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Neue Dammaran-Sapogenine, ihre Verwendung
als Antikrebsmittel und ein Verfahren zur Herstellung derselben
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Technisches Gebiet
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Diese
Erfindung betrifft neue Dammaran-Sapogenine, ihre Verwendung bei
Antikrebsanwendungen und ein Verfahren zur Herstellung der Dammaran-Sapogenine. Insbesondere
betrifft die Erfindung zwei neue Dammaran-Sapogenine, erhalten durch chemische
Abspaltung von Dammaran-Sapogeninen,
extrahiert aus Panax ginseng, Panax quinguefol, Panax notoginseng
und anderen Spezies in der Ginseng-Familie, und auf eine neue Präparation
eines Antikrebsmittels, enthaltend ein oder mehrere dieser neuen
Sapogenine für
die Behandlung von Krebs, insbesondere Multiarzneimittel-resistenten
Krebserkrankungen, als auch auf ein Verfahren zur Herstellung dieser
neuen Sapogenine.
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Hintergrund
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Seit
Beginn des letzten Jahrzehnts richtete sich die Antikrebsforschung
zunehmend auf die Auffindung neuer Antikrebsmittel, die aus natürlichen
Quellen erhalten werden, als auch auf die Identifizierung und Herstellung
synthetischer Verbindungen, die in natürlichen Quellen gefunden wurden.
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Ginseng-Saponine
(Dammaran-Saponine, auch als "Ginsenoside" bezeichnet, die
wirksame Inhaltsstoffe sind, die ursprünglich in Panax ginseng, Panax
quinguefol, Panax notoginseng und anderen Spezies in der Ginseng-Familie
vorkommen) und Sapogenine (diejenigen, die in der Ginsengpflanze
oder anderen Spezies in der Ginseng-Familie nicht natürlich vorkommen
und nur durch chemische Strukturmodifikation über Abspaltung und/oder Semi-Synthese
von Dammaran-Saponinen abgeleitet werden können), als Wurzel-Verbindungen
natürlicher
Quellen, wurden auf ihre Antikrebseigenschaften umfassend untersucht.
Bei manchen von ihnen wurden Antikrebswirkungen berichtet, von denen
zum Beispiel über
Ginsenosid Rh2 [3-O-β-D-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxadiol]
wegen seiner Antikrebsaktivitäten,
einschließlich
Auslösung
der Differenzierung und Apoptose in Krebszellen, Hemmung des Wachstums
von menschlichem Eierstockkrebs in Nacktmäusen nach oraler Verabreichung,
und der Fähigkeit,
die Vermehrung von Multiarzneimittel-resistenten (MDR) Krebszellen
während
der Verwendung mit anderen chemotherapeutische Arzneimittel in vitro
zu hemmen, berichtet wurde.
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Über Ginsenosid
Rg3 [3-O-[β-D-glucopyranosyl(1-2)-Q-D-glucopyranosyl]-20(s)-protopanaxadiol] wurde
berichtet, dass es die Invasion durch verschiedene Krebszellen hemmt
und die Proliferation von menschlichen Prostatakrebszellen in vitro
unterdrückt
und Lungen-Metastase bei Mäusen
und peritoneale Metastase bei Ratten hemmt.
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Über einen
Metaboliten von Ginseng-Saponin, von menschlichen Darmbakterien
erzeugt, Mc [20-O-[α-L-arabinofuranosyl-(1 → 6)-β-D-glucopyranosyl]-20(s)-protopanaxadiol],
wurde berichtet, dass er die Vaskularisation von Tumoren und Extravasation
von Krebszellen hemmt.
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Während herkömmliche
chemotherapeutische Mittel die Krebszellen direkt angreifen und
schwere nachteilige Nebenwirkungen zeigen, wurde über einige
Ginseng-Saponine und Sapogenine als auch über ihre Darmbakterien-Metaboliten
berichtet, dass sie Hemmwirkungen auf Krebserkrankungen durch Auslösung von Krebszellen-Apoptose
und/oder durch Unterdrückung
der Vaskularisation von Krebserkrankungen mit geringen nachteiligen
Nebenwirkungen aufweisen.
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In
dem Fall der Behandlung von Krebserkrankungen mit Ginseng-Saponinen
wurde berichtet, dass Saponine, die von Darmbakterien zu Sapogeninen
metabolisiert werden, Antikrebswirkungen aufweisen. Es wurde auch
berichtet, dass Ginseng-Saponine mit einem Hydroxyl an C-20(R) oder
20(R) Epimere, wie z. B. 20(R)-Rh2 und 20(R)-Rg3, wesentlich geringere
biologische Aktivitäten
aufweisen als diejenigen mit einem Hydroxyl an C-20(S) oder 20(S)
Epimere, wie z. B. 20(S)-Rh2 bzw. 20(S)-Rg3. Derzeit sind Gemische
von 20(R) und 20(S) Epimere sehr schwer, falls nicht unmöglich, zu
trennen. Somit besitzt das Gemisch eine geringere Wirksamkeit als
das 20(S) Epimer. Außerdem
besitzen sämtliche
zuvor aufgefundenen Ginsenoside und Sapogenine entweder Zuckerreste
an C-3, C-6 oder
C-20 oder besitzen ein Hydroxyl an C-20 oder besitzen beides.
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Die
WO 97/31933 offenbart neue
Ginseng-Saponin-Verbindungen mit Strukturen gemäß der folgenden Formeln (I)
und (II)
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Diese
Verbindungen sollen als Antikrebsverbindungen aktiv sein. Jedoch
ist die Cytotoxizität
gegen Krebszellen verglichen mit den Verbindungen der vorliegenden
Erfindung gering.
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Außerdem offenbaren
S. W. KWON et al., "Liquid
chromatographic determination of less polar ginsenosides in processed
ginseng", Journal
of Chromatography, Elsevier Science Publishers B. V. Amsterdam,
NL, Bd. 921, Nr. 2, 6. Juli 2001, Seiten 335–339, Ginsenoside zur Verwendung
gegen Nicht-Kleinzellen-Lungenkrebs.
Die getestete Verbindung weist eine geringere Cytotoxizität als die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft zwei neue Sapogenine, ihre Verwendung bei Antikrebsanwendungen
und ein Verfahren für
ihre Herstellung. Insbesondere betrifft die Erfindung die Dammaran-Sapogenine
PAM-120 und PBM-100 (die Dammaran-Sapogenin-Struktur in diesen zwei Sapogeninen
ist spezifisch frei von jeglichen Zuckerresten (Glycone) an jeder
Position und einem Hydroxyl an C-20) der Dammaran-Saponine. Die
Erfindung schließt
ferner eine neue Anwendung der Sapogenine für die Antikrebsbehandlung,
indem sie getrennt oder zusammen und/oder zusammen mit anderen Wirkstoffen
verwendet werden, als auch für
das Verfahren zur Herstellung dieser neuen Sapogenine ein. Die neuen
Dammaran Sapogenine zeigen bei Anwendung eine überraschende Antikrebswirkung.
Insbesondere zeigen die neuen Dammaran-Sapogenine unerwartete und überragende
Aktivität
gegen Multiarzneimittel-resistente Krebserkrankungen.
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Die
Erfindung betrifft ein Sapogenin gemäß der Formel:
worin
R1 H, glc oder glcl
1-2 glc ist, R2 H oder
OH ist, R3 H oder OH ist; und wenn R1, R2 und R3 H sind, Doppelbindungen
an den Positionen 20(21) und 24(25) vorhanden sind; und wenn R1
H ist, R2 OH ist und R3 OH ist, Doppelbindungen an den Positionen
20(22) und 25(26) vorhanden sind; und wenn R1 H ist, R2 OH ist und R3
H ist, Doppelbindungen an den Positionen 20(22) und 24(25) vorhanden
sind; und wenn R1 glc ist, R2 H ist und R3 H ist, Doppelbindungen
an den Positionen 20(21) und 24(25) vorhanden sind; und wenn R1
glc
1-2 glc ist, R2 H ist und R3 H ist, Doppelbindungen
an den Positionen 20(22) und 24(25) vorhanden sind; und
pharmazeutisch
verträgliche
Zusammensetzungen, die die Sapogenine beinhalten.
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Die
Erfindung betrifft bei einer Ausführungsform ein Sapogenin gemäß der Formel:
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Die
Erfindung betrifft bei einer zweiten Ausführungsform ein Sapogenin gemäß der Formel:
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Die
Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines Sapogenins gemäß der Formel
der Erfindung zur Behandlung von Krebszellen in einem Menschen,
der an Krebs leidet, umfassend die Abtötung von Krebszellen, die Auslösung der
Apoptose in Krebszellen oder die Hemmung der Vermehrung von Krebszellen
oder eine beliebige Kombination davon. Die Sapogenine der Erfindung
sind insbesondere bei der Behandlung von Medikamenten-resistenten
Krebszellen (MDR) in einem Menschen nützlich, der an Krebs leidet,
umfassend die Verwendung der Sapogenine entweder einzeln oder in
Kombination miteinander oder in Kombinationen mit anderen chemotherapeutischen
Mitteln.
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Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Behandlung von Krebs
in Menschen oder anderen Tieren, die an Krebs leiden, umfassend
die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung,
umfassend eines oder mehrere aus PAM-120 und PBM-100, an die Menschen
oder andere Tiere.
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Das
Verfahren kann eine pharmazeutisch wirksame Menge an PAM-120 und
PAM-100 mit oder ohne einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen.
Der Wirkstoff kann in einer Dosierung zwischen 5 Mikrogramm bis
50 Gramm pro 1 kg Körpergewicht
pro Tag verabreicht werden. Ein bevorzugter Bereich ist 50 Mikrogramm
bis 5 Gramm pro 1 kg Körpergewicht
pro Tag. Die Form der Zusammensetzung kann aus der Gruppe ausgewählt werden,
die aus einer oral verabreichbaren Form, einer injizierbaren Form
und einer topisch anwendbaren Form besteht.
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Die
oral verabreichbare Form kann aus der Gruppe ausgewählt werden,
die aus einer Tablette, einem Pulver, einer Suspension, einer Emulsion,
einer Kapsel, einem Granulat, einer Lutschpastille, einer Pille,
einer Flüssigkeit,
einem Spiritus, einem Sirup und einer Limonade besteht. Die injizierbare
Form kann aus der Gruppe ausgewählt
werden, die aus einer Flüssigkeit,
einer Suspension und einer Lösung
besteht. Die topisch anwendbare Form kann aus der Gruppe ausgewählt werden,
die aus einem Tropfen, einer Paste, einer Salbe, einer Flüssigkeit,
einem Puder, einem Pflaster, einer Suppositorie, einem Aerosol,
einem Linimentum, einer Lotion, eines Klistiers und einer Emulsion
besteht. Die Zusammensetzung kann Menschen oder anderen Tieren verabreicht
werden, die eine oder mehrere andere Antikrebsbehandlungen erhalten.
Die Zusammensetzung kann mit einem oder mehreren anderen Antikrebsmitteln
für additive
Behandlungswirkungen oder synergistische Behandlungswirkungen auf
Multiarzneimittelresistente Krebserkrankungen oder jeden anderen
Krebstyp formuliert werden.
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Die
Erfindung schließt
ferner die Einarbeitung der erfindungsgemäßen Sapogenine in Lebensmittel, Reformlebensmittel,
Nahrungsprodukte, Naturstoffe und Alternativmedizin-Produkte ein.
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Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Sapogenins,
welches die Herstellung eines Ginsenosid-Extrakts aus Pflanzen,
die aus der Gruppe ausgewählt
sind, die aus Panax ginseng, Panax quinguefol und Panax notoginseng
besteht, und das Vorgehen gemäß den folgenden
Schritten umfasst: (a) Mischen des Ginsenosid-Extrakts mit Wasser;
(b) (i) Mischen des Ginsenosid-Extrakts
und Wasser mit einer kurzkettigen (1–5 Kohlenstoff) Alkalimetallalkoholat-Lösung oder
einer Hydroxid-Ethanol-Lösung,
um ein Gemisch herzustellen; und (ii) Vorlegen des resultierenden
Gemisches in einem Reaktionsbehälter,
so dass das resultierende Gemisch chemische Reaktionen unter notwendiger
hoher Temperatur und hohem Druck eingehen kann; oder alternativ
(c) (i) Mischen des Ginsenosid-Extrakts mit Ethanol; (ii) Mischen
des Extrakts und Ethanol mit einer Alkalimetallalkoholat-Lösung, um
ein Gemisch herzustellen, und (ii) Vorlegen des resultierenden Gemisches
in einem Reaktionsbehälter,
so dass das resultierende Gemisch chemische Reaktionen unter notwendiger
hoher Temperatur und hohem Druck eingehen kann; (d) nach abgeschlossener
Umsetzung, Sammeln eines intermediären Produkts aus einem Gemisch
von Ginsenosiden und Sapogeninen aus dem Ethanol-Gemisch; und (e)
Abtrennen der gewünschten
Sapogenine aus dem intermediären
Saponin-Sapogenin-Gemisch durch Kieselgelsäulenchromatographie.
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Das
Alkalimetall kann Kalium oder Natrium sein. Das Hydroxid kann Natriumhydroxid
oder Kaliumhydroxid sein. Die Alkalimetallalkoholat-Lösung oder
die Konzentration der Hydroxid-Ethanol-Lösung kann 5–50% (m/V) betragen. Der Alkohol
kann 1–5
Kohlenstoffatome aufweisen. Die Temperatur des Reaktionsbehälters kann
zwischen 150–300°C betragen
und der Reaktionsdruck kann zwischen 2,5–8,4 MPa betragen. Vorzugsweise
ist die Temperatur zwischen 240–300°C und der
Druck ist zwischen 3,5–8,4
MPa.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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In
den Zeichnungen, die spezifische Ausführungsformen der Erfindung
darstellen, die aber nicht so ausgelegt werden sollen, dass sie
das Wesen oder den Schutzumfang der Erfindung in irgendeiner Weise
einschränken:
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1 zeigt
einen Graphen der Tumor-Hemmwirkung von verschiedenen Ginsenosiden
bei B16 Zellen.
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2 zeigt
einen Graphen der Tumor-Hemmwirkung von verschiedenen Ginsenosiden
bei Arzneimittel-resistenten menschlichen Brustkrebszellen MCF7r.
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3 zeigt
eine Auftragung der synergistischen Wirkung von PAM-120 mit Cisplatin
bei Arzneimittel-resistenten menschlichen Brustkrebszellen MCF7r.
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4 zeigt
eine Auftragung der synergistischen Wirkung von PAM-120 mit Taxol
bei Arzneimittel-resistenten menschlichen Brustkrebszellen MCF7r.
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5 zeigt einen Graphen der therapeutischen
Wirkung von PAM-120 an dem Maus-Modell für intrakraniales menschliches
malignes Gliom (U87).
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6 zeigt
einen Graphen der therapeutischen Wirkung von PAM-120 an dem Maus-Modell
für subkutanes
menschliches malignes Gliom (U87).
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7 zeigt
ein Flussdiagramm von zwei Verfahren, die verwendet werden können, um
die erfindungsgemäßen Sapogenine
zu erhalten.
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Beschreibung
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Im
Verlauf der folgenden Beschreibung sind spezifische Details dargestellt,
um ein tieferes Verständnis
der Erfindung bereitzustellen. Jedoch kann die Erfindung ohne diese
Einzelheiten ausgeführt
werden. In anderen Fällen
wurden wohl bekannte Elemente im Detail nicht gezeigt oder beschrieben,
um die Erfindung nicht unnötig
undurchsichtig zu machen. Dementsprechend sollen die Beschreibung
und die Zeichnungen in einer erläuternden
anstatt einer einschränkenden
Bedeutung betrachtet werden.
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Diese
Erfindung betrifft eine physikalische erhaltene Gruppe von neuen
Verbindungen, wie folgt:
- – Dammara-20(21)-dien-3,12-diol
(als PAM-120 bezeichnet);
- – Dammara-20(22E)-dien-3,12,24-triol
(als PBM-100 bezeichnet);
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Die
chemischen Formeln, Strukturen und Spektraleigenschaften der vorstehend
aufgeführten
neuen Verbindungen sind auf den folgenden Seiten gezeigt:
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Sapogenin PAM-120
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Dammara-20(21)-dien-3,12-diol (als PAM-120
bezeichnet)
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- (1) Strukturformel:
- (2) Summenformel: C30H50O2
- (3) Molmasse: 442,723
- (4) Das 1H-NMR-Spektrum (300 MHz, C5D5N) zeigte Signale
bei δ 5,28
(1H, br-t), δ 5,14
(1H, s), δ 4,90
(1H, s), δ 1,67
(3H, s), δ 1,60
(3H, s), δ 1,23
(3H; s), δ 1,06
(3H, s), δ 1,03
(3H, s), δ 0,95
(3H, s) und δ 0,90
(3H, s).
- (5) Das 13C-NMR-Spektrum (75,4 MHz,
C5D5N) zeigte Signale
bei δ 39,57
(C-1), δ 28,31
(C-2), δ 78,02 (C-3), δ 40,30 (C-4), δ 56,46 (C-5), δ 18,84 (C-6), δ 35,46 (C-7), δ 37,53 (C-8), δ 51,03 (C-9), δ 39,61 (C-10), δ 32,76 (C-11), δ 72,51 (C-12), δ 48,29 (C-13), δ 51,27 (C-14), δ 32,68 (C-15), δ 27,12 (C-16), δ 52,51 (C-17), δ 15,91 (C-18), δ 16,61 (C-19), δ 155,57 (C-20), δ 108,18 (C-21), δ 33,91 (C-22), δ 30,82 (C-23), δ 125,38 (C-24), δ 131,24(C-25), δ 25,81 (C-26), δ 17,81 (C-27), δ 28,73 (C-28), δ 16,34 (C-29)
und δ 17,06 (C-30).
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Sapogenin PBM-100
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Dammara-20(22E)-dien-3,12,24-triol (als
PBM-100 bezeichnet)
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- (1) Strukturformel:
- (2) Summenformel: C30H50O4
- (3) Molmasse: 474,721
- (4) Das 1H-NMR-Spektrum (300 MHz, C5D5N) zeigte Signale
bei δ 5,31
(1H, br.t), δ 5,22
(1H, s), δ 4,82
(1H, s), δ 1,95
(3H, s), δ 1,81
(3H, s), δ 1,66
(3H, s), δ 1,64
(3H, s), δ 1,47
(3H, s), δ 1,19
(3H, s), δ 1,06
(3H, s) und δ 1,03
(3H s).
- (5) Das 13C-NMR-Spektrum (75,4 MHz,
C5D5N) zeigte Signale
bei δ 39,48
(C-1), δ 27,52
(C-2), δ 78,48 (C-3), δ 40,42 (C-4), δ 61,86 (C-5), δ 67,77 (C-6), δ 47,69 (C-7), δ 41,48 (C-8), δ 50,55 (C-9), δ 39,48 (C-10), δ 32,02 (C-11), δ 72,63 (C-12), δ 50,47 (C-13), δ 50,73 (C-14), δ 32,69 (C-15), δ 27,52 (C-16), δ 50,92 (C-17), δ 17,80 (C-18), δ 17,70 (C-19), δ 140,11 (C-20), δ 13,23 (C-21), δ 124,63 (C-22), δ 30,04 (C-23), δ 78,00 (C-24), δ 149,90 (C-25), δ 110,54 (C-26), δ 17,80 (C-27), δ 28,94 (C-28), δ 16,56 (C-29)
und δ 17,14 (C-30).
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Die
Erfinder haben hierin festgestellt, dass die Dammaran-Sapogenin-Struktur,
die modifiziert ist, um spezifisch frei von jeglichen Zuckerresten
(Glycone) an jeder Position und frei von Hydroxyl an C-20 zu sein, die
Wirksamkeit bei der Behandlung von Krebserkrankungen, insbesondere
bei der Behandlung von Multiarzneimittel-resistenten Krebserkrankungen,
im Vergleich zu Sapogeninen, die Zuckerreste in der Struktur oder ein
Hydroxyl an C-20 aufweisen, überraschend
verbessert hat. Die Erfinder haben unerwarteterweise festgestellt,
dass PAM-120 und PBM-100, die alle in diese chemische Gruppe fallen,
eine größere Antikrebswirkung als
andere bekannte Saponine und Sapogenine aufweisen. Genauer zeigen
diese beiden Sapogenine und insbesondere PAM-120 eine überraschend
wirksame Aktivität
bei der Behandlung von Multiarzneimittel-resistenten Krebserkrankungen.
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Während die
Erfinder es nicht wünschen,
sich auf irgendwelche nachteiligen Theorien festzulegen, falls sie
sich als unzutreffend erweisen, bieten die Erfinder das Folgende
als eine Hilfe bei dem Verstehen der Erfindung an. Es scheint, dass
Sapogenine, die kein Hydroxyl an C-20 aufweisen, im Vergleich zu
Sapogeninen, die ein Hydroxyl an C-20 aufweisen, überraschenderweise
bei der Krebsbehandlung wirksam sind. Ferner scheint es, dass ein
Sapogenin, das keinen Zuckerrest (Glycon) an der Sapogenin-Struktur
aufweist, wirksamer als Sapogenine ist, die einen Zuckerrest aufweisen.
Ferner scheint es, dass das Diol wirksamer als das Triol ist. Nichts
hiervon konnte erwartet oder vorhergesagt werden, ohne die Sapogenine
der Erfindung zu testen.
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Erfindungsgemäß und mit
der Schwere der von dem Patienten durchlebten Symptome variierend
beträgt
die aktive tägliche
Dosierung von Sapogenin PAM-120 0,1 mg–10 g pro kg Körpergewicht
oder vorzugsweise 1 mg–1
g pro kg Körpergewicht.
Die aktive tägliche
Dosierung von Sapogenin PBM-100 beträgt 0,1 mg–10 g pro kg Körpergewicht
oder vorzugsweise 1 mg–1
g pro kg Körpergewicht.
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Das
erfindungsgemäße Antikrebsmittel
enthält
einen oder mehrere der neuen Sapogenine PAM-120 und PBM-100 mit
oder ohne anderen Antikrebsmitteln, verwendet mit oder ohne einem
oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern, wie z. B. feste und flüssige Exzipienten.
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Die
Verabreichungsformen der erfindungsgemäßen Antikrebsmittel sind wie
folgt aufgeführt:
- – Injektionsformen,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf intramuskuläre
(IM) Injektion, intravenöse
(IV) Injektion, subkutane Injektion und Zielgewebe-Injektion in
wässrigen
Lösungen, Öllösungen,
Emulsion oder beliebiges Formen;
- – Orale
Formen, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf Tabletten, Kapseln, Granulat, Dragees, Suspensionen, Pulvern,
Sprits, Emulgatoren und Sirups; und
- – Topische
Form, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf Tropfen, Tinkturen, Einläufe,
Salben, Suspensionen, Breie, Pasten, Suppositorien, Aerosole, Kataplasmas,
Emulgatoren, Linimente und Pflaster.
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Diese
Erfindung betrifft ferner ein Herstellungsverfahren, das verwendet
werden kann, um die vorstehend erwähnten neuen Dammaran-Sapogenine
für Antikrebsanwendungen über chemische
Abspaltung und Semi-Synthese von Dammaran-Saponinen kommerziell
herzustellen.
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Die 7 stellt
ein Flussdiagramm von zwei alternativen Verfahren dar, die verwendet
werden können,
um die erfindungsgemäßen Sapogenine
herzustellen. Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren
verwendet allgemeine Ginsenoside (auch als Dammaran-Saponine bezeichnet,
einschließlich
Ra, Rc, Rd, Re, usw.), extrahiert aus Pflanzen, die aus der Ginseng-Familie
ausgewählt
sind, wie z. B. Panax ginseng, Panax quinguefol und Panax notoginseng,
als Rohmaterialien. In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden allgemeine
Ginsenoside zunächst
mit Wasser und danach mit einer kurzkettigen (1–5 Kohlenstoff) Alkalimetallalkoholat-Lösung oder
einer Hydroxid-Ethanol-Lösung
vermischt. Das Gemisch wird danach in einem Reaktionsbehälter vorgelegt,
um chemische Reaktionen unter notwendiger hoher Temperatur und hohem
Druck einzugehen. Alternativ werden allgemeine Ginsenoside zunächst mit
Ethanol und danach mit einer Alkalimetallalkoholat-Lösung vermischt.
Das Gemisch wird danach in einem Reaktionsbehälter vorgelegt, um chemische
Reaktionen unter notwendiger hoher Temperatur und hohem Druck einzugehen.
Nach der benötigten
Zeitdauer für
die Vervollständigung
der Reaktion wird das intermediäre
Produkt aus einem Gemisch von Ginsenosiden und Sapogeninen aus der
Ethanol-Lösung
gesammelt. Der nächste
Schritt besteht in dem Abtrennen der gewünschten Dammaran-Sapogenine aus dem
intermediären
Saponin-Sapogenin-Gemisch durch Verwendung von Kieselgelsäulenchromatographie
Erfindungsgemäß kann das
Alkalimetall Kalium oder Natrium sein, das Hydroxid kann Natriumhydroxid
oder Kaliumhydroxid sein, die Konzentration der Alkalimetallalkoholat-Lösung oder
die Konzentration der Hydroxid-Ethanol-Lösung kann 5–50 % (m/V) betragen und der
kurzkettige Alkohol kann ein Alkohol mit 1–5 Kohlenstoffatomen sein.
Erfindungsgemäß kann während des
Herstellungsverfahrens die Temperatur des Reaktionsbehälters zwischen
150–300°C betragen
und der Reaktionsdruck ist zwischen 2,5–8,4 MPa.
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Krebserkrankungen,
die auf die Behandlung mit den Verbindungen der Erfindung alleine
oder in Kombination mit einem chemotherapeutischen Mittel gemäß verschiedenen
Aspekten der Erfindung ansprechen, können sowohl primäre und metastatische
Tumoren und Hyperplasien einschließen, einschließlich Karzinome von
Brust, Kolon, Rektum, Lunge, Oropharynx, Hypopharynx, Ösophagus,
Magen, Pankreas, Leber, Gallenblase und Gallenleitungen, Dünndarm,
Harnwege (einschließlich
Niere, Blase und Urothelium), weibliche Geschlechtsteile (ein schließlich Zervix,
Uterus und Eierstöcke
als auch Choriocarcinom und Gestationsbedingte Trophoblasterkrankung),
männliche
Geschlechtsteile (einschließlich
Prostata-, Samenblasen-, Hoden- und Keimzellentumoren), endokrine
Drüsen
(einschließlich
der Schilddrüse,
Nebenniere und Hirnanhangsdrüse) und
Haut als auch Hämangiome,
Melanome, Sarkome (einschließlich
derjenigen, die aus Knochen und Weichzellen entstehen sowie Kaposi
Sarkoma) und Tumoren des Gehirns, der Nerven, der Augen und der
Hirnhaut (einschließlich
Astrocytome, Gliome, Glioblastome, Retinoblastome, Neurome, Neuroblastome,
Schwannome und Meningiome). Bei manchen Aspekten der Erfindung können die
Verbindungen der Erfindung in Kombination mit einem chemotherapeutischen
Mittel auch bei der Behandlung von hämatopoietischen Krebserkrankungen
nützlich
sein, wie z. B. Leukämien
(d. h. Chlorome, Plastocytome und die Plaques und Tumore von Mycosis
fungoides und kutanes T-Zellen-Lymphom/Leukämie) und Lymphomen (sowohl
Hodgkin als auch Nicht-Hodgkin-Lymphome).
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Die
Verbindungen der Erfindung und das chemotherapeutische Mittel kann
in Kombination separat oder als eine einzige kombinierte pharmazeutische
Zusammensetzung verabreicht werden. Die Menge von jeder verabreichten
Komponente kann von einem behandelnden Arzt bestimmt werden, der
eine Vielzahl von Faktoren berücksichtigt,
wie z. B. die Ätiologie
und Schwere der Krankheit, den Zustand und Alter des Patienten und
die Wirksamkeit von jeder Komponen te. Die Komponenten können gemäß den Standardmethoden verabreicht
werden, wie zum Beispiel in dem Physician's Desk Reference (PDR), herausgegeben
von Medical Economics Co. Inc. of Oradell, N. J., offenbart ist.
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Eine
oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger oder Exzipienten können verwendet
werden, um die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung
zu formulieren, einschließlich
Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Überzüge, antibakterielle
und antimykotische Mittel, isotonische und absorptionsverzögernde Mittel
und dergleichen, die physiologisch kompatibel sind. In alternativen
Ausführungsformen
kann der Träger
für eine
parenterale, intravenöse,
intraperitoneale, intramuskuläre,
sublinguale oder orale Verabreichung geeignet sein. Pharmazeutisch
verträgliche
Träger
können
sterile wässrige
Lösungen
oder Dispersionen und sterile Pulver für die unvorbereitete Herstellung
von sterilen injizierbaren Lösungen
oder Dispersionen einschließen.
Mit der Ausnahme, dass ein beliebiges herkömmliches Medium oder Mittel
mit dem Wirkstoff inkompatibel ist, ist die Verwendung davon in
den pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung umfasst. Ergänzende Wirkstoffe
können
in die pharmazeutischen Zusammensetzungen auch eingearbeitet werden.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen müssen
typischerweise unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung
steril und stabil sein. Die Zusammensetzung kann als eine Lösung, Mikroemulsion,
Liposom oder eine andere geordnete Struktur formuliert sein, die
für eine
hohe Wirkstoffkonzentration geeignet ist. Der Träger kann ein Lösungsmittel
oder ein Dispersionsmedium sein, das zum Beispiel Wasser, Ethanol,
Polyol (zum Beispiel Glycerol, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol
und dergleichen) und geeignete Gemische davon enthält. Die
passende Fluidität
kann zum Beispiel durch die Verwendung eines Überzuges, wie z. B. Lecithin,
indem die erforderliche Teilchengröße in dem Fall einer Dispersion
aufrechterhalten wird, und durch die Verwendung von oberflächenaktiven
Mitteln aufrechterhalten werden. In vielen Fällen ist es vorzuziehen, isotonische
Mittel, zum Beispiel Zucker, Polyalkohole, wie z. B. Mannit, Sorbit,
oder Natriumchlorid, in die Zusammensetzung einzuschließen. Eine
verlängerte
Adsorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann erreicht werden,
indem ein absorptionsverzögerndes
Mittel, zum Beispiel Monostearatsalze und Gelatine, in die Zusammensetzung
eingeschlossen wird. Außerdem
können
die phar mazeutischen Zusammensetzungen in einer zeitabhängig freisetzenden
Formulierung, zum Beispiel in einer Zusammensetzung, die langsam
freisetzendes Polymer einschließt,
verabreicht werden. Die Wirkstoffe können mit Trägern hergestellt werden, die
die Verbindung gegenüber
einer raschen Freisetzung schützen,
wie z. B. eine kontrolliert freisetzende Formulierung, einschließlich Implantate
und mikroverkapselte Abgabesysteme. Bioabbaubare, biokompatible Polymere
können
verwendet werden, wie z. B. Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Collagen, Polyorthoester,
Polymilchsäure
und Polymilchsäure-Polyglycol-Copolymere
(PLG). Viele Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen sind
patentiert oder den Fachleuten allgemein bekannt.
-
Sterile
injizierbare Lösungen
können
hergestellt werden, indem ein Wirkstoff in der erforderlichen Menge
in einem geeigneten Lösungsmittel
mit oder ohne eine Kombination von vorstehend aufgeführten Inhaltsstoffen,
je nach Erfordernis, eingearbeitet wird, worauf eine gefilterte
Sterilisation folgt. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch Einarbeiten
des Wirkstoffs in ein steriles Vehikel hergestellt, das ein basisches
Dispersionsmedium und die anderen erforderlichen Inhaltsstoffe aus
den vorstehend aufgezählten
enthält.
In dem Fall von sterilen Pulvern für die Herstellung von sterilen
injizierbaren Lösungen
sind die bevorzugten Verfahren der Herstellung Vakuumtrocknen und
Gefriertrocknen, die ein Pulver des Wirkstoffs plus eines beliebigen
zusätzlich
erwünschten
Inhaltsstoffs aus einer zuvor steril filtrierten Lösung hiervon
ergeben. Pharmazeutische Zusammensetzungen können mit einer oder mehreren
Verbindungen formuliert sein, die die Löslichkeit der Wirkstoffe begünstigen.
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Beispiele
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Beispiele für die Herstellungsverfahren:
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Beispiel 1: Herstellungsverfahren zur
Herstellung von PAM-120 und PBM-100
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- [1] Ginseng-Rohextrakt 10 g wurden in 40 ml
95% Ethanol gelöst
- [2] 40 ml 5 N NaOH zugeben
- [3] in den Reaktionsbehälter
gießen
und Temperatur auf 240°C
und den Druck auf 3,5 MPa einstellen, für 1,5 Stunden
- [4] Temperatur auf Raumtemperatur verringern und Produkte aus
dem Behälter
nehmen
- [5] HCl zugeben, um pH auf etwa 7 zu neutralisieren, und das
Volumen auf 800 ml unter Verwendung von Wasser vergrößern
- [6] 3 Mal mit Essigester extrahieren, jedes Mal 100 ml
- [7] alle Extrakte vereinigen und den Druck zum Trocknen verringern.
Somit werden 3,8 g an getrockneten Extrakten erhalten
- [8] das Extrakt in 20 ml Methanol verreiben und auflösen und
die Methanollösung
mit Kieselgel vermischen
- [9] das Gemisch trocknen und danach zu einem Feinpulver verreiben
- [10] die Kieselgelsäule
beladen
- [11] die Säule
mit 60 ml Ether:Petroleumbenzin (1:3) waschen und somit wurden 250
mg PAM-120 und 45 mg PBM-100 erhalten
- [12] die Säule
mit 90 ml Chloroform:Methanol (95:5) waschen und somit wurden 50
mg PAN-20 erhalten.
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Beispiel 2: Ein weiteres Beispiel des
Herstellungsverfahrens zur Herstellung von PAM-120 und PBM-100
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- [1] 10 g Ginseng-Rohextrakt wurden in einen
Reaktionsbehälter
gegeben
- [2] dem Reaktionsbehälter
100 ml 5 N NaOH zugeben
- [3] die Temperatur auf 270°C
und den Druck auf 4,5 MPa für
1 Stunde einstellen
- [4] Temperatur auf Raumtemperatur verringern und danach die
Produkte herausnehmen
- [5] unter Verwendung von HCl den pH auf 7 neutralisieren
- [6] filtrieren und Feststoffe aufbewahren
- [7] die Feststoffe in 10 ml 95% Ethanol auflösen
- [8] Wasser zugeben, um den Ethanolgehalt auf weniger als 5%
zu bringen
- [9] über
Nacht stehen lassen
- [10] filtrieren und Feststoffe aufbewahren
- [11] die Feststoffe trocknen
- [12] die Feststoffe in 10 ml Methanol auflösen
- [13] filtrieren und die Lösung
aufbewahren
- [14] die Lösung
trocknen, um 3,6 g an Produkten zu erhalten
- [15] die Produkte mit 11 g Kieselgel vermischen
- [16] verreiben und dann die Kieselgelsäule beladen
- [17] die Säule
mit 100 ml Ether:Petroleumbenzin (1:3) waschen und somit wurden
60 mg PAM-120 und 65 mg PBM-100 erhalten
- [18] die Säule
mit Chloroform:Methanol (95:5) waschen und somit wurden 60 mg PAN-20
erhalten.
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Beispiel 3: Vergleich von Krebszellen-Hemmwirkungen
in vitro zwischen Ginsenosid 20(S)-Rh2 und neuen Dammaran-Sapogeninen
PAM-120, PBM-100, PAN-30
(Vergleich) und ihre Zusammensetzung
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A. Verfahren
-
Zusammensetzung:
20(S)-Rh2 wurde von Shenyang Pegasus Pharmaceutical R&D Co., China,
mit einer Reinheit von über
98% bereitgestellt. Die Molmasse für Rh2 betrug 622,3. Die Sapogenine
PAM-120, PBM-100 und PAN-30 wurden aus dem in Beispiel 1 angegebenen
Verfahren abgeleitet. Die Molmassen von PAM-120, PBM-100 und PAN-30
betrugen jeweils 442,7, 474,7 und 604,9, und die Reinheit für jede der
drei Wirkstoffe war höher
als 99%. Rh2, PAM-120, PBM-100 und PAN-30 wurden jeweils zu 1 Gramm
separat in 100 ml absolutem Ethanol gelöst und bei 4°C aufbewahrt.
Die Wirkstoffe wurden mit RPMI-1640 Medium auf die gewünschten
Konzentrationen verdünnt,
wie in der Tabelle 1 gezeigt ist.
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Zellen:
menschliche Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinom H460 Zellen wurden
in RPMI-1640 Medium, das mit 10% fetalem Kälberserum, 100 Einheiten Penicillin/ml
und 100 μg
Streptomycin/ml in 5% CO2 versetzt war,
bei 37°C
inkubiert.
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Behandlung
in vitro: H460 Zellen wurden in flachbödige 96-Well-Mikrotestplatten
mit 1,2×10
3 Zellen pro Loch, sechs Löcher in
jeder Gruppe, eingesetzt, in befeuchtetem 5% CO
2 bei
37°C für 24 Stunden
mit oder ohne die Wirkstoffe gemäß der Tabelle
inkubiert, wie nachstehend gezeigt ist. Tabelle 1. Dosierung
| Gruppe | Dosierung
(mg/ml) |
| Kontrolle | Kein
Wirkstoff | - |
| Niedrige Dosierung | Rh2 | 25 |
| PAM-120 |
| PBM-100 |
| PAN-30 |
| Hohe Dosierung | Rh2 | 40 |
| PAM-120 |
| PBM-100 |
| PAN-30 |
-
Nach
den 24 Stunden der Inkubation wurde ein gleiches Volumen an 10%
Formalinphosphat-gepufferter Salzlösung, enthaltend 0,2% Kristallviolett,
jedem Loch zugegeben und bei Raumtemperatur für 20 Minuten belassen. Die
Platten wurden dann zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und
bei Raumtemperatur getrocknet. Das Absorptionsvermögen der
gefärbten
Zellen bei 590 nm wurde dann unter Verwendung eines automatischen
Mikrotestplattenlesers gemessen. Das durchschnittliche Absorptionsvermögen der
Kontrolllöcher
(A
c) ohne irgendeine Behandlung wurde berechnet,
das durchschnittliche Absorptionsvermögen jeder Behandlungsgruppe
(A
Ti) wurde bestimmt, und danach wurde die
durchschnittliche Lebensfähigkeit
der Zellen jeder Behandlungsgruppe (V
i)
unter Verwendung der folgenden Formel abgeleitet:
B. Ergebnis Tabelle 2. Lebensfähigkeit der Krebszellen (%)
| Gruppe | Absorptionsfähigkeit
von gefärbten
Zellen (M ± SD) | V
(%) | tTest
w/Kontrolle | tTest
w/Rh2 |
| Kontrolle | Keine
Wirkstoffe | 0,368 ± 0,69 | 100,00 | | |
| Niedrige Dosierung (25 μg/ml) | Rh2 | 0,278 ± 0,030 | 78,49 | P < 0,01 | |
| PAM-120 | 0,220 ± 0,051 | 62,08 | P < 0,01 | P < 0,05 |
| PBM-100 | 0,223 ± 0,040 | 62,72 | P < 0,01 | P < 0,05 |
| PAN-30 | 0,249 ± 0,045 | 70,30 | P < 0,01 | |
| Hohe Dosierung (40 μg/ml) | Rh2 | 0,181 ± 0,049 | 50,99 | P < 0,01 | |
| PAM-120 | 0,125 ± 0,031 | 35,34 | P < 0,01 | P < 0,05 |
| PBM-100 | 0,130 ± 0,019 | 36,51 | P < 0,01 | P < 0,05 |
| PAN-30 | 0,147 ± 0,032 | 41,49 | P < 0,01 | |
-
Die
Ergebnisse in der Tabelle 2 zeigen eine signifikante Hemmwirkung
auf die Proliferation von H460 Zellen durch jede der neuen Verbindungen
PAM-120, PBM-100 und PAN-30 (P < 0,01
verglichen mit derjenigen der Rh2-Kontrolle) und einen beachtenswerten
Anstieg der Hemmwirkung von PAM-120 und PBM-100 auf die Proliferation
von H640 Zellen (P < 0,05
verglichen mit derjenigen von Rh2).
-
Beispiel 4: Tumorgewichtstest
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A. Verfahren
-
Vierzig
(40) C57BL/6J Mäuse,
die 18–22
g wogen, wurden zufällig
in vier Gruppen aufgeteilt: eine Kontrollgruppe und drei Behandlungsgruppen,
jeweils mit 10 Tieren. Maussarkom 180 Zellen wurden hyperdermisch
in die Mäuse
unter Verwendung einer Transplantationsnadel unter die rechte Armhöhle transplantiert.
-
Nach
der Transplantation bildeten sämtliche
Mäuse einen
Tumor. Die Gemischzusammensetzung aus Ginsenosiden und Sapogeninen,
einschließlich
der drei neuen Dammaran-Sapogenine (PAM-120, PBM-100 und PAN-30),
abgeleitet als ein Zwischenprodukt aus dem in Beispiel 2 beschriebenen
Verfahren, wurde in einer Suspensionsform hergestellt. Die Mäuse wurden
täglich
vor der Wirkstoffverabreichung gewogen, um die tatsächliche
Bemessung des verabreichten Wirkstoffs zu bestimmen. Die Wirkstoffverabreichung
wurde 24 Stunden nach der Tumortransplantation begonnen. Den Mäusen in
den drei Behandlungsgruppen wurde die Gemischzusammensetzung mit
einer täglichen
Dosierung von 0,4 mg/kg, 1,2 mg/kg bzw. 3,6 mg/kg für 8 Tage unter
Verwendung eines Magenkatheters oral verabreicht. Den Mäusen in
der Kontrollgruppe wurde ein normales Placebo aus Salzlösung oral
verabreicht. 24 Stunden nach der letzten Verabreichung des Wirkstoffs wurden
die Mäuse
mit einer Überdosis
an Anästhetika
getötet.
Das Gewicht des Sarkoms in jeder Maus wurde gemessen. Das durchschnittliche
Tumorgewicht jeder Behandlungsgruppe (Wt
i)
und dasjenige der Kontrollgruppe (Wc) wurden berechnet und das Tumorhemmverhältnis (R
i) von jeder Behandlungsgruppe wurde an Hand
der folgenden Formel bestimmt:
B. Ergebnis Tabelle 3. Tumorgewichtsverhältnis (%)
| Gruppe | Mäuseanzahl | Tumorgewicht (g) (M ± SD) | R
(%) | P |
| Kontrolle | 10 | 2,995 ± 0,621 | | |
| Gemisch
0,4 mg/kg | 10 | 1,269 ± 0,525 | 57,63 | < 0,01 |
| Gemisch
1,2 mg/kg | 10 | 0,725 ± 0,270 | 75,79 | < 0,01 |
| Gemisch
3,6 mg/kg | 10 | 0,388 ± 0,130 | 87,04 | < 0,01 |
-
Die
Ergebnisse in der Tabelle 3 haben gezeigt, dass die orale Verabreichung
der zugrunde liegenden Gemischzusammensetzung, das Zwischenprodukt
aus Beispiel 2, Tumorhemmverhältnisse
von 58%, 76% bzw. 87% bei den Dosierungen von 0,4 mg/kg, 1,2 mg/kg
und 3,6 mg/kg erzielt, was eine dosisabhängige Antikrebswirksamkeit
des Gemisches des Zwischenprodukts aus Beispiel 2 zeigt, das die
drei neuen Sapogenine PAM-120, PBM-100 und PAN-30 und einige andere
Saponine und Sapogenine enthält,
dessen Strukturen bekannt oder unbekannt sind.
-
Beispiel 5: Lebensverlängerungstest bei krebsbefallenen
Mäusen
-
A. Verfahren
-
Fünfzig (50)
C57BL/6J Mäuse,
die 18–22
g wogen, wurden ohne Geschlechtsunterscheidung zufällig einer
Kontrollgruppe und vier Behandlungsgruppen mit jeweils 10 Tieren
zugewiesen. Maussarkoma 180 Zellen wurden den Mäusen intraperitoneal transplantiert.
20(S)-Rh2 wurde von Shenyang Pegasus Pharmaceutical R&D Co., China,
mit einer Reinheit von über
98% bereitgestellt. Die Molmasse von Rh2 betrug 622,3. Das neue
Sapogenin PAM-120 wurde aus dem erfindungsgemäßen in Beispiel 2 beschriebenen
Verfahren abgeleitet. Die Molmasse von PAM-120 betrug 442,7 und
die Reinheit für
PAM-120 war höher
als 99%. Die Wirkstoffe wurden jeweils in einer Suspensionsform
hergestellt. Die Mäuse
wurden täglich
vor der Wirkstoffverabreichung gewogen, um die tatsächliche
Bemessung des verabreichten Wirkstoffs zu bestimmen. Die Wirkstoffverabreichung
wurde 24 Stunden nach der Tumorbeimpfung begonnen. Den Mäusen in
den zwei Behandlungsgruppen niedriger Dosierung wurden die Rh2-
und PAM-120-Präparationen
unter Verwendung eines Magenkatheters mit einer täglichen
Dosis von 10 mg/kg Rh2 bzw. 10 mg/kg PAM-120 für eine Lebensdauer von bis
zu 120 Tagen oral verabreicht. Den Mäusen in den zwei Behandlungsgruppen
hoher Dosierung wurden die Rh2- und PAM-120-Präparationen unter Verwendung
eines Magenkatheters mit einer täglichen
Dosis von 25 mg/kg Rh2 bzw. 25 mg/kg PAM-120 für eine Lebensdauer von bis
zu 120 Tagen oral verabreicht. Den Mäusen in der Kontrollgruppe
wurde eine normale Salzlösung
oral verabreicht. Für
jede Gruppe wurden die Tage des Überlebens
für 50%
der Tiere (DS
50) und die durchschnittlichen
Tage des Überlebens
(ADS) aufgezeichnet. Für
Gruppen mit einem oder mehreren Tieren, die länger als 120 Tage hätten überleben
können
(der festgelegte Tötungstag
war der Tag 120), wurde das ADS derart berechnet, dass diese Tiere
so gewertet wurden, als ob sie an dem Tag 120 verstorben wären, und
ein Vermerk wurde gemacht. Die Lebensverlängerungsrate (LPR) wurde an
Hand der folgenden Formel berechnet:
B. Ergebnis Tabelle 4. Lebensverlängerungsrate von Maussarkoma
180 befallenen Mäusen
| Gruppe | DS50 | ADS
(M ± SD) | LPR
(%) |
| Kontrolle | 14 | 14,7 ± 5,4 | |
| Rh2
(10 mg/kg) | 22 | 24,7 ± 12,6 | 68,0 |
| PAM-120
(10 mg/kg) | 38 | 38,6 ± 16,4 | 162,6 |
| Rh2
(25 mg/kg) | 41 | 44,3 ± 19,6 | 201,4 |
| PAM-120
(25 mg/kg) | 77 | 80,6 ± 34,4 | 448,3 |
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Die
Antikrebswirkung des neuen Sapogenins PAM-120 wurde durch den signifikanten
Anstieg in der Lebensverlängerung
der Mäuse,
die von Maussarkoma befallen waren, gezeigt (P < 0,01 verglichen mit den durchschnittlichen
Tagen des Überlebens
bei der Kontrolle). Eine bessere Antikrebswirkung des neuen Sapogenins
PAM-120 bei Maussarkoma als diejenige von Rh2 wurde durch den signifikanten
Anstieg der Lebensverlängerung
der Sarkoma-befallenen Mäuse
gezeigt (P < 0,01
verglichen mit den durchschnittlichen Tagen des Überlebens bei den relevanten
Behandlungsgruppen mit Rh2-Dosierung). Zwei Mäuse in der Behandlungsgruppe
mit 25 mg/kg Zusammensetzung überlebten
während
der gesamten 120 Tage und es wurde bei ihnen festgestellt, dass
nach ihrer Tötung
keinerlei Tumoren in ihren Körpern
vorhanden waren.
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Die 1 stellt
einen Graphen der Tumorhemmwirkung von verschiedenen Ginsenosiden
bei B16 Zellen dar. Maus-Melanomtumor B16 Zellen wurden mit DMEM
und 5% Serumanreicherung in 96-Well-Platten kultiviert. Die Zellen
wurden danach mit verschiedenen Konzentrationen an PAN-20, PAN-30,
PBM-100 (Erfindung), PBM-110, PAM-120 (Erfindung) bzw. Rh2 behandelt.
Die Anzahl von lebenden Zellen wurde unter Verwendung des MTT-Verfahrens
24 Stunden nach der Behandlung gemessen und mit den Kontrollproben
verglichen. Sämtliche
der neuen Verbindungen zeigten eine signifikant höhere Tumorhemmwirkung
als Rh2, insbesondere bei niedrigen Konzentrationen (P < 0,01, Student t
Test).
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Die 2 stellt
einen Graphen der Tumorhemmwirkung von verschiedenen Ginsenosiden
bei Arzneimittel-resistenten menschlichen Brustkrebszellen MCF7r
dar. Menschliche Arzneimittel-resistente Brustkrebszellen (MCF7r)
wurden mit DMEM und 5% Serumanreicherung in 96-Well-Platten kultiviert.
Die Zellen wurden danach mit verschiedenen Konzentrationen an PAN-20,
PAN-10, PAN-12 bzw. Hr2 behandelt. Die Anzahl von lebenden Zellen
Die Anzahl von lebenden Zellen wurde unter Verwendung des MTT-Verfahrens
24 Stunden nach der Behandlung gemessen und mit den Kontrollproben
verglichen. Sämtliche
der neuen Verbindungen zeigten eine signifikant höhere Tumorhemmwirkung
als Rh2, insbesondere bei niedrigen Konzentrationen (P < 0,01, Student t
Test).
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Die 3 zeigt
eine Auftragung der synergistischen Wirkung von PAM-120 mit Cisplatin
bei Arzneimittel-resistenten menschlichen Brustkrebszellen MCF7r.
MCF7r Zellen wurden mit dem chemotherapeutischen Antikrebsmittel
Cisplatin bei verschiedenen Konzentrationen in Gegenwart von 10 μg/ml PAM-120
behandelt. In der 3 stellen die ersten Balken
in jeder Konzentrationsgruppe die Prozentsätze von lebenden Zellen 24
Stunden nach der Behandlung mit nur Cisplatin dar. Die zweiten Balken
in jeder Gruppe stellen die Ergebnisse von mit Cisplatin und PAM-120
behandelten Zellen dar.
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Die 4 zeigt
eine Auftragung der synergistischen Wirkung von PAM-120 mit Taxol
bei Arzneimittel-resistenten menschlichen Brustkrebszellen MCF7r.
MCF7r Zellen wurden mit dem chemotherapeutischen Antikrebsmittel
Taxol bei verschiedenen Konzentrationen in Gegenwart von 10 μg/ml PAM-120
oder 20 μg/ml Rh2
behandelt. In der 4 stellen die ersten. Balken
in jeder Konzentrationsgruppe die Prozentsätze von lebenden Zellen 24
Stunden nach der Behandlung mit nur Taxol dar. Die zweiten Balken
in jeder Gruppe stellen die Ergebnisse von mit Taxol und PAM-120
behandelten Zellen dar, während
die dritten Balken die Ergebnisse von mit 20 μg/ml Rh2 behandelten Zellen
darstellen.
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Die 6 zeigt
einen Graphen der therapeutischen Wirkung von PAM-120 an dem Modell
Maus-subkutanes menschliches malignes Glioma (U87). Nacktmäusen wurden
subkutan menschliche maligne Gliomazellen (U87) implantiert. An
dem Tag 7 nach der Tumorimplantation wurden die Tiere mit 25 mg/ml
PAM-120 oder einer gleichen Dosis Rh2 behandelt. Die Tumorgrößen wurden
an dem Tag 7 (vor der Behandlung) und an dem Tag 24 (nach der Behandlung)
gemessen. Sowohl PAM-120 als auch Rh2 hemmten signifikant das Tumorwachstum
im Vergleich zu PBS-Kontrolltieren. Die Tumorgrößen in mit PAM-120 behandelten
Tieren waren signifikant kleiner als diejenigen in den mit Rh2 behandelten
Tieren (P < 0,05).
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Die 7 zeigt
ein Flussdiagramm von zwei Verfahren, die verwendet werden können, um
die erfindungsgemäßen Sapogenine
zu erhalten.
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Wie
es Fachleuten angesichts der vorstehenden Offenbarung offensichtlich
sein wird, sind viele Änderungen
und Modifikationen bei der Ausführung
dieser Erfindung möglich,
ohne von dem Schutzumfang davon abzuweichen. Dementsprechend ist
der Schutzumfang der Erfindung gemäß der Substanz auszulegen,
die durch die folgenden Ansprüche
bestimmt wird.
