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I. GEBIET DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf das Gebiet der Krebsbehandlung und beruht auf der Entdeckung,
dass Betulinsäure
oder Betulin und deren Derivate wirksame anti-neuroektodermale Mittel
sind. Wie hier geoffenbart, sind Betulinsäure oder Betulin und deren
Derivate aufgrund ihres ausgeprägten
Wirkungsmechanismus nützlich
für die
Behandlung neuroektodermaler Tumore, einschließlich neuroektodermaler Tumore, die
gegenüber
herkömmlichen
chemotherapeutischen Mitteln resistent sind. Zusätzlich zur neuen Verwendung bekannter
Verbindungen offenbart die Erfindung neuartige Verbindungen und
pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung neuroektodermaler
Tumore.
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II. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Neuroektodermale Tumore, wie z. B.
das Neuroblastom, das Medulloblastom und das Ewing-Sarkom, stellen
die im Kindesalter am häufigsten
vorkommenden harten Tumore dar. Eine Chemotherapie ist die primäre Behandlung
für viele
Arten von neuroektodermalen Tumoren. Zwei Drittel der Neuroblastomfälle treten bei
Kindern im Alter von 5 Jahren oder darunter auf. Der frühe Ausbruch
des Neuroblastoms wird durch das pränatale Neuroblastom veranschaulicht,
welches durch eine Ultrasonographie des Fötus nachweisbar ist. Jennings
et al. 1993, J. Ped. Surg. 28: 1168–1174. Das Neuroblastom entsteht
im Nebennierenmark oder in den paraspinalen Stellen, wo Gewebe des
sympathischen Nervensystems vorhanden ist. Ein Neuroblastom hat
ernsthafte klinische Folgen, einschließlich Symptomen, die mit der
Tumormasse oder Knochenschmerzen von Metastasen zusammenhängen. Da
sie in paraspinalen Ganglien ihren Ausgang nehmen, können Neuroblastome
durch neurale Foramen dringen und das Rückenmark zusammendrücken, was
eine Lähmung
verursacht. Azizkhan und Haase, 1993, Sem. Surg. Oncol. 9: 493–501.
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Bei ungefähr 70% aller Patienten mit
einem Neuroblastom wird eine Metastasenerkrankung diagnostiziert.
Siehe, z. B. Brodeur et al., 1993, J. Clin. Oncol. 11: 1466–1477; Adams
et al., 1993, J. Ped. Surg. 28: 372–378; Evans et al., 1976, Cancer
38: 661–666.
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Die Chemotherapie bleibt weiterhin
eine der effektivsten Behandlungen bei Neuroblastomtumoren. Neuroblastompatienten
werden im Allgemeinen mit einer Chemotherapie behandelt, und zwar
mit Cyclophosphamid und Doxorubicin, Cisplatin mit Teniposid oder
Etoposid oder Vincristin mit Cisplatin und Teniposid oder Etoposid
bei resistenteren Tumoren. Bei Patienten unter einem Jahr wird im
Allgemeinen eine aggressive Chemotherapie unter Verwendung von Kombinationen
aus Cyclophosphamid, Doxorubicin, Cisplatin und Teniposid oder Etoposid
eingesetzt. Castleberry et al., 1991, J.
Clin. Oncol. 9: 789–795;
Bowman et al., 1997, J. Natl. Cancer Inst. 89: 373–380; Castleberry
et al., 1992, J. Clin. Oncol. 10: 1299–1304.
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Eine aggressive Chemotherapie mit
mehreren Wirkstoffen führte
zu einer Überlebensrate
von 2 Jahren bei etwa 20% der älteren
Kinder mit einem Stufe-IV-Neuroblastom. Bowman et al., 1991, J.
Clin. Oncol. 9: 1599–1608;
Williams et al., 1995, Med. Ped. Oncol. 24: 176–180. Ein Neuroblastom beim
Heranwachsenden oder Erwachsenen hat ungeachtet der Stufe oder Stelle
eine schlechtere Langzeitprognose und in vielen Fällen einen
längeren
Verlauf. Franks et al., 1997, Cancer 79: 2028–2035.
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Das Ewing-Sarkom (EWS) tritt üblicherweise
im Knochen auf und wird am häufigsten
im zweiten Lebensjahrzehnt diagnostiziert. Die üblichsten Stellen für die Primärläsion sind
die Beckenknochen, der Oberschenkelknochen, der Oberarmknochen und
die Rippen. Das Ewing-Sarkom tritt weniger häufig an nicht knochigen Primärstellen
auf, eine Lage, die historisch als extraossales Ewing-Sarkom bezeichnet
wurde.
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Die morphologischen und biologischen
Merkmale von Ewing-Tumoren, die sich in Weichteilen entwickeln,
scheinen jedoch nicht von jenen der Tumore, die sich an knochigen
Stellen entwickeln, unterscheidbar zu sein. Delattre et al., 1994,
New Engl. J. Med. 331: 294-299;
Llombart-Bosch et al., 1990, Cancer 66: 2589–2601.
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Primitive neuroektodermale Tumore
(PNETs) wurden in Abhängigkeit
von ihrer Lage und dem Ausmaß der
neuralen Differenzierung mit verschiedenen Begriffen bezeichnet:
peripheres Neuroepitheliom, Askin-Tumor, adultes Neuroblastom, peripheres
Neuroblastom und primitive neuroektodermale Tumore. Der Sammelbegriff
ist primitive neuroektodermale Tumore. Das Ewing-Sarkom und PNET
stellen ein biologisches Spektrum desselben Tumors dar. Mehr als
90% dieser Tumore sind durch eine Chromosom 11/22-Translokation gekennzeichnet.
Da diese Tumore nur neuroektodermale Differenzierungsmarker aufweisen,
wurde behauptet, dass sie aus Neuralleistenzellen entstehen. Da
die Behandlung bei diesen Tumoren dieselbe ist, werden sie oft als
Ewing-Sarkom bezeichnet.
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Studien legen nahe, dass mehr als
50% der Patienten ohne Metastasenerkrankung ein krankheitsfreies
Langzeitüberleben
haben können,
im Vergleich zu nur 20–30%
bei Patienten, die eine Metastasenerkrankung aufweisen. Siehe z.
B. Burgert et al., 1990, J. Clin. Oncol. 8: 1514–1524; Grier et al., 1994,
Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13: A-1443; Rosen et al., 1981, Cancer
47: 2204–2213;
Dunst et al., 1995, Int. J. Rad. Oncol. Biol. Phy. 32: 919-930; Arai et al.,
1991, Int. J. Rad. Oncol. Biol.
Phv. 21: 1501–1508.
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Ein chirurgischer Eingriff beim Ewing-Sarkom
beschränkt
sich üblicherweise
auf die anfängliche
diagnostische Biopsie des primären
Tumors. Die Patienten unterzogen sich üblicherweise einer Induktionschemotherapie,
gefolgt von einer Bestrahlungstherapie zur lokalen Kontrolle. Die
erfolgreiche Behandlung von Patienten mit Ewing-Sarkom erfordert
die Anwendung einer Chemotherapie mit mehreren Arzneimitteln. Die
Kombinationschemotherapie beim Ewing-Sarkom umfasste traditionellerweise
Vincristin, Doxorubicin, Cyclophosphamid und Dactinomycin (VAdriaC
oder VAC).
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Die Bedeutung von Doxorubicin zeigte
sich in zufällig
angeordneten Vergleichsversuchen mit erhöhter Stärke der Doxorubicin-Dosierung
während
der frühen
Monate der Therapie, was zu einem verbesserten, ereignisfreien Überleben
führte.
Siehe z. B. Nesbit et al., 1990, J. Clin. Oncol. 8: 1664–1674; Kinsella
et al., 1991, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phy. 20: 389–395; Smith
et al., 1991, J. Natl. Cancer Inst. 83: 1460–1470.
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Es gibt einige Referenzen, die sich
mit der Behandlung neuroektodermaler Tumore beschäftigen (Schmidt
et al., Eur. J. Cancer (1997), 33(12), 2007–2010; Fulda et al., Cancer
Res. (1997), 57(21), 4956–4964;
WO-A-96/29068).
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Obwohl viele neuroektodermale Tumore
anfänglich
auf die Chemotherapie ansprechen, bleibt die Prognose für Kinder,
die einen Rückfall
erleiden oder eine ausgebreitete Erkrankung aufweisen, aufgrund
der Entwicklung einer Arzneimittelresistenz schlecht. Einige chemotherapeutische
Mittel, wie z. B. Doxorubicin, beruhen zur Ausübung ihrer Antitumorwirkungen
auf dem Vorhandensein eines funktionierenden CD95-Systems in den
Zieltumorzellen. Zellen, denen ein funktionsfähiges CD95 fehlt, sind gegenüber Doxorubicin
resistent. Einige andere chemotherapeutische Mittel beruhen zur
Ausübung
ihrer Antitumorwirkungen auf dem Vorhandensein eines funktionsfähigen p53-Systems.
Solche chemotherapeutische Mittel sind gegenüber Zellen, denen ein funktionsfähiges p53-Protein fehlt, wirkungslos.
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Daher besteht ein großer Bedarf
an der Entwicklung chemotherapeutischer Arzneimittel, die auf neuroektodermale
Tumore und insbesondere auf arzneimittelresistente neuroektodermale
Tumore abzielen.
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Demgemäß stellt diese Erfindung chemische
Zusammensetzungen und deren Verwendung für die Behandlung neuroektodermaler
Tumore bereit. Diese Zusammensetzungen beruhen zur Ausübung ihrer
Antitumorwirkungen nicht auf dem CD95- oder p53-System.
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III. KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung stellt
neuartige, für
die Behandlung neuroektodermaler Tumore nützliche Verbindungen bereit,
die aus folgenden Verbindungen ausgewählt sind:
3-β-28-(Acetyloxy)lup-20(29)-en-3-yl-β-D-glucopyranosid
(28-Acetyl-3-β-Dglucosylbetulin)
3-β-28-Hydroxylup-20(29)-en-3-yl-β-D-glucopyranosid
3-β-3-Hydroxylup-20(29)-en-28-yl-β-D-glucopyranosid
3-(β-D-Glucopyranosyloxy)lup-20(29)-en-28-olsäureethylester
3-β-D-Galactosylbetulinsäureethylester
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D-Enantiomeren, L-Enantiomeren und
Racematen davon; und pharmazeutisch geeigneten Salzen davon.
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Die vorliegende Erfindung stellt
weiters für
die Behandlung neuroektodermaler Tumore nützliche Zusammensetzungen bereit,
die eine therapeutisch wirksame Menge von Folgendem umfassen:
3-β-28-(Acetyloxy)lup-20(29)-en-3-yl-β-D-glucopyranosid(28-Acetyl-3-β-Dglucosylbetulin)
3-β-28-Hydroxylup-20(29)-en-3-yl-β-D-glucopyranosid
3-β-3-Hydroxylup-20(29)-en-28-yl-β-D-glucopyranosid
3-(β-D-Glucopyranosyloxy)lup-20(29)-en-28-olsäureethylester
3-β-D-Galactosylbetulinsäureethylester
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D-Enantiomeren, L-Enantiomeren und
Racematen davon; und pharmazeutisch geeigneten Salzen davon.
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Solche Zusammensetzungen können auch
einen pharmazeutisch geeigneten Träger oder ein pharmazeutisch
geeignetes Vehikel umfassen.
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Die Erfindung stellt weiters die
Verwendung der obenstehend erwähnten
Verbindungen für
die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereit, welche
in einem Verfahren zur Behandlung neuroektodermaler Tumore zu verwenden
ist, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge
dieser Verbindungen an einen Patienten, der eine solche Behandlung
benötigt.
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Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird
die erfindungsgemäße Verbindung
in einer Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch geeigneten Träger oder
ein pharmazeutisch geeignetes Vehikel umfasst, verabreicht.
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch
eine Vielfalt von Verfahren, einschließlich oraler, sublingualer,
intranasaler, intramuskulärer,
intravenöser,
subkutaner, intravaginaler, transdermaler, rektaler Verfahren, durch
Inhalation oder als Mundwasser, verabreicht werden.
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Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und die
Verfahren, die hier geoffenbart sind, sind besonders vorteilhaft
für die
Behandlung neuroektodermaler Tumore, welche gegenüber den
am häufigsten
gebrauchten chemotherapeutischen Mitteln resistent sind. Bei einer
Ausführungsform
umfasst das Verfahren das systemische Verabreichen von Betulinsäurederivaten
oder Betulinderivaten und/oder von Zusammensetzungen, welche dieselben
enthalten, an ein Individuum. Bei einer weiteren Ausführungsform
umfasst das Verfahren das lokale Anwenden von Betulinsäurederivaten
oder Betulinderivaten auf einen Tumor. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
werden Betulinsäurederivate
oder Betulinderivate systemisch an einen Patienten verabreicht,
der an einem Doxorubicinresistenten neuroektodermalen Tumor leidet.
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IV. KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1A–C zeigen das Herbeiführen einer Apoptose durch Betulinsäure.
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2A–E zeigen die Betulinsäure-induzierte Aktivierung
einer Caspase.
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3A–B zeigen das CD95-unabhängige Herbeiführen einer
Apoptose.
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4A–B zeigen eine Betulinsäure-induzierte Störung der
Mitochondrienfunktion.
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5A–D zeigen die Beteiligung von Bcl-2-verwandten
Proteinen und von p53 an der Betulinsäure-induzierten Apoptose.
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6A–B zeigen die Wirkung von Betulinsäure auf
arzneimittelresistente Zellen.
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7 zeigt,
dass Betulinsäure
direkt einen Wechsel der Mitochondrienpermeabilität auslöst.
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8A–C zeigen, dass ein Betulinsäure-induzierter
Wechsel der Mitochondrienpermeabilität eine Kernfragmentierung auslöst.
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9A und B zeigen, dass die Betulinsäure-induzierte
Spaltung von Caspasen vom Wechsel der Mitochondrienpermeabilität abhängt.
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10A–C zeigen, dass Betulinsäure die Freisetzung eines apoptogenen
Faktors/von apoptogenen Faktoren aus isolierten Mitochondrien bewirkt.
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11A zeigen,
dass aus Mitochondrien freigesetzte apoptogene Proteine die Spaltung
von Caspasen induzieren.
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12A–D zeigen eine arzneimittelinduzierte Apoptose
und einen Mitochondrien-PT.
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13A–C zeigen, dass die Aktivierung des CD95-Systems
durch Doxorubicin stromaufwärts
von den Mitochondrien stattfindet.
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14A–B zeigen die funktionelle Beziehung zwischen
dem Ä⌀m-Bruch
und der Aktivierung der Caspase-Kaskade.
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15A–B zeigen die Aktivierung von Caspasen in
CFS.
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16A–B zeigen die Spaltung von Caspasen durch
cyt. C und AIF.
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17A–C zeigen das Herbeiführen einer Apoptose durch Betulinsäurederivate.
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V. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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1. Übersicht über die
Erfindung
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Die Erfindung beruht teilweise auf
der unerwarteten Entdeckung der Erfinder, dass Betulinsäurederivate
oder Betulinderivate wirksam das Wachstum einer Vielfalt von neuroektodermalen
Zellen hemmen. Die Erfindung beruht weiters teilweise auf der unerwarteten
Entdeckung, dass Betulinsäurederivate
oder Betulinderivate ihre Wirkung über andere Pfade ausüben als
routinemäßig verwendete,
chemotherapeutische Mittel. Wie obenstehend im Abschnitt I besprochen,
erfordert die Behandlung neuroektodermaler Tumore oftmals eine Langzeit-Kombinationschemotherapie.
Die Patienten entwickeln nach langer Anwendung solcher Mittel oft
eine Resistenz gegenüber
chemotherapeutischen Mitteln. In der Tat ist bekannt, dass viele
chemotherapeutische Mittel ihre Antitumorwirkung durch das Herbeiführen einer
Apoptose in den Zieltumorzellen ausüben. Eine große Anzahl
solcher Mittel induziert in den Zieltumorzellen eine Tumorzellenapoptose
durch Apoptose-Signalsysteme, insbesondere das CD95- und das p53-System.
Häufig
entwickeln die Zieltumorzellen jedoch eine Arzneimittelresistenz,
indem die Komponenten des Apoptose-meldenden Pfades mutiert werden. Beispielsweise
verleiht der Verlust entweder von CD95 oder von p53 den Tumorzellen
eine Arzneimittelresistenz. Indem sie über einen Apoptosepfad wirken,
der verschieden und unabhängig
vom CD95- und vom p53-System ist, bieten die Zusammensetzungen und
Verfahren der Erfindung den Vorteil, dass sie bei Tumoren wirksam
sind, welche gegenüber
den am häufigsten
gebrauchten chemotherapeutischen Mitteln, die durch CD95 und/oder
p53 wirken, resistent sind.
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Somit ist die vorliegende Erfindung
im Allgemeinen auf Betulinsäurederivate
und Betulinderivate sowie auf deren Verwendung für die Behandlung neuroektodermaler
Tumore gerichtet. Genauer gesagt, die vorliegende Erfindung ist
auf neuartige Derivate von Betulinsäure und Betulin sowie auf Verfahren
zu deren Synthese gerichtet. Weiters ist die vorliegende Erfindung
auf pharmazeutische Zusammensetzungen gerichtet, welche die neuartigen
erfindungsgemäßen Verbindungen
und einen pharmazeutisch geeigneten Träger enthalten, der für die Behandlung
neuroektodermaler Tumore nützlich
ist.
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2. Die Antitumorwirkung
von Betulinsäure,
Betulin und Derivaten davon
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Betulinsäure-induzierte Apoptose: Die
Induktion einer Tumorzellenapoptose (programmierter Zelltod) ist
ein starker therapeutischer Zugang zum Behandeln von Tumoren. Der
Begriff Apoptose bezieht sich auf eine morphologisch unterschiedliche
Form des Zelltods, der mit der normalen Physiologie zusammenhängt. Kerr
et al., 1972, Brit. J. Cancer 26: 239. Die Apoptose unterscheidet
sich von der Nekrose, die mit einer akuten Verletzung der Zellen
zusammenhängt.
In morphologischer Hinsicht ist die Apoptose durch eine Kernchromatin-Kondensation,
ein cytoplasmatisches Schrumpfen, ein erweitertes endoplasmatisches
Retikulum und Membranbläschen
gekennzeichnet.
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Die Entdeckung der Erfinder besteht
darin, dass Betulinsäure,
Betulin und Derivate davon eine Apoptose in Zelllinien des Neuroblastoms
(SH-EP), Medulloblastoms (Daoy), Ewigg-Sarkoms (A 17/95) und Melanoms
(A-378) induzieren. Obwohl früher
berichtet wurde, dass Betulinsäure
eine Cytotoxizität
gegenüber
einer Melanom-Zelllinie (MEL-2) ausübt, war weder bekannt noch
wurde erwartet, dass Betulinsäure
auf eine breite Vielfalt von Krebszellen wirken würde. Siehe,
Dascupta und Pezzuto, PCT/US96/04016, worin geoffenbart wird, dass
Betulinsäure
unter zehn verschiedenen Tumorzellen, die untersucht wurden, nur
auf MEL-2 cytotoxische Wirkungen hatte. Es ist daher eine überraschende
Entdeckung, dass Betulinsäure
und ihre Derivate in neuroektodermalen Zellen eine Apoptose induzieren.
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Die Betulinsäure-induzierte Apoptose ist
unabhängig
von CD95 und P53: Ein Apoptose-Zelltod
kann durch eine breite Vielfalt von Stimuli ausgelöst werden,
und nicht alle Zellen sterben notwendigerweise als Reaktion auf
denselben Stimulus. Zu den näher
untersuchten Todes-Stimuli gehört
ein DNA-Schaden, z. B. durch Bestrahlung oder Arzneimittel, die
zur Krebschemotherapie eingesetzt werden, welcher in vielen Zellen über einen
von p53 abhängigen
Pfad zum Apoptose-Tod führt.
Einige Hormone, wie z. B. Corticosteroide, führen bei bestimmten Zellen,
z. B. Thymozyten, zum Absterben, obwohl andere Zelltypen stimuliert
werden können. Einige
Zelltypen exprimieren Fas, ein Oberflächenprotein, welches als Reaktion
auf eine Vernetzung ein intrazelluläres Todessignal auslöst. In anderen
Fällen
scheinen die Zellen einen fehlerhaften Todes-Pfad zu besitzen, welcher
durch einen Überlebensfaktor
aktiv blockiert werden muss, um ein Überleben der Zellen zu ermöglichen.
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Es wurde gezeigt, dass cytotoxische
Arzneimittel, ungeachtet ihres intrazellulären Ziels, das Absterben empfindlicher
Zielzellen bewirken, indem sie eine Apoptose induzieren. Fisher,
1994, Cell, 78: 539–542. Das
CD95 (APO-1/Fas)-System ist ein Hauptvermittler einer arzneimittelinduzierten
Apoptose in Leukämie- und
Neuroblastomzellen. Friesen et al., 1996, Mature Med., 2: 574–577; Faldo
et al., 1997, Cancer Res. 57: 3823–3829. Nach der Behandlung
mit cytotoxischen Arzneimitteln wurde ein CD95-Ligand (CD95-L) induziert und
bewirkte in autokriner oder parakriner Weise eine Apoptose. CD95-L
ist ein M 40.000-Typ II-Transmembranmolekül der Familie von Liganden
mit dem TNF/-Nervenwachstumsfaktor (Suda et al., 1993, Cell 75: 1169–1178),
welche auch in einer nach der proteolytischen Spaltung aus der Zelloberfläche freigesetzten,
löslichen
Form auftreten können.
Tonaka et aL., 1995, EMBO J. 14: 1129–1135.
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Eine überraschende Entdeckung der
Erfinder besteht darin, dass Betulinsäure und ihre Derivate die Apoptose
einer Tumorzelle induzieren, und zwar unabhängig vom CD95-Status in der Tumorzelle.
Beispielsweise induziert die Betulinsäure, wie hier untenstehend
geoffenbart, eine Apoptose in den SH-EP-Neuroblastomzellen, ohne
die Expression von CD95-L zu induzieren, während eine Doxorubicin-Behandlung
die Expression von CD95-L induziert. Werden Zellen mit anti-APO-1
(anti-CD95)-Antikörpern
behandelt, um die Funktion von CD95 zu blockieren, so ist die Induktion
einer Apoptose durch Betulinsäure
nicht betroffen. Siehe unten. Im Gegensatz dazu wird eine Doxorubicin-induzierte
Apoptose durch anti-CD95-Antikörper
erheblich blockiert.
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Neben CD95 spielt auch das p53-Gen
eine entscheidende Rolle bei der Durchführung der Apoptose. Eine Vielzahl
von Hinweisen impliziert p53 bei der Apoptose. Ist das p53 in einer
Krebszelle mutiert, so ist weniger wahrscheinlich, dass die Zellen
in eine Apoptose treten, wenn sie mit diesen chemotherapeutischen
Mitteln behandelt werden. Eine Bestrahlung und DNA-schädigende
chemotherapeutische Arzneimittel neigen dazu, über Pfade zu arbeiten, die
p53 einschließen.
Ein Verlust der p53-Funktion könnte
zu einem merklichen Anstieg der zellulären Chemoresistenz führen und
kann zum signifikanten Ausmaß des
Versagens der Behandlung beisteuern, welches bei diesen Tumoren
beobachtet wird. Siehe z. B. Buttitta et al., 1997, Proc. Ann. Meet.
Am. Assoc. Cancer Res. 38: A713.
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Wie untenstehend gezeigt, induziert
eine Doxorubicin-Behandlung die Anhäufung des p53-Proteins. Im
Gegensatz dazu induziert Betulinsäure keine Anhäufung des
p53-Proteins, was
nahe legt, dass die Apoptose-induzierende Wirkung von Betulinsäure unabhängig vom
p53-Protein ist.
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Ohne Beabsichtigung, an eine bestimmte
Theorie gebunden zu sein, zeigen die untenstehenden Beispiele 3
und 4, dass Betulinsäure
in isolierten Mitochondrien direkt einen Permeabilitätswechsel
PT auslöste, und
die Induktion eines PT scheint das anfängliche Ereignis bei einer
durch Betulinsäure
ausgelösten
Apoptose zu sein. Mitochondrien, die ein PT durchmachen, setzen
aus dem Mitochondrien-Intermembranraum apoptogene Proteine, wie
z. B. Cytochrom c oder den Apoptose-induzierenden Faktor (AIF),
frei, und zwar in das Cytosol, wo sie Caspasen und Endonucleasen
aktivieren. Kroemet et al., 1997, Immunol. Today 18: 44–51; Susin
et al., J. Exp. Med. 186: 25–37.
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Wie die untenstehenden Beispiele
3 und 4 zeigen, verhinderte eine Hemmung des PT durch Überexpression
von Bcl-2 oder Bcl-XL oder durch den Mitochondrien-spezifischen Inhibitor
Bongkreksäure
jegliche Manifestationen einer Apoptose in intakten Zellen und in
einem zellfreien System, wie z. B. die Zerstörung des Mitochondrien-Transmembranpotentials
(ΔΨm), die Aktivierung von Caspasen, die Spaltung
von Substraten (PARP) und die Kernfragmentierung. Im Gegensatz zur
Betulinsäure
induzierten klassische cytotoxische Arzneimittel, wie z. B. Doxorubicin,
Cisplatin oder Etoposid, keinerlei Mitochondrien-Störungen in
isolierten Mitochondrien, was nahe legt, dass ein Mitochondrien-PT,
der in intakten Zellen während
einer durch diese Substanzen ausgelösten Apoptose auftrat, die
Folge einer primären
Aktivierung anderer Pfade oder Systeme war.
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Zu intakten Zellen hinzugefügt, induzierte
Betulinsäure
spezifisch Mitochondrienveränderungen
in SHEP-Neuroblastomzellen, jedoch nicht in Lymphzelllinien. Betulinsäurebehandelte
Mitochondrien, welche aus der B-Lymphoblastoid-Zelllinie SKW6,4
isoliert worden waren, lösten
jedoch einen Mitochondrien-PT aus und vermittelten eine Kernfragmentierung, ähnlich wie
Mitochondrien aus SHEP-Zellen. Somit kann die Spezifizität der Betulinsäure hinsichtlich
neuroektodermaler Tumore besser durch eine zellspezifische Aufnahme und/oder
Translokation der Verbindung in das Mitochondrienkompartiment erklärt werden
als durch Unterschiede bei den Mitochondrien selbst.
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3. Die Verbindungen
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
sind die für
die Behandlung neuroektodermaler Tumore nützlichen Verbindungen folgende:
3-β-28-(Acetyloxy)lup-20(29)-en-3-yl-β-D-glucopyranosid(28-Acetyl-3-β-Dglucosylbetulin)
3-β-28-Hydroxylup-20(29)-en-3-yt-β-D-glucopyranosid
3-β-3-Hydroxylup-20(29)-en-28-yl-β-D-glucopyranosid
3-(β-D-Glucopyranosyloxy)1up-20(29)-en-28-olsäureethylester
3-β-D-Galactosylbetulinsäureethylester
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D-Enantiomere, L-Enantiomere und
Racemate davon; und pharmazeutisch geeignete Salze davon.
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Solche pharmazeutisch geeigneten
Salze sind dem Fachmann bekannt und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein,
Natrium-, Kalium-, Lithium-, Calcium-, Magnesium-, Zink- und Eisensalze.
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen, einschließlich pharmazeutisch
geeigneter Salze davon, umfassen zumindest ein Chiralitätszentrum
und können
daher als einzelne Enantiomere, enantiomerisch angereicherte Mischungen
von Enantiomeren und Racemate existieren. Demgemäß sind die erfindungsgemäßen Verbindungen,
wie hier in Betracht gezogen, für
die Behandlung neuroektodermaler Tumore nützlich, wenn sie sich in ihrer
Denantiomerischen, L-enantiomerischen oder racemischen Form befinden.
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Die Verbindungen der Formel (1) können direkt
aus natürlichen
Quellen isoliert oder aus natürlichen oder
synthetischen Ausgangsmaterialien oder -reagenzien chemisch synthetisiert
und anschließend
aus einer Reaktionsmischung isoliert werden. So oder so können die
erfindungsgemäßen Verbindungen
durch Standard-Reinigungstechniken, einschließlich der Säulenchromatographie, der Rekristallisation,
der enzymatischen Gewinnung oder anderer, dem Fachmann bekannter
Mittel, ohne auf diese beschränkt
zu sein, in gereinigter Form erhalten werden.
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4. Verfahren
zur Herstellung der Verbindungen
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen können über eine
herkömmliche
organische Synthese erhalten werden, wie untenstehend beschrieben.
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Im Allgemeinen können die erfindungsgemäßen Verbindungen
aus Verfahren erhalten werden, die beispielsweise bei Ohara et al.,
1994, Mokuzai Gakkaishi 40(4): 444–51 und Uvarova et al., 1980,
Carbohydrate Research 83: 33–42,
beschrieben sind.
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Zusätzlich kann die Synthese der
erfindungsgemäßen Verbindungen
durch folgende Verfahren durchgeführt werden: Der synthetische
Zugriff auf die Verbindungen beginnt mit Betulin oder Betulinsäure.
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Im Verlauf der Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung,
welche unter die Formel (I)
fällt, kann die R
1-
oder R
2 -Position zeitweise geschützt werden.
Beispiele für
geeignete Schutzgruppen umfassen Acetyl- und andere Acylschutzgruppen
für R
1, und für
R
2, falls R
2=CH
2OH. Ist -CO
2H für R
2 ausgewählt, so
kann diese Gruppe in Form irgendeines Esters, beispielsweise eines
Methyl-, Ethyl- oder Isopropylesters, geschützt werden. Die Schutzgruppen
können
durch Standardverfahren eingebracht werden, wie beispielsweise bei
Greene und Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (2. Ausgabe,
1991) und in den darin angeführten
Literaturstellen beschrieben. Zusätzlich kann der selektive Schutz
der R
2 (-CH
2OH)-Gruppe
von Betulin in Gegenwart der C-3-Hydroxylgruppe gemäß der von
0. Pancharoen et al., 1994, Phytochemistry 35(4): 987–92, beschriebenen
Verfahrensweise erzielt werden.
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Um Verbindungen der Formel (I) zu
erhalten, wobei R1 mit dem Sauerstoffatom,
an das R1 gebunden ist, eine Etherbindung
bildet oder wobei R2 eine -CH2O-Etherverknüpfung enthielt,
wobei beispielsweise R1 oder R2 ein
gerades oder verzweigtes -C-C20-Kettenalkyl,
ein gerades oder verzweigtes -C2-C20-Kettenalkenyl, ein gerades oder verzweigtes
-C2-C20-Kettenalkinyl, myo-Inosityl,
scyllo-Inosityl, Cyclitol, Coduritol A, Quebrachitol oder Ketten
von Polyethylenglycol (-(CH2CH2O)nH, -(CH2CH2O)nCH3 oder
-(CH2CH2O)nCH2CH3)
ist, wird eine Verknüpfung über eine
Etherbindung erzielt.
-
Zu diesem Zweck kann Betulin oder
Betulinsäure
unter etherbindungsbildenden Standardbedingungen mit dem geraden
oder verzweigten -C1-C20-Kettenalkyl,
dem geraden oder verzweigten -C2-C20-Kettenalkenyl, dem geraden oder verzweigten
-C2-C20-Kettenalkinyl, myo-Inosityl,
scyllo-Inosityl, Cyclitol, Coduritol A, Quebrachitol oder einer
Polyethylenglycol (-(CH2CH2O)nH, -(CH2CH2O)nCH3 oder
-(CH2CH2O)nCH2CH3)-Kette reagieren.
Das gerade oder verzweigte -C1-C2-Kettenalkyl, das gerade oder verzweigte
-C2-C20-Kettenalkenyl, das gerade oder verzweigte
-C2-C20-Kettenalkinyl,
myo-Inosityl, scyllo-Inosityl,
Cyclitol, Coduritol A, Quebrachitol oder die Polyethylenglycol (-(CH2CH2O)nH,
-(CH2CH2O)nCH3 oder -(CH2CH2O)nCH2CH3)-Kette kann
als Halogen-, beispielsweise Chlor-, Brom- oder Iod-, Derivat oder
als aktiviertes Ester-, beispielsweise Tosylat-, Triflat-, Mesylat-
oder Brosylat, Derivat aktiviert werden. Die Etherifizierungsreaktion
kann gemäß einer standardmäßigen Williamson-Verfahrensweise
oder gemäß verbesserten
Protokollen durchgeführt
werden, wie beispielsweise bei R. A. W. Johnston et al., Tetrahedron
35: 2196 (1979) geoffenbart.
-
Um Derivate mit glykosidischen Verknüpfungen
zu erhalten, wobei beispielsweise R1 ein
Monosaccharid oder Disaccharid oder ein Oligosaccharid ist oder
wobei R2 -CH2O(Monosaccharid),
-CH2O(Disaccharid), -CH2O(Oligosaccharid),
-CO2(Monosaccharid), -CO2(Disaccharid)
oder -CO2(Oligosaccharid) ist, kann ein
geeignet geschütztes
Derivat entweder von Betulin oder Betulinsäure unter glycosidbindungsbildenden
Standardbedingungen mit einem aktivierten und/oder geeignet geschützten Saccharidderivat
reagieren.
-
Das Saccharidderivat kann in stereospezifischer
Weise mit dem C-3-Sauerstoffatom oder dem -CH2-Abschnitt
von R2 der Verbindungen der Formel (I) verknüpft werden.
-
Vorzugsweise ist das Saccharidderivat
mit dem C-3-Sauerstoffatom oder dem -CH2-Abschnitt von R2 solcherart in einem Gebilde verknüpft, dass
eine â-Glycosidbindung
gebildet wird. Dies trifft besonders im Fall von Glucose und Galactose
zu. Zu diesem Zweck verwendbare Protokolle umfassen das Koenigs
Knorr-Verfahren (W. Koenigs et al., Ber. Dtsch. Chem. Ges. 34: 957
(1901), wobei ein Glycosylbromid in Gegenwart eines Silberkatalysators,
beispielsweise Silbercarbonat, reagiert), und das Helferich-Verfahren
(B. Helferich et al., Ber. Dtsch. Chem. Ges. 73: 532 (1940) und
N. I. Uvarova et al., Carbohydrate Research 83: 33–42 (1980)).
-
Um Esterderivate zu erhalten, wobei
beispielsweise R2 -CO2(gerades
oder verzweigtes -C1-C20-Kettenalkyl),
-CO2(gerades oder verzweigtes -C2-C20-Kettenalkenyl),
-CO2(gerades oder verzweigtes -C2-C2-Kettenalkinyl),
-CO2(myo-Inosityl), -CO2(scyllo-Inosityl), -CO2(Cyclitol), -CO2(Coduritol
A), -CO2(Quebrachitol), -CO(OCH2OCH2)nOH, -CO(OCH2OCH2)nOCH3 und -CO(OCH2OCH2)nOCH2CH3) ist, muss die Carboxylgruppe eines – beispielsweise über R1 – geeignet
geschützen
Betulinsäurederivats
aktiviert werden. Geeignete aktivierte Betulinsäurederivate umfassen Carboxylhalogenid-
und Dicyclohexylcarbodiimidderivate, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Das aktivierte Carbonsäurederivat
kann unter esterbindungsbildenden Standardbedingungen mit einer
Gruppe reagieren, welche eine Hydroxylfunktion enthält. Eine
solche Reaktion kann gemäß einem
Standard-Schotten-Baumann-Verfahren
oder gemäß Protokollen,
wie sie bei Kaiser et al., 1070, J Org. Chem, 35: 1198, geoffenbart
sind, durchgeführt
werden.
-
Ist der Schutz einer oder beider
Hydroxylgruppen von Betulin oder der Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe
von Betulinsäure
erforderlich, um eine Verbindung der Formel (I) zu erhalten, so
können
Schutz- oder Deprotektionsreaktionen gemäß Standardverfahren durchgeführt werden,
wie beispielsweise bei Greene und Wuts, Protective Groups in Organic
Synthesis (2. Ausgabe, 1991) und in den darin angeführten Literaturstellen beschrieben.
-
Falls Acylschutzgruppen für R2 eingesetzt werden, wenn dieses die Form
-CH2OZ besitzt, wobei Z die Acylschutzgruppe
ist, werden bei Raumtemperatur vorzugsweise wässrige Natriumhydroxidlösungen für die Deprotektion
der Z-Gruppe eingesetzt.
-
Glycosylhalogenide, welche für Glycosidierungen
geeignet sind, und aliphatische (Alkanyl-, Alkenyl- und Alkinyl-)
und Polyethylenglycolketten sowie Halogenidderivate davon sind bei
standardmäßigen Chemielieferanten
im Handel erhältlich.
-
Die Verbindungen der Formel (I),
wobei R3 = -CH(CH3)2, können
aus den Verbindungen der Formel (I) erhalten werden, wobei R3 = -C(CH3) (=CH2). Um Verbindungen der Formel (I) zu erhalten,
wobei R3 = -CH(CH3)2, können
die Verbindungen, wobei R3 = -C(CH3) (=CH2), katalytisch
hydriert werden, wobei gemäß den bei
T. Fuijoka et al., 1994, J. Nat. Prod. 57(2): 243–47, beschriebenen
Verfahren Palladium auf Aktivkohle verwendet wird.
-
Zusätzlich zu den obenstehenden
Verfahren können
die erfindungsgemäßen Verbindungen
durch eine dem Fachmann gemeinhin bekannte, herkömmliche organische Synthese
erhalten werden.
-
Sobald die erfindungsgemäßen Verbindungen
synthetisiert wurden, können
sie gereinigt oder im Wesentlichen gereinigt werden, wobei die herkömmliche
Chromatographie, die Rekristallisation oder andere, dem Fachmann
bekannte Reinigungstechniken angewandt werden.
-
5. Therapeutische
Indikationen und Behandlungsverfahren
-
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind nützlich für Verfahren
und Zusammensetzungen zum Behandeln von Tumoren, typischerweise
neuroektodermalen Tumoren und deren Metastasen, und zwar bei einem
Individuum, das eine solche Behandlung benötigt. Das Individuum ist typischerweise
ein Säugetier
und am meisten bevorzugt ein Mensch.
-
Wie hier demonstriert, sind die geoffenbarten
Verbindungen und pharmazeutischen Zusammensetzungen nützlich für die Behandlung
neuroektodermaler Tumore, einschließlich des Neuroblastoms, des
Medulloblastoms und des Ewing-Sarkoms, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Die Diagnose von neuroektodermalen Tumoren und deren Metastasen
ist dem Fachmann bekannt. Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen das
Verabreichen pharmazeutischer Zusammensetzungen, welche eine therapeutisch
wirksame Menge einer ausgewählten
erfindungsgemäßen Verbindung
und einen geeigneten pharmazeutischen Träger, siehe unten, enthalten,
an das Individuum, welches dies benötigt, d.h. an ein Individuum,
das von einem neuroektodermalen Tumor befallen ist.
-
Bei manchen spezifischen Ausführungsformen
werden die geoffenbarten Verbindungen und Zusammensetzungen der
Erfindung zur Behandlung neuroektodermaler Tumore eingesetzt, welche
gegenüber
bestimmten chemotherapeutischen Mitteln resistent sind. Bei einer
derartigen Ausführungsform
werden sie zur Behandlung Doxorubicinresistenter Neuroektodermalien
eingesetzt. Bei einer weiteren derartigen bevorzugten Ausführungsform
wird zumindest eine der Zusammensetzungen der Erfindung systemisch
verabreicht, und zwar in Verbindung mit anderen chemotherapeutischen
Mitteln, wie z. B. Doxorubicin.
-
Es zeigte sich, dass insbesondere
die Verbindungen 28-Acetyl-3-β-D-glucosylbetulin
(„B10"), 3-β-28-Hydroxylup-20(29)-en-3-yl-β-D-glucopyranosid
(„B11
"), 3-β-3-Hydroxylup-20(29)-en-28-yl-β-D-glucopyranosid
(„B12"),
3-(β-D-Glucopyranosyloxy)lup-20(29)-en-28-olsäureethylester
(„B13"),
3-β-D-Galactosylbetulin
(„B 14")
und 3-β-D-Galactosylbetulinsäureethylester
(„B15")
oder geeignete Salze davon eine starke Wirksamkeit hinsichtlich
der Aktivierung einer Apoptose in Tumorzellen aufweisen und vorteilhafterweise
in der Veterinär-
und Humanmedizin für
die Behandlung neuroektodermaler Tumore nützlich sind. Diese Betulin- bzw.
Betulinsäurederivate
besitzen eine verbesserte Wasserlöslichkeit, haben eine verbesserte
Aufnahme in die Zellen und sind somit verglichen mit Betulin und
Betulinsäure
von Vorteil.
-
Bei Verabreichung an einen Patienten,
z. B. ein Säugetier
zur tierärztlichen
Verwendung oder an einen Menschen zur klinischen Verwendung, werden
die erfindungsgemäßen Verbindungen
vorzugsweise in isolierter Form verabreicht. Unter „isoliert"
ist zu verstehen, dass die Verbindungen vor der Formulierung in
eine Zusammensetzung von anderen Komponenten entweder aus (a) einer
natürlichen
Quelle, wie z. B. einer Pflanze oder Zellkultur, oder (b) einer
synthetischen, organischen, chemischen Reaktionsmischung getrennt
werden. Vorzugsweise werden die Verbindungen durch herkömmliche
Techniken gereinigt.
-
Für
eine erfolgreiche Behandlung von Indikationen, die Tumore im Gehirn
umfassen, wie z. B. beim primären
Medulloblastom, beim primären
Neuroblastom oder beim Ewing-Sarkom,
kann notwendig sein, dass die aktive Verbindung in der Lage ist,
die Blut/Gehirn-Barriere
zu überschreiten,
und zwar abhängig
davon, wie intakt die Blut/Gehirn-Barriere im bestimmten Fall ist.
Im Allgemeinen sind kleine lipophile Verbindungen, wie z. B. Betulinsäure und
die geoffenbarten Derivate, gut zum passiven Überschreiten der Blut/Gehirn-Barriere geeignet.
Von besonderen Wert können
jedoch Verbindungen sein, welche Zuckerreste aufweisen, wie insbesondere
Glucosereste, da diese die Blut/Gehirn-Barriere durch Saccharidrezeptoren
und -kanäle,
insbesondere Glucosekanäle,
aktiv überschreiten
können.
Diese Betulin- bzw. Betulinsäurederivate
besitzen eine verbesserte Wasserlöslichkeit, zeigen eine verbesserte
Aufnahme in die und einen verbesserten Transport in den Zellen und
sind somit verglichen mit Betulin und Betulinsäure von Vorteil. Daher können Verbindungen
einschließlich
28-Acetyl-3-β-D-glucosylbetutin
(„B10"),
3-β-28-Hydroxylup-20(29)-en-3-yl-β-D-glucopyranosid
(„B11
"), 3-β-3-Hydroxylup-20(29)-en-28-yl-β-Dglucopyranosid
(„B12"),
3-(β-D-Glucopyranosyloxy)lup-20(29)-en-28-olsäureethylester
(„B13"),
3-β-D-Galactosylbetulin
(„B14")
und 3-β-D-Galactosylbetulinsäureethylester
(„B15") für die Behandlung
von im Gehirn lokalisierten Tumoren von besonderem Vorteil sein.
-
Bei Verabreichung an einen Patienten,
z. B. ein Säugetier
zur tierärztlichen
Verwendung oder an einen Menschen zur klinischen Verwendung, können die
Verbindungen der Formel (I) allein oder in Kombination mit irgendeinem
physiologisch geeigneten Träger
oder Vehikel, der bzw. das für
die enterale oder parenterale Verabreichung geeignet ist, eingesetzt
werden. Bei Verwendung zur parenteralen Verabreichung sollte der
physiologisch geeignete Träger
oder das physiologisch geeignete Vehikel steril und zur in vivo-Verwendung
beim Menschen oder zur Verwendung in einer veterinärklinischen
Situation geeignet sein.
-
6. Formulierungen
und Verabreichungswege
-
Die hier beschriebenen Verbindungen
oder die pharmazeutisch geeigneten Zusatzsalze und/oder -hydrate
davon können
einem Patienten unter Anwendung eines breiten Umfangs von Verabreichungswegen oder
-methoden verabreicht werden. Geeignete Verabreichungswege umfassen
die Inhalation, die transdermale, orale, rektale, transmukosale,
intestinale und parenterale Verabreichung, einschließlich intramuskulärer, subkutaner
und intravenöser
Injektionen, ohne darauf beschränkt
zu sein.
-
Die hier beschriebenen Verbindungen
oder die pharmazeutisch geeigneten Salze und/oder -hydrate davon
können
allein, in Kombination mit anderen erfindungsgemäßen Verbindungen und/oder in
Cocktails, die mit anderen therapeutischen Mitteln kombiniert sind,
verabreicht werden. Natürlich
hängt die
Wahl der therapeutischen Mittel, die zusammen mit den erfindungsgemäßen Verbindungen
verabreicht werden können,
teilweise vom behandelten Leiden ab.
-
Werden die erfindungsgemäßen Verbindungen
beispielsweise Patienten verabreicht, die an neuroektodermalen Tumoren
oder arzneimittelresistenten Tumoren Leiden, so können sie
in Cocktails verabreicht werden, welche Mittel enthalten, die zur
Behandlung des Schmerzes, einer Infektion und anderer Symptome und Nebenwirkungen,
die üblicherweise
mit solchen Tumoren zusammenhängen,
eingesetzt werden. Solche Mittel umfassen z. B. Schmerzmittel, Antibiotika
etc.. Die Verbindungen können
auch in Cocktails verabreicht werden, welche andere Mittel enthalten,
die üblicherweise
zur Behandlung neuroektodermaler Tumore eingesetzt werden, wie z.
B. Vincristin, Doxorubicin (oder Dactinomycin) und Cyclophosphamid.
Grier et al., 1994, Proceedings of the American Society of Clinical
Oncoloy 13: A-1443, 421.
-
Bei Verabreichung an einen Patienten,
der eine Krebsbehandlung durchmacht, können die Verbindungen in Cocktails
verabreicht werden, welche andere Antikrebsmittel und/oder ergänzende Potenzierungsmittel enthalten.
Die Verbindungen können
auch in Cocktails verabreicht werden, welche Mittel enthalten, welche
die Nebenwirkungen einer Strahlentherapie behandeln, wie z. B. Mittel
gegen Erbrechen, Strahlenschutzmittel etc..
-
Arzneimittel zur Krebsbekämpfung,
die zusammen mit den erfindungsgemäßen Verbindungen verabreicht
werden können,
umfassen z. B. auch Aminoglutethimid; Asparaginase; Bleomycin; Busulfan;
Carboplatin; Carmustin (BCNU); Chlorambucil; Cisplatin (cis-DDP);
Cyclophosphamid; Cytarabin HCl; Dacarbazin; Dactinomycin; Daunorubicin
HCl; Doxorubicin HCl; Estramustinphosphatnatrium; Etoposid (VP-16); Floxuridin; Fluoruracil
(5-FU); Flutamid; Hydroxyharnstoff (Hydroxycarbamid); Ifosfamid;
Interferon Alfa-2a, Alfa 2b, Lueprolidacetat (LRRH-Freisetzungsfaktor-Analogon);
Lomustin (CCNU); Mechlorethamin HCl (Stickstoffsenf); Melphalan;
Mercaptopurin; Mesna; Methotrexat (MTX); Mitomycin; Mitotan (o.p'-DDD);
Mitoxantron HCl; Octreotid; Plicamycin; Procarbazin HCl; Streptozocin;
Tamoxifencitrat; Thioguanin; Thiotepa; Vinblastinsulfat; Vincristinsulfat;
Amsacrin (m-AMSA); Azacitidin; Hexamethylmelamin (HMM); Interleukin
2; Mitoguazon (Methyl-GAG; Methylglyoxal-bis-guanylhydrazon; MGBG);
Pentostatin; Semustin (Methyl-CCNU); Teniposid (VM-26); Paclitaxel
und andere Taxane; und Vindesinsulfat.
-
Ergänzende Potenzierungsmittel,
welche zusammen mit den erfindungsgemäßen Verbindungen verabreicht
werden können,
umfassen z. B. tricyclische Antidepressiva (z. B. Imipramin, Desipramin,
Amitriptylin, Clomipramin, Trimipramin, Doxepin, Nortriptylin, Protriptylin,
Amoxapin und Maprotilin); nicht tricyclische Antidepressiva (z.
B. Sertralin, Trazodon und Citalopram); Ca++-Antagonisten
(z. B. Verapamil, Nifedipin, Nitrendipin und Caroverin); Amphotericin
(z. B. Tween 80 und Perhexilinmaleat); Triparanol-Analoga (z. B.
Tamoxifen); Arzneimittel gegen Rhythmusstörungen (z. B. Chinidin); blutdrucksenkende
Mittel (z. B. Reserpin); Thiolabreicherer (z. B. Buthionin und Sulfoximin);
und Calciumleucovorin.
-
Die aktive Verbindung/die aktiven
Verbindungen kann bzw. können
an sich oder in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht
werden, wobei sich die aktive Verbindung die aktiven Verbindungen
in Mischung mit einem oder mehreren pharmazeutisch geeigneten Trägern, Arzneimittelträgern oder
Verdünnungsmitteln
befindet bzw. befinden. Pharmazeutische Zusammensetzungen zur erfindungsgemäßen Verwendung
können
in herkömmlicher
Weise formuliert werden, wobei ein oder mehrere physiologisch geeignete Träger verwendet
werden, die Arzneimittelträger
und Hilfsstoffe umfassen, welche das Verarbeiten der aktiven Verbindungen
zu Präparaten,
die pharmazeutisch eingesetzt werden können, ermöglichen. Die richtige Formulierung
hängt vom
gewählten
Verabreichungsweg ab.
-
Für
die Injizierung können
die erfindungsgemäßen Mittel
in wässrigen
Lösungen,
vorzugsweise in physiologisch verträglichen Puffern, wie z. B.
einer Hanks-Lösung,
einer Ringer-Lösung,
oder in einem physiologischen Salzpuffer, formuliert werden. Für die transmukosale
Verabreichung werden Eindringmedien, die für die zu durchdringende Barriere
passend sind, in der Formulierung verwendet. Solche Eindringmedien
sind im Stand der Technik allgemein bekannt.
-
Für
die orale Verabreichung können
die Verbindungen leicht zubereitet werden, indem die aktive Verbindung/die
aktiven Verbindungen mit im Stand der Technik wohlbekannten, pharmazeutisch
geeigneten Trägern
kombiniert wird bzw. werden. Solche Träger ermöglichen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen
als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gels, Sirups, Breimassen,
Suspensionen und dergleichen zubereitet werden, und zwar für die orale
Aufnahme durch einen zu behandelnden Patienten. Pharmazeutische
Präparate
zur oralen Verwendung können
als fester Arzneimittelträger
erhalten werden, gegebenenfalls indem eine resultierende Mischung
zermahlen und die Körnchenmischung
verarbeiten wird, nachdem, falls gewünscht, geeignete Hilfsstoffe
zugegeben wurden, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Arzneimittelträger sind
insbesondere Füllstoffe,
wie z. B. Zucker einschließlich
Lactose, Sucrose, Mannit oder Sorbit; Cellulosepräparate,
wie beispielsweise Maisstärke,
Weizenstärke,
Reisstärke,
Kartoffelstärke,
Gelatine, Tragantgummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose,
Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP).
Falls gewünscht,
können
Auflösungsmittel
hinzugefügt
werden, wie z. B. vernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder
ein Salz davon, wie z. B. Natriumalginat.
-
Drageekerne werden mit passenden Überzügen versehen.
Zu diesem Zweck können
konzentrierte Zuckerlösungen
verwendet werden, welche gegebenenfalls Gummiarabikum, Talk, Polyvinylpyrrolidon,
Carbopolgel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und
geeignete organische Lösungsmittel
oder Lösungsmittelmischungen
enthalten können.
Farbstoffe oder Pigmente können
zwecks Identifizierung zu den Tabletten oder Drageeüberzügen hinzugefügt werden,
oder um verschiedene Kombinationen der Dosierungen einer aktiven
Verbindung zu kennzeichnen.
-
Pharmazeutische Präparate,
welche oral eingesetzt werden können,
umfassen aus Gelatine bestehende Push-fit-Kapseln sowie weiche,
verschlossene Kapseln, die aus Gelatine und einem Weichmacher, wie z.
B. Glycerin oder Sorbit, bestehen. Die Push-fit-Kapseln können die
Wirkstoffe in Mischung mit einem Füllstoff, wie z. B. Lactose,
mit Bindemitteln, wie z. B. Stärken,
und/oder mit Schmierstoffen, wie z. B. Talk oder Magnesiumstearat,
und gegebenenfalls mit Stabilisierungsmitteln enthalten. In weichen
Kapseln können
die aktiven Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten, wie z. B. Fettölen, flüssigem Paraffin
oder flüssigen
Polyethylenglycolen, aufgelöst
oder suspendiert sein. Zusätzlich
können
Stabilisierungsmittel hinzugefügt
werden. Alle Formulierungen zür
oralen Verabreichung sollten in für eine solche Verabreichung
geeigneten Dosierungen vorhanden sein.
-
Zur bukkalen Verabreichung können die
Zusammensetzungen die Form von in herkömmlicher Weise zubereiteten
Tabletten oder Pillen aufweisen.
-
Zur Verabreichung durch Inhalation
werden die Verbindungen zur erfindungsgemäßen Verwendung geeigneterweise
in Form einer Aerosolspray-Anordnung aus Aerosolpackungen oder aus
einem Zerstäuber abgegeben,
und zwar unter Verwendung eines geeigneten Treibmittels, z. B. Dichlordifluormethan,
Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid, oder
eines anderen geeigneten Gases. Im Fall eines unter Druck stehenden
Aerosols kann die Dosierungseinheit durch Bereitstellung eines Ventils
zur Abgabe einer dosierten Menge bestimmt werden. Beispielsweise
aus Gelatine bestehende Kapseln und Patronen zur Verwendung in einem
Inhalator oder Einblaser können
so gestaltet sein, dass sie eine Pulvermischung der Verbindung und
eine geeignete Pulverbasis, z. B. Lactose oder Stärke, enthalten.
-
Die Verbindungen können für die parenterale
Verabreichung mittels Injektion, z. B. durch eine Bolus-Injektion
oder eine Dauerinfusion, formuliert werden. Formulierungen für die Injektion
können
in einer Form zur Dosierung in Einheiten vorliegen, z. B. in Ampullen
oder in Behältern
zur Mehrfachdosierung, mit beigefügtem Konservierungsstoff. Die
Zusammensetzungen können
z. B. die Form von Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder
wässrigen
Vehikeln aufweisen und können
Formulierungsmittel, wie z. B. Suspensions-, Stabilisierungs- und/oder
Dispergiermittel, enthalten.
-
Pharmazeutische Formulierungen zur
parenteralen Verabreichung umfassen wässrige Lösungen der aktiven Verbindungen
in wasserlöslicher
Form. Zusätzlich
können
Suspensionen der aktiven Verbindungen als adequate ölige Injektionssuspensionen
hergestellt wenden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel umfassen
Fettöle,
wie z. B. Sesamöl,
oder synthetische Fettsäureester,
wie z. B. Ethyloleat oder Triglyceride, oder Liposomen. Wässrige Injektionssuspensionen
können
Substanzen enthalten, welche die Viskosität der Suspension erhöhen, wie
z. B. Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit oder Dextran. Gegebenenfalls
kann die Suspension auch geeignete Stabilisierungsmittel enthalten,
oder Mittel, welche die Löslichkeit
der Verbindungen erhöhen,
um die Herstellung hochkonzentrierter Lösungen zu ermöglichen.
-
Alternativ kann der Wirkstoff in
Pulverform vorliegen, und zwar zwecks Zusammenbringung mit einem geeigneten
Vehikel, z. B. sterilem, pyrogenfreiem Wasser, vor der Verwendung.
-
Die Verbindungen können auch
zu rektalen Zusammensetzungen zubereitet werden, wie z. B. Zäpfchen oder
langsamen Einläufen,
welche z. B. herkömmliche
Zäpfchengrundbestandteile
wie Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten.
-
Abgesehen von den zuvor beschriebenen
Formulierungen können
die Verbindungen auch als Depotpräparat zubereitet werden. Derartige
langwirkende Formulierungen können
durch Implantierung oder transkutane Abgabe (beispielsweise subkutan
oder intramuskulär),
durch eine intramuskuläre
Injektion oder ein transdermales Pflaster verabreicht werden. Somit
können
die Verbindungen beispielsweise mit geeigneten polymeren oder hydrophoben
Materialien (beispielsweise als Emulsion in einem geeigneten Öl) oder
mit Ionenaustauschharzen oder al; schwer lösliche Derivate, z. B. als
schwer lösliches
Salz, zubereitet werden.
-
Die phrmazeutischen Zusammensetzungen
können
auch geeignete Fest- oder Gelphasenträger oder Arzneimittelträger umfassen.
Beispiele für
derartige Träger
oder Arzneimittelträger
umfassen Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zuckerarten,
Stärken,
Cellulosederivate, Gelatine und Polymere, wie z. B. Polyethylenglycole,
ohne auf diese beschränkt
zu sein.
-
7. Wirksame
Dosierungen
-
Zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignete pharmazeutische
Zusammensetzungen umfassen Zusammensetzungen, bei denen der Wirkstoff
in einer therapeutisch wirksamen Menge enthalten ist, d.h. in einer
Menge, die wirksam ist, um ihren beabsichtigten Zweck zu erfüllen. Natürlich hängt die
tatsächliche
Menge, die bei einer bestimmten Anwendung wirksam ist, unter anderem
vom behandelten Leiden ab. Werden derartige Zusammensetzungen beispielsweise
in Verfahren zum Induzieren einer Apoptose in neuroektodermalen Tumoren
verabreicht, so enthalten sie eine Wirkstoffmenge, die wirksam ist,
um dieses Ergebnis zu erreichen. Werden derartige Zusammensetzungen
in Verfahren zur Hemmung des Wachstums von Tumorzellen, denen p53
fehlt, verabreicht, so enthalten sie eine Wirkstoffmenge, die wirksam
ist, um dieses Ergebnis zu erreichen. Werden solche Zusammensetzungen
Patienten verabreicht, die an neuroektodermalen Tumoren leiden,
so enthalten sie eine Wirkstoffmenge, die wirksam ist, um unter
anderem die beim behandelten Patienten existierenden Symptome abzumildern
oder deren Entwicklung zu verhindern oder sein Überleben zu verlängern. Für die Verwendung
bei der Behandlung einer Krebserkrankung, die gegenüber anderen
Arzneimitteln resistent ist, umfasst eine therapeutisch wirksame
Menge weiters jene Menge einer Verbindung oder Zusammensetzung,
die das Wachstum eines Tumors stoppt oder zurückentwickelt. Die Bestimmung
einer wirksamen Menge liegt ohne weiteres innerhalb der Fähigkeiten
eines Fachmanns, insbesondere angesichts der hier dargelegten detaillierten
Offenbarung.
-
Für
jegliche, hier beschriebene Verbindung kann die therapeutisch wirksame
Menge anfänglich
aus Zellkulturreihen ermittelt werden. Die Zielplasmakonzentrationen
sind jene Konzentrationen der aktiven Verbindung/der aktiven Verbindungen,
welche in der Lage sind, eine zumindest etwa 25%ige Apoptose und/oder eine
zumindest etwa 25%ige Hemmung der Zellwucherung in Zellkulturproben
zu induzieren, natürlich
in Abhängigkeit
von der bestimmten gewünschten
Anwendung. Zielplasmakonzentrationen der aktiven Verbindung/der
aktiven Verbindungen, welche in der Lage sind, eine zumindest etwa
50%ige, 75%ige oder sogar 90%ige oder noch höhere Induktion einer Apoptosehemmung
der Zellwucherung in Zellkulturproben zu induzieren, werden bevorzugt.
Der Prozentsatz der Induktion einer Apoptose oder Hemmung der Zellwucherung beim
Patienten kann überwacht
werden, um die Angemessenheit der erzielten Plasmaarzneimittelkonzentration
zu bewerten.
-
Die therapeutisch wirksamen Mengen
zur Verwendung beim Menschen können
auch aus Tiermodellen ermittelt werden. Beispielsweise kann eine
Dosis für
den Menschen formuliert werden, um eine zirkulierende Konzentration
zu erhalten, die sich beim Tier als wirksam erwiesen hat. Tiermodelle,
die für
durch anomale Zellwucherung gekennzeichnete Erkrankungen nützlich sind,
sind im Stand der Technik wohlbekannt. Insbesondere die folgenden
Literaturhinweise bieten für
Krebsxenotransplantate geeignete Tiermodelle (Corbett et al., 1996,
J. Exp. Ther. Oncol. 1: 95–108;
Dykes et al., 1992, Contrib. Oncol. Basel. Kareger 42: 1–22); Restenose
(Carter et al., 1994, J. Am. Coll. Cardiol. 24(5): 1398-1405), Atherosklerose
(Zhu et al., 1994, Cardiology 85(6): 370–377) und Neovaskularisierung
(Epstein et al., 1987, Cornea 6(4): 250–257). Die Dosierung kann beim
Menschen angepasst werden, indem die Größe der Tumore überwacht
wird.
-
Eine therapeutisch wirksame Dosierung
kann auch aus menschlichen Daten hinsichtlich Verbindungen ermittelt
werden, von denen bekannt ist, dass sie ähnliche pharmakologische Wirkungen
aufweisen, wie z. B. Doxorubicin (siehe z. B. Brugnara et al., 1995,
JPET 273: 266–272;
Benzaquen et al., 1995, Nature Medicine 1: 534–540; Brugnara et al., 1996,
J. Clin. Invest. 97(5): 1227–1234).
Die eingesetzte Dosierung kann auf Basis der relativen Bioverfügbarkeit
und Wirkungsstärke
der verabreichten Verbindung im Vergleich zu Doxorubicin angepasst
werden.
-
Das Anpassen der Dosierung zur Erzielung
der maximalen Wirksamkeit beim Menschen, welches auf den obenstehend
beschriebenen Verfahren und auf anderen, im Stand der Technik wohlbekannten
Verfahren beruht, liegt ohne weiteres innerhalb der Fähigkeiten
eines durchschnittlichen Fachmanns.
-
Im Fall einer lokalen Verabreichung
ist die systemische zirkulierende Konzentration der verabreichten Verbindung
natürlich
von keiner besonderen Bedeutung. In solchen Fällen wird die Verbindung verabreicht,
um im lokalen Bereich eine Konzentration zu erzielen, die wirksam
ist, um das beabsichtigte Ergebnis zu erreichen.
-
Für
die Verwendung bei der Prophylaxe und/oder Behandlung neuroektodermaler
Tumore wird eine zirkulierende Konzentration der verabreichten Verbindung
von etwa 0,001 μM
bis 20 μM
als wirksam erachtet, wobei etwa 0,1 μM bis 5 μM bevorzugt werden.
-
Patientendosierungen für die orale
Verabreichung der hier beschriebenen Verbindungen, was die bevorzugte
Verabreichungsmethode zur Behandlung neuroektodermaler Tumore ist,
reichen typischerweise von etwa 80 mg/Tag bis 16.000 mg/Tag, noch
typischer von etwa 800 mg/Tag bis 8.000 mg/Tag, und am typischsten von
etwa 800 mg/Tag bis 4.000 mg/Tag. In Hinblick auf das Körpergewicht
des Patienten ausgedrückt,
reichen typische Dosierungen von etwa 1 bis 200 mg/kg/Tag, noch
typischer von etwa 10 bis 100 mg/kg/Tag, und am typischsten von
etwa 10 bis 50 mg/kg/Tag. In Hinblick auf die Körperoberfläche des Patienten ausgedrückt, reichen
typische Dosierungen von etwa 40 bis 8000 mg/m2/Tag,
noch typischer von etwa 400 bis 4000 mg/m2/Tag,
und am typischsten von etwa 400 bis 2000 mg/m2/Tag.
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Für
die Verwendung bei der Behandlung von Tumoren, die durch ihre Resistenz
gegenüber
anderen chemotherapeutischen Mitteln gekennzeichnet sind, einschließlich Tumoren,
denen p53-Wildtypproteine fehlen oder die Defekte im CD95-System
aufweisen, wird eine zirkulierende Konzentration der verabreichten
Verbindung von etwa 0,001 μM
bis 20 μM
als wirksam erachtet, wobei etwa 0,1 μM bis 5 μM bevorzugt werden.
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Patientendosierungen für die orale
Verabreichung der hier beschriebenen Verbindungen zur Behandlung
oder Verhinderung von Krebserkrankungen reichen typischerweise von
etwa 80 mg/Tag bis 16.000 mg/Tag, noch typischer von etwa 800 mg/Tag
bis 8.000 mg/Tag, und am typischsten von etwa 800 mg/Tag bis 4.000
mg/Tag. In Hinblick auf das Körpergewicht
des Patienten ausgedrückt,
reichen typische Dosierungen von etwa 1 bis 200 mg/kg/Tag, noch
typischer von etwa 10 bis 100 mg/kg/Tag, und am typischsten von
etwa 10 bis 50 mg/kg/Tag. In Hinblick auf die Körperoberfläche des Patienten ausgedrückt, reichen
typische Dosierungen von etwa 40 bis 8000 mg/m2/Tag,
noch typischer von etwa 400 bis 4000 mg/m2/Tag,
und am typischsten von etwa 400 bis 2000 mg/m2/Tag.
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Für
andere Verabreichungsmethoden können
Dosierungsmenge und Dosierungsintervall individuell angepasst werden,
um Plasmapegel der verabreichten Verbindung bereitzustellen, welche
hinsichtlich der bestimmten klinischen Indikation, die behandelt
wird, wirksam sind. Für
die Verwendung bei der Behandlung tumorerzeugender Krebserkrankungen
können
die Verbindungen vor, während
oder nach der operativen Entfernung des Tumors verabreicht werden.
Beispielsweise können
die Verbindungen dem Tumor vor dem chirurgischen Eingriff über eine
Injektion in die Tumormasse verabreicht werden, und zwar in einer
einzigen oder in mehreren Dosierungen. Der Tumor oder soviel wie
möglich
vom Tumor kann dann operativ entfernt werden. Weitere Dosen des
Arzneimittels können
nach der Entfernung an der Tumorstelle eingesetzt werden. Alternativ kann
der operativen Entfernung von soviel wie möglich des Tumors die Verabreichung
der Verbindungen an der Tumorstelle vorangehen.
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In Kombination mit den hier dargelegten
Lehren kann durch Auswählen
unter den verschiedenen aktiven Verbindungen und Bewertungsfaktoren,
wie z. B. Wirkungsstärke,
relative Bioverfügbarkeit,
Körpergewicht
des Patienten, Schwere der nachteiligen Nebenwirkungen und bevorzugte
Verabreichungsmethode, ein wirksamer prophylaktischer oder therapeutischer
Behandlungsablauf geplant werden, welcher keine substantielle Toxizität bewirkt
und dennoch gänzlich
dahingehend wirkt, die klinischen Symptome, die ein bestimmter Patient
aufweist, zu behandeln. Natürlich
sind viele Faktoren bei der Bestimmung eines Therapieablaufs, der für eine bestimmte
Indikation oder einen bestimmten Patienten geeignet ist, wichtig.
Schwere Indikationen rechtfertigen die Verabreichung höherer Dosen
im Vergleich zu weniger schweren Indikationen.
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8. Toxizität
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Das Verhältnis zwischen Toxizität und therapeutischer
Wirkung bei einer bestimmten Verbindung ist deren therapeutischer
Index und kann als Verhältnis
zwischen LD50 (der Menge einer Verbindung,
die bei 50% der Population tödlich
ist) und ED50 (der Menge einer Verbindung,
die bei 50% der Population wirksam ist) ausgedrückt werden. Verbindungen, welche
hohe therapeutische Indices aufweisen, werden bevorzugt. Aus Zellkulturproben
und/oder Tierstudien erhaltene Daten des therapeutischen Index können zur
Zubereitung einer Reihe von Dosierungen zur Verwendung beim Menschen
eingesetzt werden. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise
in einem Bereich von Plasmakonzentrationen, welche die ED50 mit geringer oder ohne Toxizität umfassen.
Die Dosierung kann in diesem Bereich in Abhängigkeit von der angewandten
Dosierungsform und dem eingesetzten Verabreichungsweg variieren.
Die genaue Formulierung, der genaue Verabreichungsweg und die genaue
Dosierung können
vom jeweiligen Arzt in Anbetracht des Zustands des Patienten gewählt werden.
(Siehe z. B. Fingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of
Therapeutics, Abs. 1, S. 1).
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9. Verpackung
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Die Zusammmensetzungen können, falls
gewünscht,
in einer Verpackungs- oder Spendervorrichtung vorhanden sein, welche
ein oder mehrere, den Wirkstoff enthaltende Formen zur Dosierung
in Einheiten enthalten kann. Die Verpackung kann beispielsweise
Metall- oder Plastikfolie, wie z. B. ein Blisterpack, umfassen. Der
Verpackungs- oder Spendervorrichtung können Instruktionen zur Verabreichung
beigelegt sein. Zusammensetzungen, die eine erfindungsgemäße Verbindung
umfassen, welche in einem kompatiblen pharmazeutischen Träger formuliert
ist, können
ebenfalls hergestellt, in einen geeigneten Behälter gegeben und hinsichtlich
der Behandlung eines angegebenen Zustands markiert werden. Geeignete
Zustände,
die auf der Markierung angegeben sind, können die Behandlung neuroektodermaler
Tumore, des Medulloblastoms, des Neuroblastoms, des Ewing-Sarkoms
und dergleichen umfassen.
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Die folgenden Beispiele für die Erzeugung
und Anwendung der erfindungsgemäßen Auswahlsysteme sind
dargelegt, um dem Fachmann ein genaueres Verständnis und ein Ausüben der
vorliegenden Erfindung zu ermöglichen.
Einige Materialien zu den nachfolgenden Beispielen wurden veröffentlicht
bei Fulda et al., 1997; Cancer Res. 57: 4956- 4964 und Fulda et al., 1998, Cancer
Res. 58: 4453–4460,
hier durch Querverweise aufgenommen.
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VI. BEISPIELE
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Beispiel 1: Synthese von
Verbindungen der Formel I
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28-Acetyl-3-β-D-glucosylbetulin: 1 Äqu. Betulin
wurde bei Raumtemperatur 12 Stunden lang mit einem Überschuss
Acetanhydrid in Pyridin als Lösungsmittel
behandelt, um 3,28-Diacetylbetulin
zu ergeben. 1 Äqu. 3,28-Diacetylbetulin
wurde mit 1 Äqu.
NaOH in Ethanol behandelt, um 28-Acetylbetulin in 61%-iger Ausbeute zu
ergeben. 28-Acetylbetulin wurde gemäß der Verfahrensweise von S.
Ohara et al., Mokuzai Gakkaishi 40(4): 4444–51 (1994), erhalten. Spezifisch
wurde 1 Äqu.
28-Acetylbetulin mit 3 Äqu.
2,3,4,6-Tetraacetyl-β-Dglucopyranosylbromid
behandelt, und zwar in Gegenwart eines Überschusses von Hg(CN)2 und in Nitromethan als Lösungsmittel,
um ein rohes Reaktionsprodukt zu ergeben, das durch eine Säulenchromatographie
gereinigt wurde, um 28-Acetyl-3-β-D-(2,3,4,6-tetraacetyl)glucosylbetulin
in 62%-iger Ausbeute bereitzustellen. 1 Äqu. des so erhaltenen 28-Acetyl-3-β-D-(2,3,4,6-tetraacetyl)glucosylbetulins
wurde danach bei 40–50°C 1 Stunde lang
mit einem Überschuss
einer 4 : 2 : 1-Mischung aus McOH : H2O
: Et3N behandelt, um die im obigen Titel angeführte Verbindung
in 62%-iger Ausbeute zu ergeben.
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28-Acetyl-3-β-D-galactosylbetulin: 28-Acetyl-3-β-D-galactosylbetulin
wurde gemäß der Verfahrensweise
des obigen Beispiels 1 hergestellt, abgesehen davon, dass 2,3,4,6-Tetraacetyl-β-D-galactopyranosylbromid
anstelle von 2,3,4,6-Tetraacetyl-β-Dglucopyranosylbromid
verwendet wurde und dass das 28-Acetyl-3-β-D-galactosylbetulin nicht von
seiner Reaktionsmischung gereinigt wurde.
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3-Acetyl-28-β-D-glucosylbetulin: Um 3-Acetylbetulin
zu ergeben, wird 1 Äqu.
Betulin bei 0°C
mit einem Überschuss
Acetanhydrid in Pyridin als Lösungsmittel
behandelt, und zwar 0,5 bis 1 Stunde lang oder solange, bis eine
Dünnschichtchromatographie
anzeigt, dass die Reaktion beendet ist.
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1 Äqu. β-D-Glucose wird in Gegenwart
von Pyridin als Lösungsmittel
mit einem Überschuss
Trichloracetylchlorid behandelt, um eine Mischung aus Pertrichloracetyl-β-Dglucose
und Pertrichloracetyl-β-D-glucose zu
ergeben. 1 Äqu.
der so erhaltenen Mischung aus Pertrichloracetyl-β-D-glucose
und Pertrichloracetyl-β-D-glucose
wird mit HBr in Essigsäure
als Lösungsmittel
behandelt, um 2,3,4,6-Tetratrichloracetyl-β-D-glucopyranosylbromid zu ergeben.
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1 Äqu. 3-Acetylbetulin wird in
Gegenwart eines Überschusses
von Hg(CN)2 und in Nitromethan als Lösungsmittel
mit einem Überschuss
2,3,4,6-Tetratrichloracetyl-β-D glucopyranosylbromid
behandelt, um ein rohes Reaktionsprodukt zu ergeben, das durch eine
Säulenchromatographie
gereinigt wird, um 3-Acetyl-28-β-D-(2,3,4,6-Tetratrichloracetyl)glucosylbetulin
bereitzustellen. 1 Äqu.
3-Acetyl-28-β-D-(2,3,4,6-Tetratrichloracetyl)glucosylbetulin
wird daraufhin mit NH3/EtOH in Chloroform
als Lösungsmittel
behandelt (V. Schwarz, Coll. Czech. Commun. 27: 2567 (1962)), um
die im obigen Titel angeführte
Verbindung zu ergeben.
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3-β-D-Galactosylbetulinsäureethylester:
Aus 1 Äqu.
Betulinsäure
wurde Betulinsäureethylester
erhalten, welcher in einer Mischung aus 50% Ethanol und Ethylacetat
als Lösungsmittel
aufgelöst
wurde. Ein Überschuss
einer Lösung
von Diazothan in Diethylether, hergestellt aus N-Nitroso-N-ethylharnstoff,
wurde unter Rühren
hinzugefügt.
Das Rühren
wurde 30 Min. lang fortgesetzt, und die Lösung wurde mit einem Überschuss Essigsäure behandelt.
Die Lösung
wurde bis zur Trockenheit abgedampft. Betulinsäureethylester fällte aus und
wurde aus Ethanol rekristallisiert. Gemäß dem im obigen Beispiel 1
beschriebenen Glycosylierungsverfahren wurde Betulinsäureethylester
(1 Äqu.)
mit 3 Äqu.
2,3,4,6-Tetraacetyl-α-D-galactosylbromid
umgesetzt, um nach einer Säulenchromatographie
2,3,4,6-Tetraacetyl-3-β-D-galactosylbetulinsäureethylester
in 58%-iger Ausbeute zu erhalten. Die Spaltung der Acetylschutzgruppen
von dieser Verbindung wurde erzielt, indem 5% KOH in Wasser/Ethanol
1 : 1 12 Stunden lang bei Raumtemperatur verwendet wurden, um die
Titelverbindung nach einer Säulenchromatographie
in 79%-iger Ausbeute zu ergeben.
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3-β-D-Galactosylbetulin:
Diese Verbindung wird wie obenstehend beschrieben hergestellt. Anstelle von
Betulinsäureethylester
wurde jedoch Betulin verwendet.
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Beispiel 2: Betulinsäure induziert
in neuroektodermalen Zellen eine Apoptose
-
Dieses Beispiel veranschaulicht,
dass Betulinsäure
in neuroektodermalen Tumoren, wie z. B. dem Neuroblastom, dem Medulloblastom
und dem Ewing-Sarkom, welche die im Kindesalter am häufigsten
vorkommenden harten Tumore darstellen, eine Apoptose induziert.
Dieses Beispiel zeigt auch, dass Betulinsäure einen Apoptosepfad auslöste, der
sich von jenem unterschied, welcher zuvor
bei standardmäßigen chemotherapeutischen Arzneimitteln
identifiziert wurde. Eine Betulinsäure-induzierte Apoptose war
unabhängig
von der CD95-Ligand/Rezeptor-Interaktion und der Anhäufung des
Wildtyp-p53-Proteins, allerdings hing sie entscheidend von der Aktivierung
von Caspasen (Interleukin-1â-umwandelndes Enzym/Ced-3-artige
Proteasen) ab. FLICE/MACH (Caspase-8), welche als stromaufwärtige Protease
in der Caspasekaskade betrachtet wird, und die stromabwärtige Caspase
CPP32/YAMA/A-Popain (Caspase-3) wurden aktiviert, was zu einer Spaltung
des Prototypsubstrats der Caspasen PARP führte. Der Breitband-Peptidhemmer
Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-Fluormethylketon, welcher die Spaltung
von FLICE und PARP blockierte, hob auch gänzlich die durch Betulinsäure ausgelöste Apoptose
auf. Der Caspasenspaltung gingen eine Störung des Mitochondrienmembran-Potentials
und die Erzeugung reaktionsfähiger
Sauerstoffarten voraus. Eine Überexpression
von Bcl-2 und BclxL verlieh gegen Betulinsäure auf
der Ebene der Mitochondrien-Fehlfunktion, der Proteaseaktivierung
und der Kernfragmentierung eine Resistenz. Dies legte nahe, dass
Mitochondrienveränderungen
bei der Betulinsäure-induzierten
Aktivierung von Caspasen eine Rolle spielten.
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Überdies
wurden Bax und Bcl-xm, zwei das Absterben
fördernde
Proteine der Bcl-2-Familie,
nach einer Betulinsäurebehandlung
hinaufgeregelt. Am wichtigsten ist, dass gegenüber einer CD95- und einer Doxorubicin-vermittelten
Apoptose resistente Neuroblastomzellen auf eine Behandlung mit Betulinsäure ansprachen, was
nahe legt, dass Betulinsäure
einige Formen der Arzneimittelresistenz umgehen kann. Betulinsäure induziert
die Apoptose auch in neuroektodermalen Zellen, welche dem Patienten
ex vivo entnommen wurden, was darauf hinweist, dass Betulinsäure in vivo
aktiv sein sollte.
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Materialien
und Verfahren
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Arzneimittel: Betulinsäure (Aldrich;
Steinheim, Deutschland) und Doxorubicin (Farmitalia, Milan, Italien)
wurden als reine Substanzen bereitgestellt und vor jedem Versuch
in DMSO (4 mg/ml Betulinsäure)
oder sterilem Wasser (1 mg/ml Doxorubicin) aufgelöst.
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Zellkultur: Neuroblastom- (SH-EP,
IMR-32, Kelly und LAN-5, freundlicherweise von Professor M. Schwab,
Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Deutschland, zur Verfügung gestellt),
Medulloblastomzellen (Daoy, freundlicherweise von Dr. T. Pietsch,
Abteilung für
Neuropathologie, Universität
Bonn, Zentrum für
Medizin, Bonn, Deutschland, zur Verfügung gestellt), Ewing-Sarkom-Zellen
(A17/95, freundlicherweise von Dr. U. Anderer, Institut für Pathologie,
Humboldt-Universität,
Berlin, Deutschland, zur Verfügung
gestellt), Melanom- (A-378), Brustkarzinom- (MCF-71), Dickdarmkarzinom-
(HT-29), Kleinzellen-Lungenkarzinom- (H-126), Nierenzellenkarzinom-
(KTCTL-26, freundlicherweise von H. Lörke, Deutsches Krebsforschungszentrum,
Heidelberg, Deutschland, zur Verfügung gestellt) und T-Zellen-Leukämie (CEM)-Zellen
wurden in RPMI 1640 (Life Technologies, Inc., Eggenstein, Deutschland),
das mit 10%igem, durch Hitze deaktiviertem Rinderfötusserum
(FCS) von Conco. (Wiesbaden, Deutschland), 10 mM HEPES, pH 7,3 (Biochrom, Berlin,
Deutschland), 100 Einheiten/ml Penicillin (Life Technologies, Inc.),
100 μg/ml
Streptomycin (Life Technologies, Inc.) und 2 mM L-Glutamin (Biochrom,
Berlin, Deutschland) ergänzt
war, kultiviert. SH-EP-Neuroblastomzellen, die stabil mit bcl-2,
bcl-XL oder einer Vektorkontrolle transfiziert
waren, wurden in Dulbeccos minimalem Eagle-Medium (Life Technologies, Inc.), welches
500 μg/m1
G418 (Geneticin, Life Technologies, Inc.) enthielt, kultiviert,
wie bei Dole et al., 1994, Cancer Res. 54: 3253–3259 und Dole et al., 1995,
Cancer Res. 55: 2576–2582
beschrieben. SH-EPCD95R und SH-EPDpxoR-Zellen, Varianten der gegenüber anti-CD95
bzw. Doxorubicin resistenten SH-EP-Neuroblastomzellen, wurden durch
eine mehr als 6 Monate dauernde, kontinuierliche Kultivierung in
Gegenwart des agonistischen anti-APO-1-(anti-CD95)-Antikörpers (1 μg/ml; Trauth
et al., 1989, Science (Washington DC). 245: 301–305) oder von Doxorubicin
(0,1 μg/m1
) hergestellt. Für
die Versuche wurden resistente Zellen gewaschen und in einem Medium
ohne anti-APO-1 (anti-CD95) 24 Stunden lang oder ohne Doxorubicin
2 Wochen lang kultiviert.
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Bestimmung einer Apoptose: Die quantitative
Bestimmung der DNA-Fragmentierung wurde durch eine FACS-Analyse
von Propidiumiodid-gefärbten
Zellkernen durchgeführt,
wie bei Nicoletti et al., 1991, J. Immunol. Methods, 139: 271–279, beschrieben.
Die Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie (FACScan, Becton Dickinson,
Heidelberg, Deutschland) hinsichtlich des DNA-Anteils analysiert,
wobei die CELLQuest-Software eingesetzt wurde. Frühe apoptotische
Veränderungen
wurden nach den Instruktionen des Herstellers durch Einfärbung mit
biotinyliertem Annexin V (Bender Med Systems, Wien, Österreich)
identifiziert. Annexin V bindet an Phosphatidylserin, das an der
Oberfläche
apoptotischer Zellen freigelegt ist. Koopman et al., 1994, Blood,
84: 1415–1420.
Die Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie (FAC-Scan, Becton
Dickinson) analysiert, wobei die CELLQuest-Software eingesetzt wurde.
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Herstellung von Neuroblastomtumor-Proben:
Frische Tumorproben von zwei Patienten mit Neuroblastomen der Stufe
IV5 bzw. IV wurden aus operativen Resektionen vor der Chemotherapie
erhalten und unverzüglich
analysiert. Einzellen-Suspensionen wurden unter Verwendung von DNase
(0,154 mg/ml), Collagenase (0,416 mg/ml) und Hyaluronidase (0,33
mg/ml; Boehringer Mannheim) hergestellt. Eine Zweifarben-Fluoreszenz
unter Verwendung eines FITC-konjugierten Maus-Antimensch-GD2-Antikörpers (IgG2a,
0,2 mg/ml, freundlicherweise von R. Handgretinger, Universität Tübingen,
Tübingen,
Deutschland, zur Verfügung
gestellt) und von biotinyliertem Annexin V (Bender Med Systems),
gefolgt von Streptavidin-Phycoerythrin, wurde durchgeführt, um
apoptotische Neuroblastomzellen zu detektieren. Wu et al., 1986,
Cancer Res. 46: 440–443.
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Inkubation mit einem Tripeptidhemmer
von Caspasen oder F(ab')2 Anti APO-1 (anti-CD95); Antikörperfragmente:
Der Breitband-Tripeptidhemmer von Caspasen 2VAD-tmk
(Enzyme Systems Products, Dublin, CA) wurde in einer Konzentration
von 60 im verwendet. Die Herstellung von F(ab')2 anti-APO-1
(anti-CD95)-Antikörperfragmenten
und des Isotyp-abgestimmten Antikörpers F1123 (IgG3) wurde durchgeführt wie
bei Dhein et al., 1995, Nature (Lond.) 375: 81–83, beschrieben. Die Zellen
wurden vor der Zugabe von Betulinsäure bei 37°C 1 Stunde lang mit 10 μg/m1 F(ab')2 anti-APO-1-Antikörperfragmenten oder 10 μg/ml F(ab')2 F1123-Antikörperfragmenten inkubiert.
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Bestimmung der Caspaseaktivität: Die Caspaseaktivität wurde
mittels einer FACS-Analyse gemessen, wie bei Los et al., 1995, Nature
(Lond.) 375: 81–83,
beschrieben. Kurz gesagt, die Zellen wurden mit dem Fluorogensubstrat
Val-Ala-Asp-[2(4-Methoxynaphthylamid)] in einer Endkonzentration
von 50 μm
(Enzyme Systems Products) in einem hypotonischen Medium beladen.
Die Fluoreszenz wurde mit einem Durchflusszytometer (FACVantage,
Becton Dickinson) gemessen, wobei eine Anregungswellenlänge von
365 nm und eine Emissionswellenlänge
von 425 nm angewandt wurde.
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Bewertung von Mitochondrienpotential,
intrazellulären
Peroxiden und Membranperoxidation: Das kationische lipophile Fluorochrom
DiOC6(3) (460 ng/ml, Molecular Probes, Eugene,
OR) wurde zur Messung des ΔΨm, eingesetzt. HE (126 ng/ml, Molecular Probes)
wurde zur Bestimmung der ROS-Erzeugung eingesetzt, und NAO (94 ng/ml,
Molecular Probes) wurde zur Bestimmung der Lipidperoxidation eingesetzt.
Kroemer et al., 1997, Immunol. Todar, 18: 44–51. Die Zellen wurden in Gegenwart
der Fluorochrome bei 37°C
12 Minuten lang inkubiert, in PBS/1% FCS gewaschen und unverzüglich mittels
Durchflusszytometrie (FACScan, Becton Dickinson) analysiert. DiOC6(3) und NAO-Fluoreszenz wurden in Fluoreszenz 1
aufgezeichnet; die He-Fluoreszenz wurde in Fluoreszenz 3 bewertet.
Der Prozentsatz an Zellen mit niedrigem Mitochondrienpotential oder
erhöhter
ROS-Produktion wurde im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen
berechnet.
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RT-PCR für CD95-L mRNA: Eine Gesamt-RNA
wurde unter Verwendung des Qiagen-Gesamt-RNA-Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland)
hergestellt. Durch Reverse Transcripton wurde die RNA in cDNA umgewandelt
und mittels PCR in einem Thermozykler (Stratagene, Heidelberg, Deutschland)
38 Zyklen lang amplifiziert, wobei das Gene Amplification-RNA-PCR-Kit
(Perkin-Elmer, Branchburg, NJ) gemäß den Instruktionen des Herstellers
eingesetzt wurde. Die für
die Amplifikation des CD95-L-Fragments verwendeten Primer entsprechen
der Sequenz des menschlichen CD95-L (Suda et al., 1995, Cell 75:
1169-1178; Herr
et al., 1996, Cell Death Diff., 5: 299–305). Die Expression von α-Actin (MWG- Biotech, Ebersberg,
Deutschland) wurde als interner Standard für die RNA-Integrität und eine
gleiche Gelbeladung eingesetzt. Die PCR-Produkte wurden bei 60 V
2 Stunden lang über
ein mit Ethidiumbromid gefärbtes,
1,5%iges Agarosegel laufen gelassen und durch UV-Beleuchtung sichtbar gemacht.
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Western-Blot-Analyse: Die Zellen
wurden 30 Min. lang bei 4°C
in PBS mit 0,5% Triton X (Serva, Heidelberg, Deutschland) und 1
mM Phenylmethylsulfonylfluorid (Sigma, Deisenhofen, Deutschland)
lysiert, gefolgt von einer Hochgeschwindigkeitszentrifugation. Die
Membranproteine wurden in einem 0,1 M Glycin, pH 3,0, und 1,5 M
Tris, pH 8,8, enthaltenden Puffer eluiert. Die Proteinkonzentration
wurde unter Verwendung von Bicinchoninsäure (Pierce Chemical Co., Rockford,
IL) analysiert. Vierzig μg
Protein pro Bahn wurden durch 12%ige SDS-PAGE abgetrennt und auf
Nitrocellulose (Amersham, Braunschweig, Deutschland) elektrogeblottet.
Eine gleiche Proteinbeladung wurde durch eine Ponceau-Rotfärbung der
Membrane kontrolliert. Nach einstündiger Blockierung in mit 2%
BSA (Sigma) und 0,1% Tween 20 (Sigma) ergänztem PBS wurde eine Immundetektion
des FLICE-, CPP32-, PARP-, Bax-, Bcl-x-, Bcl-2- und p53-Proteins
durchgeführt,
wobei der monoklonale Maus-anti-FLICE-Antikörper C15 (1 : 5-Verdünnung des
Hybridomüberstands),
der monoklonale Maus-anti-CPP32-Antikörper (1 : 1000, Transduction
Laboratories, Lexington, KY), der polyklonale Kaninchen-anti-PARP-Antikörper (1
: 10000, Enzyme Systems Products), der polyklonale Kaninchen-anti-Bax-Antikörper (1
: 500, Calbiochem, Bad Soden, Deutschland), der polyklonale Kaninchen-anti-Bcl-x-Antikörper (1
: 1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), der monoklonale
Maus-anti-p53-Antikörper
(1 : 10000, Transduction Laboratories) und der Ziegen-anti-Maus-IgG-
oder der Ziegen-anti-Kaninchen-IgG
(1 : 5000, Santa Cruz Biotechnology), ECL (Amersham) zur Detektion
eingesetzt wurden.
-
Ergebnisse
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Betulinsäure induziert in neuroektodermalen
Zellen eine Apoptose. 1A zeigt das
Herbeiführen
einer Apoptose durch Betulinsäure
in verschiedenen Tumorzelllinien. Die Zellen wurden 72 Stunden lang
mit 10 μg/m1
Betulinsäure
behandelt. Die Apoptose wurde mittels einer FACS-Analyse von Propidiumiodid-gefärbten Zellkernen
bewertet. Der Prozentsatz an spezifischer Apoptose wurde wie folgt
berechnet: experimentelle Apoptose (%) – spontane Apoptose in einem
Medium (%)/[100% – spontane
Apoptose in einem Medium (%)] × 100%.
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Die untersuchten Zelllinien waren
ein Neuroblastom (SH-EP), ein Medulloblastom (Daoy), ein Ewing-Sarkom
(A17195), ein Melanom (A.378), ein Brustkarzinom (MCF-7), ein Dickdarmkarzinom
(HT-29), ein Kleinzellen-Lungenkarzinom- (H-146), ein Nierenzellenkarzinom
(KTCTL-26) und T-Zellen-Leukämie
(CEM). Jede Säule
ist ein Mittel von drei Werten. Die Standardabweichungen (Sds) betrugen
weniger als 10%. Ähnliche
Ergebnisse wurden in drei getrennten Versuchen erzielt.
-
1B zeigt
die Dosis-Wirkung einer Betulinsäure-induzierten
Apoptose. SH-EP (♦),
LAN-5 (Δ), IMR-32
(x) und Kelly
-Neuroblastomzellen wurden
72 Stunden lang mit Betulinsäure
in den angezeigten Konzentrationen behandelt. Die Apoptose wurde
mittels einer FACS-Analyse von Propidiumiodid-gefärbten Zellkernen
bewertet. Der Prozentsatz an spezifischer Apoptose wurde berechnet
wie bei
1A beschrieben. Jeder Datenpunkt
ist ein Mittel von drei Werten. Die SDs betrugen weniger als 10%. Ähnliche
Ergebnisse wurden in drei getrennten Versuchen erzielt.
-
1C zeigt
die Dosis-Wirkung einer Betulinsäure-induzierten
Apoptose in Neuroblastomzellen ex vivo. Einzellen-Suspensionen wurden
aus Tumorproben hergestellt, welche durch eine operative Resektion
vor der Chemotherapie erhalten wurden, und wurden mit den angegebenen
Betulinsäurekonzentrationen
18 Stunden lang inkubiert. Eine Zweifarben-Fluoreszenzfärbung unter
Verwendung eines FITC-konjugierten Maus-Antimensch-GD2-Antikörpers und von biotinyliertem
Annexin V, gefolgt von Streptavidin-Phycoerythrin, wurde mit einem Durchflusszytometer
durchgeführt.
Die spezifische Apoptose wurde berechnet wie bei 1 A
beschrieben. Repräsentative
Daten eines von zwei Patienten werden gezeigt. Die Versuche wurden
dreifach durchgeführt.
Die SDs betrugen weniger als 10%.
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Es wurde herausgefunden, dass Neuroblastom-,
Medulloblastom- und Ewing-Sarkom-Zellen
auf Betulinsäure
stark ansprechen, und zwar neben Melanomzellen, von denen zuvor
berichtet wurde, dass sie auf Betulinsäure ansprechen. Im Gegensatz
dazu waren Epitheltumore, wie z. B. Brustkarzinom-, Dickdarmkarzinom-,
Kleinzellen-Lungenkarzinom-
und Nierenzellenkarzinom- sowie T-Zellen-Leukämiezellen, für eine Behandlung
mit Betulinsäure
beinahe völlig
unempfänglich
(1A).
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Mit Betulinsäure behandelte Neuroblastomzellen
wiesen mit Schrumpfung, Membranbläschen und Kernfragmentierung
die typischen morphologischen Merkmale apoptotischer Zellen auf.
Die Dosis-Wirkung einer Bongkreksäure-induzierten Apoptose wurde
mittels Durchflusszytometrie bewertet, wobei die DNA mit Propidiumiodid
gefärbt
wurde (1B). Durch eine Agarosegel-Elektrophorese
wurde auch die DNA-Fragmentierung
der mit Betulinsäure
behandelten Neuroblastomzellen entdeckt (Daten nicht gezeigt). Zusätzlich zur
DNA-Analyse wurde die Apoptose auch durch eine Annexin V-Färbung abgeschätzt, was ähnliche
Ergebnisse erbrachte (Daten nicht gezeigt). Um zu untersuchen, ob
die Betulinsäure
auf Neuroblastomzellen ex vivo wirkte oder nicht, analysierten wir
aus Tumorproben erhaltene Zellpräparate
mittels einer FACS-Analyse unter Anwendung einer Zweifarben-Fluoreszenz,
um durch anti-GD2-Färbung
die Apoptose in Tumorzellen zu identifizieren. Wu et al., 1986,
Cancer Res. 46 : 440–443.
Die von den Patienten gewonnenen Neuroblastomzellen machten sogar
bei geringen Konzentrationen von 0,5 μg/ml Betulinsäure eine
rasche Apoptose durch (1C). Diese
Ergebnisse legen nahe, dass Betulinsäure in vivo eine starke Antitumorwirkung
ausüben könnte.
-
Caspasen vermitteln eine Bonkreksäure-induzierte
Apoptose: Die Aktivierung der CD95-Rezeptor-proximalen Caspase FLICS und
der stromabwärtigen
Caspase CPP32 wurde überwacht,
um verschiedene Komponenten der Caspasekaskade zu bewerten.
-
2A zeigt
eine von Betulinsäure
beeinflusste Caspaseaktivität.
SH-EP-Neuroblastomzellen
wurden für
die angegebenen Zeiträume
mit 1 (x), 5 (•),
10 ( i ) und 50
μg/m1 Betulinsäure inkubiert.
Die Zellen wurden durch einen hypotonischen Schock durchlässig gemacht,
mit 50 μM
des Fluorogensubstrats Val-Ala-Asp-[2(4-Methoxynaphthylaroid)] inkubiert und
mit einem Durchflusszytometer analysiert. Jeder Datenpunkt ist ein
Mittelwert aus drei unabhängigen
Versuchen in dreifacher Ausführung.
Die SDs betrugen weniger als 10%.
-
2B und 2C zeigen die Spaltung von FLICE, CPP32
und PARP. SH-EP-Neuroblastomzellen wurden
für die
angegebenen Zeiträume
mit 10 μg/ml
Betulinsäure
oder 24 Stunden lang mit 0,5 μg/ml
Doxorubicin behandelt. Vierzig μg
aus Zelllysaten isoliertes Protein pro Bahn wurden durch 12%ige
SDS-PAGE abgetrennt, eine Immundetektion von FLICE- (2B), CPP32- (2C)
und PARP (C)-Proteinen wurde durch einen monoklonalen Maus-anti-FLICE-Antikörper, einen
monoklonalen Maus-anti-CPP32-Antikörper oder
einen polyklonalen Kaninchen-anti-PARP-Antikörper und ECL durchgeführt. Das
Verarbeiten von FLICS, das als mit zwei FLICE-Isoformen (Caspase-8/a
und 8/b) übereinstimmendes
Doppelband detektiert wurde, führte
zur p43- bzw. p4- (von Caspase-8/a bzw. 8/b abgeleitete Spaltungszwischenprodukte)
sowie zur aktiven p18-Untereinheit.
-
2D zeigt
die Hemmung einer Betulinsäure-induzierten
Apoptose durch zVADmk. SH-EP-Neuroblastomzellen wurden in Abwesenheit
oder Anwesenheit (?)
von 60 μM
zVAD-fmk 72 Stunden lang mit 10 μg/m1
Betulinsäure
behandelt. Die spezifische Apoptose wurde bestimmt und berechnet
wie in der Zeichenerklärung
für
1A beschrieben. Jede Säule ist ein Mittelwert aus
drei unabhängigen
Versuchen in dreifacher Ausführung.
Die SDs betrugen weniger als 10%.
-
2E zeigt
die Hemmung einer Betulinsäure-induzierten
Spaltung von FLICS und PARP durch zVAD-fmk. SH-EP-Neuroblastomzellen
wurden mit oder ohne 60 μM
zVADfmk 24 Stunden lang mit 10 μg/m1 Betulinsäure behandelt.
Die Western-Blot-Analyse hinsichtlich der FLICS- und PARP-Spaltung
wurde durchgeführt
wie bei 2B beschrieben.
-
Betulinsäure bewirkte einen starken
Anstieg der Caspaseaktivität,
welche 18 Stunden nach Zugabe der Betulinsäure einen Höhepunkt erreichte (2A). FLICE wurde nach der Behandlung mit
Betulinsäure
in aktive p18-Untereinheiten gespalten (2B).
Außerdem
wurde CPP32 proteolytisch verarbeitet, und PARP, eines der bekannten
Substrate für
CPP32, wurde proteolytisch verarbeitet, und PARP, eines der bekannten Substrate
für CPP32
(35), wurde in sein charakteristisches M 85.000-Fragment gespalten
(2C). Die Inkubation mit zVAD-fmk
stoppte die Apoptose nach einer Behandlung mit Betulinsäure beinahe
vollständig (2D) und hemmte die Spaltung von FLICE
und PARP (2E), was darauf hinwies,
dass die Caspasen bei der Betulinsäure-induzierten Apoptose eine
entscheidende Rolle spielten. Um zu untersuchen, ob die Betulinsäure FLICE
direkt spalten konnte oder nicht, wurde eine in vitro-Spaltungsanalyse
durchgeführt.
Nachdem in vitrotranslatiertes, 35S-markiertes
FLICE bei 4 oder 37°C
24 Stunden lang mit Betulinsäure
inkubiert worden war, wurden keinerlei Spaltprodukte nachgewiesen,
was zeigte, dass Betulinsäure
FLICE nicht direkt spaltete (Daten nicht gezeigt), während das
aktivierte CD95 DISC, wenn es in einer in vitro-FLICE-Analyse eingesetzt
wurde, FLICE spaltete. Medema et al., 1997, EMBO J., 16: 2794–2804.
-
Betulinsäure induziert eine Apoptose
unabhängig
vom CD95-System: 3A zeigt die Analyse
einer CD95-L mRNA-Expression durch RT-PCR. SH-EP-Neuroblastomzellen
wurden für
die angegebenen Zeiträume
mit 5 und 10 μg/m1
Betulinsäure
oder 24 Stunden lang mit 0,5 μg/ml
Doxorubicin inkubiert. Die CD95-L mRNA-Expression wurde mittels
RT-PCR bestimmt. Die Expression von α-Actin wurde zur Kontrolle der RNA-Integrität und einer
gleichen Gelbeladung eingesetzt.
-
3B zeigt
den Glücksfall
einer Hemmung der Betulinsäure-induzierten
Apoptose durch F(ab')
2 anti-APO-1 (anti-CD95).
SH-EP-Neuroblastomzellen wurden nach einstündiger Vorinkubation mit einem
Medium
, 10 μg/ml F(ab')
2 FII23
(IgG3-ontro antikörper: ☐)
oder 10 μg/m1
F(ab')
2 anti-APO-1 (anti-CD95: blockierender
Antikörper:
72 Stunden lang mit 10 μg/m1 Betulinsäure, 50μg/ml VP-16,
10 μg/ml
Cisplatin (DDP) oder 0,5 μg/m1
Doxorubicin behandelt. Die spezifische Apoptose wurde bestimmt und
berechnet wie in der Zeichenerklärung
für
1A beschrieben. Jede Säule ist ein Mittelwert aus
drei unabhängigen
Versuchen in dreifacher Ausführung.
Die SDs betrugen weniger als 10%.
-
Betulinsäure induzierte keine CD95-L
mRNA, wie durch RT-PCR bewertet, während Doxorubicin die CD95-L
mRNA stark höherregulierte
und auch die FLICE-Spaltung stimulierte (3A und 2B). Überdies konnte
nach einer Inkubation mit Betulinsäure keine Höherregulierung des CD95-Proteins
detektiert werden (Daten nicht gezeigt), während über eine Höherregulierung von CD95 als
Reaktion auf cytotoxische Arzneimittel berichtet wurde. Siehe z.
B. Debatin et al., 1997, J. Natl. Cancer Irrst. 89: 750–751; Micheau,
1997, J.
-
Natl. Cancer Inst. 89: 783–789. Eine
Blockierung von CD95 durch P(ab')2 anti-APO-1-Antikörperfragmente,
bei denen zuvor gezeigt wurde, dass sie das autokrine/parakrine
Absterben in T-Zellen hemmen, und eine durch Arzneimittel ausgelöste Apoptose
hemmten nicht den Bongkreksäure-induzierten
Zelltod, während die
Apoptose nach einer Behandlung mit Doxorubicin, Cisplatin und VP-16
merklich reduziert wurde (3B). Zusammen
weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass eine durch Bongkreksäure vermittelte
Apoptose unabhängig
von der CD95-L/Rezeptor-Interaktion war.
-
Betulinsäure induziert eine Störung der
Mitochondrienfunktion: 4A zeigt eine
Verringerung des Mitochondrienmembran-Potentials und eine Überproduktion
von ROS. SH-EP-Neuroblastomzellen wurden für die angegebenen Zeiträume mit
10 μg/m1
Betulinsäure
behandelt. Die Zellen wurden mit dem Fluorochrom DiOC6(3)
gefärbt,
um ΔΨm zu bestimmen, und mit HE, um die ROS-Erzeugung
zu bestimmen, und sie wurden mittels einer Durchflusszytometrie
analysiert. Der mehrfache Anstieg an Zellen mit geringem ΔΨm [DiOC6(3)low] oder mit verstärkter ROS-Erzeugung (He+) ist
dargestellt. 4B zeigt die Lipidperoxidation.
SH-EP-Neuroblastomzellen, die 24 Stunden lang mit 10 μg/ml Bonkreksäure behandelt
wurden (dicke Linie), oder Kontrollzellen (dünne Linie) wurden mit NAO filtriert,
um das oxidierte Cardiolipin abzuschätzen, und wurden mittels einer
Durchflusszytometrie analysiert.
-
Die Behandlung von SH-EP-Zellen mit
Betulinsäure
bewirkte eine Zerstörung
des ΔΨm, gefolgt von einer ROS-Überproduktion (4A).
Der frühe
Verlust des Mitochondrienpotentials kann eine direkte Wirkung der
Betulinsäure
auf die Mitochondrienfunktion wiederspiegeln. ΔΨm-Zusammenbruch und ROS-Erzeugung gingen
einer Caspasenspaltung voraus, was nahe legt, dass bei der Aktivierung
von Caspasen Mitochondrienvorgänge
eine Rolle spielen könnten.
Um zu bestimmen, ob das in den Mitochondrien erzeugte ROS eine direkte
lokale Wirkung auf die Mitochondrienmembrane hatte, wurde die Menge
an intaktem Cardiolipin, einem Molekül, das auf die innere Mitochondrienmembran
beschränkt
ist, mittels des Fluorochroms NAO abgeschätzt. Wie in 4B gezeigt,
wurde die Mitochondrien-ROS-Erzeugung von einer reduzierten Einfärbung mit
NAO begleitet, was nahe legt, dass die Produktion von ROS eine sofortige
Beschädigung
der inneren Mitochondrienmembran verursachte. Somit schien die Bongkreksäure-induzierte
Apoptose mit einer Mitochondrien-Fehlfunktion zusammenzuhängen.
-
Beteiligung von Proteinen der Bcl-2-Familie
und von p53 an einer Bongkreksäureinduzierten
Apoptose: 5A zeigt die Hemmung einer
Betulinsäure-induzierten
Störung
der Mitochondrienfunktion durch Überexpression
von Bcl-2 und Bcl-XL SH-EP-Neuroblastomzellen,
die nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor, bcl-2 oder bcl-XL transfiziert waren, wurden für die angegebenen
Zeiträume
mit 10 μg/m1
Betulinsäure
behandelt. Die Zellen wurden mit dem Fluorochrom DiOC6(3)
gefärbt,
um ΔΨm zu bestimmen, und mit HE, um die ROS-Erzeugung
zu bestimmen, und sie wurden mittels einer Durchflusszytometrie
analysiert. Der mehrfache Anstieg an Zellen mit geringem ΔΨm (DiOC6(3)low-Zellen, linke Tafel oder mit verstärkter ROS-Produktion (He+-Zellen,
rechte Tafel) ist dargestellt.
-
5B zeigt
die Hemmung einer Betulinsäure-induzierten
FLICE- und PARP-Spaltung
durch Überexpression
von Bcl-2 und Bcl-X. Neuroblastomzellen, die nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor
(Neo), bcl-2 oder bcl-XL transfiziert waren,
wurden unbehandelt gelassen (-) oder 24 Stunden lang mit 10 μg/m1 Bonkreksäure behandelt
(+). Die Western-Blot-Analyse hinsichtlich der FLICE- und PARP-Spaltung
wurde durchgeführt
wie bei 2B beschrieben.
-
5C zeigt
die Induktion von Bax und Bcl-Xs. SH-EP-Neuroblastomzellen
wurden für
die angegebenen Zeiträume
mit 10 μg/m1
Betulinsäure
behandelt. Vierzig μg
aus Zelllysaten isoliertes Protein pro Bahn wurden durch 12%ige
SDS-PAGE abgetrennt. Eine Immundetektion von Bax, Bcl-x und Bcl-2
wurde durch einen polyklonalen Kaninchen-anti-Bax-Antikörper, einen polyklonalen Kaninchen-anti-Bcl-x-Antikörper und
einen monoklonalen Maus-anti-Bcl-2-Antikörper unter Anwendung von ECL
durchgeführt.
Unbehandelte KM3-Zellen wurden als positive Kontrolle für die Bcl-2-Expression
eingesetzt.
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5D zeigt
das Fehlen einer p53-Anhäufung
während
der Betulinsäure-induzierten
Apoptose. SH-EP-Neuroblastomzellen wurden für die angegebenen Zeiträume mit
10 μg/m1
Betulinsäure
oder 12 Stunden lang mit 0,5 μg/ml
Doxorubicin behandelt. Vierzig μg
aus Zelllysaten isoliertes Protein pro Bahn wurden durch 12%ige
SDS-PAGE abgetrennt. Eine Immundetektion von p53 wurde durch einen
monoklonalen Maus-anti-p53-Antikörper
unter Anwendung von ECL durchgeführt.
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Bcl-2 und Bcl-XL wurden
kürzlich
an der Bewahrung der Zelllebensfähigkeit
durch Verhinderung eines Verlusts an Mitochondrienmembran-Potential
beteiligt. Kroemer et al., 1997, Immunol. Today, 18 : 44–51. Eine Überexpression
von Bcl-2 und Bcl-xL hemmte stark die Zerstörung von ΔΨm und die Überproduktion von ROS (5A) und blockierte die Spaltung von FLICS
und PARP (5B), was weiters die Hypothese
unterstützte, dass
Mitochondrienveränderungen
bei der Aktivierung von Caspasen eine Rolle spielen könnten. Überdies wurden
pro-apoptotische Bcl-2-verwandte Proteine, wie z. B. Bax und Bcl-Xs, nach einer Inkubation mit Betulinsäure höherreguliert,
während
die Expressionsstärken
von Bcl-2 und Bcl-XL von einer Behandlung
mit Betulinsäure
unbeeinflusst blieben (5C), und zuvor
wurde gezeigt, dass p53 in den Vorgang einer arzneimittelinduzierten
Apoptose nach einem DNA-Schaden involviert ist und als direkter
transcriptioneller Aktivator des bax-Gens fungieren kann. Lowe et
al., 1994, Science (Washington DC), 266: 807–810; Miyashita et al., 1995, Cell
80: 293–299.
-
Nach einer Behandlung der SH-EP-Zellen
mit Doxorubicin wuchs die Anhäufung
des Wildtyp-p53-Proteins jedoch nicht stark an (5D).
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine durch Betulinsäure vermittelte
Apoptose und eine Höherregulierung
von Bax unabhängig
vom p53-Protein in den Neuroblastomzellen auftraten.
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Betulinsäure umgeht die CD95-Resistenz
und Doxorubicin-vermittelte Apoptose:
6A zeigt
die Induktion einer Apoptose durch Bongkreksäure in CD95- und Doxorubicinresistenten
Neuroblastomzellen. SH-EP-Neuroblastomzellen (☐), CD95-resistente
SH-EP
CD95R-Zellen
wurden 72 Stunden lang
mit 10 μg/ml Bongkreksäure oder
0,5 μg/m1
Doxorubicin behandelt. Die spezifische Apoptose wurde bestimmt und
berechnet wie in der Zeichenerklärung
für
1A beschrieben. Jede Säule ist ein Mittelwert aus
drei unabhängigen Versuchen
in dreifacher Ausführung.
Die SDs betrugen weniger als 10%.
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6B zeigt
die Spaltung von FLICS und PARP in Bongkreksäure-empfindlichen Zellen; die
Zellen [(CD95-resistente Neuroblastom-, SH-EPCD95R),
Doxorubicin-resistente Neuroblastom- (SH-EPDoxoR),
Medulloblastom- (Daoy), Swing-Sarkom- (A17195), Brustkarzinom- (MCF-7),
Dickdarmkarzinom- (HT-29), Kleinzellen-Lungenkarzinom- (H-146) und
Nierenzellenkarzinomzellen (KTCTL-26)] wurden unbehandelt gelassen
(-) oder 24 Stunden lang mit 10 μg/m1
Bonkreksäure
behandelt (+). Vierzig μg
aus Zelllysaten isoliertes Protein pro Bahn wurden durch 12%ige
SDS-PAGE abgetrennt. Die Western-Blot-Analyse hinsichtlich der FLICS-
und PARP-Spaltung wurde durchgeführt
wie in der Zeichenerklärung
für 2B beschrieben.
-
Da der Molekularmechanismus eines
Bonkreksäure-induzierten
Absterbens anders zu sein schien als die Aktivierung einer CD95-L/Rezeptor-Interaktivierung,
welche durch andere herkömmliche
cytotoxische Mittel induziert wurde, fragten wir uns, ob Betulinsäure eine
Arzneimittelresistenz von Tumorzellen überwinden könnte oder nicht. Elterliche
SH-EP-Zellen und
abweichende Zelllinien, die gegenüber anti-CD95 oder Doxorubicin
resistent waren, sprachen auf Betulinsäure an, während anti-CD95- und Doxorubicin-resistente
Zellen gegenüber
Doxorubicin teilresistent waren (6A). Überdies
führte
eine Inkubation mit Betulinsäure
in teilresistenten Neuroblastomzellen zur Spaltung von FLICS und
PARP ( 6B). Diese Ergebnisse zeigen,
dass Betulinsäure
in CD95- und Doxorubicin-resistenten SH-EP-Zellen eine Apoptose vermittelt,
und zwar unabhängig
vom CD95-System und über
die Aktivierung von Caspasen. Außerdem wurden FLICS und PARP
auch in anderen Tumorzelllinien, die auf Betulinsäure ansprachen,
verarbeitet, wie z. B. im Medulloblastom (Daoy) und im Swing-Sarkom
(A17/95), jedoch nicht in Tumorzellen, die gegenüber Betulinsäure resistent
waren (MCF-7, HT-29, H-146 und KTTL-26; 6B).
-
Versuch 3: Betulinsäure induziert
die Aktivierung der Mitochondrien und einer AIFvermittelten Caspase-8
-
Dieses Beispiel zeigt, dass Betulinsäure ein
cytotoxisches Mittel ist, welches durch direkte Einwirkung auf die
Mitochondrien eine Apoptose auslöst.
In isolierten Mitochondrien induziert die Betulinsäure direkt
einen Verlust an Transmembranpotential, unabhängig von einer zVAD-fmk-hemmbaren
Caspase. Dies wird durch Bongkreksäure gehemmt, einem Mittel,
welches den Permeabilitätswechsel-Porenkomplex
stabilisiert. Mitochondrien, welche einen Betulinsäure-induzierten
Permeabilitätswechsel
durchmachen, vermitteln die Spaltung von Caspase-8 (FLICE/MACH/MchS)
und Caspase-3 (CPP32/YAMA) in einem zeltfreien System. Löslichkeitsfaktoren,
wie z. B. Cytochrom c oder der Apoptose-induzierende Faktor (AIF),
die aus Betulinsäure-behandelten
Mitochondrien freigesetzt werden, reichen zur Caspasenspaltung und
zur Kernfragmentierung aus. Die Zugabe von Cytochrom c zu Cytosolextrakten
führt zur
Spaltung von Caspase-3, allerdings nicht von Caspase-8. Mitochondrienüberstände, welche
einen Permeabilitätswechsel
durchgemacht haben, und ein teilweise gereinigter AIF aktivieren
jedoch in Cytosolextrakten sowohl Caspase-8 als auch –3 und genügen, um
die rekombinante Caspase-8 zu aktivieren. Diese Ergebnisse zeigen,
dass die Induktion eines Mitochondrienpermeabilitätswechsets
allein ausreicht, um das volle Apoptoseprogramm auszulösen, und
dass manche cytotoxische Arzneimittel, wie z. B. Betulinsäure, über eine
direkte Einwirkung auf die Mitochondrien eine Apoptose induzieren
können.
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Materialien
und Verfahren
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Arzneimittel: Betulinsäure (Sigma,
Deisenhofen, Deutschland) wurde als reine Substanz bereitgestellt und
in Dimethylsulfoxid aufgelöst.
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Zeltkultur: Die menschliche Neuroblastomzelllinie
SHEP wurde freundlicherweise von M. Schwab (Deutsches Krebsforschungszentrum,
Heidelberg, Deutschland) zur Verfügung gestellt und in einer
Monoschichtkultur in 75 cm2-Gewebekulturfläschchen
(Falcon, Heidelberg, Deutschland) aufbewahrt, und zwar in einem
RPMI 1640-Medium (Life Technologies, Inc., Eggenstein, Deutschland),
das mit 10%igem, durch Hitze deaktiviertem FCS (Conco, Wiesbaden,
Deutschland), 10 mM HEPES, pH 7,4 (Biochrom, Berlin, Deutschland),
100 U/ml Penicillin (Life Technologies, Inc.), 100 μg/m1 Streptomycin
(Life Technologies, Inc.) und 2 mM L-Glutamin (Biochrom) ergänzt war,
und wurde bei 37°C
in 95% Luft/5% CO2 inkubiert. SHEP-Neuroblastomzellen,
die stabil mit bcl-2, bcl-XL, oder einer
Vektorkontrolle transfiziert waren, wurden in Dulbeccos minimalem Eagle-Medium
(Life Technologies, Inc.), welches 500 μg/m1 G418 (Geneticin, Life Technologies,
Inc.) enthielt, kultiviert. Siehe Dole et al., 1994, Cancer Res.
54: 3253–3259;
Dole et al., 1995, Cancer Res. 55: 2576–2582.
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Bestimmung einer Apoptose: Die Zellen
wurden für
die angegebenen Zeiträume
mit Betulinsäure
inkubiert und durch Trypsinierung geerntet, wobei 0,05% Trypsin
und 0,02% EDTA ohne Ca2+ und Mg2+ (Life Technologies,
Inc.) verwendet wurden. Die quantitative Bestimmung der DNA-Fragmentierung
wurde durch eine FACS-Analyse von Propidiumiodid-gefärbten Zellkernen
durchgeführt
wie zuvor bei Nicoletti et al., 1991, J.
Immunol. Methods, 139: 271–279
beschrieben, und zwar unter Verwendung der CELLQuest-Software (Becton
Dickinson, Heidelberg, Deutschland).
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Hemmung einer arzneimittelinduzierten
Apoptose durch Benzyloxycarbonyl-Va-Ala-Asp-Fluormethylketon (ZVAD-fmk) oder
Bongkreksäure.
Der Breitband-Tripeptidhemmer der Caspasen zVAD-fmk (Enzyme Systems
Products, Dublin, USA) wurde in einer Konzentration von 60 μM und der
mitochondrienspezifische Inhibitor Bongkreksäure in einer Konzentration
von 50 μM
verwendet (freundlicherweise von Dr. Duine, Universität Delft,
Delft, Niederlande, zur Verfügung
gestellt).
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Western-Blot-Analyse: Die Zellen
wurden 30 Min. lang bei 4°C
in PBS mit 0,5% Triton X (Serva, Heidelberg, Deutschland) und 1
mM PMSF (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) lysiert, gefolgt von einer
Hochgeschwindigkeitszentrifugation. Die Membranproteine wurden in
einem 0,1 M Glycin, pH 3,0 und 1,5 M Tris, pH 8,8, enthaltenden
Puffer eluiert. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung
von Bicinchoninsäure (Pierce,
Rockford, IL) analysiert. 40 μg
Protein pro Bahn wurden durch 12% oder 15%ige SDS-PAGE abgetrennt
und auf Nitrocellulose (Amersham, Braunschweig, Deutschland) elektrogeblottet.
Eine gleiche Proteinbeladung wurde durch eine Ponceau-Rotfärbung der
Membrane kontrolliert. Nach einstündiger Blockierung in mit 2%
BSA (Sigma) und 0,1% Tween 20 (Sigma) ergänztem PBS wurde eine Immundetektion
der Caspasen-3 und-8, PARP, und des Cytochrom 2-Proteins durchgeführt, wobei
der Maus-anti-Caspase-8 mAb C 15 (Scaffidi et al., 1997, J. Biol.
Chem. 272, 26953–26958,
1 : 5-Verdünnung
des Hybridomüberstands),
der Maus-anti-Caspase-3-spezifische mAb (1 : 1000, Transduction
Laboratories, Lexington, KY), der polyklonale Kaninchen-anti-PARP-Antikörper (1
: 10000, Enzyme Systems Products) oder der Maus-anti-Cytochrom c
mAb (1 : 5000, PharMingen, San Diego, CA) verwendet wurde. Der Ziegen-anti-Maus-IgG
oder der Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (1 : 5000, Santa Cruz Biotechnology),
gefolgt von ECL (Amersham), wurde zur Detektion eingesetzt.
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Herstellung von Mitochondrien, Cytosolextrakten,
Zellkernen und Mitochondrienüberstand.
Zur Isolierung der Mitochondrien wurden Zellen (3 × 105 pro Probe) zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen
und mit fünf Volumen
des Puffers A (50 mM Tris, 1 mM EGTA, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 0,2%
BSA, 10 mM KHP2O4,
pH 7,6, 0,4 M Sucrose) resuspendiert und auf Eis 20 Minuten lang
quellen gelassen. Die Zellen wurden mit 30 Schlägen eines Teflon-Homogenisators
homogenisiert und bei 4°C
mit 10000 g 10 Min. lang zentrifugiert. Die resultierenden Pellets
wurden im Puffer B (10 mM KH2PO4,
pH 7,2, 0,3 mM Mannit, 0,1% BSA) resuspendiert. Die Mitochondrien
wurden durch einen Sucrosegradienten (untere Schicht: 1,6 M Sucrose,
10 mM KH2PO4, pH
7,5, 0,1% BSA; obere Schicht: 1,2 M Sucrose, 10 mM KH2P O4, pH 7,5, 0,1%
BSA) abgetrennt. Zwischenphasen, die Mitochondrien enthielten, wurden
mit dem Puffer B bei 4°C
mit 18000 g 10 Min. lang gewaschen, und die resultierenden Mitochondrienpellets
wurden im Puffer B resuspendiert. Zur Herstellung von Cytosolextrakten
wurden Zellen (1 × 108 pro Probe) zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen,
mit einem Volumen des Puffers A resuspendiert und auf Eis 20 Minuten
lang quellen gelassen. Die Zellen wurden mit 30 Schlägen eines Dounce-Homogenisators homogenisiert
und bei 4°C
mit 15000 × g
15 Min. lang zentrifugiert. Die Proteinkonzentration der Mitochondrien
oder Cytosolextrakte wurde durch das Bradford-Verfahren (Bio-Rad) bestimmt. Zur Isolierung
der Zellkerne wurden die Zellen zweimal in eiskaltem PBS gewaschen,
in 10 Volumen des Puffers C (10 mM PIPES, pH 7,4, 10 mM KCl, 2 mM
MgCl2, 1 mM DDT, 1 mM PMSF, 10 μM Cytochalasin
B) resuspendiert, 20 Min. lang auf Eis quellen gelassen und unter
Verwendung eines Teflon-Homogenisators homogenisiert. Die Homogenate
wurden über
30% Sucrose im Puffer C geschichtet und mit 800 g 10 Min. lang zentrifugiert.
Die resultierenden Zellkernpellets wurden im Puffer C resuspendiert
und dreimal gewaschen. Die Zellkerne wurden in Aliquoten von 108 Zellkernen/ml bei –80° gelagert, bis sie benötigt wurden.
Ein AIF-hältiger Mitochondrienüberstand
wurde hergestellt wie bei Susin et al., 1997, J. Exp. Med., 186,
5–37,
und Susin et al., 1996, J. Exp. Med., 184, 1331–41, beschrieben.
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Zellfreies Apoptosesystem. Zur Bestimmung
der Kernfragmentierung wurden Zellkerne (103/μl) bei 37°C 2 Stunden
lang mit Mitochondrien (1 μg/μl) im Puffer
D (10 mM HEPES, pH 7,4, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl2,
5 mM EGTA, 1 mM DDT, 2 mM ATP, 10 mM Phosphokreatin, 50 μg/m1 Kreatinkinase,
10 μM Cytochalasin
B) inkubiert. Die Zellkerne wurden mit Propidiumiodid (10 μg/μl) gefärbt und
mittels Durchflusszytometrie analysiert. Zur Bestimmung der Caspaseaktivierung
wurden Cytosolextrakte (2 μg/μl) bei 37°C 2 Stunden
lang mit Mitochondrien (1 μg/μl), Cytochrom
c (0,1 – 100 μM) oder einem
AIFhältigen
Mitochondrienüberstand
(0,5 μg/μl) im Puffer
D inkubiert. Ein teilweise gereinigter AIF (Cytochrom c-frei) wurde
wie zuvor beschrieben hergestellt (0,5 mg/ml, Susin et al., 1997,
J. Exp. Med., 186, 5–37,
Susin et al., 1996, J. Exp. Med., 184, 1331–41). Die Proteine wurden durch
15%ige SDS-PAGE abgetrennt, und eine Western-Blot-Analyse wurde
wie obenstehend beschrieben durchgeführt. Um eine gleiche Beladung
mit Mitochondrienprotein zu bestätigen,
wurden alle Western-Blots auch mit einem Antikörper entwickelt, welcher auf
ein 60 kDa-Mitochondrienantigen gerichtet war (Daten nicht gezeigt).
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Bestimmung des Mitochondrienmembran-Potentials.
Mitochondrien (5 × 105/ml) wurden 30 Min. lang mit 10 μg/m1 Betulinsäure behandelt,
bei 37°C
15 Min. lang mit 3,3'-Dihexyloxycarbocyanidiodid
(DiOC6(3), 40 nM, Molecular Probes, Inc.,
Eugene, OR) inkubiert und mit einem Durchflusszytometer (FACS Vantage,
Becton Dickinson) analysiert. Als Kontrolle wurden die Zellen mit
dem Entkopplungsmittel Carbonylcyanid-mchlorphenylhydrazon (mCICCP,
200 μM,
Sigma) behandelt.
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In vitro-Translations- und in vitro-Spaltungsassay.
Ein in vitro-Translations- und in vitro-Spaltungsassay von Caspase-8
wurden durchgeführt
wie zuvor bei Medema et al., 1997, EMBO J. 16, 2794–2804, beschrieben.
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Ergebnisse
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Betulinsäure löst in isolierten Mitochondrien
einen Mitochondrien-PT aus. Isolierte Mitochondrien wurden mit Betulinsäure inkubiert
und mit dem Farbstoff DiOC6(3) gefärbt, um
das Mitochondrienmembran-Potential zu bewerten (7). Mitochondrien, die aus mit bcl-2
oder Bcl-X oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor transfizierten
SHEP-Zellen isoliert
worden waren, wurden unbehandelt gelassen (Kontrolle) oder 30 Min.
lang in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 μM Bongkreksäure oder 60 pM zVAD-fmk mit
10 μg/m1 Betulinsäure behandelt.
5 mM Atracrylosid, ein direkter Mitochondrienaktivator, wurde als
positive Kontrolle eingesetzt. ΔΨm wurde durch das Einfärben der Mitochondrien mit
dem Fluorochrom DiOC6(3) bestimmt. Die gepunktete
Linie im Histogramm 1 zeigt das in Gegenwart des ΔΨm abgebenden Mittels mCICCP erhaltene Färbeprofil
an.
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Wie 7 zeigt,
machten Mitochondrien, die aus Wildtyp-SHEP-Zellen oder aus nur
mit einem Vektor transfizierten Zellen isoliert worden waren, einen
Verlust an ΔΨm innerhalb 30 mm einer Behandlung mit Betulinsäure durch.
Eine Betulinsäure-induzierte ΔΨm Dissipation wurde durch Bongkreksäure gehemmt,
einem Liganden des Adenin-Nucleotidtranslokators
(ANT), welcher den Permeabilitätswechsel
(PT) hemmt, und Betulinsäure
hatte keine Wirkung auf Mitochondrien, die aus Zellen isoliert worden
waren, welche mit Bcl-2 oder Bcl-X (7),
zwei endogenen Inhibitoren von PT, transfiziert worden waren. Der
Caspase-Inhibitor zVAD-fmk störte
jedoch den Betulinsäure-induzierten ΔΨm-Verlust nicht (7). Somit kann Betulinsäure ohne
Beteiligung einer Z-VAD-fmkhemmbaren Caspase direkt einen Mitochondrienpermeabilitätswechsel
auslösen.
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Betulinsäure-induzierte, Mitochondrien-PT-induzierte
Apoptose. 8 zeigt die
Kernfragmentierung nach einer Koinkubation isolierter Zellkerne
mit isolierten Mitochondrien in Gegenwart von Betulinsäure. Mitochondrien,
die aus mit bcl-2 oder bcl-XL oder nur mit
einem Neomycin-Widerstandsvektor transfizierten SHEP-Zellen isoliert
worden waren, wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 iM Bongkreksäure oder 60 μMZ- VAD-fmk 6 Stunden
lang mit Zellkernen und 0,1–10 μg/m1 Betulinsäure (8A) oder 5 mM Atractylosid (8B) inkubiert. Zellkerne, die entweder
mit Mitochondrien aus Nur-Vektor-Zellen
oder mit Betulinsäure
inkubiert worden waren, wurden als Kontrolle eingesetzt. Eine Kernapoptose
wurde durch eine FACS-Analyse eines mit Propidiumiodid gefärbten DNA-Anteils
bestimmt.
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Mit bcl-2 oder bcl-XL oder
nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor transfizierte SHEP-Zellen
wurden 6–24
Stunden lang mit 10 μg/m1
Betulinsäure
oder 5 mM Atractylosid behandelt (8C).
Die Mitochondrien wurden isoliert und in Gegenwart oder Abwesenheit
von 50 μM
Bongkreksäure
oder 60 μMZ-VAD-fmk mit
Zellkernen inkubiert. Die Zellkerne, die entweder mit Mitochondrienzellen
nur mit Frontvektor oder mit Betulinsäure inkubiert worden waren,
wurden als Kontrolle eingesetzt. Eine Kernapoptose wurde durch eine FACS-Analyse eines mit
Propidiumiodid gefärbten
DNA-Anteils bestimmt.
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In diesen Versuchsanordnungen führte die
Kombination von Mitochondrien aus Neo-Kontrollzellen plus Zellkernen und Betulinsäure zu einer
Kern-DNA-Fragmentierung ( 8A). Die
Entfernung der Mitochondrien aus dieser Mischung hob die Wirkung
der Betulinsäure
auf, was darauf hindeutet, dass Mitochondrien für eine Betulinsäure-induzierte
Kernapoptose in diesem zeltfreien System notwendig waren. Ohne Zugabe
von Betulinsäure
hatten die Mitochondrien keine Wirkung auf die Zellkerne. Bei Verwendung
einer Kombination aus Mitochondrien plus Zellkernen, zu der apoptotische
Dosen cytotoxischer Standardarzneimttel, wie z. B. Doxorubicin,
Cisplatin oder Etoposid, hinzugefügt wurden, wurde keine DNA-Fragmentierung
beobachtet (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu hatte Atractylosid
(Atra), das durch Bindung an den Adenin-Nucleotidtranslokator an
der inneren Mitochondrienmembran spezifisch einen Mitochondrien-PT
auslöst,
Kroemer et al., 1997, Immunol. Todar, 18: 44–51, dieselbe Wirkung wie Betulinsäure (8B). Eine durch Betulinsäure induzierte
Fragmentierung der Zellkerne wurde durch zVAD-fmk bzw. Bongkreksäure gehemmt,
oder wenn die Mitochondrien aus Zellen mit Bcl-2- oder BcI-XL-Überexpression
erhalten wurden (8A). Eine Kernfragmentierung
konnte auch durch Mitochondrien induziert werden, welche aus mit
Betulinsäure
vorbehandelten Zellen isoliert wurden (8C).
Diese Wirkung wurde wiederum durch zVAD-fmk, Bongkreksäure oder
durch eine Bct-2- oder BcI-XL-Überexpression
blockiert (8C). Diese Ergebnisse zeigen,
dass Betulinsäure
eine direkte und spezifische Wirkung auf Mitochondrien hat, was
zu einer Fragmentierung der Zellkerne und zu einem apoptotischen
DNA-Abbau führt.
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Die Betulinsäure-induzierte Spaltung von
Caspasen hängt
vom Mitochondrien-PT
ab. 9A zeigt, dass Caspasen durch
Mitochondrien gespalten werden, die einen PT durchmachen. Mit bcl-2
oder Bcl-X oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor transfizierte
SHEP-Zellen wurden 16 Stunden lang mit 10 μg/ml Betulinsäure behandelt.
Die Mitochondrien wurden isoliert und in Gegenwart oder Abwesenheit
von 60 μM zVAD-fmk 6
Stunden lang mit Cytosolextrakten inkubiert (linke Tafel, Zellen).
Alternativ wurden aus unbehandelten Zellen isolierte Mitochondrien
in Gegenwart oder Abwesenheit von 60 μMZ-VAD-fmk 6 Stunden lang mit 10 μg/m1 Betulinsäure oder
5 mM Atractylosid, zusammen mit Cytosolextrakten, inkubiert (rechte
Tafel, mitos, Atra). Cytosolextrakte, die mit aus unbehandelten
Zellen isolierten Mitochondrien oder mit unbehandelten Mitochondrien
inkubiert wurden, wurden als Kontrolle eingesetzt. 40 μg aus Zelllysaten
isoliertes Protein pro Bahn wurden durch 15%ige SDS-PAGE abgetrennt.
Eine Immundetektion der Caspasen-3, -8 und des PARP-Proteins wurde
durch einen Maus-anti-Caspase-3 mAb, einen Maus-anti-Caspase-8 mAb,
einen polyklonalen Kaninchen-anti-PARP-Antikörper und ECL durchgeführt.
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9B zeigt
die Kinetik einer Betulinsäure-induzierten
Spaltung von Caspasen in einem zeltfreien System. SHEP-Zellen wurden
für die
angegebenen Zeiträume
mit 10 μg/m1
Betulinsäure
behandelt. Die Mitochondrien wurden isoliert und 6 Stunden lang
mit Cytosolextrakten inkubiert. Eine Western-Blot-Analyse wurde wie
obenstehend beschrieben durchgeführt.
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Eine Inkubation von Cytoplasmaextrakten
mit aus Betulinsäure-behandelten
Zellen isolierten Mitochondrien führte zur Verarbeitung von Caspase-6,
Caspase-3 und des Prototypsubstrats PARP (9A,
Mitochondrien). Die Spaltung der Caspasen wurde in Gegenwart von
zVAD-fmk blockiert, oder wenn Mitochondrien aus Zellen mit Bcl-2-
oder Bcl-xl-Überexpression
verwendet wurden (9A). Gleichermaßen wurde eine
Caspasenspaltung beobachtet, wenn Betulinsäure-behandelte Mitochondrien
verwendet wurden (9A, mitos). Die
Behandlung isolierter Mitochondrien mit Atra führte auch zu einer Aktivierung
von Caspasen (9A). Überdies
induzierten aus Betulinsäurebehandelten
Zellen isolierte Mitochondrien eine Spaltung von Caspase-8, Caspase-3
und PARP in zeitabhängiger
Weise, was zuerst nach einer 12-stündigen Behandlung mit Betulinsäure nachweisbar
war (9B). Um zu sehen, ob Betulinsäure eine
Caspasenspaltung direkt induzierten konnte, wurde eine in vitro-Spaltungsanalyse
durchgeführt.
Nach einer Inkubation der in vitro-translatierten, radiomarkierten
Caspase-8 oder Caspase-3 mit Betulinsäure wurden keine Spaltprodukte nachgewiesen
(Daten nicht gezeigt), was darauf hinweist, dass Betulinsäure Caspase-8
oder Caspase-3 nicht direkt spaltet. Diese Ergebnisse legen nahe,
dass eine Betulinsäure-induzierte
Caspaseaktivierung durch einen Mitochondrien-PT vermittelt wird.
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Betulinsäure bewirkt die Freisetzung
apoptogener Faktoren aus isolierten Mitochondrien. 10A zeigt,
dass ein Löslichkeitsfaktor/Löslichkeitsfaktoren,
der bzw. die aus einen PT durchmachenden Mitochondrien freigesetzt
wurde bzw. wurden, die Spaltung von Caspasen induziert bzw. induzieren.
Mitochondrien, die aus mit bcl-2 oder BCl-XL oder
nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor transfizierten SHEP-Zellen isoliert worden
waren, wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 μM Bongkreksäure oder
60 μM zVAD-fmk
eine halbe Stunde lang mit 10 μg/m1
Betulinsäure
oder 5 mM Atractylosid behandelt. Mittels Hochgeschwindigkeitszentrifugation
erhaltene Mitochondrienüberstände wurden
bei 37°C
6 Stunden lang mit Cytosolextrakten inkubiert. Mit Überständen unbehandelter
Mitochondrien inkubierte Cytosolextrakte wurden als Kontrolle eingesetzt.
Eine Western-Blot-Analyse wurde durchgeführt wie bei 9A beschrieben.
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10B zeigt,
dass ein Löslichkeitsfaktor/Löslichkeitsfaktoren,
der bzw. die aus einen PT durchmachenden Mitochondrien freigesetzt
wurde bzw. wurden, eine Kernfragmentierung induziert bzw. induzieren.
Mitochondrien, die aus mit bcl-2, Bcl-XL oder
nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor transfizierten SHEP-Zellen
isoliert worden waren, wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von
50 μM Bongkreksäure oder 60 μM zVAD-fmk
eine halbe Stunde lang mit 10 μg/ml
Betulinsäure
oder 5 mM Atractylosid behandelt. Mittels Hochgeschwindigkeitszentrifugation
erhaltene Mitochondrienüberstände wurden
bei 37°C
2 Stunden lang mit Zellkernen inkubiert.
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Mit Überständen unbehandelter Mitochondrien
inkubierte Zellkerne wurden als Kontrolle eingesetzt. Eine Kernapoptose
wurde durch eine FACS-Analyse eines mit Propidiumiodid gefärbten DNA-Anteils
bestimmt.
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10C zeigt
die Betulinsäure-induzierte
Freisetzung von Cytochrom c. Mitochondrien, die aus mit bcl-2, BCl-XL, oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor
(Neo) transfizierten SHEP-Zellen isoliert worden waren, wurden mit
10 μg/m1
Betulinsäure
behandelt. 5 μg
Protein pro Bahn wurden durch 15%ige SDS-PAGE abgetrennt. Eine Immundetektion
von Cytochrom c wurde durch einen Maus-anti-Cytochrom c mAb und
BCL durchgeführt.
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Beim Hinzufügen von Überständen aus Betulinsäure-behandelten
Mitochondrien zu Cytosolextrakten wurden Caspase-8, -3 und PARP
gespalten (10A). Die Verarbeitung
der Caspasen wurde durch Bongkreksäure, zVAD-fmk oder in Mitochondrien
aus Zellen mit Bcl-2- oder BcI-XL-Überexpression
gehemmt (10A). Außerdem induzieren Überstände aus
Betulinsäure-behandelten
Mitochondrien eine DNA-Fragmentierung, und auch diese Wirkung wurde
in Gegenwart von Bongkreksäure,
zVAD-fmk oder durch eine Bcl-2- oder Bcl-XL-Überexpression
blockiert (10B). Gleichermaßen wurden
eine Caspaseaktivierung und eine Kernfragmentierung beobachtet,
wenn anstelle von Betulinsäure
Atra verwendet wurde (10A, B). Dies weist darauf hin, dass Betulinsäure die
Freisetzung eines apoptogenen Löslichkeitsfaktors/apoptogener Löslichkeitsfaktoren
in Mitochondrien auslöst.
Demgemäß induziert
Betulinsäure
direkt eine Freisetzung von Cytochrom c in isolierten Mitochondrien
(10C). Diese durch Betulinsäure angetriebene
Freisetzung von Cytochrom c wurde durch Bongkreksäure oder
in Mitochondrien aus Zellen mit Bcl-2- oder Bcl-XL-Überexpression
blockiert (10C).
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Die Caspase-8-Spaltung wird durch
AlF, aber nicht durch Cytochrom e, vermittelt. 11A zeigt,
dass Cytochrom c die Spaltung von Caspase-3 induziert. Cytosolextrakte
aus SHEP-Zellen wurden mit 0,1 – 100 μM Cytochrom
c inkubiert. Eine Immundetektion der Caspasen-3, -8 und von PARP
wurde durchgeführt
wie in 9A beschrieben.
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11B zeigt,
dass AIF sowohl die Spaltung von Caspase-8 als auch von -3 induziert.
Cytosolextrakte aus nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor (Nec)
oder mit bcl-2 transfizierten SHEP-Zellen wurden mit teilweise gereinigtem
AIF inkubiert. Eine Immundetektion der Caspasen-3, -8 und von PARP
wurde durchgeführt
wie in 9A beschrieben.
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11C zeigt,
dass AIF die rekombinante Caspase-8 spaltet. Eine in vitrotranslatierte, 35S-markierte Caspase-8 wurde bei 4°C 16 Stunden
lang mit teilweise gereinigtem AIF inkubiert, und zwar in Gegenwart
oder Abwesenheit von 60 μMZ-VADfmk.
Die Reaktionsprodukte wurden durch 15%ige SDS-PAGE abgetrennt und mittels
Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Migrationsposition einer
N-terminalen, abgeschnitteten Caspase-8 ist durch einen offenen
Pfeil gekennzeichnet.
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Wie in 11A gezeigt,
löste Cytochrom
c die proteolytische Verarbeitung von Caspase-3 in ihre aktiven
Untereinheiten aus und bewirkte eine Caspase-vermittelte Spaltung
von PARP (11A). Die Zugabe von Cytochrom
c zu Cytosolextrakten induzierte allerdings keine Caspase-8-Spaltung
(11A). Im Gegensatz dazu wurde sowohl
Caspase-3 als auch
-8 in Cytosolextrakte gespalten, wenn anstelle von Cytochrom c Mitochondrienüberstände oder
ein teilweise gereinigter (Cytochrom c-freier) AIF verwendet wurden
( 11B). Außerdem induzierte ein teilweise
gereinigter AIF die Spaltung einer in vitrotranslatierten, radiomarkierten
Caspase-8 in die aktiven p18-Untereinheiten (11C).
Diese Ergebnisse zeigen, dass sich verschiedene, durch Betulinsäure freigesetzte
Mitochondrienproteine in ihrem Vermögen, verschiedene Caspasen
zu aktivieren, unterscheiden. Die Spaltung von Caspase-8 stromabwärts von
den Mitochondrien scheint eine AIF-Aktivität zu erfordern.
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Beispiel 4: Molekülordnung
einer durch Antikrebsmittel induzierten Apoptose
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Eine durch Antikrebsmittel vermittelte
Apoptose kann die Aktivierung von das Absterben induzierenden Ligand/Rezeptor-Systemen,
wie z. B. CD95 (APO-1/Fas), die Spaltung von Caspasen und eine Störung der
Mitochondrienfunktionen umfassen. In diesem Beispiel wurde die Abfolge
dieser Ereignisse bei mit Bcl-2 oder Bcl-X transfizierten SHEP-Neuroblastomzellen
untersucht, wobei zwei unterschiedliche Arzneimittel verwendet wurden,
nämlich
Doxorubicin (Doxorubicin), welches das CD95/CD95-L-System aktiviert,
und Betulinsäure,
welche die Expression von CD9S oder seiner Liganden nicht verstärkt und,
wie hier gezeigt, direkt auf die Mitochondrien abzielt.
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Eine durch beide Arzneimittel induzierte
Apoptose wurde durch eine Bcl-2- oder Bcl-XL-Überexpression
oder durch Bongkreksäure,
einem Mittel, das die Mitochondrienmembran-Barrierenfunktion stabilisiert,
gehemmt, was auf eine entscheidende Rolle der Mitochondrien hinweist.
Nach einer Doxorubicin-Behandlung wurden die verstärkte CD95/CD95-L-Expression
und die Caspase-8-Aktivierung nicht durch Bcl-2 oder Bcl-XL blockiert und wurden in Zellen mit noch
immer normalem Mitochondrien-Transmembranpotential (ΔΨ
m,high-Zellen)
vorgefunden. Im deutlichen Gegensatz dazu trat nach einer Betulinsäure-Behandlung
in Bcl-2- oder Bcl-XL-hemmbarer Weise eine
Caspase-8-Aktivierung
auf und beschränkte
sich auf Zellen, welche ihr Mitochondrien-Transmembranpotential
verloren hatten (ΔΨm
low-Zellen). Mitochondrien
aus Zellen, die entweder mit Doxorubicin oder mit Betulinsäure behandelt
worden waren, induzierten in Cytosolextrakten eine Spaltung sowohl
von Caspase-8 als auch von Caspase-3. Somit kann eine Caspase-8-Aktivierung
stromaufwärts
oder stromabwärts
von den Mitochondrien auftreten, und zwar abhängig vom Apoptose-auslösenden Stimulus.
Im Gegensatz zur Caspase-8 beschränkte sich die Spaltung von
Caspase-3 oder PARP stets auf ΔΨm
low-Zellen, stromabwärts vom
Bcl-2- oder BcI-XL-kontrollierten Apoptosekontrollpunkt.
Cytochrom c, das aus einen Permeabilitätswechsel durchmachenden Mitochondrien
freigesetzt wurde, aktivierte in einem zellfreien System Caspase-3,
aber nicht Caspase-8. Beide Caspasen wurden jedoch vom Apoptose-induzierenden
Faktor (AIF) aktiviert, was darauf hinweist, dass sich der Mechanismus
der Caspase-8-Aktivierung von jenem der Caspase-3-Aktivierung unterscheidet.
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Materialien
und Verfahren
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Arzneimittel: Doxorubicin (Farmitalia,
Milan, Italien) und Betulinsäure
(Sigma, Deisenhofen, Deutschland) wurden als reine Substanzen bereitgestellt
und in sterilem Wasser (Doxorubicin) oder Dimethylsulfoxid (Betulinsäure) aufgelöst.
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Zeltkultur: Die menschliche Neuroblastomzelllinie
SHEP wurde freundlicherweise von Professor M. Schwab (Deutsches
Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Deutschland) zur Verfügung gestellt.
Die Zellen wurden in einer Monoschichtkultur in 75 cm2-Gewebekulturfläschchen
(Falcon, Heidelberg, Deutschland) aufbewahrt, und zwar in einem
RPMI 1640-Medium
(Life Technologies, Inc., Eggenstein, Deutschland), das mit 10%igem,
durch Hitze deaktiviertem FCS (Conco, Wiesbaden, Deutschland), 10
mM HEPES, pH 7,4 (Biochrom, Berlin, Deutschland), 100 U/ml Penicillin
(Life Technologies, Inc.), 100 μg/ml
Streptomycin (Life Technologies, Inc.) und 2 mM L-Glutamin (Biochrom)
ergänzt
war, und wurden bei 37°C
in 95% Luft/5% CO2 inkubiert. SHEP-Neuroblastomzellen,
die stabil mit bcl-2, bcl-XL oder einer
Vektorkontrolle transfiziert waren, wurden in Dulbeccos minimalem
Eagle-Medium (Life
Technologies, Inc.), welches 500 μg/m1
G418 (Geneticin, Life Technologies, Inc.; Dole et al., 1994, Cancer
Res. 54: 3253–3259;
Dole et al., 1995, Cancer Res. 55: 2576-2582) enthielt, kultiviert.
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Bestimmung einer Apoptose: Die Zellen
wurden für
die angegebenen Zeiträume
mit Doxorubicin, Betulinsäure
oder anti-APO-1 inkubiert und durch Trypsinierung geerntet, wobei
0,05% Trypsin und 0,02% EDTA ohne Ca2+ und
Mg2+ (Life Technologies, Inc.) verwendet
wurden. Die quantitative Bestimmung der DNA-Fragmentierung wurde
durch eine FACS-Analyse von Propidiumiodid-gefärbten Zellkernen durchgeführt wie
zuvor bei Nicoletti et al., J. Immunol. Methods, 139: 271–279, beschrieben,
und zwar unter Verwendung der CELLQuest-Software (Becton Dickinson,
Heidelberg, Deutschland).
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Hemmung einer arzneimittelinduzierten
Apoptose durch Benzyloxycarbonyl-Val-Al a-Asp-Fluormethylketon (zVAD-fmk) oder
Bongkreksäure.
Der Breitband-Tripeptidhemmer
der Caspasen zVAD-fmk (Enzyme Systems Products, Dublin, USA) wurde
in einer Konzentration von 60 μM
und der mitochondrienspezifische Inhibitor Bongkreksäure in einer
Konzentration von 50 μM
verwendet (freundlicherweise von Dr. Duine, Universität Delf Delf
Niederlande, zur Verfügung
gestellt).
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Analyse einer CD95-Expression. Die
Zellen wurden bei 4°C
45 Minuten lang mit einem monoklonalen anti-APO-1(CD95)-IgGI-Antikörper (moab)
(1 μg/ml;
Trauth et al., 1989, Science 245: 301–305) gefärbt, gefolgt von 30 Minuten
Ziegen-anti-Maus-IgG-FITC (Immunotech, Hamburg, Deutschland) bei
4°C. Der
FII23 IgGI-Antikörper
wurde als Isotypabgestimmter, nicht bindender Antikörper zur
Steuerung einer unspezifischen Bindung eingesetzt.
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RT-PCR für CD95 und CD95-L mRNA. Eine
Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des Qiagen-Gesamt-RNA-Kits (Qiagen,
Hilden, Deutschland) hergestellt.
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Durch Reverse Transcripton wurde
die RNA in cDNA umgewandelt und mittels PCR in einem Thermozykler
(Stratagene, Heidelberg, Deutschland) 38 Zyklen lang amplifiziert,
wobei das Gene Amplification-RNA-PCR-Kit (Perkin Elmer, Branchburg,
NJ) gemäß den Instruktionen
des Herstellers eingesetzt wurde. Ein 500-Basenpaarfragment von
CD95-L wurde unter Verwendung des Primers 5'ATGTTTCAGCTCTTCCACCTACAGA3'
(SEQ ID: No 1) und 5'CCAGAGAGAGCTCAGATACGTTGAC3' (SEQ II: No 2)
amplifiziert, und ein 311-Basenpaarfragment von CD95 wurde unter
Verwendung des Primers 5'TCAAGGAATGCACACTCACCAGC (SEQ ID: No 3)
und 5*GGCTTCATTGACACCATTCTTTCG3' (SEQ ID: No 4) amplifiziert. Die
Expression von â-Actin
(MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland) wurde als Standard für die RNA- Integrität und eine
gleiche Gelbeladung eingesetzt. Die PCR-Reaktionsprodukte wurden
bei 60 V 2 Stunden lang über
ein mit Ethidiumbromid gefärbtes,
1,5%iges Agarosegel laufen gelassen und durch UV-Beleuchtung sichtbar
gemacht.
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Western-Blot-Analyse: Die Zellen
wurden für
30 mm bei 4°C
in PBS mit 0,5% Triton X (Serva, Heidelberg, Deutschland) und 1
mM PMSF (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) lysiert, gefolgt von einer
Hochgeschwindigkeitszentrifugation. Die Membranproteine wurden in
einem 0,1 M Glycin, pH 3,0, und 1,5 M Tris, pH 8,8, enthaltenden
Puffer eluiert. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung
von Bicinchoninsäure (Pierce,
Rockford, IL) analysiert. 40 μg
Protein pro Bahn wurden durch 12%ige oder 15%ige SDS-PAGE abgetrennt
und auf Nitrocellulose (Amersham, Braunschweig, Deutschland) elektrogeblottet.
Eine gleiche Proteinbeladung wurde durch eine Ponceau-Rotfärbung der
Membrane kontrolliert. Nach einstündiger Blockierung in mit 2%
BSA (Sigma) und 0,1% Tween 20 (Sigma) ergänztem PBS wurde eine Immundetektion
der Caspasen-3 und-8, des PARP-, CD95-L-, CD95- und Cytochrom c-Proteins
durchgeführt,
wobei der Maus-anti-Caspase-8 moab C15 (Scaffidi et al., 1997, J.
Biol. Chem. 272, 26953–26958,
1 : 5-Verdünnung
des Hybridomüberstands),
der Maus-anti-Caspase-3-spezifische moab (1 : 1000, Transduction
Laboratories, Lexington, KY), der polyklonale Kaninchen-anti-PARP-Antikörper (1
: 10.000, Enzyme Systems Products), der Maus-anti-CD95-L moab (1
: 5.000, Transduction Laboratories), der Maus-anti-CD95 moab (1
: 1.000, Transduction Laboratories) oder der Maus-anti-Cytochrom
c moab (1 : 5000, PharMingen, San Diego, CA) verwendet wurde. Der
Ziegen-anti-Maus-IgG oder der Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (1 : 5000,
Santa Cruz . Biotechnology), gefolgt von ECL (Amersham), wurde zur
Detektion eingesetzt.
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Herstellung von Mitochondrien, Cytosolextrakten
und Zellkernen. Zur Isolierung der Mitochondrien wurden Zellen (3 × 108 pro Probe) zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen
und mit fünf
Volumen des Puffers A (50 mM Tris-Puffer, 1 mM EGTA, 5 mM 2-Mercaptoethanol,
0,2% BSA, 10 mM KH2PO4,
pH 7,6, 0,4 M Sucrose) resuspendiert und auf Eis 20 Minuten lang
quellen gelassen. Die Zellen wurden mit 30 Schlägen eines Teflon-Homogenisators homogenisiert
und bei 4°C
mit 4000 × g
1 Min. lang zentrifugiert. Die Überstände wurden weiters
bei 4°C
mit 10.000 × g
für 10
mm zentrifugiert, und die resultierenden Pellets wurden im Puffer
B (10 mM KHP2O4,
pH 7,2, 0,3 mM Mannit, 0,1 % BSA) resuspendiert. Die Mitochondrien
wurden durch einen Sucrosegradienten (untere Schicht: 1,6 M Sucrose,
10 mM KH2P O4, pH 7,5, 0,1% BSA; obere Schicht: 1,2 M
Sucrose, 10 mM KH2PO4,
pH 7,5, 0,1 % BSA) abgetrennt. Zwischenphasen, die Mitochondrien
enthielten, wurden mit dem Puffer B bei 4°C mit 18.000 × g 10 Min.
lang gewaschen, und die resultierenden Mitochondrienpellets wurden
im Puffer B resuspendiert. Zur Herstellung von Cytosolextrakten
wurden Zellen (1 × 108 pro Probe) zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen,
mit einem Volumen des Puffers A resuspendiert und auf Eis 20 Minuten
lang quellen gelassen. Die Zellen wurden mit 30 Schlägen eines
Dounce-Homogenisators homogenisiert und bei 4°C mit 15.000 × g für 15 mm
zentrifugiert. Die Proteinkonzentration der Mitochondrien oder Cytosolextrakte
wurde durch das Bradford-Verfahren bestimmt. Zur Isolierung der
Zellkerne wurden die Zellen zweimal in eiskaltem PBS gewaschen,
in 10 Volumen des Puffers C (10 mM Pipes, pH 7,4, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DDT, 1 mM PMSF, 10 μM Cytochalasin
B) resuspendiert, 20 Min. lang auf Eis quellen gelassen und unter
Verwendung eines Teflon-Homogenisators homogenisiert. Die Homogenate
wurden über
30% Sucrose im Puffer C geschichtet und mit 800 x g 10 Min, lang
zentrifugiert. Die resultierenden Zellkernpellets wurden im Puffer
C resuspendiert und dreimal gewaschen. Die Zellkerne wurden in Aliquoten
von 108 Zellkernen/ml bei –80° gelagert,
bis sie benötigt
wurden. Ein AIF-hältiger
Mitochondrienüberstand
wurde hergestellt wie zuvor bei Kroemer et al., 1997, Immunol. Todar.
18: 44–51,
beschrieben.
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Zellfreies Apoptosesystem. Zur Bestimmung
der Kernfragmentierung wurden Zellkerne (103; μl) bei 37°C 2 Stunden
lang mit Mitochondrien (1 μg/μl) im Puffer
D (10 mM HEPES, pH 7,4, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl2,
5 mM EGTA, 1 mM DDT, 2 mM ATP, 10 mM Phosphokreatin, 50 μg/m1 Kreatinkinase,
10 μM Cytochalasin
B) inkubiert. Die Zellkerne wurden mit Propidiumiodid (10 μg/μl) gefärbt und
mittels Durchflusszytometrie analysiert (Susin et al., 1997 Exp.
Cell Res. 236: 397–403).
Zur Bestimmung der Caspaseaktivierung wurden Cytosolextrakte (2 μg/μl) bei 37°C 2 Stunden
lang mit Mitochondrien (1 μg/μl), Cytochrom
c (10 μM)
oder einem AIF-hältigen
Mitochondrienüberstand
(0,5 μg/μl) im Puffer
D inkubiert. Die Proteine wurden durch 15%ige SDS-PAGE abgetrennt,
und eine Western-Blot-Analyse wurde wie obenstehend beschrieben
durchgeführt.
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Bestimmung des Mitochondrienmembran-Potentials.
Zur Bestimmung des Mitochondrienmembran-Potentials wurden Zellen
(5 × 105/ml) bei 37°C 15 Min. lang mit 3,3'-Dihexyloxycarbocyanidiodid
(DiOC6(3), 40 nM, Molecular Probes, Inc.,
Eugene, OR) inkubiert und mit einem Durchflusszytometer (FACScan)
analysiert (Zamzami et al., 1996 J. Exp. Med. 183: 1533–44). Zur
Zellsortierung wurden die Zellen mit DiOC(3) gefärbt und mit einem Cytofluorometer
(FACS Vantage, Becton Dickinson) in DiOC6(3)high- und DiOC6(3)low-Zellen sortiert. Als Kontrolle wurden
die Zellen mit dem Entkopplungsmittel Carbonylcyanid-m-chlorphenylhydrazon (mCICCP,
200 μM,
Sigma) behandelt.
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Ergebnisse
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Die Doxorubicin- und Betulinsäure-induzierte
Apoptose hängt
von Mitochondrien-PT und Caspaseaktivierung ab. 12 zeigt eine arzneimittelinduzierte
Apoptose und einen Mitochondrien-PT. A-C zeigen, dass
die Doxorubicin- und Betulinsäure-induzierte
Apoptose vom Mitochondrien-PT und der Aktivierung von Caspasen abhängt. Mit
Bcl-2 oder Bcl-X oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor (Neo)
transfizierten SHEP-Zellen
wurden 48 Stunden lang (A) oder 24 Stunden lang (B und C) mit 0,5 μg/ml Doxorubicin
oder 10 μg/ml
Betulinsäure
behandelt. Nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor (Neo) transfizierte
Zellen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 μm BA oder
60 μm zVAD-fmk
behandelt. Eine Kernapoptose wurde durch eine FACS-Analyse eines
mit Propidiumiodid gefärbten
DNA-Anteils bestimmt, und zwar in intakten Zellen (A) oder in CFS-inkubierenden
isolierten Zellkernen mit Mitochondrien aus mit Doxo oder Betulinsäure behandelten
Zellen (C). ΔΨm wurde durch das Einfärben der Zellen mit dem Potential-empfindlichen
Fluorochrom DiOC6(3) bestimmt (B).
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12D zeigt,
dass Betulinsäure
direkt einen Mitochondrien-PT induziert. Mitochondrien, die aus
mit Bcl-2 oder Bcl-X oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor
(Neo) transfizierten SHEP-Zellen isoliert worden waren, wurden eine
halbe Stunde Lang mit 10 μg/ml
Betulinsäure
behandelt. Nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor (Neo) transfizierte
Zellen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 μm Betulinsäure oder
60 μM zVAD-fmk
behandelt. ΔΨm wurde durch das Einfärben der Mitochondrien mit
dem Fluorochrom DiOC6(3) bestimmt. Die gepunktete
Linie im ersten Histogramm zeigt das in Gegenwart des ΔΨm-auflösenden
Mittels Carbonylcyanid-m-chlorphenylhydrazon erhaltene Färbeprofil
an.
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Die Doxorubicin- und Betulinsäure-induzierte
Apoptose wurde durch Bestimmung der Kernfragmentierung und Störung des ΔΨm-Doxorubicin- und Betulinsäure-induzierten
Verlusts an ΔΨm und an Kernfragmentierung analysiert (12A und B).
Das Auftreten einer Apoptose sowohl in den Mitochondrien als auch
im Zellkern wurde durch eine Überexpression
von Bcl-2 und Bcl-XL blockiert (12A und B).
Um zu bestimmen, ob eine Apoptose ein Öffnen der Mitochondrien-PT-Pore
mit sich bringt, wurde die Wirkung der Bongkreksäure, eines spezifischen Inhibitors
dieser Pore, getestet. Die Zugabe von Bongkreksäure hemmte eine durch Arzneimittel
ausgelöste
Kernfragmentierung und den ΔΨm Verlust, was darauf hinwies, dass Mitochondrienveränderungen
ein Öffnen
der PT-Poren mit
sich bringen (12A und B).
In Doxorubicin-behandelten Zellen wurden sowohl Kernfragmentierung
als auch ΔΨm Verlust
durch den Breitband-Caspase-Inhibitor zVADfmk gehemmt (12A und B).
Im Gegensatz dazu beeinflusste zVAD-fmk nur die Betulinsäure-induzierte
Kernfragmentierung, hatte aber keine Wirkung auf die Betulinsäureinduzierte ΔΨm-Dissipation (12A und B). Um zu untersuchen, ob arzneimittelinduzierte
Mitochondrienveränderungen
ausreichten, um eine Kernfragmentierung zu bewirken, wurden aus
Arzneimittel-behandelten Zellen isolierte Mitochondrien in einem
zellfreien System mit Zellkernen inkubiert und wurde der Kern-DNA-Verlust
mittels Durchflusszytometrie gemessen. Mitochondrien aus Doxorubicin-
oder Betulinsäure-behandelten
Zellen induzierten eine Kern-DNA-Fragmentierung (12C).
Diese Wirkung wurde durch eine Überexpression
von Bcl-2 oder Bcl-X blockiert, und auch durch die Behandlung der
Zellen mit zVAD-fmk oder Bongkreksäure (12C).
Zusammen legen diese Versuche nahe, dass eine durch Doxorubicin
oder Betulinsäure
induzierte Kernapoptose unterschiedslos vom Mitochondrien-PT und
der Caspaseaktivierung abhängt.
Der zum ΔΨm-Verlust führende Mechanismus hängt jedoch
davon ab, welches Antikrebsmittel verwendet wird. Im Fall von Doxorubicin
erfordert er die Aktivierung von zVAD-fmk-inhibitierbaren Caspasen.
Ganz im Gegensatz dazu löst
Betulinsäure
in Caspase-unabhängiger Weise
eine ΔΨm-Dissipation
aus.
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Betulinsäure löst direkt einen Mitochondrien-PT
aus. Betulinsäure
bewirkte einen Verlust an ΔΨm in isolierten Mitochondrien (12D). Dieser Verlust an ΔΨm wurde durch eine Bcl-2- oder Bcl-XL-Überexpression
oder durch Bongkreksäure
gehemmt (12D), was darauf hinweist,
dass der ΔΨm-Verlust einen PT einschloss. Der Rückgang an ΔΨm wurde jedoch nicht durch zVAD-fmk blockiert
(12D), was nahe legt, dass Betulinsäure durch
direkte Einwirkung auf die Mitochondrien einen PT auslösen kann.
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Doxorubicin induziert CD95-L und
CD95 stromaufwärts
von den Mitochondrien. 13A zeigt die
Induktion von CD95-L. Mit Bcl-2 oder Bcl-X oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor
(Neo) transfizierte SHEP-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 0,5 μg/m1 Doxo
oder 10 μg/m1
Betulinsäure
behandelt (Bahnen +). Die CD95-L mRNA-Expression wurde durch RT-PCR
bestimmt. Die Expression von â-Actin
wurde zur Kontrolle der RNA-Integrität und einer
gleichen Gelbeladung eingesetzt. Für einen Western-Blot wurden
40 μg aus Zelllysaten
stammendes Protein pro Bahn durch 12%ige SDS-PAGE abgetrennt. Das
CD95-L-Protein wurde durch einen Maus-anti-CD9S-L moab und eine
erhöhte
Chemilumineszenz als M, 37.000-Band detektiert.
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14B und C zeigen die Induktion von CD95. Mit Bcl-2
oder Bcl-XL, oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor
(Neo) transfizierte SHEP-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 0,5 μg/m1 Doxo
oder 10 μg/m1
Bet A behandelt (Bahnen +). Die CD95 mRNA-Expression wurde durch RT-PCR bestimmt.
Die Expression von â-Actin
wurde zur Kontrolle der RNA-Integrität und einer gleichen Gelbeladung
eingesetzt. Für
eine Western-Blot-Analyse
(B) wurden 40 μg
aus Zelllysaten stammendes Protein pro Bahn durch 12%ige SDS-PAGE
abgetrennt. Die Immundetektion des CD95-Proteins wurde durch einen
Mausanti-CD95 moab und eine erhöhte
Chemilumineszenz durchgeführt.
Für die
FACS-Analyse der CD95-Proteinexpression (C) wurden die Zellen mit
Maus-anti-AP0-1 moab, gefolgt von einem Dy FITC-konjugierten Antimaus-IgG-Antikörper, gefärbt und
mittels Durchflusszytometrie analysiert. Ähnliche Ergebnisse wurden in
drei getrennten Versuchen erzielt.
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Sowohl CD95-L als auch CD95 wurde
auf der mRNA- und auf der Proteinstufe in Neo-transfizierten Kontrollzellen
und in Bcl-2- oder Bcl-XL-überexprimierenden
Zellen induziert (13A-C). Hinsichtlich
der Kinetik einer CD95-L- und einer CD95-Induktion wurden keinerlei
signifikanten Unterschiede beobachtet. Ein ähnlicher Anstieg der CD95-und CD9-L-Expression
wurde nach einer Behandlung mit Cisplatin oder VP-16 beobachtet,
und zwar ungeachtet der Expression von Bcl-2- oder Bcl-X. Diese
Ergebnisse legen nahe, dass eine Höherregulierung von CD95-L und
CD95 nach einer Doxorubicin-Behandlung unabhängig und stromaufwärts von
den Mitochondrien stattfindet. Im Gegensatz dazu wurde nach der
Behandlung mit Betulinsäure
zu keinem Zeitpunkt eine Höherregulierung
von CD95-L oder CD95 festgestellt (13A und 13B), was darauf hinweist, dass Betulinsäure unabhängig vom
CD95-L/Rezeptor-System eine Apoptose auslöst.
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Verbindung zwischen ΔΨm-Zerstörung
und Aktivierung der Caspasenkaskade.
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14A zeigt,
dass Bcl-2 und Bcl-X die Aktivierung stromabwärtiger Caspasen blockieren.
Mit Bcl-2 oder Bcl-X oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor
(Neo) transfizierte SHEP-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 0,5 μg/ml Doxo
oder 10 μg/ml
Bet A behandelt (Bahnen +). Der Prozentsatz an behandelten oder unbehandelten
Zellen mit ΔΨm wird gezeigt. Vierzig μg aus Zelllysaten isoliertes
Protein pro Bahn wurden durch 15%ige SDS-PAGE abgetrennt. Die Immundetektion
von Caspase-3, Caspase-8 und des PARP-Proteins wurde durch einen Maus-anti-Caspase-3
moab, einen Maus-anti-Caspase-8 moab, einen polyklonalen Kaninchen-anti-PARP-Antikörper und
eine erhöhte
Chemilumineszenz durchgeführt.
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14B zeigt
die zeitliche Beziehung zwischen ΔΨm-Zerstörung
und Caspasenspaltung. SHEP-Zellen wurden 18 Stunden lang mit 0,5 μg/m1 Doxorubicin,
10 μg/m1
Bet A oder 1 μg/ml
anti-APO-1 behandelt, mit DiOC(3) gefärbt und mit einem Cytofluorometer
in Zellen mit noch immer normalem ΔΨm(ΔΨm
high) und Zellen
mit zerstörtem ΔΨm (ΔΨmlow) getrennt. Die Zellsortierung wurde
entsprechend den Bereichen mit ΔΨm
high- oder ΔΨm
low-Zellen durchgeführt, wie
in den Histogrammen gezeigt. Eine Western-Blot-Analyse der Zelllysate wurde
durchgeführt
wie in 14A beschrieben.
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Nach einer Behandlung mit Doxorubicin
wurde Caspase-8 in p43- und p41-Zwischenprodukte
und in die aktive p18-Untereinheit gespalten, und zwar ungeachtet
einer Bcl-2- oder Bcl-X-Überexpression (14A). Im Gegensatz dazu wurde die proteolytische
Verarbeitung von Caspase-3 und PARP in Bcl-2- und Bcl-X-transfizierten
Zellen gehemmt (14A). Ähnliche
Daten wurden bei Verwendung von Cisplatin oder VP-16 als chemotherapeutische
Mittel erhalten. Im Gegensatz dazu wurde die Verarbeitung sowohl
von Caspase-8 als auch von Caspase-3 durch Bcl-2 oder Bcl-X gehemmt,
wenn durch Betulinsäure
eine Apoptose ausgelöst
wurde. Diese Daten weisen darauf hin, dass Caspase-8 nach einer
Behandlung mit Doxorubicin stromaufwärts von einem Bcl-2/Bcl-XLkontrollierten Kontrollpunkt gespalten wird,
jedoch nach einer Inkubation mit Betulinsäure stromabwärts von
diesem Kontrollpunkt. In beiden Fällen wurde eine Verarbeitung
von Caspase-3 und PARP jedoch durch Bcl-2 oder Bcl-X verhindert.
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Um die Beziehung zwischen Mitochondrien-PT
(was ein Bcl-2/BcI-XL-gesteuertes Ereignis
darstellt), CD95-L-Induktion und Caspaseaktivierung weiter darzulegen,
wurden mit Doxorubicin oder Betulinsäure behandelte Zellen in Zellen
mit noch immer normalem ΔΨm(DiOC6(3)high) und Zellen mit zerstörtem ΔΨm(DiOC6(3)low) sortiert. Nach einer Inkubation mit
Doxorubicin wurden sowohl in ΔΨm
high-als auch in ΔΨm
low-Zellen eine
CD95-L-Induktion und eine Spaltung von Caspase-8 vorgefunden (14B). Allerdings wiesen nur ΔΨm
low-Zellen gespaltene
Caspase-3 und PARP auf (14B). Ein ähnliches
Muster einer Caspasenspaltung wurde beobachtet, wenn Zellen durch
eine CD95-Vernetzung
stimuliert wurden (14B). Dies weist
darauf hin, dass eine Aktivierung des Apoptoseprogramms durch die
Höherregulierung
von CD95/CD95-L und die durch CD95 ausgelöste Caspaseaktivierung stromaufwärts von
den Mitochondrien auftritt. Im Gegensatz dazu wiesen nach einer
Inkubation mit Betulinsäure
nur ΔΨm
low-Zellen gespaltene
Caspasen-3 und -8
auf, und zwar zusätzlich
zu verarbeitetem PARP (14B). Somit
trat die Caspase-8-Aktivierung bei einer Betulinsäure-induzierten
Apoptose stromabwärts
von der ΔΨm-Dissipation
auf, während
die Caspase-8-Spaltung und die CD95-L-Induktion bei einer Doxorubicin-induzierten
Apoptose stromaufwärts
vom ΔΨm-Zusammenbruch auftraten.
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Caspase-8 wird durch einen PT durchmachende
Mitochondrien aktiviert. 15A zeigt,
dass die Caspase-8 durch einen PT durchmachende Mitochondrien gespalten
wird. Mit Bcl-2 oder Bcl-X oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor
(Neo) transfizierte SHEP-Zellen wurden 16 Stunden lang mit 0,5 μg/m1 Doxo oder
10 μg/m1
Bet A behandelt (Bahnen +). Die Mitochondrien wurden isoliert und
in Gegenwart oder Abwesenheit von 60 μm Z-VAD.fmk 6 Stunden lang mit
Cytosolextrakten inkubiert. Eine Western-Blot-Analyse wurde durchgeführt wie
in 14A beschrieben.
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15B zeigt,
dass Bcl-2 und Bcl-X die Spaltung von Caspasen auf der Mitochondrienebene
hemmen. Mitochondrien (mito) von Doxo- oder Bet A-behandelten Vektorkontrollzellen
(Neo) und Bcl-2- oder Bcl-XL-überexprimierenden
SHEP-Zellen wurden mit den Cytosolextrakten von Bcl-2- oder Bcl-XL-überexprimierenden
Zellen bzw. Vektorkontrollzellen inkubiert, gefolgt von einer Immundetektion
von Caspase-3 und Caspase-8, wie in 14A beschrieben.
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Die Mitochondrien aus Doxorubicin-
oder Betulinsäure-behandelten
Vektorkontrollzellen induzierten die Spaltung der Caspasen-3, -8
und von PARP in Cytosolextrakten ( 15A).
Diese Wirkung wurde durch den Breitband-Caspase-Inhibitor zVAD-fmk
blockiert, was darauf hinweist, dass zur Aktivierung von Caspase-3
und -8 eine Proteaseaktivität
erforderlich war (15A). Um zu bestätigen, dass
die Spaltung von Caspasen von einen PT durchmachenden Mitochondrien
abhängt,
wurden ähnliche
Versuche durchgeführt,
wobei Bcl-2- oder Bcl-XL-transfizierte Zellen
verwendet wurden, bei welchen die Mitochondrien im Folge einer Doxorubicin-
oder Betulinsäure-Behandlung
keinen PT durchmachen ( 12).
Die Mitochondrien aus Bcl-2- oder Bcl-XL-überexprimierenden
Zellen, welche mit Doxorubicin oder Betulinsäure behandelt wurden, induzierten
in Cytosolextrakten keine Caspasenspaltung (15A).
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Bei Verwendung von Mitochondrien
aus Vektorkontrollzellen wurde eine Spaltung von Caspasen in den
Cytosolextrakten aus Bcl-2- oder Bcl-XL-transfizierten
Zellen festgestellt (15B). Die Verarbeitung
von Caspasen wurde jedoch gehemmt, wenn Mitochondrien aus Bcl-2-
oder Bcl-XL-überexprimierenden Zellen in Kombination
mit den Cytosolextrakten aus Vektorkontrollzellen verwendet wurden
(15B). Dies weist darauf hin, dass
eine fehlerhafte Spaltung von Caspasen in Bcl-2- oder BcI-XL-überexprimierenden
Zellen sich direkt zu einer blockierten Mitochondrienfunktion anstatt
zu direkten oder indirekten Auswirkungen, einschließlich der
Sequestration von Caspasen aus dem Cytosol, entspannte.
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Caspase-8 wird durch einen AIF-hältigen Mitochondrienüberstand,
aber nicht durch Cytochrom c, gespalten. 16A zeigt
diese arzneimittelinduzierte Freisetzung von cyt c aus Mitochondrien.
Mit Bcl-2 oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor (Neo) transfizierte
SFIEP-Zellen wurden für
die angegebenen Zeiträume
mit 0,5 μg/m1
Doxo oder 10 μg/ml
Bet A behandelt. Die Mitochondrien und Cytosolextrakte (S100-Fraktion) wurden
hergestellt wie unter „Materialien
und Verfahren" beschrieben. Fünf μg Protein
pro Bahn wurden durch 15%ige SDS-PAGE abgetrennt. Die Immundetektion
von cyt c wurde durch einen Maus-anti-cyt c moab und eine erhöhte Chemilumineszenz
durchgeführt.
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16B zeigt,
dass sie Spaltung von pro-Caspase-8 durch AIF, aber nicht durch
cyt c, ausgelöst
wird. Cytosolextrakte aus SHEP-Zellen, die nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor
(Neo) oder mit Bcl-2 transfiziert waren, wurden hergestellt und
mit 10 μm
cyt c oder einem AIF-hältigen
Mitochondrienüberstand
inkubiert. Die Immundetektion von Caspase-3, Caspase-8 und PARP
wurde durchgeführt
wie in 14A beschrieben.
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Nach einer Stimulierung mit Doxorubicin
oder Betulinsäure
nahmen die Pegel an Mitochondrien-Cytochrom c ab, während die
Konzentration an ektopischem Cytosol-Cytochrom c anstieg (16A).
Eine erzwungene Expression von Bcl-2 oder BCl-X blockierte die Mitochondrienfreisetzung
von Cytochrom c (16A). Die Zugabe
von gereinigtem Cytochrom c zu Cytosolextrakten führte zur
Verarbeitung von Caspase-3 und PARP sowohl in Vektorkontroll- als
auch in Bcl-2-überexprimierenden
Zellen (16B), was wiederum darauf hinweist,
dass die apoptogene Aktivität
im Cytosol Bcl-2-überexprimierender
Zellen erhalten blieb. Die Zugabe von Cytochrom c zu Cytosolextrakten
induzierte jedoch keine Caspase-8-Aktivierung (16B).
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Eine Inkubation von Cytosolextrakten
mit einem AIF-hältigen
Mitochondrienüberstand
führte
zur Spaltung der Caspasen-3, -8 und von PARP (16B).
Somit aktivieren die verschiedenen, während eines PT freigesetzten
Mitochondrienproteine verschiedene Caspasen, die am Apoptosemechanismus
beteiligt sind.
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Bespiel 5: Betulinsäurederivate
induzieren in neuroektodermalen Zellen eine Apoptose
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Der folgende Versuch zeigt, dass
die als Beispiele angeführten
Betulinsäurederivate
in einer Vielzahl von neuroektodermalen Zellen eine Apoptose induzieren.
Genauer gesagt, Betulinsäure,
28-Acetyl-3-β-D-glucosylbetulin
(„B10"),
3-β-28-Hydroxylup-20(29)-en-3-yl-β-D-glucopyranosid („B11"),
3-β-3-Hydroxylup-20(29)-en-28-yl-β-D-glucopyranosid
(„B12")
und 3-(β-D-Glucopyranosyloxy)lup-20(29)-en-28-olsäureethylester
(„B13")
wurden unter Anwendung der in Beispiel 2 gezeigten Analysen hinsichtlich
einer spezifischen Apoptose-Induktion untersucht. Siehe oben. Wie
in 17A dargestellt, wiesen in SHEP-Zellen alle untersuchten
Derivate eine apoptotische Aktivität auf, welche sogar jene der
Betulinsäure übertraf.
In IMR-S-Zellen wiesen B10, B12 und B13 im Vergleich zur Betulinsäure eine
verstärkte
apoptotische Aktivität
auf, während
B 11 ungefähr
dieselbe Aktivität
zeigte wie Betulinsäure
(17B). Schließlich wiesen in Kelly-Zellen
alle untersuchten Derivate, B10, B11, B12 und B13, eine apoptotische
Aktivität
auf, welche zumindest so stark war wie jene der Betulinsäure (17C).
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Zuckerderivate, insbesondere Glucosederivate,
bieten den zusätzlichen
Vorteil, dass sie die Blut/Gehirn-Barriere durch Saccharidrezeptoren
und -kanäle,
insbesondere Glucosekanäle,
aktiv überschreiten
können.
Daher haben die gezeigten Derivate hinsichtlich der Behandlung von
im Gehirn lokalisierten Tumoren zusätzliche Vorteile.
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Beispiel 6: in verschiedenen
Zelllinien untersuchte Betulinsäurederivate
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Die unten angeführten Zellen wurden mit verschiedenen
Konzentrationen (1–50 μg/ml) von
Betulinsäure
(BetA) oder von Derivaten (B10-B15) behandelt. B10, B11, B12 und
B 13 sind dieselben Verbindungen wie im Beispiel 5 abgegeben, während B
14 3-β-D-Galactosylbetulin
und B 15 3-β-D-Galactosylbetulinsäureethylester
war. Die Apoptose wurde durch eine FACS-Analyse eines mit Propidiumiodid
gefärbten
DNA-Anteils bestimmt, wobei die CELLQuest-Software eingesetzt wurde.
Der Prozentsatz an spezifischer Apoptose wurde wie folgt berechnet:
100 × (experimentelle
Apoptose (%) – spontane
Apoptose (%) / 100% spontane Apoptose (%)). Die spontane Apoptose
lag unter 12%. Die Daten waren die Mittel von drei Werten. Die Konzentrationen, die
für die
Induktion einer spezifischen Apoptose bei 50% der Zellpopulation
(ED50 (μg/ml))
notwendig sind, sind angegeben.
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