2 раз, затем осадок, содержащий активное вещество, промывают на нутч-фильтре двукратными объемами охлажденного до температуры 7-16°С ацетона до получения осадка светло-серого цвета, протирают через металлическое сито, высушивают, растворяют в дистиллированной воде при комнатной температуре и постоянном перемешивании до концентрации полипептидов 2,5-2,9 мг/мл, раствор центрифугируют, фильтруют, подвергают ультрафильтрационной очистке на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см² через материалы с задерживающей способностью 15000 Да, в ультрафильтрат добавляют гликокол до его конечной концентрации 10-20 мг/мл при рН 5,66,6, раствор подвергают стерилизующей фильтрации под давлением не более 2,0 кгс/см², разливают в ампулы по 2 мл и автоклавируют в течение 8 мин при температуре 120°С и атмосферном давлении 1,1 кгс/см².

Сущность изобретения поясняется таблицами и фигурой.

На фигуре изображено влияние препарата на развитие эксплантатов головного мозга.

В табл. 1 показано влияние препарата на морфологические и биохимические показатели перифери

- 2 010739 ческой крови морских свинок при изучении токсичности.

В табл. 2 показано влияние препарата на показатели выполнения больными корректурной пробы.

В табл. 3 показано влияние препарата на изменение альфа-индекса ЭЭГ у больных сосудистой энцефалопатией.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами: пример 1 - способ получения препарата; примеры 2 и 3, подтверждающие активность препарата; пример 4 - изучение токсичности препарата; пример 5, подтверждающий терапевтическую эффективность препарата, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения, содержащей терапевтически эффективную дозу пептидного комплекса.

Пример 1. Способ получения препарата.

В качестве сырья используется головной мозг телят (не старше 12-месячного возраста) или свиней, который замораживают при температуре не менее минус 40°С и выдерживают при температуре минус (20-22)°С в течение не менее двух месяцев.

В реактор для экстракции перекачивают 350 л 3% раствора уксусной кислоты и охлаждают до температуры 20±5°С, затем в реактор при постоянном перемешивании загружают 70 кг измельченного до получения гомогенной массы сырья. Экстракцию проводят при постоянном перемешивании, после получения однородной взвеси добавляют в нее 1% раствор хлористого цинка в объемном соотношении 50:1, охлаждают при постоянном перемешивании до температуры плюс (7-16)°С, затем перемешивают по 1 ч через каждые 4 ч отстаивания в течение 48 ч.

Экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием при 5000±500 об/мин в течение 1 ч. К экстракту добавляют ацетон в объемном соотношении 1:5. Выдерживают при температуре плюс (3-5)°С в течение 4 ч. Образовавшийся осадок гомогенизируют и повторно осаждают ацетоном не менее двух раз. Затем осадок, содержащий активное вещество, промывают на нутч-фильтре двукратными объемами охлажденного до температуры 7-16°С ацетона до получения осадка светло-серого цвета. Промытый осадок протирают через металлическое сито, выкладывают тонким слоем в эмалированные кюветы, закрывают двойным слоем ткани хлопчатобумажной и высушивают при периодическом помешивании в вытяжном шкафу до полного удаления запаха ацетона.

Выход активного вещества (порошка биологически активного пептидного комплекса, выделенного из головного мозга) составляет 50 г на 1 кг исходного сырья.

Полученный порошок растворяют в дистиллированной воде при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 40 мин до концентрации пептидов 2,5-2,9 мг/мл. Полученный раствор центрифугируют при 3000±200 об/мин в течение 20±5 мин. Центрифугат фильтруют через фильтр типа АР-15 или аналогичный.

Фильтрат подвергают ультрафильтрационной очистке на установке для ультрафильтрации при противодавлении не более 1,0 кгс/см² через материалы с задерживающей способностью 15000 Да.

В ультрафильтрат добавляют расчетную навеску гликокола, до его конечной концентрации 10-20 мг/мл, перемешивают до полного растворения гликокола при сохранении рН 5,6-6,6.

Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, которую проводят под давлением, не превышающим 2,0 кгс/см².

Полученный раствор разливают в ампулы по 2,0 мл и автоклавируют, причем ампулы с препаратом подвергают стерилизации в течение 8 мин при температуре 120°С и атмосферном давлении не более 1,1 кгс/см².

Препарат представляет собой бесцветный, прозрачный раствор и содержит пептидный комплекс с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл.

Тестирование на отсутствие высокомолекулярных белковых компонентов осуществляют путем добавления к содержимому 1 ампулы препарата 1 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Прозрачность раствора свидетельствует об отсутствии высокомолекулярных белковых компонентов.

Для определения в препарате пептидных связей к его раствору добавляют биуретовый реактив. Окрашивание раствора в фиолетовый цвет свидетельствует об имеющихся в препарате пептидных связях.

С целью определения в препарате полипептидов и их фракций используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле.

Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 250 до 350 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 270-5 нм.

Молекулярную массу полипептидов, входящих в препарат, определяют следующими методами: методом гель-хроматографии на сефадексах С-25 и С-50 («Рйагшааа», Швеция). Для калибровки колонки 1,6x60 см используют Рсрббс Мо1есиаг \Уеф111 Κίΐ Μδ III («§егуа», Германия);

методом масс-спектрометрии. Спектры получают на времяпролетном масс-спектрометре Уоуадег ΌΕ Вюкресйошейу с лазерной десорбцией и ионизацией с помощью матрицы (ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ) при относительной интенсивности азотного лазера 2300-2400, ускоряющем напряжении 25000 В, времени задержки 90 нс и давлении в вакуумной камере 2,6х 10⁶ тор;

- 3 010739 методом электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков.

Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят полипептиды с молекулярной массой от 72 до 250 Да.

С помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте ацетонитрила (сорбент «Ь1сйго80гЬ С18», колонка 2x62 мм), установлено, что в состав препарата входят преимущественно низкомолекулярные фракции - от 70 до 90%, а высокомолекулярные компоненты в препарате отсутствуют.

Пирогенность препарата определяют на кроликах общепринятым методом (ГФ XI, вып.2, с. 183) при тест-дозе препарата 0,25 мг на 1 кг массы животного в 1,0 мл изотонического 0,9% раствора натрия хлорида для инъекций. Показано, что препарат является апирогенным.

Таким образом, вышеизложенным способом получен препарат - лекарственная форма для парентерального введения, представляющая собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90%, с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 72 до 250 Да, с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл.

Пример 2. Влияние препарата на развитие эксплантатов головного мозга.

Эксперименты проведены на 65 фрагментах коры головного мозга и 48 фрагментах спинномозговых ганглиев 10-11-суточных эмбрионов цыпленка.

Питательная среда для культивирования эксплантатов состояла из 35% раствора Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, 35% раствора Хенкса, 5% куриного эмбрионального экстракта, в среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед./мл), пенициллин (100 ед./мл), глютамин (2мМ). Фрагменты коры головного мозга или спинно-мозговых ганглиев помещали в эту среду и культивировали на коллагеновой подложке в чашках Петри, в термостате при температуре 36,7°С в течение 2 суток. В экспериментальную среду добавляли исследуемый препарат и церебролизин (положительный контроль) в концентрациях 0,5, 1, 2, 20, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 нг/мл. Критерием биологической активности служил индекс площади (ИП) - соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной роста к исходящей площади фрагмента головного мозга. Достоверность различия сравниваемых средних значений ИП оценивали с помощью 1критерия Стъюдента. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100%.

Зону роста контрольных эксплантатов головного мозга составляли короткие нейриты, а также выселяющиеся клетки глии и фибробластоподобные клетки.

При исследовании непосредственного влияния препаратов на фрагменты головного мозга были поставлены следующие серии опытов.

В питательную среду эксплантатов коры головного мозга и спинно-мозговых ганглиев эмбрионов цыплят добавляли церебролизин в различных концентрациях. На 3-и сутки культивирования при концентрации 100 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов коры головного мозга на 28±2%, по сравнению с контрольными значениями ИП. Достоверных значений ИП эксплантатов коры при действии других концентраций церебролизина не наблюдалось. Отчетливая стимуляция развития эксплантатов коры головного мозга выявилась при действии исследуемого препарата в концентрации 20 нг/мл, когда ИП экспериментальных эксплантатов на 37±3% был выше, чем ИП контрольных эксплантатов, и достоверно выше, чем ИП эксплантатов сравнения при действии церебролизина. При добавлении церебролизина в среду для культивирования эксплантатов спинно-мозговых ганглиев достоверного увеличения ИП эксплантатов не отмечалось, в то время как при добавлении в среду исследуемого препарата наблюдалось увеличение ИП эксплантата на 31 ±2%.

При исследовании эксплантатов коры головного мозга и спинно-мозговых ганглиев на более длительных сроках культивирования - 7 дней - выявились те же эффекты нейрит-стимулирующего действия, в тех же концентрациях исследуемого препарата.

На фигуре представлено влияние препарата на развитие эксплантатов коры головного мозга.

Таким образом, в отношении тканей головного мозга наблюдалось уменьшение порога эффективных концентраций для исследуемого препарата по сравнению с церебролизином. Так, увеличение зоны роста эксплантатов фрагментов коры головного мозга выявлялось при действии церебролизина только в концентрации 100 нг/мл, а при действии исследуемого препарата - в концентрации 20 нг/мл. При этом интенсивность стимулирующего действия препарата была достоверно выше, чем церебролизина. На увеличение зоны роста эксплантатов спинно-мозговых ганглиев церебролизин достоверного действия не оказывал, в то время как исследуемый препарат способствовал увеличению ИП на 31%. Это свидетельствует о выраженном и направленном стимулирующем действии препарата на нейроны различных отделов головного мозга.

Пример 3. Влияние препарата на токсические эффекты нейротропных веществ.

На 38 крысах линии «\У|Чаг» проведено исследование влияния препарата на токсические эффекты нейротропных веществ различных фармакологических групп.

Через 1 ч после внутримышечной инъекции физиологического раствора (контроль) или исследуе

- 4 010739 мого препарата (в двух дозах - 70 и 350 мкг/кг в 0,5 мл стерильного физиологического раствора) крысам внутрибрюшинно вводили токсические дозы различных нейрофармакологических препаратов (апоморфин, галоперидол, никотин, кофеин) и регистрировали показатели вертикальной (тревожность) и горизонтальной (локомоторика) спонтанной двигательной активности.

Апоморфин оказывает рвотное действие за счет стимуляции хеморецепторной пусковой зоны продолговатого мозга. Кроме того, апоморфин способен взаимодействовать с дофаминовыми рецепторами и возбуждать дофаминергические структуры мозга. В экспериментах при введении апоморфина у животных наблюдались гиперлокомоторика, гипертермия, психоз, миотония. Исследуемый препарат в обеих концентрациях противодействовал влиянию апоморфина, снижая уровень тревожности и выраженность локомоторных реакций, препятствуя развитию гипертермии и миотонии.

Галоперидол относится к группе нейролептиков, обладает слабой адренолитической активностью. В экспериментах при ведении животным галоперидол вызывал у них снижение локомоторики, гипотермию, каталепсию, депрессию и миоплегию. Исследуемый препарат действовал как фармакологический антагонист галоперидола, усиливая тревожность и локомоторные реакции, препятствуя развитию гипотермии и миоплегии, как в дозе 70 мкг/кг, так и в дозе 350 мкг/кг.

Никотин обладает н-холиномиметическим действием. В экспериментах при введении животным вызывал у них повышение вертикальной и горизонтальной двигательной активности, а также мышечного тонуса. Под действием исследуемого препарата наблюдалось снижение влияния никотина на тревожность животных, что выражалось в уменьшении вертикальной и горизонтальной двигательной активности и мышечного тонуса. Достоверной разницы в эффективности применения препарата в разных дозах не выявлено.

Кофеин является психостимулятором, механизм его действия основан на подавлении активности фосфодиэстеразы и ассоциированным с ним повышении уровня сАМР. В экспериментах при введении животным кофеин вызывал у них гиперлокомоторную реакцию и повышение зоосоциального контакта животных. Исследуемый препарат оказывал выраженное антитоксическое действие в обеих дозах, снижая тревожность, вызываемую кофеином, но не влиял при этом на локомоторику.

Способность препарата подавлять токсические эффекты таких препаратов, как адреностимуляторы, нейролептики, холиномиметики и психостимуляторы, свидетельствует о его нормализующем действии на функциональную активность нейронов и может быть использована как в лечении отравлений нейротропными веществами, так и для восстановления функции нейронов при действии других повреждающих факторов. Эффект препарата проявлялся в одинаковой степени как в дозе 70 мкг/кг, так и в дозе 350 мкг/кг, что свидетельствует о возможности считать дозировку 70 мкг/кг (или 5 мг на человека) терапевтически эффективной.

Пример 4. Изучение токсичности препарата.

Общетоксическое действие препарата исследовали в соответствии с требованиями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000): острой токсичности при однократном введении препарата, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении препарата.

Исследование по изучению острой токсичности проведено на 72 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 20-22 г. Животные были рандомизированно разделены на 6 равных групп. Препарат вводили животным однократно внутримышечно в дозах 35, 50, 100, 150, 200 мг/кг в 0,25 мл стерильного 0,9% раствора ИаС1. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9% раствор №1С1.

Исследования по изучению подострой токсичности проведено на 65 белых беспородных крысахсамцах с массой тела 150-180 г. Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили препарат внутримышечно в течение 90 дней в дозах 1, 10, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора ИаС1. Животным контрольной группы вводили в том же объеме стерильный 0,9% раствор №1С1. До введения препарата, на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.

Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев, исходя из длительности рекомендуемого клинического назначения препарата, на 84 морских свинках-самцах с массой тела 250-280 г. Животные подопытных групп получали ежедневно однократно внутримышечно препарат в течение 6 месяцев в дозах 1, 10, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора ИаС1. В контрольной группе животным вводили по аналогичной схеме стерильный 0,9% раствор №С1 в том же объеме. У животных в периферической крови общепринятыми методами определяли: количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинно-мозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга.

- 5 010739

При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение исследуемого препарата животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения, более чем в 5000 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической широте препарата.

Изучение подострой и хронической токсичности препарата свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата в дозах, превышающих терапевтическую в 3003000 раз. При исследовании влияния препарата на морфологический состав и биохимические показатели периферической крови морских свинок через 3 и 6 месяцев после начала его введения достоверного изменения показателей не выявлено (табл. 1).

При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.

Следовательно, препарат, полученный предлагаемым способом, при длительном введении животным не обладает токсическими свойствами, препятствующими дальнейшему его применению в качестве лекарственного средства, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения.

Пример 5. Эффективность применения препарата у больных сосудистыми энцефалопатиями.

Исследование проведено с участием 30 больных сосудистыми энцефалопатиями в возрасте 61-80 лет. Все больные ранее получали традиционные лекарственные средства симптоматического и патогенетического действия, при применении которых отмечался кратковременный терапевтический эффект, требующий увеличения дозы препаратов на курс лечения и продолжительного их приема.

Все пациенты, принимавшие участие в исследовании, методом рандомизации были разделены на 2 группы. 19 пациентам, составившим основную группу, вводили препарат в дозе 5 мг в 2,0 мл физиологического раствора внутримышечно ежедневно однократно течение 10 дней.

пациентам контрольной группы назначали общепринятое лечение.

При сопоставлении субъективных показателей состояния больных до и после применения препарата установлено, что количество жалоб на здоровье уменьшилось в 3,5 раза. Больные отмечали улучшение памяти, сообразительности, уменьшение интенсивности и длительности головных болей, появление эмоциональной уравновешенности, волевых качеств, чувства отдыха после ночного сна.

Оценка влияния препарата на интегральную функцию головного мозга - внимание - и на биоэлектрическую активность исследовали с помощью корректурной пробы и электроэнцефалографии, соответственно.

У больных после лечения с применением препарата значительно возросло количество просмотренных знаков и уменьшилось количество ошибок (табл. 2). В группах больных, получавших лечение с применением препарата, получены лучшие результаты при анализе динамики выполнения корректурной пробы до и после лечения. Это выражалось в отсутствии резких колебаний в количестве просмотренных знаков за равные отрезки времени, наличии периода врабатываемости к середине выполнения задания и постепенном снижении кривой к концу задания, что свидетельствует о большей устойчивости внимания после применения препарата.

Для оценки влияния препарата на биоэлектрическую активность головного мозга проводился расчет альфа-индекса до и после лечения. Наиболее выраженные изменения биоэлектрической активности головного мозга наблюдались у больных после лечения с применением препарата по сравнению с пациентами контрольной группы. Установлено, что под влиянием лечения с применением препарата произошло достоверное увеличение альфа-индекса у больных исследуемой группы (табл. 3).

Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о нормализующем действии препарата в терапевтически эффективной дозе 5 мг (2,5 мг/мл) на интегративную функцию головного мозга у больных сосудистыми энцефалопатиями и целесообразности его применения для лечения больных с патологией головного мозга в дозе 5 мг внутримышечно однократно ежедневно в течение 10 дней.

- 6 010739

Таблица 1

Показатель	Введение препарата (10 мг/кг)
3 месяца	6 месяцев
Контроль (п=21)	Препарат (п=21)	Контроль (п=21)	Препарат (п=21)
Эритроциты, х10,2/л	5,210,6	5,310,2	5,4+0,4	5,2+0,6
Гемоглобин, г/л	14,1+1,3	14,211,1	14,3+1,2	14,311,6
Ретикулоциты, %	1,210,04	1,2+0,09	1,3+0,02	1,210,1
Тромбоциты, х109/л	144,516,4	144,817,9	143,618,2	143,217,6
Лейкоциты, хЮ’/л	9,7+0,2	9,810,4	9,510,3	9,710,5
Нейтрофилы палочкоядерные, %	0,3310,02	0,33+0,08	0,3210,01	0,3410,05
Нейтрофилы сегментоядерные, %	44,5+1,9	45,412,6	45,012,6	43,513,3
Эозинофилы, %	0,70+0,04	0,71±0,07	0,6910,06	0,7210,02
Базофилы, %	0,64+0,06	0,6710,02	0,70+0,02	0,6810,02
Моноциты, %	2,410,04	2,310,04	2,510,01	2,610,05
Лимфоциты, %	47,9+1,57	52,7+2,8	50,412,4	49,511,3
СОЭ, мм/ч	1,73+0,03	1,89+0,05	1,95+0,05	1,8410,02
Резистентность эритроцитов, % ЫаС! -максимальная -минимальная	0,4210,01 0,3010,04	0,4210,04 0,32+0,02	0,4110,01 0,33±0,06	0,40+0,05 0,32+0,04
Общий белок в сыворотке крови, г/л	71,612,6	72,612,8	72,313,1	71,812,8
Натрий в сыворотке крови, ммоль/л	152,616,2	154,1+6,7	153,717,1	152,616,3
Калий в сыворотке крови, ммоль/л	5,212,5	5,112,1	5,111,6	5,212,4

Таблица 2

Группа пациентов	Количество просмотренных знаков	Количество ошибок
Здоровые	2954,6173,6	3,510,3
Больные до лечения	1417,11131,9	15,611,7
Больные после лечения с применением общепринятых средств	1876,51121,1*	10,311,5*
Больные после лечения с применением препарата	2325,61114,2*#	6,311,4*#

* Р<0,05 по сравнению с показателем у больных до лечения;

# Р<0,05 по сравнению с показателем у больных после лечения с применением об- щепринятых средств.

Таблица 3

Группа пациентов	Альфа-индекс
Здоровые	51,8+2,3
Больные до лечения	34,5+3,7
Больные после лечения с применением общепринятых средств	43,1+3,2*
Больные после лечения с применением препарата	49,2+2,8*#

* Р<0,01 по сравнению с показателями у больных до лечения;

* Р<0,05 по сравнению с показателем у больных после лечения с применением общепринятых средств;

* Р<0,05 по сравнению с показателем в контроле, принятым за 100%.

- 7 010739

Claims (2)

1. Средство, нормализующее функции головного мозга, представляющее собой лекарственную форму для парентерального введения в виде раствора пептидного комплекса с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 72 до 250 Да, с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл и полученное из головного мозга телят не старше 12-месячного возраста или свиней путем экстракции уксусной кислотой в присутствии хлористого цинка.

2. Способ получения средства по п.1, характеризующийся тем, что головной мозг телят не старше 12-месячного возраста или свиней замораживают при температуре не менее минус 40°С, выдерживают при температуре минус (20-22)°С в течение не менее двух месяцев, затем измельчают, добавляют 3% раствор уксусной кислоты в объемном соотношении 1:5 при температуре 20±5°С, экстракцию проводят при постоянном перемешивании, после получения однородной взвеси в нее добавляют 1% раствор хлористого цинка в объемном соотношении 50 объемов однородной взвеси к 1 объему 1% раствора хлористого цинка, охлаждают при постоянном перемешивании до температуры 7-16°С, затем перемешивают по 1 ч через каждые 4 ч отстаивания в течение 48 ч, экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием, к экстракту добавляют ацетон в объемном соотношении сырье: ацетон, равном 1:5, выдерживают при температуре 3-5°С в течение 4 ч, образовавшийся гомогенизированный осадок повторно осаждают ацетоном не менее 2 раз, затем осадок, содержащий активное вещество, промывают на нутч-фильтре двукратными объемами охлажденного до температуры 7-16°С ацетона до получения осадка светло-серого цвета, протирают через металлическое сито, высушивают, растворяют в дистиллированной воде при комнатной температуре и постоянном перемешивании до концентрации полипептидов 2,5-2,9 мг/мл, раствор центрифугируют, фильтруют, подвергают ультрафильтрационной очистке на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см² через материалы с задерживающей способностью 15000 Да, в ультрафильтрат добавляют гликокол до его конечной концентрации 10-20 мг/мл при рН 5,6-6,6, раствор подвергают стерилизующей фильтрации под давлением не более 2,0 кгс/см², разливают в ампулы по 2 мл и автоклавируют в течение 8 мин при температуре 120°С и атмосферном давлении 1,1 кгс/см².