JPS62129225A - 狂犬病ワクチンの製造法 - Google Patents
狂犬病ワクチンの製造法Info
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- JPS62129225A JPS62129225A JP61276881A JP27688186A JPS62129225A JP S62129225 A JPS62129225 A JP S62129225A JP 61276881 A JP61276881 A JP 61276881A JP 27688186 A JP27688186 A JP 27688186A JP S62129225 A JPS62129225 A JP S62129225A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は化学的処理によって増殖をする完全な、損傷の
ないウィルスから成る狂犬病ワクチンの経済的製造法で
ある。
ないウィルスから成る狂犬病ワクチンの経済的製造法で
ある。
この方法によって得られたワクチンはその高狂犬病ワク
チンの大部分は今日まだ生きている動物、たとえばマウ
ス、ラット、ウサギ、羊等々中でウィルスを増殖して得
ている。しかしこの場合ウィルス含有組織を生じ、それ
は著しい量のミニリンを含有する。
チンの大部分は今日まだ生きている動物、たとえばマウ
ス、ラット、ウサギ、羊等々中でウィルスを増殖して得
ている。しかしこの場合ウィルス含有組織を生じ、それ
は著しい量のミニリンを含有する。
最近狂犬病ワクチンを家禽脂汗中で増殖されたウィルス
からも得ている。これはその原生じるウィルス含有組織
が有害なミニリンをほとんど含有しないという本質的な
利点を有する。家禽中でのウィルスの増殖後、この胎仔
を一般にミキサー又はブレングー中で完全に均一化する
。
からも得ている。これはその原生じるウィルス含有組織
が有害なミニリンをほとんど含有しないという本質的な
利点を有する。家禽中でのウィルスの増殖後、この胎仔
を一般にミキサー又はブレングー中で完全に均一化する
。
かゆ状の均−物て於てウィルス−成分を、接種にあたり
所望されない副反応を生ぜしめる異種たん白から不完全
にしか分離することができない。同様なことが狂犬病に
感染した脳を有する生きている動物から得られたワクチ
ンに対してもいえる。この副反応が特定の職業人、たと
えばハンター、山林官、獣医に欠くことができないくり
返しの接種で異種たん白に対するあまりにも激しいアレ
ルギー防御反応を増大させる。
所望されない副反応を生ぜしめる異種たん白から不完全
にしか分離することができない。同様なことが狂犬病に
感染した脳を有する生きている動物から得られたワクチ
ンに対してもいえる。この副反応が特定の職業人、たと
えばハンター、山林官、獣医に欠くことができないくり
返しの接種で異種たん白に対するあまりにも激しいアレ
ルギー防御反応を増大させる。
ワクチン品質の改善を欠の様にして得ることができる。
すなわちワクチン収得のために、比たワクチンは対応し
て僅かな含有量の副生成物を有し、比較的僅かな副作用
を惹起する。
て僅かな含有量の副生成物を有し、比較的僅かな副作用
を惹起する。
参照：ドイツ特許第３，００９，０６４号明細書及び米
国特許第４．２５５．５２０号明細書。
国特許第４．２５５．５２０号明細書。
しかし動物の神経組織から、胎仔から又は胎仔頭部から
ワクチン製造する場合、ウィルス含有組織をミキサー又
はブレンダーで均一化する際にウィルスをしばしば損傷
し又は細分化してしまう。これはこの様は均−物から製
造されたワクチンの有効性を著しく減少し、その精製を
極めて困難にする。というのは多量のたん白及び脂質を
細分化された細胞から遊離するからである。改良された
ワクチンは従来ヒトの二倍体細胞（ＨＤＣ）−培養中で
試験管内で狂犬病ウィルスを増殖することによってしか
得ることができなかった。
ワクチン製造する場合、ウィルス含有組織をミキサー又
はブレンダーで均一化する際にウィルスをしばしば損傷
し又は細分化してしまう。これはこの様は均−物から製
造されたワクチンの有効性を著しく減少し、その精製を
極めて困難にする。というのは多量のたん白及び脂質を
細分化された細胞から遊離するからである。改良された
ワクチンは従来ヒトの二倍体細胞（ＨＤＣ）−培養中で
試験管内で狂犬病ウィルスを増殖することによってしか
得ることができなかった。
Ｈ，Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ 、ＷＨＯモノグラフシリーズ
＆２３、第２８章、第２５６−６０頁（１９７３） ：
ヒト二倍二倍体細胞で製造される狂犬病ワクチンの製造
及び調節： Ｔ、 Ｊ、 Ｗｉｋｔｏｒ等、］）ｅｖｅ
ｌｏｐ、 ｂｉｏｌ、 ５ｔａｎｄａｒｄ 。
＆２３、第２８章、第２５６−６０頁（１９７３） ：
ヒト二倍二倍体細胞で製造される狂犬病ワクチンの製造
及び調節： Ｔ、 Ｊ、 Ｗｉｋｔｏｒ等、］）ｅｖｅ
ｌｏｐ、 ｂｉｏｌ、 ５ｔａｎｄａｒｄ 。
第４０巻、第３−９頁（１９７８） ：組織培養による
狂犬病ワクチンの発展及び臨床証拠。得られたワクチン
は不純物としてヒトたん白を含有する。このたん白は異
種たん白として僅かな副反応を生じる。
狂犬病ワクチンの発展及び臨床証拠。得られたワクチン
は不純物としてヒトたん白を含有する。このたん白は異
種たん白として僅かな副反応を生じる。
この方法の著しい欠点は二倍体線維芽細胞での狂犬病ウ
ィルスの比較的僅かな増殖度合である。これはワクチン
製造に対して１０〜２５倍の濃縮を必要とする。したが
ってこの方法は経済的可能性の範囲内で狂犬病ワクチン
の巾広い需要をカバーするための能力が不十分である。
ィルスの比較的僅かな増殖度合である。これはワクチン
製造に対して１０〜２５倍の濃縮を必要とする。したが
ってこの方法は経済的可能性の範囲内で狂犬病ワクチン
の巾広い需要をカバーするための能力が不十分である。
米国特許第８，６７４，８６２号明細書中で胎仔−細胞
培養中での狂犬病ワクチンの製造が記載されている。こ
の細胞培養での増殖度合は制限されている。米国特許第
３，９７１，０００号明細書には密度勾配遠心法による
狂犬病ウィルスの濃縮法が記載されているｏ Ｍ、 Ｒ
ｏｌｌｅ及びＡ、 Ｍａｙｒ ：微生物学、感染−及
び疫学、シュツツガル） １９７８、第４８９−４９８
頁に胎仔−狂犬病ワクチンの慣用製造法が記載されてい
る。
培養中での狂犬病ワクチンの製造が記載されている。こ
の細胞培養での増殖度合は制限されている。米国特許第
３，９７１，０００号明細書には密度勾配遠心法による
狂犬病ウィルスの濃縮法が記載されているｏ Ｍ、 Ｒ
ｏｌｌｅ及びＡ、 Ｍａｙｒ ：微生物学、感染−及
び疫学、シュツツガル） １９７８、第４８９−４９８
頁に胎仔−狂犬病ワクチンの慣用製造法が記載されてい
る。
しだがって完全に得られた抗原性活性を有する機械的な
損傷のないウィルスを含有し、簡単に製造され、したが
って高価でなく、副作用を全く生じない、新規の高度に
有効な狂犬病ワクチンに差し迫った要求がある。この様
なワクチンは実際上巾広く生じる恐しい伝染病−これは
不快な方法で広まる−の予防のために、以前から研究さ
れた、有効なかつ十分に相客な剤である。
損傷のないウィルスを含有し、簡単に製造され、したが
って高価でなく、副作用を全く生じない、新規の高度に
有効な狂犬病ワクチンに差し迫った要求がある。この様
なワクチンは実際上巾広く生じる恐しい伝染病−これは
不快な方法で広まる−の予防のために、以前から研究さ
れた、有効なかつ十分に相客な剤である。
したがって本発明の目的は二倍体ヒト細胞培養で増殖さ
れたウィルスから収得されたワクチ今や本発明者は次の
処理工程の使用によってこの高い目標を達成することが
できることを見い出しだ： １、 動物の神経組織、好ましくは家禽脂汗中で増殖さ
れた狂犬病ウィルスをその機械的損傷又は細分化の回避
下に単離する。
れたウィルスから収得されたワクチ今や本発明者は次の
処理工程の使用によってこの高い目標を達成することが
できることを見い出しだ： １、 動物の神経組織、好ましくは家禽脂汗中で増殖さ
れた狂犬病ウィルスをその機械的損傷又は細分化の回避
下に単離する。
その際狂犬病ウィルスの抽出は神経組織又は無菌のカモ
脂汗頭部を慎重に細胞の保護下で微粉砕し、次いで組織
砕片をリン酸塩含有緩衝液で洗浄して行われる。この方
法はミキサー又はブレダーによる均一化に比して有効で
ある。異種たん白及び脂質を比較的少量で溶解し、抗原
、たん白及び脂質の酸化生成物の発生を減少し、細胞内
の、不完全かつ非免疫性狂犬病抗原を減少する。組織砕
片を水性緩衝液で洗浄して得られるウィルス含有懸濁液
を遠心分画によって分離する。
脂汗頭部を慎重に細胞の保護下で微粉砕し、次いで組織
砕片をリン酸塩含有緩衝液で洗浄して行われる。この方
法はミキサー又はブレダーによる均一化に比して有効で
ある。異種たん白及び脂質を比較的少量で溶解し、抗原
、たん白及び脂質の酸化生成物の発生を減少し、細胞内
の、不完全かつ非免疫性狂犬病抗原を減少する。組織砕
片を水性緩衝液で洗浄して得られるウィルス含有懸濁液
を遠心分画によって分離する。
２、得られたウィルス濃縮物から水と混和し得ない有機
溶剤、たとえば揮発性パラフィン炭化水素又はフッ素化
炭化水素で抽出することによって脂質を除去する。
溶剤、たとえば揮発性パラフィン炭化水素又はフッ素化
炭化水素で抽出することによって脂質を除去する。
３、脱脂されたウィルス−濃縮物を密度勾配遠心によっ
て更に濃縮する及び（又は） ４、 ウィルスをポリエチレングリコール（たとえばＰ
ＥＧ６０００） の添加によって沈殿させ、遠心によ
って濃縮し、精製する。
て更に濃縮する及び（又は） ４、 ウィルスをポリエチレングリコール（たとえばＰ
ＥＧ６０００） の添加によって沈殿させ、遠心によ
って濃縮し、精製する。
操作３及び（又は）４によって残りのたん白の少なくと
も９５％を除去する。
も９５％を除去する。
最後にウィルスを公知方法で、たとえばβ−プロピオラ
クトン又はトリー（ｎ−ブチル）−ホスフェートの添加
によって不活性化する。
クトン又はトリー（ｎ−ブチル）−ホスフェートの添加
によって不活性化する。
個々の処理工程を驚異的に良好な全結果を生じるように
相互に一致させる。脂汗の頭部からのみウィルスを収得
してウィルスの高い基本的濃縮物が得られる。ウィルス
含有組織材料の保護された処理は特にミキサーで徹細な
かゆとなすその均一化を避けることによって次の様なウ
ィルス懸濁液を生じる。これはほとんど機械的に損傷の
ない及び細分化されていない、不完全な抗原を含有する
ウィルスを有し、更に極めて僅かな異物、たとえば細胞
砕片、たん白及び脂質を含有する。このウィルス懸濁液
から残存脂質を抽出によって及びたん白をウィルスの選
択的濃縮及び（又は）沈殿によってかゆ状の均−物から
よりも極めて完全に除去することができる。
相互に一致させる。脂汗の頭部からのみウィルスを収得
してウィルスの高い基本的濃縮物が得られる。ウィルス
含有組織材料の保護された処理は特にミキサーで徹細な
かゆとなすその均一化を避けることによって次の様なウ
ィルス懸濁液を生じる。これはほとんど機械的に損傷の
ない及び細分化されていない、不完全な抗原を含有する
ウィルスを有し、更に極めて僅かな異物、たとえば細胞
砕片、たん白及び脂質を含有する。このウィルス懸濁液
から残存脂質を抽出によって及びたん白をウィルスの選
択的濃縮及び（又は）沈殿によってかゆ状の均−物から
よりも極めて完全に除去することができる。
記載された処理順序によって得られたワクチンは通常の
脂汗−狂犬病ワクチンに比して９０倍はど改良されてい
る。
脂汗−狂犬病ワクチンに比して９０倍はど改良されてい
る。
しかし本発明による新規方法は動物、たとえばマウス、
ラット、ウサギ及び羊等々から狂犬病ワクチンを製造す
ることに拡大することもできる。その際標準化された種
株から狂犬病ウィルスの脳内接種によってウィルスを生
きている動物内で増殖する。しかし生きている動物内の
ウィルス増殖は家禽脂汗中でのウィルス増殖に比して次
の欠点を有する。それは生きている動物の神経組織はミ
ニリンを含有し、これはワクチンの使用にあたり脳炎に
至るまで悪化させる副反応の原因となる。
ラット、ウサギ及び羊等々から狂犬病ワクチンを製造す
ることに拡大することもできる。その際標準化された種
株から狂犬病ウィルスの脳内接種によってウィルスを生
きている動物内で増殖する。しかし生きている動物内の
ウィルス増殖は家禽脂汗中でのウィルス増殖に比して次
の欠点を有する。それは生きている動物の神経組織はミ
ニリンを含有し、これはワクチンの使用にあたり脳炎に
至るまで悪化させる副反応の原因となる。
動物から屠殺後に脳を取り出し、細胞を保護しながら微
粉砕し、得られた細胞懸濁液からワクチンを上記の本発
明による処理順序に従って製造する。
粉砕し、得られた細胞懸濁液からワクチンを上記の本発
明による処理順序に従って製造する。
ウィルス含有神経組織の微粉砕に於て細胞破壊を避ける
ことによって、ミキサーを用いる微粉砕の場合に比して
より僅かなミニリンを遊離する。ワクチン製造後の層中
で有機溶剤を用いて脂質を抽出する場合、まだ存在する
ミエリンの大部分を除去する。この様にしてほんの僅か
な許容可能な副反応しか生じないワクチンが最後に得ら
れる。
ことによって、ミキサーを用いる微粉砕の場合に比して
より僅かなミニリンを遊離する。ワクチン製造後の層中
で有機溶剤を用いて脂質を抽出する場合、まだ存在する
ミエリンの大部分を除去する。この様にしてほんの僅か
な許容可能な副反応しか生じないワクチンが最後に得ら
れる。
したがって本発明の対象は動物の神経組織、好ましくは
家禽脂汗中で狂犬病ウィルスを増殖し、神経組織又は脂
汗の頭部からウィルスを収得し、ウィルスを濃縮不活性
化し、ワクチンに加工することによって狂犬病ワクチン
を製造するにあた）、ウィルスの収得に於いてミキサー
又はブレンダーによる神経組織又は脂汗の頭部の均一化
を避け、それによってウィルスの損傷及び細分化を阻止
し、その際神経組織又は脂汗の頭部又はその内容物を細
胞の保護下に微粉砕し、この得られた細胞懸濁液から完
全な、生きたかつ増殖性ウィルスを洗い出し、得られた
ウィルス懸濁液を精製し、水と混和し得ない有機溶剤で
抽出して脱脂し、その後選択的に濃縮することを特徴と
する、前記ワクチンの製造法である。
家禽脂汗中で狂犬病ウィルスを増殖し、神経組織又は脂
汗の頭部からウィルスを収得し、ウィルスを濃縮不活性
化し、ワクチンに加工することによって狂犬病ワクチン
を製造するにあた）、ウィルスの収得に於いてミキサー
又はブレンダーによる神経組織又は脂汗の頭部の均一化
を避け、それによってウィルスの損傷及び細分化を阻止
し、その際神経組織又は脂汗の頭部又はその内容物を細
胞の保護下に微粉砕し、この得られた細胞懸濁液から完
全な、生きたかつ増殖性ウィルスを洗い出し、得られた
ウィルス懸濁液を精製し、水と混和し得ない有機溶剤で
抽出して脱脂し、その後選択的に濃縮することを特徴と
する、前記ワクチンの製造法である。
神経組織又は脂汗頭部又はその内容物の微粉砕は粗く調
整された肉挽き機を用いて細分化によって又は頭部の切
開及び取り出された脳組織の細胞保護しながら微粉砕に
よって行われる。
整された肉挽き機を用いて細分化によって又は頭部の切
開及び取り出された脳組織の細胞保護しながら微粉砕に
よって行われる。
微粉砕された組織からウィルスを洗い出す又は抽出する
ことは緩衝液を用いて、好ましくはｐＨ７−８の水性リ
ン酸塩緩衝液を用いて行われる。脂質の除去は液状の易
揮発性の、場合によりハロゲン化された炭化水素を用い
て、たとえば石油エーテル、たとえばヘプタン、フッ素
化された及び塩素化されたエタン又はそのほぼ同族体を
用いて行われる。脱脂されたウィルス懸濁液の次の濃縮
化は密度勾配遠心によって及び（又は）ポリエチレング
リコール、好ましくはＰＥＧ ６０００を用いる沈殿に
よって行わされる。
ことは緩衝液を用いて、好ましくはｐＨ７−８の水性リ
ン酸塩緩衝液を用いて行われる。脂質の除去は液状の易
揮発性の、場合によりハロゲン化された炭化水素を用い
て、たとえば石油エーテル、たとえばヘプタン、フッ素
化された及び塩素化されたエタン又はそのほぼ同族体を
用いて行われる。脱脂されたウィルス懸濁液の次の濃縮
化は密度勾配遠心によって及び（又は）ポリエチレング
リコール、好ましくはＰＥＧ ６０００を用いる沈殿に
よって行わされる。
家禽脂汗中での狂犬病ウィルスの増殖に適する家禽の種
類はカモ、ニワ） ＩＪ及びウズラである。
類はカモ、ニワ） ＩＪ及びウズラである。
一般にふ化されたカモの卵をウィルスの増殖用組織基体
として適用する。
として適用する。
本発明の対象はまたミニリンネ含狂犬病ワクチンである
。これは狂犬病ウィルスを含有する家禽脂汗頭部組織か
ら前記の細胞を保護する方法に従って得ることを特徴と
する。
。これは狂犬病ウィルスを含有する家禽脂汗頭部組織か
ら前記の細胞を保護する方法に従って得ることを特徴と
する。
本発明による方法によれば、従来公知の方法で得られた
ワクチンに比してたん白含有率と抗原含有率との改良さ
れた割合を有し、異種−脂質を含有せずかつ品質上ＨＤ
Ｃ−理想ワクチンに近い狂犬病ワクチンが得られる。
ワクチンに比してたん白含有率と抗原含有率との改良さ
れた割合を有し、異種−脂質を含有せずかつ品質上ＨＤ
Ｃ−理想ワクチンに近い狂犬病ワクチンが得られる。
この方法について詳細に説明する。
１、 ワクチン製造に適するウィルス株を家禽の卵中で
又はマウス、ラット、ウサギ又は羊等々中で脂汗細胞の
対応する継代接種によって宿主ウィルスに適合させる。
又はマウス、ラット、ウサギ又は羊等々中で脂汗細胞の
対応する継代接種によって宿主ウィルスに適合させる。
２、病原性減弱された狂犬病ウィルスをたとえば受精さ
れかつふ化された家禽卵中に植菌する。その卵中で脂汗
が発育する。約２週間後脂汗を取り出し、その頭部を収
得する。
れかつふ化された家禽卵中に植菌する。その卵中で脂汗
が発育する。約２週間後脂汗を取り出し、その頭部を収
得する。
脂汗頭部を肉挽き機中で細胞の保護下に微粉砕する又は
脳組織を細分化又は頭部の切開後、取出し、微粉砕する
。
脳組織を細分化又は頭部の切開後、取出し、微粉砕する
。
生きている動物中でウィルスの増殖を実施した場合、種
特異的に病原性減弱された種ウィルスを通常生後はんの
数日の動物（マウス、ラット、ウサギ、子羊等々）に脳
内植菌する。
特異的に病原性減弱された種ウィルスを通常生後はんの
数日の動物（マウス、ラット、ウサギ、子羊等々）に脳
内植菌する。
約１０−８０日後動物が死亡する。その脳を取り出し、
細胞の保護下に微粉砕する。微粉砕された組織から狂犬
病ウィルスの抽出はリン酸塩含有緩衝液で組織破片を洗
浄して行われる。たとえば蒸留水中にリン酸水素ジナト
リウム０．７５重量部、リン酸二水素カリウム０．１４
５重景部長び塩化す） ＩＪウム０．４８重量部を含有
するｐＩ（７，４のリン酸塩−緩衝液と共に、ウィルス
ワクチン−懸濁液の製造に慣用である安定化剤及び塩溶
液又は抽出用脱塩水さえも同様に良好に使用することが
できる。
細胞の保護下に微粉砕する。微粉砕された組織から狂犬
病ウィルスの抽出はリン酸塩含有緩衝液で組織破片を洗
浄して行われる。たとえば蒸留水中にリン酸水素ジナト
リウム０．７５重量部、リン酸二水素カリウム０．１４
５重景部長び塩化す） ＩＪウム０．４８重量部を含有
するｐＩ（７，４のリン酸塩−緩衝液と共に、ウィルス
ワクチン−懸濁液の製造に慣用である安定化剤及び塩溶
液又は抽出用脱塩水さえも同様に良好に使用することが
できる。
この際ｐＨ−値は７〜８にある。
ウィルス抗原−含有懸濁液を約１０，０００−１５．０
００ Ｘ ｇ （ｘｇは×かける重力加速度を示す。）
で遠心分画して組織から分離する。残存する組織沈殿を
次の抽出に使用することができる。それによって約３０
％のウィルス抗原−収得が可能である。２つのウィルス
含有抽出物を一緒にし、済過する。
００ Ｘ ｇ （ｘｇは×かける重力加速度を示す。）
で遠心分画して組織から分離する。残存する組織沈殿を
次の抽出に使用することができる。それによって約３０
％のウィルス抗原−収得が可能である。２つのウィルス
含有抽出物を一緒にし、済過する。
２、水と混和し得ない有機溶剤、たとえば場合によシフ
ッ素化された炭化水素で抽出して、まだウィルス懸濁液
中に残存する異種脂質を除去する。
ッ素化された炭化水素で抽出して、まだウィルス懸濁液
中に残存する異種脂質を除去する。
次いで抗原抽出物（＝ウィルス懸濁液）をそれ自体公知
の方法で１５，０００−９０，０００Ｘｇで密度勾配遠
心によって種々の濃度の緩衝−及び糖溶液を用いて、す
なわち増加する糖濃度で濃縮することによって及び（又
は）ポリエチレングリコールで沈降して濃縮する。
の方法で１５，０００−９０，０００Ｘｇで密度勾配遠
心によって種々の濃度の緩衝−及び糖溶液を用いて、す
なわち増加する糖濃度で濃縮することによって及び（又
は）ポリエチレングリコールで沈降して濃縮する。
３、密度勾配遠心を公知の方法で１５，０００〜９０．
０００Ｘｇで種々の濃度の糖溶液を用いて及び緩衝液を
用いて、すなわち増加する糖濃度で及び緩衝液中で、そ
れ自体公知の方法で実施する。これに予め精製された懸
濁液を１５、０００〜９０，０００Ｘｇ及び流動割合４
１／ｈで糖の増加する濃度の予め提示された段階的勾配
（通常１５〜５５％のショ糖）によって送入する。種々
の密度で集められた分画について密度、脂質−１核たん
白−及び抗原含有率並びに不稔性を測定する。抗原含有
分画を合併し、支度試験し、次いでワクチンに更に加工
する。夫々の種類の生理学的塩溶液、たとえばその他の
上述のリン酸塩緩衝液を希釈のために使用することがで
きる。このことに関連して次の文献が挙げられる：カモ
脂汗狂犬病ワクチン： Ｊ、Ｍ、Ｈｏ５ｋｉｎｓ Ｘ’
狂犬病の研究”、カブ２ノ Ｍ、 Ｍ、 Ｋａｐｌａｎ 等、、 ＷＨＯゲンフ１
９７３、第２７Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ ５ｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ １９７６
、４゜ｂｉｏｌ、 ５ｔａｎｄａｒｄ、、第４０巻、
第８５−４４頁。
０００Ｘｇで種々の濃度の糖溶液を用いて及び緩衝液を
用いて、すなわち増加する糖濃度で及び緩衝液中で、そ
れ自体公知の方法で実施する。これに予め精製された懸
濁液を１５、０００〜９０，０００Ｘｇ及び流動割合４
１／ｈで糖の増加する濃度の予め提示された段階的勾配
（通常１５〜５５％のショ糖）によって送入する。種々
の密度で集められた分画について密度、脂質−１核たん
白−及び抗原含有率並びに不稔性を測定する。抗原含有
分画を合併し、支度試験し、次いでワクチンに更に加工
する。夫々の種類の生理学的塩溶液、たとえばその他の
上述のリン酸塩緩衝液を希釈のために使用することがで
きる。このことに関連して次の文献が挙げられる：カモ
脂汗狂犬病ワクチン： Ｊ、Ｍ、Ｈｏ５ｋｉｎｓ Ｘ’
狂犬病の研究”、カブ２ノ Ｍ、 Ｍ、 Ｋａｐｌａｎ 等、、 ＷＨＯゲンフ１
９７３、第２７Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ ５ｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ １９７６
、４゜ｂｉｏｌ、 ５ｔａｎｄａｒｄ、、第４０巻、
第８５−４４頁。
４、付加的に又は代りに密度勾配遠心によってウィルス
濃度を増加するために、予め精製された及び通常に濃縮
されたウィルス懸濁液をポリエチレングリコールで沈殿
して更に濃縮し、精製する。すなわち特に異種たん白を
除去する。更にウィルス懸濁液のｐＨを８に調整する。
濃度を増加するために、予め精製された及び通常に濃縮
されたウィルス懸濁液をポリエチレングリコールで沈殿
して更に濃縮し、精製する。すなわち特に異種たん白を
除去する。更にウィルス懸濁液のｐＨを８に調整する。
６重量％の最終濃度になるまでポリエチレングリコール
（たとえばＰＥＧ６０００）の添加後、懸濁液を少なく
とも１時間攪拌する。
（たとえばＰＥＧ６０００）の添加後、懸濁液を少なく
とも１時間攪拌する。
１０．０００−１５，０００ Ｘｇで引き続き遠心して
ウィルスを沈殿する。ウィルス沈殿物を乳糖及び生理学
的ゼラチンを含有する溶液から成る安定化剤中に新たに
懸濁する。このことに関連して次の文献が挙げられる：
Ｅ、 Ｍ、 Ｍｉｋｈａｉｌｏｖｓｋｙ第５６８−５
６８頁： Ｊａｍｅｓ Ｍｃｓｌａｒｒｙ 等々、ウ
ィルス学、１９７０、第４０巻、第７４５−７４６頁。
ウィルスを沈殿する。ウィルス沈殿物を乳糖及び生理学
的ゼラチンを含有する溶液から成る安定化剤中に新たに
懸濁する。このことに関連して次の文献が挙げられる：
Ｅ、 Ｍ、 Ｍｉｋｈａｉｌｏｖｓｋｙ第５６８−５
６８頁： Ｊａｍｅｓ Ｍｃｓｌａｒｒｙ 等々、ウ
ィルス学、１９７０、第４０巻、第７４５−７４６頁。
５、得られたウィルス濃縮物中に含有される損傷のない
生きているかつ増殖性ウィルスを不活性化する。通常不
活性化のためにβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）を使用
する。これに関連Ａｎｎａｔｓ ｍｅｗ ｘｏｒＫＡｃ
ａａｅｍｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅｓ 。
生きているかつ増殖性ウィルスを不活性化する。通常不
活性化のためにβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）を使用
する。これに関連Ａｎｎａｔｓ ｍｅｗ ｘｏｒＫＡｃ
ａａｅｍｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅｓ 。
〈
第８８巻（１９６０） 、第５７８−９４頁。しかしそ
の他の物質もこれに適する。たとえばトリ１３２−１４
４ ： トリー（ｎ−ブチル）ホスフェＤｅｖｅｌｏｐ
、 ｂｉｏｌ、 ５ｔａｎｄａｒｄ、、第４０巻、・第
８−９頁（１９７８）。
の他の物質もこれに適する。たとえばトリ１３２−１４
４ ： トリー（ｎ−ブチル）ホスフェＤｅｖｅｌｏｐ
、 ｂｉｏｌ、 ５ｔａｎｄａｒｄ、、第４０巻、・第
８−９頁（１９７８）。
新規方法によって得られたワクチン−濃縮物は窒素ｍｇ
あたり１００よシ極めて大きい抗原−評価単位（マウス
に於て標準ＮＩＨテスト及びＲＦＦＩ Ｔテストを用い
て測定）のその高い含有率の点で市販の狂犬病ワクチン
と相異する。一般に生まれていない脂汗を使用して得ら
れる。この脂汗は痛みを感じないうえ、脂汗に於てやつ
と発育の段階にある脳組織はまだミニリンを含んでない
と考えられる。これに関連して次の文献を挙げる： 題、ヒトのウィルス性すッケチア及び細菌性疾病の効力
検定に対するワクチンの適用に関する国際会議、Ｐａｎ
、Ａｍ、 Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇ、 （ＰＡＪ（Ｏ）
。
あたり１００よシ極めて大きい抗原−評価単位（マウス
に於て標準ＮＩＨテスト及びＲＦＦＩ Ｔテストを用い
て測定）のその高い含有率の点で市販の狂犬病ワクチン
と相異する。一般に生まれていない脂汗を使用して得ら
れる。この脂汗は痛みを感じないうえ、脂汗に於てやつ
と発育の段階にある脳組織はまだミニリンを含んでない
と考えられる。これに関連して次の文献を挙げる： 題、ヒトのウィルス性すッケチア及び細菌性疾病の効力
検定に対するワクチンの適用に関する国際会議、Ｐａｎ
、Ａｍ、 Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇ、 （ＰＡＪ（Ｏ）
。
１ｂｉｄ、 第６０−６５頁。
６、不活性化後、得られたワクチンを通常小ピンに詰め
、凍結乾燥する。
、凍結乾燥する。
使用にあたり、蒸留水で溶解又は懸濁して再構成する。
記載した新規方法によって制限がないとはいえ少なくと
も十分な量の所望の価値ある無害のワクチンを経済的に
及び比較的簡単に製造することができる。ヒト二倍体細
胞（ＨＤＣ）−培養液中でウィルスを増殖して狂犬病ワ
クチンを製造する場合、これはこの基体の効率の悪さよ
って不可能である。参照： ’ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏ
ｒ １）ｉｅｓｅａｓｅ（：：ｏｎｔｒｏｌ“、ＣＤＣ
，２月１９７９：ＣＤＣはヒトー二倍体妙 細胞−狂犬病ワクチンの使用を次のヒト限定する。その
ヒ）Ｋ於ては脂汗−ワクチンの投与後、する。これに関
する理由としてヒト二倍体細胞培養の不十分な生産性が
記載されている。
も十分な量の所望の価値ある無害のワクチンを経済的に
及び比較的簡単に製造することができる。ヒト二倍体細
胞（ＨＤＣ）−培養液中でウィルスを増殖して狂犬病ワ
クチンを製造する場合、これはこの基体の効率の悪さよ
って不可能である。参照： ’ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏ
ｒ １）ｉｅｓｅａｓｅ（：：ｏｎｔｒｏｌ“、ＣＤＣ
，２月１９７９：ＣＤＣはヒトー二倍体妙 細胞−狂犬病ワクチンの使用を次のヒト限定する。その
ヒ）Ｋ於ては脂汗−ワクチンの投与後、する。これに関
する理由としてヒト二倍体細胞培養の不十分な生産性が
記載されている。
参照： Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉ
ｔｙＷｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒｔ （ＭＭＷＲ）２７．
８３３，４１３（１９７８）。
ｔｙＷｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒｔ （ＭＭＷＲ）２７．
８３３，４１３（１９７８）。
次の例１の最後に認められる様に、本発明による方法に
従って製造された狂犬病ワクチンはウィルスをヒト二倍
体細胞−培養液中で増殖されたＨＤＣ−ワクチンと少な
くとも等価である。
従って製造された狂犬病ワクチンはウィルスをヒト二倍
体細胞−培養液中で増殖されたＨＤＣ−ワクチンと少な
くとも等価である。
副作用は観察されなかった。したがって冒頭に示した本
発明の目的は医者が価格上有利な、かつにもかかわらず
理想的に有効な狂犬病ワクチン−これ直最少の副作用を
有する−を自由に使用できることを明らかに達成するこ
とである。
発明の目的は医者が価格上有利な、かつにもかかわらず
理想的に有効な狂犬病ワクチン−これ直最少の副作用を
有する−を自由に使用できることを明らかに達成するこ
とである。
例１
はワクチン製造に適するその他の狂犬病ウィルス株を本
来の使用の前にマウスに脳内継代接種及びふ化されたカ
モの卵にくり返し継代接種して脂汗細胞に適合させる。
来の使用の前にマウスに脳内継代接種及びふ化されたカ
モの卵にくり返し継代接種して脂汗細胞に適合させる。
ワクチン調製のために特に高い力価を有する継代接種か
ら成るウィルスを使用する。このウィルスはＪ、 Ｈ，
Ｈｏ５ｋｉｎｓ第２４１−５５頁；アヒル脂汗ワクチン
）の方法による狂犬病ワクチンの製造に於てすでに適す
ることが明らかである。
ら成るウィルスを使用する。このウィルスはＪ、 Ｈ，
Ｈｏ５ｋｉｎｓ第２４１−５５頁；アヒル脂汗ワクチン
）の方法による狂犬病ワクチンの製造に於てすでに適す
ることが明らかである。
健康な状態から受精されたカモの卵を３６℃±１℃の温
度で及び６５−７０％の湿度でふ卵させる。６日後、こ
れを光にあて、不適当な卵をえシ抜く。ふ卯第７日目に
狂犬病ウィルスを直接脂汗が発育する卯の卵黄嚢中に植
菌する。
度で及び６５−７０％の湿度でふ卵させる。６日後、こ
れを光にあて、不適当な卵をえシ抜く。ふ卯第７日目に
狂犬病ウィルスを直接脂汗が発育する卯の卵黄嚢中に植
菌する。
ふ卵を続ける。１０−１４日後、卵を新たにＵＶ−光線
にあてる。脂分が良好に発育する卵を無菌条件下で切開
する。脂分を取り出し、頭を切断する。頭部を個々に無
菌条件下蒸気層中で液体窒素を介して、不稔性テストが
終了するまで保存する。無菌の頭部夫々４０−６０を特
定量の安定化剤の添加下に一緒にし、集合物となす。夫
々の集合物の不稔性を新たに試験する。
にあてる。脂分が良好に発育する卵を無菌条件下で切開
する。脂分を取り出し、頭を切断する。頭部を個々に無
菌条件下蒸気層中で液体窒素を介して、不稔性テストが
終了するまで保存する。無菌の頭部夫々４０−６０を特
定量の安定化剤の添加下に一緒にし、集合物となす。夫
々の集合物の不稔性を新たに試験する。
安定化剤の他にＮａＣ１／ ！Ｊン酸塩−緩衝液（＝蒸
留水中に０．７５％リン酸水素シナ） ＩＪウム、０、
１４５％リン酸二水素カリウム及び塩化ナトｌ）ラム０
．４８％）又はｐＨ−値が７〜８の範囲内にある限り脱
塩水を含めて、ワクチンの製造に於て希釈ために一般的
であるその他の塩溶液を使用することができる。
留水中に０．７５％リン酸水素シナ） ＩＪウム、０、
１４５％リン酸二水素カリウム及び塩化ナトｌ）ラム０
．４８％）又はｐＨ−値が７〜８の範囲内にある限り脱
塩水を含めて、ワクチンの製造に於て希釈ために一般的
であるその他の塩溶液を使用することができる。
狂犬病ウィルス−抽出物を上記無菌脂分頭部を肉挽き機
で微粉砕して得る。組織破片を２回リン酸塩含有緩衝液
で洗浄する。伝染性ウィルスを１０，０００−１５，０
００ ｘｇ及び２−８℃の温度で遠心後、上澄分画の形
で集める。完全な濾過システムで引き続き濾過して、残
存する脳粒子又はその他の脂質含有組織を分離する。残
存する頭部組織残渣を同一の方法でもう一度抽出し、濾
過する。それによって約３０％の比較的高い抗原収率が
得られる。沈殿物を新たにリン酸塩含有緩衝液で懸濁し
、遠心及び濾過前に少なくとも１時間低温度（１−４℃
）で攪拌する。
で微粉砕して得る。組織破片を２回リン酸塩含有緩衝液
で洗浄する。伝染性ウィルスを１０，０００−１５，０
００ ｘｇ及び２−８℃の温度で遠心後、上澄分画の形
で集める。完全な濾過システムで引き続き濾過して、残
存する脳粒子又はその他の脂質含有組織を分離する。残
存する頭部組織残渣を同一の方法でもう一度抽出し、濾
過する。それによって約３０％の比較的高い抗原収率が
得られる。沈殿物を新たにリン酸塩含有緩衝液で懸濁し
、遠心及び濾過前に少なくとも１時間低温度（１−４℃
）で攪拌する。
（ｂ） 次の実質上完全な脱脂は得られたウィルス懸
濁液と比較的小さい密度を有する、不活性液状炭化水素
−溶剤、たとえばｎ−ヘプタンの同一容量とＩυ混合に
よって行われる。いかなる場合も窒素ガスを有する鐘形
ガラス下に均一化する。一定の流動速度（たとえば５０
０ ｍＡ／分）でつ５０ ｍｌ１分の速度で混合系に送
入する。脂質−含有層を１０，０００−１５，０００
ｘｇで遠心して分離する。
濁液と比較的小さい密度を有する、不活性液状炭化水素
−溶剤、たとえばｎ−ヘプタンの同一容量とＩυ混合に
よって行われる。いかなる場合も窒素ガスを有する鐘形
ガラス下に均一化する。一定の流動速度（たとえば５０
０ ｍＡ／分）でつ５０ ｍｌ１分の速度で混合系に送
入する。脂質−含有層を１０，０００−１５，０００
ｘｇで遠心して分離する。
次いで脱脂されたウィルス抽出物から痕跡程度の溶解さ
れた炭化水素−溶剤を除く。しかもこれは次の様に行わ
れる：不活性ガス、たとえば窒素を水性層に通気し、水
性層を約１５時間４℃で減圧下に維持する。
れた炭化水素−溶剤を除く。しかもこれは次の様に行わ
れる：不活性ガス、たとえば窒素を水性層に通気し、水
性層を約１５時間４℃で減圧下に維持する。
（Ｃ）炭化水素を用いる別の脱脂方法は次の通りである
：無菌の脂汗頭部を（１ａ）に記載した様に、微粉砕し
、抽出し、濾過する。異種脂質の分離をフッ素化された
炭化水素−溶剤、１，１．２−トリクロルトリフルオル
エタンの使用下に行う。個々の処理工程は同一である。
：無菌の脂汗頭部を（１ａ）に記載した様に、微粉砕し
、抽出し、濾過する。異種脂質の分離をフッ素化された
炭化水素−溶剤、１，１．２−トリクロルトリフルオル
エタンの使用下に行う。個々の処理工程は同一である。
２、ウィルス懸濁液の濃縮及び次の精製（ａ） 予め
精製された、上述の方法に従って調製された狂犬病ウィ
ルス−懸濁液は１０７〜１０８ＭＬＤ５０７ｍｌ の
ウィルス力価を有する。この材料を更に精製し、濃縮す
る。しかもこれは７５．０００−９０，０００ ｘｇで
線状のショ糖勾配（１５−５５％）による２倍の遠心に
よって行われる。
精製された、上述の方法に従って調製された狂犬病ウィ
ルス−懸濁液は１０７〜１０８ＭＬＤ５０７ｍｌ の
ウィルス力価を有する。この材料を更に精製し、濃縮す
る。しかもこれは７５．０００−９０，０００ ｘｇで
線状のショ糖勾配（１５−５５％）による２倍の遠心に
よって行われる。
この方法で１００ ： １の濃度ファクターが得られる
。勾配分画の糖たん白−及び核たん白含有率（トリトン
×１００によるウィルス膜の溶解前及びその後、すなわ
ち損傷のないヴイリオンの選択率）、ウィルス力価、密
度及び不稔性を試験する。狂犬病−糖たん白と核たん白
との割合−これは精製された完全なヴイリオンー溶液の
割合に相当する−及び極めて高い感染力価（たとえば１
０ １０１０Ｍ１０１Ｏ１／ｍｌ）を有する無菌の分
画を集め、次の加工処理のために取っておく。
。勾配分画の糖たん白−及び核たん白含有率（トリトン
×１００によるウィルス膜の溶解前及びその後、すなわ
ち損傷のないヴイリオンの選択率）、ウィルス力価、密
度及び不稔性を試験する。狂犬病−糖たん白と核たん白
との割合−これは精製された完全なヴイリオンー溶液の
割合に相当する−及び極めて高い感染力価（たとえば１
０ １０１０Ｍ１０１Ｏ１／ｍｌ）を有する無菌の分
画を集め、次の加工処理のために取っておく。
（ｂ） ウィルス懸濁液の次の精製及び濃縮はポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）−沈殿で達成される。
チレングリコール（ＰＥＧ）−沈殿で達成される。
更にＰＥＧ６０００ （シークフリート社製、ツオフ
イゲン、スイス）を３０％リン酸塩−含有緩衝液（ｐＨ
８，０）中に溶解する。このＰＥＧ−母溶液をオートク
レーブ中で滅菌し、４℃で保存する。
イゲン、スイス）を３０％リン酸塩−含有緩衝液（ｐＨ
８，０）中に溶解する。このＰＥＧ−母溶液をオートク
レーブ中で滅菌し、４℃で保存する。
１０％ＮａＯＨ−溶液を用いて８．０のｐＨ−値に調整
したウィルス懸濁液をＰＥＧ−母溶液を用いて６％の最
終希釈率で沈殿する。混合物を４“Ｃの温度で少なくと
も１時間攪拌する。次いで狂犬病ウィルスを３０分かけ
て１０，０００−１５．０００ ｘｇの速度で遠心して
沈降させる。分離されたウィルスを新たに安定化剤を用
いて最終容量にふやし、次の加工処理のために取ってお
く。
したウィルス懸濁液をＰＥＧ−母溶液を用いて６％の最
終希釈率で沈殿する。混合物を４“Ｃの温度で少なくと
も１時間攪拌する。次いで狂犬病ウィルスを３０分かけ
て１０，０００−１５．０００ ｘｇの速度で遠心して
沈降させる。分離されたウィルスを新たに安定化剤を用
いて最終容量にふやし、次の加工処理のために取ってお
く。
３、ウィルス濃縮物の形成
予めテストされたウィルス濃縮物を一緒にし、適する安
定化剤、たとえばリン酸す）ＩＪウムー緩衝液（ＰＨ７
−４）Ｎ生理食塩溶液を用いて、あるいはその他の前記
安定化剤（Ｈｏ５ｋｉｎｓ 、 ｌ、 ｃ参照）を用い
て約１０８・５ＭＬＤ５ｏ／ｍｌの濃度に希釈する。不
稔性及びウィルス力価を新たに試験する。
定化剤、たとえばリン酸す）ＩＪウムー緩衝液（ＰＨ７
−４）Ｎ生理食塩溶液を用いて、あるいはその他の前記
安定化剤（Ｈｏ５ｋｉｎｓ 、 ｌ、 ｃ参照）を用い
て約１０８・５ＭＬＤ５ｏ／ｍｌの濃度に希釈する。不
稔性及びウィルス力価を新たに試験する。
β−プロピオラクトンで不活性化するために、ウィルス
懸濁液の最終容量を一定の攪拌下に１−４℃の温度で維
持する。１ ： ４０００の濃度を得るために、多量の
新たに調製された水冷却された水性β−プロピオラクト
ン−溶液を加える。
懸濁液の最終容量を一定の攪拌下に１−４℃の温度で維
持する。１ ： ４０００の濃度を得るために、多量の
新たに調製された水冷却された水性β−プロピオラクト
ン−溶液を加える。
懸濁液を５分間４℃の温度で攪拌した後、第二容器中に
移し、更に４０時間攪拌する。ｐＨ−値及び温度を一定
にコントロールする。ｐＨ−値の減少はＢＰＬ−加水分
解に対する度合である。これは次のことを示す。ｐＨ−
値は約８．０から約７．４に下る。不活性化の最後にチ
オメルザール（０−（エチル水銀チオ）−安息香酸）を
この抗敗血性物質の濃度が１ ： １００００になるま
で加える。
移し、更に４０時間攪拌する。ｐＨ−値及び温度を一定
にコントロールする。ｐＨ−値の減少はＢＰＬ−加水分
解に対する度合である。これは次のことを示す。ｐＨ−
値は約８．０から約７．４に下る。不活性化の最後にチ
オメルザール（０−（エチル水銀チオ）−安息香酸）を
この抗敗血性物質の濃度が１ ： １００００になるま
で加える。
５、凍結乾燥
第４欄によって得られた不活性ウィルス懸濁液を１ｍｌ
の個々の用量で８ｒｒｄｌ小ピン・中に詰め、凍結乾燥
用枠をゆるくはめこみ、ワクチンを減圧で凍結乾燥する
。乾燥工程の終了後、栓をかたく締め、小ピンを栓がし
つかシビンに固定される様に金属キャップで密閉する。
の個々の用量で８ｒｒｄｌ小ピン・中に詰め、凍結乾燥
用枠をゆるくはめこみ、ワクチンを減圧で凍結乾燥する
。乾燥工程の終了後、栓をかたく締め、小ピンを栓がし
つかシビンに固定される様に金属キャップで密閉する。
−２０℃の温度で小ピンを保存する。
使用のために、滅菌蒸留水１ｍＡ？を小ピンのゴム栓か
ら注入する。次いで小ピンを慎重に泡が生じない様にワ
クチンが完全に溶解するまで振盪する。次いで小ピンの
内容物全体を上腕の皮下組織に注射する。
ら注入する。次いで小ピンを慎重に泡が生じない様にワ
クチンが完全に溶解するまで振盪する。次いで小ピンの
内容物全体を上腕の皮下組織に注射する。
７、最終生成物の品質調節
品質調節は次のことを包含する：抗原作用、不稔性、不
活性度、無毒性、窒素−及びコレステリン含有率、Ｎａ
Ｃ１，ＢＰＬ−残渣及びチオメルザールの測定。
活性度、無毒性、窒素−及びコレステリン含有率、Ｎａ
Ｃ１，ＢＰＬ−残渣及びチオメルザールの測定。
（ＵＳＡ）の標準法に従って試験する。更にこれをＲＦ
ＦＩＴ−テスト抗体と結合するその能力についＴｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｒａｂｉｅｓ 、第３版、ｗｍモ
ノゲラフシグラフシリーズ２３、第３５４〜３５７頁、
１９７３参照〕 不稔性：使用されるすべての最終生成物が不稔であるこ
とは明白である。
ＦＩＴ−テスト抗体と結合するその能力についＴｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｒａｂｉｅｓ 、第３版、ｗｍモ
ノゲラフシグラフシリーズ２３、第３５４〜３５７頁、
１９７３参照〕 不稔性：使用されるすべての最終生成物が不稔であるこ
とは明白である。
不活性：これをすべての場合、若いウサギ３匹及びマウ
ス１０匹についてテストする。これは再構成されたワク
チンの脳内接種後１４日間観察される。動物はどんな疾
病症状も全く示さない。
ス１０匹についてテストする。これは再構成されたワク
チンの脳内接種後１４日間観察される。動物はどんな疾
病症状も全く示さない。
無毒性：モルモット３匹に再構成されたワクチン溶液５
ｍｌを腹腔内投与し、マウス３匹に０、５ ｍｌを腹腔
内投与する。
ｍｌを腹腔内投与し、マウス３匹に０、５ ｍｌを腹腔
内投与する。
動物はどれも規則に返する反応を示さない。
上述に従って、凍結乾燥された形で得られたワクチンの
安定性：記載した温度で８ケ月貯蔵した後の有効性（出
発値（０値）の％に於てＡＧＶ−Ｕ／ｍ１） （ａ） 例１（２ａにより濃縮化）により得られた、
凍結乾燥された形でのワクチンの安定性。
安定性：記載した温度で８ケ月貯蔵した後の有効性（出
発値（０値）の％に於てＡＧＶ−Ｕ／ｍ１） （ａ） 例１（２ａにより濃縮化）により得られた、
凍結乾燥された形でのワクチンの安定性。
投与ＮＯ０〇−値 ＋３７℃ ＋３７℃ＡＧＶ−Ｕ
／ｍ１ １ケ月 ２ケ月 ８３ Ｌｙ ｍ Ｔ１６ ６，７ １０８％ １
１０％８８ Ｌｙ ｍ Ｔ１８− ７，３ ９３
％ ９２％（ｂ） 例１ （２ｂにより濃縮化）
により得られた、凍結乾燥された形でのワクチンの安定
性。
／ｍ１ １ケ月 ２ケ月 ８３ Ｌｙ ｍ Ｔ１６ ６，７ １０８％ １
１０％８８ Ｌｙ ｍ Ｔ１８− ７，３ ９３
％ ９２％（ｂ） 例１ （２ｂにより濃縮化）
により得られた、凍結乾燥された形でのワクチンの安定
性。
有効性（出発値（０値）の％に於いてＡＧＶ−Ｕ／ｍｌ
）投与ＮＯ１〇−値 ＋３７℃ ＋３７℃８８ Ｌ
ｙｍＴ１５ ５．Ｏｔ４８％ ９８％８８
Ｌｙ ＩＩＩ Ｔ１９ ８，２ １０７％
１０４％８８ Ｌｙ ｍＴ２Ｏ９，７１４４％
７６％８１ Ｌｙ ｍＴ２１ １５．３
１２４％ ９２％８８ Ｌｙ ｍＴ２２
８．５ １６５％ １０５％８８ＬｙｍＴ２
８ １８．４ １０５％ １１２％（Ｃ
） 下 ′の ・ｌ ｌ ’つ ′右欄の数
より多くの 犬７匹による 犬８匹による０、５ Ｉ
Ｅ １００％ １００％１
８６％ ８８％２
４３％ ７５％ＩＥ＝抗体含有量の国際単
位 （ｄ ヒトに・ る １１ よつ ′ ・ ゛病ワ
クチン 新規ワクチンの有効性はＨＤＣワクチン（べ−リング）
の有効性とも同一である。次表にこのワクチンの１つを
投与した後、抗体の形成と共に反応するヒトのパーセン
ト割合を示す。この際０．５ ＩＥは一般に効能がある
と認められる（０．３，７，１４．２８日に接種）。
）投与ＮＯ１〇−値 ＋３７℃ ＋３７℃８８ Ｌ
ｙｍＴ１５ ５．Ｏｔ４８％ ９８％８８
Ｌｙ ＩＩＩ Ｔ１９ ８，２ １０７％
１０４％８８ Ｌｙ ｍＴ２Ｏ９，７１４４％
７６％８１ Ｌｙ ｍＴ２１ １５．３
１２４％ ９２％８８ Ｌｙ ｍＴ２２
８．５ １６５％ １０５％８８ＬｙｍＴ２
８ １８．４ １０５％ １１２％（Ｃ
） 下 ′の ・ｌ ｌ ’つ ′右欄の数
より多くの 犬７匹による 犬８匹による０、５ Ｉ
Ｅ １００％ １００％１
８６％ ８８％２
４３％ ７５％ＩＥ＝抗体含有量の国際単
位 （ｄ ヒトに・ る １１ よつ ′ ・ ゛病ワ
クチン 新規ワクチンの有効性はＨＤＣワクチン（べ−リング）
の有効性とも同一である。次表にこのワクチンの１つを
投与した後、抗体の形成と共に反応するヒトのパーセン
ト割合を示す。この際０．５ ＩＥは一般に効能がある
と認められる（０．３，７，１４．２８日に接種）。
０．５・ＩＥ １００％ １００％ １０
０％２ ９８％ １００％ １００％５
８０％ ８０％ ８０％１０４５％
６０％ ５０％ 結果：本発明による方法に従って製造された狂犬病ワク
チンはＨＤＣ−ワクチンの臨床試験で、すなわちウィル
スをヒト二倍体細胞（ＨＤＣ）−培養液で増殖したワク
チンと少なくとも同等であることが認められる。
０％２ ９８％ １００％ １００％５
８０％ ８０％ ８０％１０４５％
６０％ ５０％ 結果：本発明による方法に従って製造された狂犬病ワク
チンはＨＤＣ−ワクチンの臨床試験で、すなわちウィル
スをヒト二倍体細胞（ＨＤＣ）−培養液で増殖したワク
チンと少なくとも同等であることが認められる。
例２
カモ脂汗−ワクチンの製造
例１に従って狂犬病ウィルスをふ化されたカモの卵生で
増殖する。
増殖する。
ウィルスを脂汗頭部から頭部の切断、脳組織の取り出し
、細胞保護による微粉砕によって除去し、リン酸塩緩衝
液中に懸濁１７て収得する。
、細胞保護による微粉砕によって除去し、リン酸塩緩衝
液中に懸濁１７て収得する。
ウィルス懸濁液を例１により更にワクチンに加工する。
例３
カモ脂汗−ワクチン
例１による高濃度ウィルス懸濁液の製造。
トリー（ｎ−ブチル）−ホスフェートで処理して狂犬病
ワクチンを不活性化する。不活性化後、濃縮物を凍結乾
燥する。
ワクチンを不活性化する。不活性化後、濃縮物を凍結乾
燥する。
例４
鶏卵を７日間３６℃±１℃及び湿度６０−７５％でふ卵
する。ふ卵の７日目に接種ウィルスを直接卵生の発育す
る給仕の卵黄嚢に植菌する。
する。ふ卵の７日目に接種ウィルスを直接卵生の発育す
る給仕の卵黄嚢に植菌する。
ふ卯を続ける。１０日後、卵を切開し、給仕を取り出す
。給仕を切り分ける。頭、を髄及び胴を別々に処理する
。１０％組織組織−液を生じる様にこれらを微粉砕する
（すなわち１０重量％胎脂汗織を有する懸濁液）。ウィ
ルス濃度をＲＦＦ Ｉ Ｔ−テスト（Ｒａｐｉｄ Ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｆｏｃｕｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏ
ｎＴｅｓｔ） で滴定測定する。
。給仕を切り分ける。頭、を髄及び胴を別々に処理する
。１０％組織組織−液を生じる様にこれらを微粉砕する
（すなわち１０重量％胎脂汗織を有する懸濁液）。ウィ
ルス濃度をＲＦＦ Ｉ Ｔ−テスト（Ｒａｐｉｄ Ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｆｏｃｕｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏ
ｎＴｅｓｔ） で滴定測定する。
３つのテスト検体で行う。結果を次表に示す。
頭 ４，２５／４，４ ＆ ４．８
を髄 、９．５５ ＆ ４．８胴
３，０ ７３，６ ＆ ３．８ＩＤ５０７
ｍｌ＝組織培養の５０％の感染のために少なくとも必要
な濃度に対するウイルスカ価×ｌｏｇ１ｏ０中枢神経系
（ＺＮＳ ）の組織はＺＮＳのない胴に比して約１０倍
多く含有する。
を髄 、９．５５ ＆ ４．８胴
３，０ ７３，６ ＆ ３．８ＩＤ５０７
ｍｌ＝組織培養の５０％の感染のために少なくとも必要
な濃度に対するウイルスカ価×ｌｏｇ１ｏ０中枢神経系
（ＺＮＳ ）の組織はＺＮＳのない胴に比して約１０倍
多く含有する。
この結果に基づきニワｌ−ＩＪ胎脂汗ワクチンの製造は
例１に記載された方法に従って脂汗頭部からのみ行われ
る。
例１に記載された方法に従って脂汗頭部からのみ行われ
る。
この場合ニワトリ細胞に適合された狂犬病つ第２６章、
第２３５−２４２頁の方法に従って行われる。ふ卯の７
日目に卵に植菌する。。次の日更に植菌する。卵黄嚢中
にウィルスを植菌後９〜１０日してニワ） ＩＪ胎脂汗
頭部を取り出し、例１に記載した方法で処理する。その
際ウィルスの最終濃縮をポリエチレングリコールで沈殿
して行う。この様に製造されたワクチンを１．７に記載
した品質コントロールに付す。このワクチンもヒトに完
全に有効である。
第２３５−２４２頁の方法に従って行われる。ふ卯の７
日目に卵に植菌する。。次の日更に植菌する。卵黄嚢中
にウィルスを植菌後９〜１０日してニワ） ＩＪ胎脂汗
頭部を取り出し、例１に記載した方法で処理する。その
際ウィルスの最終濃縮をポリエチレングリコールで沈殿
して行う。この様に製造されたワクチンを１．７に記載
した品質コントロールに付す。このワクチンもヒトに完
全に有効である。
例５
ウズラ脂汗−ワクチンの製造
例１に記載したのと同様に、病原性減弱された狂犬病ウ
ィルスを受精したウズラ卵生で増殖し、収得し、ワクチ
ンに後処理する。
ィルスを受精したウズラ卵生で増殖し、収得し、ワクチ
ンに後処理する。
得られたワクチンは動物実験で□全く有効である。
例６
生後５日目のマウスに脳内接種する。
１０日後、まだ生き残るマウスを殺す。動物の脳を取り
出し、細胞保護下に微粉砕する。細胞懸濁液を例１の方
法に従ってワクチンに加工する。
出し、細胞保護下に微粉砕する。細胞懸濁液を例１の方
法に従ってワクチンに加工する。
例７
生後３−４日目のラットに脳内接種する。
１２日後、まだ生き残るラットを殺す。動物の脳を例６
に準じてワクチンに加工する。
に準じてワクチンに加工する。
例８
後６日目のウサギに脳内接種する。
１５日後ウサギを殺す。動物の脳を例６に準じてワクチ
ンに加工する。
ンに加工する。
例９
生後８−１００日目小羊に脳内接種する。
３０日後小羊を殺す。その脳を取り出し、例６に準じて
ワクチンに加工する。
ワクチンに加工する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）動物の神経組織、主に家禽胎仔中で狂犬病ウィルス
を増殖し、神経組織又は胎仔の頭部からウィルスを収得
し、ウィルスを濃縮し、不活性化し、ワクチンに加工す
ることによつて狂犬病ワクチンを製造するあたり、ウィ
ルスの収得に於いてミキサー又はブレンダーによる神経
組織又は胎仔の頭部の均一化を避け、それによつてウィ
ルスの損傷及び細分化を阻止し、その際神経組織又は胎
仔の頭部又はその内容物を細胞の保護下に微粉砕し、こ
の得られた細胞懸濁液から完全な、生きたかつ増殖性ウ
ィルスを洗い出し、得られたウィルス懸濁液を精製し、
水と混和し得ない有機溶剤で抽出して脱脂し、その後選
択的に濃縮することを特徴とする、前記ワクチンの製造
法。 ２）ウィルスを家禽胎仔中で増殖し、その後ウィルス含
有胎仔頭部を肉挽き機で微粉砕する又は細切するあるい
は頭部の切開後、脳組織を取り出し、その後細胞の保護
下に微粉砕する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）ウィルスを微粉砕された組織から、緩衝液、好まし
くはｐＨ７〜８の水性緩衝液で洗い出す又は抽出する特
許請求の範囲第１項記載の方法。 ４）脂質の抽出のために溶剤として液状、易揮発性、場
合によりハロゲン化された炭化水素を使用する特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ５）溶剤として石油エーテル、好ましくはヘプタン、フ
ッ素化されたかつ塩素化されたエタン又はその近い同族
体を使用する特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６）脱脂質されたウィルス懸濁液を密度勾配遠心によつ
て及び（又は）ポリエチレングリコール、好ましくはＰ
ＥＧ６０００で沈殿して、次に濃縮する特許請求の範囲
第１項記載の方法。 ７）狂犬病ウィルスの増殖のためにふ化された、カモ、
ニワトリ又はウズラの卵を使用する特許請求の範囲第１
項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH04999/85-9 | 1985-11-22 | ||
| CH499985 | 1985-11-22 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62129225A true JPS62129225A (ja) | 1987-06-11 |
| JPH0586934B2 JPH0586934B2 (ja) | 1993-12-14 |
Family
ID=4286207
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61276881A Granted JPS62129225A (ja) | 1985-11-22 | 1986-11-21 | 狂犬病ワクチンの製造法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0222974B1 (ja) |
| JP (1) | JPS62129225A (ja) |
| AT (1) | ATE69383T1 (ja) |
| AU (1) | AU593041B2 (ja) |
| CA (1) | CA1271708A (ja) |
| DE (1) | DE3682482D1 (ja) |
| ES (1) | ES2000065A6 (ja) |
| PT (1) | PT83543B (ja) |
| ZA (1) | ZA866846B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003522740A (ja) * | 1999-12-23 | 2003-07-29 | アルバ・インターナショナル・プロプライアタリ・リミテッド | 感染性疾患を治療する方法 |
| JP2004507462A (ja) * | 2000-06-29 | 2004-03-11 | リピド サイエンスィズ インコーポレイテッド | 感染性疾患の処置及び防御方法 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AUPN030794A0 (en) | 1994-12-22 | 1995-01-27 | Aruba International Pty Ltd | Discontinuous plasma or serum delipidation |
| US20090017069A1 (en) | 2000-06-29 | 2009-01-15 | Lipid Sciences, Inc. | SARS Vaccine Compositions and Methods of Making and Using Them |
| WO2005016246A2 (en) * | 2003-06-20 | 2005-02-24 | Lipid Sciences, Inc. | Modified viral particles with immunogenic properties and reduced lipid content useful for treating and preventing infectious diseases |
| JP2007527387A (ja) * | 2003-07-03 | 2007-09-27 | リピッド サイエンシーズ，インコーポレイテッド | 脂質含量の低下したｈｄｌの粒子誘導体を製造するための方法及び装置 |
| US7393826B2 (en) | 2003-07-03 | 2008-07-01 | Lipid Sciences, Inc. | Methods and apparatus for creating particle derivatives of HDL with reduced lipid content |
| US11027052B2 (en) | 2017-11-22 | 2021-06-08 | HDL Therapuetics, Inc. | Systems and methods for priming fluid circuits of a plasma processing system |
| JP2021509894A (ja) | 2017-12-28 | 2021-04-08 | エイチディーエル セラピューティクス インコーポレイテッドＨｄｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． | ヒト血漿から抽出されたｐｒｅ−β高密度リポタンパク質を保存および投与するための方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3143470A (en) * | 1961-04-24 | 1964-08-04 | Parke Davis & Co | Rabies virus propagation in embryonic cells maintained in a medium containing pancreatic digest of casein |
| CH638985A5 (de) * | 1979-04-10 | 1983-10-31 | Schweiz Serum & Impfinst | Verfahren zur herstellung eines tollwutimpfstoffes und danach erhaltener impfstoff. |
| US4347239A (en) * | 1980-07-30 | 1982-08-31 | Norden Laboratories, Inc. | Inactivated rabies vaccine for veterinary use |
-
1986
- 1986-07-23 DE DE8686110116T patent/DE3682482D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-23 EP EP86110116A patent/EP0222974B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-23 AT AT86110116T patent/ATE69383T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-07-30 ES ES8600731A patent/ES2000065A6/es not_active Expired
- 1986-09-05 CA CA000517612A patent/CA1271708A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-09-09 ZA ZA866846A patent/ZA866846B/xx unknown
- 1986-10-14 PT PT83543A patent/PT83543B/pt unknown
- 1986-11-21 JP JP61276881A patent/JPS62129225A/ja active Granted
- 1986-11-21 AU AU65630/86A patent/AU593041B2/en not_active Ceased
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP2003522740A (ja) * | 1999-12-23 | 2003-07-29 | アルバ・インターナショナル・プロプライアタリ・リミテッド | 感染性疾患を治療する方法 |
| JP2004507462A (ja) * | 2000-06-29 | 2004-03-11 | リピド サイエンスィズ インコーポレイテッド | 感染性疾患の処置及び防御方法 |
| JP2010077135A (ja) * | 2000-06-29 | 2010-04-08 | Eli Lilly & Co | 感染性疾患の処置及び防御方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0222974A3 (en) | 1989-06-14 |
| CA1271708A (en) | 1990-07-17 |
| AU593041B2 (en) | 1990-02-01 |
| ZA866846B (en) | 1987-04-29 |
| AU6563086A (en) | 1987-05-28 |
| DE3682482D1 (de) | 1991-12-19 |
| EP0222974B1 (de) | 1991-11-13 |
| EP0222974A2 (de) | 1987-05-27 |
| ATE69383T1 (de) | 1991-11-15 |
| JPH0586934B2 (ja) | 1993-12-14 |
| PT83543A (fr) | 1986-11-01 |
| ES2000065A6 (es) | 1987-11-16 |
| PT83543B (pt) | 1988-11-30 |
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |