DE69908397T2

DE69908397T2 - Betulinsäure derivate zur behandlung von neuroektodermalen tumoren

Info

Publication number: DE69908397T2
Application number: DE69908397T
Authority: DE
Inventors: Michael Klaus DEBATIN; Simone Fulda; Manfred Wiessler; Marek Los; Walter Mier
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1998-10-28
Filing date: 1999-10-28
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2019-10-29
Also published as: WO2000024762A1; ATE241641T1; US6369109B1; ES2201800T3; DE69908397D1; AU1266900A; PT1124842E; EP1124842B1; EP1124842A1; DK1124842T3

Description

I. GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Krebsbehandlung und beruht auf der Entdeckung, dass Betulinsäure oder Betulin und deren Derivate wirksame anti-neuroektodermale Mittel sind. Wie hier geoffenbart, sind Betulinsäure oder Betulin und deren Derivate aufgrund ihres ausgeprägten Wirkungsmechanismus nützlich für die Behandlung neuroektodermaler Tumore, einschließlich neuroektodermaler Tumore, die gegenüber herkömmlichen chemotherapeutischen Mitteln resistent sind. Zusätzlich zur neuen Verwendung bekannter Verbindungen offenbart die Erfindung neuartige Verbindungen und pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung neuroektodermaler Tumore.
II. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Neuroektodermale Tumore, wie z. B. das Neuroblastom, das Medulloblastom und das Ewing-Sarkom, stellen die im Kindesalter am häufigsten vorkommenden harten Tumore dar. Eine Chemotherapie ist die primäre Behandlung für viele Arten von neuroektodermalen Tumoren. Zwei Drittel der Neuroblastomfälle treten bei Kindern im Alter von 5 Jahren oder darunter auf. Der frühe Ausbruch des Neuroblastoms wird durch das pränatale Neuroblastom veranschaulicht, welches durch eine Ultrasonographie des Fötus nachweisbar ist. Jennings et al. 1993, J. Ped. Surg. 28: 1168–1174. Das Neuroblastom entsteht im Nebennierenmark oder in den paraspinalen Stellen, wo Gewebe des sympathischen Nervensystems vorhanden ist. Ein Neuroblastom hat ernsthafte klinische Folgen, einschließlich Symptomen, die mit der Tumormasse oder Knochenschmerzen von Metastasen zusammenhängen. Da sie in paraspinalen Ganglien ihren Ausgang nehmen, können Neuroblastome durch neurale Foramen dringen und das Rückenmark zusammendrücken, was eine Lähmung verursacht. Azizkhan und Haase, 1993, Sem. Surg. Oncol. 9: 493–501.
Bei ungefähr 70% aller Patienten mit einem Neuroblastom wird eine Metastasenerkrankung diagnostiziert. Siehe, z. B. Brodeur et al., 1993, J. Clin. Oncol. 11: 1466–1477; Adams et al., 1993, J. Ped. Surg. 28: 372–378; Evans et al., 1976, Cancer 38: 661–666.
Die Chemotherapie bleibt weiterhin eine der effektivsten Behandlungen bei Neuroblastomtumoren. Neuroblastompatienten werden im Allgemeinen mit einer Chemotherapie behandelt, und zwar mit Cyclophosphamid und Doxorubicin, Cisplatin mit Teniposid oder Etoposid oder Vincristin mit Cisplatin und Teniposid oder Etoposid bei resistenteren Tumoren. Bei Patienten unter einem Jahr wird im Allgemeinen eine aggressive Chemotherapie unter Verwendung von Kombinationen aus Cyclophosphamid, Doxorubicin, Cisplatin und Teniposid oder Etoposid eingesetzt. Castleberry et al., 1991, J. Clin. Oncol. 9: 789–795; Bowman et al., 1997, J. Natl. Cancer Inst. 89: 373–380; Castleberry et al., 1992, J. Clin. Oncol. 10: 1299–1304.
Eine aggressive Chemotherapie mit mehreren Wirkstoffen führte zu einer Überlebensrate von 2 Jahren bei etwa 20% der älteren Kinder mit einem Stufe-IV-Neuroblastom. Bowman et al., 1991, J. Clin. Oncol. 9: 1599–1608; Williams et al., 1995, Med. Ped. Oncol. 24: 176–180. Ein Neuroblastom beim Heranwachsenden oder Erwachsenen hat ungeachtet der Stufe oder Stelle eine schlechtere Langzeitprognose und in vielen Fällen einen längeren Verlauf. Franks et al., 1997, Cancer 79: 2028–2035.
Das Ewing-Sarkom (EWS) tritt üblicherweise im Knochen auf und wird am häufigsten im zweiten Lebensjahrzehnt diagnostiziert. Die üblichsten Stellen für die Primärläsion sind die Beckenknochen, der Oberschenkelknochen, der Oberarmknochen und die Rippen. Das Ewing-Sarkom tritt weniger häufig an nicht knochigen Primärstellen auf, eine Lage, die historisch als extraossales Ewing-Sarkom bezeichnet wurde.
Die morphologischen und biologischen Merkmale von Ewing-Tumoren, die sich in Weichteilen entwickeln, scheinen jedoch nicht von jenen der Tumore, die sich an knochigen Stellen entwickeln, unterscheidbar zu sein. Delattre et al., 1994, New Engl. J. Med. 331: 294-299; Llombart-Bosch et al., 1990, Cancer 66: 2589–2601.
Primitive neuroektodermale Tumore (PNETs) wurden in Abhängigkeit von ihrer Lage und dem Ausmaß der neuralen Differenzierung mit verschiedenen Begriffen bezeichnet: peripheres Neuroepitheliom, Askin-Tumor, adultes Neuroblastom, peripheres Neuroblastom und primitive neuroektodermale Tumore. Der Sammelbegriff ist primitive neuroektodermale Tumore. Das Ewing-Sarkom und PNET stellen ein biologisches Spektrum desselben Tumors dar. Mehr als 90% dieser Tumore sind durch eine Chromosom 11/22-Translokation gekennzeichnet. Da diese Tumore nur neuroektodermale Differenzierungsmarker aufweisen, wurde behauptet, dass sie aus Neuralleistenzellen entstehen. Da die Behandlung bei diesen Tumoren dieselbe ist, werden sie oft als Ewing-Sarkom bezeichnet.
Studien legen nahe, dass mehr als 50% der Patienten ohne Metastasenerkrankung ein krankheitsfreies Langzeitüberleben haben können, im Vergleich zu nur 20–30% bei Patienten, die eine Metastasenerkrankung aufweisen. Siehe z. B. Burgert et al., 1990, J. Clin. Oncol. 8: 1514–1524; Grier et al., 1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13: A-1443; Rosen et al., 1981, Cancer 47: 2204–2213; Dunst et al., 1995, Int. J. Rad. Oncol. Biol. Phy. 32: 919-930; Arai et al., 1991, Int. J. Rad. Oncol. Biol. Phv. 21: 1501–1508.
Ein chirurgischer Eingriff beim Ewing-Sarkom beschränkt sich üblicherweise auf die anfängliche diagnostische Biopsie des primären Tumors. Die Patienten unterzogen sich üblicherweise einer Induktionschemotherapie, gefolgt von einer Bestrahlungstherapie zur lokalen Kontrolle. Die erfolgreiche Behandlung von Patienten mit Ewing-Sarkom erfordert die Anwendung einer Chemotherapie mit mehreren Arzneimitteln. Die Kombinationschemotherapie beim Ewing-Sarkom umfasste traditionellerweise Vincristin, Doxorubicin, Cyclophosphamid und Dactinomycin (VAdriaC oder VAC).
Die Bedeutung von Doxorubicin zeigte sich in zufällig angeordneten Vergleichsversuchen mit erhöhter Stärke der Doxorubicin-Dosierung während der frühen Monate der Therapie, was zu einem verbesserten, ereignisfreien Überleben führte. Siehe z. B. Nesbit et al., 1990, J. Clin. Oncol. 8: 1664–1674; Kinsella et al., 1991, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phy. 20: 389–395; Smith et al., 1991, J. Natl. Cancer Inst. 83: 1460–1470.
Es gibt einige Referenzen, die sich mit der Behandlung neuroektodermaler Tumore beschäftigen (Schmidt et al., Eur. J. Cancer (1997), 33(12), 2007–2010; Fulda et al., Cancer Res. (1997), 57(21), 4956–4964; WO-A-96/29068).
Obwohl viele neuroektodermale Tumore anfänglich auf die Chemotherapie ansprechen, bleibt die Prognose für Kinder, die einen Rückfall erleiden oder eine ausgebreitete Erkrankung aufweisen, aufgrund der Entwicklung einer Arzneimittelresistenz schlecht. Einige chemotherapeutische Mittel, wie z. B. Doxorubicin, beruhen zur Ausübung ihrer Antitumorwirkungen auf dem Vorhandensein eines funktionierenden CD95-Systems in den Zieltumorzellen. Zellen, denen ein funktionsfähiges CD95 fehlt, sind gegenüber Doxorubicin resistent. Einige andere chemotherapeutische Mittel beruhen zur Ausübung ihrer Antitumorwirkungen auf dem Vorhandensein eines funktionsfähigen p53-Systems. Solche chemotherapeutische Mittel sind gegenüber Zellen, denen ein funktionsfähiges p53-Protein fehlt, wirkungslos.
Daher besteht ein großer Bedarf an der Entwicklung chemotherapeutischer Arzneimittel, die auf neuroektodermale Tumore und insbesondere auf arzneimittelresistente neuroektodermale Tumore abzielen.
Demgemäß stellt diese Erfindung chemische Zusammensetzungen und deren Verwendung für die Behandlung neuroektodermaler Tumore bereit. Diese Zusammensetzungen beruhen zur Ausübung ihrer Antitumorwirkungen nicht auf dem CD95- oder p53-System.
III. KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt neuartige, für die Behandlung neuroektodermaler Tumore nützliche Verbindungen bereit, die aus folgenden Verbindungen ausgewählt sind:
3-β-28-(Acetyloxy)lup-20(29)-en-3-yl-β-D-glucopyranosid (28-Acetyl-3-β-Dglucosylbetulin)
3-β-28-Hydroxylup-20(29)-en-3-yl-β-D-glucopyranosid
3-β-3-Hydroxylup-20(29)-en-28-yl-β-D-glucopyranosid
3-(β-D-Glucopyranosyloxy)lup-20(29)-en-28-olsäureethylester
3-β-D-Galactosylbetulinsäureethylester
D-Enantiomeren, L-Enantiomeren und Racematen davon; und pharmazeutisch geeigneten Salzen davon.
Die vorliegende Erfindung stellt weiters für die Behandlung neuroektodermaler Tumore nützliche Zusammensetzungen bereit, die eine therapeutisch wirksame Menge von Folgendem umfassen:
3-β-28-(Acetyloxy)lup-20(29)-en-3-yl-β-D-glucopyranosid(28-Acetyl-3-β-Dglucosylbetulin)
3-β-28-Hydroxylup-20(29)-en-3-yl-β-D-glucopyranosid
3-β-3-Hydroxylup-20(29)-en-28-yl-β-D-glucopyranosid
3-(β-D-Glucopyranosyloxy)lup-20(29)-en-28-olsäureethylester
3-β-D-Galactosylbetulinsäureethylester
D-Enantiomeren, L-Enantiomeren und Racematen davon; und pharmazeutisch geeigneten Salzen davon.
Solche Zusammensetzungen können auch einen pharmazeutisch geeigneten Träger oder ein pharmazeutisch geeignetes Vehikel umfassen.
Die Erfindung stellt weiters die Verwendung der obenstehend erwähnten Verbindungen für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereit, welche in einem Verfahren zur Behandlung neuroektodermaler Tumore zu verwenden ist, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge dieser Verbindungen an einen Patienten, der eine solche Behandlung benötigt.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird die erfindungsgemäße Verbindung in einer Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch geeigneten Träger oder ein pharmazeutisch geeignetes Vehikel umfasst, verabreicht.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch eine Vielfalt von Verfahren, einschließlich oraler, sublingualer, intranasaler, intramuskulärer, intravenöser, subkutaner, intravaginaler, transdermaler, rektaler Verfahren, durch Inhalation oder als Mundwasser, verabreicht werden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und die Verfahren, die hier geoffenbart sind, sind besonders vorteilhaft für die Behandlung neuroektodermaler Tumore, welche gegenüber den am häufigsten gebrauchten chemotherapeutischen Mitteln resistent sind. Bei einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das systemische Verabreichen von Betulinsäurederivaten oder Betulinderivaten und/oder von Zusammensetzungen, welche dieselben enthalten, an ein Individuum. Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren das lokale Anwenden von Betulinsäurederivaten oder Betulinderivaten auf einen Tumor. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden Betulinsäurederivate oder Betulinderivate systemisch an einen Patienten verabreicht, der an einem Doxorubicinresistenten neuroektodermalen Tumor leidet.
IV. KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A–C zeigen das Herbeiführen einer Apoptose durch Betulinsäure.
2A–E zeigen die Betulinsäure-induzierte Aktivierung einer Caspase.
3A–B zeigen das CD95-unabhängige Herbeiführen einer Apoptose.
4A–B zeigen eine Betulinsäure-induzierte Störung der Mitochondrienfunktion.
5A–D zeigen die Beteiligung von Bcl-2-verwandten Proteinen und von p53 an der Betulinsäure-induzierten Apoptose.
6A–B zeigen die Wirkung von Betulinsäure auf arzneimittelresistente Zellen.
7 zeigt, dass Betulinsäure direkt einen Wechsel der Mitochondrienpermeabilität auslöst.
8A–C zeigen, dass ein Betulinsäure-induzierter Wechsel der Mitochondrienpermeabilität eine Kernfragmentierung auslöst.
9A und B zeigen, dass die Betulinsäure-induzierte Spaltung von Caspasen vom Wechsel der Mitochondrienpermeabilität abhängt.
10A–C zeigen, dass Betulinsäure die Freisetzung eines apoptogenen Faktors/von apoptogenen Faktoren aus isolierten Mitochondrien bewirkt.
11A zeigen, dass aus Mitochondrien freigesetzte apoptogene Proteine die Spaltung von Caspasen induzieren.
12A–D zeigen eine arzneimittelinduzierte Apoptose und einen Mitochondrien-PT.
13A–C zeigen, dass die Aktivierung des CD95-Systems durch Doxorubicin stromaufwärts von den Mitochondrien stattfindet.
14A–B zeigen die funktionelle Beziehung zwischen dem Ä_⌀m-Bruch und der Aktivierung der Caspase-Kaskade.
15A–B zeigen die Aktivierung von Caspasen in CFS.
16A–B zeigen die Spaltung von Caspasen durch cyt. C und AIF.
17A–C zeigen das Herbeiführen einer Apoptose durch Betulinsäurederivate.
V. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
1. Übersicht über die Erfindung
Die Erfindung beruht teilweise auf der unerwarteten Entdeckung der Erfinder, dass Betulinsäurederivate oder Betulinderivate wirksam das Wachstum einer Vielfalt von neuroektodermalen Zellen hemmen. Die Erfindung beruht weiters teilweise auf der unerwarteten Entdeckung, dass Betulinsäurederivate oder Betulinderivate ihre Wirkung über andere Pfade ausüben als routinemäßig verwendete, chemotherapeutische Mittel. Wie obenstehend im Abschnitt I besprochen, erfordert die Behandlung neuroektodermaler Tumore oftmals eine Langzeit-Kombinationschemotherapie. Die Patienten entwickeln nach langer Anwendung solcher Mittel oft eine Resistenz gegenüber chemotherapeutischen Mitteln. In der Tat ist bekannt, dass viele chemotherapeutische Mittel ihre Antitumorwirkung durch das Herbeiführen einer Apoptose in den Zieltumorzellen ausüben. Eine große Anzahl solcher Mittel induziert in den Zieltumorzellen eine Tumorzellenapoptose durch Apoptose-Signalsysteme, insbesondere das CD95- und das p53-System. Häufig entwickeln die Zieltumorzellen jedoch eine Arzneimittelresistenz, indem die Komponenten des Apoptose-meldenden Pfades mutiert werden. Beispielsweise verleiht der Verlust entweder von CD95 oder von p53 den Tumorzellen eine Arzneimittelresistenz. Indem sie über einen Apoptosepfad wirken, der verschieden und unabhängig vom CD95- und vom p53-System ist, bieten die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung den Vorteil, dass sie bei Tumoren wirksam sind, welche gegenüber den am häufigsten gebrauchten chemotherapeutischen Mitteln, die durch CD95 und/oder p53 wirken, resistent sind.
Somit ist die vorliegende Erfindung im Allgemeinen auf Betulinsäurederivate und Betulinderivate sowie auf deren Verwendung für die Behandlung neuroektodermaler Tumore gerichtet. Genauer gesagt, die vorliegende Erfindung ist auf neuartige Derivate von Betulinsäure und Betulin sowie auf Verfahren zu deren Synthese gerichtet. Weiters ist die vorliegende Erfindung auf pharmazeutische Zusammensetzungen gerichtet, welche die neuartigen erfindungsgemäßen Verbindungen und einen pharmazeutisch geeigneten Träger enthalten, der für die Behandlung neuroektodermaler Tumore nützlich ist.
2. Die Antitumorwirkung von Betulinsäure, Betulin und Derivaten davon
Betulinsäure-induzierte Apoptose: Die Induktion einer Tumorzellenapoptose (programmierter Zelltod) ist ein starker therapeutischer Zugang zum Behandeln von Tumoren. Der Begriff Apoptose bezieht sich auf eine morphologisch unterschiedliche Form des Zelltods, der mit der normalen Physiologie zusammenhängt. Kerr et al., 1972, Brit. J. Cancer 26: 239. Die Apoptose unterscheidet sich von der Nekrose, die mit einer akuten Verletzung der Zellen zusammenhängt. In morphologischer Hinsicht ist die Apoptose durch eine Kernchromatin-Kondensation, ein cytoplasmatisches Schrumpfen, ein erweitertes endoplasmatisches Retikulum und Membranbläschen gekennzeichnet.
Die Entdeckung der Erfinder besteht darin, dass Betulinsäure, Betulin und Derivate davon eine Apoptose in Zelllinien des Neuroblastoms (SH-EP), Medulloblastoms (Daoy), Ewigg-Sarkoms (A 17/95) und Melanoms (A-378) induzieren. Obwohl früher berichtet wurde, dass Betulinsäure eine Cytotoxizität gegenüber einer Melanom-Zelllinie (MEL-2) ausübt, war weder bekannt noch wurde erwartet, dass Betulinsäure auf eine breite Vielfalt von Krebszellen wirken würde. Siehe, Dascupta und Pezzuto, PCT/US96/04016, worin geoffenbart wird, dass Betulinsäure unter zehn verschiedenen Tumorzellen, die untersucht wurden, nur auf MEL-2 cytotoxische Wirkungen hatte. Es ist daher eine überraschende Entdeckung, dass Betulinsäure und ihre Derivate in neuroektodermalen Zellen eine Apoptose induzieren.
Die Betulinsäure-induzierte Apoptose ist unabhängig von CD95 und P53: Ein Apoptose-Zelltod kann durch eine breite Vielfalt von Stimuli ausgelöst werden, und nicht alle Zellen sterben notwendigerweise als Reaktion auf denselben Stimulus. Zu den näher untersuchten Todes-Stimuli gehört ein DNA-Schaden, z. B. durch Bestrahlung oder Arzneimittel, die zur Krebschemotherapie eingesetzt werden, welcher in vielen Zellen über einen von p53 abhängigen Pfad zum Apoptose-Tod führt. Einige Hormone, wie z. B. Corticosteroide, führen bei bestimmten Zellen, z. B. Thymozyten, zum Absterben, obwohl andere Zelltypen stimuliert werden können. Einige Zelltypen exprimieren Fas, ein Oberflächenprotein, welches als Reaktion auf eine Vernetzung ein intrazelluläres Todessignal auslöst. In anderen Fällen scheinen die Zellen einen fehlerhaften Todes-Pfad zu besitzen, welcher durch einen Überlebensfaktor aktiv blockiert werden muss, um ein Überleben der Zellen zu ermöglichen.
Es wurde gezeigt, dass cytotoxische Arzneimittel, ungeachtet ihres intrazellulären Ziels, das Absterben empfindlicher Zielzellen bewirken, indem sie eine Apoptose induzieren. Fisher, 1994, Cell, 78: 539–542. Das CD95 (APO-1/Fas)-System ist ein Hauptvermittler einer arzneimittelinduzierten Apoptose in Leukämie- und Neuroblastomzellen. Friesen et al., 1996, Mature Med., 2: 574–577; Faldo et al., 1997, Cancer Res. 57: 3823–3829. Nach der Behandlung mit cytotoxischen Arzneimitteln wurde ein CD95-Ligand (CD95-L) induziert und bewirkte in autokriner oder parakriner Weise eine Apoptose. CD95-L ist ein M 40.000-Typ II-Transmembranmolekül der Familie von Liganden mit dem TNF/-Nervenwachstumsfaktor (Suda et al., 1993, Cell 75: 1169–1178), welche auch in einer nach der proteolytischen Spaltung aus der Zelloberfläche freigesetzten, löslichen Form auftreten können. Tonaka et aL., 1995, EMBO J. 14: 1129–1135.
Eine überraschende Entdeckung der Erfinder besteht darin, dass Betulinsäure und ihre Derivate die Apoptose einer Tumorzelle induzieren, und zwar unabhängig vom CD95-Status in der Tumorzelle. Beispielsweise induziert die Betulinsäure, wie hier untenstehend geoffenbart, eine Apoptose in den SH-EP-Neuroblastomzellen, ohne die Expression von CD95-L zu induzieren, während eine Doxorubicin-Behandlung die Expression von CD95-L induziert. Werden Zellen mit anti-APO-1 (anti-CD95)-Antikörpern behandelt, um die Funktion von CD95 zu blockieren, so ist die Induktion einer Apoptose durch Betulinsäure nicht betroffen. Siehe unten. Im Gegensatz dazu wird eine Doxorubicin-induzierte Apoptose durch anti-CD95-Antikörper erheblich blockiert.
Neben CD95 spielt auch das p53-Gen eine entscheidende Rolle bei der Durchführung der Apoptose. Eine Vielzahl von Hinweisen impliziert p53 bei der Apoptose. Ist das p53 in einer Krebszelle mutiert, so ist weniger wahrscheinlich, dass die Zellen in eine Apoptose treten, wenn sie mit diesen chemotherapeutischen Mitteln behandelt werden. Eine Bestrahlung und DNA-schädigende chemotherapeutische Arzneimittel neigen dazu, über Pfade zu arbeiten, die p53 einschließen. Ein Verlust der p53-Funktion könnte zu einem merklichen Anstieg der zellulären Chemoresistenz führen und kann zum signifikanten Ausmaß des Versagens der Behandlung beisteuern, welches bei diesen Tumoren beobachtet wird. Siehe z. B. Buttitta et al., 1997, Proc. Ann. Meet. Am. Assoc. Cancer Res. 38: A713.
Wie untenstehend gezeigt, induziert eine Doxorubicin-Behandlung die Anhäufung des p53-Proteins. Im Gegensatz dazu induziert Betulinsäure keine Anhäufung des p53-Proteins, was nahe legt, dass die Apoptose-induzierende Wirkung von Betulinsäure unabhängig vom p53-Protein ist.
Ohne Beabsichtigung, an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, zeigen die untenstehenden Beispiele 3 und 4, dass Betulinsäure in isolierten Mitochondrien direkt einen Permeabilitätswechsel PT auslöste, und die Induktion eines PT scheint das anfängliche Ereignis bei einer durch Betulinsäure ausgelösten Apoptose zu sein. Mitochondrien, die ein PT durchmachen, setzen aus dem Mitochondrien-Intermembranraum apoptogene Proteine, wie z. B. Cytochrom c oder den Apoptose-induzierenden Faktor (AIF), frei, und zwar in das Cytosol, wo sie Caspasen und Endonucleasen aktivieren. Kroemet et al., 1997, Immunol. Today 18: 44–51; Susin et al., J. Exp. Med. 186: 25–37.
Wie die untenstehenden Beispiele 3 und 4 zeigen, verhinderte eine Hemmung des PT durch Überexpression von Bcl-2 oder Bcl-X_L oder durch den Mitochondrien-spezifischen Inhibitor Bongkreksäure jegliche Manifestationen einer Apoptose in intakten Zellen und in einem zellfreien System, wie z. B. die Zerstörung des Mitochondrien-Transmembranpotentials (ΔΨ_m), die Aktivierung von Caspasen, die Spaltung von Substraten (PARP) und die Kernfragmentierung. Im Gegensatz zur Betulinsäure induzierten klassische cytotoxische Arzneimittel, wie z. B. Doxorubicin, Cisplatin oder Etoposid, keinerlei Mitochondrien-Störungen in isolierten Mitochondrien, was nahe legt, dass ein Mitochondrien-PT, der in intakten Zellen während einer durch diese Substanzen ausgelösten Apoptose auftrat, die Folge einer primären Aktivierung anderer Pfade oder Systeme war.
Zu intakten Zellen hinzugefügt, induzierte Betulinsäure spezifisch Mitochondrienveränderungen in SHEP-Neuroblastomzellen, jedoch nicht in Lymphzelllinien. Betulinsäurebehandelte Mitochondrien, welche aus der B-Lymphoblastoid-Zelllinie SKW6,4 isoliert worden waren, lösten jedoch einen Mitochondrien-PT aus und vermittelten eine Kernfragmentierung, ähnlich wie Mitochondrien aus SHEP-Zellen. Somit kann die Spezifizität der Betulinsäure hinsichtlich neuroektodermaler Tumore besser durch eine zellspezifische Aufnahme und/oder Translokation der Verbindung in das Mitochondrienkompartiment erklärt werden als durch Unterschiede bei den Mitochondrien selbst.
3. Die Verbindungen
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die für die Behandlung neuroektodermaler Tumore nützlichen Verbindungen folgende:
3-β-28-(Acetyloxy)lup-20(29)-en-3-yl-β-D-glucopyranosid(28-Acetyl-3-β-Dglucosylbetulin)
3-β-28-Hydroxylup-20(29)-en-3-yt-β-D-glucopyranosid
3-β-3-Hydroxylup-20(29)-en-28-yl-β-D-glucopyranosid
3-(β-D-Glucopyranosyloxy)1up-20(29)-en-28-olsäureethylester
3-β-D-Galactosylbetulinsäureethylester
D-Enantiomere, L-Enantiomere und Racemate davon; und pharmazeutisch geeignete Salze davon.
Solche pharmazeutisch geeigneten Salze sind dem Fachmann bekannt und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Natrium-, Kalium-, Lithium-, Calcium-, Magnesium-, Zink- und Eisensalze.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen, einschließlich pharmazeutisch geeigneter Salze davon, umfassen zumindest ein Chiralitätszentrum und können daher als einzelne Enantiomere, enantiomerisch angereicherte Mischungen von Enantiomeren und Racemate existieren. Demgemäß sind die erfindungsgemäßen Verbindungen, wie hier in Betracht gezogen, für die Behandlung neuroektodermaler Tumore nützlich, wenn sie sich in ihrer Denantiomerischen, L-enantiomerischen oder racemischen Form befinden.
Die Verbindungen der Formel (1) können direkt aus natürlichen Quellen isoliert oder aus natürlichen oder synthetischen Ausgangsmaterialien oder -reagenzien chemisch synthetisiert und anschließend aus einer Reaktionsmischung isoliert werden. So oder so können die erfindungsgemäßen Verbindungen durch Standard-Reinigungstechniken, einschließlich der Säulenchromatographie, der Rekristallisation, der enzymatischen Gewinnung oder anderer, dem Fachmann bekannter Mittel, ohne auf diese beschränkt zu sein, in gereinigter Form erhalten werden.
4. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können über eine herkömmliche organische Synthese erhalten werden, wie untenstehend beschrieben.
Im Allgemeinen können die erfindungsgemäßen Verbindungen aus Verfahren erhalten werden, die beispielsweise bei Ohara et al., 1994, Mokuzai Gakkaishi 40(4): 444–51 und Uvarova et al., 1980, Carbohydrate Research 83: 33–42, beschrieben sind.
Zusätzlich kann die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen durch folgende Verfahren durchgeführt werden: Der synthetische Zugriff auf die Verbindungen beginnt mit Betulin oder Betulinsäure.
Im Verlauf der Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung, welche unter die Formel (I)
fällt, kann die R¹- oder R²-Position zeitweise geschützt werden. Beispiele für geeignete Schutzgruppen umfassen Acetyl- und andere Acylschutzgruppen für R¹, und für R², falls R²=CH₂OH. Ist -CO₂H für R² ausgewählt, so kann diese Gruppe in Form irgendeines Esters, beispielsweise eines Methyl-, Ethyl- oder Isopropylesters, geschützt werden. Die Schutzgruppen können durch Standardverfahren eingebracht werden, wie beispielsweise bei Greene und Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (2. Ausgabe, 1991) und in den darin angeführten Literaturstellen beschrieben. Zusätzlich kann der selektive Schutz der R² (-CH₂OH)-Gruppe von Betulin in Gegenwart der C-3-Hydroxylgruppe gemäß der von 0. Pancharoen et al., 1994, Phytochemistry 35(4): 987–92, beschriebenen Verfahrensweise erzielt werden.
Um Verbindungen der Formel (I) zu erhalten, wobei R¹ mit dem Sauerstoffatom, an das R¹ gebunden ist, eine Etherbindung bildet oder wobei R² eine -CH₂O-Etherverknüpfung enthielt, wobei beispielsweise R¹ oder R² ein gerades oder verzweigtes -C-C₂₀-Kettenalkyl, ein gerades oder verzweigtes -C₂-C₂₀-Kettenalkenyl, ein gerades oder verzweigtes -C₂-C₂₀-Kettenalkinyl, myo-Inosityl, scyllo-Inosityl, Cyclitol, Coduritol A, Quebrachitol oder Ketten von Polyethylenglycol (-(CH₂CH₂O)_nH, -(CH₂CH₂O)_nCH₃ oder -(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₃) ist, wird eine Verknüpfung über eine Etherbindung erzielt.
Zu diesem Zweck kann Betulin oder Betulinsäure unter etherbindungsbildenden Standardbedingungen mit dem geraden oder verzweigten -C₁-C₂₀-Kettenalkyl, dem geraden oder verzweigten -C₂-C₂₀-Kettenalkenyl, dem geraden oder verzweigten -C₂-C₂₀-Kettenalkinyl, myo-Inosityl, scyllo-Inosityl, Cyclitol, Coduritol A, Quebrachitol oder einer Polyethylenglycol (-(CH₂CH₂O)_nH, -(CH₂CH₂O)_nCH₃ oder -(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₃)-Kette reagieren. Das gerade oder verzweigte -C₁-C₂-Kettenalkyl, das gerade oder verzweigte -C₂-C₂₀-Kettenalkenyl, das gerade oder verzweigte -C₂-C₂₀-Kettenalkinyl, myo-Inosityl, scyllo-Inosityl, Cyclitol, Coduritol A, Quebrachitol oder die Polyethylenglycol (-(CH₂CH₂O)_nH, -(CH₂CH₂O)_nCH₃ oder -(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₃)-Kette kann als Halogen-, beispielsweise Chlor-, Brom- oder Iod-, Derivat oder als aktiviertes Ester-, beispielsweise Tosylat-, Triflat-, Mesylat- oder Brosylat, Derivat aktiviert werden. Die Etherifizierungsreaktion kann gemäß einer standardmäßigen Williamson-Verfahrensweise oder gemäß verbesserten Protokollen durchgeführt werden, wie beispielsweise bei R. A. W. Johnston et al., Tetrahedron 35: 2196 (1979) geoffenbart.
Um Derivate mit glykosidischen Verknüpfungen zu erhalten, wobei beispielsweise R¹ ein Monosaccharid oder Disaccharid oder ein Oligosaccharid ist oder wobei R² -CH₂O(Monosaccharid), -CH₂O(Disaccharid), -CH₂O(Oligosaccharid), -CO₂(Monosaccharid), -CO₂(Disaccharid) oder -CO₂(Oligosaccharid) ist, kann ein geeignet geschütztes Derivat entweder von Betulin oder Betulinsäure unter glycosidbindungsbildenden Standardbedingungen mit einem aktivierten und/oder geeignet geschützten Saccharidderivat reagieren.
Das Saccharidderivat kann in stereospezifischer Weise mit dem C-3-Sauerstoffatom oder dem -CH₂-Abschnitt von R² der Verbindungen der Formel (I) verknüpft werden.
Vorzugsweise ist das Saccharidderivat mit dem C-3-Sauerstoffatom oder dem -CH₂-Abschnitt von R² solcherart in einem Gebilde verknüpft, dass eine â-Glycosidbindung gebildet wird. Dies trifft besonders im Fall von Glucose und Galactose zu. Zu diesem Zweck verwendbare Protokolle umfassen das Koenigs Knorr-Verfahren (W. Koenigs et al., Ber. Dtsch. Chem. Ges. 34: 957 (1901), wobei ein Glycosylbromid in Gegenwart eines Silberkatalysators, beispielsweise Silbercarbonat, reagiert), und das Helferich-Verfahren (B. Helferich et al., Ber. Dtsch. Chem. Ges. 73: 532 (1940) und N. I. Uvarova et al., Carbohydrate Research 83: 33–42 (1980)).
Um Esterderivate zu erhalten, wobei beispielsweise R² -CO₂(gerades oder verzweigtes -C₁-C₂₀-Kettenalkyl), -CO₂(gerades oder verzweigtes -C₂-C₂₀-Kettenalkenyl), -CO₂(gerades oder verzweigtes -C₂-C₂-Kettenalkinyl), -CO₂(myo-Inosityl), -CO₂(scyllo-Inosityl), -CO₂(Cyclitol), -CO₂(Coduritol A), -CO₂(Quebrachitol), -CO(OCH₂OCH₂)_nOH, -CO(OCH₂OCH₂)_nOCH₃ und -CO(OCH₂OCH₂)_nOCH₂CH₃) ist, muss die Carboxylgruppe eines – beispielsweise über R¹ – geeignet geschützen Betulinsäurederivats aktiviert werden. Geeignete aktivierte Betulinsäurederivate umfassen Carboxylhalogenid- und Dicyclohexylcarbodiimidderivate, ohne auf diese beschränkt zu sein. Das aktivierte Carbonsäurederivat kann unter esterbindungsbildenden Standardbedingungen mit einer Gruppe reagieren, welche eine Hydroxylfunktion enthält. Eine solche Reaktion kann gemäß einem Standard-Schotten-Baumann-Verfahren oder gemäß Protokollen, wie sie bei Kaiser et al., 1070, J Org. Chem, 35: 1198, geoffenbart sind, durchgeführt werden.
Ist der Schutz einer oder beider Hydroxylgruppen von Betulin oder der Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe von Betulinsäure erforderlich, um eine Verbindung der Formel (I) zu erhalten, so können Schutz- oder Deprotektionsreaktionen gemäß Standardverfahren durchgeführt werden, wie beispielsweise bei Greene und Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (2. Ausgabe, 1991) und in den darin angeführten Literaturstellen beschrieben.
Falls Acylschutzgruppen für R² eingesetzt werden, wenn dieses die Form -CH₂OZ besitzt, wobei Z die Acylschutzgruppe ist, werden bei Raumtemperatur vorzugsweise wässrige Natriumhydroxidlösungen für die Deprotektion der Z-Gruppe eingesetzt.
Glycosylhalogenide, welche für Glycosidierungen geeignet sind, und aliphatische (Alkanyl-, Alkenyl- und Alkinyl-) und Polyethylenglycolketten sowie Halogenidderivate davon sind bei standardmäßigen Chemielieferanten im Handel erhältlich.
Die Verbindungen der Formel (I), wobei R³= -CH(CH₃)₂, können aus den Verbindungen der Formel (I) erhalten werden, wobei R³ = -C(CH₃) (=CH₂). Um Verbindungen der Formel (I) zu erhalten, wobei R³ = -CH(CH₃)₂, können die Verbindungen, wobei R³ = -C(CH₃) (=CH₂), katalytisch hydriert werden, wobei gemäß den bei T. Fuijoka et al., 1994, J. Nat. Prod. 57(2): 243–47, beschriebenen Verfahren Palladium auf Aktivkohle verwendet wird.
Zusätzlich zu den obenstehenden Verfahren können die erfindungsgemäßen Verbindungen durch eine dem Fachmann gemeinhin bekannte, herkömmliche organische Synthese erhalten werden.
Sobald die erfindungsgemäßen Verbindungen synthetisiert wurden, können sie gereinigt oder im Wesentlichen gereinigt werden, wobei die herkömmliche Chromatographie, die Rekristallisation oder andere, dem Fachmann bekannte Reinigungstechniken angewandt werden.
5. Therapeutische Indikationen und Behandlungsverfahren
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind nützlich für Verfahren und Zusammensetzungen zum Behandeln von Tumoren, typischerweise neuroektodermalen Tumoren und deren Metastasen, und zwar bei einem Individuum, das eine solche Behandlung benötigt. Das Individuum ist typischerweise ein Säugetier und am meisten bevorzugt ein Mensch.
Wie hier demonstriert, sind die geoffenbarten Verbindungen und pharmazeutischen Zusammensetzungen nützlich für die Behandlung neuroektodermaler Tumore, einschließlich des Neuroblastoms, des Medulloblastoms und des Ewing-Sarkoms, ohne auf diese beschränkt zu sein. Die Diagnose von neuroektodermalen Tumoren und deren Metastasen ist dem Fachmann bekannt. Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen das Verabreichen pharmazeutischer Zusammensetzungen, welche eine therapeutisch wirksame Menge einer ausgewählten erfindungsgemäßen Verbindung und einen geeigneten pharmazeutischen Träger, siehe unten, enthalten, an das Individuum, welches dies benötigt, d.h. an ein Individuum, das von einem neuroektodermalen Tumor befallen ist.
Bei manchen spezifischen Ausführungsformen werden die geoffenbarten Verbindungen und Zusammensetzungen der Erfindung zur Behandlung neuroektodermaler Tumore eingesetzt, welche gegenüber bestimmten chemotherapeutischen Mitteln resistent sind. Bei einer derartigen Ausführungsform werden sie zur Behandlung Doxorubicinresistenter Neuroektodermalien eingesetzt. Bei einer weiteren derartigen bevorzugten Ausführungsform wird zumindest eine der Zusammensetzungen der Erfindung systemisch verabreicht, und zwar in Verbindung mit anderen chemotherapeutischen Mitteln, wie z. B. Doxorubicin.
Es zeigte sich, dass insbesondere die Verbindungen 28-Acetyl-3-β-D-glucosylbetulin („B10"), 3-β-28-Hydroxylup-20(29)-en-3-yl-β-D-glucopyranosid („B11 "), 3-β-3-Hydroxylup-20(29)-en-28-yl-β-D-glucopyranosid („B12"), 3-(β-D-Glucopyranosyloxy)lup-20(29)-en-28-olsäureethylester („B13"), 3-β-D-Galactosylbetulin („B 14") und 3-β-D-Galactosylbetulinsäureethylester („B15") oder geeignete Salze davon eine starke Wirksamkeit hinsichtlich der Aktivierung einer Apoptose in Tumorzellen aufweisen und vorteilhafterweise in der Veterinär- und Humanmedizin für die Behandlung neuroektodermaler Tumore nützlich sind. Diese Betulin- bzw. Betulinsäurederivate besitzen eine verbesserte Wasserlöslichkeit, haben eine verbesserte Aufnahme in die Zellen und sind somit verglichen mit Betulin und Betulinsäure von Vorteil.
Bei Verabreichung an einen Patienten, z. B. ein Säugetier zur tierärztlichen Verwendung oder an einen Menschen zur klinischen Verwendung, werden die erfindungsgemäßen Verbindungen vorzugsweise in isolierter Form verabreicht. Unter „isoliert" ist zu verstehen, dass die Verbindungen vor der Formulierung in eine Zusammensetzung von anderen Komponenten entweder aus (a) einer natürlichen Quelle, wie z. B. einer Pflanze oder Zellkultur, oder (b) einer synthetischen, organischen, chemischen Reaktionsmischung getrennt werden. Vorzugsweise werden die Verbindungen durch herkömmliche Techniken gereinigt.
Für eine erfolgreiche Behandlung von Indikationen, die Tumore im Gehirn umfassen, wie z. B. beim primären Medulloblastom, beim primären Neuroblastom oder beim Ewing-Sarkom, kann notwendig sein, dass die aktive Verbindung in der Lage ist, die Blut/Gehirn-Barriere zu überschreiten, und zwar abhängig davon, wie intakt die Blut/Gehirn-Barriere im bestimmten Fall ist. Im Allgemeinen sind kleine lipophile Verbindungen, wie z. B. Betulinsäure und die geoffenbarten Derivate, gut zum passiven Überschreiten der Blut/Gehirn-Barriere geeignet. Von besonderen Wert können jedoch Verbindungen sein, welche Zuckerreste aufweisen, wie insbesondere Glucosereste, da diese die Blut/Gehirn-Barriere durch Saccharidrezeptoren und -kanäle, insbesondere Glucosekanäle, aktiv überschreiten können. Diese Betulin- bzw. Betulinsäurederivate besitzen eine verbesserte Wasserlöslichkeit, zeigen eine verbesserte Aufnahme in die und einen verbesserten Transport in den Zellen und sind somit verglichen mit Betulin und Betulinsäure von Vorteil. Daher können Verbindungen einschließlich 28-Acetyl-3-β-D-glucosylbetutin („B10"), 3-β-28-Hydroxylup-20(29)-en-3-yl-β-D-glucopyranosid („B11 "), 3-β-3-Hydroxylup-20(29)-en-28-yl-β-Dglucopyranosid („B12"), 3-(β-D-Glucopyranosyloxy)lup-20(29)-en-28-olsäureethylester („B13"), 3-β-D-Galactosylbetulin („B14") und 3-β-D-Galactosylbetulinsäureethylester („B15") für die Behandlung von im Gehirn lokalisierten Tumoren von besonderem Vorteil sein.
Bei Verabreichung an einen Patienten, z. B. ein Säugetier zur tierärztlichen Verwendung oder an einen Menschen zur klinischen Verwendung, können die Verbindungen der Formel (I) allein oder in Kombination mit irgendeinem physiologisch geeigneten Träger oder Vehikel, der bzw. das für die enterale oder parenterale Verabreichung geeignet ist, eingesetzt werden. Bei Verwendung zur parenteralen Verabreichung sollte der physiologisch geeignete Träger oder das physiologisch geeignete Vehikel steril und zur in vivo-Verwendung beim Menschen oder zur Verwendung in einer veterinärklinischen Situation geeignet sein.
6. Formulierungen und Verabreichungswege
Die hier beschriebenen Verbindungen oder die pharmazeutisch geeigneten Zusatzsalze und/oder -hydrate davon können einem Patienten unter Anwendung eines breiten Umfangs von Verabreichungswegen oder -methoden verabreicht werden. Geeignete Verabreichungswege umfassen die Inhalation, die transdermale, orale, rektale, transmukosale, intestinale und parenterale Verabreichung, einschließlich intramuskulärer, subkutaner und intravenöser Injektionen, ohne darauf beschränkt zu sein.
Die hier beschriebenen Verbindungen oder die pharmazeutisch geeigneten Salze und/oder -hydrate davon können allein, in Kombination mit anderen erfindungsgemäßen Verbindungen und/oder in Cocktails, die mit anderen therapeutischen Mitteln kombiniert sind, verabreicht werden. Natürlich hängt die Wahl der therapeutischen Mittel, die zusammen mit den erfindungsgemäßen Verbindungen verabreicht werden können, teilweise vom behandelten Leiden ab.
Werden die erfindungsgemäßen Verbindungen beispielsweise Patienten verabreicht, die an neuroektodermalen Tumoren oder arzneimittelresistenten Tumoren Leiden, so können sie in Cocktails verabreicht werden, welche Mittel enthalten, die zur Behandlung des Schmerzes, einer Infektion und anderer Symptome und Nebenwirkungen, die üblicherweise mit solchen Tumoren zusammenhängen, eingesetzt werden. Solche Mittel umfassen z. B. Schmerzmittel, Antibiotika etc.. Die Verbindungen können auch in Cocktails verabreicht werden, welche andere Mittel enthalten, die üblicherweise zur Behandlung neuroektodermaler Tumore eingesetzt werden, wie z. B. Vincristin, Doxorubicin (oder Dactinomycin) und Cyclophosphamid. Grier et al., 1994, Proceedings of the American Society of Clinical Oncoloy 13: A-1443, 421.
Bei Verabreichung an einen Patienten, der eine Krebsbehandlung durchmacht, können die Verbindungen in Cocktails verabreicht werden, welche andere Antikrebsmittel und/oder ergänzende Potenzierungsmittel enthalten. Die Verbindungen können auch in Cocktails verabreicht werden, welche Mittel enthalten, welche die Nebenwirkungen einer Strahlentherapie behandeln, wie z. B. Mittel gegen Erbrechen, Strahlenschutzmittel etc..
Arzneimittel zur Krebsbekämpfung, die zusammen mit den erfindungsgemäßen Verbindungen verabreicht werden können, umfassen z. B. auch Aminoglutethimid; Asparaginase; Bleomycin; Busulfan; Carboplatin; Carmustin (BCNU); Chlorambucil; Cisplatin (cis-DDP); Cyclophosphamid; Cytarabin HCl; Dacarbazin; Dactinomycin; Daunorubicin HCl; Doxorubicin HCl; Estramustinphosphatnatrium; Etoposid (VP-16); Floxuridin; Fluoruracil (5-FU); Flutamid; Hydroxyharnstoff (Hydroxycarbamid); Ifosfamid; Interferon Alfa-2a, Alfa 2b, Lueprolidacetat (LRRH-Freisetzungsfaktor-Analogon); Lomustin (CCNU); Mechlorethamin HCl (Stickstoffsenf); Melphalan; Mercaptopurin; Mesna; Methotrexat (MTX); Mitomycin; Mitotan (o.p'-DDD); Mitoxantron HCl; Octreotid; Plicamycin; Procarbazin HCl; Streptozocin; Tamoxifencitrat; Thioguanin; Thiotepa; Vinblastinsulfat; Vincristinsulfat; Amsacrin (m-AMSA); Azacitidin; Hexamethylmelamin (HMM); Interleukin 2; Mitoguazon (Methyl-GAG; Methylglyoxal-bis-guanylhydrazon; MGBG); Pentostatin; Semustin (Methyl-CCNU); Teniposid (VM-26); Paclitaxel und andere Taxane; und Vindesinsulfat.
Ergänzende Potenzierungsmittel, welche zusammen mit den erfindungsgemäßen Verbindungen verabreicht werden können, umfassen z. B. tricyclische Antidepressiva (z. B. Imipramin, Desipramin, Amitriptylin, Clomipramin, Trimipramin, Doxepin, Nortriptylin, Protriptylin, Amoxapin und Maprotilin); nicht tricyclische Antidepressiva (z. B. Sertralin, Trazodon und Citalopram); Ca⁺⁺-Antagonisten (z. B. Verapamil, Nifedipin, Nitrendipin und Caroverin); Amphotericin (z. B. Tween 80 und Perhexilinmaleat); Triparanol-Analoga (z. B. Tamoxifen); Arzneimittel gegen Rhythmusstörungen (z. B. Chinidin); blutdrucksenkende Mittel (z. B. Reserpin); Thiolabreicherer (z. B. Buthionin und Sulfoximin); und Calciumleucovorin.
Die aktive Verbindung/die aktiven Verbindungen kann bzw. können an sich oder in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, wobei sich die aktive Verbindung die aktiven Verbindungen in Mischung mit einem oder mehreren pharmazeutisch geeigneten Trägern, Arzneimittelträgern oder Verdünnungsmitteln befindet bzw. befinden. Pharmazeutische Zusammensetzungen zur erfindungsgemäßen Verwendung können in herkömmlicher Weise formuliert werden, wobei ein oder mehrere physiologisch geeignete Träger verwendet werden, die Arzneimittelträger und Hilfsstoffe umfassen, welche das Verarbeiten der aktiven Verbindungen zu Präparaten, die pharmazeutisch eingesetzt werden können, ermöglichen. Die richtige Formulierung hängt vom gewählten Verabreichungsweg ab.
Für die Injizierung können die erfindungsgemäßen Mittel in wässrigen Lösungen, vorzugsweise in physiologisch verträglichen Puffern, wie z. B. einer Hanks-Lösung, einer Ringer-Lösung, oder in einem physiologischen Salzpuffer, formuliert werden. Für die transmukosale Verabreichung werden Eindringmedien, die für die zu durchdringende Barriere passend sind, in der Formulierung verwendet. Solche Eindringmedien sind im Stand der Technik allgemein bekannt.
Für die orale Verabreichung können die Verbindungen leicht zubereitet werden, indem die aktive Verbindung/die aktiven Verbindungen mit im Stand der Technik wohlbekannten, pharmazeutisch geeigneten Trägern kombiniert wird bzw. werden. Solche Träger ermöglichen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gels, Sirups, Breimassen, Suspensionen und dergleichen zubereitet werden, und zwar für die orale Aufnahme durch einen zu behandelnden Patienten. Pharmazeutische Präparate zur oralen Verwendung können als fester Arzneimittelträger erhalten werden, gegebenenfalls indem eine resultierende Mischung zermahlen und die Körnchenmischung verarbeiten wird, nachdem, falls gewünscht, geeignete Hilfsstoffe zugegeben wurden, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Arzneimittelträger sind insbesondere Füllstoffe, wie z. B. Zucker einschließlich Lactose, Sucrose, Mannit oder Sorbit; Cellulosepräparate, wie beispielsweise Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragantgummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Falls gewünscht, können Auflösungsmittel hinzugefügt werden, wie z. B. vernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder ein Salz davon, wie z. B. Natriumalginat.
Drageekerne werden mit passenden Überzügen versehen. Zu diesem Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, welche gegebenenfalls Gummiarabikum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Carbopolgel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelmischungen enthalten können. Farbstoffe oder Pigmente können zwecks Identifizierung zu den Tabletten oder Drageeüberzügen hinzugefügt werden, oder um verschiedene Kombinationen der Dosierungen einer aktiven Verbindung zu kennzeichnen.
Pharmazeutische Präparate, welche oral eingesetzt werden können, umfassen aus Gelatine bestehende Push-fit-Kapseln sowie weiche, verschlossene Kapseln, die aus Gelatine und einem Weichmacher, wie z. B. Glycerin oder Sorbit, bestehen. Die Push-fit-Kapseln können die Wirkstoffe in Mischung mit einem Füllstoff, wie z. B. Lactose, mit Bindemitteln, wie z. B. Stärken, und/oder mit Schmierstoffen, wie z. B. Talk oder Magnesiumstearat, und gegebenenfalls mit Stabilisierungsmitteln enthalten. In weichen Kapseln können die aktiven Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten, wie z. B. Fettölen, flüssigem Paraffin oder flüssigen Polyethylenglycolen, aufgelöst oder suspendiert sein. Zusätzlich können Stabilisierungsmittel hinzugefügt werden. Alle Formulierungen zür oralen Verabreichung sollten in für eine solche Verabreichung geeigneten Dosierungen vorhanden sein.
Zur bukkalen Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von in herkömmlicher Weise zubereiteten Tabletten oder Pillen aufweisen.
Zur Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen zur erfindungsgemäßen Verwendung geeigneterweise in Form einer Aerosolspray-Anordnung aus Aerosolpackungen oder aus einem Zerstäuber abgegeben, und zwar unter Verwendung eines geeigneten Treibmittels, z. B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid, oder eines anderen geeigneten Gases. Im Fall eines unter Druck stehenden Aerosols kann die Dosierungseinheit durch Bereitstellung eines Ventils zur Abgabe einer dosierten Menge bestimmt werden. Beispielsweise aus Gelatine bestehende Kapseln und Patronen zur Verwendung in einem Inhalator oder Einblaser können so gestaltet sein, dass sie eine Pulvermischung der Verbindung und eine geeignete Pulverbasis, z. B. Lactose oder Stärke, enthalten.
Die Verbindungen können für die parenterale Verabreichung mittels Injektion, z. B. durch eine Bolus-Injektion oder eine Dauerinfusion, formuliert werden. Formulierungen für die Injektion können in einer Form zur Dosierung in Einheiten vorliegen, z. B. in Ampullen oder in Behältern zur Mehrfachdosierung, mit beigefügtem Konservierungsstoff. Die Zusammensetzungen können z. B. die Form von Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln aufweisen und können Formulierungsmittel, wie z. B. Suspensions-, Stabilisierungs- und/oder Dispergiermittel, enthalten.
Pharmazeutische Formulierungen zur parenteralen Verabreichung umfassen wässrige Lösungen der aktiven Verbindungen in wasserlöslicher Form. Zusätzlich können Suspensionen der aktiven Verbindungen als adequate ölige Injektionssuspensionen hergestellt wenden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel umfassen Fettöle, wie z. B. Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester, wie z. B. Ethyloleat oder Triglyceride, oder Liposomen. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, welche die Viskosität der Suspension erhöhen, wie z. B. Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit oder Dextran. Gegebenenfalls kann die Suspension auch geeignete Stabilisierungsmittel enthalten, oder Mittel, welche die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um die Herstellung hochkonzentrierter Lösungen zu ermöglichen.
Alternativ kann der Wirkstoff in Pulverform vorliegen, und zwar zwecks Zusammenbringung mit einem geeigneten Vehikel, z. B. sterilem, pyrogenfreiem Wasser, vor der Verwendung.
Die Verbindungen können auch zu rektalen Zusammensetzungen zubereitet werden, wie z. B. Zäpfchen oder langsamen Einläufen, welche z. B. herkömmliche Zäpfchengrundbestandteile wie Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten.
Abgesehen von den zuvor beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch als Depotpräparat zubereitet werden. Derartige langwirkende Formulierungen können durch Implantierung oder transkutane Abgabe (beispielsweise subkutan oder intramuskulär), durch eine intramuskuläre Injektion oder ein transdermales Pflaster verabreicht werden. Somit können die Verbindungen beispielsweise mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (beispielsweise als Emulsion in einem geeigneten Öl) oder mit Ionenaustauschharzen oder al; schwer lösliche Derivate, z. B. als schwer lösliches Salz, zubereitet werden.
Die phrmazeutischen Zusammensetzungen können auch geeignete Fest- oder Gelphasenträger oder Arzneimittelträger umfassen. Beispiele für derartige Träger oder Arzneimittelträger umfassen Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zuckerarten, Stärken, Cellulosederivate, Gelatine und Polymere, wie z. B. Polyethylenglycole, ohne auf diese beschränkt zu sein.
7. Wirksame Dosierungen
Zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen Zusammensetzungen, bei denen der Wirkstoff in einer therapeutisch wirksamen Menge enthalten ist, d.h. in einer Menge, die wirksam ist, um ihren beabsichtigten Zweck zu erfüllen. Natürlich hängt die tatsächliche Menge, die bei einer bestimmten Anwendung wirksam ist, unter anderem vom behandelten Leiden ab. Werden derartige Zusammensetzungen beispielsweise in Verfahren zum Induzieren einer Apoptose in neuroektodermalen Tumoren verabreicht, so enthalten sie eine Wirkstoffmenge, die wirksam ist, um dieses Ergebnis zu erreichen. Werden derartige Zusammensetzungen in Verfahren zur Hemmung des Wachstums von Tumorzellen, denen p53 fehlt, verabreicht, so enthalten sie eine Wirkstoffmenge, die wirksam ist, um dieses Ergebnis zu erreichen. Werden solche Zusammensetzungen Patienten verabreicht, die an neuroektodermalen Tumoren leiden, so enthalten sie eine Wirkstoffmenge, die wirksam ist, um unter anderem die beim behandelten Patienten existierenden Symptome abzumildern oder deren Entwicklung zu verhindern oder sein Überleben zu verlängern. Für die Verwendung bei der Behandlung einer Krebserkrankung, die gegenüber anderen Arzneimitteln resistent ist, umfasst eine therapeutisch wirksame Menge weiters jene Menge einer Verbindung oder Zusammensetzung, die das Wachstum eines Tumors stoppt oder zurückentwickelt. Die Bestimmung einer wirksamen Menge liegt ohne weiteres innerhalb der Fähigkeiten eines Fachmanns, insbesondere angesichts der hier dargelegten detaillierten Offenbarung.
Für jegliche, hier beschriebene Verbindung kann die therapeutisch wirksame Menge anfänglich aus Zellkulturreihen ermittelt werden. Die Zielplasmakonzentrationen sind jene Konzentrationen der aktiven Verbindung/der aktiven Verbindungen, welche in der Lage sind, eine zumindest etwa 25%ige Apoptose und/oder eine zumindest etwa 25%ige Hemmung der Zellwucherung in Zellkulturproben zu induzieren, natürlich in Abhängigkeit von der bestimmten gewünschten Anwendung. Zielplasmakonzentrationen der aktiven Verbindung/der aktiven Verbindungen, welche in der Lage sind, eine zumindest etwa 50%ige, 75%ige oder sogar 90%ige oder noch höhere Induktion einer Apoptosehemmung der Zellwucherung in Zellkulturproben zu induzieren, werden bevorzugt. Der Prozentsatz der Induktion einer Apoptose oder Hemmung der Zellwucherung beim Patienten kann überwacht werden, um die Angemessenheit der erzielten Plasmaarzneimittelkonzentration zu bewerten.
Die therapeutisch wirksamen Mengen zur Verwendung beim Menschen können auch aus Tiermodellen ermittelt werden. Beispielsweise kann eine Dosis für den Menschen formuliert werden, um eine zirkulierende Konzentration zu erhalten, die sich beim Tier als wirksam erwiesen hat. Tiermodelle, die für durch anomale Zellwucherung gekennzeichnete Erkrankungen nützlich sind, sind im Stand der Technik wohlbekannt. Insbesondere die folgenden Literaturhinweise bieten für Krebsxenotransplantate geeignete Tiermodelle (Corbett et al., 1996, J. Exp. Ther. Oncol. 1: 95–108; Dykes et al., 1992, Contrib. Oncol. Basel. Kareger 42: 1–22); Restenose (Carter et al., 1994, J. Am. Coll. Cardiol. 24(5): 1398-1405), Atherosklerose (Zhu et al., 1994, Cardiology 85(6): 370–377) und Neovaskularisierung (Epstein et al., 1987, Cornea 6(4): 250–257). Die Dosierung kann beim Menschen angepasst werden, indem die Größe der Tumore überwacht wird.
Eine therapeutisch wirksame Dosierung kann auch aus menschlichen Daten hinsichtlich Verbindungen ermittelt werden, von denen bekannt ist, dass sie ähnliche pharmakologische Wirkungen aufweisen, wie z. B. Doxorubicin (siehe z. B. Brugnara et al., 1995, JPET 273: 266–272; Benzaquen et al., 1995, Nature Medicine 1: 534–540; Brugnara et al., 1996, J. Clin. Invest. 97(5): 1227–1234). Die eingesetzte Dosierung kann auf Basis der relativen Bioverfügbarkeit und Wirkungsstärke der verabreichten Verbindung im Vergleich zu Doxorubicin angepasst werden.
Das Anpassen der Dosierung zur Erzielung der maximalen Wirksamkeit beim Menschen, welches auf den obenstehend beschriebenen Verfahren und auf anderen, im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren beruht, liegt ohne weiteres innerhalb der Fähigkeiten eines durchschnittlichen Fachmanns.
Im Fall einer lokalen Verabreichung ist die systemische zirkulierende Konzentration der verabreichten Verbindung natürlich von keiner besonderen Bedeutung. In solchen Fällen wird die Verbindung verabreicht, um im lokalen Bereich eine Konzentration zu erzielen, die wirksam ist, um das beabsichtigte Ergebnis zu erreichen.
Für die Verwendung bei der Prophylaxe und/oder Behandlung neuroektodermaler Tumore wird eine zirkulierende Konzentration der verabreichten Verbindung von etwa 0,001 μM bis 20 μM als wirksam erachtet, wobei etwa 0,1 μM bis 5 μM bevorzugt werden.
Patientendosierungen für die orale Verabreichung der hier beschriebenen Verbindungen, was die bevorzugte Verabreichungsmethode zur Behandlung neuroektodermaler Tumore ist, reichen typischerweise von etwa 80 mg/Tag bis 16.000 mg/Tag, noch typischer von etwa 800 mg/Tag bis 8.000 mg/Tag, und am typischsten von etwa 800 mg/Tag bis 4.000 mg/Tag. In Hinblick auf das Körpergewicht des Patienten ausgedrückt, reichen typische Dosierungen von etwa 1 bis 200 mg/kg/Tag, noch typischer von etwa 10 bis 100 mg/kg/Tag, und am typischsten von etwa 10 bis 50 mg/kg/Tag. In Hinblick auf die Körperoberfläche des Patienten ausgedrückt, reichen typische Dosierungen von etwa 40 bis 8000 mg/m²/Tag, noch typischer von etwa 400 bis 4000 mg/m²/Tag, und am typischsten von etwa 400 bis 2000 mg/m²/Tag.
Für die Verwendung bei der Behandlung von Tumoren, die durch ihre Resistenz gegenüber anderen chemotherapeutischen Mitteln gekennzeichnet sind, einschließlich Tumoren, denen p53-Wildtypproteine fehlen oder die Defekte im CD95-System aufweisen, wird eine zirkulierende Konzentration der verabreichten Verbindung von etwa 0,001 μM bis 20 μM als wirksam erachtet, wobei etwa 0,1 μM bis 5 μM bevorzugt werden.
Patientendosierungen für die orale Verabreichung der hier beschriebenen Verbindungen zur Behandlung oder Verhinderung von Krebserkrankungen reichen typischerweise von etwa 80 mg/Tag bis 16.000 mg/Tag, noch typischer von etwa 800 mg/Tag bis 8.000 mg/Tag, und am typischsten von etwa 800 mg/Tag bis 4.000 mg/Tag. In Hinblick auf das Körpergewicht des Patienten ausgedrückt, reichen typische Dosierungen von etwa 1 bis 200 mg/kg/Tag, noch typischer von etwa 10 bis 100 mg/kg/Tag, und am typischsten von etwa 10 bis 50 mg/kg/Tag. In Hinblick auf die Körperoberfläche des Patienten ausgedrückt, reichen typische Dosierungen von etwa 40 bis 8000 mg/m²/Tag, noch typischer von etwa 400 bis 4000 mg/m²/Tag, und am typischsten von etwa 400 bis 2000 mg/m²/Tag.
Für andere Verabreichungsmethoden können Dosierungsmenge und Dosierungsintervall individuell angepasst werden, um Plasmapegel der verabreichten Verbindung bereitzustellen, welche hinsichtlich der bestimmten klinischen Indikation, die behandelt wird, wirksam sind. Für die Verwendung bei der Behandlung tumorerzeugender Krebserkrankungen können die Verbindungen vor, während oder nach der operativen Entfernung des Tumors verabreicht werden. Beispielsweise können die Verbindungen dem Tumor vor dem chirurgischen Eingriff über eine Injektion in die Tumormasse verabreicht werden, und zwar in einer einzigen oder in mehreren Dosierungen. Der Tumor oder soviel wie möglich vom Tumor kann dann operativ entfernt werden. Weitere Dosen des Arzneimittels können nach der Entfernung an der Tumorstelle eingesetzt werden. Alternativ kann der operativen Entfernung von soviel wie möglich des Tumors die Verabreichung der Verbindungen an der Tumorstelle vorangehen.
In Kombination mit den hier dargelegten Lehren kann durch Auswählen unter den verschiedenen aktiven Verbindungen und Bewertungsfaktoren, wie z. B. Wirkungsstärke, relative Bioverfügbarkeit, Körpergewicht des Patienten, Schwere der nachteiligen Nebenwirkungen und bevorzugte Verabreichungsmethode, ein wirksamer prophylaktischer oder therapeutischer Behandlungsablauf geplant werden, welcher keine substantielle Toxizität bewirkt und dennoch gänzlich dahingehend wirkt, die klinischen Symptome, die ein bestimmter Patient aufweist, zu behandeln. Natürlich sind viele Faktoren bei der Bestimmung eines Therapieablaufs, der für eine bestimmte Indikation oder einen bestimmten Patienten geeignet ist, wichtig. Schwere Indikationen rechtfertigen die Verabreichung höherer Dosen im Vergleich zu weniger schweren Indikationen.
8. Toxizität
Das Verhältnis zwischen Toxizität und therapeutischer Wirkung bei einer bestimmten Verbindung ist deren therapeutischer Index und kann als Verhältnis zwischen LD₅₀ (der Menge einer Verbindung, die bei 50% der Population tödlich ist) und ED₅₀ (der Menge einer Verbindung, die bei 50% der Population wirksam ist) ausgedrückt werden. Verbindungen, welche hohe therapeutische Indices aufweisen, werden bevorzugt. Aus Zellkulturproben und/oder Tierstudien erhaltene Daten des therapeutischen Index können zur Zubereitung einer Reihe von Dosierungen zur Verwendung beim Menschen eingesetzt werden. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise in einem Bereich von Plasmakonzentrationen, welche die ED₅₀ mit geringer oder ohne Toxizität umfassen. Die Dosierung kann in diesem Bereich in Abhängigkeit von der angewandten Dosierungsform und dem eingesetzten Verabreichungsweg variieren. Die genaue Formulierung, der genaue Verabreichungsweg und die genaue Dosierung können vom jeweiligen Arzt in Anbetracht des Zustands des Patienten gewählt werden. (Siehe z. B. Fingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Abs. 1, S. 1).
9. Verpackung
Die Zusammmensetzungen können, falls gewünscht, in einer Verpackungs- oder Spendervorrichtung vorhanden sein, welche ein oder mehrere, den Wirkstoff enthaltende Formen zur Dosierung in Einheiten enthalten kann. Die Verpackung kann beispielsweise Metall- oder Plastikfolie, wie z. B. ein Blisterpack, umfassen. Der Verpackungs- oder Spendervorrichtung können Instruktionen zur Verabreichung beigelegt sein. Zusammensetzungen, die eine erfindungsgemäße Verbindung umfassen, welche in einem kompatiblen pharmazeutischen Träger formuliert ist, können ebenfalls hergestellt, in einen geeigneten Behälter gegeben und hinsichtlich der Behandlung eines angegebenen Zustands markiert werden. Geeignete Zustände, die auf der Markierung angegeben sind, können die Behandlung neuroektodermaler Tumore, des Medulloblastoms, des Neuroblastoms, des Ewing-Sarkoms und dergleichen umfassen.
Die folgenden Beispiele für die Erzeugung und Anwendung der erfindungsgemäßen Auswahlsysteme sind dargelegt, um dem Fachmann ein genaueres Verständnis und ein Ausüben der vorliegenden Erfindung zu ermöglichen. Einige Materialien zu den nachfolgenden Beispielen wurden veröffentlicht bei Fulda et al., 1997; Cancer Res. 57: 4956- 4964 und Fulda et al., 1998, Cancer Res. 58: 4453–4460, hier durch Querverweise aufgenommen.
VI. BEISPIELE
Beispiel 1: Synthese von Verbindungen der Formel I
28-Acetyl-3-β-D-glucosylbetulin: 1 Äqu. Betulin wurde bei Raumtemperatur 12 Stunden lang mit einem Überschuss Acetanhydrid in Pyridin als Lösungsmittel behandelt, um 3,28-Diacetylbetulin zu ergeben. 1 Äqu. 3,28-Diacetylbetulin wurde mit 1 Äqu. NaOH in Ethanol behandelt, um 28-Acetylbetulin in 61%-iger Ausbeute zu ergeben. 28-Acetylbetulin wurde gemäß der Verfahrensweise von S. Ohara et al., Mokuzai Gakkaishi 40(4): 4444–51 (1994), erhalten. Spezifisch wurde 1 Äqu. 28-Acetylbetulin mit 3 Äqu. 2,3,4,6-Tetraacetyl-β-Dglucopyranosylbromid behandelt, und zwar in Gegenwart eines Überschusses von Hg(CN)₂ und in Nitromethan als Lösungsmittel, um ein rohes Reaktionsprodukt zu ergeben, das durch eine Säulenchromatographie gereinigt wurde, um 28-Acetyl-3-β-D-(2,3,4,6-tetraacetyl)glucosylbetulin in 62%-iger Ausbeute bereitzustellen. 1 Äqu. des so erhaltenen 28-Acetyl-3-β-D-(2,3,4,6-tetraacetyl)glucosylbetulins wurde danach bei 40–50°C 1 Stunde lang mit einem Überschuss einer 4 : 2 : 1-Mischung aus McOH : H₂O : Et₃N behandelt, um die im obigen Titel angeführte Verbindung in 62%-iger Ausbeute zu ergeben.
28-Acetyl-3-β-D-galactosylbetulin: 28-Acetyl-3-β-D-galactosylbetulin wurde gemäß der Verfahrensweise des obigen Beispiels 1 hergestellt, abgesehen davon, dass 2,3,4,6-Tetraacetyl-β-D-galactopyranosylbromid anstelle von 2,3,4,6-Tetraacetyl-β-Dglucopyranosylbromid verwendet wurde und dass das 28-Acetyl-3-β-D-galactosylbetulin nicht von seiner Reaktionsmischung gereinigt wurde.
3-Acetyl-28-β-D-glucosylbetulin: Um 3-Acetylbetulin zu ergeben, wird 1 Äqu. Betulin bei 0°C mit einem Überschuss Acetanhydrid in Pyridin als Lösungsmittel behandelt, und zwar 0,5 bis 1 Stunde lang oder solange, bis eine Dünnschichtchromatographie anzeigt, dass die Reaktion beendet ist.
1 Äqu. β-D-Glucose wird in Gegenwart von Pyridin als Lösungsmittel mit einem Überschuss Trichloracetylchlorid behandelt, um eine Mischung aus Pertrichloracetyl-β-Dglucose und Pertrichloracetyl-β-D-glucose zu ergeben. 1 Äqu. der so erhaltenen Mischung aus Pertrichloracetyl-β-D-glucose und Pertrichloracetyl-β-D-glucose wird mit HBr in Essigsäure als Lösungsmittel behandelt, um 2,3,4,6-Tetratrichloracetyl-β-D-glucopyranosylbromid zu ergeben.
1 Äqu. 3-Acetylbetulin wird in Gegenwart eines Überschusses von Hg(CN)₂ und in Nitromethan als Lösungsmittel mit einem Überschuss 2,3,4,6-Tetratrichloracetyl-β-D glucopyranosylbromid behandelt, um ein rohes Reaktionsprodukt zu ergeben, das durch eine Säulenchromatographie gereinigt wird, um 3-Acetyl-28-β-D-(2,3,4,6-Tetratrichloracetyl)glucosylbetulin bereitzustellen. 1 Äqu. 3-Acetyl-28-β-D-(2,3,4,6-Tetratrichloracetyl)glucosylbetulin wird daraufhin mit NH₃/EtOH in Chloroform als Lösungsmittel behandelt (V. Schwarz, Coll. Czech. Commun. 27: 2567 (1962)), um die im obigen Titel angeführte Verbindung zu ergeben.
3-β-D-Galactosylbetulinsäureethylester: Aus 1 Äqu. Betulinsäure wurde Betulinsäureethylester erhalten, welcher in einer Mischung aus 50% Ethanol und Ethylacetat als Lösungsmittel aufgelöst wurde. Ein Überschuss einer Lösung von Diazothan in Diethylether, hergestellt aus N-Nitroso-N-ethylharnstoff, wurde unter Rühren hinzugefügt. Das Rühren wurde 30 Min. lang fortgesetzt, und die Lösung wurde mit einem Überschuss Essigsäure behandelt. Die Lösung wurde bis zur Trockenheit abgedampft. Betulinsäureethylester fällte aus und wurde aus Ethanol rekristallisiert. Gemäß dem im obigen Beispiel 1 beschriebenen Glycosylierungsverfahren wurde Betulinsäureethylester (1 Äqu.) mit 3 Äqu. 2,3,4,6-Tetraacetyl-α-D-galactosylbromid umgesetzt, um nach einer Säulenchromatographie 2,3,4,6-Tetraacetyl-3-β-D-galactosylbetulinsäureethylester in 58%-iger Ausbeute zu erhalten. Die Spaltung der Acetylschutzgruppen von dieser Verbindung wurde erzielt, indem 5% KOH in Wasser/Ethanol 1 : 1 12 Stunden lang bei Raumtemperatur verwendet wurden, um die Titelverbindung nach einer Säulenchromatographie in 79%-iger Ausbeute zu ergeben.
3-β-D-Galactosylbetulin: Diese Verbindung wird wie obenstehend beschrieben hergestellt. Anstelle von Betulinsäureethylester wurde jedoch Betulin verwendet.
Beispiel 2: Betulinsäure induziert in neuroektodermalen Zellen eine Apoptose
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass Betulinsäure in neuroektodermalen Tumoren, wie z. B. dem Neuroblastom, dem Medulloblastom und dem Ewing-Sarkom, welche die im Kindesalter am häufigsten vorkommenden harten Tumore darstellen, eine Apoptose induziert. Dieses Beispiel zeigt auch, dass Betulinsäure einen Apoptosepfad auslöste, der sich von jenem unterschied, welcher zuvor bei standardmäßigen chemotherapeutischen Arzneimitteln identifiziert wurde. Eine Betulinsäure-induzierte Apoptose war unabhängig von der CD95-Ligand/Rezeptor-Interaktion und der Anhäufung des Wildtyp-p53-Proteins, allerdings hing sie entscheidend von der Aktivierung von Caspasen (Interleukin-1â-umwandelndes Enzym/Ced-3-artige Proteasen) ab. FLICE/MACH (Caspase-8), welche als stromaufwärtige Protease in der Caspasekaskade betrachtet wird, und die stromabwärtige Caspase CPP32/YAMA/A-Popain (Caspase-3) wurden aktiviert, was zu einer Spaltung des Prototypsubstrats der Caspasen PARP führte. Der Breitband-Peptidhemmer Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-Fluormethylketon, welcher die Spaltung von FLICE und PARP blockierte, hob auch gänzlich die durch Betulinsäure ausgelöste Apoptose auf. Der Caspasenspaltung gingen eine Störung des Mitochondrienmembran-Potentials und die Erzeugung reaktionsfähiger Sauerstoffarten voraus. Eine Überexpression von Bcl-2 und Bclx_L verlieh gegen Betulinsäure auf der Ebene der Mitochondrien-Fehlfunktion, der Proteaseaktivierung und der Kernfragmentierung eine Resistenz. Dies legte nahe, dass Mitochondrienveränderungen bei der Betulinsäure-induzierten Aktivierung von Caspasen eine Rolle spielten.
Überdies wurden Bax und Bcl-x_m, zwei das Absterben fördernde Proteine der Bcl-2-Familie, nach einer Betulinsäurebehandlung hinaufgeregelt. Am wichtigsten ist, dass gegenüber einer CD95- und einer Doxorubicin-vermittelten Apoptose resistente Neuroblastomzellen auf eine Behandlung mit Betulinsäure ansprachen, was nahe legt, dass Betulinsäure einige Formen der Arzneimittelresistenz umgehen kann. Betulinsäure induziert die Apoptose auch in neuroektodermalen Zellen, welche dem Patienten ex vivo entnommen wurden, was darauf hinweist, dass Betulinsäure in vivo aktiv sein sollte.
Materialien und Verfahren
Arzneimittel: Betulinsäure (Aldrich; Steinheim, Deutschland) und Doxorubicin (Farmitalia, Milan, Italien) wurden als reine Substanzen bereitgestellt und vor jedem Versuch in DMSO (4 mg/ml Betulinsäure) oder sterilem Wasser (1 mg/ml Doxorubicin) aufgelöst.
Zellkultur: Neuroblastom- (SH-EP, IMR-32, Kelly und LAN-5, freundlicherweise von Professor M. Schwab, Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Deutschland, zur Verfügung gestellt), Medulloblastomzellen (Daoy, freundlicherweise von Dr. T. Pietsch, Abteilung für Neuropathologie, Universität Bonn, Zentrum für Medizin, Bonn, Deutschland, zur Verfügung gestellt), Ewing-Sarkom-Zellen (A17/95, freundlicherweise von Dr. U. Anderer, Institut für Pathologie, Humboldt-Universität, Berlin, Deutschland, zur Verfügung gestellt), Melanom- (A-378), Brustkarzinom- (MCF-71), Dickdarmkarzinom- (HT-29), Kleinzellen-Lungenkarzinom- (H-126), Nierenzellenkarzinom- (KTCTL-26, freundlicherweise von H. Lörke, Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Deutschland, zur Verfügung gestellt) und T-Zellen-Leukämie (CEM)-Zellen wurden in RPMI 1640 (Life Technologies, Inc., Eggenstein, Deutschland), das mit 10%igem, durch Hitze deaktiviertem Rinderfötusserum (FCS) von Conco. (Wiesbaden, Deutschland), 10 mM HEPES, pH 7,3 (Biochrom, Berlin, Deutschland), 100 Einheiten/ml Penicillin (Life Technologies, Inc.), 100 μg/ml Streptomycin (Life Technologies, Inc.) und 2 mM L-Glutamin (Biochrom, Berlin, Deutschland) ergänzt war, kultiviert. SH-EP-Neuroblastomzellen, die stabil mit bcl-2, bcl-X_L oder einer Vektorkontrolle transfiziert waren, wurden in Dulbeccos minimalem Eagle-Medium (Life Technologies, Inc.), welches 500 μg/m1 G418 (Geneticin, Life Technologies, Inc.) enthielt, kultiviert, wie bei Dole et al., 1994, Cancer Res. 54: 3253–3259 und Dole et al., 1995, Cancer Res. 55: 2576–2582 beschrieben. SH-EP^CD95R und SH-EP^DpxoR-Zellen, Varianten der gegenüber anti-CD95 bzw. Doxorubicin resistenten SH-EP-Neuroblastomzellen, wurden durch eine mehr als 6 Monate dauernde, kontinuierliche Kultivierung in Gegenwart des agonistischen anti-APO-1-(anti-CD95)-Antikörpers (1 μg/ml; Trauth et al., 1989, Science (Washington DC). 245: 301–305) oder von Doxorubicin (0,1 μg/m1 ) hergestellt. Für die Versuche wurden resistente Zellen gewaschen und in einem Medium ohne anti-APO-1 (anti-CD95) 24 Stunden lang oder ohne Doxorubicin 2 Wochen lang kultiviert.
Bestimmung einer Apoptose: Die quantitative Bestimmung der DNA-Fragmentierung wurde durch eine FACS-Analyse von Propidiumiodid-gefärbten Zellkernen durchgeführt, wie bei Nicoletti et al., 1991, J. Immunol. Methods, 139: 271–279, beschrieben. Die Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie (FACScan, Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) hinsichtlich des DNA-Anteils analysiert, wobei die CELLQuest-Software eingesetzt wurde. Frühe apoptotische Veränderungen wurden nach den Instruktionen des Herstellers durch Einfärbung mit biotinyliertem Annexin V (Bender Med Systems, Wien, Österreich) identifiziert. Annexin V bindet an Phosphatidylserin, das an der Oberfläche apoptotischer Zellen freigelegt ist. Koopman et al., 1994, Blood, 84: 1415–1420. Die Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie (FAC-Scan, Becton Dickinson) analysiert, wobei die CELLQuest-Software eingesetzt wurde.
Herstellung von Neuroblastomtumor-Proben: Frische Tumorproben von zwei Patienten mit Neuroblastomen der Stufe IV5 bzw. IV wurden aus operativen Resektionen vor der Chemotherapie erhalten und unverzüglich analysiert. Einzellen-Suspensionen wurden unter Verwendung von DNase (0,154 mg/ml), Collagenase (0,416 mg/ml) und Hyaluronidase (0,33 mg/ml; Boehringer Mannheim) hergestellt. Eine Zweifarben-Fluoreszenz unter Verwendung eines FITC-konjugierten Maus-Antimensch-GD2-Antikörpers (IgG2a, 0,2 mg/ml, freundlicherweise von R. Handgretinger, Universität Tübingen, Tübingen, Deutschland, zur Verfügung gestellt) und von biotinyliertem Annexin V (Bender Med Systems), gefolgt von Streptavidin-Phycoerythrin, wurde durchgeführt, um apoptotische Neuroblastomzellen zu detektieren. Wu et al., 1986, Cancer Res. 46: 440–443.
Inkubation mit einem Tripeptidhemmer von Caspasen oder F(ab')₂ Anti APO-1 (anti-CD95); Antikörperfragmente: Der Breitband-Tripeptidhemmer von Caspasen ₂VAD-tmk (Enzyme Systems Products, Dublin, CA) wurde in einer Konzentration von 60 im verwendet. Die Herstellung von F(ab')₂ anti-APO-1 (anti-CD95)-Antikörperfragmenten und des Isotyp-abgestimmten Antikörpers F1123 (IgG3) wurde durchgeführt wie bei Dhein et al., 1995, Nature (Lond.) 375: 81–83, beschrieben. Die Zellen wurden vor der Zugabe von Betulinsäure bei 37°C 1 Stunde lang mit 10 μg/m1 F(ab')₂ anti-APO-1-Antikörperfragmenten oder 10 μg/ml F(ab')₂ F1123-Antikörperfragmenten inkubiert.
Bestimmung der Caspaseaktivität: Die Caspaseaktivität wurde mittels einer FACS-Analyse gemessen, wie bei Los et al., 1995, Nature (Lond.) 375: 81–83, beschrieben. Kurz gesagt, die Zellen wurden mit dem Fluorogensubstrat Val-Ala-Asp-[2(4-Methoxynaphthylamid)] in einer Endkonzentration von 50 μm (Enzyme Systems Products) in einem hypotonischen Medium beladen. Die Fluoreszenz wurde mit einem Durchflusszytometer (FACVantage, Becton Dickinson) gemessen, wobei eine Anregungswellenlänge von 365 nm und eine Emissionswellenlänge von 425 nm angewandt wurde.
Bewertung von Mitochondrienpotential, intrazellulären Peroxiden und Membranperoxidation: Das kationische lipophile Fluorochrom DiOC₆(3) (460 ng/ml, Molecular Probes, Eugene, OR) wurde zur Messung des ΔΨ_m, eingesetzt. HE (126 ng/ml, Molecular Probes) wurde zur Bestimmung der ROS-Erzeugung eingesetzt, und NAO (94 ng/ml, Molecular Probes) wurde zur Bestimmung der Lipidperoxidation eingesetzt. Kroemer et al., 1997, Immunol. Todar, 18: 44–51. Die Zellen wurden in Gegenwart der Fluorochrome bei 37°C 12 Minuten lang inkubiert, in PBS/1% FCS gewaschen und unverzüglich mittels Durchflusszytometrie (FACScan, Becton Dickinson) analysiert. DiOC₆(3) und NAO-Fluoreszenz wurden in Fluoreszenz 1 aufgezeichnet; die He-Fluoreszenz wurde in Fluoreszenz 3 bewertet. Der Prozentsatz an Zellen mit niedrigem Mitochondrienpotential oder erhöhter ROS-Produktion wurde im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen berechnet.
RT-PCR für CD95-L mRNA: Eine Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des Qiagen-Gesamt-RNA-Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) hergestellt. Durch Reverse Transcripton wurde die RNA in cDNA umgewandelt und mittels PCR in einem Thermozykler (Stratagene, Heidelberg, Deutschland) 38 Zyklen lang amplifiziert, wobei das Gene Amplification-RNA-PCR-Kit (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ) gemäß den Instruktionen des Herstellers eingesetzt wurde. Die für die Amplifikation des CD95-L-Fragments verwendeten Primer entsprechen der Sequenz des menschlichen CD95-L (Suda et al., 1995, Cell 75: 1169-1178; Herr et al., 1996, Cell Death Diff., 5: 299–305). Die Expression von α-Actin (MWG- Biotech, Ebersberg, Deutschland) wurde als interner Standard für die RNA-Integrität und eine gleiche Gelbeladung eingesetzt. Die PCR-Produkte wurden bei 60 V 2 Stunden lang über ein mit Ethidiumbromid gefärbtes, 1,5%iges Agarosegel laufen gelassen und durch UV-Beleuchtung sichtbar gemacht.
Western-Blot-Analyse: Die Zellen wurden 30 Min. lang bei 4°C in PBS mit 0,5% Triton X (Serva, Heidelberg, Deutschland) und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) lysiert, gefolgt von einer Hochgeschwindigkeitszentrifugation. Die Membranproteine wurden in einem 0,1 M Glycin, pH 3,0, und 1,5 M Tris, pH 8,8, enthaltenden Puffer eluiert. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung von Bicinchoninsäure (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) analysiert. Vierzig μg Protein pro Bahn wurden durch 12%ige SDS-PAGE abgetrennt und auf Nitrocellulose (Amersham, Braunschweig, Deutschland) elektrogeblottet. Eine gleiche Proteinbeladung wurde durch eine Ponceau-Rotfärbung der Membrane kontrolliert. Nach einstündiger Blockierung in mit 2% BSA (Sigma) und 0,1% Tween 20 (Sigma) ergänztem PBS wurde eine Immundetektion des FLICE-, CPP32-, PARP-, Bax-, Bcl-x-, Bcl-2- und p53-Proteins durchgeführt, wobei der monoklonale Maus-anti-FLICE-Antikörper C15 (1 : 5-Verdünnung des Hybridomüberstands), der monoklonale Maus-anti-CPP32-Antikörper (1 : 1000, Transduction Laboratories, Lexington, KY), der polyklonale Kaninchen-anti-PARP-Antikörper (1 : 10000, Enzyme Systems Products), der polyklonale Kaninchen-anti-Bax-Antikörper (1 : 500, Calbiochem, Bad Soden, Deutschland), der polyklonale Kaninchen-anti-Bcl-x-Antikörper (1 : 1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), der monoklonale Maus-anti-p53-Antikörper (1 : 10000, Transduction Laboratories) und der Ziegen-anti-Maus-IgG- oder der Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (1 : 5000, Santa Cruz Biotechnology), ECL (Amersham) zur Detektion eingesetzt wurden.
Ergebnisse
Betulinsäure induziert in neuroektodermalen Zellen eine Apoptose. 1A zeigt das Herbeiführen einer Apoptose durch Betulinsäure in verschiedenen Tumorzelllinien. Die Zellen wurden 72 Stunden lang mit 10 μg/m1 Betulinsäure behandelt. Die Apoptose wurde mittels einer FACS-Analyse von Propidiumiodid-gefärbten Zellkernen bewertet. Der Prozentsatz an spezifischer Apoptose wurde wie folgt berechnet: experimentelle Apoptose (%) – spontane Apoptose in einem Medium (%)/[100% – spontane Apoptose in einem Medium (%)] × 100%.
Die untersuchten Zelllinien waren ein Neuroblastom (SH-EP), ein Medulloblastom (Daoy), ein Ewing-Sarkom (A17195), ein Melanom (A.378), ein Brustkarzinom (MCF-7), ein Dickdarmkarzinom (HT-29), ein Kleinzellen-Lungenkarzinom- (H-146), ein Nierenzellenkarzinom (KTCTL-26) und T-Zellen-Leukämie (CEM). Jede Säule ist ein Mittel von drei Werten. Die Standardabweichungen (Sds) betrugen weniger als 10%. Ähnliche Ergebnisse wurden in drei getrennten Versuchen erzielt.
1B zeigt die Dosis-Wirkung einer Betulinsäure-induzierten Apoptose. SH-EP (♦), LAN-5 (Δ), IMR-32 (x) und Kelly
-Neuroblastomzellen wurden 72 Stunden lang mit Betulinsäure in den angezeigten Konzentrationen behandelt. Die Apoptose wurde mittels einer FACS-Analyse von Propidiumiodid-gefärbten Zellkernen bewertet. Der Prozentsatz an spezifischer Apoptose wurde berechnet wie bei 1A beschrieben. Jeder Datenpunkt ist ein Mittel von drei Werten. Die SDs betrugen weniger als 10%. Ähnliche Ergebnisse wurden in drei getrennten Versuchen erzielt.
1C zeigt die Dosis-Wirkung einer Betulinsäure-induzierten Apoptose in Neuroblastomzellen ex vivo. Einzellen-Suspensionen wurden aus Tumorproben hergestellt, welche durch eine operative Resektion vor der Chemotherapie erhalten wurden, und wurden mit den angegebenen Betulinsäurekonzentrationen 18 Stunden lang inkubiert. Eine Zweifarben-Fluoreszenzfärbung unter Verwendung eines FITC-konjugierten Maus-Antimensch-GD2-Antikörpers und von biotinyliertem Annexin V, gefolgt von Streptavidin-Phycoerythrin, wurde mit einem Durchflusszytometer durchgeführt. Die spezifische Apoptose wurde berechnet wie bei 1 A beschrieben. Repräsentative Daten eines von zwei Patienten werden gezeigt. Die Versuche wurden dreifach durchgeführt. Die SDs betrugen weniger als 10%.
Es wurde herausgefunden, dass Neuroblastom-, Medulloblastom- und Ewing-Sarkom-Zellen auf Betulinsäure stark ansprechen, und zwar neben Melanomzellen, von denen zuvor berichtet wurde, dass sie auf Betulinsäure ansprechen. Im Gegensatz dazu waren Epitheltumore, wie z. B. Brustkarzinom-, Dickdarmkarzinom-, Kleinzellen-Lungenkarzinom- und Nierenzellenkarzinom- sowie T-Zellen-Leukämiezellen, für eine Behandlung mit Betulinsäure beinahe völlig unempfänglich (1A).
Mit Betulinsäure behandelte Neuroblastomzellen wiesen mit Schrumpfung, Membranbläschen und Kernfragmentierung die typischen morphologischen Merkmale apoptotischer Zellen auf. Die Dosis-Wirkung einer Bongkreksäure-induzierten Apoptose wurde mittels Durchflusszytometrie bewertet, wobei die DNA mit Propidiumiodid gefärbt wurde (1B). Durch eine Agarosegel-Elektrophorese wurde auch die DNA-Fragmentierung der mit Betulinsäure behandelten Neuroblastomzellen entdeckt (Daten nicht gezeigt). Zusätzlich zur DNA-Analyse wurde die Apoptose auch durch eine Annexin V-Färbung abgeschätzt, was ähnliche Ergebnisse erbrachte (Daten nicht gezeigt). Um zu untersuchen, ob die Betulinsäure auf Neuroblastomzellen ex vivo wirkte oder nicht, analysierten wir aus Tumorproben erhaltene Zellpräparate mittels einer FACS-Analyse unter Anwendung einer Zweifarben-Fluoreszenz, um durch anti-GD2-Färbung die Apoptose in Tumorzellen zu identifizieren. Wu et al., 1986, Cancer Res. 46 : 440–443. Die von den Patienten gewonnenen Neuroblastomzellen machten sogar bei geringen Konzentrationen von 0,5 μg/ml Betulinsäure eine rasche Apoptose durch (1C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Betulinsäure in vivo eine starke Antitumorwirkung ausüben könnte.
Caspasen vermitteln eine Bonkreksäure-induzierte Apoptose: Die Aktivierung der CD95-Rezeptor-proximalen Caspase FLICS und der stromabwärtigen Caspase CPP32 wurde überwacht, um verschiedene Komponenten der Caspasekaskade zu bewerten.
2A zeigt eine von Betulinsäure beeinflusste Caspaseaktivität. SH-EP-Neuroblastomzellen wurden für die angegebenen Zeiträume mit 1 (x), 5 (•), 10 ( i ) und 50
μg/m1 Betulinsäure inkubiert. Die Zellen wurden durch einen hypotonischen Schock durchlässig gemacht, mit 50 μM des Fluorogensubstrats Val-Ala-Asp-[2(4-Methoxynaphthylaroid)] inkubiert und mit einem Durchflusszytometer analysiert. Jeder Datenpunkt ist ein Mittelwert aus drei unabhängigen Versuchen in dreifacher Ausführung. Die SDs betrugen weniger als 10%.
2B und 2C zeigen die Spaltung von FLICE, CPP32 und PARP. SH-EP-Neuroblastomzellen wurden für die angegebenen Zeiträume mit 10 μg/ml Betulinsäure oder 24 Stunden lang mit 0,5 μg/ml Doxorubicin behandelt. Vierzig μg aus Zelllysaten isoliertes Protein pro Bahn wurden durch 12%ige SDS-PAGE abgetrennt, eine Immundetektion von FLICE- (2B), CPP32- (2C) und PARP (C)-Proteinen wurde durch einen monoklonalen Maus-anti-FLICE-Antikörper, einen monoklonalen Maus-anti-CPP32-Antikörper oder einen polyklonalen Kaninchen-anti-PARP-Antikörper und ECL durchgeführt. Das Verarbeiten von FLICS, das als mit zwei FLICE-Isoformen (Caspase-8/a und 8/b) übereinstimmendes Doppelband detektiert wurde, führte zur p43- bzw. p4- (von Caspase-8/a bzw. 8/b abgeleitete Spaltungszwischenprodukte) sowie zur aktiven p18-Untereinheit.
2D zeigt die Hemmung einer Betulinsäure-induzierten Apoptose durch zVADmk. SH-EP-Neuroblastomzellen wurden in Abwesenheit
oder Anwesenheit (?) von 60 μM zVAD-fmk 72 Stunden lang mit 10 μg/m1 Betulinsäure behandelt. Die spezifische Apoptose wurde bestimmt und berechnet wie in der Zeichenerklärung für 1A beschrieben. Jede Säule ist ein Mittelwert aus drei unabhängigen Versuchen in dreifacher Ausführung. Die SDs betrugen weniger als 10%.
2E zeigt die Hemmung einer Betulinsäure-induzierten Spaltung von FLICS und PARP durch zVAD-fmk. SH-EP-Neuroblastomzellen wurden mit oder ohne 60 μM zVADfmk 24 Stunden lang mit 10 μg/m1 Betulinsäure behandelt. Die Western-Blot-Analyse hinsichtlich der FLICS- und PARP-Spaltung wurde durchgeführt wie bei 2B beschrieben.
Betulinsäure bewirkte einen starken Anstieg der Caspaseaktivität, welche 18 Stunden nach Zugabe der Betulinsäure einen Höhepunkt erreichte (2A). FLICE wurde nach der Behandlung mit Betulinsäure in aktive p18-Untereinheiten gespalten (2B). Außerdem wurde CPP32 proteolytisch verarbeitet, und PARP, eines der bekannten Substrate für CPP32, wurde proteolytisch verarbeitet, und PARP, eines der bekannten Substrate für CPP32 (35), wurde in sein charakteristisches M 85.000-Fragment gespalten (2C). Die Inkubation mit zVAD-fmk stoppte die Apoptose nach einer Behandlung mit Betulinsäure beinahe vollständig (2D) und hemmte die Spaltung von FLICE und PARP (2E), was darauf hinwies, dass die Caspasen bei der Betulinsäure-induzierten Apoptose eine entscheidende Rolle spielten. Um zu untersuchen, ob die Betulinsäure FLICE direkt spalten konnte oder nicht, wurde eine in vitro-Spaltungsanalyse durchgeführt. Nachdem in vitrotranslatiertes, ³⁵S-markiertes FLICE bei 4 oder 37°C 24 Stunden lang mit Betulinsäure inkubiert worden war, wurden keinerlei Spaltprodukte nachgewiesen, was zeigte, dass Betulinsäure FLICE nicht direkt spaltete (Daten nicht gezeigt), während das aktivierte CD95 DISC, wenn es in einer in vitro-FLICE-Analyse eingesetzt wurde, FLICE spaltete. Medema et al., 1997, EMBO J., 16: 2794–2804.
Betulinsäure induziert eine Apoptose unabhängig vom CD95-System: 3A zeigt die Analyse einer CD95-L mRNA-Expression durch RT-PCR. SH-EP-Neuroblastomzellen wurden für die angegebenen Zeiträume mit 5 und 10 μg/m1 Betulinsäure oder 24 Stunden lang mit 0,5 μg/ml Doxorubicin inkubiert. Die CD95-L mRNA-Expression wurde mittels RT-PCR bestimmt. Die Expression von α-Actin wurde zur Kontrolle der RNA-Integrität und einer gleichen Gelbeladung eingesetzt.
3B zeigt den Glücksfall einer Hemmung der Betulinsäure-induzierten Apoptose durch F(ab')₂ anti-APO-1 (anti-CD95). SH-EP-Neuroblastomzellen wurden nach einstündiger Vorinkubation mit einem Medium
, 10 μg/ml F(ab')₂ FII23 (IgG3-ontro antikörper: ☐) oder 10 μg/m1 F(ab')₂ anti-APO-1 (anti-CD95: blockierender Antikörper:
72 Stunden lang mit 10 μg/m1 Betulinsäure, 50μg/ml VP-16, 10 μg/ml Cisplatin (DDP) oder 0,5 μg/m1 Doxorubicin behandelt. Die spezifische Apoptose wurde bestimmt und berechnet wie in der Zeichenerklärung für 1A beschrieben. Jede Säule ist ein Mittelwert aus drei unabhängigen Versuchen in dreifacher Ausführung. Die SDs betrugen weniger als 10%.
Betulinsäure induzierte keine CD95-L mRNA, wie durch RT-PCR bewertet, während Doxorubicin die CD95-L mRNA stark höherregulierte und auch die FLICE-Spaltung stimulierte (3A und 2B). Überdies konnte nach einer Inkubation mit Betulinsäure keine Höherregulierung des CD95-Proteins detektiert werden (Daten nicht gezeigt), während über eine Höherregulierung von CD95 als Reaktion auf cytotoxische Arzneimittel berichtet wurde. Siehe z. B. Debatin et al., 1997, J. Natl. Cancer Irrst. 89: 750–751; Micheau, 1997, J.
Natl. Cancer Inst. 89: 783–789. Eine Blockierung von CD95 durch P(ab')₂ anti-APO-1-Antikörperfragmente, bei denen zuvor gezeigt wurde, dass sie das autokrine/parakrine Absterben in T-Zellen hemmen, und eine durch Arzneimittel ausgelöste Apoptose hemmten nicht den Bongkreksäure-induzierten Zelltod, während die Apoptose nach einer Behandlung mit Doxorubicin, Cisplatin und VP-16 merklich reduziert wurde (3B). Zusammen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass eine durch Bongkreksäure vermittelte Apoptose unabhängig von der CD95-L/Rezeptor-Interaktion war.
Betulinsäure induziert eine Störung der Mitochondrienfunktion: 4A zeigt eine Verringerung des Mitochondrienmembran-Potentials und eine Überproduktion von ROS. SH-EP-Neuroblastomzellen wurden für die angegebenen Zeiträume mit 10 μg/m1 Betulinsäure behandelt. Die Zellen wurden mit dem Fluorochrom DiOC₆(3) gefärbt, um ΔΨ_m zu bestimmen, und mit HE, um die ROS-Erzeugung zu bestimmen, und sie wurden mittels einer Durchflusszytometrie analysiert. Der mehrfache Anstieg an Zellen mit geringem ΔΨ_m [DiOC₆(3)^low] oder mit verstärkter ROS-Erzeugung (He+) ist dargestellt. 4B zeigt die Lipidperoxidation. SH-EP-Neuroblastomzellen, die 24 Stunden lang mit 10 μg/ml Bonkreksäure behandelt wurden (dicke Linie), oder Kontrollzellen (dünne Linie) wurden mit NAO filtriert, um das oxidierte Cardiolipin abzuschätzen, und wurden mittels einer Durchflusszytometrie analysiert.
Die Behandlung von SH-EP-Zellen mit Betulinsäure bewirkte eine Zerstörung des ΔΨ_m, gefolgt von einer ROS-Überproduktion (4A). Der frühe Verlust des Mitochondrienpotentials kann eine direkte Wirkung der Betulinsäure auf die Mitochondrienfunktion wiederspiegeln. ΔΨm-Zusammenbruch und ROS-Erzeugung gingen einer Caspasenspaltung voraus, was nahe legt, dass bei der Aktivierung von Caspasen Mitochondrienvorgänge eine Rolle spielen könnten. Um zu bestimmen, ob das in den Mitochondrien erzeugte ROS eine direkte lokale Wirkung auf die Mitochondrienmembrane hatte, wurde die Menge an intaktem Cardiolipin, einem Molekül, das auf die innere Mitochondrienmembran beschränkt ist, mittels des Fluorochroms NAO abgeschätzt. Wie in 4B gezeigt, wurde die Mitochondrien-ROS-Erzeugung von einer reduzierten Einfärbung mit NAO begleitet, was nahe legt, dass die Produktion von ROS eine sofortige Beschädigung der inneren Mitochondrienmembran verursachte. Somit schien die Bongkreksäure-induzierte Apoptose mit einer Mitochondrien-Fehlfunktion zusammenzuhängen.
Beteiligung von Proteinen der Bcl-2-Familie und von p53 an einer Bongkreksäureinduzierten Apoptose: 5A zeigt die Hemmung einer Betulinsäure-induzierten Störung der Mitochondrienfunktion durch Überexpression von Bcl-2 und Bcl-X_L SH-EP-Neuroblastomzellen, die nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor, bcl-2 oder bcl-X_L transfiziert waren, wurden für die angegebenen Zeiträume mit 10 μg/m1 Betulinsäure behandelt. Die Zellen wurden mit dem Fluorochrom DiOC₆(3) gefärbt, um ΔΨ_m zu bestimmen, und mit HE, um die ROS-Erzeugung zu bestimmen, und sie wurden mittels einer Durchflusszytometrie analysiert. Der mehrfache Anstieg an Zellen mit geringem ΔΨ_m (DiOC₆(3)^low-Zellen, linke Tafel oder mit verstärkter ROS-Produktion (He+-Zellen, rechte Tafel) ist dargestellt.
5B zeigt die Hemmung einer Betulinsäure-induzierten FLICE- und PARP-Spaltung durch Überexpression von Bcl-2 und Bcl-X. Neuroblastomzellen, die nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor (Neo), bcl-2 oder bcl-X_L transfiziert waren, wurden unbehandelt gelassen (-) oder 24 Stunden lang mit 10 μg/m1 Bonkreksäure behandelt (+). Die Western-Blot-Analyse hinsichtlich der FLICE- und PARP-Spaltung wurde durchgeführt wie bei 2B beschrieben.
5C zeigt die Induktion von Bax und Bcl-X_s. SH-EP-Neuroblastomzellen wurden für die angegebenen Zeiträume mit 10 μg/m1 Betulinsäure behandelt. Vierzig μg aus Zelllysaten isoliertes Protein pro Bahn wurden durch 12%ige SDS-PAGE abgetrennt. Eine Immundetektion von Bax, Bcl-x und Bcl-2 wurde durch einen polyklonalen Kaninchen-anti-Bax-Antikörper, einen polyklonalen Kaninchen-anti-Bcl-x-Antikörper und einen monoklonalen Maus-anti-Bcl-2-Antikörper unter Anwendung von ECL durchgeführt. Unbehandelte KM3-Zellen wurden als positive Kontrolle für die Bcl-2-Expression eingesetzt.
5D zeigt das Fehlen einer p53-Anhäufung während der Betulinsäure-induzierten Apoptose. SH-EP-Neuroblastomzellen wurden für die angegebenen Zeiträume mit 10 μg/m1 Betulinsäure oder 12 Stunden lang mit 0,5 μg/ml Doxorubicin behandelt. Vierzig μg aus Zelllysaten isoliertes Protein pro Bahn wurden durch 12%ige SDS-PAGE abgetrennt. Eine Immundetektion von p53 wurde durch einen monoklonalen Maus-anti-p53-Antikörper unter Anwendung von ECL durchgeführt.
Bcl-2 und Bcl-X_L wurden kürzlich an der Bewahrung der Zelllebensfähigkeit durch Verhinderung eines Verlusts an Mitochondrienmembran-Potential beteiligt. Kroemer et al., 1997, Immunol. Today, 18 : 44–51. Eine Überexpression von Bcl-2 und Bcl-x_L hemmte stark die Zerstörung von ΔΨ_m und die Überproduktion von ROS (5A) und blockierte die Spaltung von FLICS und PARP (5B), was weiters die Hypothese unterstützte, dass Mitochondrienveränderungen bei der Aktivierung von Caspasen eine Rolle spielen könnten. Überdies wurden pro-apoptotische Bcl-2-verwandte Proteine, wie z. B. Bax und Bcl-X_s, nach einer Inkubation mit Betulinsäure höherreguliert, während die Expressionsstärken von Bcl-2 und Bcl-X_L von einer Behandlung mit Betulinsäure unbeeinflusst blieben (5C), und zuvor wurde gezeigt, dass p53 in den Vorgang einer arzneimittelinduzierten Apoptose nach einem DNA-Schaden involviert ist und als direkter transcriptioneller Aktivator des bax-Gens fungieren kann. Lowe et al., 1994, Science (Washington DC), 266: 807–810; Miyashita et al., 1995, Cell 80: 293–299.
Nach einer Behandlung der SH-EP-Zellen mit Doxorubicin wuchs die Anhäufung des Wildtyp-p53-Proteins jedoch nicht stark an (5D). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine durch Betulinsäure vermittelte Apoptose und eine Höherregulierung von Bax unabhängig vom p53-Protein in den Neuroblastomzellen auftraten.
Betulinsäure umgeht die CD95-Resistenz und Doxorubicin-vermittelte Apoptose: 6A zeigt die Induktion einer Apoptose durch Bongkreksäure in CD95- und Doxorubicinresistenten Neuroblastomzellen. SH-EP-Neuroblastomzellen (☐), CD95-resistente SH-EP^CD95R-Zellen
wurden 72 Stunden lang mit 10 μg/ml Bongkreksäure oder 0,5 μg/m1 Doxorubicin behandelt. Die spezifische Apoptose wurde bestimmt und berechnet wie in der Zeichenerklärung für 1A beschrieben. Jede Säule ist ein Mittelwert aus drei unabhängigen Versuchen in dreifacher Ausführung. Die SDs betrugen weniger als 10%.
6B zeigt die Spaltung von FLICS und PARP in Bongkreksäure-empfindlichen Zellen; die Zellen [(CD95-resistente Neuroblastom-, SH-EP^CD95R), Doxorubicin-resistente Neuroblastom- (SH-EP^DoxoR), Medulloblastom- (Daoy), Swing-Sarkom- (A17195), Brustkarzinom- (MCF-7), Dickdarmkarzinom- (HT-29), Kleinzellen-Lungenkarzinom- (H-146) und Nierenzellenkarzinomzellen (KTCTL-26)] wurden unbehandelt gelassen (-) oder 24 Stunden lang mit 10 μg/m1 Bonkreksäure behandelt (+). Vierzig μg aus Zelllysaten isoliertes Protein pro Bahn wurden durch 12%ige SDS-PAGE abgetrennt. Die Western-Blot-Analyse hinsichtlich der FLICS- und PARP-Spaltung wurde durchgeführt wie in der Zeichenerklärung für 2B beschrieben.
Da der Molekularmechanismus eines Bonkreksäure-induzierten Absterbens anders zu sein schien als die Aktivierung einer CD95-L/Rezeptor-Interaktivierung, welche durch andere herkömmliche cytotoxische Mittel induziert wurde, fragten wir uns, ob Betulinsäure eine Arzneimittelresistenz von Tumorzellen überwinden könnte oder nicht. Elterliche SH-EP-Zellen und abweichende Zelllinien, die gegenüber anti-CD95 oder Doxorubicin resistent waren, sprachen auf Betulinsäure an, während anti-CD95- und Doxorubicin-resistente Zellen gegenüber Doxorubicin teilresistent waren (6A). Überdies führte eine Inkubation mit Betulinsäure in teilresistenten Neuroblastomzellen zur Spaltung von FLICS und PARP ( 6B). Diese Ergebnisse zeigen, dass Betulinsäure in CD95- und Doxorubicin-resistenten SH-EP-Zellen eine Apoptose vermittelt, und zwar unabhängig vom CD95-System und über die Aktivierung von Caspasen. Außerdem wurden FLICS und PARP auch in anderen Tumorzelllinien, die auf Betulinsäure ansprachen, verarbeitet, wie z. B. im Medulloblastom (Daoy) und im Swing-Sarkom (A17/95), jedoch nicht in Tumorzellen, die gegenüber Betulinsäure resistent waren (MCF-7, HT-29, H-146 und KTTL-26; 6B).
Versuch 3: Betulinsäure induziert die Aktivierung der Mitochondrien und einer AIFvermittelten Caspase-8
Dieses Beispiel zeigt, dass Betulinsäure ein cytotoxisches Mittel ist, welches durch direkte Einwirkung auf die Mitochondrien eine Apoptose auslöst. In isolierten Mitochondrien induziert die Betulinsäure direkt einen Verlust an Transmembranpotential, unabhängig von einer zVAD-fmk-hemmbaren Caspase. Dies wird durch Bongkreksäure gehemmt, einem Mittel, welches den Permeabilitätswechsel-Porenkomplex stabilisiert. Mitochondrien, welche einen Betulinsäure-induzierten Permeabilitätswechsel durchmachen, vermitteln die Spaltung von Caspase-8 (FLICE/MACH/MchS) und Caspase-3 (CPP32/YAMA) in einem zeltfreien System. Löslichkeitsfaktoren, wie z. B. Cytochrom c oder der Apoptose-induzierende Faktor (AIF), die aus Betulinsäure-behandelten Mitochondrien freigesetzt werden, reichen zur Caspasenspaltung und zur Kernfragmentierung aus. Die Zugabe von Cytochrom c zu Cytosolextrakten führt zur Spaltung von Caspase-3, allerdings nicht von Caspase-8. Mitochondrienüberstände, welche einen Permeabilitätswechsel durchgemacht haben, und ein teilweise gereinigter AIF aktivieren jedoch in Cytosolextrakten sowohl Caspase-8 als auch –3 und genügen, um die rekombinante Caspase-8 zu aktivieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Induktion eines Mitochondrienpermeabilitätswechsets allein ausreicht, um das volle Apoptoseprogramm auszulösen, und dass manche cytotoxische Arzneimittel, wie z. B. Betulinsäure, über eine direkte Einwirkung auf die Mitochondrien eine Apoptose induzieren können.
Materialien und Verfahren
Arzneimittel: Betulinsäure (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) wurde als reine Substanz bereitgestellt und in Dimethylsulfoxid aufgelöst.
Zeltkultur: Die menschliche Neuroblastomzelllinie SHEP wurde freundlicherweise von M. Schwab (Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Deutschland) zur Verfügung gestellt und in einer Monoschichtkultur in 75 cm²-Gewebekulturfläschchen (Falcon, Heidelberg, Deutschland) aufbewahrt, und zwar in einem RPMI 1640-Medium (Life Technologies, Inc., Eggenstein, Deutschland), das mit 10%igem, durch Hitze deaktiviertem FCS (Conco, Wiesbaden, Deutschland), 10 mM HEPES, pH 7,4 (Biochrom, Berlin, Deutschland), 100 U/ml Penicillin (Life Technologies, Inc.), 100 μg/m1 Streptomycin (Life Technologies, Inc.) und 2 mM L-Glutamin (Biochrom) ergänzt war, und wurde bei 37°C in 95% Luft/5% CO₂ inkubiert. SHEP-Neuroblastomzellen, die stabil mit bcl-2, bcl-X_L, oder einer Vektorkontrolle transfiziert waren, wurden in Dulbeccos minimalem Eagle-Medium (Life Technologies, Inc.), welches 500 μg/m1 G418 (Geneticin, Life Technologies, Inc.) enthielt, kultiviert. Siehe Dole et al., 1994, Cancer Res. 54: 3253–3259; Dole et al., 1995, Cancer Res. 55: 2576–2582.
Bestimmung einer Apoptose: Die Zellen wurden für die angegebenen Zeiträume mit Betulinsäure inkubiert und durch Trypsinierung geerntet, wobei 0,05% Trypsin und 0,02% EDTA ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ (Life Technologies, Inc.) verwendet wurden. Die quantitative Bestimmung der DNA-Fragmentierung wurde durch eine FACS-Analyse von Propidiumiodid-gefärbten Zellkernen durchgeführt wie zuvor bei Nicoletti et al., 1991, J. Immunol. Methods, 139: 271–279 beschrieben, und zwar unter Verwendung der CELLQuest-Software (Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland).
Hemmung einer arzneimittelinduzierten Apoptose durch Benzyloxycarbonyl-Va-Ala-Asp-Fluormethylketon (ZVAD-fmk) oder Bongkreksäure. Der Breitband-Tripeptidhemmer der Caspasen zVAD-fmk (Enzyme Systems Products, Dublin, USA) wurde in einer Konzentration von 60 μM und der mitochondrienspezifische Inhibitor Bongkreksäure in einer Konzentration von 50 μM verwendet (freundlicherweise von Dr. Duine, Universität Delft, Delft, Niederlande, zur Verfügung gestellt).
Western-Blot-Analyse: Die Zellen wurden 30 Min. lang bei 4°C in PBS mit 0,5% Triton X (Serva, Heidelberg, Deutschland) und 1 mM PMSF (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) lysiert, gefolgt von einer Hochgeschwindigkeitszentrifugation. Die Membranproteine wurden in einem 0,1 M Glycin, pH 3,0 und 1,5 M Tris, pH 8,8, enthaltenden Puffer eluiert. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung von Bicinchoninsäure (Pierce, Rockford, IL) analysiert. 40 μg Protein pro Bahn wurden durch 12% oder 15%ige SDS-PAGE abgetrennt und auf Nitrocellulose (Amersham, Braunschweig, Deutschland) elektrogeblottet. Eine gleiche Proteinbeladung wurde durch eine Ponceau-Rotfärbung der Membrane kontrolliert. Nach einstündiger Blockierung in mit 2% BSA (Sigma) und 0,1% Tween 20 (Sigma) ergänztem PBS wurde eine Immundetektion der Caspasen-3 und-8, PARP, und des Cytochrom 2-Proteins durchgeführt, wobei der Maus-anti-Caspase-8 mAb C 15 (Scaffidi et al., 1997, J. Biol. Chem. 272, 26953–26958, 1 : 5-Verdünnung des Hybridomüberstands), der Maus-anti-Caspase-3-spezifische mAb (1 : 1000, Transduction Laboratories, Lexington, KY), der polyklonale Kaninchen-anti-PARP-Antikörper (1 : 10000, Enzyme Systems Products) oder der Maus-anti-Cytochrom c mAb (1 : 5000, PharMingen, San Diego, CA) verwendet wurde. Der Ziegen-anti-Maus-IgG oder der Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (1 : 5000, Santa Cruz Biotechnology), gefolgt von ECL (Amersham), wurde zur Detektion eingesetzt.
Herstellung von Mitochondrien, Cytosolextrakten, Zellkernen und Mitochondrienüberstand. Zur Isolierung der Mitochondrien wurden Zellen (3 × 10⁵ pro Probe) zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen und mit fünf Volumen des Puffers A (50 mM Tris, 1 mM EGTA, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 0,2% BSA, 10 mM KHP₂O₄, pH 7,6, 0,4 M Sucrose) resuspendiert und auf Eis 20 Minuten lang quellen gelassen. Die Zellen wurden mit 30 Schlägen eines Teflon-Homogenisators homogenisiert und bei 4°C mit 10000 g 10 Min. lang zentrifugiert. Die resultierenden Pellets wurden im Puffer B (10 mM KH₂PO₄, pH 7,2, 0,3 mM Mannit, 0,1% BSA) resuspendiert. Die Mitochondrien wurden durch einen Sucrosegradienten (untere Schicht: 1,6 M Sucrose, 10 mM KH₂PO₄, pH 7,5, 0,1% BSA; obere Schicht: 1,2 M Sucrose, 10 mM KH₂PO₄, pH 7,5, 0,1% BSA) abgetrennt. Zwischenphasen, die Mitochondrien enthielten, wurden mit dem Puffer B bei 4°C mit 18000 g 10 Min. lang gewaschen, und die resultierenden Mitochondrienpellets wurden im Puffer B resuspendiert. Zur Herstellung von Cytosolextrakten wurden Zellen (1 × 10⁸ pro Probe) zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen, mit einem Volumen des Puffers A resuspendiert und auf Eis 20 Minuten lang quellen gelassen. Die Zellen wurden mit 30 Schlägen eines Dounce-Homogenisators homogenisiert und bei 4°C mit 15000 × g 15 Min. lang zentrifugiert. Die Proteinkonzentration der Mitochondrien oder Cytosolextrakte wurde durch das Bradford-Verfahren (Bio-Rad) bestimmt. Zur Isolierung der Zellkerne wurden die Zellen zweimal in eiskaltem PBS gewaschen, in 10 Volumen des Puffers C (10 mM PIPES, pH 7,4, 10 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DDT, 1 mM PMSF, 10 μM Cytochalasin B) resuspendiert, 20 Min. lang auf Eis quellen gelassen und unter Verwendung eines Teflon-Homogenisators homogenisiert. Die Homogenate wurden über 30% Sucrose im Puffer C geschichtet und mit 800 g 10 Min. lang zentrifugiert. Die resultierenden Zellkernpellets wurden im Puffer C resuspendiert und dreimal gewaschen. Die Zellkerne wurden in Aliquoten von 10⁸ Zellkernen/ml bei –80° gelagert, bis sie benötigt wurden. Ein AIF-hältiger Mitochondrienüberstand wurde hergestellt wie bei Susin et al., 1997, J. Exp. Med., 186, 5–37, und Susin et al., 1996, J. Exp. Med., 184, 1331–41, beschrieben.
Zellfreies Apoptosesystem. Zur Bestimmung der Kernfragmentierung wurden Zellkerne (10³/μl) bei 37°C 2 Stunden lang mit Mitochondrien (1 μg/μl) im Puffer D (10 mM HEPES, pH 7,4, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 5 mM EGTA, 1 mM DDT, 2 mM ATP, 10 mM Phosphokreatin, 50 μg/m1 Kreatinkinase, 10 μM Cytochalasin B) inkubiert. Die Zellkerne wurden mit Propidiumiodid (10 μg/μl) gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Zur Bestimmung der Caspaseaktivierung wurden Cytosolextrakte (2 μg/μl) bei 37°C 2 Stunden lang mit Mitochondrien (1 μg/μl), Cytochrom c (0,1 – 100 μM) oder einem AIFhältigen Mitochondrienüberstand (0,5 μg/μl) im Puffer D inkubiert. Ein teilweise gereinigter AIF (Cytochrom c-frei) wurde wie zuvor beschrieben hergestellt (0,5 mg/ml, Susin et al., 1997, J. Exp. Med., 186, 5–37, Susin et al., 1996, J. Exp. Med., 184, 1331–41). Die Proteine wurden durch 15%ige SDS-PAGE abgetrennt, und eine Western-Blot-Analyse wurde wie obenstehend beschrieben durchgeführt. Um eine gleiche Beladung mit Mitochondrienprotein zu bestätigen, wurden alle Western-Blots auch mit einem Antikörper entwickelt, welcher auf ein 60 kDa-Mitochondrienantigen gerichtet war (Daten nicht gezeigt).
Bestimmung des Mitochondrienmembran-Potentials. Mitochondrien (5 × 10⁵/ml) wurden 30 Min. lang mit 10 μg/m1 Betulinsäure behandelt, bei 37°C 15 Min. lang mit 3,3'-Dihexyloxycarbocyanidiodid (DiOC₆(3), 40 nM, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) inkubiert und mit einem Durchflusszytometer (FACS Vantage, Becton Dickinson) analysiert. Als Kontrolle wurden die Zellen mit dem Entkopplungsmittel Carbonylcyanid-mchlorphenylhydrazon (mCICCP, 200 μM, Sigma) behandelt.
In vitro-Translations- und in vitro-Spaltungsassay. Ein in vitro-Translations- und in vitro-Spaltungsassay von Caspase-8 wurden durchgeführt wie zuvor bei Medema et al., 1997, EMBO J. 16, 2794–2804, beschrieben.
Ergebnisse
Betulinsäure löst in isolierten Mitochondrien einen Mitochondrien-PT aus. Isolierte Mitochondrien wurden mit Betulinsäure inkubiert und mit dem Farbstoff DiOC₆(3) gefärbt, um das Mitochondrienmembran-Potential zu bewerten (7). Mitochondrien, die aus mit bcl-2 oder Bcl-X oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor transfizierten SHEP-Zellen isoliert worden waren, wurden unbehandelt gelassen (Kontrolle) oder 30 Min. lang in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 μM Bongkreksäure oder 60 pM zVAD-fmk mit 10 μg/m1 Betulinsäure behandelt. 5 mM Atracrylosid, ein direkter Mitochondrienaktivator, wurde als positive Kontrolle eingesetzt. ΔΨ_m wurde durch das Einfärben der Mitochondrien mit dem Fluorochrom DiOC₆(3) bestimmt. Die gepunktete Linie im Histogramm 1 zeigt das in Gegenwart des ΔΨ_m abgebenden Mittels mCICCP erhaltene Färbeprofil an.
Wie 7 zeigt, machten Mitochondrien, die aus Wildtyp-SHEP-Zellen oder aus nur mit einem Vektor transfizierten Zellen isoliert worden waren, einen Verlust an ΔΨ_m innerhalb 30 mm einer Behandlung mit Betulinsäure durch. Eine Betulinsäure-induzierte ΔΨ_m Dissipation wurde durch Bongkreksäure gehemmt, einem Liganden des Adenin-Nucleotidtranslokators (ANT), welcher den Permeabilitätswechsel (PT) hemmt, und Betulinsäure hatte keine Wirkung auf Mitochondrien, die aus Zellen isoliert worden waren, welche mit Bcl-2 oder Bcl-X (7), zwei endogenen Inhibitoren von PT, transfiziert worden waren. Der Caspase-Inhibitor zVAD-fmk störte jedoch den Betulinsäure-induzierten ΔΨ_m-Verlust nicht (7). Somit kann Betulinsäure ohne Beteiligung einer Z-VAD-fmkhemmbaren Caspase direkt einen Mitochondrienpermeabilitätswechsel auslösen.
Betulinsäure-induzierte, Mitochondrien-PT-induzierte Apoptose. 8 zeigt die Kernfragmentierung nach einer Koinkubation isolierter Zellkerne mit isolierten Mitochondrien in Gegenwart von Betulinsäure. Mitochondrien, die aus mit bcl-2 oder bcl-X_L oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor transfizierten SHEP-Zellen isoliert worden waren, wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 iM Bongkreksäure oder 60 μMZ- VAD-fmk 6 Stunden lang mit Zellkernen und 0,1–10 μg/m1 Betulinsäure (8A) oder 5 mM Atractylosid (8B) inkubiert. Zellkerne, die entweder mit Mitochondrien aus Nur-Vektor-Zellen oder mit Betulinsäure inkubiert worden waren, wurden als Kontrolle eingesetzt. Eine Kernapoptose wurde durch eine FACS-Analyse eines mit Propidiumiodid gefärbten DNA-Anteils bestimmt.
Mit bcl-2 oder bcl-X_L oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor transfizierte SHEP-Zellen wurden 6–24 Stunden lang mit 10 μg/m1 Betulinsäure oder 5 mM Atractylosid behandelt (8C). Die Mitochondrien wurden isoliert und in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 μM Bongkreksäure oder 60 μMZ-VAD-fmk mit Zellkernen inkubiert. Die Zellkerne, die entweder mit Mitochondrienzellen nur mit Frontvektor oder mit Betulinsäure inkubiert worden waren, wurden als Kontrolle eingesetzt. Eine Kernapoptose wurde durch eine FACS-Analyse eines mit Propidiumiodid gefärbten DNA-Anteils bestimmt.
In diesen Versuchsanordnungen führte die Kombination von Mitochondrien aus Neo-Kontrollzellen plus Zellkernen und Betulinsäure zu einer Kern-DNA-Fragmentierung ( 8A). Die Entfernung der Mitochondrien aus dieser Mischung hob die Wirkung der Betulinsäure auf, was darauf hindeutet, dass Mitochondrien für eine Betulinsäure-induzierte Kernapoptose in diesem zeltfreien System notwendig waren. Ohne Zugabe von Betulinsäure hatten die Mitochondrien keine Wirkung auf die Zellkerne. Bei Verwendung einer Kombination aus Mitochondrien plus Zellkernen, zu der apoptotische Dosen cytotoxischer Standardarzneimttel, wie z. B. Doxorubicin, Cisplatin oder Etoposid, hinzugefügt wurden, wurde keine DNA-Fragmentierung beobachtet (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu hatte Atractylosid (Atra), das durch Bindung an den Adenin-Nucleotidtranslokator an der inneren Mitochondrienmembran spezifisch einen Mitochondrien-PT auslöst, Kroemer et al., 1997, Immunol. Todar, 18: 44–51, dieselbe Wirkung wie Betulinsäure (8B). Eine durch Betulinsäure induzierte Fragmentierung der Zellkerne wurde durch zVAD-fmk bzw. Bongkreksäure gehemmt, oder wenn die Mitochondrien aus Zellen mit Bcl-2- oder BcI-X_L-Überexpression erhalten wurden (8A). Eine Kernfragmentierung konnte auch durch Mitochondrien induziert werden, welche aus mit Betulinsäure vorbehandelten Zellen isoliert wurden (8C). Diese Wirkung wurde wiederum durch zVAD-fmk, Bongkreksäure oder durch eine Bct-2- oder BcI-X_L-Überexpression blockiert (8C). Diese Ergebnisse zeigen, dass Betulinsäure eine direkte und spezifische Wirkung auf Mitochondrien hat, was zu einer Fragmentierung der Zellkerne und zu einem apoptotischen DNA-Abbau führt.
Die Betulinsäure-induzierte Spaltung von Caspasen hängt vom Mitochondrien-PT ab. 9A zeigt, dass Caspasen durch Mitochondrien gespalten werden, die einen PT durchmachen. Mit bcl-2 oder Bcl-X oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor transfizierte SHEP-Zellen wurden 16 Stunden lang mit 10 μg/ml Betulinsäure behandelt. Die Mitochondrien wurden isoliert und in Gegenwart oder Abwesenheit von 60 μM zVAD-fmk 6 Stunden lang mit Cytosolextrakten inkubiert (linke Tafel, Zellen). Alternativ wurden aus unbehandelten Zellen isolierte Mitochondrien in Gegenwart oder Abwesenheit von 60 μMZ-VAD-fmk 6 Stunden lang mit 10 μg/m1 Betulinsäure oder 5 mM Atractylosid, zusammen mit Cytosolextrakten, inkubiert (rechte Tafel, mitos, Atra). Cytosolextrakte, die mit aus unbehandelten Zellen isolierten Mitochondrien oder mit unbehandelten Mitochondrien inkubiert wurden, wurden als Kontrolle eingesetzt. 40 μg aus Zelllysaten isoliertes Protein pro Bahn wurden durch 15%ige SDS-PAGE abgetrennt. Eine Immundetektion der Caspasen-3, -8 und des PARP-Proteins wurde durch einen Maus-anti-Caspase-3 mAb, einen Maus-anti-Caspase-8 mAb, einen polyklonalen Kaninchen-anti-PARP-Antikörper und ECL durchgeführt.
9B zeigt die Kinetik einer Betulinsäure-induzierten Spaltung von Caspasen in einem zeltfreien System. SHEP-Zellen wurden für die angegebenen Zeiträume mit 10 μg/m1 Betulinsäure behandelt. Die Mitochondrien wurden isoliert und 6 Stunden lang mit Cytosolextrakten inkubiert. Eine Western-Blot-Analyse wurde wie obenstehend beschrieben durchgeführt.
Eine Inkubation von Cytoplasmaextrakten mit aus Betulinsäure-behandelten Zellen isolierten Mitochondrien führte zur Verarbeitung von Caspase-6, Caspase-3 und des Prototypsubstrats PARP (9A, Mitochondrien). Die Spaltung der Caspasen wurde in Gegenwart von zVAD-fmk blockiert, oder wenn Mitochondrien aus Zellen mit Bcl-2- oder Bcl-xl-Überexpression verwendet wurden (9A). Gleichermaßen wurde eine Caspasenspaltung beobachtet, wenn Betulinsäure-behandelte Mitochondrien verwendet wurden (9A, mitos). Die Behandlung isolierter Mitochondrien mit Atra führte auch zu einer Aktivierung von Caspasen (9A). Überdies induzierten aus Betulinsäurebehandelten Zellen isolierte Mitochondrien eine Spaltung von Caspase-8, Caspase-3 und PARP in zeitabhängiger Weise, was zuerst nach einer 12-stündigen Behandlung mit Betulinsäure nachweisbar war (9B). Um zu sehen, ob Betulinsäure eine Caspasenspaltung direkt induzierten konnte, wurde eine in vitro-Spaltungsanalyse durchgeführt. Nach einer Inkubation der in vitro-translatierten, radiomarkierten Caspase-8 oder Caspase-3 mit Betulinsäure wurden keine Spaltprodukte nachgewiesen (Daten nicht gezeigt), was darauf hinweist, dass Betulinsäure Caspase-8 oder Caspase-3 nicht direkt spaltet. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Betulinsäure-induzierte Caspaseaktivierung durch einen Mitochondrien-PT vermittelt wird.
Betulinsäure bewirkt die Freisetzung apoptogener Faktoren aus isolierten Mitochondrien. 10A zeigt, dass ein Löslichkeitsfaktor/Löslichkeitsfaktoren, der bzw. die aus einen PT durchmachenden Mitochondrien freigesetzt wurde bzw. wurden, die Spaltung von Caspasen induziert bzw. induzieren. Mitochondrien, die aus mit bcl-2 oder BCl-X_L oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor transfizierten SHEP-Zellen isoliert worden waren, wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 μM Bongkreksäure oder 60 μM zVAD-fmk eine halbe Stunde lang mit 10 μg/m1 Betulinsäure oder 5 mM Atractylosid behandelt. Mittels Hochgeschwindigkeitszentrifugation erhaltene Mitochondrienüberstände wurden bei 37°C 6 Stunden lang mit Cytosolextrakten inkubiert. Mit Überständen unbehandelter Mitochondrien inkubierte Cytosolextrakte wurden als Kontrolle eingesetzt. Eine Western-Blot-Analyse wurde durchgeführt wie bei 9A beschrieben.
10B zeigt, dass ein Löslichkeitsfaktor/Löslichkeitsfaktoren, der bzw. die aus einen PT durchmachenden Mitochondrien freigesetzt wurde bzw. wurden, eine Kernfragmentierung induziert bzw. induzieren. Mitochondrien, die aus mit bcl-2, Bcl-X_L oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor transfizierten SHEP-Zellen isoliert worden waren, wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 μM Bongkreksäure oder 60 μM zVAD-fmk eine halbe Stunde lang mit 10 μg/ml Betulinsäure oder 5 mM Atractylosid behandelt. Mittels Hochgeschwindigkeitszentrifugation erhaltene Mitochondrienüberstände wurden bei 37°C 2 Stunden lang mit Zellkernen inkubiert.
Mit Überständen unbehandelter Mitochondrien inkubierte Zellkerne wurden als Kontrolle eingesetzt. Eine Kernapoptose wurde durch eine FACS-Analyse eines mit Propidiumiodid gefärbten DNA-Anteils bestimmt.
10C zeigt die Betulinsäure-induzierte Freisetzung von Cytochrom c. Mitochondrien, die aus mit bcl-2, BCl-X_L, oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor (Neo) transfizierten SHEP-Zellen isoliert worden waren, wurden mit 10 μg/m1 Betulinsäure behandelt. 5 μg Protein pro Bahn wurden durch 15%ige SDS-PAGE abgetrennt. Eine Immundetektion von Cytochrom c wurde durch einen Maus-anti-Cytochrom c mAb und BCL durchgeführt.
Beim Hinzufügen von Überständen aus Betulinsäure-behandelten Mitochondrien zu Cytosolextrakten wurden Caspase-8, -3 und PARP gespalten (10A). Die Verarbeitung der Caspasen wurde durch Bongkreksäure, zVAD-fmk oder in Mitochondrien aus Zellen mit Bcl-2- oder BcI-X_L-Überexpression gehemmt (10A). Außerdem induzieren Überstände aus Betulinsäure-behandelten Mitochondrien eine DNA-Fragmentierung, und auch diese Wirkung wurde in Gegenwart von Bongkreksäure, zVAD-fmk oder durch eine Bcl-2- oder Bcl-X_L-Überexpression blockiert (10B). Gleichermaßen wurden eine Caspaseaktivierung und eine Kernfragmentierung beobachtet, wenn anstelle von Betulinsäure Atra verwendet wurde (10A, B). Dies weist darauf hin, dass Betulinsäure die Freisetzung eines apoptogenen Löslichkeitsfaktors/apoptogener Löslichkeitsfaktoren in Mitochondrien auslöst. Demgemäß induziert Betulinsäure direkt eine Freisetzung von Cytochrom c in isolierten Mitochondrien (10C). Diese durch Betulinsäure angetriebene Freisetzung von Cytochrom c wurde durch Bongkreksäure oder in Mitochondrien aus Zellen mit Bcl-2- oder Bcl-X_L-Überexpression blockiert (10C).
Die Caspase-8-Spaltung wird durch AlF, aber nicht durch Cytochrom e, vermittelt. 11A zeigt, dass Cytochrom c die Spaltung von Caspase-3 induziert. Cytosolextrakte aus SHEP-Zellen wurden mit 0,1 – 100 μM Cytochrom c inkubiert. Eine Immundetektion der Caspasen-3, -8 und von PARP wurde durchgeführt wie in 9A beschrieben.
11B zeigt, dass AIF sowohl die Spaltung von Caspase-8 als auch von -3 induziert. Cytosolextrakte aus nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor (Nec) oder mit bcl-2 transfizierten SHEP-Zellen wurden mit teilweise gereinigtem AIF inkubiert. Eine Immundetektion der Caspasen-3, -8 und von PARP wurde durchgeführt wie in 9A beschrieben.
11C zeigt, dass AIF die rekombinante Caspase-8 spaltet. Eine in vitrotranslatierte, ³⁵S-markierte Caspase-8 wurde bei 4°C 16 Stunden lang mit teilweise gereinigtem AIF inkubiert, und zwar in Gegenwart oder Abwesenheit von 60 μMZ-VADfmk. Die Reaktionsprodukte wurden durch 15%ige SDS-PAGE abgetrennt und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Migrationsposition einer N-terminalen, abgeschnitteten Caspase-8 ist durch einen offenen Pfeil gekennzeichnet.
Wie in 11A gezeigt, löste Cytochrom c die proteolytische Verarbeitung von Caspase-3 in ihre aktiven Untereinheiten aus und bewirkte eine Caspase-vermittelte Spaltung von PARP (11A). Die Zugabe von Cytochrom c zu Cytosolextrakten induzierte allerdings keine Caspase-8-Spaltung (11A). Im Gegensatz dazu wurde sowohl Caspase-3 als auch -8 in Cytosolextrakte gespalten, wenn anstelle von Cytochrom c Mitochondrienüberstände oder ein teilweise gereinigter (Cytochrom c-freier) AIF verwendet wurden ( 11B). Außerdem induzierte ein teilweise gereinigter AIF die Spaltung einer in vitrotranslatierten, radiomarkierten Caspase-8 in die aktiven p18-Untereinheiten (11C). Diese Ergebnisse zeigen, dass sich verschiedene, durch Betulinsäure freigesetzte Mitochondrienproteine in ihrem Vermögen, verschiedene Caspasen zu aktivieren, unterscheiden. Die Spaltung von Caspase-8 stromabwärts von den Mitochondrien scheint eine AIF-Aktivität zu erfordern.
Beispiel 4: Molekülordnung einer durch Antikrebsmittel induzierten Apoptose
Eine durch Antikrebsmittel vermittelte Apoptose kann die Aktivierung von das Absterben induzierenden Ligand/Rezeptor-Systemen, wie z. B. CD95 (APO-1/Fas), die Spaltung von Caspasen und eine Störung der Mitochondrienfunktionen umfassen. In diesem Beispiel wurde die Abfolge dieser Ereignisse bei mit Bcl-2 oder Bcl-X transfizierten SHEP-Neuroblastomzellen untersucht, wobei zwei unterschiedliche Arzneimittel verwendet wurden, nämlich Doxorubicin (Doxorubicin), welches das CD95/CD95-L-System aktiviert, und Betulinsäure, welche die Expression von CD9S oder seiner Liganden nicht verstärkt und, wie hier gezeigt, direkt auf die Mitochondrien abzielt.
Eine durch beide Arzneimittel induzierte Apoptose wurde durch eine Bcl-2- oder Bcl-X_L-Überexpression oder durch Bongkreksäure, einem Mittel, das die Mitochondrienmembran-Barrierenfunktion stabilisiert, gehemmt, was auf eine entscheidende Rolle der Mitochondrien hinweist. Nach einer Doxorubicin-Behandlung wurden die verstärkte CD95/CD95-L-Expression und die Caspase-8-Aktivierung nicht durch Bcl-2 oder Bcl-X_L blockiert und wurden in Zellen mit noch immer normalem Mitochondrien-Transmembranpotential (ΔΨ _m,^high-Zellen) vorgefunden. Im deutlichen Gegensatz dazu trat nach einer Betulinsäure-Behandlung in Bcl-2- oder Bcl-X_L-hemmbarer Weise eine Caspase-8-Aktivierung auf und beschränkte sich auf Zellen, welche ihr Mitochondrien-Transmembranpotential verloren hatten (ΔΨ_m ^low-Zellen). Mitochondrien aus Zellen, die entweder mit Doxorubicin oder mit Betulinsäure behandelt worden waren, induzierten in Cytosolextrakten eine Spaltung sowohl von Caspase-8 als auch von Caspase-3. Somit kann eine Caspase-8-Aktivierung stromaufwärts oder stromabwärts von den Mitochondrien auftreten, und zwar abhängig vom Apoptose-auslösenden Stimulus. Im Gegensatz zur Caspase-8 beschränkte sich die Spaltung von Caspase-3 oder PARP stets auf ΔΨ_m ^low-Zellen, stromabwärts vom Bcl-2- oder BcI-X_L-kontrollierten Apoptosekontrollpunkt. Cytochrom c, das aus einen Permeabilitätswechsel durchmachenden Mitochondrien freigesetzt wurde, aktivierte in einem zellfreien System Caspase-3, aber nicht Caspase-8. Beide Caspasen wurden jedoch vom Apoptose-induzierenden Faktor (AIF) aktiviert, was darauf hinweist, dass sich der Mechanismus der Caspase-8-Aktivierung von jenem der Caspase-3-Aktivierung unterscheidet.
Materialien und Verfahren
Arzneimittel: Doxorubicin (Farmitalia, Milan, Italien) und Betulinsäure (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) wurden als reine Substanzen bereitgestellt und in sterilem Wasser (Doxorubicin) oder Dimethylsulfoxid (Betulinsäure) aufgelöst.
Zeltkultur: Die menschliche Neuroblastomzelllinie SHEP wurde freundlicherweise von Professor M. Schwab (Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Deutschland) zur Verfügung gestellt. Die Zellen wurden in einer Monoschichtkultur in 75 cm²-Gewebekulturfläschchen (Falcon, Heidelberg, Deutschland) aufbewahrt, und zwar in einem RPMI 1640-Medium (Life Technologies, Inc., Eggenstein, Deutschland), das mit 10%igem, durch Hitze deaktiviertem FCS (Conco, Wiesbaden, Deutschland), 10 mM HEPES, pH 7,4 (Biochrom, Berlin, Deutschland), 100 U/ml Penicillin (Life Technologies, Inc.), 100 μg/ml Streptomycin (Life Technologies, Inc.) und 2 mM L-Glutamin (Biochrom) ergänzt war, und wurden bei 37°C in 95% Luft/5% CO₂ inkubiert. SHEP-Neuroblastomzellen, die stabil mit bcl-2, bcl-X_L oder einer Vektorkontrolle transfiziert waren, wurden in Dulbeccos minimalem Eagle-Medium (Life Technologies, Inc.), welches 500 μg/m1 G418 (Geneticin, Life Technologies, Inc.; Dole et al., 1994, Cancer Res. 54: 3253–3259; Dole et al., 1995, Cancer Res. 55: 2576-2582) enthielt, kultiviert.
Bestimmung einer Apoptose: Die Zellen wurden für die angegebenen Zeiträume mit Doxorubicin, Betulinsäure oder anti-APO-1 inkubiert und durch Trypsinierung geerntet, wobei 0,05% Trypsin und 0,02% EDTA ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ (Life Technologies, Inc.) verwendet wurden. Die quantitative Bestimmung der DNA-Fragmentierung wurde durch eine FACS-Analyse von Propidiumiodid-gefärbten Zellkernen durchgeführt wie zuvor bei Nicoletti et al., J. Immunol. Methods, 139: 271–279, beschrieben, und zwar unter Verwendung der CELLQuest-Software (Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland).
Hemmung einer arzneimittelinduzierten Apoptose durch Benzyloxycarbonyl-Val-Al a-Asp-Fluormethylketon (zVAD-fmk) oder Bongkreksäure. Der Breitband-Tripeptidhemmer der Caspasen zVAD-fmk (Enzyme Systems Products, Dublin, USA) wurde in einer Konzentration von 60 μM und der mitochondrienspezifische Inhibitor Bongkreksäure in einer Konzentration von 50 μM verwendet (freundlicherweise von Dr. Duine, Universität Delf Delf Niederlande, zur Verfügung gestellt).
Analyse einer CD95-Expression. Die Zellen wurden bei 4°C 45 Minuten lang mit einem monoklonalen anti-APO-1(CD95)-IgGI-Antikörper (moab) (1 μg/ml; Trauth et al., 1989, Science 245: 301–305) gefärbt, gefolgt von 30 Minuten Ziegen-anti-Maus-IgG-FITC (Immunotech, Hamburg, Deutschland) bei 4°C. Der FII23 IgGI-Antikörper wurde als Isotypabgestimmter, nicht bindender Antikörper zur Steuerung einer unspezifischen Bindung eingesetzt.
RT-PCR für CD95 und CD95-L mRNA. Eine Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des Qiagen-Gesamt-RNA-Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) hergestellt.
Durch Reverse Transcripton wurde die RNA in cDNA umgewandelt und mittels PCR in einem Thermozykler (Stratagene, Heidelberg, Deutschland) 38 Zyklen lang amplifiziert, wobei das Gene Amplification-RNA-PCR-Kit (Perkin Elmer, Branchburg, NJ) gemäß den Instruktionen des Herstellers eingesetzt wurde. Ein 500-Basenpaarfragment von CD95-L wurde unter Verwendung des Primers 5'ATGTTTCAGCTCTTCCACCTACAGA3' (SEQ ID: No 1) und 5'CCAGAGAGAGCTCAGATACGTTGAC3' (SEQ II: No 2) amplifiziert, und ein 311-Basenpaarfragment von CD95 wurde unter Verwendung des Primers 5'TCAAGGAATGCACACTCACCAGC (SEQ ID: No 3) und 5*GGCTTCATTGACACCATTCTTTCG3' (SEQ ID: No 4) amplifiziert. Die Expression von â-Actin (MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland) wurde als Standard für die RNA- Integrität und eine gleiche Gelbeladung eingesetzt. Die PCR-Reaktionsprodukte wurden bei 60 V 2 Stunden lang über ein mit Ethidiumbromid gefärbtes, 1,5%iges Agarosegel laufen gelassen und durch UV-Beleuchtung sichtbar gemacht.
Western-Blot-Analyse: Die Zellen wurden für 30 mm bei 4°C in PBS mit 0,5% Triton X (Serva, Heidelberg, Deutschland) und 1 mM PMSF (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) lysiert, gefolgt von einer Hochgeschwindigkeitszentrifugation. Die Membranproteine wurden in einem 0,1 M Glycin, pH 3,0, und 1,5 M Tris, pH 8,8, enthaltenden Puffer eluiert. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung von Bicinchoninsäure (Pierce, Rockford, IL) analysiert. 40 μg Protein pro Bahn wurden durch 12%ige oder 15%ige SDS-PAGE abgetrennt und auf Nitrocellulose (Amersham, Braunschweig, Deutschland) elektrogeblottet. Eine gleiche Proteinbeladung wurde durch eine Ponceau-Rotfärbung der Membrane kontrolliert. Nach einstündiger Blockierung in mit 2% BSA (Sigma) und 0,1% Tween 20 (Sigma) ergänztem PBS wurde eine Immundetektion der Caspasen-3 und-8, des PARP-, CD95-L-, CD95- und Cytochrom c-Proteins durchgeführt, wobei der Maus-anti-Caspase-8 moab C15 (Scaffidi et al., 1997, J. Biol. Chem. 272, 26953–26958, 1 : 5-Verdünnung des Hybridomüberstands), der Maus-anti-Caspase-3-spezifische moab (1 : 1000, Transduction Laboratories, Lexington, KY), der polyklonale Kaninchen-anti-PARP-Antikörper (1 : 10.000, Enzyme Systems Products), der Maus-anti-CD95-L moab (1 : 5.000, Transduction Laboratories), der Maus-anti-CD95 moab (1 : 1.000, Transduction Laboratories) oder der Maus-anti-Cytochrom c moab (1 : 5000, PharMingen, San Diego, CA) verwendet wurde. Der Ziegen-anti-Maus-IgG oder der Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (1 : 5000, Santa Cruz . Biotechnology), gefolgt von ECL (Amersham), wurde zur Detektion eingesetzt.
Herstellung von Mitochondrien, Cytosolextrakten und Zellkernen. Zur Isolierung der Mitochondrien wurden Zellen (3 × 10⁸ pro Probe) zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen und mit fünf Volumen des Puffers A (50 mM Tris-Puffer, 1 mM EGTA, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 0,2% BSA, 10 mM KH₂PO₄, pH 7,6, 0,4 M Sucrose) resuspendiert und auf Eis 20 Minuten lang quellen gelassen. Die Zellen wurden mit 30 Schlägen eines Teflon-Homogenisators homogenisiert und bei 4°C mit 4000 × g 1 Min. lang zentrifugiert. Die Überstände wurden weiters bei 4°C mit 10.000 × g für 10 mm zentrifugiert, und die resultierenden Pellets wurden im Puffer B (10 mM KHP₂O₄, pH 7,2, 0,3 mM Mannit, 0,1 % BSA) resuspendiert. Die Mitochondrien wurden durch einen Sucrosegradienten (untere Schicht: 1,6 M Sucrose, 10 mM KH₂PO₄, pH 7,5, 0,1% BSA; obere Schicht: 1,2 M Sucrose, 10 mM KH₂PO₄, pH 7,5, 0,1 % BSA) abgetrennt. Zwischenphasen, die Mitochondrien enthielten, wurden mit dem Puffer B bei 4°C mit 18.000 × g 10 Min. lang gewaschen, und die resultierenden Mitochondrienpellets wurden im Puffer B resuspendiert. Zur Herstellung von Cytosolextrakten wurden Zellen (1 × 10⁸ pro Probe) zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen, mit einem Volumen des Puffers A resuspendiert und auf Eis 20 Minuten lang quellen gelassen. Die Zellen wurden mit 30 Schlägen eines Dounce-Homogenisators homogenisiert und bei 4°C mit 15.000 × g für 15 mm zentrifugiert. Die Proteinkonzentration der Mitochondrien oder Cytosolextrakte wurde durch das Bradford-Verfahren bestimmt. Zur Isolierung der Zellkerne wurden die Zellen zweimal in eiskaltem PBS gewaschen, in 10 Volumen des Puffers C (10 mM Pipes, pH 7,4, 10 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DDT, 1 mM PMSF, 10 μM Cytochalasin B) resuspendiert, 20 Min. lang auf Eis quellen gelassen und unter Verwendung eines Teflon-Homogenisators homogenisiert. Die Homogenate wurden über 30% Sucrose im Puffer C geschichtet und mit 800 x g 10 Min, lang zentrifugiert. Die resultierenden Zellkernpellets wurden im Puffer C resuspendiert und dreimal gewaschen. Die Zellkerne wurden in Aliquoten von 10⁸ Zellkernen/ml bei –80° gelagert, bis sie benötigt wurden. Ein AIF-hältiger Mitochondrienüberstand wurde hergestellt wie zuvor bei Kroemer et al., 1997, Immunol. Todar. 18: 44–51, beschrieben.
Zellfreies Apoptosesystem. Zur Bestimmung der Kernfragmentierung wurden Zellkerne (10³; μl) bei 37°C 2 Stunden lang mit Mitochondrien (1 μg/μl) im Puffer D (10 mM HEPES, pH 7,4, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 5 mM EGTA, 1 mM DDT, 2 mM ATP, 10 mM Phosphokreatin, 50 μg/m1 Kreatinkinase, 10 μM Cytochalasin B) inkubiert. Die Zellkerne wurden mit Propidiumiodid (10 μg/μl) gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert (Susin et al., 1997 Exp. Cell Res. 236: 397–403). Zur Bestimmung der Caspaseaktivierung wurden Cytosolextrakte (2 μg/μl) bei 37°C 2 Stunden lang mit Mitochondrien (1 μg/μl), Cytochrom c (10 μM) oder einem AIF-hältigen Mitochondrienüberstand (0,5 μg/μl) im Puffer D inkubiert. Die Proteine wurden durch 15%ige SDS-PAGE abgetrennt, und eine Western-Blot-Analyse wurde wie obenstehend beschrieben durchgeführt.
Bestimmung des Mitochondrienmembran-Potentials. Zur Bestimmung des Mitochondrienmembran-Potentials wurden Zellen (5 × 10⁵/ml) bei 37°C 15 Min. lang mit 3,3'-Dihexyloxycarbocyanidiodid (DiOC₆(3), 40 nM, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) inkubiert und mit einem Durchflusszytometer (FACScan) analysiert (Zamzami et al., 1996 J. Exp. Med. 183: 1533–44). Zur Zellsortierung wurden die Zellen mit DiOC(3) gefärbt und mit einem Cytofluorometer (FACS Vantage, Becton Dickinson) in DiOC₆(3)^high- und DiOC₆(3)^low-Zellen sortiert. Als Kontrolle wurden die Zellen mit dem Entkopplungsmittel Carbonylcyanid-m-chlorphenylhydrazon (mCICCP, 200 μM, Sigma) behandelt.
Ergebnisse
Die Doxorubicin- und Betulinsäure-induzierte Apoptose hängt von Mitochondrien-PT und Caspaseaktivierung ab. 12 zeigt eine arzneimittelinduzierte Apoptose und einen Mitochondrien-PT. A-C zeigen, dass die Doxorubicin- und Betulinsäure-induzierte Apoptose vom Mitochondrien-PT und der Aktivierung von Caspasen abhängt. Mit Bcl-2 oder Bcl-X oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor (Neo) transfizierten SHEP-Zellen wurden 48 Stunden lang (A) oder 24 Stunden lang (B und C) mit 0,5 μg/ml Doxorubicin oder 10 μg/ml Betulinsäure behandelt. Nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor (Neo) transfizierte Zellen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 μm BA oder 60 μm zVAD-fmk behandelt. Eine Kernapoptose wurde durch eine FACS-Analyse eines mit Propidiumiodid gefärbten DNA-Anteils bestimmt, und zwar in intakten Zellen (A) oder in CFS-inkubierenden isolierten Zellkernen mit Mitochondrien aus mit Doxo oder Betulinsäure behandelten Zellen (C). ΔΨ_m wurde durch das Einfärben der Zellen mit dem Potential-empfindlichen Fluorochrom DiOC₆(3) bestimmt (B).
12D zeigt, dass Betulinsäure direkt einen Mitochondrien-PT induziert. Mitochondrien, die aus mit Bcl-2 oder Bcl-X oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor (Neo) transfizierten SHEP-Zellen isoliert worden waren, wurden eine halbe Stunde Lang mit 10 μg/ml Betulinsäure behandelt. Nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor (Neo) transfizierte Zellen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 μm Betulinsäure oder 60 μM zVAD-fmk behandelt. ΔΨ_m wurde durch das Einfärben der Mitochondrien mit dem Fluorochrom DiOC₆(3) bestimmt. Die gepunktete Linie im ersten Histogramm zeigt das in Gegenwart des ΔΨ_m-auflösenden Mittels Carbonylcyanid-m-chlorphenylhydrazon erhaltene Färbeprofil an.
Die Doxorubicin- und Betulinsäure-induzierte Apoptose wurde durch Bestimmung der Kernfragmentierung und Störung des ΔΨ_m-Doxorubicin- und Betulinsäure-induzierten Verlusts an ΔΨ_m und an Kernfragmentierung analysiert (12A und B). Das Auftreten einer Apoptose sowohl in den Mitochondrien als auch im Zellkern wurde durch eine Überexpression von Bcl-2 und Bcl-X_L blockiert (12A und B). Um zu bestimmen, ob eine Apoptose ein Öffnen der Mitochondrien-PT-Pore mit sich bringt, wurde die Wirkung der Bongkreksäure, eines spezifischen Inhibitors dieser Pore, getestet. Die Zugabe von Bongkreksäure hemmte eine durch Arzneimittel ausgelöste Kernfragmentierung und den ΔΨ_m Verlust, was darauf hinwies, dass Mitochondrienveränderungen ein Öffnen der PT-Poren mit sich bringen (12A und B). In Doxorubicin-behandelten Zellen wurden sowohl Kernfragmentierung als auch ΔΨm Verlust durch den Breitband-Caspase-Inhibitor zVADfmk gehemmt (12A und B). Im Gegensatz dazu beeinflusste zVAD-fmk nur die Betulinsäure-induzierte Kernfragmentierung, hatte aber keine Wirkung auf die Betulinsäureinduzierte ΔΨ_m-Dissipation (12A und B). Um zu untersuchen, ob arzneimittelinduzierte Mitochondrienveränderungen ausreichten, um eine Kernfragmentierung zu bewirken, wurden aus Arzneimittel-behandelten Zellen isolierte Mitochondrien in einem zellfreien System mit Zellkernen inkubiert und wurde der Kern-DNA-Verlust mittels Durchflusszytometrie gemessen. Mitochondrien aus Doxorubicin- oder Betulinsäure-behandelten Zellen induzierten eine Kern-DNA-Fragmentierung (12C). Diese Wirkung wurde durch eine Überexpression von Bcl-2 oder Bcl-X blockiert, und auch durch die Behandlung der Zellen mit zVAD-fmk oder Bongkreksäure (12C). Zusammen legen diese Versuche nahe, dass eine durch Doxorubicin oder Betulinsäure induzierte Kernapoptose unterschiedslos vom Mitochondrien-PT und der Caspaseaktivierung abhängt. Der zum ΔΨ_m-Verlust führende Mechanismus hängt jedoch davon ab, welches Antikrebsmittel verwendet wird. Im Fall von Doxorubicin erfordert er die Aktivierung von zVAD-fmk-inhibitierbaren Caspasen. Ganz im Gegensatz dazu löst Betulinsäure in Caspase-unabhängiger Weise eine ΔΨ_m-Dissipation aus.
Betulinsäure löst direkt einen Mitochondrien-PT aus. Betulinsäure bewirkte einen Verlust an ΔΨ_m in isolierten Mitochondrien (12D). Dieser Verlust an ΔΨ_m wurde durch eine Bcl-2- oder Bcl-X_L-Überexpression oder durch Bongkreksäure gehemmt (12D), was darauf hinweist, dass der ΔΨ_m-Verlust einen PT einschloss. Der Rückgang an ΔΨ_m wurde jedoch nicht durch zVAD-fmk blockiert (12D), was nahe legt, dass Betulinsäure durch direkte Einwirkung auf die Mitochondrien einen PT auslösen kann.
Doxorubicin induziert CD95-L und CD95 stromaufwärts von den Mitochondrien. 13A zeigt die Induktion von CD95-L. Mit Bcl-2 oder Bcl-X oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor (Neo) transfizierte SHEP-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 0,5 μg/m1 Doxo oder 10 μg/m1 Betulinsäure behandelt (Bahnen +). Die CD95-L mRNA-Expression wurde durch RT-PCR bestimmt. Die Expression von â-Actin wurde zur Kontrolle der RNA-Integrität und einer gleichen Gelbeladung eingesetzt. Für einen Western-Blot wurden 40 μg aus Zelllysaten stammendes Protein pro Bahn durch 12%ige SDS-PAGE abgetrennt. Das CD95-L-Protein wurde durch einen Maus-anti-CD9S-L moab und eine erhöhte Chemilumineszenz als M, 37.000-Band detektiert.
14B und C zeigen die Induktion von CD95. Mit Bcl-2 oder Bcl-X_L, oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor (Neo) transfizierte SHEP-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 0,5 μg/m1 Doxo oder 10 μg/m1 Bet A behandelt (Bahnen +). Die CD95 mRNA-Expression wurde durch RT-PCR bestimmt. Die Expression von â-Actin wurde zur Kontrolle der RNA-Integrität und einer gleichen Gelbeladung eingesetzt. Für eine Western-Blot-Analyse (B) wurden 40 μg aus Zelllysaten stammendes Protein pro Bahn durch 12%ige SDS-PAGE abgetrennt. Die Immundetektion des CD95-Proteins wurde durch einen Mausanti-CD95 moab und eine erhöhte Chemilumineszenz durchgeführt. Für die FACS-Analyse der CD95-Proteinexpression (C) wurden die Zellen mit Maus-anti-AP0-1 moab, gefolgt von einem Dy FITC-konjugierten Antimaus-IgG-Antikörper, gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Ähnliche Ergebnisse wurden in drei getrennten Versuchen erzielt.
Sowohl CD95-L als auch CD95 wurde auf der mRNA- und auf der Proteinstufe in Neo-transfizierten Kontrollzellen und in Bcl-2- oder Bcl-X_L-überexprimierenden Zellen induziert (13A-C). Hinsichtlich der Kinetik einer CD95-L- und einer CD95-Induktion wurden keinerlei signifikanten Unterschiede beobachtet. Ein ähnlicher Anstieg der CD95-und CD9-L-Expression wurde nach einer Behandlung mit Cisplatin oder VP-16 beobachtet, und zwar ungeachtet der Expression von Bcl-2- oder Bcl-X. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Höherregulierung von CD95-L und CD95 nach einer Doxorubicin-Behandlung unabhängig und stromaufwärts von den Mitochondrien stattfindet. Im Gegensatz dazu wurde nach der Behandlung mit Betulinsäure zu keinem Zeitpunkt eine Höherregulierung von CD95-L oder CD95 festgestellt (13A und 13B), was darauf hinweist, dass Betulinsäure unabhängig vom CD95-L/Rezeptor-System eine Apoptose auslöst.
Verbindung zwischen ΔΨ_m-Zerstörung und Aktivierung der Caspasenkaskade.
14A zeigt, dass Bcl-2 und Bcl-X die Aktivierung stromabwärtiger Caspasen blockieren. Mit Bcl-2 oder Bcl-X oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor (Neo) transfizierte SHEP-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 0,5 μg/ml Doxo oder 10 μg/ml Bet A behandelt (Bahnen +). Der Prozentsatz an behandelten oder unbehandelten Zellen mit ΔΨ_m wird gezeigt. Vierzig μg aus Zelllysaten isoliertes Protein pro Bahn wurden durch 15%ige SDS-PAGE abgetrennt. Die Immundetektion von Caspase-3, Caspase-8 und des PARP-Proteins wurde durch einen Maus-anti-Caspase-3 moab, einen Maus-anti-Caspase-8 moab, einen polyklonalen Kaninchen-anti-PARP-Antikörper und eine erhöhte Chemilumineszenz durchgeführt.
14B zeigt die zeitliche Beziehung zwischen ΔΨ_m-Zerstörung und Caspasenspaltung. SHEP-Zellen wurden 18 Stunden lang mit 0,5 μg/m1 Doxorubicin, 10 μg/m1 Bet A oder 1 μg/ml anti-APO-1 behandelt, mit DiOC(3) gefärbt und mit einem Cytofluorometer in Zellen mit noch immer normalem ΔΨ_m(ΔΨ_m ^high) und Zellen mit zerstörtem ΔΨ_m (ΔΨ_mlow) getrennt. Die Zellsortierung wurde entsprechend den Bereichen mit ΔΨ_m ^high- oder ΔΨ_m ^low-Zellen durchgeführt, wie in den Histogrammen gezeigt. Eine Western-Blot-Analyse der Zelllysate wurde durchgeführt wie in 14A beschrieben.
Nach einer Behandlung mit Doxorubicin wurde Caspase-8 in p43- und p41-Zwischenprodukte und in die aktive p18-Untereinheit gespalten, und zwar ungeachtet einer Bcl-2- oder Bcl-X-Überexpression (14A). Im Gegensatz dazu wurde die proteolytische Verarbeitung von Caspase-3 und PARP in Bcl-2- und Bcl-X-transfizierten Zellen gehemmt (14A). Ähnliche Daten wurden bei Verwendung von Cisplatin oder VP-16 als chemotherapeutische Mittel erhalten. Im Gegensatz dazu wurde die Verarbeitung sowohl von Caspase-8 als auch von Caspase-3 durch Bcl-2 oder Bcl-X gehemmt, wenn durch Betulinsäure eine Apoptose ausgelöst wurde. Diese Daten weisen darauf hin, dass Caspase-8 nach einer Behandlung mit Doxorubicin stromaufwärts von einem Bcl-2/Bcl-X_Lkontrollierten Kontrollpunkt gespalten wird, jedoch nach einer Inkubation mit Betulinsäure stromabwärts von diesem Kontrollpunkt. In beiden Fällen wurde eine Verarbeitung von Caspase-3 und PARP jedoch durch Bcl-2 oder Bcl-X verhindert.
Um die Beziehung zwischen Mitochondrien-PT (was ein Bcl-2/BcI-X_L-gesteuertes Ereignis darstellt), CD95-L-Induktion und Caspaseaktivierung weiter darzulegen, wurden mit Doxorubicin oder Betulinsäure behandelte Zellen in Zellen mit noch immer normalem ΔΨ_m(DiOC₆(3)^high) und Zellen mit zerstörtem ΔΨ_m(DiOC₆(3)^low) sortiert. Nach einer Inkubation mit Doxorubicin wurden sowohl in ΔΨ_m ^high-als auch in ΔΨ_m ^low-Zellen eine CD95-L-Induktion und eine Spaltung von Caspase-8 vorgefunden (14B). Allerdings wiesen nur ΔΨ_m ^low-Zellen gespaltene Caspase-3 und PARP auf (14B). Ein ähnliches Muster einer Caspasenspaltung wurde beobachtet, wenn Zellen durch eine CD95-Vernetzung stimuliert wurden (14B). Dies weist darauf hin, dass eine Aktivierung des Apoptoseprogramms durch die Höherregulierung von CD95/CD95-L und die durch CD95 ausgelöste Caspaseaktivierung stromaufwärts von den Mitochondrien auftritt. Im Gegensatz dazu wiesen nach einer Inkubation mit Betulinsäure nur ΔΨ_m ^low-Zellen gespaltene Caspasen-3 und -8 auf, und zwar zusätzlich zu verarbeitetem PARP (14B). Somit trat die Caspase-8-Aktivierung bei einer Betulinsäure-induzierten Apoptose stromabwärts von der ΔΨm-Dissipation auf, während die Caspase-8-Spaltung und die CD95-L-Induktion bei einer Doxorubicin-induzierten Apoptose stromaufwärts vom ΔΨ_m-Zusammenbruch auftraten.
Caspase-8 wird durch einen PT durchmachende Mitochondrien aktiviert. 15A zeigt, dass die Caspase-8 durch einen PT durchmachende Mitochondrien gespalten wird. Mit Bcl-2 oder Bcl-X oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor (Neo) transfizierte SHEP-Zellen wurden 16 Stunden lang mit 0,5 μg/m1 Doxo oder 10 μg/m1 Bet A behandelt (Bahnen +). Die Mitochondrien wurden isoliert und in Gegenwart oder Abwesenheit von 60 μm Z-VAD.fmk 6 Stunden lang mit Cytosolextrakten inkubiert. Eine Western-Blot-Analyse wurde durchgeführt wie in 14A beschrieben.
15B zeigt, dass Bcl-2 und Bcl-X die Spaltung von Caspasen auf der Mitochondrienebene hemmen. Mitochondrien (mito) von Doxo- oder Bet A-behandelten Vektorkontrollzellen (Neo) und Bcl-2- oder Bcl-X_L-überexprimierenden SHEP-Zellen wurden mit den Cytosolextrakten von Bcl-2- oder Bcl-X_L-überexprimierenden Zellen bzw. Vektorkontrollzellen inkubiert, gefolgt von einer Immundetektion von Caspase-3 und Caspase-8, wie in 14A beschrieben.
Die Mitochondrien aus Doxorubicin- oder Betulinsäure-behandelten Vektorkontrollzellen induzierten die Spaltung der Caspasen-3, -8 und von PARP in Cytosolextrakten ( 15A). Diese Wirkung wurde durch den Breitband-Caspase-Inhibitor zVAD-fmk blockiert, was darauf hinweist, dass zur Aktivierung von Caspase-3 und -8 eine Proteaseaktivität erforderlich war (15A). Um zu bestätigen, dass die Spaltung von Caspasen von einen PT durchmachenden Mitochondrien abhängt, wurden ähnliche Versuche durchgeführt, wobei Bcl-2- oder Bcl-X_L-transfizierte Zellen verwendet wurden, bei welchen die Mitochondrien im Folge einer Doxorubicin- oder Betulinsäure-Behandlung keinen PT durchmachen ( 12). Die Mitochondrien aus Bcl-2- oder Bcl-X_L-überexprimierenden Zellen, welche mit Doxorubicin oder Betulinsäure behandelt wurden, induzierten in Cytosolextrakten keine Caspasenspaltung (15A).
Bei Verwendung von Mitochondrien aus Vektorkontrollzellen wurde eine Spaltung von Caspasen in den Cytosolextrakten aus Bcl-2- oder Bcl-X_L-transfizierten Zellen festgestellt (15B). Die Verarbeitung von Caspasen wurde jedoch gehemmt, wenn Mitochondrien aus Bcl-2- oder Bcl-X_L-überexprimierenden Zellen in Kombination mit den Cytosolextrakten aus Vektorkontrollzellen verwendet wurden (15B). Dies weist darauf hin, dass eine fehlerhafte Spaltung von Caspasen in Bcl-2- oder BcI-X_L-überexprimierenden Zellen sich direkt zu einer blockierten Mitochondrienfunktion anstatt zu direkten oder indirekten Auswirkungen, einschließlich der Sequestration von Caspasen aus dem Cytosol, entspannte.
Caspase-8 wird durch einen AIF-hältigen Mitochondrienüberstand, aber nicht durch Cytochrom c, gespalten. 16A zeigt diese arzneimittelinduzierte Freisetzung von cyt c aus Mitochondrien. Mit Bcl-2 oder nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor (Neo) transfizierte SFIEP-Zellen wurden für die angegebenen Zeiträume mit 0,5 μg/m1 Doxo oder 10 μg/ml Bet A behandelt. Die Mitochondrien und Cytosolextrakte (S100-Fraktion) wurden hergestellt wie unter „Materialien und Verfahren" beschrieben. Fünf μg Protein pro Bahn wurden durch 15%ige SDS-PAGE abgetrennt. Die Immundetektion von cyt c wurde durch einen Maus-anti-cyt c moab und eine erhöhte Chemilumineszenz durchgeführt.
16B zeigt, dass sie Spaltung von pro-Caspase-8 durch AIF, aber nicht durch cyt c, ausgelöst wird. Cytosolextrakte aus SHEP-Zellen, die nur mit einem Neomycin-Widerstandsvektor (Neo) oder mit Bcl-2 transfiziert waren, wurden hergestellt und mit 10 μm cyt c oder einem AIF-hältigen Mitochondrienüberstand inkubiert. Die Immundetektion von Caspase-3, Caspase-8 und PARP wurde durchgeführt wie in 14A beschrieben.
Nach einer Stimulierung mit Doxorubicin oder Betulinsäure nahmen die Pegel an Mitochondrien-Cytochrom c ab, während die Konzentration an ektopischem Cytosol-Cytochrom c anstieg (16A). Eine erzwungene Expression von Bcl-2 oder BCl-X blockierte die Mitochondrienfreisetzung von Cytochrom c (16A). Die Zugabe von gereinigtem Cytochrom c zu Cytosolextrakten führte zur Verarbeitung von Caspase-3 und PARP sowohl in Vektorkontroll- als auch in Bcl-2-überexprimierenden Zellen (16B), was wiederum darauf hinweist, dass die apoptogene Aktivität im Cytosol Bcl-2-überexprimierender Zellen erhalten blieb. Die Zugabe von Cytochrom c zu Cytosolextrakten induzierte jedoch keine Caspase-8-Aktivierung (16B).
Eine Inkubation von Cytosolextrakten mit einem AIF-hältigen Mitochondrienüberstand führte zur Spaltung der Caspasen-3, -8 und von PARP (16B). Somit aktivieren die verschiedenen, während eines PT freigesetzten Mitochondrienproteine verschiedene Caspasen, die am Apoptosemechanismus beteiligt sind.
Bespiel 5: Betulinsäurederivate induzieren in neuroektodermalen Zellen eine Apoptose
Der folgende Versuch zeigt, dass die als Beispiele angeführten Betulinsäurederivate in einer Vielzahl von neuroektodermalen Zellen eine Apoptose induzieren. Genauer gesagt, Betulinsäure, 28-Acetyl-3-β-D-glucosylbetulin („B10"), 3-β-28-Hydroxylup-20(29)-en-3-yl-β-D-glucopyranosid („B11"), 3-β-3-Hydroxylup-20(29)-en-28-yl-β-D-glucopyranosid („B12") und 3-(β-D-Glucopyranosyloxy)lup-20(29)-en-28-olsäureethylester („B13") wurden unter Anwendung der in Beispiel 2 gezeigten Analysen hinsichtlich einer spezifischen Apoptose-Induktion untersucht. Siehe oben. Wie in 17A dargestellt, wiesen in SHEP-Zellen alle untersuchten Derivate eine apoptotische Aktivität auf, welche sogar jene der Betulinsäure übertraf. In IMR-S-Zellen wiesen B10, B12 und B13 im Vergleich zur Betulinsäure eine verstärkte apoptotische Aktivität auf, während B 11 ungefähr dieselbe Aktivität zeigte wie Betulinsäure (17B). Schließlich wiesen in Kelly-Zellen alle untersuchten Derivate, B10, B11, B12 und B13, eine apoptotische Aktivität auf, welche zumindest so stark war wie jene der Betulinsäure (17C).
Zuckerderivate, insbesondere Glucosederivate, bieten den zusätzlichen Vorteil, dass sie die Blut/Gehirn-Barriere durch Saccharidrezeptoren und -kanäle, insbesondere Glucosekanäle, aktiv überschreiten können. Daher haben die gezeigten Derivate hinsichtlich der Behandlung von im Gehirn lokalisierten Tumoren zusätzliche Vorteile.
Beispiel 6: in verschiedenen Zelllinien untersuchte Betulinsäurederivate
Die unten angeführten Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen (1–50 μg/ml) von Betulinsäure (BetA) oder von Derivaten (B10-B15) behandelt. B10, B11, B12 und B 13 sind dieselben Verbindungen wie im Beispiel 5 abgegeben, während B 14 3-β-D-Galactosylbetulin und B 15 3-β-D-Galactosylbetulinsäureethylester war. Die Apoptose wurde durch eine FACS-Analyse eines mit Propidiumiodid gefärbten DNA-Anteils bestimmt, wobei die CELLQuest-Software eingesetzt wurde. Der Prozentsatz an spezifischer Apoptose wurde wie folgt berechnet: 100 × (experimentelle Apoptose (%) – spontane Apoptose (%) / 100% spontane Apoptose (%)). Die spontane Apoptose lag unter 12%. Die Daten waren die Mittel von drei Werten. Die Konzentrationen, die für die Induktion einer spezifischen Apoptose bei 50% der Zellpopulation (ED50 (μg/ml)) notwendig sind, sind angegeben.

Claims

Verbindung, umfassend die Struktur 3-β-28-(Acetyloxy)lup-20(29)-en-3-yl-β-Dglucopyranosid (28-Acetyl-3-β-D-glucosylbetulin), ein D-Enantiomer, L-Enantiomer oder Racemat davon, oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz davon.
Verbindung, umfassend die Struktur 3-ß-28-Hydroxylup-20(29)-en-3-yl-β-Dglucopyranosid, ein D-Enantiomer, L-Enantiomer oder Racemat davon, oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz davon:
Verbindung, umfassend die Struktur 3-β-3-Hydroxylup-20(29)-en-28-yl-β-Dglucopyranosid, ein D-Enantiomer, L-Enantiomer oder Racemat davon, oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz davon.
Verbindung, umfassend die Struktur 3-(β-D-Glucopyranosyloxy)lup-20(29)-en-28-olsäureethylester, ein D-Enantiomer, L-Enantiomer oder Racemat davon, oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz davon.
Verbindung, umfassend die Struktur 3-β-D-Galactosylbetulinsäureethylester, ein D-Enantiomer, L-Enantiomer oder Racemat davon, oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz davon.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die Verbindung nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5 und einen pharmazeutisch geeigneten Träger.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5 zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln eines neuroektodermalen Tumors.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei der neuroektodermale Tumor ein Neuroblastom, ein Medulloblastom oder ein Ewing-Sarkom ist.