JP2010077135A - 感染性疾患の処置及び防御方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】脂質含有感染性生物から脂質を抽出するのに有用な溶媒を用い、それにより感染性生物の感染性を低減させる。また感染性生物の脂質含量を低減させるため溶媒で処理した脂質含有感染性生物を、医薬適合性の担体と組み合わせて含んでなるワクチン組成物をも提供する。ワクチン組成物を動物またはヒトに投与して脂質含有感染性生物に対する保護法。
【選択図】なし
Description
本発明の方法で処置できる感染性生物には脂質を含有する感染性生物などがある。かかる感染性生物には、これらに限定されないがウイルス及び細菌などがあり、ただしウイルスまたは細菌は、各々ウイルスエンベロープまたは細菌細胞壁に脂質を含有する。本発明の方法は感染性生物の感染性を低減し、またこれらの生物に対するワクチンをも提供する。
「液体」なる用語は、これらに限定されないが動物またはヒトのごとき生物から得られる体液などの、感染性生物を含有するいずれかの液体を意味する。生物から得られるかかる体液には、これらに限定されないが血漿、血清、脳脊髄液、リンパ液、腹膜液、卵胞液、羊水、胸膜液、心膜液、生殖液及び生物に含まれるいずれか別の液体などがある。別の液体は、いずれかの選択された液体に懸濁された感染性生物を含む実験用サンプルを含んでよい。別の液体には細胞培養試薬が含まれ、その多くは、生きている生物から得られる液体のごとき生物学的化合物を含み、これらに限定されないが種々動物から得られ、細胞及び組織培養適用で成長培地として用いられる「正常血清」などがある。
溶媒またはその組み合わせが脂質の可溶化に有効である場合、脂質含有生物、とりわけ感染性生物から脂質を除去するために本発明の方法において多くの有機溶媒を使用することができる。適当な溶媒は炭化水素、エーテル、アルコール及びアミンの混合物を含んでなる。本発明の方法で使用できる別の溶媒にはアミン及びアミンの混合物などがある。好ましい溶媒はアルコール及びエーテルの組み合わせである。もう1つの好ましい溶媒はエーテルまたはエーテルの組み合わせを含んでなる。溶媒または溶媒の組み合わせが比較的低沸点を有し、真空及びおそらく加熱との組み合わせにより除去を促進するのが好ましい。
処置された脂質含有生物、例えば感染性生物を用いてワクチンを製造するために、異なる溶媒及び溶媒の組み合わせを脂質含有生物、例えば感染性生物を処置するのに使用することができる。このセクションではこれらの溶媒及びその組み合わせについて記載する。適当な溶媒は炭化水素、エーテル、アルコール、アミン、界面活性剤、エステル及びその組み合わせからなる。
前記したように、液体中の脂質含有生物のレベルまたは感染性を低下させるために本発明の方法で種々の体液を使用できる。本発明の好ましい実施形態では、動物またはヒトから得られた血漿を、血漿中の脂質含有感染性生物の濃度及び/または感染性を低減させるために本発明の方法で処置することができる。この実施形態では公知の方法を用いて動物またはヒトから血液を抜き取り、血漿から血液の細胞成分(赤血球及び白血球)を分離するために、血液を通常の方法で処置することにより、動物またはヒトから血漿を得ることができる。かかる方法は当業者に公知であり、遠心及び濾過を含む。
部分的にまたは実質的に脱脂された感染性生物またはその構成成分を医薬適合性の担体と組み合わせてワクチンを含んでなる組成物を製造する。このワクチン組成物を場合によっては免疫刺激剤と組み合わせて動物またはヒトに投与する。ワクチン組成物は1つ以上の部分的にまたは実質的に脱脂された感染性生物またはその構成成分を含有し、ワクチン接種後に1つまたはそれ以上の疾患に対する保護を提供することは理解される。かかる組み合わせを望ましい免疫性に従って選択できる。例えば、HIV及び肝炎の組み合わせ、またはインフルエンザと肝炎の組み合わせでよい。生物の残りの粒子は脱脂された体液に保持され、動物またはヒトに再導入された場合、恐らく食細胞により摂食される。脱脂処置により単離され影響を受ける粒子の数は処置の前後の粒子の計数により決定される。
脱脂された生物を動物またはヒトに投与する場合、典型的には医薬適合性の単体と組み合わせてワクチンを製造し、場合によっては当業者に公知の免疫刺激剤と組み合わせる。
本発明のワクチンをヒトまたは動物に投与することができる。ワクチンの投与に最適な時間は最初の感染の約1から3か月前である。しかしながらワクチンを最初の感染の後に投与して疾患の進行を改善するか、または最初の感染後に疾患を処置することもできる。
当業者に公知の種々のアジュバントをワクチン組成物のタンパク質と一緒に投与することができる。かかるアジュバントには、これらに限定されないが以下のものがある:ポリマー、コポリマー、例えばポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、遮断コポリマーを含む;ポリマーP1005;モノタイドISA72;フロイント完全アジュバント(動物用);フロイント不完全アジュバント;モノオレイン酸ソルビタン;スクワレン;CRL−8300アジュバント;ミョウバン;QS21、ムラミールジペプチド;トレハロース;細菌抽出物、ミコバクテリウム抽出物を含む;無毒化エンドトキシン;膜脂質;またはその組み合わせ。
DHBVの106 ID50用量を含有する標準的なアヒル血清プール(カムデン)を用いた。ID50はその用量で処置された動物の50%を感染するのに有効な感染性用量(ID)として当業者に公知である。孵化の日にDHBV陰性群から21匹の雛アヒルを入手した。これらの雛アヒルを購入時に試験し、ドットブロットハイブリダイゼーションによりDHBV DNA陰性であることが示された。
標準的なウシペスチウイルス単離体(BVDV)をこれらの実験で使用した。この単離体「ヌメレラ(Numerella)」BVDウイルスを、1987年、オーストラリア、ニュー・サウス・ウェールズ、ベガ地区の農場の「粘膜病」の典型例から提出された診断用標本から単離した。このウイルスは非細胞変性であり、型別試薬としてエリザベス・マッカーサー農業研究所(EMAI)、NSW(オーストラリア)で作製したモノクローナル抗体のパネルの12個全てと反応させる。従ってこのウイルスはオーストラリアBVDウイルスの「標準株」を表す。
106.8ウイルス粒子/mlを含有する組織培養上清100mlを150cm2組織培養フラスコから収穫した。遠心により上清を清澄化し(細胞砕片を3000rpm、4℃で10分)、動物接種のための陽性対照(非不活化ウイルス)として取っておく。残りの107.5感染性ウイルスを含有する90mlを以下のプロトコルを用いて不活性化した。簡単には、ブタノール:ジイソプロピルエーテル(2:1)180mlを加え、渦巻きにより混合した。次いで500mlコニカルフラスコ中混合物をオービタルシェーカーで30rpm、室温で60分間振盪した。次いで400xg、4℃で10分間遠心し、有機溶媒相を除去し、廃棄した。次の工程では、底部層(水相)を有機相の下から除去し、収量がかなり改善された。
2.1組織培養接種
約107.1と予測されるウイルス等価物を含有する溶媒不活性化ウイルス調製物2mlを、10%試験済み成熟ウシ血清を含有する組織培養培地最小イーグル培地(MEM)8mlと混合し、25cm2組織培養フラスコ中MDBK細胞の単層に60分間吸収させた。陽性対照として非不活化ウイルス(同一量の生存感染性ウイルス)2mlを同様に25cm2組織培養フラスコ中MDBK細胞に吸収させた。60分後、上清を双方のフラスコから除去し、正常な成長培地(+10%ABS)と置換した。次いでMDBK細胞が固定される前に、細胞を標準条件下5日間成長させ、標準的なイムノペルオキシダーゼプロトコルを用いて6BVDV特異的モノクローナル抗体の混合物で染色した(2つの異なるBVDウイルスタンパク質と反応するEMAIパネル)。
さらにもっと感受性の高いインビボ試験は不活性化ウイルス調製物を未処置(抗体陰性)ウシに接種することである。かかる動物に皮下注射したできるだけ小さな感染性ウイルス粒子が、細胞内に侵入し、ウイルス複製がBVDVに極めて効率的であれば感染性ウシ用量であると考えられる。
実施例2に記載した不活性化BVDV調製物の初期用量4.5mlを投与された6匹の去勢ウシ全てに第1回目の初回抗原刺激投与後4週に類似用量を皮下に再注射した。このときに1回投与後の抗体応答はなかった。動物は通常第2回目の投与の後に反応する。不活性化ウイルスの第2回投与後2週に6匹中3匹の去勢ウシで抗E2抗体レベルに強い既往性の応答(中和抗体SNTと同等)が観察された。この応答は競合ELISAにおける阻止の70%以上であった。残りの3匹の動物は弱い抗体応答を示した(23から31%阻止)。
ジイソプロピルエーテル(DIPE)/ブタノール及びDIPE単独で、60分、1分及び30秒間脱脂を行った。標準的な微細構造の免疫細胞化学技術を使用した。ウシ血清アルブミンを1%の濃度で遮断溶液として使用し、抗体をこの溶液で希釈し、サンプルを室温で15分間インキュベートした。金標識プロテインAをバイオセル(英国)より購入した。
アヒルB型肝炎ウイルス(DHBV)に対するワクチンを提供するための脱脂手順の効率を試験した。
有機溶媒系を用いて血清の脱脂を行った。溶媒系は40%ブタノール(分析試薬の等級)及び60%ジイソプロピルエーテルからなる。この溶媒を2:1の比率で血清と混合した。従って、有機溶媒4mlを血清2mlと混合して1時間回転させた。この混合物をおよそ400xgで10分間遠心し、水相を除去した。次いで水相を等容量のジエチルエーテルと混合し、400xgで10分間遠心した。次に、水相を除去し、等容量のジエチルエーテルと、30rpmで約1時間ひっくり返して回転させて混合し、400xgで10分間遠心した。水相を除去し、残留ジエチルエーテルをおよそ10から30分間ヒュームキャビネットで蒸発させることにより除去した。ジエチルエーテルの除去の後に残ったものを処置された血清と考え、ワクチンの製造に使用した。脱脂手順の対照は、DHBV陰性血清をDHBV陽性血清と同一の脱脂手順に供することを含む。
被験ワクチン:
第1回投与−脱脂血清の40μlアリコートをリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)1960μlと混合した。
第1回投与−DHBV陽性血清プール#4(20.4.99)の200μlアリコートをPBS 300μl及び2%グルタルアルデヒド溶液(ホワイトレイ・ケミカルズのアイダル・プラス)100μlと混合し、10分間インキュベートし、DHBVを不活性化した。不活性化した血清/PBS混合物の40μlアリコートをPBS 1960μlに加えた。
第1回投与−PBS
第2回及び第3回投与−PBS混合物の2000μlアリコートをフロイント不完全アジュバント1000μl中で乳化した。
孵化の日付:23.10.00
ワクチン接種プロトコル:第1回投与−孵化後8日にアヒルの腹膜腔に各々のワクチン200μlを注射した。第2回投与−孵化後16日に各々のワクチン300μlをアヒルの筋肉内にワクチン接種した。第3回投与−孵化後22日に各々のワクチン300μlをアヒルの筋肉内にワクチン接種した。
被験ワクチン
被験ワクチンでワクチン接種した6匹の被験アヒルのうち5匹の被験アヒルが対抗後、血清及び肝臓でDHBV DNAに関して陰性のままであった。1匹の被験アヒルは対抗後、DHBVに関して陽性になった。
被験アヒルグルタルアルデヒド不活化血清でワクチン接種した4匹の被験アヒルの全てが対抗後、DHBVに関して陽性になった。
6匹の偽ワクチン接種した陰性対照アヒルのうち5匹が対抗後DHBV陽性になった。
Claims (28)
- 脂質含有感染性生物を含有する液体を、前記脂質含有感染性生物から脂質を抽出することができる第1有機溶媒と接触させるステップと、
前記液体と前記第1溶媒とを混合するステップと、
有機相および水相を分離させるステップと、
脂質含量を低減させた前記感染性生物を含有する前記水相を回収するステップ
とを含む、液体中の脂質含有感染性生物のレベルを低減させる方法。 - 前記水相と、前記第1有機溶媒を除去できる解乳化剤とを接触させるステップと、
除去された前記第1有機溶媒を含有する前記解乳化剤を、接触させた前記水相から分離するステップ
とをさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 動物またはヒトから脂質含有感染性生物を含有する液体を得るステップと、
前記脂質含有感染性生物を含有する液体を、脂質含有感染性生物から脂質を抽出できる第1有機溶媒と接触させるステップと、
前記液体と前記第1有機溶媒とを混合するステップと、
有機相および水相を分離させるステップと、
脂質含量が低減された感染性生物を含有する水相を回収するステップと、
前記脂質含量が低減された感染性生物を含有する水相を、前記動物またはヒトに導入するステップ
とを含む、動物またはヒトにおける脂質含有感染性生物のレベルを低減させる方法。 - 前記水相を回収した後、前記脂質含量が低減された感染性生物を含有する水相を、前記動物またはヒトに導入する前に、前記第1有機溶媒を除去できる解乳化剤と接触させ、除去された前記第1有機溶媒を含有する前記解乳化剤を前記水相から除去する、請求項3に記載の方法。
- 動物またはヒトから脂質含有感染性生物を含有する血液を取り出すステップと、
前記血液から脂質含有感染性生物を含有する血漿を得るステップと、
前記脂質含有感染性生物を含有する血漿を、脂質含有感染性生物から脂質を抽出できる第1有機溶媒と接触させるステップと、
前記血漿と前記第1有機溶媒とを混合するステップと、
有機相および水相を分離させるステップと、
脂質含量が低減された感染性生物を含有する水相を回収するステップと、
前記脂質含量が低減された感染性生物を含有する水相を、前記動物またはヒトに導入するステップ
とを含む、動物またはヒトの血漿における脂質含有感染性生物のレベルを低減させる方法。 - 前記水相を回収した後、前記脂質含量が低減された感染性生物を含有する水相を、前記動物またはヒトに導入する前に、前記第1有機溶媒を除去できる解乳化剤と接触させ、除去された前記第1有機溶媒を含有する前記解乳化剤を接触させた前記水相から分離し除去する、請求項5に記載の方法。
- 前記動物またはヒトに導入する前に、前記脂質含量が低減された感染性生物を含有する水相に細胞を添加するステップをさらに含む、請求項5または6に記載の方法。
- 液体中の脂質含有感染性生物を、前記脂質含有感染性生物から脂質を抽出できる第1有機溶媒と接触させるステップと、
前記脂質含有感染性生物から脂質を抽出するのに十分な時間、前記液体と前記第1有機溶媒とを混合するステップと、
有機相および水相を分離させるステップと、
脂質含量が低減された感染性生物を含有する水相を回収するステップ
とを含む、ワクチンを製造するための方法。 - 前記水相を、前記第1有機溶媒を除去できる解乳化剤と接触させるステップと、
接触させた前記水相から、前記解乳化剤および除去された前記第1有機溶媒を分離するステップ
とをさらに含む、請求項8に記載の方法。 - 医薬適合性の担体中に請求項8に記載の脂質含量が低減された感染性生物を含む組成物の有効量を動物またはヒトに投与するステップであって、ここで量は動物またはヒトにおいて感染性生物による感染に対して保護効果を提供するのに有効な量である;
を含む、動物またはヒトにおいて感染性生物に対する保護を提供する方法。 - さらに免疫刺激剤の投与を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記脂質含有感染性生物が、ウイルス、細菌、原生動物または真菌である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記感染性生物がウイルスであり、前記ウイルスが免疫不全ウイルス、肝炎ウイルスまたはペスチウイルスである、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1有機溶媒が、アルコール、エーテル、アミン、炭化水素、またはその組み合わせである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1有機溶媒が、アルコール、エーテル、またはその組み合わせである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記エーテルがC4−C8エーテルであり、前記アルコールがC1−C5アルコールである、請求項15に記載の方法。
- 前記解乳化剤がエーテルである、請求項2、4、6、および9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記液体が、血漿、血清、腹膜液、リンパ液、胸膜液、心膜液、脳脊髄液、または生殖系の液体である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1有機溶媒が、アルコール、エーテル、アミン、炭化水素、エステル、界面活性剤またはこれらの組み合わせである、請求項8に記載の方法。
- 実質的に脱脂された感染性生物および医薬適合性の担体を含む、ワクチン組成物。
- 免疫刺激剤をさらに含む、請求項20に記載の組成物。
- 前記感染性生物が、ウイルス、細菌、真菌または原生動物である、請求項20に記載の組成物。
- 前記ウイルスが免疫不全ウイルスまたは肝炎である、請求項22に記載の組成物。
- 免疫応答を誘導するための医薬品を調製するための、請求項20に記載の組成物の使用。
- ワクチンを調製するための、請求項20に記載の組成物の使用。
- 動物またはヒトから液体を入手するステップと、
液体中の脂質含有感染性生物の活性レベルを低減させるのに十分な時間、前記液体を溶媒系と接触させるステップと、
前記溶媒系から前記液体を分離するステップと、
前記液体を動物またはヒトに再導入するステップ
とにより、脂質含有感染性生物に感染した動物またはヒトを処置するための溶媒系を調製するための、ジイソプロピルエーテルおよびブタノールを含む有機溶媒混合物の使用であって、溶解された脂質は溶媒系で分離され、溶媒系に残存する、ジイソプロピルエーテルおよびブタノールを含む有機溶媒混合物の使用。 - 前記液体が前記動物またはヒトの血液から得られた血漿である、請求項26に記載の使用。
- 動物またはヒトから血液を入手するステップと、
血漿を得るために血液細胞を分離するステップと、
血漿中の脂質含有感染性生物の活性レベルを低減させるのに十分な時間、前記血漿を溶媒系と接触させるステップと、
前記溶媒系から前記血漿を分離するステップと、
前記血漿を前記動物またはヒトに再導入するステップ
とにより、脂質含有感染性生物に感染した動物またはヒトを処置するための溶媒系を調製するための、ジイソプロピルエーテルおよびブタノールを含む有機溶媒混合物の使用であって、溶解された脂質は溶媒系で分離され、溶媒系に残存する、ジイソプロピルエーテルおよびブタノールを含む有機溶媒混合物の使用。
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