DE19681353B4

DE19681353B4 - Metabolit der Ginseng-Saponine durch menschliche Darmbakterien und seine Zube reitung als Antikrebsmittel

Info

Publication number: DE19681353B4
Application number: DE19681353T
Authority: DE
Inventors: Hasegawa Hideo; Jong Hwan Guri Sung; Matsumiya Satoshi; Uchiyama Masamori; Jae Doo Guri Huh
Original assignee: Happy World Inc; IL HWA CO Ltd GURI; Il Hwa Co Ltd
Current assignee: Happy World Inc; IL HWA CO Ltd GURI; Il Hwa Co Ltd
Priority date: 1996-02-22
Filing date: 1996-12-31
Publication date: 2004-09-30
Anticipated expiration: 2017-01-01
Also published as: DE19681353T1; CN1182433A; US5919770A; KR970061909A; KR0164266B1; WO1997031013A1; CA2218724C; CA2218724A1

Abstract

20-0-[α-L-arabinofuranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol (Ginsenosid Mc) der folgenden Formel:

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Metaboliten der Ginseng-Saponine durch menschliche Darmbakterien und seine Zubereitung als Antikrebsmittel, und insbesondere eine neuartiges Saponin eines Metaboliten des Panax-Ginseng-Saponine durch menschliche Bakterien und eine neuartige Zubereitung des Antikrebsmittels enthaltend ein neuartiges Saponin eines Metaboliten des Panax-Ginseng-Saponins durch menschliche Bakterien, das eine Immunpotenzierungswirkung zeigt, einschließlich Hemmungswirkungen auf die Vaskularisation von Tumoren und die Extravasation von Krebszellen.
In neuester Zeit konzentrierte sich die Entwicklung neuartiger Antikrebsmittel weitgehend auf natürliche Quellen und synthetische Verbindungen.
Von den aus Panax-Ginseng extrahierten Saponinen wurde berichtet, daß das Ginsenosid Rh₂ d[3-0-β-D-glucopyranosyl-20 S)-protopanxadiol] die Proliferation von Leberkrebszellen hemmt (cf. Japanisches Patent Nr. 89-28759).
Im Falle der herkömmlichen Chemotherapien, die ihre therapeutische Wirkung durch direkten Angriff auf die Krebszellen ausüben, sind ihre nachteiligen Auswirkungen ziemlich ernst. Seit mehreren Jahrzehnten sind keine Cytostatika mit neuen Wirkungsmechanismen mehr auf den Markt gekommen. Bei der Anwendung von Panax-Ginseng-Saponinen zur Behandlung verschiedener Krankheiten wird ferner berichtet, daß diese Substanzen durch die Darmbakterien metabolisiert werden und diese Bakterien möglicherweise durch die Konstitution und den Speiseplan des betreffenden Menschen beeinflußt werden. Somit können individuelle Unterschiede im Metabolismus der Saponine zu individuell unterschiedlichen Behandlungen führen.
Im Hinblick auf diese Situation haben die Erfinder den Metabolismus des Ginseng-Saponin im Zusammenhang mit menschlichen Darmbakterien untersucht und es ist ihnen gelungen, die folgenden Verbindungen zu isolieren und zu bestimmen, und zwar a) Protopanaxadiol-Saponin (Ginsenosid Rb₁, Ginsenosid Rb₂ und Ginsenosid Rc,), b) Verbindung K, Verbindung y und die erfindungsgemäße beanspruchte Verbindung [20-0-[α-L-arabinofuranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl-20 (S)-protopanaxadiol], die als Ginsenosid Mc, Metaboliten des Ginsenosid Rd bezeichnet werden, und c) 20 (S)-protopanaxatriol, ein Metabolit des Ginsenosid Rg₁ und Ginsenosid Re, das zum Protopanaxatriol-Saponin gehört.
Der Erfinder stellte fest, daß diese Darmflorametaboliten vom Darmtrakt ins Blut absorbiert werden und über Urin und Stuhl wieder ausgeschieden werden. Durch Sicherstellung, daß diese Darmflorametaboliten Hauptsubstanzen des Panax-Ginseng-Saponin sind, hat der Erfinder die Entwicklung einer therapeutischen Dosierungsform angestrebt, die den Wirkstoff des Saponine enthält und die nicht durch die Unterschiede der Darmbakterien beeinflußt wird. Als Ergebnis der Überprüfung dieser physiologischen Wirkungen hat der Erfinder ein neuartiges Präparat für ein Antikrebsmittel entdeckt, das ein immunpotenzierende Wirkung ausübt, einschließlich Hemmwirkung auf die Vaskularisation von Tumoren und Extravasation von Krebszellen. Somit wurde die Erfindung schließlich vervollständigt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher das Vorsehen von [20-0-α-L-arabinofuranosyl (1→6)-β-D-glucopranosyl-20 (S)-protopanaxadiol] der nachfolgenden Formel, ein neuartiger Ginseng-Saponin-Matabolit, bewirkt durch menschliche Darmbakterien, (genannt Ginsenosid Mc) mit den nachstehenden Merkmalen:

1) Strukturformel:
2.) Bruttoformel: C₄₁N₇₀O₁₂
3.) Das Massenspektrum (FAB-MS, negativ und m/z) zeigte Signale bei 753 [M-H]^–, 621 (M-arabinofuranose-H)^–, und 459 [M-arabinofuranose-glucopyranose-H]^–.
4.) Das H-NMR Spektrum (d5-pyridin) zeigte Signale bei δ3,39 (1H, t, J = 10,5, 5, 1 Hz, H-3), 0,80 (1H, d, J = 11, 0Ohz, H-5), 3,93 (1H, dd-ähnlich, H-12), 5,32 (1H, t, J = 7, 1 Hz, H-24), 0,92 (3H, s, Me-18), 0,89 (3H, S, Me-19), 1,69 (H3, s, Me-21), 1,67 (3H, s, Me-26), 1,67 (3H, s, Me-27), 1,21 (3H, s, Me-28), 1,01 (3H, s, Me-29), 0,99 (3H, s, Me-30), S,10 (JH, d, J = 7, 8Hz, H-1'-20-glucopyranosyl), S,61 (1H, J = 1, 7Hz, H-1''-6'-arabinofuranosyl).
5.) Das ¹³C-NMR Spektrum (d5-pyridin) für den Aglykon-Teil zeigte Signale bei δ39,5 (C-1), 28,3 (C-2), 78,2 (C-3), 39,5 (C-4), 56,5 (C-5), 18,8 (C-6), 35,2 (C-7), 40,2 (C-8), 50,4 (C-9), 37,4 (C-10), 30,8 (C-11), 70,3 (C-12), 49,5 (C-13), 51,5 (C-14), 30,0 (C-15), 26,7 (C-16), 51,8 (C-17), 16,3 (C-18), 16,1 (C-19), 83,2 (C-20), 22,4 (C-21), 36,2 (C-22), 23,2 (C-23), 126,1 (C-24), 131,0 (C-25), 25,8 (C-26), 17,9 (C-27), 28,7 (C-28), 16,4 (C-29), 17,5 (C-30);

Das ¹³C-NMR Spektrum (d5-pyridin) für den 20-glucopyranosyl-Teil zeigte Signale bei 98,1 (C-1'), 75,1 (C-2'), 79,2 (C-3'), 72,2 (C-4'), 76,5 (C-5'), 68,5 (C-6');
Das ¹³C-NMR Spektrum (d5-pyridin) für den 6'-arabinofuranosyl-Teil zeigte Signale bei 110 (C-1''), 83,5 (C-2''), 79,0 (C-3''), 86,3 (C-4''), 62,8 (C-5'').
Das Ginsenosid 'Verbindung Mc' liefert ein Antikrebsmittel zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch unbedenklichen Trägern. Dieser Darmbakterienmetabolit des Ginseng-Saponin zeigt auf die Dauer bemerkenswerte cytostatische Effekte, weil er die hemmende Wirkung auf die Krebszellen in den Lymphzellen potenziert und die Vaskularisation von Tumoren und die Extravasation von Krebszellen hemmt.
Wenn auch die Schwere der Symptome unterschiedlich ist, ist die orale Dosis des erfindungsgemäßen Antikrebsmittels für den Erwachsenen 1–50 mg/60 kg Körpergewicht einmal täglich, oder mehrere Male täglich, vorzugsweise 3–15 mg/Tag/60 kg Körpergewicht.
Das erfindungsgemäße Antikrebsmittel enthält entweder nur einen Wirkstoff oder den Wirkstoff zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch unbedenklichen Trägern wie z. B. Vehikel in fester oder flüssiger Form.
Das Verabreichungsverfahren und die verfügbaren Dosisformen sind wie folgt:

a) Orale Formen: Pulver, Tabletten, Suspensionen, Emulgatoren, Kapseln, Granulat, Pastillen, Pillen, Alkohole, Sirup und Limonasen;
b) Injektionsformen, oder
c) Äußerliche Formen: Salben, Feststoffe, Suspensionen, Pulver, Brie, Zäpfchen, Aerosole, Breiumschläge, Einreibungen, Lotionen, Klistiere und Emulgatoren.

Erfindungsgemäß können wohlbekannte feste oder flüssige Vehikel benutzt werden. Wie oben erwähnt, muß die Zusammensetzung so gemacht werden, daß jeweils der für eine Einzeldosis benötigte Aktivstoff darin enthalten ist. Die verschiedenen Beispiele für die zur Herstellung der Dosis benutzten Vehikel sind wie folgt:

– Pulverförmige Vehikel und sonstige orale Pulver: Lactose, kristallisierte Cellulose, Stärke, Dextrin, Calciumphosphat, Calciumcarbonat, synthetisches und natürliches Aluminiumdioxid, Magnesiumoxid, getrocknetes Aluminiumhydroxid, Magnesiumstearat und Natriumbicarbonat;
– Pulverförmige Vehikel für äußerliche Anwendung: Zinkoxid, Talk, Stärke, Kaolin, Boratpulver, Zinkstearat, Magnesiumstearat, Magnesiumcarbonat, ausgefälltes Calciumcarbonat, Wismutsubgallat und pulverförmiges Kaliumaluminiumsulfat;
– Flüssige Vehikel: Wasser, Glycerin, Propylenglycol, süßsechmeckender Sirup, Ethanol, Fettöl, Ethylenglycol, Polyethylenglycol und D-Sorbit;
– Salbenförmige Vehikel: Wasserabstoßende oder wasserfreundliche Salben (einschließlich öllösliche Salbengrundlage, wasserlösliche Salbengrundlage und Suspensionsgrundlage) hergestellt durch Vermischen von Fett, Fettöl, Lanolin, Vaseline, Glycerin, Wachs, Japan-Wachs, Paraffin, Paraffinsulfat, Harze, höher Alkohole, Kunststoffe, Glycerine, Wasser oder Tenside.

BEISPIEL: Zubereitung des Ginsenosid Mc.
Die suspendierte Lösung der menschlichen Darmflora wurde über Nacht in einem GAM-Medium vorgezüchtet und dann wurden diesem Medium 100 mg Ginsenosid Rc in einem frisch sterilisierten GAM-Medium auf die gewünschte Konzentration von 2% beigemischt und 1 Tag lang bei 37°C bebrütet. Das Medium wurde mit 1-Butanol extrahiert und die extrahierte Lösung wurde mit umgekehrter/nichtumgekehrter Phasenchromatografie konzentriert und gereinigt und ergab schließlich 25 mg reines Ginsenosid Mc.
(Zubereitungsbeispiele)

– Zubereitungsbeispiel 1: Ein Gemisch aus Lactose, kristalliner Cellulose und 14 Magnesiumstearat wurde zu 30 mg Verbindung K, einem Darmflora-Metabolit Ginseng-Saponin zugegeben und homogen gemischt. Das Gemisch wurde in einer Tablettierungsmaschine tablettiert und ergab Tabletten mit jeweils 200 mg.
– Zubereitungsbeispiel 2–4: Auf der Grundlage des gleichen Verfahrens wie vorstehend für die Zubereitung 1 beschrieben, wurde jedes Präparat erzeugt jeweils mit 30 mg Verbindung Y, Ginsenosid Mc bzw. 20 (S)-Protopanaxatrio anstatt 30 mg Verbindung K.
– Zubereitungsbeispiel 5: Eine Lösung von 15 mg Verbindung K, ein Darmflorametabolit des Ginseng-Saponin, und Polysorbit 80 wurden aseptisch in eine sterlisierte Phiole gegeben und nach Ausziehen der Feuchtigkeit wurde das Präparat zur Injektion erhalten.
– Zubereitungsbeispiel 6–8: Auf der Grundlage des gleichen Verfahrens wie in Zubereitung 5 beschrieben, wurde jedes Präparat erhalten, enthaltend jeweils 15 mg Verbindung Y, Ginsenosid Mc zw. 20 ((S)-Protopanaxatriol anstatt 15 mg Verbindung K.

In den nachfolgenden Beispielen werden die physiologischen Wirkungen des erfindungsgemäßen Darmflorametaboliten des Ginseng-Saponin beschrieben, die Schutzbereiche sind jedoch nicht auf die vorliegenden Beispiele beschränkt.
[Versuch 1]
Antitumor-Wirkung an Leukämie-Zellenreihen (P388) in Lymphocyten von Mäusen.
a) Versuchsverfahren
Für diesen Versuch wurden Milzlymphocyten von Mäusen und Leukämiezellenreihen (P388) benutzt. Milzlymphocyten (4 × 10⁶ Zellen) und Leukämiezellen (P388) (2 × 10⁸ Zellen) wurden 16 Stunden in einem Medium (RPMI 1640, ergänzt mit 20 μM Mercaptoethanol und 10% Rinderfötusserum) enthaltend Darmflorametaboliten von Ginseng-Saponin (2,5 μM) in dampfgesättigtem 5%igem CO₂ kultiviert.
Außerdem wurde die gleiche Menge Milzlymphocyten oder Leukämiezellenreihe in einem Medium enthaltend Darmflorametaboliten des Ginseng-Saponin in gleicher Konzentration als Kontrollversuch angesetzt. Die Menge der jeweils überlebenden Zellen wurde durch MTT-Methode bereinigt, um den geschädigten Anteil der Zellen aus den Leukämiezellen (P388) der Lymphocyten zu errechnen.
b) Versuchsergebnisse
Wie in Tabelle 1 gezeigt wird, offenbarten die Versuchsergebnisse, daß alle Darmflorametaboliten des Ginseng-Saponin in geringer Konzentration von 2,5 μM eine Antitumorwirkung zeigten, die 1,6 bis 2 Mal höher war als die der Kontrollgruppe. Tabelle 1. Antitumorwirkung auf Lymphocyten-Krebszellen durch Darmflorametaboliten des Ginseng-Saponin.
[Zweiter Versuch]
Hemmung der Tumorblutvaskularisation (Versuch zur Hemmung der Proliferation)
a) Versuchsmethode
Humanlymphozyten (HL), Leukämiezellenreihe (K562) und Rinderarterien-Endotheliocyten (BAE) wurden für diesen Versuch angesetzt. HL (1 × 10⁵ Zellen), Leukämiezellenreihe (K562) (2 × 10⁵ Zellen) und BAE (5 × 10³ Zellen) wurden kultiviert in einem Medium (HL, K562: RPMI 1640 Medium enthaltend 10% Rinderfötus, BAE: DMEM Medium enthaltend 10% Rinderfötus) enthaltend Darmflorametaboliten des Ginseng-Saponin, konzentriert mit 2mal Verdünnung in dampfgesättigtem 5%igen CO₂ (HL, K562: 24 Std., BAE: 72 Std.) Die Menge der überlebenden Zellen wurde mit MTT Methode bereinigt zur Berechnung einer 50%igen Hemmungskonzentration (IC₅₀), beschädigte Zellenrate (IC₅₀(HL)/IC₅₀(BAE) und IC₅₀(K562)/IC₅₀(BAE).
b) Versuchsergebnisse
Wie in Tabelle 2 ersichtlich, offenbarten die Versuchsergebnisse, daß Ginsenosid Mc und 20(S)-protopanaxatriol eine hemmende Wirkung auf die Proliferation der Tumorzellen ausüben. Tabelle 2. Hemmende Wirkung auf die Proliferation durch Darmflorametaboliten des Ginseng-Saponin
[Versuch 3]
Hemmung der Tumorvaskularisation (Test zur Hemmung der Migration)
a) Versuchsmethode
Für diesen Versuch wurden Rinderarterien-Endotheliocyten (BAE) benutzt . BAE (5 × 10³ Zellen) wurden in einer Pipettierplatte mit 6 Vertiefungen 24 Std. kultiviert und an der Platte haftende Zellen wurden mit einem Rasiermesser abgekratzt. Dieses Medium wurde durch ein neues ersetzt, und nach einer Stunde wurde eine Lösung mit Darmflorametaboliten des Ginseng-Saponin auf die gewünschte Hemmungskonzentration von 10% bzw. 50% zugegeben und 24 Stunden kultiviert. Nach Abschluß der Kultivierung wurden die Zellen mit Methanol fixiert, mit der Giemsa-Methode gefärbt und die von der gelösten Reihe abwandernden Zellen wurden unter dem Mikroskop gezählt.
b) Versuchsergebnisse
Wie in Tabelle 3 gezeigt wird, offenbarten die Versuchsergebnisse, daß jeder Darmmetabolit des Ginseng-Saponin eine hemmende Wirkung auf die Migration ausübte, und unter diesen wurde bemerkt, daß Verbindung K eine stärkere Hemmwirkung auf die Migration ausübte als Suramin (Wako Pure Chem. Ind. Ltd., Japan), eine Kontrollgruppe. Tabelle 3. Migrationshemmung durch Darmflorametaboliten des Ginseng-Saponin.
[Versuch 4]
Hemmung der Extravasation der Grundmembran
a) Versuchsmethode
Die Transwell-Kulturkammer wurde für diesen Versuch mit einer Hapt-Invasionsmethode benutzt (cf. Cancer Res., 47, 3239, (1987)). Die untere Seite eines Filters mir einem Loch von 8,0 μm Durchmesser wurde mit 5 μg Matrigel beschichtet zur Herstellung eines Matrigel/FN-Filters. Human-Adenosarkomgewebezellen (HT1080), die 30 Minuten im Darmflorametabolit des Ginseng-Saponin mit einer Konzentration von 1–1000 μM bei 37°C behandelt wurden, wurden auf die obere Seite jedes Filters mit 1 × 10⁵ Zellen/100 μL gebracht. Dann wurden die Filter zur Pipettierplatte mit 24 Vertiefungen mit 600 μL MEM-Medium, ergänzt durch 0,1% Rinderserum-Albumin, hinzugefügt und dann 4 Std. kultiviert. Nach Abschluß der Kultivierung wurden die Zellen mit Methanol fixiert und mit Hämatoxylin, einem Gewebefärbemittel, gefärbt. Nach dem Abziehen der Zellen an der Oberseite mit einem Wattestab wurden die zur unteren Seite durchfiltrierenden Zellen unter dem Mikroskop gezählt.
b) Versuchsergebnisse
Wie aus Tabelle 4 hervorgeht, offenbaren die Versuchsergebnisse, daß jeder Darmmetabolit des Ginseng-Saponin eine potentere Hemmwirkung auf die Extravasation ausübt als RGDS-Peptide (derzeit in Entwicklung bei Glycomed Co.: Cancer Res., 49, 3815 (1989)), einer Kontrollgruppe, und unter diesen zeigte eine 50%ige Extravasationshemmungskonzentration der Verbindung K eine potente Aktivität in einer niedrigen Konzentration von 3,2 μM. Tabelle 4. Extravasationshemmung der Basismembran durch Darmflorametaboliten des Ginseng-Saponin.
Aus dem obigen geht hervor, daß es bekannt ist, daß Darmflorametaboliten des Ginseng-Saponin, wie z.B. Verbindung K, Verbindung Y, 20(S)-protopanaxatriol einschließlich das erfindungsgemäße Ginsenosid Mc neuartige Typen eines potentiellen Antikrebsmittels sind, da sie immunpotenzierende Wirkung einschließlich Hemmwirkungen auf die Vaskularisation von Tumoren und Extravasation von Krebszellen haben.
Die Toxizität des Ginsenosid Mc, einer neuartigen erfindungsgemäßen Verbindung, ist in mehreren Tierversuchen mit Ratten und Mäusen nahezu vernachlässigbar und die Stabilität des Produkts auf der Grundlage jedes zubereiteten Beispiels ist ganz wirksam.

Claims

20-0-[α-L-arabinofuranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol (Ginsenosid Mc) der folgenden Formel:
Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend die Verbindung gemäß Anspruch 1 zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch unbedenklichen Trägern.