IT201800007093A1 - Oligosaccaridi per l’uso nel trattamento della malattia di Parkinson - Google Patents
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Description
Titolo: “Oligosaccaridi per l’uso nel trattamento della malattia di Parkinson”
Descrizione
Formano oggetto della presente invenzione oligosaccaridi di formula (1):
R1-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-R2-R3 (1) dove
R1 è assente o selezionato tra α-Fuc-(1-2), α-Neu5Ac-(2-3);
R2 è selezionato tra tra –(1-4)-β-Gal, -(1-4)-Gal; R3 è assente o selezionato tra -(1-4)-Glc, -(1-4)-sorbitolo;
per l’uso nel trattamento di malattie neurodegenerative del sistema nervoso centrale, in particolare della malattia di Parkinson.
Forma ulteriore oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica che comprende uno o più di detti oligosaccaridi.
Stato dell’arte
La malattia di Parkinson è una malattia neurodegenerativa i cui sintomi motori tipici sono il risultato della morte delle cellule della substantia nigra che sintetizzano e rilasciano la dopamina.
Ad oggi, non è disponibile una cura per la malattia di Parkinson. Il trattamento farmacologico, la chirurgia e la gestione multidisciplinare sono in grado di fornire sollievo ai sintomi. I farmaci principalmente utilizzati nel trattamento dei sintomi motori sono la levodopa, gli agonisti della dopamina e gli inibitori MAO-B (Inibitore della monoamino ossidasi) (The National Collaborating Centre for Chronic Conditions 2006 Parkinson's Disease, Londra, Royal College of Physicians, 59–100).
Giunti allo stadio in cui i farmaci non sono più sufficienti a controllare i sintomi, la chirurgia e la stimolazione cerebrale profonda possono rivelarsi utili (Bronstein JM et al. 2011 Arch. Neurol. 68(2):165).
E’ pertanto fortemente avvertita l’esigenza di un approccio terapeutico capace di curare la malattia di Parkinson.
Descrizione dell’invenzione
Descrizione delle figure
Figura 1: Distribuzione della radioattività associata all’oligosaccaride β-[6-<3>H]Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-Glc in seguito a somministrazione A) subcutanea, B) intraperitoneale, e C) intravenosa, misurata a 1 ora e a 22 ore dalla somministrazione.
Figura 2: Risultati dei test comportamentali effettuati dopo somministrazione per via intraperitoneale dell’oligosaccaride β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-Glc: A) Grip Test, B) Irritant Removal test, e C) Pole Test.
Figura 3: A) foto al microscopio rappresentativa di cellule di neuroblastoma trattate con DCB (3′,4′-Dichlorobenzamil hydrochloride) o controllo, in presenza o in assenza dell’oligosaccaride indicato. B) conta delle cellule vive.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
Si è qui sorprendentemente dimostrato che la somministrazione in un soggetto di uno o più oligosaccaridi di formula (1):
R1-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-R2-R3 (1) dove R1 è assente o selezionato tra α-Fuc(1-2), α-Neu5Ac-(2-3);
R2 è selezionato tra –(1-4)-β-Gal, –(1-4)-Gal;
R3 è assente o selezionato tra -(1-4)-Glc, -(1-4)-sorbitolo;
è in grado di eliminare la sintomatologia legata a malattie neurodegenerative del sistema nervoso centrale, in particolare alla malattia di Parkinson.
In una forma preferita, detti oligosaccaridi sono uno o più degli oligosaccaridi selezionati nel gruppo che comprende:
1. β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-Glc,
2. β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-sorbitolo,
3. β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal, 4. α-Fuc(1-2)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-Glc,
5. α-Fuc(1-2)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-sorbitolo,
6. α-Fuc(1-2)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]--Gal,
7. α-Neu5Ac-(2-3)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal(1-4)-Glc
8. α-Neu5Ac-(2-3)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal(1-4)-sorbitolo
9. α-Neu5Ac-(2-3)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-Gal
L’esposizione a detti oligosaccaridi si è mostrata in grado di eliminare la sintomatologia motoria tipicamente associata a patologie neurodegenerative del sistema nervoso centrale, di ridurre l’aggregazione cerebrale di α-sinucleina e la formazione di placche sulla superfice dei neuroni.
Si rivendica qui l’uso di uno o più degli oligosaccaridi descritti nel trattamento di patologie neurodegenerative, dove dette patologie sono selezionate nel gruppo che comprende: la malattia di Alzheimer, la malattia di Parkinson, la malattia di Huntington, la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), la paralisi sopranucleare progressiva, la demenza frontotemporale, la demenza da corpi di Lewy, la Malattia di CreutzfeldtJakob (MCJ). In una forma preferita, detto uso è nel trattamento della malattia di Parkinson.
E’stato altresì dimostrato che detti oligosaccaridi, quando somministrati per via intraperitoneale, intravenosa o sottocutanea, superano la barriera ematoencefalica e raggiungono immodificati l’ambiente extracellulare dei neuroni.
Detti oligosaccaridi vengono somministrati di per sé o sotto forma di composizione farmaceutica in cui uno o più composti attivi si presentano in mescola o miscela con uno o più eccipienti farmaceuticamente accettabili. Le composizioni farmaceutiche per l'uso in conformità con la presente invenzione possono essere formulate in modo convenzionale usando uno o più eccipienti farmaceuticamente accettabili compresi carrier, diluenti, e adiuvanti che agevolano il processamento dei composti attivi in preparazioni che possono essere usate fisiologicamente. Una composizione appropriata è dipendente dalla via di somministrazione scelta.
In una forma preferita di realizzazione, la via di somministrazione è intraperitoneale, sottocutanea o intravenosa.
Ancora più preferibilmente, detta composizione farmaceutica comprende altresì uno o più ulteriori principi attivi.
Esempi:
Esempio 1: sintesi degli oligosaccaridi.
Gli oligosaccaridi per l’uso secondo la presente invenzione sono stati preparati come segue:
- per gli oligosaccaridi:
1. β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-Glc,
2. α-Fuc(1-2)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-Glc,
3. α-Neu5Ac-(2-3)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-Glc
è stata operata una reazione di ozonolisi seguita da trattamento basico con trietilammina (Ghidoni et al.
1976 J. Neurochem 27:511-515, Tettamanti et al 1973 Biochim Biophys Acta 296:160-170) a partire da glicolipidi estratti da tessuti animali.
- per gli oligosaccaridi:
4. β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-sorbitolo,
5. α-Fuc(1-2)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-sorbitolo,
6. Neu5Ac(2-3)-β-Gal(1-3)-β-GalNAc(1-4)-[α-Neu5Ac(2-3)]-β-Gal(1-4)-sorbitolo
la sintesi è partita dagli oligosaccaridi 1, 2, 3, ridotti con sodio boroidruro.
- per gli oligosaccaridi:
7. β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-Gal, 8. α-Fuc-(1-2)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-Gal,
9. α-Neu5Ac-(2-3)-β-Gal(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-Gal
è stata operata una blanda idrolisi chimica degli oligosaccaridi sintetizzati 1, 2, 3.
I composti triziati sono stati triziati sul galattosio esterno in posizione 6, attraverso una reazione di ossidazione enzimatica con la galattosio ossidasi seguita da una riduzione con sodio boro[3H]idruro (Sonnino et al. 1996 Glycobiology 6:479-487).
Esempio 2: attraversamento barriera ematoencefalica.
Topi wild-type (C57BL/6) di circa 3 mesi sono stati trattati con β-[6-<3>H]Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-Glc.
La somministrazione è stata effettuata per via intraperitoneale, sottocutanea o intravenosa (Orlando P. et al 1979, Pharmacological Research Communications 11:759-773). Per la via intravenosa, l’iniezione è stata effettuata nella vena centrale della coda. Il trattamento è stato effettuato con 10 μg di oligosaccaride triziato (10 μCi) sciolto in 0.1 ml di soluzione fisiologica. Per ogni gruppo sperimentale sono stati utilizzati 5 animali. Dopo 1 ora e 22 ore dalla somministrazione, gli animali sono stati sacrificati per perfusione cardiaca (10 min), al fine di rimuovere il sangue, soprattutto a livello del sistema nervoso centrale. Il cervello è stato rimosso e le diverse aree (corteccia, ippocampo, substancia nigra, cervelletto, tronco) sono state identificate e separate. I campioni tissutali sono stati liofilizzati, omogenizzati e la radioattività relativa associata è stata rilevata al βcounter (Orlando et al 1979, Pharmacological Research Communication 11:759-773).
In figura 1 sono riportati i risultati ottenuti. Si osserva che una discreta dose dell’oligosaccaride è in grado di raggiungere il sistema nervoso centrale, compresa la substantia nigra entro poche ore dalla somministrazione.
Esempio 3: gli olisaccaridi secondo la presente invenzione recuperano la sintomatologia in un modello murino di PD.
E’stato utilizzato un modello animale di PD ampiamente utilizzato, topi eterozigoti per mancanza dell’enzima galattosaminiltransferasi B4galnt1 (GalNacT) (Liu Y. et al 1999, J. of Clinical Investigation 103:497-505; Wu G. et al 2012, J of Neurosci Research 90:1997-2008). Il modello B4galnt1+/- presenta un ridotto contenuto degli oligosaccaridi acidi della serie Gg4, nota anche come serie 1, legati alla porzione ceramidica inserita nella membrana plasmatica. Particolarmente ridotte in quantità risultano essere le catene β-Gal-(1-3)-βGalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-β-Glc e α-Neu5Ac-(2-3)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-β-Glc. L’assenza di questi oligosaccaridi induce un accumulo di aggregati di αsinucleina, soprattutto a livello della substantia nigra, debolezza muscolare e tremore (Wu G. et al 2012, J of Neurosci Research 90:1997-2008). Questo modello animale è rappresentativo della malattia di Parkinson di tipo sporadico (Wu G. et al 2012, J of Neurosci Research 90:1997-2008).
Gli animali sono stati trattati giornalmente per via subcutanea, intraperitoneale o intravenosa, con un oligosaccaride selezionato tra:
1. β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-Glc,
2. α-Fuc(1-2)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-Glc,
3. α-Neu5Ac-(2-3)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal(1-4)-Glc
4. β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-sorbitolo,
5. α-Fuc(1-2)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-sorbitolo
6. α-Neu5Ac-(2-3)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal(1-4)-sorbitolo
7. β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal, 8. α-Fuc(1-2)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-Gal,
9. α-Neu5Ac-(2-3)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-Gal
Il trattamento è stato protratto per 5 settimane ad una dose fissa (20 mg/kg di peso corporeo) in soluzione fisiologica.
I topi B4galnt1+/- controllo hanno ricevuto iniezioni di soluzione salina. Come controllo positivo sono stati utilizzati topi wild-type di circa 3 mesi trattati con soluzione salina. Per ogni gruppo sperimentale sono stati utilizzati 8 topi. I topi sono stati suddivisi applicando il principio della randomizzazione nei diversi gruppi sperimentali.
Per l’intero periodo del trattamento, gli animali sono stati analizzati nei loro comportamenti.
I test comportamentali eseguiti sono stati il “Grip test” e l’”Irritant Removal test”, test comportamentali ampiamente utilizzati per definire le capacità di miglioramento di topi Parkinsoniani (Wu G. et al 2012 J of Neurosci Research 90:1997-2008). Dopo una settimana dall’avvio del trattamento, i topi Parkinsoniani trattati con uno dei 9 oligosaccaridi hanno mostrato le stesse caratteristiche dei topi WT, caratteristiche che mantenevano per tutto il trattamento. A titolo esemplificativo, in figura 2A e 2B sono riportati i risultati ottenuti trattando con β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-Glc. Il trattamento con uno qualsiasi degli altri composti ha portato a risultati paragonabili. Al termine del trattamento, è stato effettuato un terzo test comportamentale, “Pole test”, che ha confermato a livello fenotipico la reversione della sindrome parkinsoniana nei topi trattati con uno dei 9 oligosaccaridi. La figura 2C mostra i risultati ottenuti dopo il trattamento con β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-Glc.
Al termine del trattamento i topi sono stati sacrificati tramite perfusione cardiaca con soluzione fisiologica e sono state condotte indagini biochimiche al fine di verificare l’impatto del trattamento sull’accumulo di αsinucleina a livello della substantia nigra.
Per ogni gruppo sperimentale i topi sono stati suddivisi in 2 sottogruppi: 4 topi sono stati utilizzati per indagini di IHC e 4 topi per indagini IB (Wu et al. 2011 Neurochem Research 36:1706-1714; Wu G. et al 2012 J of Neurosci Research 90:1997-2008).
I 4 cervelli destinati all’IHC sono stati fissati in soluzione di paraformaldeide al 4% overnight e successivamente trasferiti in soluzione di saccarosio al 30% per la crioprotezione e conservati a 4°C.
Sezioni coronali (20 μm) sono state trattate con anticorpo primario anti α-syn (mouse, 1:2000 BD Science) e anticorpo secondario anti-mouse (alexa fluor 568, thermofisher).
I 4 cervelli destinati ad indagini di IB sono stati suddivisi in substancia nigra, ippocampo e striato. I tessuti sono stati omogenizzati e lisati. 20 μg di proteine sono state separate tramite SDS-page utilizzando gel precasted (4-20% poliacrilammide, Biorad) e trasferite su membrane PVDF. La presenza degli oligomeri di α-sinucleina è stata effettuata utilizzando anticorpo primario anti α-syn (mouse, 1:1000 BD Science) e anticorpo secondario anti-mouse (1:2000, thermofisher).
Gli esperimenti hanno rilevato una diminuzione significativa nei livelli di α-sinucleina nei topi trattati rispetto ai controlli (dati non mostrati).
Esempio 4: gli olisaccaridi secondo la presente invenzione sono in grado di attivare la sintesi di proteine coinvolte nella protezione da stress ossidativo, da eccitotossicità e da neuroinfiammazione. Cellule di neuroblastoma di origine murina sono state trattate con β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-Glc per indurre il differenziamento neuronale (Chiricozzi et al. 2017 Journal of Neurochemistry 143:645-659). Dopo 24 h dal trattamento le cellule sono state raccolte per l’analisi delle proteine. L’analisi proteomica tramite spettroscopia di massa ha rilevato che il trattamento con β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-Glc è in grado di indurre l’espressione di 320 proteine. Queste proteine sono coinvolte in signalling cellulari di i) neuroprotezione da eccitotossicità; ii) inibizione dello stress ossidativo; iii) inibizione dell’iperattivazione della microglia e downregolazione delle molecole proinfiammatorie.
Esempio 5: gli olisaccaridi secondo la presente invenzione proteggono dall’eccitotossicità.
Nella malattia di Parkinson, così più in generale nelle malattie degenerative del sistema nervoso centrale, c’è una forte attivazione del sistema immunitario, dello stress ossidativo e di eccitotossicità. Cellule di neuroblastoma sono state quindi trattate con il DCB (3′,4′-Dichlorobenzamil hydrochloride) per indurre un accumulo di calcio intracellulare, strategia sperimentale che mima l’eccitotossicità indotta da glutammato. E’ stato dimostrato che la somministrazione di β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-Glc è in grado di proteggere le cellule dalla morte indotta da DCB, senza essere tossico per le cellule, come mostrato in Figura 3A e 3B. In particolare, il risultato di figura 3B mostra un recupero pressochè totale della vitalità cellulare dalla tossicità indotta da DCB.
Claims (9)
- RIVENDICAZIONI 1. Oligosaccaridi di formula (1): R1-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-R2-R3 (1) dove R1 è assente o selezionato tra α-Fuc(1-2), α-Neu5Ac-(2-3); R2 è selezionato tra –(1-4)-β-Gal, -(1-4)-Gal; R3 è assente o selezionato tra (1-4)-Glc, -(1-4)-sorbitolo; per l’uso nel trattamento di malattie neurodegenerative del sistema nervoso centrale.
- 2. Oligosaccaridi per l’uso secondo la rivendicazione 1, dove detta malattia è la malattia di Parkinson.
- 3. Oligosaccaridi per l’uso secondo la rivendicazione 1 o 2, dove detti oligosaccaridi sono selezionati nel gruppo che comprende: β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-Glc, β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-sorbitolo, β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal, α-Fuc(1-2)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-Glc, α-Fuc(1-2)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal-(1-4)-sorbitolo, α-Fuc(1-2)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]--Gal, α-Neu5Ac-(2-3)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal(1-4)-Glc α-Neu5Ac-(2-3)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-β-Gal(1-4)-sorbitolo α-Neu5Ac-(2-3)-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-Gal.
- 4. Composizione farmaceutica che comprende uno o più oligosaccaridi di formula (1): R1-β-Gal-(1-3)-β-GalNAc-(1-4)-[α-Neu5Ac-(2-3)]-R2-R3 (1) dove R1 è assente o selezionato tra α-Fuc(1-2), α-Neu5Ac-(2-3); R2 è selezionato tra –(1-4)-β-Gal, -(1-4)-Gal; R3 è assente o selezionato tra (1-4)-Glc, -(1-4)-sorbitolo; e uno o più eccipienti farmaceuticamente accettabili.
- 5. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 4 per l’uso nel trattamento di malattie neurodegenerative.
- 6. Composizione farmaceutica per l’uso secondo la rivendicazione 5 che comprende altresì uno o più ulteriori principi attivi.
- 7. Composizione farmaceutica per l’uso secondo la rivendicazione 5 o 6, dove detta malattia è la malattia di Parkinson.
- 8. Composizione farmaceutica per l’uso secondo una delle rivendicazioni da 5 a 7, dove detta composizione è somministrata per via intraperitoneale, sottocutanea o intravenosa.
- 9. Composizione farmaceutica per l’uso secondo una delle rivendicazioni da 5 a 8, dove detto trattamento è protratto per circa 5 settimane.
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