DE3042117A1 - Gynosaponine, verfahren zu ihrer herstellung und diese verbindungen enthaltende arzneipraeparate - Google Patents

Description

"Gynosaponine, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneipräparate"

beanspruchte
Prioritäten:

11. März 1980 - Japan

11- März 1980 - Japan

8. Mai 1980 - Japan

8. Mai 1980 - Japan

8. Mai 1980 - Japan

Nr. 55-30635

Nr. 55-30636

Nr. 55-61507

Nr. 55-61508

Nr. 55-61509

27. September 1980 - Japan - Nr. 55-134684

Die Erfindung betrifft neue Saponine, die aus der japanischen Pflanze "Amachazuru", Gynostemma Pentaphyllum Makino, die zur Gattung Cucurbitaceae gehört, isoliert werden können, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in Arzneipräparaten.

Es ist bekannt, daß einige Pflanzen, wie Panax ginseng, Saponine enthalten. Nagai und.Mitarbeiter berichten, daß Gynostemma pentaphyllum ein Saponin enthält, dessen saure Hydrolyse Panaxadiol als Sapogenin gibt (vgl. The 23rd Meeting (1976) of
Pharmacognosy Society in Japan). Auch M. Takemoto und Mitarbei-

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ter berichten, daß bei der enzymatischen Hydrolyse eines aus der oben angegebenen Pflanze extrahierten Saponins eine "Verbindung K" erhalten wird, die ein Prosapogenin eines aus Panax ginseng isolierten Saponins ist (vgl. The 24th Meeting (1977) of Pharinacognosy Society in Japan) .

Es wurde nun ein Gemisch von Saponinen in praktisch reiner Form sowie eine Gruppe von neuen Saponinen in Einzelform aus Gynostemma pentaphyllum isoliert. Es wurde auch festgestellt, daß diese Saponine einmalige pharmakologische Wirkungen haben.

Gegenstand der Erfindung sind somit Saponine der Formel (I) und deren nicht toxische Salze

GH₂IT

(I)

in der

(a) wenn R eine /ß-D-Glucopyranosyl (1·*2) -oC-L-rhamnopyranosyl(1-»6)_7-ß-D-glycopyranosylgruppe ist, R ein Wasserstoff atom, eine ß-D-Glucopyranosyl (1*6) -ß-D-glucopyranosyl- , eine cxf-L-Rhamnopyranosyl (1·»6)-ß-D-glucopyranosyl- oder ß-D-Glucopyranosyl-

gruppe und R ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe ist,

(b) wenn R eine ß-D-Glucopyranosyl(1>2)-ß-D-glucopyranosyl-

2
gruppe ist, R eine o(-L-Rhamnopyranosyl (1·>6) -ß-D-glucopyranosylgruppe und R ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe

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(c) wenn R eine ot-L-Rhamnopyranosyl (1-»6) -ß-D-glucopyranosyl-

gruppe ist, R eine ß-D-Glucopyranosyl (1 ·>6) -ß-D-glucopyranosyl-,

o(-L-Rhamnopyranosyl( 1*6)-ß-D-glucopyranosyl- oder ß-D-Glucopyranosylgruppe und R ein Wasserstoffatom ist,

1 2

(d) wenn R eine D-Glucopyranosylgruppe ist, R eine ß-D-Xylopyranosyl (1 ->6) -ß-D-glucopyranosyl-, e(-L-Rhamnopyranosy 1 (146)-ß-D-glucopyranosyl- oder ß-D-Glucopyranosyl (1->6) -ß-D-glucopyrano-

sylgruppe und R ein Wasserstoffatom ist,

1 2

(e) wenn R ein Wasserstoffatom ist, R eine ß-D-Glucopyrano-

syl-, ß-D-Xylopyranosyl (1^6)-ß-D-glucopyranosyl- oder ex-L-Rhamnopyranosyl (1->6)-ß-D-glucopyranosylgruppe und R ein Wasserstoff atom oder eine Hydroxylgruppe ist, ausgenommen der Fall,

13 2

in dem R und R Wasserstoffatome und R die ß-D-Glucopyranosyl-

gruppe ist,

(f) wenn R eine ß-D-Xylopyranosyl (1·*2) -ß-D-glucopyranosyl-

2
gruppe ist, R eine ß-D-Xylopyranosyl (1·>6)-ß-D-glucopyranosyl-

oder o<-L-Rhamnopyranosyl(1»6)-ß-D-glucopyranosylgruppe und R ein Wasserstoffatom ist.

Beispiele für Verbindungen der Formel (I) sind: 20S-Protopanaxadiol-3-0-{/"ß-D-glucopyranosyl (1^2) -oO-L-rhamnopyranosyl (1 ^öJ-ß-D-glucopyranosidJ— 20-O-/T3-D-glucopyranosyl (1 ß-D-glucopyranosidT", im folgenden als "Gynosaponin A" bezeichnet. 20S-Protopanaxadiol-3-0-f/ß-D-glucopyranosyl (1 ->2) -<K-L-rhamnopyranosyl (1 -^j/^ß-D-glucopyranosidl^O-O-^-L-rhamnopyranosyl- -ß-D-glucopyranosid_7 : "Gynosaponin B".

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20S-Protopanaxadiol-3-O {/ß-D-glucopyranosyl (1*2) -oi-L-rhamnopyranosyl (1->6)_7-ß-D-glucopyranosid}-20-O-ß-D-glucopyranosid: "Gynosaponin F".

20S-Protopanaxadiol-3-0-/B-D-glucopyranosyl (1 ->2) -ß-D-glucopyranosidJ-SO-O-^-L-rhamnopyranosyl (1 -^6) -ß-D-glucopyranosid/ · "Gynosaponin E".

20S-Protopanaxadiol-3,20-bis-O^<-L-rhamnopyranosyl(146)-ß-D-glucopyranosidj?: "Gynosaponin G".

20S-Protopanaxadiol-3-O-/5^-L-rhamnopyranosyl (1 ->6) -ß-D-glucopyranosid7-20-O-ß-D-glucopyranosid: "Gynosaponin K". 20S-Protopanaxadiol-3-O-ß-D-glucopyranosid-20-O-ZB-D-xylopyranosyl (1-^6)-ß-D-glucopyranosid/: "Gynosaponin I". 20S-Protopanaxadiol-3-O-ß-D-glucopyranosid-20-O-2!?t-L-rhamnopyranosyl(1-*6)-ß-D-glucopyranosid7: "Gynosaponin J". 20S-Protopanaxadiol-20-0-/ß-D-xylopyranosyl(1-»6) -ß-D-glucopyranosid7: "Gynosaponin M".

20S-Protopanaxadiol-20-0-^-L-rhamnopyranosyl (1 *6) -ß-D-glucopyranosid7: "Gynosaponin N".

20S,26-Hydroxyprotopanaxadiol-3-O-{/fß-D-glucopyranosyl (1-^2)- L-rhamnopyranosyl(1->6)J7-ß-D-glucopyranosid}-20-O-^-L-rhamnopyranosyl(1*6)-ß--D-glucopyranosid7: "Gynosaponin Ο". 20S-Protopanaxadiol-3-0-J/Ä-L-rhaInnopyranosyl (1·^6) -ß-D-glucopyranosid7-20-O-/ß-D-glucopyranosyl(1^6)-B-D-glucopyranosidJ^7: "Progynosapogenin A_?".

20S-Protopanaxadiol-3-0- [/ß-D-glucopyranosyl (14-2-o(-L-rhamnopyranosyl (1-»6)_7-ß-D-glucopyranosid): "Progynosapogenin A-AH". 2OS,26-Hydroxyprotopanaxadiol-20-O-ß-D-glucopyranosid: "Progynosapogenin O₁".

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2OS,26-Hydroxyprotopanaxadiol-3-0-/B-D-glucopyranosyl(1*2)-ß-D-glucopyranosid7-20-O-/p<-L-rhamnopyranosyl (146) -ß-D-glucopyra-

nosidj: "Gynosaponin P".

20S-Protopanaxadiol-3-O-/TJ-D-xylopyranosyl (1 *2) -ß-D-glucopyranosid7-20-O-£'B-D-xylopyranosyl (1 -*6) -ß-D-glucopyranosidJ:

"Gynosaponin Q".

20S-Protopanaxadiol-3-O-/"ß-D-xylopyranosyl (1-^2) -ß-D-glucopyra-

nosid_7-20-0-^-L-rhamnopyranosyl (1 *6) -ß-D-glucopyranosid/:

"Gynosaponin R".

20S-Protopanaxadiol-3-O-ß-D-glucopyranosid-20-O-/"ß-D-glucopyra-

nosyl (1·>6)-ß-D-glucopyranosidy J "Gynosaponin S".

2OS , 26-Hydroxyprotopanaxadiol-3-0- i^fß-D-glucopyranosyl (1 -*2) - L-rhamnopyranosyl (1-?6)_7-ß-D-glucopyranosidJ-20-O-^B-D-glucopy-

ranosyl(1-»6)-ß-D-glucopyranosid7: "Gynosaponin T".

2OS, 26-Hydroxyprotopanaxadiol-20-0-/~ß-D-xylopyranosyl (1 -»6) -ß-

D-glucopyranosid7: "Gynosaponin U".

unter den Gynosaponinen der Formel (I) sind die Gynosaponine A, B, E, F, G, I, J, K, M, N, O, P, Q, R, S, T und ü Bestandteile von Gynostemma pentaphyllum und können aus dieser Pflanze oder botanisch entsprechenden Pflanzen nach dem folgenden Verfahren isoliert werden.

Pflanzen, die botanisch Gynostemma pentaphyllum entsprechen, schließen Gynostemma burumacicum King ex Chakravarty, Gynostemma laxum Cogn. und Gynostemma integrifoliola Cogn. ein, die alle zur Gattung Cucurbitaceae gehören.

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Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Isolierung der Saponine der Formel (I), das dadurch gekennzeichnet ist,

Makino

daß man Gynostemma pentaphyllum/oder eine botanisch entsprechende Pflanze der Gattung Cucurbitaceae mit Wasser oder einem wäßrigen niedrigen aliphatischen Alkohol extrahiert, den erhaltenen Extrakt mit einem nicht-ionischen Adsorptionsharz behandelt, die adsorbierte Substanz mit einem niederen Alkohol eluiert, das Eluat mit Aluminiumoxid behandelt, die adsorbierte Substanz mit einem gegebenenfalls Wasser enthaltenden niedrigen aliphatischen Alkohol eluiert und die von anderen Pflanzenbestandteilen praktisch freien Saponine isoliert.

Diese Lösung der Rohsaponine wird dann mit einem Styroladsorptionsharz und/oder Kieselgel behandelt.

Im einzelnen wird dieses Verfahren wie folgt durchgeführt: Zuerst wird die Pflanze mit Wasser oder einem Wasser enthaltenden niederen aliphatischen Alkohol extrahiert, wie Methanol oder Äthanol, die 50 Volumenprozent oder weniger Wasser enthalten. Die Extraktion wird vorzugsweise unter Erwärmen oder Erhitzen durchgeführt. Man kann ganze Teile der Pflanze verwenden, die in herkömmlicher Weise fein geschnitten oder vor der Extraktion entfettet worden sind. Wird ein Wasser enthaltender niederer aliphatischer Alkohol als Extraktionsmittel verwendet, so wird die Extraktlösung vorzugsweise eingeengt, um den Alkohol zu entfernen, dann wird das Konzentrat mit einer entsprechenden Menge Wasser versetzt und mit einem nicht-ionischen Adsorptionsharz behandelt.

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Als nicht-ionisches Adsorptionsharz wird ein hochporöses Styrol-Vinylbenzol-Copolymerisat bevorzugt. Es ist zweckmäßig, den Extrakt durch eine Säule, die mit dem Adsorptionsharz gefüllt ist, durchlaufen zu lassen, wobei die Saponine an dem Harz adsorbiert werden.

Die adsorbierten Saponine werden dann mit einem niederen aliphatischen Alkohol, vorzugsweise Methanol oder Äthanol, eluiert.

Vor dieser Elution wird die Säule vorzugsweise mit Wasser oder

Wasser
einem etwa 20 %/enthaltenden niederen aliphatischen Alkohol

gewaschen.

Das alkoholische Eluat wird mit Aluminiumoxid behandelt. Man kann auch eine Säule, die mit Aluminiumoxid gefüllt ist, verwenden. Vor der Aluminiumoxidbehandlung kann man das alkoholische Eluat einengen. Die adsorbierten Saponine werden mit einem gegebenenfalls Wasser enthaltenden niederen aliphatischen Alkohol, z.B. etwa 50prozentigem wäßrigem Alkohol, eluiert. Das Eluat wird eingeengt? man erhält die rohen Saponine.

Die erhaltenen rohen Saponine sind praktisch frei von anderen* Pflanzeninhaltsstoffen und enthalten die Gynosaponine A, B, E, F, G, I, J, K, M, N, O, P, Q, R, S, T und U. Jedes dieser Gynosaponine kann abgetrennt und gereinigt werden, z.B. nach dem folgenden Verfahren.

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Trennung der Gynosaponine

Die einzelnen Gynosaponine können durch Adsorbieren der Rohsaponine auf einem Styroladsorptionsharz und/oder einem Kieselgel und anschließende Elution erhalten werden. Diese Behandlung wird im allgemeinen auf jedem der Adsorptionsmittel wiederholt, wobei die Reihenfolge Styrolharz-Kieselgel wirkungsvoll ist. Unter Verwendung der Hochdruck-Flüssigchromatographie erreicht man eine schnelle und gute Trennung.

Styrol-Adsorptionsharze Für die Adsorption der Rohsaponine sind im Handel erhältliche / sowie die Kieselgele, die im allgemeinen bei der Säulen- oder Flüssigchromatographie verwendet werden.

Im einzelnen wird das Verfahren wie folgt durchgeführt: Die in Wasser gelösten Rohsaponine werden auf einem Styrolharz adsorbiert, das dann mit einem Gradienten von 20 bis 99 % Methanol eluiert wird. Die eluierten Fraktionen mit 30 bis 40 % Methanol und 45 bis 99 % Methanol werden eingeengt.

Das Konzentrat der 30 bis 40 % Methanol-Fraktionen wird auf Kieselgel adsorbiert und mit Chloroform/niederem aliphatischen! Alkohol/Wasser, vorzugsweise mit der unteren Schicht von Chloroform/Methanol/Wasser im Verhältnis 65:35:10, eluiert. Das Eluat wird unter der Kontrolle von Dünnschichtchromatographie in Fraktion I und Fraktion II getrennt. Fraktion I und II werden mit Kieselgel in herkömmlicher Weise (Eluiermittel: n-Butanol/Äthylacetat/Wasser im Verhältnis 14:3:3) und dann mit einem modifizierten Kieselgel in umgekehrter Weise (Eluiermittel: 35 bis 39 % Äthanol) behandelt. Die Verwendung einer Hoch-

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druck-Flüssigchromatographie-Apparatur ist wirkungsvoll. Gynosaponin P wird aus Fraktion I, Gynosaponin O und T aus Fraktion II erhalten.

Das Konzentrat der Fraktionen mit 40 bis 99 % Methanol wird auf die gleiche Weise auf Kieselgel adsorbiert und vorzugsweise mit der unteren Schicht von Chloroform/Methanol/Wasser in Verhältnis 65:35:10 zu Fraktionen 1 bis 6 eluiert. Durch Behandeln dieser Fraktionen wie oben erhält man Gynosaponin M, N und U aus Fraktion 1, Gynosaponin I, J und K aus Fraktion 2, Gynosaponin G, Q, R und S aus Fraktion 3, Gynosaponin E und F aus Fraktion 4, Gynosaponin B aus Fraktion 5 und Gynosaponin A aus Fraktion 6. Gleichzeitig können die Gynosaponine C, D, H und L, die bekannte Strukturen haben, isoliert werden.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Saponinen der Formel (I), in der an den Substituenten in Stellung 3 und/oder 20 mindestens ein Kohlenhydratrest fehlt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der Formel (I), in der R¹, R² und R
eine Verbindung der Formel (II)

12 3

Formel (I), in der R , R und R wie oben definiert sind, oder

CH₂R

(ID

in der R eine ß-D-Glucopyranosyl(1*2)-ß-D-glucopyranosylgruppe und R eine ß-D-Glucopyranosyl (1 -J-6) -ß-D-glucopyranosyl-,

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ß-D-Xylopyranosyl (1->6) -ß-D-glucopyranosyl- oder ß-D-Glucopyra-

4 ' 5
nosylgruppe ist oder in der R und R beide je eine ß-D-Gluco-

hydrolytisch wirkenden

pyranosylgruppe sind, mit einem/Enzym behandelt und die gewünschte Verbindung isoliert.

Wird die Verbindung der Formel (I) einer enzymatischen Hydrolyse unterworfen, so kann man eine Verbindung der Formel (I) erhalten, in der aus den Substituenten in den Stellungen 3 und/oder 20 mindestens ein Kohlenhydratrest entfernt worden ist.

Das wird dadurch erreicht, daß man die Verbindung der Formel (I) mit einem Enzym behandelt, das die Fähigkeit besitzt, O-glycosidische Bindungen aufzuspalten. Bevorzugte Beispiele für derartige Enzyme sind Hesperidinase, Maltase, Cellulase und Takadiastase. Andere Beispiele sind Naringinase, Pectinase, Amylase und Emulsin. Diese Enzyme können in roher oder in gereinigter Form eingesetzt werden.

Die verwendete Menge an Enzym hängt von der Art des Enzyms ab; für Cellulase z.B. sind etwa 600 bis 1000 Einheiten je g Verbindung der Formel (I) geeignet.

Die enzymatische Reaktion wird vorzugsweise unter sauren Bedingungen, z.B. in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 4, durchgeführt. Der pH-Wert hängt von der Art des Enzyms ab.

Die Reaktionstemperatur kann bei Raumtemperatur oder höher liegen, im allgemeinen sind 30 bis 4O⁰C geeignet. Die Reaktionsdauer hängt von der Art und dem Reinigungsgrad des Enzyms, der

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Reaktionstemperatur und dem zu erreichenden Hydrolysegrad ab, im allgemeinen liegt sie zwischen einigen Stunden und 1 Woche.

Wird die Verbindung der Formel (I) unter diesen Bedingungen hydrolysiert, so wird mindestens 1 Kohlenhydratrest aus den Substituenten in Stellung 3 und 20 entfernt. So können Substituenten in Stellung 3 wie folgt umgewandelt werden: Die Glucopyranosylgruppe in ein Wasserstoffatom, die Glucopyranosylglucopyranosylgruppe oder Rhamnopyranosylgruppe in eine Glucopyranosylgruppe oder ein Wasserstoffatom, die Glucopyranosylrhamnopyranosyl-glucopyranosylgruppe in die Rhamnopyranosylglucopyranosylgruppe, die Glucopyranosy!gruppe oder in ein Wasserstoffatom. Das gleiche gilt für die Substituenten in Stellung 20.

Dementsprechend kann man im erfindungsgemäßen Verfahren einen Kohlenhydratrest durch Wählen geeigneter Bedingungen selektiv entfernen. Man kann aber auch zwei oder mehrere Kohlenhydratrest entfernen. Es ist jedoch wünschenswert, die Hydrolyse zu unterbrechen, so daß ein oder mehrere Kohlenhydratreste erhalten bleiben.

Wird außerdem ein Hydrolysat aus mehreren Verbindungen hergestellt, so kann man dieses in einzelne Verbindungen auftrennen unter Verwendung von Verfahren, die denen der Isolierung und Reinigung von Extrakten der oben angegebenen Pflanze entsprechen. Man kann die Verbindungen der Formel (I) auch in Form eines Gemisches für diese Hydrolyse verwenden.

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Unter den angegebenen Hydrolysebedingungen kann man z.B. Gynosaponin A in Gynosaponin P, Progynosaponin A₂, Gynosaponin K, Ginsenosid F₂ (eine bekannte, aus Panax ginseng isolierte Verbindung) und in "Verbindung K" (ein Prosapogenin eines Saponins von Panax ginseng) umwandeln. Die drei ersten Verbindungen entsprechen der Formel (I).

Wird die Verbindung der Formel (I), in der R das Wasserstoffatom ist, einer sauren Hydrolyse unterworfen, so kann man eine Verbindung erhalten, in der ein oder mehrere Kohlenhydratreste aus den Substituenten in Stellung 20 entfernt worden sind.

Zu diesem Zweck wird die Verbindung der Formel (I) mit einer schwachen Säure umgesetzt, wie einer wasserlöslichen niederen aliphatischen Carbonsäure, z.B. Essigsäure. Besonders bevorzugt ist eine 40- bis 60prozentige wäßrige Essigsäurelösung.

Die Reaktion kann bei Raumtemperatur oder höherer Temperatur durchgeführt werden, z.B. bei 70 bis 8O⁰C. Die Menge an Säure beträgt im allgemeinen 100 bis 1000 Mol, vorzugsweise 270 bis 630 Mol, je Mol Saponine.

Unter diesen Bedingungen werden die Substituenten in Stellung 20 selektiv hydrolysiert, während die Substituenten in Stellung 3 unverändert bleiben. Das heißt, die Glucopyranosyl-, Glucopyranosyl-glucopyranosyl-, Xylopyranosyl-glucopyranosyl- oder Rhamnopyranosylgruppen können in Wasserstoffatome umgewandelt werden.

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Die Trennung der Hydrolysate kann wie oben für die enzymatische Hydrolyse beschrieben durchgeführt werden. Auch die Verbindungen der Formel (I), in der R das Wasserstoffatom ist, können in Form eines Gemisches für die Hydrolyse verwendet werden.

So kann z.B. Gynosaponin A oder B in Progynosapogenin A-AH

2 1

umgewandelt werden (R ist ein Wasserstoffatom und R ist eine ß-D-Glucopyranosy 1 (1 £-2) -et-L-rhamnopyranosyl (1 ->6) -ß-D-glucopyranosy!gruppe).

Die Erfindung betrifft auch Verbindungen der Formel (II)

aus Gynostemma pentaphyllum oder einer botanisch entsprechenden

Pflanze

(II)

in der R eine ß-D-Glucopyranosyl (1 ·*·2) -ß-D-glucopyranosylgruppe und R eine ß-D-Glucopyranosyl(1*6)-ß-D-glucopyranosyl-, ß-D-Xylopyranosyl(1^6)-ß-D-glucopyranosyl- oder ß-D-Glucopyranosylgruppe ist oder in der R und R beide, je eine ß-D-Glucopyranosylgruppe sind.

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Die Erfindung betrifft auch die nicht-toxischen Salze der Verbindungen der Formel (II).

Spezielle Beispiele für Verbindungen der Formel (II) sind: 20S-Protopanaxadiol-3-0-/"ß-D-glucopyranosyl (1 ·*2)-ß-D-glucopyranosid7-20-O-/"B-D-glucopyranosyl (1*6) -ß-D-glucopyranosid, im folgenden als "Gynosaponin C" bezeichnet. 20S-Protopanaxadiol-3-0-/B-D-glucopyranosyl(1*2)-ß-D-glucopyranosid7-20-O-£B-D-xylopyranosyl(1 ·>6)-ß-D-glucopyranosidJ' "Gynosaponin D".

20S-Protopanaxadiol-3-O-/"ß-D-glucopyranosyl (1*2) -ß-D-glucopyranosicl7-20-O-ß-D-glucopyranosid: "Gynosaponin H". 20S-Protopanaxadiol-3,20-di-(O-ß-D-glucopyranosid) : "Gynosaponin L".

Diese Gynosaponine der Formel (II) kann man dann erhalten, wenn die Verbindungen der Formel (I) nach dem oben beschriebenen Verfahren isoliert werden.

Die Gynosaponine der Formel (IiQ können in andere Saponine durch Hydrolysieren der Kohlenhydratkette umgewandelt werden. So erhält man z.B. bei einer enzyrnatischen Hydrolyse von Gynosaponin C Gynosaponin H, Gynosaponin L und Progynosapogenin A.

(d.h. die Verbindung der Formel (I), in der R das Wasserstoff-

2 3

atom, R die ß-D-Glucopyranosylgruppe und R das Wasserstoffatom ist; Fp. 154-156°C). Durch enzymatische"Hydrolyse von Gynosaponin D erhält man die Gynosaponine H, I und M sowie Progynosapogenin A.. . Die enzymatische Hydrolyse wird im einzelnen wie für die Verbindungen der Formel (I) beschrieben durch-

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geführt.

Auch eine saure Hydrolyse der Verbindungen der Formel (II) erfolgt unter den gleichen Bedingungen wie für die Verbindungen der Formel (I); man erreicht an den Substituenten in Stellung 20 eine selektive Abspaltung, wogegen die Substituenten in Stellung 3 unverändert bleiben. Das heißt, die Glucopyranosyl-, Glucopyranosyl-glucopyranosyl- oder Xylopyranosyl-glucopyranosylgruppen der Substituenten in Stellung 20 können in Wasserstoff atome umgewandelt werden.

Erhält man bei der Hydrolyse ein Gemisch von Hydrölysaten, so kann man ein Verfahren zur Isolierung wie für die Verbindungen der Formel (I) oder (II) beschrieben auch auf die Hydrolysate anwenden.

Als nicht-toxische Salze der Verbindungen der Formel (I) oder (II) sind pharmakologisch verträgliche Salze, wie die Alkalimetallsalze, z.B. Natrium- oder Kaliumsalze, und die Erdalkalimetallsalze, z.B. Calcium- und Magnesiumsalze, geeignet.

Die Erfindung betrifft daher ferner Arzneipräparate, die durch einen Gehalt an mindestens einer Verbindung der Formel (I) oder deren nicht-toxischen Salzen in Kombination mit pharmakologisch verträglichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln gekennzeichnet sind. Die Arzneipräparate können aber auch das Gemisch der extrahierbaren Saponine als Wirkstoff enthalten.

Die aus Gynostemma pentaphyllum isolierten Saponine wirken auf die Zellen von Menschen und Tieren und sind als Antiulcusmittel, als Mittel zur Vermeidung von Nebeneffekten von Glucocorticoi-

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den, als Zellaktivator, als Antitumormittel und als Mittel zur Aktivierung des Lipiditietabolismus geeignet. Sie wirken auch auf das zentrale Nervensystem und sind als Mittel zur Verbesserung des Allgemeinzustandes, als Sedidativ und als Hypnotikum brauchbar.

Im allgemeinen wird aus wirtschaftlichen Erwägungen bevorzugt, diese Saponine eher in Form eines Gemisches zu verwenden als in Form der einzelnen Saponine. Der Ausdruck "Saponine" bedeutet im weiteren ein Gemisch, das im wesentlichen nur aus Saponinen besteht.

Die Saponine haben einen extrem niedrigen Toxizitätsgrad. Bei der intraperitonealen Verabreichung an Mäuse beträgt die LD₅₀ 755 mg/kg. Bei der Verabreichung der Saponine an Menschen zeigen sich keine beobachtbaren . Nebeneffekte.

Die erf indungsgeniäßen Arzneipräparate können entweder oral oder als Injektion parenteral verabreicht werden. Sie enthalten die Saponine und einen Feststoff oder eine Flüssigkeit oder einen Träger.

Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Arzneipräparate für die interne Verabreichung konfektioniert. So ein Präparat für die interne Verabreichung kann als Pulver, Tablette, Emulsion, Kapsel, Tee, Granulat oder Flüssigkeit einschließlich eines flüssigen Extrakts oder eines Sirups vorliegen.

Beispiele für Hilfsstoffe, die für die internen Präparate ver-

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wendet werden können, sind Lactose, Stärke, Dextrin, Calciumphosphat, Calciumcarbonat, synthetisches und natürliches Aluminiumsilikat, Magnesiumoxid, entwässertes Aluminiumhydroxid, Magnesiumstearat, Natriumbicarbonat und Trockenhefe, zur Herstellung eines Pulvers oder eines gepulverten Präparats. Beispiele von Hilfsstoffen für die Herstellung eines Pulvers für den externen Gebrauch sind Zinkoxid, Talcum, Stärke, Kaolin, Borsäurepulver, Zinkstearat, Magnesiumstearat, ausgefälltes Calciumcarbonat, WismutdigaUat und Kaliumaluminiumsulfat-Pulver. Für ein flüssiges Präparat kann man Hilfsmittel, wie Wasser, Glycerin, Propylenglykol, einfachen Sirup, Äthanol, fette öle Äthylenglykol, Polyäthylenglykol und Sorbit verwenden.

Wasser
Sterilisiertes destilliertes/kann z.B. als flüssiger Träger

für die Herstellung einer Injektion verwendet werden.

Beispiele für Dosisformen für den externen Gebrauch können Suppositorien, Salben, Lösungen, Pulver, Umschläge, Sprays, Klistiereoder eine Emulsion sein. Die festen oder flüssigen Hilfsstoffe für diese Art der Präparate sind an sich bekannt, so kann man für eine Salbe eine hydrophobe oder hydrophile Grundlage verwenden, einschließlich einer 'Emulsion oder Suspension oder einer wasserlöslichen Grundlage, die durch Kombinieren von Fett, fettem öl, Lanolin, Vaseline, gelbem Wachs, Pflanzenwachs, Paraffin, flüssigem Paraffin, einem Harz, einem höheren Alkohol, Kunststoffen, Glykolen, Wasser und einem Netzmittel hergestellt werden.

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Auch an sich bekannte übliche Zusatzstoffe können für die erfindungsgemäßen Arzneipräparate verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen Präparate können in an sich jeder bekannten Weise hergestellt werden; es ist jedoch wünschenswert sicherzustellen, daß jede Dosisform eine einzige Dosis der erfindungsgemäßen Saponine enthält. Diese Präparate werden selektiv in der am besten geeigneten und passenden Form für den gewünschten Zweck verwendet, wobei die Dosis der Saponine bis zu einem gewissen Grad von dem gewünschten Zweck abhängt.

Die erfindungsgemäßen Saponine sind als Sedidativ oder Hypnotikum, als Mittel zur Verbesserung des Allgemeinzustandes und als Zeilaktivator zur Verhinderung des Alterns und zur Beseitigung von Müdigkeit geeignet. Diese Wirkungen der Saponine erreicht man, wenn ein Erwachsener zwei·³ bis dreimal täglich eine Gesamtmenge von 20 bis 500mg, vorzugsweise 50 bis 300 mg täglich einnimmt, entweder oral oder parenteral. Für die orale Verabreichung sind die oben angegebenen Präparatformen geeignet; für eine parenterale Verabreichung sind Injektionen, Suppositorien oder eine hydrophile: Salbe für die Absorption durch das Rektum oder die Schleimhäute geeignet. Für jede Verabreichungsform ist eine Konzentration der Saponine von 5 bis 5 0 mg/ml für eine Injektion und 0,1 bis 10 Gewichtsprozent für ein Zäpfchen oder eine Salbe wünschenswert.

Die erfindungsgemäßen Saponine sind auch als Heilmittel für Ulcera beim Menschen sehr geeignet, besonders angebracht sind sie zur Heilung eines gastrischen oder Duodenalulcus. Die für

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-»· 0V γ ~ ^w-

diesen Zweck benötigte Dosis an Saponinen hängt von der Schwere der Krankheit ab; in jedem Fall beträgt sie bei einem Erwachsenen bei interner Verabreichung 50 bis 1000 mg, vorzugsweise 100 bis 250 mg täglich auf -zwei- bis dreimal.

Die erfindungsgemäßen Saponine sind auch als Antitumormittel beim Menschen geeignet. Die für diesen Zweck geeignete Dosis hängt von der Schwere der Krankheit ab; im allgemeinen beträgt sie 50 bis 1000 mg, vorzugsweise 100 bis 300 mg täglich in zwei bis drei Dosen bei einem Erwachsenen. Man kann das Präparat in jeder Form verabreichen, entweder als internes Präparat, Injektion oder externes Präparat, abhängig von der Art der Krankheit.

Die erfindungsgemäßen Saponine können für fast alle Arten von Tumoren verwendet werden, einschließlich Krebs, wie Krebs des Magens, des Rektums, der Brust, der Gebärmutter, des Mundes, des Oesophagus, der Gallenblase, der Gallengänge, des Pankreas, Cholangioma, Nierentumor, Prostatacarzinom, bösartigem Tumor der Schilddrüse, Lungenkrebs, zerebralem Tumor, Leberkrebs, Zungenkrebs, bösartigen Thymoma, Hautkrebs und Sarkoma.

Glucocorticoide, z.B. Cortison, die zur den ädrenocortikalen Hormonen gehören und vielfach als Mittel zum Schutz eines Organismus vor Streß verwendet werden, nehmen an der Umwandlung der Proteine zu Kohlenhydraten und am Lipidmetabolismus teil. Die kontinuierliche Verwendung dieser Mittel verursacht jedoch schwere Störungen an den internen Organen, wie eine Atrophie der Adrenocortex, wobei zur gleichen Zeit verschiedene Neben-

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effekte auftreten, bekannt unter dem Namen Cushing's Syndrom, einschließlich anormaler Fettablagerung oder Ödeme im Gesicht, Hals oder Körper, wie Mondgesicht oder Stiernacken, anormale Appetitzunahme, Erhöhung des Körpergewichts, Pigmentation in der Haut und in den Nägeln, Verhornung der Haut, Hyperglykämie, Hypertension, Abnahme der Muskelkraft, Hypokalämie und Verschlechterung von eventuell vorhandenen ülcera. *

Werden die erfindungsgemäßen Saponine in Kombination mit einem Glucocorticoid verwendet, so können die Saponine jede schwerwiegende Störung, die durch die Glucocorticoide in den internen Organen verursacht worden ist, heilen oder verhindern. Das heißt, die erfindungsgemäßen Saponine haben eine deutliche Wirkung gegen die durch die Verwendung von Glucocorticoiden verursachte Adrenoatrophie und der damit verbundenen Reduktion der Plasmacortisolmenge. Deshalb sind die erfindungsgemäßen Saponine zur Heilung von Störungen, die von einer Adrenoatrophie verursacht sind,und den damit verbundenen Nebeneffekten geeignet.

Die geeignete Dosis an Saponinen zur Heilung jeder Krankheit, die auf den Nebeneffekten von Glucocorticoiden beruht, hängt von der Schwere der Krankheit ab. Im allgemeinen werden einem Erwachsenen intern drei- bis viermal täglich 5 bis 500 mg, vorzugsweise 10 bis 250 mg verabreicht.

Die verabreichte Menge an Glucocorticoid hängt von der verwendeten Verbindung sowie von der Schwere der Krankheit ab. So werden z.B. bei Cortison, das ein typisches Glucocorticoid ist, im allgemeinen Mengen von 5 bis 30 mg täglich verabreicht, ob-

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wohl gelegentlich am Anfang einer Behandlung eines an einer akuten Erkrankung leidenden Patienten auch Mengen von 200 bis 400 mg täglich verwendet werden können.

Werden ein Glucocorticoid und die Saponine zusammen verwendet, so werden sie vorzugsweise in eine einzige Dosisform einverleibt. Für diesen Zweck ist jede in der Glucocorticoid-Therapie bekannte Dosisform geeignet; eine orale oder parenterale Verabreichung ist zufriedenstellend.

Ein Präparat für die orale Verabreichung sollte vorzugsweise 5 bis 100 mg Saponine und 0,5 bis 10 mg eines Glucocorticoids je g oder Tablette enthalten. Ein Präparat für die parenterale Verabreichung sollte vorzugsweise 0,1 bis 10g Saponine und 0,05 bis 1 g eines Glucocorticoids je 100 ml Lösung enthalten. Eine Injektion für parenterale Verabreichung sollte vorzugsweise 5 bis 50 mg Saponine und 1 bis 20 mg eines Glucocorticoids je ml enthalten.

Sollte es wünschenswert sein, die Saponine allein zu verabreichen, so kann man dafür jede Dosisform, entweder ein internes oder externes Präparat oder eine Injektion, verwenden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

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Beispiel 1

2 kg getrocknete Gesamtteile von Gynostenuna pentaphyllum werden zweimal unter Erhitzen mit 30 Liter Wasser extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden durch eine Säule, die mit 4 Liter Styrol-Vinylbenzol-Copolymerisat gefüllt ist, durchgeleitet. Nach dem Waschen der Säule mit 10 Liter Wasser und 6 Liter 20prozentigem Methanol werden die adsorbierten Substanzen mit 5 Liter Methanol eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft? man erhält 37 g eines gelblichbraunen Pulvers.

Eine Lösung dieses Pulvers in 1 Liter Methanol wird durch eine Säule, die mit 300 g Aluminiumoxid gefüllt ist, geleitet. Die adsorbierten Substanzen werden mit etwa 20 Liter 50prozentigem Methanol eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt; man erhält 25 g Rohgynosaponine als schwachgelbes Pulver.

Eine Lösung von 20 g Rohgynosaponinen in 1 Liter Wasser wird durch eine Säule geleitet, die mit 600 ml eines Styroladsorptionsharzes gefüllt ist. Die adsorbierten Substanzen werden mit 20-bis 99prozentigem Methanol eluiert, wobei der Methanolgehalt stufenweise von 20 auf 99 % erhöht wird. Die bei einem Methanolgehalt von 45 bis 99 % eluierten Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Man erhält 16g eines schwachgelben Pulvers.

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Das Pulver wird an einer Kieselgelsäule (300 g) chromatographiert und mit je 100 ml der unteren Phase eines Gemisches von Chloroform/Methanol/Wasser im Verhältnis 65:35:10 eluiert. Durch Kontrolle mittels Dünnschichtchromatographie erhält man die Fraktionen 1 bis 6.

Jede dieser Fraktionen 1 bis 6 wird zur Trockene eingedampft. Jedes Konzentrat der Fraktionen 1 bis 3 wird an einer Kieselgelsäule (100 g) chromatographiert und mit der unteren Phase eines Gemisches aus Chloroform/Methanol/Äthylacetat/Wasser im Verhältnis 2:2:4:1 eluiert. Dieses Verfahren wird zweimal wiederholt. Man erhält 60 mg Gynosaponin M und 160 mg Gynosaponin N aus Fraktion 1 (1,1 g), 60 mg Gynosaponin I, 120 mg Gynosaponin J und 110 mg Gynosaponin K aus Fraktion 2 (1,0 g) und 450 mg Gynosaponin G aus Fraktion 3 (1,0 g).

Jedes Konzentrat aus den Fraktionen 4 und 5 wird an einer Kieselgelsäule (200 g) mit der oberen Phase eines Gemisches aus n-Butanol/Äthylacetat/Wasser im Verhältnis 4:1:2 dreimal chromatographiert. Man erhält 350 mg Gynosaponin D', 1500 mg Gynosaponin E und 80 mg Gynosaponin F aus Fraktion 4 (3,4 g) und 220 mg Gynosaponin B sowie 240 mg Gynosaponin C aus Fraktion 5 (2,5 g).

Außerdem erhält man durch zweifache Säulenchromatographie (100 g Kieselgel mit der unteren Phase von Chloroform/Methanol/Wasser im Verhältnis 65:35:10) 510 mg Gynosaponin A.

Die physikalischen Eigenschaften dieser Gynosaponine sind in den Tabellen I und II"zusammengestellt.

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Beispiel 2

getrocknete
2 kg/Gesamtteile von Gynosteituna pentaphyllum werden unter Erhitzen zweimal mit 30 Liter Wasser extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden durch eine Säule, die mit 4 Liter Styrol-Vinylbenzol-Copolymerisat (mittlerer Teilchendurchmesser: 0,45 bis 0,60 mm) gefüllt ist, geleitet. Nach dem Waschen mit 10 Liter Wasser und 6 Liter 20prozentigem Methanol werden die adsorbierten Substanzen mit 5 Liter 99prozentigem Methanol eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft; man erhält 37 g eines gelblich-braunen Pulvers. Eine Lösung dieses Pulvers in 1 Liter 99prozentigem Methanol wird durch eine Säule geleitet, die mit 300 g neutralem Aluminiumoxid (70 bis 290 Maschen) gefüllt ist. Die adsorbierten Substanzen werden mit etwa 20 Liter 50prozentigem Methanol eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft; man erhält 25 g einer Rohgynosaponin-Fraktion als schwachgelbes Pulver.

Eine Lösung von 20 g Rohgynosaponine in 1 Liter Wasser wird durch eine Säule geleitet, die mit 600 ml Styroladsorptionsharz (mittlerer Teilchendurchmesser: 100 bis 200 μ) gefüllt ist. Die adsorbierten Substanzen werden mit 20-bis 99prozentigern Methanol eluiert, wobei der Methanolgehalt durch 5 %-Stufen von 20 auf

99 % erhöht wird. Die bei einem Methanolgehalt von 30 bis 40 % eluierten Fraktionen (40 Liter) sowie die bei 45 bis 99 % Methanol eluierten Fraktionen werden unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Man erhält 2 bzw. 16 g eines schwachgelben

Pulvers. Die 2 g der 30 bis 40 %-Methanolfraktion werden in einem Minimum an 99prozentigem Methanol gelöst und mit 4 g Kieselgel vermischt. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck

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zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird auf eine Säule aufgegeben, die mit 200 g (trocken) Kieselgel (230 bis 400 Maschen ASTM) gefüllt ist, und mit der unteren Phase eines Gemisches von Chloroform/Methanol/Wasser im Verhältnis 65:35:10 elüiert. Man erhält die Fraktionen I und II durch Kontrolle mittels Dünnschichtchromatographie (Adsorbens:Kieselgel, Entwicklungsmittel: die untere Phase von Chloroform/Methanol/Wasser im Verhältnis 65:35:10, Nachweismittel: 30prozentige Schwefelsäure) . Jede der Fraktionen I und II wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Etwa 0,7 g Fraktion I und etwa 0,9 g Fraktion II werden getrennt einer Hochdruck-Flüssigchromatographie unterworfen, wobei ein Chromatograph (Waters Co. ALC/GPC-Typ) mit der unten beschriebenen Säule verwendet wird. Die Eluate werden mittels Dünnschichtchromatographie kontrolliert. Man erhält 120 mg Gynosaponin P aus Fraktion I und 150 mg Gynosaponin 0 sowie 60 mg Gynosaponin T aus Fraktion II.

Für die Chromatographie wurden vier Porasil A-Säulen (37 bis 75 μ, 7 mm χ 61 cm, von Japan Waters Ltd.) und zwei Nucleosil-30-C.g-Kolonnen (30_+4μ, 7 mm χ 61 cm, M-NAGEL, BRD) verwendet, die mobilen Phasen waren ein Gemisch von n-Butanol/Äthylacetat/ Wasser im Verhältnis von 14:3:3 bzw. 35- bis 39prozentiges Äthanol.

16g der 45 bis 99 % Methanolfraktion werden in einem Minimum an 99prozentigem Methanol gelöst und mit 30 g Kieselgel vermischt. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird auf eine Säule, die mit 300 g Kieselgel (trocken) gefüllt ist, aufgegeben und dann mit der

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unteren Phase eines Gemisches von Chloroform/Methanol/Wasser im Verhältnis 65:35:10 eluiert. Man erhält die Fraktionen 1 bis 6, wobei die Eluate mittels Dünnschichtchromatographie kontrolliert wurden (Adsorptionsmittel:Kieselgel/ Lösungsmittel: die untere Phase von Chloroform/Methanol/Wasser im Verhältnis 65:35:10, Nachweismittel: 30prozentige Schwefelsäure). Jede der Fraktionen 1 bis 6 wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft.

Etwa 1,1 g der Fraktion 1, etwa 1,1 g der Fraktion 2 und etwa 1,0 g der Fraktion 3 werden je in einem Minimum an 99prozentigem Methanol gelöst und mit 3 g Kieselgel gerührt. Jedes der Gemische wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Jeder Rückstand wird auf eine Säule aufgegeben, die mit 100 g Kieselgel (trocken) gefüllt ist, und dann mit der unteren Phase eines Gemisches von Chloroform/Methanol/Äthylacetat/Wasser im Verhältnis von 2:2:4:1 eluiert. Dieses Verfahren wird zweimal wiederholt; man erhält 350 mg Gynosaponin L, 60 mg Gynosaponin M und 160 mg Gynosaponin N aus der Fraktion 1, 150 mg Gynosaponin H, 60 mg Gynosaponin I, 120 mg Gynosaponin J und 110 mg Gynosaponin K aus der Fraktion 2 sowie 450 mg Gynosaponin G aus der Fraktion 3.

Jeder Rückstand nach dieser Behandlung der Fraktionen 1 bis 3 wird einer Hochdruck-Flüssigchromatographie unter Verwendung des Chromatographen mit den unten angegebenen Säulen unterworfen. Man erhält 30 mg Gynosaponin U aus dem Rückstand der Fraktion 1, 25 mg Gynosaponin Q, 40 mg Gynosaponin R und 30 mg Gynosaponin S aus dem Rückstand der Fraktion 3.

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Als Säulen werden vier Porasil A-Säulen (7 mm χ 61 cm) und als mobile Phase n-Butanol/Äthylacetat/Wasser im Verhältnis 14:3:3 sowie zwei Nucleosil 30-C. g-Säulen (7 mm χ 61 cm) mit einer mobilen Phase'von 40 bis 45 % Äthanol verwendet.

Etwa 3,4 g der Fraktion 4 und etwa 2,5 g der Fraktion 5 werden in einem Minimum an 99prözentigem Methanol gelöst und gut mit 6 g Kieselgel vermischt. Jedes Gemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Jeder Rückstand wird auf eine Säule aufgegeben, die mit 200 g Kieselgel (trocken) gefüllt ist, und dann mit der. oberen Phase des Gemisches von n-Butanol/ Äthylacetat/Wasser im Verhältnis 4:1:5 eluiert. Dieses Verfahren wird zweimal wiederholt; man erhält 350 mg Gynosaponin D, 1500 mg Gynosaponin E und 80 mg Gynosaponin F aus Fraktion 4 sowie 220 mg Gynosaponin B und 240 mg Gynosaponin C aus Fraktion 5.

Außerdem werden etwa 0,9g der Fraktion 6 mit der unteren Phase eines Gemisches von Chloroform/Methanol/Wasser im Verhältnis 65:35:10 wie oben eluiert. Man erhält 510 mg Gynosaponin A.

Die physikalischen Eigenschaften dieser Gynosaponine sind in den Tabellen I und II zusammengestellt.

Die Gynosaponine C, D, H und L sind mit den Ginsenosiden -Rb₁, -Rb_, -Rd und -F- der Ginseng-Saponine identisch, was durch direkten Vergleich der physikalischen Eigenschaften und der NMR-Daten gezeigt wird.

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Beispiel 3

Eine Lösung von 250 mg Gynosaponin A in 50 ml einer wäßrigen Lösung von 0,005 m Natriumdihydrogenphosphat, pH 4,0, wird mit 500 mg Rohhesperidinase (Tanabe Seiyaku Co., Ltd.) versetzt. Das Gemisch wird 6 h bei 37 bis 38°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird durch eine Säule geleitet, die mit 50 ml Styroladsorptionsharz gefüllt ist. Nach dem Waschen mit 1 Liter Wasser und 2 Liter 20prozentigem Methanol werden die adsorbierten Substanzen mit 300 ml Methanol eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt, das Konzentrat wird auf eine Kieselgelsäule aufgegeben und mit der unteren Phase eines Gemisches von Chloroform/Methanol/Wasser im Verhältnis 65:35:10 eluiert. Man erhält 20 mg Gynosaponin P, 15 mg Gynosaponin K und 35 mg Progynosaponin A~. Die Gynosaponine F und K sind gemäß dem Vergleich der IR- und NMR-Daten mit den Standardproben, die gemäß Beispiel 1 erhalten wurden, identisch.

Die physikalischen Eigenschaften des Progynosaponins A₂ sind in den Tabellen I und II beschrieben.

Beispiel 4

Eine Lösung von 150 mg Gynosaponin A in 10 ml 50prozentiger Essigsäure wird 6 h bei 70⁰C gerührt. Das Gemisch wird durch eine Säule geleitet, die mit 50 ml Styroladsorptionsharz gefüllt ist. Man erhält etwa 100 mg der Prosapogeninfraktion. Diese Fraktion wird an einer Kieselgelsäule chromatographiert und mit der unteren Phase eines Gemisches von Chloroform/Methanol/ Äthylacetat/Wasser im Verhältnis 2:2:4:1 eluiert. Man erhält 35 mg Progynosaponin A-AH.

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Die physikalischen Eigenschaften dieses Produkts finden sich in Tabellen I und II.

Beispiel 5

400 mg Gynosaponin A werden in 50 ml einer wäßrigen Lösung von 0,005 m Natriumdihydrogenphosphat, pH 4,0, gelöst und mit 300 mg Cellulase (Sigma Co.) versetzt. Das Gemisch wird 24 h bei 37 bis 38°C gerührt, dann wie in Beispiel 2 beschrieben aufgearbeitet. Man erhält 110 mg Gynosaponin K, 35 mg Gynosaponin L und 20 mg Progynosapogenin A₁. Die Gynosaponine K und L sind gemäß dem Vergleich der IR- und NMR-Daten mit den Standardproben, die gemäß Beispiel 1 erhalten wurden, identisch. Auch das Progynosapogenin A₁ entspricht der Verbindung K, die man durch enzymatische Zersetzung des Ginseng-Saponins erhalten kann.

Beispiel 6

1,4 g eines Gemisches von Gynosaponin B und Gynosaponin C werden in 200 ml einer wäßrigen Lösung von 0,005 m Natriumdihydrogenphosphat, pH 4,0, gelöst und mit 600 mg Cellulase versetzt. Das Gemisch wird 7 h bei 37 bis 38°C gerührt, dann an einer Säule, die 80 ml Styroladsorptionsharz enthält, chromatographiert. Man erhält etwa 1,1 g eines Hydrolysate, das auf eine Kieselgelsäule aufgegeben und mit der unteren Phase von Chloroform/Methanol/Äthylacetat/Wasser im Verhältnis 2:2:4:1 eluiert wird. Man erhält 17 mg Progynosapogenin A-, 190 mg Gynosaponin L, 140 mg Gynosaponin K und 550 mg eines Gemisches von Gynosaponinen F, G und H. Dieses Gemisch wird wiederum auf eine Kieselgelsäule aufgegeben und mit der unteren Phase von Chloroform/Methanol/Wasser im Verhältnis 65:35:10 etuiert. Man erhält

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50 mg Gynosaponin F, 150 mg Gynosaponin G und 210 mg Gynosaponin H. Diese Gynosaponine sind gemäß dem Vergleich der IR- und NMR-Daten mit den Standardproben identisch.

Beispiel 7

Eine Lösung von 300 mg eines Gemisches von Gynosaponinen B und C in 10 ml 50prozentiger Essigsäure wird 6 h bei 7O⁰C gerührt. Das Gemisch wird durch eine Säule geleitet, die mit 50 ml Styroladsorptionsharz gefüllt ist. Man erhält eine Prosapogeninfraktion, die auf eine Kieselgelsäule aufgegeben wird und mit der unteren Phase eines Gemisches von Chloroform/Methanol/ Wasser im Verhältnis von 65:35:10 eluiert wird. Man erhält 30 mg des Progynosapogenins A-AH und 70 mg des Progynosapogenins E-AH. Dieses Progynosapogenin A-AH ist gemäß dem Vergleich der IR- und NMR-Daten mit der Standardprobe identisch, die gemäß Beispiel 4 erhalten wurde. Das Progynosapogenin E-AH ist mit dem Ginsenosid-Rg~ identisch, das man durch Hydrolyse von Ginseng-Saponin mit 50prozentiger Essigsäure erhält.

Beispiel 8

2 g eines Gemisches von Gynosaponinen D und E werden in 0,005 m Natriumdihydrogenphosphat, pH 4,0, gelöst und mit 1 g Cellulase versetzt. Das Gemisch wird 20 h bei 37 bis 38⁰C gerührt, dann an einer Säule, die mit 80 ml Styroladsorptionsharz gefüllt ist, chromatographiert. Man erhält etwa 1,6 g eines Hydrolysate, das auf eine Kieselgelsäule aufgegeben und mit dor · unteren Phase eines Gemisches von Chloroform/Methanol/Äthylacetat/Wasser im Verhältnis von 2:2:4:1 eluiert wird. Man erhält 20 mg Gynosaponin H, 355 mg. Gynosaponin I, 250 mg Gynosaponin J, 80 mg Gyno-

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saponin M, 90 mg Gynosaponin N und weitere 70 mg Progynosapogenin A..

Durch Vergleich der IR- und NMR-Daten zeigt sich, daß diese Saponine mit den Standardproben identisch sind.

Beispiel 9

5 mg Gynosaponin E werden in 1 ml 0,005 m wäßriger Natriumdihydrogenphosphatlösung, pH 4,0, gelöst und mit 10 mg Cellulase versetzt. Das Gemisch wird 4 h bei 37 bis 38°C gerührt. Durch Dünnschichtchromatographie wird bestätigt, daß sich in diesem Reaktionsgemisch die Gynosaponine H, L und N und das Progynosapogenin A. gebildet haben.

Beispiel 10

Eine Lösung von 350 mg Gynosaponin E in 10 ml 50prozentiger Essigsäure wird 6 h bei 70⁰C gerührt, dann wie in Beispiel 4 beschrieben behandelt. Man erhält etwa 210 mg einer Prosapogeninfraktion, die in einer minimalen Menge 99prozentigem Methanol gelöst und gut mit 1 g Kieselgel vermischt wird. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird auf eine Säule aufgegeben, die mit 50 g Kieselgel (trocken) gefüllt ist, und mit der unteren Phase eines Gemisches von Chloroform/Methanol/Äthylacetat/Wasser im Verhältnis von 2:2:4:1 eluiert wird. Man erhält 140 mg Progynosapogenin E-AH.

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Beispiel 11

Das gemäß Beispiel 1 erhaltene Rohgynosaponin wird mit dem Styroladsorptionsharz behandelt und mit 30-bis 40prozentigem Methanol eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft; man erhält 2 g eines schwachgelben Pulvers. Dieses Pulver wird auf eine Säule mit 200 g Kieselgel aufgegeben und mit der unteren Phase von Chloroform/Methanol/ Wasser im Verhältnis von 65:35:10 eluiert- Dieses Verfahren wird zweimal wiederholt; man erhält 150 mg Gynosaponin 0. Die physikalischen Eigenschaften dieses Produkts sind in Tabellen I und II beschrieben.

Beispiel 12

Eine Lösung von 150 mg Gynosaponin O in 30 ml 0,005 m Natriumdihydrogenphosphat wird mit 150 mg Cellulase versetzt und 24 h bei 37 bis 38°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird wie in Beispiel 3 beschrieben behandelt; man erhält 20 mg Progynosapogenin O₁. Die physikalischen Eigenschaften dieses Produkts sind in Tabellen I und II zusammengestellt.

Beispiel 13

Eine Lösung von 5 mg Gynosaponin C in 1 ml 0,005 m Natriumdihydrogenphosphat, pH 4,0, wird mit 10 mg Cellulase versetzt und 6 h bei 37 bis 38⁰C gerührt. Durch Dünnschichtchromatographie (Adsorptionsmittel: Kieselgel, Lösungsmittel: die untere Phase von Chloroform/Methanol/Wasser im Verhältnis von 65:35:10 oder Chloroform/Methanol/Äthylacetat/Wasser im Verhältnis von 2:2:4:1, Nachweismittel: 30prozentige Schwefelsäure) wird bestätigt, daß sich in diesem Reaktionsgemisch die Gynosaponine H und L sowie

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das Progynosapogenin A. gebildet haben.

Beispiel 14

Eine Lösung von 5 mg Gynosaponin D in 1 ml 0,005 m Natriumdihydrogenphosphat, pH 4,0, wird mit 10 mg Cellulase versetzt und 4 h bei 37 bis 38°C gerührt. Durch Dünnschichtchromatographie wird bestätigt, daß sich in diesem Reaktionsgemisch die Gynosaponine H, I, L und M sowie das Progynosapogenin A₁ gebildet haben.

Beispiel 15

Eine Lösung von 2 g eines Gemisches von Gynosaponinen D und E in 200 ml 0,005 m Natriumdihydrogenphosphat, pH 4,0, wird mit 1 g Cellulase versetzt und 20 h bei 37 bis 38⁰C gerührt. Das Gemisch wird an einer Säule, die mit 80 ml Styroladsorptionsharz gefüllt ist, chromatographiert. Man erhält etwa 1,6 g eines Hydrolysate, das in einem Minimum an 99 % Methanol gelöst und gut mit 3 g Kieselgel vermischt wird. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird auf eine Säule aufgegeben, die mit 200 g Kieselgel (trokken) gefüllt ist und mit der unteren Phase von Chloroform/ Methanol/Äthylacetat/Wasser im Verhältnis von 2:2:4:1 eluiert. Man erhält 20 mg Gynosaponin H, 355 mg Gynosaponin I, 250 mg Gynosaponin J, 270 mg Gynosaponin L, 80 mg Gynosaponin M, 90 mg Gynosaponin N und 70 mg Progynosapogenin A..

Gemäß der Dünnschichtchromatographie und der NMR-Daten sind diese Gynosaponine H, I, J, L, M und N sowie das Progynosapogenin A₁ mit den Standardproben identisch.

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Beispiel 16

Eine Lösung von 30 mg Gynosaponin C in 2 ml 50prozentiger Essigsäure wird 6 h bei 70⁰C gerührt. Die Bildung von Progynosapogenin E-AH wird durch Dünnschichtchromatographie bestätigt (Adsorptionsmittel: Kieselgel, Lösungsmittel: die untere Phase eines Gemisches von Chloroform/Methanol/Wasser im Verhältnis von 65:35:10 oder die obere Phase von n-Butanol/Äthylacetat/ Wasser im Verhältnis von 4:1:5, Nachweismittel: 30prozentige Schwefelsäure).

Beispiel 17

Eine Lösung von 150 mg Gynosaponin D in 10 ml 50prozentiger Essigsäure wird 6 h bei 70⁰C gerührt, dann durch eine Säule geleitet, die mit 50 ml Styroladsorptionsharz gefüllt ist. Nach dem Waschen mit 1 Liter Wasser und 2 Liter 30prozentigem Methanol wird die adsorbierte Substanz mit 300 ml 99prozentigem Methanol eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft; man erhält etwa 90 mg Rückstand. Eine Lösung dieses Rückstandes in einem Minimum an 99prozentigem Methanol wird mit 1 g Kieselgel vermischt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird auf eine Säule aufgegeben, die mit.50 g Kieselgel (trocken) gefüllt ist und mit der unteren Phase von Chloroform/Methanol/Wasser im Verhältnis von 65:35:10 eluiert. Man erhält 30 mg Progynosapogenin E-AH.

Diese Verbindung ist mit dem Ginsenosid-Rg-, identisch, das man durch Hydrolyse eines Ginseng-Saponins mit 50prozentiger Essigssäure erhält.

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Beispiel18

10 kg getrocknete Gesamtteile von Gynostemma pentaphyllum werden zerhackt und unter Erhitzen während 3 h dreimal mit

Methanol extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden auf 5 Liter eingeengt, das Konzentrat wird dann allmählich in 50 Liter Äthyläther unter Rühren gegossen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet, bis kein Äthergeruch mehr erkennbar ist. Das Produkt wird unter Erhitzen auf einem Wasserbad und unter Rühren in 10 Liter mit Wasser gesättigtem n-Butanol gelöst. Die Lösung wird dreimal mit 3 Liter mit n-Butanol gesättigtem Wasser gewaschen, um Saccharide und Farbstoffe zu entfernen. Die sich abscheidende mit Wasser gesättigte n-Butanolphase wird bei vermindertem Druck und einer Temperatur unter 80⁰C zur Trockene eingedampft. Eine Lösung des Rückstandes in 3 Liter Methanol wird in 60 Liter Äthyläther unter Rühren gegossen. Nach dem 1tägigen Stehenlassen wird ein Niederschlag abfiltriert und unter vermindertem Druck und einer Temperatur unter 6O⁰C getrocknet. Man erhält 125 g Saponine (Ausbeute: 1,25 %) .

Das erhaltene Saponin hat folgende Eigenschaften:

1. Es ist ein geruchloses, schwachgelbes oder braunes Pulver, hat einen etwas bitteren Geschmack und ist in Methanol leicht löslich, löslich in Wasser und Äthanol und unlöslich in Benzol, Chloroform, Äther, Hexan und Ligroin.

2. Seine Lprozentige wäßrige Lösung ist neutral.

3. Als KBr-Scheibe hat es ein IR-Spektrum mit Absorptions-

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maxima bei 3370, 1650, 1070 und 1040 cm" .

4. Das NMR-Spektrum in Pyridin-d_ hat Gipfel bei 4,0 (breit), 1,6 (breit), 1,2 (breit) und 0,9 ppm (breit).

5. Durch Schütteln in Wasser erhält man lang anhaltende geringe Schaumbildung.

6. In der Liebermann-Reaktion und der Salkowski-Reaktion reagiert es positiv.

7. Aus dem wasserlöslichen Teil des Säurehydrolysats erhält man Glucose, Rhamnose und Xylose; aus dem wasserunlöslichen Teil dieses Hydrolysats erhält man Panaxadiol (^C3o^H52°3' ^Fp* 205⁰C) und eine geringe Menge von 26-Hydroxylpanaxadiol.

8. In der unten angegebenen Dünnschichtchromatographie zeigen sich Saponinflecke von purpurroter Farbe.

Platte: Kieselgur, 60 F₃₅₄ (Merck) Entwicklungsmittel: untere Phase eines Gemisches von

Chloroform/Methanol/Wasser im Verhältnis von

65:35:10

Entwicklungsentfernung: 10 cm

Nachweis: nach dem Besprühen mit 1 % Cersulfat/10 % Schwefelsäure 5 min Erhitzen auf 105⁰C.

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Tabelle 1-1

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Elementaraaalyse Rotation

FP(⁰C) Formel ber. . gef. (.a)®° MeOH

MeOH (m) IH

Gynosaponi* A 201-203C₀₀H₁₀₂O₂₇-SH₂O 65,O₃ 8,3154,78 8,57 -1,38 ° ( _c=l_r5 ) -18,1 ° 3375 , 1640 , 11 60 , 1 075

GynosaponinB 196-198 Co₀H₁₀₂O₂₆. 3H₂O 65,71 8,42 55,63 8,56 "3,30° ( c «i_lB ) -42,7° 3375 [ 16 H,' All, 10₇₀ '

GynosaponinE 199-201 Cs₄H₉₂O₂₂. 3H₂O 66,52 8,61 56₍₃₃ 8,₈₆+8,61°( c=l,4 ) +98,8° 3375 ] ^640 ,' All [ 1075 <

GynosaponinP 191-193 C₅₄H₉₂O₂₂. 3H₂O '₅6,52 8,61 56,31 8,86 4*,76° (o=l,7) +89_f0° 3375 ,^! 16 35 ,'116 5 ,

Gynosaponin G 192-194 C₈₄H₉₂O₂₁. 3HiO 67,33 8,73 _B7;il 8,77 4-1,63° (o=*,0) +18,4° 3375 ', lell \ All

Gynosaponini 183-185 C₄₇H₀₀Oi₇-SH₂O" '58,I₃ 8,93 57,77 8,77 +U,2°(o= I₁B) +138° 33^5 ,' ^635 \ 1160 , 1075* "

Gynosaponin J 189-191 C₄₈Hb₂O₁₇'. 4H₂O 57,4 7 9,04 57,58 8,92 4-13,3 ° ( ο =1,5) .+1₃₃° ΙΤΛ \ 1640 ,' iL'o , 107^".;!

GynosaponinK 187-189 C₄₈H₈₂O₁₇-SH₂O 58,52 9,00 58,41 8_f89 +13,4⁰Co-I₁S) +132° II* 5 ', \ 6 3 5 ,' All, 107Q«v,

.«. „ , ' 1045,1020, 990 '«·^! ·^! <*

GynosaponinM 158-160 C₄₁Il₇₀O₁₂' 3/2H₂O 62,97 9,40 63,20 9,60 +25,7° ( _{c =1|0}) +SOl⁰ 3375,1635,1165, 107ε'"".¹«¹

Gynosaponin N 165-167 C₄₂H₇₂O₁₂-SH₂O^ 63,66 9,52 63,89 9,81 '1"25,O⁰ ( c =1,3 ) +301° 3 37 B ', 1 6 Il [A 6 5 , 1065 ^

GynosaponinO 202-205 C₆₀H₁₀₂O₂₇ · .4H₂O 54,28 8,35"_B4,28 8,30 -1,31° ( c =3,5 ) -17,4° 33^ 5 ,'^640', 11 6 0 , 1070 -

1040.1015. 9Rn'

p- ■ -r- c-> Ο,- 'Q. ο

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CN η OO in	60,38	66.05
cn in	CN cn	CN CO
co	co	cn
VO cn	r-	CN OO
co in	O VO	in VO

130039/0888

Tabelle II -1 - 39 -

Methyl

NMR Spectraldaten

Anomerisches Proton

Gynosaponin A

-* Gynosaponin B

σ co co

O OO CO CO

Gynosaponin E

Gynosaponin F

Gynosaponin G

D 0,81b ,0,9Ib ,0,96B i 1,05θ 1,59d #

¹ 1,26b ;1,62b ,1,62b ,-1,65s (J=5)

11) 0,7 9 B ,0,95 B, 0,95 s,-1,04 B l,59d . *

1,22 B ;1,6 Is-,1,66 s,-1,6 9 s (J=5)

I) 0,83 b}0.90b ;0_;98a j-1,07s l,62d,-l,62d 5,30m

1,28Β)1,59θ;176 7β}1,69θ (J=5)(J=5)

11) 0,81s-,0,9 7s ;O,97s -,1,05s 1,6Id^OId *

1,24s J1/58B j1,69b }1/71θ C J=5) ( J=5)

D O,83s;O^2s;0j98b ,-1,07s l_f60d

1,26b-,1,57s ;l,66s-,l,68s (J=5)

11) 0,79s ;0,96s-,0,96s jl_?04s l,58d ^

1,21b jl_t56B^%,l,6 9B',l,7lB ( J=5 )

D 0,82s |0,92b ,0,96β-,1,08s 1,63d 5_r30m

1,29b ,1,62s-,1,62s ,1,62s (J=6)

11) 0,78 b ,·0_?9 6θ j0,9 6 a _f 1,06 β l_f63d %

1,24s _fl,60s ,-1,66s/l_?67s (J=6)

1) 0,82s )0,90b *0,97s ;O,97b l,62d;l_/62d 5,30m

1,30 s j 1,5 9 β ,1,6 5 b ,-1,69 B ( J=G') ( J=6 )

11) 0,80b ,O.₍9Va-,0,97s ;0,9Vb l,61djl_r61d -*-

1,29b ;l₍58s ,1,69BfIjVlB (J=6)(3"=6)

4_t81d, 4,99d, 5,06d, 5_;27d, 5,38b (J=7) (J=7) (J=7) (J=7) 4,73d, 4,85d, 4,9 9 d., * *

4,86d, 5,1Od, 5,34α, 5,38b, 5,42s

(J=7) CT=7) CJ=7)

4,84d, 5,05d, 5,33s, 5_r34d_i 5_r38s

(J=V) (J=7) (J=7)

4,85d, 5,05d, 5,27d, 5,31b

(J=6,5)(J=7,5) (J=7)

4,9Id₁ 5,1Od, 5,34d, 5,37 b

j6)(75) CJ7)

4,86d, 5^15d, 5_r33d, 5,42b

(j=7) (J=V) (J=7)

4,8 3d, 5,13d, 5_y30d, 5,40s

(j=7) (J=V) (J=7)

4_f88d, 5_r09d, 5,37s, 5,50b

(J=V) (J=V)

4,85d, 5,05 d, 5,34 b, *

(J=V) (J=V)

Tabelle II -2

- 40 -

Gynosaponin I

Gynosaponin J

O CO CO

Gynosaponin K

Gynosaponin M

Gynosaponin N

Gynosaponin

Methyl

D 0,83s-,0_{98b-,0_?98s ;0,98b 1,28 a ; 1,6 3 8 j 1,6 5 s ;l,6 6s 11) 0,78s ,-0,

1,258 ;l,6lB;lj71e;l,71e

1) 0,8 3 s ;0_r93 β j 0,9 7 8,-0,9 7s l,59d 1,27 s ,-1,57 B ;1,65s ,"1,68s (J=5)

H) 0,78b ,0,94a jO,94a,-0,94a l,53d 1,22a ί 1,5la-,1,69a ;1_?69 a ( J=5 )

D 0,818-,0,92b ;0_t95av0,95a 1,6Od

1,28a ;l,57a ;1,62β}1,62β (J=5)

11) 0,'77a;0,9 4a _}0,94 8;0^9 4θ 1,57a

1,2 5a jl,5 7a ;1,668;1,66β CJ=5)

D 0,91b jO,96a

Ij22a j 1,53a ,·1>63a _rl,65a

11) 0,84 a ,0,9 6a ;0,99b ;0,99a

1.19 s _}l,53e ;l,64a ;

C-24H

5,51m

*
5,30m

1) 0,92a }0,92β·,·1,03θ ,-1,03a l,62d

1,22a }1₍59β il,6 5a_;l,69a (J=5)

H) 0,85b ,0,94a ;0,9 7b ;1,00b l_?60d

1,19 β,-1,58 β; 1,67 β,-1,7 Ib (J=5)

1) 0,81a ;0,87 a-,0,95a ,-1,06a l,58d ,-1^O d

1,26s |l_f58a ,1,07 β { '■ (J=6)(J=5)

11) 0,7 9s $0.,9 4S $0,9 4 3 ,1,03 s l,59d;l,5

1,22s ;l,55s ;l,0-7s ( J=5 ) ( J

5,22m

5j33m 5,32m

5,33m 5,30m

Anomerisches Proton

, 4_;92d, 5,06 d )()C

4,78d, 4,86d, 5,05d (j=?) (j=7) (J=7)

4,87d, 5_;05d,

4,7 7d, 5,03d, )

4,8 3d, J=W,5) 4,79d, -5_?05d, )

4,96d, 5.08d (J=7) C1=7) 4,86d, 5_?05d (j=7) (J=7)

5,09d, 5.38 b CJ=7)

5,04d, 5_;34b )

ι) η » )

4,84d, 5,08d, 5.32d, 5,3 6a, 5,42^!.b

(j=7) (J=7) (J=7)

4,82d, 5,03d, 5,33d, 5,34 s, 5.42 a

(J=7) (J=7) fJ=7')

cn

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ι—ι C=:

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G	G	G	G	G	G
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C	G	C	C	C	G
O	O	O	O	O	O
CL.	CL,	Oj	α.	α.	O
(O	(0	(0	(0	(0	(0
Ul	Ul	W	cn	cn	■ ω
O	O	O	O	O	O
C	G	G	C	C	G

130039/0888

/NSPECTED

Tabelle II -4

- 42 -

Progynosapoqenin | )

II)

Progynosapogenin | ) A-AH

Methyl

O₇SIe ;0,94s {0,979)0,9 78 l,62d

1,30s ,-1,63a ,1,63a _;l,67s ( ,T=5 )

0,7 9 b ,-0,9 7 a,-0,9 7 a ,-O₇9 7s 1,6 Od

1,27 s,-1,67a/1,71a ;l,71a ( J=5 )

0,8 4 b ,0,9 6s ,1,03 a ,1,09 s 1,6Id

1,29s ,1,39a ,1,6 4 a ,1,6 6b (J=6)

C-24H

5,33m

Anomerisches Proton

5_f30m

4,88d, 5_/04d, 5.11d, 5,48a

(j=7) (j=7) (J=7)

4,85d, 4,9 4d, 5_;09d,

(j=7) CJ=7) (J=7)

4,88d, 5,36d, 5,44 a CJ=7) (J=7)

O O CO CO

O CO 00 OO

) 0,82b,0,9 6a ,1,04 a, 1,08s l,61d 1,26b, 1,39b, 1,64S₁L₁OOb (J=6)

Progynosapogenin I ) 1

0,91b, 0,95b, 0^99b, 1,04b 1,2Sb ,1,53s, 1,82b, 0_f92s, 0,96b;1_?00s, Ij 1,23b, 1,548,1,83b,

4_f85d,
(J=7)

5,17 d
5,17 d

11}}

1) :Werte in Py-d_s

ii) :Werte in Py-d_a/D_aO

*) !Chemische Shifts sind undeutlich wegen Überlappung der Signale

- -MT-

Die Wirkung der erfindungsgemäßen Saponine aus Gynostemma pentaphyllum als Antitumormittel wird nun anhand von pharmakologischen Versuchen und klinischen Fällen beschrieben. Unter "Saponine" wird hier ein Gemisch verstanden, das gemäß der Arbeitsweise des Beispiels 18 erhalten wurde. Bei den klinischen Fällen werden die Saponine in Form eines Pulvers verabreicht, das durch Zugabe der 9fachen Menge Lactose hergestellt worden ist.

1 . Antiulcus-Wirkung

(1) Wirkung gegen ein durch Streß verursachtes Geschwür

Gemäß dem von Takagi et al (K. Takagi und S. Akabe, Japan. J. Pharmacol., _1_8, 9 (1968)) vorgeschlagenen Verfahren werden 200 g schwere mäinliche Wistar-Ratten in einer Streßbox gehalten und 7 h brusttief in einen Wassertank von 23⁰C eingetaucht. Nach dem Herausnehmen aus dem Wassertank wird jede Ratte getötet und der Magen entnommen. 10 ml einer 0,5prozentigen Formaldehydlosung werden in den Magen jeder Ratte eingespritzt. Nach 10 min wird der Magen entlang der Curvatura ventriculi major aufgeschnitten, die Magenschleimhaut wird untersucht.

Der Ulcerationsgrad wird durch einen Ulcusfaktor ausgedrückt, den man durch Messen der Länge (mm) jedes einzelnen Ulcus jeder Ratte unter einem Miniraster mit 1Ofacher Vergrößerung und Zusammenzählen der Gesamtulcuslängen jeder Ratte bestimmt,.

25 mg/kg oder 100 mg/kg Saponine werden jeder Gruppe von Ratten oral verabreicht/ die Kontrollgruppe erhält 1,0 ml/kg einer physiologischen Natriumchloridlösung oral 1/2 h,bevor die Ratten

130039/0888

dem Streß ausgesetzt werden. Der mittlere Ulcusfaktor der Gruppen wird verglichen, die Hemmung der durch den Streß verursachten Ulceration wird für jede Gruppe bestimmt. Die Hemmung wird gemäß folgender Gleichung berechnet:

mittlerer ulcusfaktor (Kontrollgruppe)

mittlerer Ulcusfaktor (Testgruppe)

Hemmung (%) =

mittlerer Ulcusfaktor (Kontrollgruppe)

Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.

χ

Tabelle III

Ulcerationsgrad und Hemmung der Ulceration durch Verabreichen

der Saponine

Ulcusfaktor (mm)

Ratte Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

mittlerer Ulcusfaktor (mm)

mittlere Hemmung
der Ulceration (%)

Kontrollgruppe (1,0 ml/kg physiologische NaCl-Lösung)

17,15 16,50 20,70 21,15 24,30 18,80 20,25 19,80 22,60 19,55 20,08

Testgruppe

(25 mg/kg ·· (100 mg/kg Saponine) Saponine)

1	5,20	1	8,70
1	3,95	1	9,55
1	6,20	1	1 ,25
1	6,40	1	4,00
1	4,65	1	6,55
1	7,26	1	4,40
1	4,70	1	0,70
1	5,65		2,04
1	5,10	1	2,57
1	4,55	9,70
1	5,37	1,95

23,46

40,49

130039/0888

(2) Wirkung gegen ein durch Säure verursachtes Geschwür

In Gruppen von 10 männlichen Wistar-Ratten mit einem Gewicht von je 200 g wird jeder Ratte nach A'thernarkose zur Freilegung des Magens der Bauch aufgeschnitten. 0,05 ml lOprozentige Essigsäure werden in die seröse Membran des Magens injiziert; es wird zugenäht, wonach eine Ulceration stattfindet. Am dritten Tag nach dem Einschnitt werden den Ratten 25 mg/kg oder 100 mg/kg Saponine oral einmal am Tag während 5 bzw. 15 Tagen kontinuierlich verabreicht bzw. 1,0 ml/kg einer physiologischen Natriumchloridlösung an die Kontrollgruppe. Am Tag nach der letzten Verabreichung wird jede Ratte getötet, der Magen wird entfernt. Es werden 10 ml einer 0,5prozentigen Formaldehydlösung in den Magen eingespritzt, nach 10 min wird der Magen entlang der Curvatura ventriculi major eingeschnitten. Die Längs- und Querlängen der ulcerierten Gegend werden unter einem Miniraster gemessen, die Fläche (mn?) der ulcerierten Gegend wird zur Bestimmung des Ulcus-Index verwendet. Die Heilrate (Hemmung der Ulceration) wird gemäß folgender Gleichung berechnet:

mittlerer Ulcus- mittlerer Ulcus-Index (Kontroll- - Index (Test-

Heilrate (%) = 2EHEEe) 2EHEEfU _{x 100}

mittlerer ülcus-Index (Kontrollgruppe)

Die Ergebnisse der 5 Tage- und 15 Tage-Versuche sind in Tabelle IV bzw. V angegeben.

130039/0888

Tabelle IV

Ulcerationsgrad und Heilrate durch Verabreichung der Saponine während 5 Tagen

ülcus-Index (mm²)

Ratte Nr.	Kontrollgruppe (1,0 ml/kg physio logische NaCl- lösung)	Testgruppe (25 mg/kg (100 mg/kg Saponine) Saponine)	10,56
1	20,07	9,20	12,60
2	19,38	14,13	8,52
3	18,64	9,79	9,04
4	15,20	13,94	10,28
5	23,64	12,20	10,70
6	24,06	11 ,45	12,06
7	20,21	13,26	10,12
8	18,95	10,66	9,56
9	19,88	8,96	11 ,98
10	18,02	11,02	10,54
mittlerer Index (mm	Ulcer- . 19,81	11,46	46,79
mittlere rate (%)	Heil- 0	42,15

130039/0888

! 17

Tabelle

Ulcerationsgrad und Heilrate durch Verabreichung der Saponine während 1 5 Tagen

Ulcus-Index (mm²)

Ratte Nr.	Kontrο1lgruppe (1,0 ml/kg physio logische NaCl- lösung)	Testgruppe (25 mg/kg (100 mg/kg Saponine) Saponine)	4,05
1	9,05	3,86	3,96
2	10,50	5,18	4,55
3	8,92	5,10	5,00 .
4	12,43	5,65	4,12
5	9,56	4,84	4,08
6	7,95	3,28	4,54
7	9,18	4,56	3,79
8	8,65	5,20	4,82
9	11 ,26	4,20	3,56
10	10,74	3,96	4,25
mittlerer Index (mm	Ulcus- 9,82 2)'	4,58	56,72
mittlere rate (%)	Heil- 0	53,36

Aus den Ergebnissen der Tabellen III bis V ist ersichtlich, daß die Heilraten für durch Streß verursachte Geschwüre 23,46 und 40,49 betragen, wenn die erfxndungsgemäßen Saponine in Mengen von 25 mg/kg und 100 mg/kg verabreicht werden- Die Heilraten betragen 42,15, 53,36, 46,79 und 56,72 bei Geschwüren, die durch Essigsäure verursacht werden, wenn die erfindungsgemäßen Saponine während 5 bzw. 15 Tagen in Mengen von 25 mg/kg und 100 mg/kg verabreicht werden. Es ist somit offensichtlich, daß die erfindungsgemäßen Saponine gegen Geschwüre im Verdauungstrakt sehr wirkungsvoll sind.

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(3) Klinische Fälle Fall 1

Patient: Y.M., eine 50jährige Hausfrau Erkrankung: Magengeschwür

Familienanamnese: ihre Mutter litt an einem Magengeschwür

Anamnese: keine besonderen Erkrankungen.

Gegenwärtige Erkrankung: seit etwa 5 Monaten hat sie einen Schmerz im Magen, der besonders akut ist, wenn sie hungrig ist. Sie hatte oft keinen Appetit und nach einer vergeblichen Behandlung in einem anderen Krankenhaus kam sie in diese Klinik. Die Röntgenaufnahmen und die endoskopische Untersuchung führten zur Diagnose eines Magengeschwürs.

Ergebnisse der Behandlung: Während 3 Monaten erhielt die Patientin zwischen den Mahlzeiten intern 100 mg Saponine täglich, Ihre subjektiven Symptome, wie Schmerz, verbesserten sich drastisch, die Röntgen- und endoskopische Untersuchung zeigte praktische keine ulcerierte Gegend mehr im Magen.

Fall 2

Patient: S.K., ein 34jähriger männlicher Angestellter; Erkrankung: Duodenalgeschwür;

Familienanamnese: der Vater starb an Magenkrebs; Anamnese: eine Appendektomie wurde durchgeführt, als er 20 Jahre alt war;

Gegenwärtige Erkrankung: seit etwa 6 Monaten hat er gelegentlich Bauchschmerzen, die besonders während der Nacht akut sind. Seit 1 Monat hat er fast jeden Tag Schmerzen, er besucht diese Klinik. Nach der Rontgenuntersuchung wird ein Duodenalgeschwür

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diagnostiziert, er wird hospitalisiert.

Ergebnisse der Behandlung: der Patient erhielt während 2 Monaten jeden Tag 200 mg Saponine oral. Die Röntgenuntersuchung zeigt, daß praktisch keine ulcerierte Gegend mehr vorhanden ist, die subjektiven Symptome des Patienten verbessern sich auf normal-Er wird deshalb aus der Klinik entlassen und soll das Krankenhaus einmal wöchentlich aufsuchen.

Fall 3

Patient: H.T., ein 40jähriger männlicher Angestellter; Erkrankung: Magengeschwür; Familienanamnese: keine besonderen Erkrankungen; Anamnese: als er 32 Jahre alt war, war er während 1 Monats wegen autonomer Ataxie hospitalisiert;

Gegenwärtige Erkrankung: seit etwa 6 Monaten hat er manchmal im oberen Teil des Magens Schmerzen. Seit 2 Monaten hat er Schmerzen, wann immer er hungrig ist, es fehlt ihm oft an Appetit und er muß erbrechen. Er besucht diese Klinik; nach der Röntgen- und endoskopischen Untersuchung wird ein Magengeschwür diagnostiziert.

Ergebnisse der Behandlung: während 2 Monaten erhält der Patient jeden Tag oral 100 mg Saponine. Die Röntgen- und endoskopische Untersuchung zeigt eine drastische Verbesserung. Er erholt sich fast vollständig von seiner Erkrankung, da er keinen Brechreiz und keine Schmerzen mehr hat und auch wieder guten Appetit.

Die erfindungsgemäßen Saponine verhindern auch die Nebeneffekte von Glucocorticoiden.

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2. Verhinderung der Nebeneffekte von Glucocorticoiden

Die Nebeneffekte von Glucocorticoiden, die adrenocorticale Hormone sind, schließen die Atrophie der adrenalen Drüsen ein, was zu Symptomen, wie einem Stiernacken und einem Mondgesicht, führt. Die Atrophie des Thymus und die Verminderung des Plasmacortisols sind auch deutliche Nebenwirkungen der Glucocortico-

zeigen

ide. Die folgenden Versuche/, wie wirkungsvoll die erfindungsgemäßen Saponine aus Hydrangea bines zur Vermeidung der Nebenwirkungen von Glucocorticoiden sind.

(1) Wirkungen auf die Atrophie der Adrenaldrüsen, die Atrophie des Thymus und auf das Plasmacortisol

(a) Verabreichung eines Glucocorticoids, gefolgt von der Verabreichung der Saponine

In einer Gruppe von 10 männlichen SD-Ratten, 5 Wochen alt und mit einem Gewicht von i40_+5 g, werden einmal täglich während 10 Tagen kontinuierlich jedem Tier 10 mg/kg Dexamethason als Glucocorticoid intraperitoneal in Form einer Lösung in 1 ml physiologischer Natriumchloridlösung injiziert. Am 11 ten Tag werden jeder Ratte 10 mg/kg Saponine in Form einer Lösung in 1 ml physiologischer Natriumchloridlösung einmal täglich während 10 Tagen kontinuierlich injiziert. Jeder Ratte der Kontrollgruppe wird intraperitoneal 1 ml/kg physiologische Natriumchloridlösung anstelle der Saponine einmal am Tag während 10 Tagen kontinuierlich, angefangen am 11 ten Tag des Versuchs, injiziert. Eine dritte Gruppe erhält weder Dexamethason, noch Saponine, noch physiologische Natriumchloridlösung. Nach der letzten Verabreichung wird den Ratten der Bauch geöffnet, das Gewicht der

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Adrenaldrüsen und des Thymus sowie die Menge an Plasmacortisol wird für jede Rattengruppe bestimmt. Die auf diese Weise erhaltenen mittleren Werte sind in Tabelle VI zusammengefaßt.

Tabelle VI

Gruppe, die Kontrollgruppe, die Gruppe,die keine Mittel Dexamethason und Dexamethaerhielt physiologische NaCl- son und Sa-Lösung erhielt ponine erhielt

Gewicht der Adrenaldrüsen (mg)

Gewicht des
Thymus (mg)

Plasmacortisol

64 + 2

286 + 9

74 + 2

23+_1

172+J3

+ 3

45^2

21 4+.1

62 + 2

Diese Werte wurden anhand der folgenden Gleichung zur Berechnung des Ausmaßes der Adrenaldrüsenatrophie und der Thymusatrophie sowie der Reduktion des Plasmacortisols verwendet:

Atrophie des
Organs

Gewicht des Organs, das kein Mittel erhielt

Gewicht des Organs, das Mittel erhielt

χ

Gewicht des Organs,
das kein Mittel
erhielt

Reduktion
des Plasmacorti
sols

Menge des Plasmacortisols in der Gruppe, die kein Mittel erhielt

Menge des Plasmacortisols in der Gruppe, die Mittel erhielt

Menge des Plasmacortisols in der Gruppe, die kein Mittel erhielt

χ

Die Ergebnisse sind in Tabelle VII· zusammengefaßt.

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-⁵⁷J-'"" " "* "^L 3Ö42117

Tabelle VII

Kontrollgruppe, die Gruppe, die Dexa-Dexamethason und methason und Saphysiologische NaCl- ponine erhielt Lösung erhielt

Atrophie der Adrenal- 64,1 29,7

drüsen (%)

Atrophie des Thymus (%) 39,9 25,2

Reduktion des Plasma- 59,5 16,2

Cortisols (%)

(b) Verabreichung der Saponine, gefolgt von der Verabreichung eines Glucocorticoids

In einer Gruppe von 10 männlichen SD-Ratten, 5 Wochen alt und mit einem Gewicht von 140+^5 g,werden einmal täglich während 10 Tagen kontinuierlich jedem Tier 10 rng/kg Saponine intraperitoneal in Form einer Lösung in 1 ml physiologischer Natriumchloridlösung injiziert. Die Tiere der Kontrollgruppe erhalten intraperitoneal 1 ml/kg physiologische Natriumchloridlösung einmal täglich während 10 Tagen kontinuierlich. Am 11 ten Tag werden jedem Tier von 2 Gruppen einmal täglich während 10 Tagen kontinuierlich 10 mg/kg Dexamethason intraperitoneal injiziert. Eine dritte Rattengruppe erhält weder Dexamethason, noch Saponine, noch physiologische Natriumchloridlösung. Nach der letzten Verabreichung wird den Ratten der Bauch geöffnet, das Gewicht der Adrenaldrüsen und des Thymus sowie die Menge an Plasmacortisol wird für jede Rattengruppe bestimmt. Die Mittelwerte sind in Tabelle VIII zusammengefaßt.

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"50*42117

Tabelle VIII

Gruppe, die Kontrollgruppe, Gruppe, die kein Mit- die Dexametha- Dexamethason tel son und physio- und Saponine erhielt logische NaCl- erhielt lösung erhielt

Gewicht der Adrenal- drüsen (%)	69^2	2OjM	55^2
Gewicht des Thymus (mg)	29Oj1IO	165^8	22Ij1IO
Plasmacorti sol (ug/dl)	71+_2	28 + 1	57^3

Diese Werte werden gemäß der oben beschriebenen Gleichung für die Berechnung der Atrophie der Adrenaldrüsen und des Thymus sowie zur Berechnung der Verminderung des Plasmacortisols verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengefaßt.

Tabelle IX

Kontrollgruppe, die Gruppe, die Dexa-

Dexamethason und methason und

physiologische Saponine erhielt NaCl-Lösung erhielt

Atrophie der Adre naldrüsen (%}	71 ,0	20,3
Atrophie des Thymus (%)	43,1	23,8
Reduktion des Plasmacortisols (%)	60,6	19,7

Die Ergebnisse zeigen, daß die Saponine für die Hemmung der durch die Atrophie verursachten Gewichtabnahme sowie zur Verhinderung der Reduktion des Plasmacortisols, die alle durch die Glucocorticoide verursacht sind, sehr wirkungsvoll sind. Die Aktivität der Saponine zeigt sich auch dort, wo die Saponine vor dem Glucocorticoid verabreicht wurden. Diese Tat-

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sache weist darauf hin, daß die erfindungsgemäßen Saponine nicht nur zur Wiederherstellung der Organe von den Nebenwirkungen der Glucocorticoide wirkungsvoll sind, sondern auch zur

beitragen Verhinderung des Auftretens dieser Nebeneffekte/. Wie auch unter

(a) beschrieben, kann das Ausmaß der Adrenaldrusenatrophie, die auftritt, wenn man täglich während 10 Tagen kontinuierlich 10 mg/kg Dexamethason intraperitoneal verabreicht,und die etwa 64 % beträgt, durch die Verabreichung der Saponine auf 29,7 % gesenkt werden, d.h. mehr als die Hälfte.Das gleiche gilt für die Thymusatrophie, die von etwa 40 auf etwa 25 % vermindert werden kann sowie für die Reduktion des Plasmacortisols, das von etwa 60 % auf 1/4 oder etwa 16 % gesenkt werden kann. Praktisch die gleichen Ergebnisse erhält man, wenn die erfindungsgemäßen Saponine vor dem Glucocorticoid, wie in (b) beschrieben, verabreicht werden. Insbesondere kann die Atrophie der Adrenaldrüsen von etwa 70% auf etwa 20%, die Atrophie des Thymus von etwa 43 % auf etwa 24 % und die Reduktion des Plasmacortisols von etwa 60 % auf etwa 20 % gesenkt werden.

(2) Klinische Fälle Fall 1

U.K., ein 29jähriger männlicher Staatsangestellter. Erkrankung: chronische Nephrose des Typs Nephritis und ein Mondgesicht, das durch die Verabreichung eines Glucocorticoids (Steroid) verursacht ist.

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- 95" -

Familienanamnese: sein älterer Bruder starb an chronischer Hepatitis.

Anamnese: keine speziellen Erkrankungen.

Gegenwärtige Erkrankung: vor drei Jahren wurde er zur medikamentösen Behandlung hospitalisiert, die. Diagnose war chronische Nephrose des Typs Nephritis. Nach der oralen Verabreichung

täglich während 3 Monaten kontinuierlich von 2 mg /eines Adrenocortico-Gl.ucocorticoids, d.h. Linderon , wurde er korpulent mit einem Mondgesicht, er hatte eine Schwäche in seinem gesamten Körper und Herzklopfen. Deshalb wurde die Menge des Glucocorticoids auf 1 mg täglich herabgesetzt, die Nebenwirkungen jedoch . besserten sich überhaupt nicht. Seit kurzem ist er schwindlig und nervös und leidet auch unter Schlaflosigkeit.

Gegenwärtige Verfassung: Mondgesicht (+); schwachrote Wangen; ürinvolumen: 500 ml/Tag; Blutdruck: 154/95 mmHg. Nierenfunktionstest: Serumcholesterin:470 mg/dl; Harnstoff-Stickstoff: 30 mg/dl; Urinprotein (-Hl·) ; Erythrozyten ( + ) ; sonst o.b. Ergebnisse der Behandlung: dem Patienten wurden Saponine in einer Menge von 100 mg täglich verabreicht, während die orale Verabreichung von 1 mg des Glucocorticoids täglich fortgesetzt wurde. Nach 3 Monaten zeigte der Nierenfunktionstest eine deutliche Besserung; deshalb wurde die Verabreichung des Glucocorticoids unterbrochen; die Saponine allein wurden 3 Monate in einer Menge von 100 mg täglich weiter oral verabreicht. Nach 3 Monaten waren das Mondgesicht, die Röte der Wangen, der Schwindel, die Reizbarkeit und die Schlaflosigkeit verschwunden. Das Urinvolumen stieg auf 1500 ml pro Tag. Zur gleichen Zeit

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zeigte der Nierenfunktionstest eine vollständige Wiederherstellung, d.h. Serumcholesterin: 112 mg/dl; Harnstoff-Stickstoff: 11 mg/dl; Urinprotein (+); Erythrozyten (-); Blutdruck: 122/80 ramHg.

Bemerkungen: Da das Glucocorticoid (Linderon), das zur Heilung der chronischen Nephrose des Typs Nephritis verabreicht wurde, zu schwere Nebunwirkungen zeigte, als daß sie hätten leicht verbessert werden können, wurden die Saponine gleichzeitig mit dem Glucocorticoid verabreicht. Als Ergebnis war es möglich, das Glucocorticoid ohne Gefahr des weiteren Fortschreitens der Nebenwirkungen zu verabreichen. Der Zweck der Behandlung konnte in kurzer Zeit erreicht werden. Eine weitere Verabreichung der Saponine aus Hydrangea binis führte zu einer vollständigen Ausschaltung der Nebenwirkungen des Glucocorticoids. Weder ein Rückfall noch Entzugserscheinungen wurden beobachtet, als die Verabreichung des Glucocorticoids unterbrochen wurde.

Fall 2

O.Y., ein 52jähriger männlicher leitender Angestellter. Erkrankung: chronische aktive Hepatitis und Schwierigkeiten in der Steroidtrennung.

Familienanamnese: keine speziellen Erkrankungen. Anamnese: keine speziellen Erkrankungen.

Gegenwärtige Erkrankung: seit 5 Jahren wird ar wegen chronischer Hepatits behandelt. Nachdem er verschiedene Behandlungsarten vergeblich erhalten hatte, begann er vor 2 Jahren mit der oralen Einnahme von Prednisolon, einem Adrenocortico-Glucocorticosteroid-Hormon, in einer Menge von 15 mg je Tag. Nach

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3 Monaten hatte er ein Mondgesicht und einen Stiernacken. Eine Verminderung der Steroidmenge verursachte eine Mattigkeit im ganzen Körper und Erbrechen. Diese Symptome besserten sich, als die Steroidmenge auf ihren ursprünglichen Wert angehoben wurde. In anderen Worten, es war für ihn schwer, die Verwendung des Steroids zu unterbrechen. Deshalb wurde die Steroidmenge trotz der Nebeneffekte nicht vermindert, die Nebenwirkungen wurden immer deutlicher. Seit kurzem nimmt das Urinvolumen ab, er ist durstig, fühlt sich müde und hat Herzklopfen. Gegenwärtiger Zustand: Mondgesicht (+); Stiernacken (+); rötliches Gesicht; vaskulare Störungen (+). Leberfunktionstest: S. GOT 245 U/L; S. GPT 285 U/L; T.T.T. 15,3 U/L; 2 T.T. 20,3 U/L; /"^Globulin 29,4 %; keine anderen Anomalitäten. Die biologische Untersuchung der Leber bestätigt, daß es sich um einen chronisch aktiven Fall handelt.

Ergebnisse der Behandlung: der Patient erhielt 100 mg täglich Saponine,während die orale Verabreichung des Prednisolons in einer Menge von 15 mg täglich fortgesetzt wurde. Nach 1 Monat waren das Mondgesicht und der Stiernacken besser, der Patient hatte keinen Durst, keine Müdigkeit oder Herzklopfen mehr. Nach 3 Monaten waren alle seine subjektiven und objektiven Symptome verschwunden, seine Gesundheit war wieder hergestellt. Der Leberfunktionstest zeigte eine drastische Verbesserung: S.GOT 42; S. GPT 34; T.T.T. 10,1; 2 T.T 11,3 und ^Globulin 24,3. Daher wurde die Verabreichung des Prednisolons unterbrochen. Es traten weder ein Rückfall noch Entzugserscheinungen auf. Nach weiteren 3 Monaten hatte der Patient weder subjektive noch objektive Symptome, der Leberfunktionstest zeigte vollkommen normale Ergebnisse, d.h. S. GOT 24; S. GPT 27; T.T.T. 4,31; 2 T.T. 7,4 und ^Globulin 20,3.

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Die Verwendung der Saponine aus Hydrangea bines, gleichzeitig mit der Verabreichung des Steroids, führt zur Ausschaltung der Nebenwirkungen und der Schwierigkeit, die mit der kurzfristigen Unterbrechung der Steroideinnahme verbunden ist, ohne daß ein Rückfall oder Entzugserscheinungen auftreten.

Fall 3

T.T., eine 44 Jahre alte Hausfrau.

Krankheit: chronischer Artikularrheumatismus und Schwierigkeiten in der Unterbrochung der Steroidverwendung. Familienanamnese: ihr Vater litt an chronischem Artikularrheumatismus .

Anamnese: keine speziellen Erkrankungen.

Gegenwärtige Erkrankung: nachdem der Fall vor 5 Jahren als chronischer Artikularrheumatismus diagnostiziert worden war, wurde sie in verschiedener Weise behandelt, sie klagte jedoch weiter über akute Schmerzen und schwere Schwellungen. Deshalb wurde ihr vor 3 Jahren oral ein Steroid verabreicht, d.h. Prednisolon, in einer Menge von 10 mg täglich. Nach 5 Monaten hatte sie ein Mondgesicht, fühlte sich sehr müde und schwindlig und litt an Oligurie. Als Folge einer Unterbrechung der Steroidverabreichung hatte sie ein Druckgefühl in der Brust und einen Fieberanfall, so daß die Prednisolon-Verabreichung in einer Menge von 10 mg täglich weitergeführt wurde.

Gegenwärtiger Zustand: Mondgesicht (+); Stiernacken (+); rote Wangen (+); RA (+); CRF (+); Blutsenkung: 70 mm {1 h) und 124 mm (2 h); Deformation der Knie-, Hand-, Fuß- und Fingergelenke:

Ergebnisse der Behandlung: Die Patientin erhielt die Saponine

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aus Hydrangea bines in einer Menge von 10 mg täglich, während die orale Verabreichung von Prednisolon in einer Menge von 10 mg täglich fortgesetzt wurde. Nach 2 Monaten hatte sich das Mondgesicht gebessert, ihre subjektiven und objektiven Symptome waren wesentlich besser. Deshalb wurde die Verabreichung von Prednisolon unterbrochen, die orale Verabreichung der Saponine wurde in einer Menge von 10 mg täglich fortgeführt. Es traten keine Rückfall- oder Entzugserscheinungen auf. Nach 4 Monaten waren die Nebeneffekte des Prednisolone vollkommen verschwunden.

Die Gelenkschmerzen und -Schwellungen wurden jedoch schlimmer, nachdem die Steroidverabreichung unterbrochen worden war. Bemerkungen: Die Nebeneffekte der längeren Verabreichung des Steroids zur Heilung von Artikularrheumatismus können durch die Verwendung der Saponine ausgeschaltet werden, auch die mit der Unterbrechung der Steroidverabreichung verbundene Schwierigkeit kann in kurzer Zeit überwunden werden.

Die Antitumor- und Antikrebswirkung der erfindungsgemäßen Saponine wird nun anhand von pharmakologischen Versuchen und klinischen FäIlen beschrieben.

3. An t i tumo rwi rkung

(1) Tumorgewicht-Verfahren

Sarkoma-180-Zellen werden in ddy-Mäuse transplantiert; die Saponine aus Hydrangea bines werden den Mäusen 7 Tage lang verabreicht. Am 12ten Tag werden die Sarkoma-Tumoren entnommen, ihr Gewicht mit denen von Tumoren verglichen, die aus einer Kontrollmäusegruppe entnommen wurden. Die Tumoren, die den Mäu-

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sen entnommen wurden, die 50 rag/kg Saponine erhalten hatten, zeigten eine Gewichtsverminderung von etwa 40 % im Vergleich zur Kontrollgruppe. Das heißt, die Wirkung der Saponine ist signifikant, wobei P unter 0,05 liegt.

Diese Versuche werden mit verschiedenen Mäusegruppen durchgeführt, wobei jede Gruppe aus 10 weiblichen ddy-Mäusen mit einem Alter von 6 Wochen und einem Gewicht von 18 bis 22 g besteht. Ein hypodermisch transplantiertes Sarkom 180 wird aus einer anderen Maus extrahiert und mit einer physiologischen Natriumchloridlösung, die Kanamycin enthält, gewaschen. Schnitte mit einem Durchmesser von 1,5 bis 2,5 mm/ die 1 χ 10 Zellen enthalten, werden aus dem nicht-blutigen Teil des Sarkoms präpariert und hydrodermisch unter die rechte Achsel jeder Maus mittels einer Transplantationsnadel transplantiert. 24 h nach der Transplantation werden den Mäusen die erfindungsgemäßen Saponine in einer Menge von 10 mg/kg, 50 mg/kg oder 500 mg/kg intraperitoneal einmal täglich in Form einer Lösung in physiologischer Natriumchloridlösung injiziert. Die orale Verabreichung der Saponine erfolgt nach Auflösen in gereinigtem Wasser mittels eines Magenkatheders. Die Mäusekontrollgruppe erhält eine physiologische Natriumchloridlösung unter den gleichen Bedingungen. Diese Verabreichung wird während 7 Tagen fortgesetzt. Am 12ten Tag wird das Gewicht jedes Tumors (Sarkom) in jeder Maus gemessen und das Verhältnis von durchschnittlichem Tumorgewicht jeder Mäusegruppe zur Kontrollgruppe (T/C) berechnet, wobei die Wirkung der Saponine bestimmt wird.

Die Ergebnisse sind Tabelle X zusammengestellt.

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Tabelle X

Menge der verwende- Mäuse- Tumorgewicht (g) ten Saponine zahl (Mittelwert+Standard-

(mg/kg/Tag)	10	abweichung)	_+ 0,91	T/C*	P<
Kontrollgruppe	10	2,75	+_ 1 ,40	1,00
10 mg (intraperi- toneal)	10	3,35	+_ 0,73	1 ,22	**
50 mg (intraperi- toneal)	10	1,71	+_ 0,88	0,62	0,05
50 mg (oral)	10	1,49	+ 0,90	0,54	0,05
500 mg (oral)	2,09	0,76	**

* T/C: Verhältnis des mittleren Tumorgewichts jeder Mäusegruppe zur Kontrollgruppe ** : keine signifikante Differenz bei P > 0,05

Die Ergebnisse zeigen, daß man mit den erfindungsgemäßen Saponinen in einer Menge von 50 mg/kg eine Hemmung des Tumorwachstums von 46 % erhält

bei oraler Verabreichung, und eine Hemmung von 38 %, wenn sie intraperitoneal injiziert werden. Die Verwendung von 50 mg/kg Saponine, ob oral oder intraperitoneal, bringt eine um 24 % höhere Hemmung als die 10fache Dosis, d.h. von 500 mg/kg. Es ist auch festzustellen, daß die orale Verabreichung wirkungsvoller als die intraperitoneale Injektion ist. Entsprechende Ergebnisse erhält man auch, wenn in den Versuchen die Anzahl der transplantierten Tumorzellen auf 1/5, d.h. auf 2x10, vermindert wird und die Saponine während 12 Tagen verabreicht werden. Diese Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Saponine das Tumorwachstum wirkungsvoll hemmen, unabhängig von der Dosis,und daß sie bei oraler Verabreichung wirkungsvoller sind.

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(2) Versuche zur Verlängerung des Lebens

Sarkoma-180-Zellen werden intraperitoneal in ddy-Mäuse transplantiert, die erfindungsgemäßen Saponine aus Hydrangea bines werden den Mäusen 10 Tage lang oral verabreicht. Die Anzahl der überlebenden Mäuse werden mit einer Kontrollgruppe verglichen, wobei die lebensverlängernde Wirkung der Saponine untersucht wird. Die Kontrollgruppe zeigt eine mittlere Uberlebenszeit von 14,1 Tagen. Mäuse, die die erfindungsgemäßen Saponine in einer Menge von 50 mg/kg erhalten hatten, zeigen eine mittlere Überlebenszeit von 19,6 Tagen. Diese Ergebnisse zeigen deutlich die lebensverlängernde Wirkung der erfindungsgemäßen Saponine. Bei Ratten wird diese lebensverlängernde Wirkung dadurch bestimmt, daß Ratten die Saponine in einer Menge von 50 mg/kg täglich während 10 Tagen erhalten, dann den Ratten ein Yoshida-Sarkom intraperitoneal transplantiert wird und die Überlebenszeit im Vergleich zu einer Kontrollgruppe, die keine Saponine erhalten hatte, bestimmt wird. Während die Kontrollgruppe eine mittlere Uberlebenszeit von 11 Tagen hat, beträgt diese Überlebenszeit für Ratten, die Saponine erhalten hatten, 24,5 Tage, wodurch die lebensverlängernde Wirkung der Saponine deutlich wird. Im einzelnen wird der Versuch wie folgt durchgeführt:

Schnitte von Sarkoma-180 (1 χ 10 Zellen), die wie unter (1) hergestellt worden sind, werden in verschiedene Gruppen von Mäusen injiziert, wobei jede Gruppe aus 10 männlichen ddy-Mäusen mit einem Alter von 6 Wochen besteht. Nach 24 h erhält jede Mäusegruppe Saponine aus Hydrangea bines in einer Menge von 10 mg/kg oder 50 mg/kg in Form einer Lösung in gereinigtem Wasser einmal täglich während 10 aufeinanderfolgenden Tagen mit-

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tels eines Magenkatheders- Die Kontrollgruppe erhält nur die gleiche Menge an gereinigtem Wasser. Anschließend wird die Überlebenszeit und die Anzahl an überlebenden Tieren in jeder Gruppe bestimmt. Da eine Menge von 50 mg/kg Saponine die besten Ergebnisse bringt, werden die Versuche mit männlichen Wistar-Ratten mit einem Gewicht von etwa 200 g weitergeführt. Die Saponine werden den Ratten in einer Menge von 50 mg/kg täglich oral während 10 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht. Nach 3 Tagen wird den Ratten ein Yoshida-Sarkom (5x10 Zellen) intraperitoneal transplantiert. Die Überlebenszeit wird bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen XI und XII zusammengefaßt.

Tabelle XI
Antitumorwirkung der Saponine auf Sarkom 180 bei Mäusen

Menge der verwen- Anzahl der mittlere Überlebens- Anzahl der deten Saponine Mäuse zeit (Tage) toten Tiere

14,1 10/10

16,5 20,0 18,1

Tabelle XII

Antitumorwirkung der Saponine auf Yoshida-Sarkom bei vorhergehender Verabreichung der Saponine

Menge der verwen- Anzahl der mittlere Überlebens- Anzahl der deten Saponine Mäuse zeit (Tage toten Tiere

Kontrollgruppe 10 11,0 10/10

50 mg 10 27,5

Kontrollgruppe	10
10 mg	10
50 mg	10
500 mg	10

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(3) Klinische Falle Fall 1

A.S., eine 49jährige weibliche Angestellte. Erkrankung: Hepatom.

Familienanamnese: keine besonderen Erkrankungen. Anamnese: keine besonderen Erkrankungen.

Gegenwärtige Erkrankung: vor 2 Monaten klagte sie über Schmerzen und Beschwerden in der rechten Rippengegend. Ihr Fall wurde als Hepatom diagnostiziert. Trotz Behandlung wurde es nicht besser. Da sie sich zunehmend schwach fühlte, ihren Appetit und Gewicht verlor, besuchte sie diese Klinik. Sie war von durchschnittlichem Körperbau und etwas unterernährt. Die Haut zeigte eine ikterische gelbe Farbe. Einige harte und unebene Knoten von Daumenballengröße waren drei Fingerbreit unter dem rechten Rippenboden tastbar. Auch eine abdominale Wassersucht wurde festgestellt. Erythrozyten: 2 200 000/mm³; Leukozyten: 1 100/mm³; Blutsenkung: 50 mm (1 h); Blutplättchen: 50 000/mm³; Urin-Bilirubin (+); okkultes Blut im Stuhl (+); GOT/GPT: 5,0; A/G: 0,50; oi-Fetoprotein: 2 000 ^iug/dl. A Scintigramm der Leber zeigte einen ausgedehnten Defekt.

Ergebnisse der Behandlung: Die Patientin erhielt oral zweimal täglich während 1 Monats 200 mg Saponine aus Hydrangea bines. Ihre Müdigkeit, ihr Mangel an Appetit und der Ikterus verschwanden. Die abdominale Wassersucht konnte nicht mehr festgestellt werden. Die Schwellung der Leber verminderte sich auf eine Fingerbreite. Zugleich verminderte sich die Größe der Knoten. Die Labomntersuchungen zeigten folgende Werte: Erythrozyten: 3 100 000/mm³; Leukozyten: 10 000/mm³; Blutsenkung: 40 mm (1 h); Blutplättchen: 82 000/mm³. Keine Bilirubinurie; okkultes Blut im

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Stuhl: (-) ; GOT/GPT: 4,0; A/G: 0,8; oi-Fetoprotein: 1 -500/ig/dl. Diese Werte sind praktisch normale Ergebnisse. Nach 4 Monaten waren keine subjektiven oder objektiven Symptome mehr vorhanden. Die Leber war einen Fingerbreit unter dem Rippenboden tastbar. Sie war etwas hart, jedoch glatt; eine Tumormasse war nicht tastbar. Die abdominale Wassersucht war verschwunden. Die Laboratoriumswerte waren normal: Erythrozyten: 4 500 000/mm³; Leukozyten: 7 900/mm³; Blutsenkung: 25 mm (1 h); Blutplättchen: 150 000/mm³; GOT/GPT: 1,5; A/G: 1,2; oc-Fetoprotein: 1 000 μg/dl. Die Patientin wurde aus der Klinik entlassen; sie nimmt die erfindungsgemäßen Saponine oral nun während 2 Monaten. Sie ist wieder in der Lage, ihre übliche Arbeit durchzuführen.

Fall 2

M.M., ein 61 Jahre alter Angestellter. Krankheit: Karzinom der Speiseröhre.

Familienanamnese: seine Tochter wurde wegen eines Gebärmutterkrebses operiert.

Anamnese: keine besonderen Erkrankungen.

Gegenwärtige Erkrankung: Vor 6 Monaten begann er beim Schlucken von Nahrungsmitteln ein Gefühl der Behinderung und Schmerzen zu haben. Nach der medizinischen Untersuchung vor 2 Monaten wurde ein leichter Fall von ösophaguskrebs diagnostiziert. Er wurde vergeblich durch Radiotherapie behandelt und besuchte dann dieses Krankenhaus. Er war von mittlerem Körperbau, unterernährt und mit trockener Haut. Die Röntgenaufnahme der Speiseröhre zeigte eine Verengung und eine Masse; die wenig vorstand. Die Erythrozytenzahl betrug 2 500 000/mm³, die Leukozytenzahl 6 000/mm³.

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" " " BAb

Ergebnisse der Behandlung: Während 1 Monat erhielt der Patient zweimal täglich oral 200 mg Saponine aus Hydrangea bines. Die Verengung und den Schmerz, den der Patient beim Schlucken von Nahrungsmitteln gefühlt hatte, besserten sich etwas, die Röntgenuntersuchung zeigte eine Größenverminderung der Masse. Die Erythrozytenzahl betrug 3 000 OQO/mm³, die Leukozytenzahl 6 000/mm³. Nach 6monatiger Einnahme der Saponine verschwand das Gefühl der Beengung und der Schmerz beim Schlucken von Nahrungsmitteln, die Röntgenuntersuchung der Speiseröhre bestätigte die Wiederherstellung und zeigte keine Ausbuchtung mehr. Sowohl die Erythrozyten- als auch die Leukozytenzahlen waren wieder normal, d.h. 4 600 000/mm³ bzw. 7 500/mm³. Während 6 Monaten konnte kein Rückfall oder Metastasen festgestellt werden.

Fall 3

CA., ein 55jähriger männlicher Angestellter. Erkrankung: Ascites infolge von Krebs. Familienanamnese: keine besonderen Erkrankungen. Anamnese: keine besonderen Erkrankungen.

Gegenwärtige Erkrankung: Vor 2 Jahren wurde er am Magen operiert wegen Magenkrebs. Seit 1 Jahr hat er eine Aufblähung des Abdomen und eine Neigung zum Erbrechen; vor 3 Monaten wurde eine abdominale Wassersucht festgestellt. Er hatte dann ein Gefühl der Schwere in der linken supraclavicularen Höhle und in der linken Achselhöhle, in der fingerkuppengroße und bohnengroße Tumormassen tastbar waren^und kam in diese Klinik. Er war von mittlerem Körporbau mit trockener Haut und unterernährt. Die fingerkuppen- und bohnengroßen metastasierten Tumore wurden in der linken supraclavicularen Höhle und der linken Achselhöhle

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festgestellt. Das Abdomen war aufgebläht und mit Wasser gefüllt. Ein Tumor war im oberen Teil des Abdomens tastbar. Die Erythrozytenzahl betrug 2 300 000/mm³, die Leukozytenzahl war 3 300/mm³. Ergebnisse der Behandlung: Der Patient erhielt dreimal täglich 150 mg Saponine. Nach 1 Monat war die abdominale Wassersucht vermindert, es konnte praktisch keine Schwellung des Abdomen mehr festgestellt werden. Die Erythrozytenzahl hatte sich auf 2 800 000/mm³ und die Leukozytenzahl auf 4 500/mm³ verbessert. Nach 5monatiger kontinuierlicher Einnahme der Saponine war die abdominale Wassersucht verschwunden, die Haut wurde glänzend, eine Verminderung der Größe des Tumors im oberen Teil des Abdomens wurde festgestellt. Obwohl die metastasierten Tumore in der linken supraclavicularen Höhle und der Achselhöhle keine Größenverminderung zeigten, trat keine Verschlechterung ein. Die Schmerzen waren vollständig verschwunden. Die Erythrozytenzahl betrug 3 100 000/mm³, die Leukozytenzahl 5 000/mm³. Der Patient wird weiterhin mit den Saponinen behandelt. Er macht günstige Fortschritte ohne Zeichen einer Verschlechterung. Dieser Fall ist ein Beispiel für die Entfernung von abdominaler Wassersucht bei Ascites infolge von Krebs.

Die erfindungsgemäßen Saponine sind aber auch als Zellaktivator (zur Verhinderung des Alterns und zur Behebung von Müdigkeit) geeignet.

4. Wirkung als Zellaktivator

(1) Versuch zur Zellaktivicrung

Es ist bekannt, daß die Zelle die Grundeinheit für da.b Leben eines Organismus ist. Das Wachstum und die Degeneration

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einer Zelle können untersucht werden, wenn eine Zelle vom Gewebe eines lebenden Organismus abgetrennt wird und durch in einem entsprechenden Kulturmedium vermehrt wird, wie einem essentiellen Suspensions-Kulturmedium, das 10 % Kälberserum enthält. Das Fortschreiten derart durchgeführter aufeinanderfolgender Kulturen kann in drei Perioden eingeteilt werden, d.h., in eine erste Periode, während der die erste Generation kultiviert wird, in eine zweite Periode, in der die Multiplikation mit konstanter Geschwindigkeit erfolgt, und in eine dritte Periode, in der die Multiplikation ständig abnimmt, bis die Zelle schließlich stirbt, ohne sich weiter vermehren zu können, auch wenn die Bedingungen noch so sorgfältig kontrolliert werden. Die zweite Periode ist langer als die anderen beiden Perioden. In dieser Periode erlangen die Zellen per se ein hohes Vermögen zur Proteinsynthese und eine erhöhte Menge an DNA. Die Zellen teilen sich aktiv mit konstanter Geschwindigkeit. Während der dritten Periode erfolgt ein Zerfall der Ribosomen in der Zelle, was zu einer Verminderung des Vermögens zur Proteinsynthese und einer Unfähigkeit zur Teilung führt, bis schließlich die Zelle stirbt. Die Häufigkeit einer Zellteilung, die als das Leben der Zelle angesehen werden kann, hängt bei Verwendung des gleichen Kulturmediums im wesentlichen von der Art der Zelle ab. So vermehrt sich z.B. ein normaler diploider Fibroblast (W1-1), der aus der Lunge eines menschlichen Fetus abgetrennt worden ist, durch wiederholte Teilung mit einer Geschwindigkeit von 35+^2 h je Teilung' während der zweiten Periode (Multiplikationsperiode), wenn er in einem essentiellen Suspensions-Kulturmedium, das 10 % Kälberserum enthält, kultiviert wird. Während der dritten Periode wird die Zelle schwach und stirbt schließlich, ohne sich weiter ver-

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mehren zu können, nach der 51sten Generation.

Eine Zelle, die aus menschlicher Haut mit Werner's Syndrom abgetrennt worden ist, stirbt ohne Möglichkeit der weiteren Kultivierung nach der 22sten Generation.

In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, daß bei Zugabe von ug/ml der erfindungsgemäßen Saponine zum Kulturmedium am Anfang der zweiten Periode die Aktivität der Zelle während dieser zweiten Periode durch die dadurch erfolgte Erhöhung der aufeinanderfolgenden Teilungen verlängert wird. Insbesondere erhält man durch die Zugabe der erfindungsgemäßen Saponine in einer Menge von 200 yug/ml aufeinanderfolgende Teilungen bis zur 27sten Generation, d.h. eine Verlängerung des Zellebens um 22,7 %. Entsprechend gibt die Zugabe von erfindungsgemäßen Saponinen in einer Menge von 200 μg/ml zum Kulturmedium eines normalen diploiden Fibroblasten aus der Lunge eines menschlichen Fetus aufeinanderfolgende Teilungen bis zur 59sten Generation, d.h. eine Verlängerung des Zellebens um 15,7 %.

Die zellaktivierende Wirkung der erfindungsgemäßen Saponine wird anhand der Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 19

Ein Gewebeschnitt von menschlicher Haut mit Werner's Syndrom wird mit einer 0,OBprozentigen wäßrigen Trypsinlösung behandelt, um eine Zellsuspension herzustellen. Diese Zellsuspension wird in ein essentielles Suspensions-Kulturmedium, das 10 % Kälberserum in einem Verhältnis von 1:4 enthält, implantiert und bei

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36⁰C kultiviert. Tn 2 bis 3 Tagen bedecken die Zellen die gesamte Oberfläche des Glases. Die Zellen werden wiederum mit Trypsin behandelt, um eine Zellsuspension herzustellen. Der Inhalt einer einzigen Kulturflasche wird in zwei Portionen aufgeteilt und in ein essentielles Suspensions-Kulturmedium, das 10 % Kälberserum enthält, zur weiteren Kultivierung gegeben. . Entsprechend werden zweimal wöchentlich aufeinanderfolgende Teilungen bis zur 22sten Generation durchgeführt. Danach hören die Zellen von selber auf, sich zu teilen und können nicht mehr vermehrt werden (Kontrollbeispiel). Mit Beginn der 7ten Generation werden der Kulturlösung Saponine in einer Menge von 200 μg/ml zugegeben, die aufeinanderfolgenden Kulturen werden entsprechend durchgeführt. Auf diese Weise wird das Leben der Zelle deutlich verlängert mit einer erhöhten Häufigkeit der aufeinanderfolgenden Teilungen. Werden dem Medium keine Saponine zugesetzt, hört die Teilung der Zellen mit der 22sten Generation auf. Die Ergebnisse sind in Tabelle XIII zusammengefaßt.

Tabelle XIII

Häufigkeit auf- Verlängerung einanderfolgen- des Zellebens der Teilungen (%) (mal)

Kontrolle 22 0

zugesetzte Saponine 27 22,7

Beispiel 20

Die Arbeitsweise des Beispiels 19 wird zur Herstellung oirior Zellsuspension eines normalen diploiden Fibroblasten (W1-1) aus dem Lungengewebe eines menschlichen Fetus wiederholt. Die auf

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diese Weise hergestellte Zellsuspension wird in ein essentielles Suspensions-Kulturmedium, das 10 % Kälberserum enthält, implantiert. Entsprechend werden die aufeinanderfolgenden Kultivierungen zweimal pro Woche bis zur 51sten Generation fortgeführt, wonach die Zellen von selber aufhören, sich zu teilen und nicht mehr kultiviert werden können (Kontrollbeispiel). Mit Beginn der 21sten Generation werden der Kulturlösung Saponine in einer Menge von 200 μg/ml zugesetzt, die aufeinanderfolgende Kultivierung wird entsprechend fortgeführt. Die Kultivierung kann bis zur 59sten Generation fortgeführt werden mit einer Verlängerung des Zellebens um 15,7 %.

Tabelle XIV

Häufigkeit aufein- Verlängerung anderfolgender Tei- des Zellebens lung en (mal) (%)

Kontrolle 51 0

zugesetzte Saponine 59 15,7

Das essentielle Suspensions-Kulturmedium hat folgende Zusammensetzung:

Bestandteile	Menge (mg/Liter)
L-Arginin-hydrochlorid	126,4
L-Cystin	24,0
L-Glutamin	292,3
L-Histidin-hydrochlorid	41 ,9
L-Isoleucin	52,5
L-Leucin	52,5
L-Lysin-hydrochlorid	73,1
!.-Methionin	14,9
L-Phenylalanin	33,0
L-Threonin	47,6
L-Tryptophan	10,2

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Fortsetzung

Bestandteile Menge (mg/Liter)

L-Tyrosin 36,2

L-Valin . 46,9

L-Cholin-hydrochlorid 1,0

D-Calcium-pantothenat 1,0.

und

Folsäure 1,0.

(2) Ermüdbarkeitstest

Männliche dr-Mäuse mit einem Gewicht von 15 bis 20 g, in Gruppen von 20, werden 1 h von Futter und Wasser ferngehalten, dann werden ihnen oral erfindungsgemäße Saponine in einer Menge von 50 mg/kg oder 200 mg/kg in Form einer wäßrigen Lösung verabreicht. Nach 1 h wird jeder Maus am Schwanz ein Gewicht entsprechend 3 % ihres Körpergewichts angebunden. Die Maus muß in 22°C warmem Wasser schwimmen, wobei die Zeit (in s), während der die Maus mit der Last schwimmen kann, bestimmt wird. Jede Maus der Kontrollgruppe erhält nur eine entsprechende Menge an Wasser. Die Ermüdungsgrenze ist dann erreicht, wenn die Maus unter Wasser sinkt und ihren Kopf nicht mehr für mindestens 10 s über Wasser heben kann.

Tabelle XI

Menge an verabreichten Anzahl der Zeit bis zur Ermüdungsgrenze Saponinen Mäuse (s) (Mittelwertestandard-

abweichung.)

Kontrollgruppe	20	188+^0,3
50 mg/kg (oral)	20	248+13,9
20 0 mg/kg (oral)	20	296^16,3

Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, daß die erfindungsge-

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30A2117

mäßen Saponine die Zeit, während der die Mäuse schwimmen können, deutlich verlängert und daß sie somit eine entzündungshemmende Wirkung haben.

Die erfindungsgemäßen Saponine haben auch eine sedative und hypnotische Wirkung und können als Mittel zur Kontrolle allgemeiner Unpäßlichkeiten oder Streß verabreicht werden.

5. Sedative und hypnotische Wirkung

(1) Verlängerung der Hypnosewirkung (Versuch zur Bestim-

mung der Verstärkung der Wirkung eines Barbitalsalzes}

Die erfindungsgemäßen Saponine werden in Mengen von 5 0 mg/kg

oder 100 mg/kg in Form einer Lösung in 1 ml physiologischer

weiblichen
Natriumchloridlösung/ddy-Mäusen mit einem Gewicht von 19 bis

20 g, in Gruppen von 10 Tieren, intraperitoneal injiziert. Nach 0,5 h werden jeder Maus 300 mg/kg Barbital-natriumsalz intraperitoneal injiziert. Die Mäuse der Kontrollgruppe erhalten zuerst 1 ml physiologischer Natriumchloridlösung, dann nach 0,5 h 300 mg/kg Barbital-natriumsalz durch intraperitoneale Injektion. Diese Versuche werden gemäß dem Vorfahren von Kuhn et al (W.L. Kuhn & E.F. Van Mannen,"J. Pharm. Exp. Therap.", 134, 60 (1961)) durchge führt.

Die Mäuse, denen die erfindungsgemäßen Saponine verabreicht worden waren, zeigten eine längere mittlere Hypnosezeit als die Tiere der Kontrollgruppe. Es wurde festgestellt, daß die Saponine die Wirkung des Barbital-natriumsalzes verstärken.

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Tabelle XVI

Menge der verab- Anzahl der Hypnosezeit (min)(Mittelreichten Saponine Mäuse wert ±·Standardabweichungj

Kontrollgruppe	10	51	,3	1 6	,3	0	,01
50 mg/kg	10	65	,1	± 2	,8	0	,01
100 mg/kg	10	67	,4	± 3	,3	0	,01

Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Saponine in einer Menge von 50 mg/kg und 100 mg/kg die Hypnosezeit um etwa 27 % bzw. 31 % verlängern können. Diese Ergebnisse bestätigen die sedative Wirkung der erfindungsgemäßen Saponine und ihre Brauchbarkeit als Hypnotikum.

(2) Mescalin-Test

Zur Bestimmung der sedierenden Wirkung eines bestimmten Präparats wird einer Maus Mescalin verabreicht, die dann mit ihren Hinterbeinen kräftig zu kratzen anfängt. Sobald die Maus ein Präparat mit sedierender Wirkung erhält, unterbleibt diese Bewegung.

Jeder Maus von Gruppen mit 10 ddy-Mäusen mit einem Gewicht von 19 bis 20 g werden intramuskulär 50 mg/kg Mescalin injiziert. Nach 15 min erhalten die Tiere durch intraperitoneale Injektion die erfindungsgemäßen Saponine in Mengen von 5 0 mg/kg oder 100 mg/kg als Lösung in 1 ml physiologischer Natriumchloridlösung. Die Tiere der Kontrollgruppe erhalten., nur 1 ml physiologische Natriumchloridlösung. Die Anzahl der Kratzbewegungen der Hinterbeine wird für jede Maus während 15 min bestimmt und mit den Ergebnissen der Kontrollgruppe verglichen (vgl. Yoshio

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Ban et al, "Method of Studying Medicines", 251, Asakura Shoten, Tokyo, 1969).

Tabelle XVII zeigt, daß die Mäuse, die die erfindungsgemäßen Saponine aus Hydrangea bines erhalten hatten, deutlich weniger Kratzbewegungen als die Tiere der Kontrollgruppe machen.

Tabelle XVII

Anzahl der Kratzbewegungen P < (Mittelwert + Standardabweichung)

45 +_ 4 0,01

21 _+ 3 0,01

17+3 0,01

Menge der verab reichten Sapo nine	Anzahl der Mäuse
Kontrollgruppe	10
50 mg/kg	10
100 mg/kg	10

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Saponine in Mengen von 50 bzw. 100 mg/kg die Kratzbewegungen der Mäuse um 53 % bzw. 62 % vermindern können, bezogen auf die Bewegungshäufigkeit der Kontrolltiere. Diese Ergebnisse bestätigen die sedative Wirkung der erfindungsgemäßen Saponine.

(3) Krümmungstest durch Essigsäure

Zur Bestimmung der sedativen und analgetischen Wirkung eines Präparats wird einer Maus nach Verabreichung des Präparats 0,7 Essigsäure intraperitoneal injiziert. Die Häufigkeit, mit der sich die Maus krümmt, wird bestimmt und mit den entsprechenden Ergebnissen einer Kontrollgruppe verglichen. Eine niedrigere Häufigkeit deutet auf die höhere sedierende und analgetische Wirkung des Präparats hin.

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Männlichen ddy-Mäusen mit einem Gewicht von 20 bis 22 g werden 50 mg/kg oder 100 mg/kg erfindungsgemäße Saponine als Lösung in 1,0 ml physiologischer Natriumchloridlösung intraperitoneal injiziert. Die Tiere der Kontrollgruppe erhalten nur 1,0 ml physiologische Natriumchloridlösung intraperitoneal. Nach 1 h wird jeder Maus 0,7prozentige Essigsäure intraperitoneal injiziert. Unmittelbar danach wird die Anzahl der Körperkrümmungen jeder Maus während 15 min gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle XVIII zusammengefaßt.

Tabelle XVIII

Menge der verab- Anzahl Anzahl der Krümmungen (Mittelreichten Sapo- der wert +_ Standardabweichung) P< nine Mäuse

Kontrollgruppe	10	48	,9	± 6	,9	0,01
50 mg/kg	10	41	,1	± 7	,7	0,01
100 mg/kg	10	35	,1	1 6	,5	0,01

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Saponine in Mengen von 50 bzw. 100 mg/kg die Anzahl der Krümmungen um etwa 16 % bzw. 28 % vermindern können, bezogen auf die Ergebnisse, die mit der Kontrollgruppe erhalten wurden. Diese Ergebnisse bestätigen deutlich die sedative Wirkung der erfindungsgemäßen Saponine.

(4) Streßversuch bei Mäusen

Die erfindungsgemäßen Saponine werden in Mengen von 50 mg/kg oder 100 mg/kg täglich während 10 aufeinanderfolgenden Tagen

männlichen
oral/ddy-Mäusen mit einem Gewicht von 19 bis 20 g, in Gruppen

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von 10 Tieren, als Lösung in 1 ml physjölogischer Natriumchloridlösung verabreicht. Die Tiere der Kontrollgruppe erhalten wäh-

oral
rend 10 Tagen/1,0 ml physiologische Natriumchloridlösung. Alle Tiere werden gemäß dem Verfahren gemäß K. Takagi et al, "Jap. J. Pharmac", 2_2' 17 (1972) einem Streß unterworfen. Die Mäuse werden in einen Käfig aus rostfreiem Stahl, der eine Größe von 14 χ 15 χ 20 mm hat und 10 g eines Schwamms enthält, gesetzt. Der Käfig wird mit einer Amplitude von 12,8 cm und einer Geschwindigkeit von 130 mal je min während 210 min geschüttelt. Nach 1 h werden die Mäuse auf eine Platte aus rostfreiem Stahl gesetzt, die Platte wird pro min um 105° geneigt. Auf diese Weise wird der Winkel bestimmt, bei dem die Maus die Platte herunterrutscht, ohne der Neigung weiter widerstehen zu können. Dadurch wird die Wirkung der Saponine zur Erholung der Mäuse vom Streß untersucht. 1 h nach Beenden des Schütteis der Käfige wird die Rektaltemperatur jeder Maus gemessen, die Erholung vom Streß wird dadurch bestätigt.

Während die Mäuse der Kontrollgruppe die Platte bei einem durchschnittlichen Winkel von 45° 1 h nach Beendigung des Schütteins hinunterrutschen, können die Mäuse, denen die erfindungsgemäßen Saponine verabreicht worden waren, der Neigung wesentlich länger widerstehen, d.h. bis zu einem Winkel von durchschnittlich 51,2°, bei Tieren, die 50 mg/kg Saponine erhalten hatten,und bis zu einem mittleren Winkel von 52,3° bei einer Dosis von 100 mg/kg.

Während die Mäuse der Kontrollgruppe 1 h nach Beenden des Schütteins eine mittlere Rektaltemperatur von 35,1⁰C hatten, erholten sich die Tiere, denen 50 mg/kg bzw. 100 mg/kg Saponine verab-

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reicht worden waren, deutlich schneller. Die Rektaltemperaturen lagen bei 36,0⁰C bzw. bei 36,2°C im Durchschnitt.

Diese vier pharmakologischen Versuche bestätigen die sedative, hypnotische und streßerlexchternde Wirkung der erfindungsgemässen Saponine.

(5) Klinische Fälle Fall 1

Y.O., eine 42jährige Hausfrau. Krankheit: Schlaflosigkeit.

Familienanamnese: ihre Mutter wurde wegen autonomen Gleichgewichtsstörungen behandelt.
Anamnese: keine besonderen Erkrankungen.

Gegenwärtige Erkrankung: vor 1 Jahr litt die Patientin zum ersten Mal an Schlaflosigkeit. Nachdem sie vergeblich ein Beruhigungsmittel genommen hatte, besuchte sie dieses Krankenhaus. Sie war von durchschnittlichem Körperbau und hatte eine durchschnittliche Haut. Der Bluttest zeigte keine Anormalitäten der Leber- oder Nierenfunktionen. C.M.I, war in der Gegend III. Das einzige Symptom der Patientin war ihre Schlaflosigkeit. Ergebnisse der Behandlung: Die Patientin erhielt oral zweimal täglich 200 mg erfindungsgemäße Saponine während 1 Monats. Als Ergebnis normalisierte sich der C.M.I, in die Gegend I. Sie litt nicht mehr an Schlaflosigkeit. Dieser Fall zeigt, daß Schlaflosigkeit in einer so kurzen Zeit, wie 1 Monat, geheilt werden kann. Dieses Ergebnis wird der Wirkung der erfindungsgemäßen Saponine als CNS-Erniedriger zugeschrieben.

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Fall 2

O.M., eine 29jährige Locherin.

Erkrankung: Syndrom von allgemeiner Unpäßlichkeit (Kopfschmerzen und Unwohlsein).

Faralienanamnese: keine besonderen Erkrankungen. Anamnese: keine besonderen Erkrankungen.

Gegenwärtige Erkrankung: Vor 2 Jahren begann sie mit der Arbeit als Locherin für einen Computer. Vor 1 Jahr bekam sie Kopfschmerzen während der Arbeit und in letzter Zeit wurde es besonders akut, daher besuchte sie diese Klinik. Sie war von mittlerem Körperbau und hatte eine durchschnittliche Haut. Ein Bluttest offenbarte keine Anomalitäten. Sie fühlte sich ständig unpäßlich und litt an Kopfschmerzen, sobald sie an die Arbeit ging. Der C.M.I, war in der Region II.

Ergebnisse der Behandlung: Die Patientin erhielt während 1 Monats oral 200 mg Saponine zweimal täglich. Als Ergebnis normalisierte sich der C.M.I, in die Gegend I. Sie litt nicht mehr an Kopfschmerzen und fühlte sich auch nicht unwohl in ihrem täglichen Leben. Auch während der Arbeit fühlte sie sich wohl.

Fall 3

K.K., eine 19jährige Studentin. Erkrankung: geistiges Unbehagen und Hysterie. Familienanamnese: keine besonderen Erkrankungen.

Anamnese: als sie 15 Jahre alt war, wurde sie wegen eines Duodenalulcus operiert.

Gegenwärtige Krankheit: seit 1 Jahr fühlt sie sich wegen ihres Studiums unwohl und ist immer gereizt. Da sie wegen jeder Kleinigkeit Angstgefühle hatte und auf Kleinigkeiten in scharfer

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OR(GiNAL

Weise reagierte, besuchte sie diese Klinik. Sie war von kleiner Gestalt und hatte eine Haut mit normaler Farbe. Ein Bluttest zeigte keine Anomalitäten. Sie fühlte sich immer gereizt und voller Angst. Der C.M.I, lag in der Gegend II.

Ergebnisse der Behandlung: die Patientin erhielt während 1 Monats 200 mg erfindungsgemäße Saponine zweimal täglich oral. Als Ergebnis fühlte sie sich nicht mehr gereizt. Nach 2 Monaten war ihr Angstgefühl vollständig verschwunden, der C.M.I, hatte sich in die Gegend I normalisiert. Es war für sie möglich geworden, ein normales Leben zu leben. Dieser Fall bestätigt die sedative Wirkung der erfindungsgemäßen Saponine.

Fall 4

D.Y., ein 39jähriger männlicher Angestellter. Erkrankung: autonome Unausgeglichenheit (Migräne, Gefühl der Müdigkeit, Appetitlosigkeit, Steifheit in den Schultern, kalte Hände und Füße, Erregbarkeit).

Familienanamnese: keine besonderen Erkrankungen. Anamnese: keine besonderen Erkrankungen.

Gegenwärtige Krankheit: seit 1 1/2 Jahren leidet der Patient unter Nervenerschöpfung bei der Arbeit, fühlt sich ständig gereizt, hat Migräne, Appetitlosigkeit, Steifheit in den Schultern und sehr kalte Hände und Füße sowie ein Gefühl der Müdigkeit. Nachdem er vergeblich ein Beruhigungsmittel versucht hatte, besuchte er dieses Krankenhaus. Er hatte einen durchschnittlichen Körperbau und eine Haut von gewöhnlicher Farbe. Weder die Rontqununtersuchung noch der Bluttest zeigten Anomalitäten. Er beklagte sich jedoch sehr über verschiedene subjektive Symptome, wie Migräne, Appetitlosigkeit, Steifheit der Schultern,

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kalte Hände und Füße, Reizbarkeit und Gefühl der Müdigkeit. Der C.M.I, war in der Gegend III.

Ergebnis der Behandlung: der Patient erhielt zweimal täglich 200 mg erfindungsgemäße Saponine oral. Nach 1 Monat fühlte er keine Reizung, Migräne oder Kälte in den Händen und Füßen, worüber er sich hauptsächlich beklagt hatte, mehr. Der C.M.I, hatte sich in die Gegend II normalisiert. Nach 2 1/2 Monaten bekam er wieder Appetit, hatte keine Steifheit in den Schultern und auch kein Gefühl der Müdigkeit-mehr. Nach 3 Monaten wurde die Verabreichung der Saponine unterbrochen, nach 6 Monaten lebt der Patient nun ein gewöhnliches Leben ohne Rückfall in die Krankheit.

6. Wirkung auf den Lipid-Metabolismus

Fettgewebe wird von den Epididymiden von männlichen Wistar-Ratten mit einem Gewicht von je 150 bis 180 g abgetrennt, die Fettzellen werden daraus gemäß der Methode von M. Rodbell "J. Biol. Chom.", 239, 375 (1965) gewonnen. Aus 4 g Fettgewebe wird ein schmaler Schnitt präpariert und mit 10 ml Krebs-Ringer-Bicarbonat-Pufferlösung versetzt, die 0,4g Albumin, 10 mg Collagenase und 5 mg Glucose enthält und einen pH-Wert von 7,4 hat. Das Gemisch wird 50 min auf 37°C erhitzt, dann bei 300 U/min zentrifugiert, die schwebende Fettzellenschicht wird abgetrennt. Diese Fettzellen werden mit 10 ml des oben angegebenen Puffers, pH 7,4, versetzt, die Lösung wird vorsichtig gerührt, um die Fettzellen zu waschen, · dann 30 s bei 300 U/min zentrifugiert. Dieses Verfahren wird zweimal wiederholt, die Fettzellen werden sehr gut gewaschen und für die verschiedenen Versuche verwendet. Die Versuche werden in einer wäßrigen Lösung jedes Gynosaponins A, B, E,

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£,8*-*"* ^: "· "^:'30"42i17

F, G, I,J, K, M, N, O, P, Q, R, S, T und U sowie der Progynosapogenine A_ , Λ-ΛΗ und O₁ durchgeführt, wobei diese Lösungen auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt wurden.

(1) Wirkung der Gynosaponine auf die durch ACTH verursachte Zersetzung der Fette in den Fettzellen

Die durch die Behandlung mit Collagenase erhaltenen Fettzellen werden in Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer, pH 7,4, suspendiert. 0,3 ml dieser Lösung, die 10 mg Fettzellen enthält, 0,1 ml ACTH-Lösung, die 1 [ig ACTH (adrenocorticotropes Hormon), 0,1 ml der jeweiligen Saponinlösung, die 500 ug Saponin enthält und 0,3 ml einer 5prozentigen Albuminlösung in Krebs-Ringer-Bicarbonatpuf-

in einem Probenröhrchen fer werden auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt und/2 h auf 37°C erhitzt. Die Menge der gebildeten freien Fettsäuren wird gemäß V.P. Dole "J. Biol. Chem.", 3_5, 150 (1958) bestimmt.

Das Reaktionsgemisch wird mit 3 ml Dole's Extrakt sowie 1 ml Thymolblaulösung versetzt. In die entstandene Lösung wird Stickstoff eingeblasen, die Lösung wird dann unter Rühren mit 0,008n Natronlauge titriert. Die Menge der gebildeten freien Fettsäure wird anhand einer Eichkurve bestimmt.

Die Hemmung der Fettzersetzung wird gemäß folgender Gleichung berechnet:

Hemmung der Fettzer- _ A-B _inn

setzung (%) " x iuu

wobei A die Menge an freien Fettsäuren ist, die durch Zugabe von 1 μ9/πι1 ACTH allein gebildet werden, B die Menge an freien Fettsäuren, die durch die Zugabe von 1 μg/ml ACTH und 20 ug/ml

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Saponin gebildet werden.

Tabelle XIX zeigt die Hemmung durch die verschiedenen Gynosaponine der durch ACTH verursachten Fettzersetzung in den Fettzellen.

Tabelle XIX

durch Zersetzung von Fett gebildete freie

Zusätze	Gynosaponin	A
ACTH	ti	B
ACTH +	Il	E
Il +	Il	F
Il +	Il	G
Il +	Il	I
Il +	Il	J
Il +		K
Il _,	Il	M
Il +	Il	N
Il ,	Il	O
M +
Il ,

Fettsäuren (uVal/g)	Hemmung (%)
0	-
8,4	0
6,1	27
6,9	18
5,9	30
6,3	25
5,8	31
6,6	21
5,3	37
6,1	27
6,4	24
5,2	38
5,6	33
6,2	26
AH 6,3	25
5,9	30
6,6	21
5,8	31
6,2	26
5,4	36
6,3	25
5,6	33

Progynosapogenin

" + Gynosaponin P

M₊ " Q

M₊ "R

H₊ "S

M₊ Il ip

¹¹ + "U

ACTH wurde in einer Menge von 1 μg/ml und die Saponine in einer Menge von 20 μg/ml verwendet.

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß eine Menge an freien Fettsäuren von 8,4 iiVal/g aus der Zersetzung von Fett entsteht,

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wenn die Fettzellen mit ACTH in einer Menge von 1 μg/ml behandelt und 2 h bei 37°C stehengelassen worden sind. Die Verwendung der Gynosaponine in einer Menge von 20 μg/ml vermindert diese Fettzersetzung, wodurch auch die Menge an freien Fettsäuren gesenkt wird. Die mittlere Hemmung beträgt 28 %.

(2) Wirkung der Gynosaponine auf die durch Adrenalin verursachte Zersetzung von Fett in den Fettzellen

Die durch Behandlung mit Collagenase erhaltenen Fettzellen werden in Krebs-Ringer-Phosphatpuffer,. pH 7,4, suspendiert.

In einem Probenröhrchen werden 0,3 ml dieser Lösung, die 100 mg

enthält,
Fettzellen/ 0,1 ml einer Adrenalinlösung, die 1 μg Adrenalin enthält, 0,1 ml einer Saponinlösung, die 20 μg Saponin enthält, und 0,5 ml einer "5prozentigen Albuminlösung in Krebs-Ringer-Phosphatpuffer auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt und 2 h auf 37°C erhitzt. Die Menge der gebildeten freien Fettsäuren wird mit der Dole-Methode bestimmt. Insbesondere wird das Reaktionssystem mit 3 ml Dole's Extrakt versetzt, 5 min geschüttelt, dann mit 3 ml Heptan und 1 ml Thymolblaulösung versetzt. Die entstandene Lösung wird unter Rühren und Stickstoffschutz gegen 0,008n Natronlauge titriert. Die Menge an gebildeten freien Fettsäuren wird anhand einer Eichkurve bestimmt.

Die Hemmung wird wie oben berechnet.

Tabelle XX zeigt die Hemmung durch verschiedene Gynosaponine der durch Adrenalin verursachten Zersetzung von Fett in den Fettzellen.

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Zusätze

Adrenalin
Adrenalin

- WS -Tabelle XX

durch Zersetzung von Fett gebildete freie

	B	Fettsauren (uVal/g) Hemmung (%)	A-AH	0	-
	E		o	14,1	0
	F		13,4	5
	G		9,1	35
	I		9,4	33
	J		13,4	5
Gynosaponin A	K		13,8	2
Il	M		12,7	10
Il	N		13,1	7
Il	0		13,8	2
Il	P		13,5	4
Il	Q		13,3	6
Il	R		13,9	1
Il	S		12,7	10
Il	T		13,5	4
Il	U		14,0	1
Il		13,5	4
Il		13,1	7 '
Il		13,8	2
Il		13,0	8
Il	Progynosapogenxn A2	.12,4	12
Il	Il	12,6	11
Il	Il

Adrenalin wurde in einer Menge von 1 μg/Inl , die Saponine in einer Menge von 20 ^g/inl verwendet.

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß freie Fettsäuren in einer Menge von 14,1 \iVal/g entstehen bei der Zersetzung von Fett,
wenn die Fettzellen mit Adrenalin in einer Menge von 1 ug/ml
behandelt und bei 37°C 2 h stehengelassen werden. Die Verwendung von Gynosaponinen in einer Menge von 20 μg/ml vermindert diese Fettzersetzung durch Adrenalin, wodurch auch die Menge der ge-

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bildeten freien Fettsäuren gesenkt wird. Alle "untersuchten Gynosaponine, ausgenommen Gynosaponin B und E, zeigen eine geringere Hemmung der Fettzersetzung durch Adrenalin als bei der Fettzersetzung durch ACTH.

(3) Wirkung der Gynosaponine auf die Fettsynthese aus Glucose in Fettzellen

C-Glucose wird mit Fettzellen umgesetzt, die Menge an Glucose,

die an der Fettsynthese teilnimmt und in die Fettzellen als neutrales Fett einverleibt wird, wird mit einem Geigerzähler bestimmt. Bei dieser Reaktion wird die Wirkung der Gynosaponine untersucht.

Insbesondere werden die durch Behandlung mit Collagenase erhaltenen Fettzellen in Krebs-Ringer-Phosphatpufferlösung suspendiert. In einem Probenröhrchen werden 0,35 ml dieser Lösung, die 100 mg Fettzellen enthält, 0,1 ml Saponinlösung, die 20 μg Saponin enthält, 0,5 ml einer 5prozentigen Albuminlösung in Krebs-Ringer-Phosphatpuffer, die 10 mMol Glucose enthält und

1 4 einen pH-Wert von 7,4 hat, und 0,05 ml einer C-Glucoselösung, die 10 mMol Glucose in Krebs-Ringer-Phosphatpuffer, pH 7,4, enthält und eine Radioaktivität von 0,5 \iCi hat, 30 min auf 37°C erhitzt. Das Gemisch wird mit 5 mi Dole's Extrakt versetzt, 5 min geschüttelt, mit 3 ml Heptan und 2 ml Wasser versetzt und wieder 5 min geschüttelt. 3 ml der Heptanphase werden abgetrennt, mit 3 ml einer alkalischen Äthanollösung (0,5 η Natronlauge, 50 % Äthanol) versetzt und 5 min geschüttelt. 1 ml der Äthanolphase wird abgetrennt und mit 10 ml einer Toluol-Scintillationslösung versetzt. Die Radioaktivität wird gemäß Skipski et al, "Biochem.

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Biophys. Acta", 106, 386 (1965) bestimmt. Tabelle XXI zeigt die Wirkung der Gynosaponine auf die Fettsynthese aus Glucose in den Fettzellen.

Tabelle XXI

Synthese neutraler Fette

	A (20	ug/ml)	aus Glucose	500	Wir
Zusätze	B	Il	(Impulse/min/g)	013	kung (%
—	E	Il	21	308	100
Gynosaponin	F	Il	8	248	37
Il	G	Il	12	620	57
Il	I	Il	10	925	48
It	J	Il	11	564	54
Il	K	Il	8	650	42
Il	M	Il	10	600	49
Il	N	Il	11	650	54
Il	O	Il	13	870	63
Il	P	Il	12	263	59
Il	Q	Il	9	165	46
Il	R	Il	8	620	38
Il	S	Il	8	600	38
II	T	Il	11	100	54
Il	U	Il	12	150	59
It	Progynosapogenin	A2 (20 ug/ml)	10	100	47
Il	Il	A-AH "	11	650	52
II	Il	O1	13	550	61
		12	200	59
		10	49
		11	52

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Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß viele der untersuchten Gynosaponine die Glucosemenge, die in die Fettzollon als neutrales Fett einverleibt wird, bis unter die Hälfte der Ergebnisse vermindert, die erhalten werden, wenn kein Gynosaponin verwendet wird. Das macht deutlich, daß die Gynosaponine eine Hemmfunktion bei der Fettsynthese aus Glucose in den Fettzellen haben.

Die erf indungscjemäßen Gynosaponine sind somit wirkungsvoll sowohl bei der Zersetzung als auch bei der Synthese von Fetten in den Fettzellen und sind daher als neues Mittel für den Lipid-Ketabolismus geeignet.

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⁰^AL INSPECTED

Claims (16)

Patentansprüche

1. ) Verbindungen der Formel I und deren nicht-toxische Salze

in der

(a) wenn R¹ eine /"ß-D-Glucopyranosyl (1-*2) -oi-L-rhamnopyranosyl(1-?6)_7-ß-D-glycopyranosylgruppe ist, R ein Wasserstoff atom, eine ß-D-Glucopyranosyl (1*6) -ß-D-glucopyranosyl-j eine c<-L-Rhamnopyranosyl (146)-i3-D-glucopyranosyl- oder ß-D-Glucopyranosylgruppe und R³ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe ist,

(b) wenn R¹ eine ß-D-Glucopyranosyl (1 -»2) -ß-D-glucopyranosylgruppe ist, R eine c<-L-Rhamnopyranosyl (1*6) -ß-D-glucopyranosylgruppe und R³ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe

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ORiGiMAL INSPECTED

(c) wenn R eine c(-L-Rhamnopyranosyl (1->6) -ß-D-glucopyranosylgruppe ist, R eine ß-D-Glucopyranosyl (1->6) -ß-D-glucopyranosyl- , o<-L-Rhamnopyranosyl (1-*6)-ß-D-glucopyranosyl- oder ß-D-Gluco-

pyranosylgruppe und R ein Wasserstoffatom ist/

1 2

(d) wenn R eine D-Glucopyranosy!gruppe ist, R eine ß-D-Xylo-

pyranosyl (1 ->6) -ß-D-glucopyranosyl-, o(-L-Rhamnopyranosyl (1 ->6) -ß-D-gluccpyranosyl- oder ß-D-Glucopyranosyl (1-3-6)-ß-D-glucopyrano-

3
sylgruppe und R ein Wasserstoffatorn ist,

1 2

(e) wenn R ein Wasserstoffatom ist, R eine ß-D-Glucopyrano-

syl-, ß-D-Xylopyranosyl (1->6) -ß-D-glucopyranosyl- oder cK-L-Rhamnopyranosyl(1^6)-ß-D-glucopyranosylgruppe und R ein Wasserstoff atom oder eine Hydroxylgruppe ist, ausgenommen der Fall,

13 2

in dem R und R Wasserstoffatome und R die ß-D-Glucopyranosyl-

gruppe ist,

(f) wenn R¹ eine ß-D-Xylopyranosyl (1 -*2) -ß-D-glucopyranosyl-

gruppe ist, R eine ß-D-Xylopyranosyl (1·*6) -ß-D-glucopyranosyl-

3 oder oC-L-Rhamnopyranosyld ->6) -ß-D-glucopyranosylgruppe und R

ein Wasserstoffatom ist.

2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Gynosaponin A, B, E, F, G, I, J, K, M, N, O, P, Q, R, S, T oder U oder Progynosapogenin A„, A-AH oder O. sind.

3. Verfahren zur Isolierung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Gynostemma pentaphyllum Makino oder eine botanisch entsprechende Pflanze der Gattung Cucurbitaceae mit Wasser oder einem wäßrigen niederen aliphatischen Alkohol extrahiert, den erhaltenen Extrakt mit einem nicht-ioni-

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Adsorptionsharz behandelt, die adsorbierte Substanz mit einem niederen Alkohol eluiert, das Eluat mit Aluminiumoxid behandelt, die adsorbierte Substanz mit einem gegebenenfalls Wasser enthaltenden niederen aliphatischen Alkohol eluiert und die von anderen Pflanzenbestandteilen praktisch freien Saponine isoliert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Saponine weiter mit einem Styrol-Adsorptionsharz und/ oder einem Kieselgel behandelt, um die einzelnen Saponine zu isolieren.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als niederen aliphatischen Alkohol Methanol oder Äthanol verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als nicht-ionisches Adsorptionsharz ein hochporöses Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Saponine mit einem Styrol-Adsorptionsharz unter Verwendung einer Gradientenelution mit 20 bis 99 % Methanol behandelt.

8. Verfahren nach Anspruch 4 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Isolierung der Gynosaponine P, O oder T die bei 30 bis 40 % Methanol eluierten Fraktionen mit Kieselgel behandelt und anschließend mit einem Lösungsmittelsystem von Chloioforru, einem niederen aliphatischen Alkohol und Wasser eluiert.

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9. Verfahren nach Anspruch 4 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Isolierung der Gynosaponine A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, Q, R, S oder U die bei 45 bis 99 % Methanol eluierten Fraktionen mit einem Kieselgel behandelt und anschliessend mit einem Lösungsmittelsystem aus Chloroform, einem niederen aliphatischen Alkohol und Wasser eluiert.

10. Verfahren zur Herstellung von Saponinen der Formel(I),

in der an den Substituenten in Stellung 3 und/oder 20 mindestens 1 Kohlenhydratrest fehlt, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel (I), in der R bis R wie in Anspruch 1 definiert sind, oder eine Verbindung der Formel (II)

CH₂R³

(ID

3 4

in der R wie in Anspruch 1 definiert ist, R eine ß-D-Glucopyranosyl (1->2) -ß-D-glucopyranosylgruppe und R eine ß-D-Glucopyranosy 1 (1 ^0-ß-D-glucopyranosyl-, ß-D-Xylopyranosyl (1 ->6) -ß-D-glucopyranosyl- oder ß-D-Glucopyranosylgruppe ist oder in der

4 5
R und R beide je eine ß-D-Glucopyranosylgruppe sind, mit einem

hydrolytisch wirkenden

/ Enzym behandelt und die gewünschte Verbindung isoliert.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym Hesperidlnase, Maltase, Cellulase oder Takadiastase verwendet.

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12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym Cellulase verwendet.

13. Verfahren zur Herstellung von Saponinen der Formel (I)/ in der an dem Substituenten in Stellung 20 1 Kohlenhydratrest fehlt, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel (I), in der R bis R wie in Anspruch 1 definiert sind,

3 5 oder eine Verbindung der Formel (II), in der R bis R wie in Anspruch 10 definiert sind, mit einer schwachen Säure behandelt und die gewünschte Verbindung isoliert.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als schwache Säure Essigsäure verwendet.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man eine 40- bis 60prozentige wäßrige Essigsäurelösung verwendet.

16. Arzneipräparat, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einer Verbindung nach Anspruch 1 als Wirkstoff in Kombination mit üblichen pharmakologisch verträglichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln.

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