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in welcher
R5 die ss-D-Glucopyranosyl-Gruppe und R6 die t3-D- Glucopyranosyl-(l o2)-ss-D-glucopyranosyl-Gruppe bedeutet.
2. Antitumormittel nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Verbindung der Formel II enthält.
3. Antitumormittel nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der Formel II das 20S- Protopanaxatriol-6,20-di-O-ss-D-glucopyranosid ist.
4. Antitumormittel nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der Formel II das 20S Protopanaxatriol-6-O-a-L-rhamnopyranosyl-( 1 glucopyranosid ist.
5. Antitumormittel nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Verbindung der Formel 1 enthält.
6. Antitumormittel nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der Formel I 20S-Protopanaxadiol-3-(O-ss-D-glucopyranosyl-(1 o2)-ss-D- glucopyranosid)-20-(O-ss-D-glucopyranosyl-(1#2)-ss-D- glucopyranosid; 20S-Protopanaxadiol-3-(O-ss-D-glucopyranosyl-(1 < 2)-ss-D- glucopyranosid)-20-(O-a-L-arabinopyranosyl-( 1
D-glucopyranosid) oder 20S-Protopanaxadiol-3-(O-ss-D-glucopyranosyl-(1 ) 2)-ss-D- glucopyranosid)-20-(O-ss-D-xylopyranosyl-(1#6)-ss-D-glu- copyranosid) ist.
7. Antitumormittel nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die aktiven Bestandteile in Form eines, die Verbindungen I und/oder II und/oder III enthaltenden Extraktes enthält.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Antitumormittel, welche spezifische Saponine enthalten und zur Behandlung von Tumoren, einschliesslich Krebsgeschwüren, bei Säugetieren und Menschen nützlich sind.
Es ist bekannt, dass Panax-Ginseng C. A. Meyer, welcher zu den Araliaceaen gehört, weit verbreitet verwendet wird als stärkendes, entzündungshemmendes, diuretisches, hypotensives oder antidiabetisches Mittel. Kürzlich haben Studien über jene Saponine, welche in den Wurzeln von Panax Ginseng enthalten sind, gezeigt, dass pharmakologische Wirkungen ausgeübt werden. Hingegen wurde bisher nicht berichtet, dass die Saponine von Panax-Ginseng Antitumoroder Antikrebswirkung aufweist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antitumormittel wie in Patentanspruch 1 definiert.
Der aktive Bestandteil lässt sich aus den unterirdischen Teilen von Panax-Arten von Araliacean gewinnen, vorzugsweise aus der Wurzel von Panax-Gienseng. Andere Beispiele von unterirdischen Teilen von Panax-Arten, welche verwendet werden können, um die Saponin-Substanz zu erhalten, sind die Wurzeln von Panaxjaponicum C.A. Meyer, Panax quinquefolium Linne, Panax pseudoginseng Wallich und Panax notoginseng Burkill, welches ähnliche Pflanzen sind wie Panax-Ginseng.
Die aktiven Bestandteile können erhalten werden, indem man die unterirdischen Teile der Panax-Arten einer Extraktion und Isolation und anschliessender Reinigung unterwirft oder indem man Abschnitte der unterirdischen Teile der Panax-Arten der Gewebezüchtung unterwirft und anschliessend extrahiert und reinigt. Hierbei wird im allgemeinen eine Saponin-Substanz erhalten, welche ein Gemisch, welches im wesentlichen Sapone enthält, darstellt nach den oben erwähnten und im folgenden beschriebenen Verfahren erhalten werden können.
Derartige Saponine werden chemisch als Ginsenoside bezeichnet.
Das Verfahren zur Gewinnung der Saponin-Substanz aus Panax-Arten ist zum Beispiel das folgende: eine Wurzel von Panax-Arten, wie zum Beispiel Panax-Ginseng, wird im allgemeinen mit einem üblichen Fett lösenden organischen Lösungsmittel behandelt, um die Wachsschicht zu entfernen, und anschliessend mit Wasser oder einem niederen aliphatischen Alkohol oder einem Gemisch davon extrahiert. Der Extrakt wird konzentriert und aufgelöst, zum Beispiel in n Butanol. Nach Zusatz von Wasser wird die Lösung geschüttelt und stehengelassen. Nach der Entfernung der unlöslichen Substanzen wird die n-Butanolschicht zur Trockene verdampft und der Rückstand wiederum in einem niederen aliphatischen Alkohol gelöst. Die Lösung wird in Äthyläther eingerührt und der entstehende Niederschlag durch Filtrieren gesammelt (siehe japanische Offenlegungsschrift Nr.
48-5016).
Ein derart erhaltener Extrakt enthält im wesentlichen nur Saponine (Ginsenoside) und kann als solcher als aktiver Bestandteil für die vorliegende Erfindung verwendet werden.
Diese Saponin-Substanz enthält im allgemeinen ein Gemisch der Verbindungen der Formeln I und/oder II und/ oder III, wobei diese Verbindungen in der Art und Menge verschieden sein können, je nach der Art und der Kultivierungszeit der als Rohmaterial verwendeten Panax-Arten.
Die physiko-chemischen Eigenschaften dieser Saponin Substanz als Ganzes sind wie folgt: hellgelbes oder braunes Pulver mit einem bitteren Geschmack; leicht löslich in Wasser, Methanol, verdünntem Methanol, löslich in Äthanol und unlöslich in Chloroform, Äthyläther und Tetrachlorkohlenstoff.
Eine Hydrolyse der Saponin-Substanz mittels Säure erzeugt immer Glucose aus dem wasserlöslichen Teil und Panaxadiol (C30H52O3, Schmelzpunkt 205 "C) und/oder Pana xatriol (C30H52O4, Schmelzpunkt 238 bis 239 C) aus dem wasserunlöslichen Teil.
Die Gewinnung der Saponin-Substanz durch Gewebekultur kann zum Beispiel wie folgt durchgeführt werden: ein Gewebstück einer Wurzel von Panax-Arten wird in ein Medium gelegt, welches aus 500 ml/Liter Knop-Kulturlösung (Calciumsulfat 100 mg/Liter, Kaliumnitrat 250 mg/Liter, Magnesiumsulfat 250 mg/Liter, Dikaliumhydrogenphosphat 250 mg/Liter), 1 ml/Liter Heller-Minerallösung, 5% Glucose, 10 - 6 g/Liter Vitamin-B, 10 - 6 g/Liter Biotin, 10-6 g/Liter Kinetin und 1 % Agar enthält; Die Kultur erfolgt bei 26"C.
Der gebildete Kallus wird in dasselbe Medium verbracht, aus welchem Saponin-Substanz auf ähnliche Weise wie oben extrahiert und gereinigt wird.
Die Saponin-Substanz enthält in der Regel mindestens eines der durch die Formeln I oder II dargstellten Ginsenoside und je nach den Umständen ss-D-Glucopyranosyloleanat-(3)-ss-D-glucopyranosyl (1 -t o2)-ss-D-glucopyranodisid der Formel III.
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R1 bedeutet die ss-D-Glucopyranosyl-(1#2)-ss-D-gluco-
pyranosyl-Gruppe,
R2 bedeutet die ss-D-Glucopyranosyl-(1#6)-ss-D-gluco- pyranosyl-, α-L-Arabinopyranosyl-(1#6)-ss-D-glucopyra- nosyl-, ss-D-Xylopyranosyl-(1 # 6)-ss-D-glucopyranosyl-, a L-Arabinofuranosyl-(1#6)-ss-D-glucopyranosyl- oder ss-D Glucopyranosyl-Gruppe.
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R3 bedeutet die a-L-Rhamnopyranosyl-(l #2)-ss-D-glu- copyranosyl-, ss-D-Glucopyranosyl-(1#2)-ss-D-glucopyra- nosyl-, ss-D-Glucopyranosyl- oder α-L-Rhamnopyranosyl- (1#2)-ss-D-glucopyranosyl-Gruppe, und
R4 bedeutet Wasserstoff oder die ss-Glucopyranosyl- Gruppe.
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Rs bedeutet die ss-D-Glucopyranosyl-Gruppe;
R6 bedeutet die ss-D-Glucopyranosyl-(1 o2)-ss-D-gluco- pyranosyl-Gruppe.
Die Saponine, welche durch die Formeln I und II dargestellt sind, gehören zu den Danmaran-Glycosiden von Triterpen. Da derartige Saponine der Formeln I und II gegenwärtig als spezifische Bestandteile der Wurzeln von Panax Ginseng gefunden werden, wird angenommen, dass sie die wesentlichen Komponenten darstellen, welche die pharmakologische Wirkung als Antitumormittel ergeben.
Konkrete Beispiele von Verbindungen der Formel I sind: 20S-Protopanaxadiol-3-(O-ss-D-glucopyranosyl-(1 1 glucopyranosid)-20-(O-ss-D-glucopyranosyl-(1 glucopyranosid) (= Ginsenosid Rb1); 20S-Protopanaxadio1-3-(O-ss-D-glucopyranosyl-(1 glucopyranosid)-20-(O-a-L-arabinopyranosyl-( 1
D-glucopyranosid) (= Ginsenosid Rb2); 20S-Protopanaxadiol-3 -(O-ss-D-glucopyranosyl-( l o glucopyranosid)-20-(O-α-L-arabinofuranosyl-(1
D-glucopyranosid) (= Ginsenosid Rc); 20S-Protopanaxadiol-3-(O-ss-D-glucopyranosyl-(1 < 2)-ss-D- glucopyranosid)-20-(O-p-D-xylopyranosyl-(1 < 6)-ss-D- glucopyranosid) (= Ginsenosid Rb3) und 20S-Protopanaxadiol-3-(O-ss-D-glucopyranosyl-(1 ¯2)-ss-D- glucopyranosid)-20-(O-ss-D-glucopyranosid) (= Gin senosid Rd).
Konkrete Beispiele der Verbindungen der Formel II sind: 20S-Protopanaxatriol-6-(O-a-L-rhamnopyranosyl-(l
D-glucopyranosid)-20-(O-ss-D-glucopyranosid)-20-(O-ss-
D-glucopyranosid) (= Ginsenosid Re); 20S-Protopanaxatriol-6-O-ss-D-glucopyranosyl-(1 ¯2)-ss-D- glucopyranosid (= Ginsenosid Rf); 20S-Protopanaxatriol-6-20-di-O-ss-D-glucopyranosid (= Ginsenosid Rg1); 20S-Protopanaxatriol-6-O-a-L-rhamnopyranosyl-(1 o2)-ss-
D-glucopyranosid (= Ginsenosid Rg2), und 20S-Protopanaxatriol-6-(O-$-D-glucopyranosyl-( 1
D-glucopyranosid)-20-O-ss-D-glucopyranosid (= Gin senosid-20-gluco-Rf).
Ausser den Saponinen der Formeln I, II und III enthält Panax-Ginseng ein Saponin, welches als Ginsenosid Ra bezeichnet wird, dessen Grundstruktur derjenigen der Formel I zu entsprechen scheint, sowie ein weiteres Saponin, welches als Ginsenosid Rh bezeichnet wird, dessen Grundstruktur derjenigen der Formel II zu entsprechen scheint (siehe Chem. Pharm. Bull., 22(2), 421 bis 428 [1974] und Yakugakuzasshi 94(2), 252 bis 260 [19743).
Die Saponin-Substanz kann weitere Saponine, deren chemische Struktur noch nicht aufgeklärt werden konnte, enthalten.
Jede der oben beschriebenen Verbindungen kann aus der Saponin-Substanz, welche nach den oben erwähnten Verfahren erhalten wurde, isoliert und gereinigt werden, zum Beispiel durch Chromatographie an einer Silicagelsäule, wobei als Eluierungsmittel zum Beispiel Chloroform/Methanol/ Wasser, Chloroform/Methanol/Äthylacetat/Wasser oder n Butanol/Essigsäure/Wasser verwendet wird, oder durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Vom wirtschaftlichen Standpunkt aus wird jedoch bevorzugt, ein Gemisch der Saponine anstelle der einzelnen Verbindungen zu verwenden.
Es wurde jedoch gefunden, dass insbesondere Ginsenosid Rgl und Ginsenosid Rg2 eine sehr hohe Antitumorwirksamkeit aufweisen und eine besondere Wirkung gegen Krebszellen ausüben. Ferner weist die Gruppe Ginsenosid Rb,, Ginsenosid Rb2 und Ginsenosid Rb3 ähnliche Eigenschaften auf wie die Ginsenoside Rgl und Rg2.
Ein bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antitumormittel, welches Ginsenosid Rg, oder Gin senosid Rg2 oder ein Gemisch davon enthält.
Ein weiteres bevorzugtes Antitumormittel ist ein solches, welches Ginsenosid Rbl, Ginsenosid Rb2 oder Ginsenosid
Rb3 oder ein Gemisch davon enthält.
Die neuen Mittel zur Bekämpfung von Krebs zeichnen sich ferner dadurch aus, dass sie nur sehr geringe Nebenwirkungen aufweisen.
Obwohl die Dosis an Antitumormittel gemäss der vorliegenden Erfindung je nach den Krankheitsbedingungen und dem Patienten variiert, beträgt sie bei oraler Verabreichung bei Erwachsenen im allgemeinen etwa 50 bis 1000 mg/ Tag, berechnet als Saponin-Substanz, vorzugsweise 100 bis
300 mg/Tag, verabreicht in zwei oder drei Teilen. Die orale Dosis der aktiven Komponenten, wie Ginsenosid Rg,, Rg2, Rbl, Rb2 und Rb3 ist geringer als diejenige der Saponin
Substanz, zum Beispiel 50 bis 250 mg/Tag.
Das erfindungsgemässe Antitumormittel enthält die Saponin-Substanz oder einzelne Verbindungen der Saponin Substanz, im allgemeinen vermischt mit festen oder flüssigen pharmazeutisch annehmbaren Trägern.
Die erfindungsgemässen Antitumormittel werden im allgemeinen in oralen Verabreichungsformen verwendet, wie zum Beispiel Pulver, Tabletten, Kapseln, Dragees, Granulate, Flüssigkeiten (Lösungen, Fluidextrakte, Sirup und dergleichen). Sie können jedoch auch parenteral in Form von Injektionen oder Infusionen oder örtlich in Form von Salben, Flüssigkeiten, Pudern, Pasten, Sprays oder dergleichen, sowie als Suppositorien verabreicht werden. Für die äusserliche Anwendung wird die Saponin-Substanz im allgemeinen in 1 bis 10%iger hydrophiler oder hydrophober Salbe verwendet.
Die erfindungsgemässen Mittel eignen sich für die Behandlung verschiedener Tumoren, einschliesslich Krebsgeschwüre im Magen, Darm, Brust, Uterus, Mundhöhle, Speiseröhre, Gallenblase, Gallenwege, Pancreas, Prostata, Lunge, Leber, Zunge und Haut, oder Nieren-, Hirn- und Thymustumoren oder Sarcoma.
Feste oder flüssige pharmazeutische Träger können aus den üblicherweise verwendeten Produkten ausgewählt werden. Es ist zweckmässig, das Präparat derart zu gestalten, dass es eine Einheitsdosierung an Saponin-Substanz enthält.
Beispiele pharmazeutisch annehmbarer Träger, welche für Pulver für die orale Verabreichung geeignet sind, umfassen Lactose, Stärke, Dextran, Calciumphosphat, Calciumcarbonat, synthetisches oder natürliches Aluminiumsilikat, Magnesiumoxid, wasserfreies Aluminiumhydroxid, Magnesiumstearat, Natriumhydrogencarbonat, Trockenhefe und dergleichen.
Für Puder zur äusserlichen Anwendung eignen sich als Träger Zinkoxid, Talkum, Stärke, Kaolin, Borsäure, Zinkstearat, Magnesiumstearat, Magnesiumcarbonat, gefälltes Calciumcarbonat, Wismuthsubnitrat, Aluminiumsulfat, Kaliumsulfat und dergleichen. Flüssige Träger sind zum Beispiel Wasser, Glycerin, Propylenglycol, Sorbitol und dergleichen.
Geeignete Träger für Salben sind zum Beispiel hydrophobe oder hydrophile Basen (einschliesslich wasserlöslicher Emulsionen oder Suspensionen), welche mit Fetten, Fett ölen, Lanolin, weissem oder gelben Petrolatum, Glycerin, Wachs, Japan-Wachs, Paraffin, flüssigem Paraffin, Harz, höheren Alkoholen, Kunststoffen, Glycolen, Wasser und oberflächenaktiven Mitteln kombiniert werden können.
Bei der intraperitonealen Verabreichung an Mäusen wurde eine erstaunlich niedrige LDso der erfindungsgemässen Saponin-Substanz festgestellt, nämlich 637 mg/kg und es wurde keine hämolytische Wirkung beobachtet.
Im folgenden wird die Erfindung anhand einiger Bei spiele für die Isolierung der aktiven Bestandteile sowie anhand pharmakologischer und klinischer Tests näher beschrieben.
Isolierung
1) 10 kg getrocknete Wurzeln von Panax-Ginseng C. A.
Meyer (4 Jahre alt) wurden zu kleinen Stücken zerkleinert und dreimal mit 100 Liter Methanol während 3 Stunden unter Erwärmung extrahiert. Die vereinten Extrakte wurden auf ein Volumen von 10 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde allmählich und in sehr kleinen Portionen in 100 Liter Äthyläther unter Rühren eingeführt. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet, bis kein Äthergeruch wahrnehmbar war. Der Rückstand wurde dreimal mit je 10 Liter n-Butanol, das mit Wasser gesättigt war, unter Erhitzen auf einem Wasserbad während 1 Stunde behandelt.
Die erhaltene Lösung wurde mit 3 Liter Wasser, das mit n-Butanol gesättigt war, dreimal gewaschen, wodurch Verunreinigungen, wie Saccharide oder Farbstoffe in die Wasserphase übergingen und entfernt wurden. Die getrennte Phase der Lösung in n-Butanol, das mit Wasser gesättigt war, wurde unter vermindertem Druck und unterhalb 80 "C zur Trockene verdampft. Der Rückstand wurde in 3 Liter Methanol aufgenommen und die Lösung in 60 Liter Äthyläther eingerührt, worauf das Gemisch während 1 Tag stehen gelassen wurde. Der Niederschlag wurde abfiltriert und unter vermindertem Druck und unterhalb 60 "C getrocknet, um 260 g der Saponin-Substanz aus Panax-Ginseng zu erhalten.
2) 50 g der oben erhaltenen Sáponin-Substanz wurde der Säulenchromatographie an einer Säule von 8 cm innerem Durchmesser aus 1 kg Kieselgel 60 (70 bis 230 Mesh, Produkt von E. Merck) unterworfen und mit der unteren Schicht von Chloroform/Methanol/Wasser (65:35:10) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 2 ml/Minute eluiert. Es wurden Fraktionen von je 300 ml gewonnen. Die Fraktionen Nr. 12 bis 30 wurden vereint und unter vermindertem Druck verdampft, wobei 11,4 g Rückstand erhalten wurde.
Diese 11,4 g Rückstand wurden einer weiteren Säulenchromatographie an einer Säule mit 5 cm innerem Durch- messer aus 500 g Kieselgel 60 (70 bis 230 Mesh) unterworfen und mit der unteren Schicht von Chloroform/Methanol/ Äthylacetat/Wasser (2:2:4: 1) eluiert. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 1 ml/Minute und es wurden Fraktionen von je 100 ml gesammelt. Die Fraktionen Nr. 59 bis 70 wurden vereint und unter vermindertem Druck zur Trockene verdampft, wobei 3,4 g rohes Ginsenosid Rg1 erhalten wurden. Das Produkt wurde weiter gereinigt durch Chromatographie über eine Säule von 5 cm innerem Durchmesser aus Kieselgel 60 (230 bis 400 Mesh, 500 g), unter Verwendung der unteren Schicht von Chloroform/Äthylacetat/Methanol/ Wasser (2:4:2:1) zur Eluierung. Es wurden Fraktionen von je 50 ml gewonnen, welche nur Ginsenosid Rg1 enthielten.
Der Nachweis des Gensenosid Rg1 erfolgte durch Dünnschichtchromatographie auf Kiegelgel F 254 mit Chloroform/Methanol/Wasser (65:35: als Entwickler, wobei ein einziger rotvioletter Fleck bei Rf von etwa 0.75 erhalten wurde, welcher mit einer Lösung von 1 % Ce(SO4)z- 1 % H2SO4 besprüht und während 5 Minuten auf 10 C erhitzt wurde. Bei Verwendung von Chloroform/Äthylacetat/Me- thanol/Wasser (2:4:2:1) als Entwickler ergab Ginsenosid Rg1 einen Rf-Wert von etwa 0;20. Die Fraktionen, welche nur Ginsenosid Rgl enthielten, wurden unter vermindertem Druck zur Trockene verdampft Der Rückstand wurde in 100 ml Methanol gelöst, mit Aktivkohle behandelt und filtriert.
Das Filtrat wurde auf 200 ml eingeengt und in 200 ml Äthyläther eingerührt. Der entstandene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und bei einer Temperatur unterhalb 50 0C getrocknet, wobei 900 mg Ginsensosid Rg vom Schmelzpunkt 194 bis 196,5 "C und [a]DI95 c = + 329 (Pyridin, C = 0,923) als weisses kristallines Pulver erhalten wurden.
3) Die Fraktionen Nrn. 62 bis 72 aus der oben genannten ersten Säulenchromatographie wurden unter vermindertem Druck zur Trockene verdampft, wobei 4,8 g Rückstand erhalten wurde. Das Produkt wurde gereinigt durch Säulenchromatographie über Kieselgel 60 (230 bis 400 Mesh, 500 g bei einem inneren Durchmesser von 5 cm) unter Verwendung der unteren Schicht von Chloroform/Methanol/Wasser (65:35:10) zur Eluierung. Das Produkt bestand aus Ginsenosid Rbl, welches bei der Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel F 254 und Entwickeln mit der unteren Schicht von Chloroform/Methanol/Wasser (65:35: 10) und Besprühen mit 1% Ce(SO4)2/10% H2SO4-Lösung einen FIeck mit Rf = 0,25 ergab.
Die Fraktionen, welche einen derartigen Fleck aufwiesen, wurden kondensiert, getrocknet und der Rückstand in Methanol aufgelöst. Die Methanollösung wurde mit Aktivkohle entfernt und das Filtrat zur Trockene verdampft, wobei 3,1 g Ginsenosid Rbl erhalten wurden.
Das Produkt war ein farbIoses, kristallines Pulver vom Schmelzpunkt 197 bis 198 "C, [a],22;C +12,42 (Me- thanol, C = 0,91).
Klinische Untersuchung
Fall 1
Bei einem männlichen Patienten von 62 Jahren wurde durch patho-histologische Diagnose ein Magenkrebs festgestellt, doch verweigerte der Patient eine Magenresektion (Gastrectomie) une wurde nicht operiert. 200 mg/Tag der nach der oben beschriebenen Isolationsmethode gewonnen Saponin-Substanz wurden dem Patienten in zwei getrennten Dosen in den leeren Magen verabreicht. Zu Beginn der Behandlung betrug das Körpergewicht des Patienten 36 kg, die Ärythrocyten-Zahl 4,15 x 106/mm2, die Leucocyten-Zahl 6600/mm2. Der Patient war bleich und litt an starken epigastrischen Schmerzen, und das Vorhandensein eines Tumors konnte durch Palpation festgestellt werden.
Nach einmonatiger Behandlung war der epigastrische Schmerz verschwunden, das Körpergewicht auf 41 kg gestigen, die Gesichtsfarbe wurde gut und eine radioskopische Palpation (Röntgenoskopie) des Magens zeigte nur noch eine kleine Vertiefung, welche als Magengeschwür diagnostiziert wurde. Nach einem weiteren Monat-ununterbrochener Behandlung verschwand das Gefühl der Müdigkeit vollständig, der Appetit nahm zu und das Körpergewicht betrug 42,5 kg. Die Ary- thocyten-Zahl betrug 4,4 x 106/mm2 und die Leucocyten Zahl 6900/mm2. In diesem Zeitpunkt konnte sowohl durch Endoscopie wie durch physiologische Untersuchung nur eine Narbe von einem Magengeschwür festgestellt werden, und eine physiologische Untersuchung des Narbengebietes ergab keinerlei maligne (bösartige) Resultate.
Nach Verabreichung der Saponin-Substanz wurde weder in subjektiven Symptomen noch bei der Untersuchung irgend ein Anhaltspunkt für die die akute oder subakute-Toxizität der Saponin-Substanz festgestellt.
Dies ist ein Fall, bei welchem die zweimonatige Verabreichung der Saponin-Substanz aussergewöhnlich gute Wirkungen zeigte
Fall 2
Die Patientin war 52 Jahre alt und von einem Magenkrebs, begleitet von carcinomatöser Peritonitis, befallen. Der Krebs war über den ganzen Magen verbreitetund erzeugte eine Infiltration in die Pancreas, das Peritoneum, Schnitzlerund Dünndarm. Dies war ein Fall, bei welchem eine Magen resektion unmöglich war. Die Patientin beklagte sich als subjektive Symptome über Schmerzen im Unterleib und Brechreiz nach den Mahlzeiten und litt an gewohnheitsmässiger Verstopfung, begleitet von sehr starken Unterleibsschmerzen vor der Entleerung.
Da die Patientin ein bleiches Aussehen und starke Schwäche aufwies, wurden 200 mg/Tag der Saponin-Substanz auf den leeren Magen in zwei getrennten Dosen verabreicht. Nach zwei Wochen der Behandlung begann der Unterleibsschmerz etwas nachzulassen und die Nahrungsaufnahme (halbflüssige Nahrung) durch die Patientin war erhöht. Nach fünf Wochen der Behandlung wurde eine Gewichtszunahme von 1 kg registriert und die Unterleibsschmerzen waren soweit reduziert, dass sie nur noch gelegentlich auftraten. Hingegen war der Schmerz vor der Stuhlentleerung unverändert und es trat auch keine merkliche Veränderung im Brechreiz nach den Mahlzeiten auf.
Fall 3
Eine 44jährige Patientin war von einem Brustkrebs befallen, begleitet von Metastasen in ersten Lendenwirbel. Die Patientin beklagt sich über einen schweren Lumbago (Schmerzen im unteren Rücken) und Schwierigkeiten beim Gehen. Für die Behandlung mit der Saponin-Substanz wurden 100 mg/Tag des Heilmittels in zwei geteilten Dosen auf den leeren Magen verabreicht. Zu Beginn der Behandlung betrug die Ärythocyten-Zahl 3,8 x 106/mm2 und die Leucocyten-Zahl 6000/mm2, wobei die Ärythrocyten-Sedimentationsgeschwindigkeit 20 mm nach 1 Stunde und 46 mm nach 2 Stunden betrug. Nach einwöchiger Behandlung begann der Schmerz im unteren Rückenteil etwas nachzulassen und das Gesicht begann eine gute Farbe anzunehmen, nach 5 Wochen war der Schmerz vollständig verschwunden und die Patientin konnte wieder gehen.
Zu dieser Zeit betrug die Ärythrocyten-Zahl 4 x 106/mm2 und die Leucocyten-Zahl 6400/ mm2 bei einer Ärythrocyten-Sedimentationsgeschwindigkeit von 16 mm nach 1 Stunde und 36 mm nach 2 Stunden. Ausserdem ergab die Röntgenstrahlen-Untersuchung der von Metastasen befallenen Knochengegend keinen Fortschritt der Metastasen. Trotz verbessertem Appetit konnte seit Beginn der Verabreichung des Ginseng-Saponins keine Veränderung des Körpergewichtes der Patientin festgestellt werden. Im Laufe der fünfwöchigen Behandlung wurden keine Symptome festgestellt, die auf Nebenwirkungen des verabreichten Präparates zurückzuführen gewesen wären.
Fall 4
Ein männlicher Patient von 62 Jahren war von einem Darmkrebs befallen, begleitet von einer Metastasis in die Bauchhöhle; ein Tumor in der Gegend des Nabels war durch Tasten feststellbar, und der Patient beklagte sich über subjektive Symptome, nämlich im unteren Rückenteil und Schmerzen in der Analgegend bei Sthlgang; die Ärythrocyten-Zahl betrug 4,15 x 106/mm2, die Leucocyten-Zahl 7300/ mm2, die Röntgenstrahlen-Untersuchung ergab keine Metastasis in der Lunge. Auf dieselbe Weise wie in Fall 3 wurden
100 mgjTag Saponin-Substanz in den leeren Magen in zwei geteilten Dosen verabreicht. Nach vierwöchiger Behandlung begannen die Schmerzen im unteren Rückenteil abzunehmen und der Appetit nahm zu. Die Schmerzen in der Analgegend bei der Stuhlentleerung wurden jedoch nicht auf befriedigende Weise behoben.
In diesem Zeitpunkt betrug die Ärythrocyten-Zahl 4,39 x 106/mm2 und die Leucocyten-Zahl 8900/mm2, wobei die Anzahl Lymphocyten betrug. Die Dosis wurde auf 200 mg/Tag (in zwei getrennten Portionen) erhöht und während 4 Wochen ununterbrochen verabreicht.
Die erhaltenen Resultate zeigen, dass der Tumor in der Nabelgegend auf eine Grösse reduziert worden war, welche kaum mehr abtastbar war, und die Schmerzen in der unteren Rückengegend verschwanden vollständig.
Fall 5
Bei einem männlichen Patienten von 54 Jahren wurde durch Röntgen-Untersuchung, endoscopische und pathohistologische Untersuchung des Magens ein fortschreitender Magenkrebs diagnostiziert. Eine Gastrectomie wurde nicht durchgeführt infolge der Schwäche des Patienten und auf dessen Wunsch. 200 mg/Tag ginsenosid Rgl wurden in zwei Dosen jeden Tag auf den leeren Magen verabreicht. Zu Beginn der Verabreichung betrug das Körpergewicht 42 kg.
Der Patient wies eine bleiche Gesichtsfarbe auf und litt an ständigem Völlegefühl im Magen (Mageninfiation), Appetitlosigkeit (Anorexie), starken Druckgefühl in der epigastrischen Gegend, und die Gegenwart eines Tumors konnte durch Abtasten festgestellt werden. Hingegen wurden keine Metastasen in anderen Organen beobachtet.
Nach vierwöchiger Behandlung verschwand die Mage ninfiation, der epigastrische Schmerz war erleichtert und gleichzeitig der Appetit verbessert, das Gesicht begann eine gute Farbe anzunehmen und das Körpergewicht stieg auf 45,4 kg. Die Ärythrocyten-Zahl betrug 4,35 x 106/mm2 und die Leucocyten-Zahl 6850/mm2. Die Gegenwart eines Tumors konnte nicht mehr durch Abtasten festgestellt werden.
Die radiographische Untersuchung ergab lediglich eine kleine Vertiefung.
Nach achtwöchiger Behandlung erreichte das Körpergewicht 47 kg, die Ärythrocyten-Zahl betrug 4,42 x 1 06/mm2 und die Leucocyten-Zahl 7000/mm2. Das Gefühl der Müdigkeit war verschwunden und auch der epigastrische Schmerz war vollständig behoben.
Nach zwölfwöchiger Behandlung war das Körpergewicht auf 48,4 kg angestiegen, die Ärythrocyten-Zahl betrug 4,5 x 106/mm2 und die Leucocyten-Zahl 7100/mm2.
Der Patient erholte sich soweit, dass nur noch die Narbe des Geschwürs mittels endoscopischer und physiologischer Untersuchung festgestellt werden konnte, und eine physiologische Untersuchung der Narbengegend ergab keinerlei maligne Resultate. Der Patient wurde aus dem Spital entlassen und nur noch ambulant weiterbehandelt.
Während einer dreimonatigen Behandlung wurden keinerlei Nebenwirkungen beobachtet, welche der Verabreichung von Ginsenosid Rg1 zuzuschreiben gewesen wären.
Fall 6
Eine 45jährige Patientin litt an Darmkrebs.
Die Patientin beklagte sich, als subjektive Symptome, über Schmerzen in der Analgegend bei der Stuhlentleerung, sie hatte eine bleiche Gesichtsfarbe und litt an Appetitlosigkeit, starker Schwäche und Schmerzen im unteren Rückenbereich (Lumbago). Der Stuhl der Patientin war blutig und wies einen putrifizierenden Geruch auf. Eine Abtastung der Nabelgegend ergab die Gegenwart eines Tumors und die folgende Röntgen-Untersuchung des Darmes, die Proctoscopie oder dergleichen ergab das Vorhandensein eines Darmkrebses. Es wurden keine Metastasen in anderen Organen beobachtet. 200 mg/Tag Ginsenosid Rgl wurden sodann in den leeren Magen in zwei geteilten Dosen verabreicht. Zu Beginn der Behandlung betrug das Körpergewicht 38 kg, die Ärythrocyten-Zahl 4,1 x 1 06/mm2 und die Leucocyten-Zahl 6100/mm2.
Nach vierwöchiger Behandlung verbesserte sich der Appetit, das Gesicht begann eine gute Farbe aufzuweisen, die Verstopfung und der Durchfall waren fast gänzlich verschwunden, die Schmerzen im unteren Rückenbereich waren abgeschwächt, der blutige Stuhl trat nicht mehr auf und der putrifizierende Geruch war viel schwächer. Das Körpergewicht war auf 40 kg angestiegen, die Ärythrocyten-Zahl betrug 4,3 x 106/mm2 und die Leucocyten-Zahl 6300/mm2.
Nach 8 Wochen der Behandlung war der Tumor in der Nabelgegend nicht mehr abtastbar. Sowohl der Lumbago wie die Schmerzen im Analbereich bei der Stuhlentleerung waren vollständig verschwunden. Das Körpergewicht betrug 42,5 kg, die Ärythrocyten-Zahl 4,45 x 106/mm2 und die Leucocyten-Zahl 6500/mm2. Der Zustand der Patientin hatte sich sehr stark gebessert.
Pharmakologische Untersuchung A) Wirkungen auf gezüchtete Morris-Hepatoma-Zellen (1) Die Wirkungen der Saponin-Substanz (Ginsenoside) auf gezüchtete Zellen von Morris-Hepatoma (MH1Cl) wur den untersucht
Die Hepatoma-Zellen wurden im Standard-Medium, welche 20 ,ug/ml der Saponin-Substanz enthielt, gezüchtet.
Nach 180 Tagen zeigte die Lichtmikroskopie (light microscopy) eine bemerkenswerte Veränderung der morphologischen Erscheinung: fast alle veränderten Zellen erschienen grösser; das Cytoplasma mit zahlreichen feinen Körnern war gewachsen im Vergleich mit dem Volumen des Nucleus, das Verhältnis von Nucleus zu Cytoplasma betrug etwa 1:3, und der intercellulare Raum war klar erkennbar.
Ausserdem wurde mit Hilfe der Methode der Koloniebildung in weicher Agar-Suspensionskultur, welches einer der Nachweise für neoplatische Transformation darstellt, bestätigt, dass die Koloniebildungsgeschwindigkeit durch die Saponin-Substanz veränderten Zellen unter V4 der Hepatoma-Zellen (MH1Cl) als Kontrolle liegt. (Der bemerkenswerte Abfall der Koloniebildung in Weich-Agar ist dahin zu interpretieren, dass die phenotypische Umwandlung der Hepatoma-Zellen durch die Saponin-Substanz erfolgte).
(ii) Die Veränderungen in den Marker-Enzym-Aktivitäten der MH1C1-Hepatoma-Zellen, welche durch die Saponin-Substanz umgewandelt worden waren, wurden beobachtet. (Der Harnstoffzyklus ist ein geeigneter metabolischer Zyklus in den Leberzellen, und die verschiedenen mit dem Harnstoffzyklus verbundenen Enzyme sind sehr wichtig als Marker-Enzyme für gezüchtete Leberzellen).
Die Aufnahme von L-3H-Ornithin durch die Hepatoma Zellen (MH1C1) betrug 358,3 dpm/105-Zellen in vollständigem Medium und 1781,1 dpm/l05-Zellen in argininfreiem Medium. In den durch Saponin-Substanz umgewandelten Hepatoma-Zellen betrug die Aufnahme von L-3H-Ornithin 699,0 dpm/105-Zellen in vollständigem Medium, welche auf 4075,6 dpm/105-Zdlen in argininfreiem Medium anstieg.
Die Aktivitäten von Succinatecytochrom-C-Reductase nahm etwa 2,0mal in dem durch die Saponin-Substanz umgewandelten Hepatoma-Zellen zu.
Die obigen Enzym-Aktivitäten wurden nach dem Odashima-Verfahren mit einer Modifikation der Methode von Leffert et al. untersucht, und wurden nach 180 Tagen Kultur in den Medien mit 20 llg/ml Saponin-Substanz beobachtet.
Aus den obigen Tatsachen kann geschlossen werden,- dass die metabolische Aktivität des Harnstoffzyklus der durch die Saponin-Substanz umgewandelten Zellen merklich zugenommen hatte im Vergleich zu normalen Zellen.
Ferner wurden beide Untersuchungen (i) und (ii) auch unter Verwendung von Ginsenosid Rgl durchgeführt, und die erhaltenen Resultate sind ähnlich wie diejenigen bei Verwendung der Saponin-Substanz.
B) Tierversuche mit Sarcoma 180
Untersuchungsmethoden und Resultate:
Erste Methode ddY-Mäuse (weiblich, 6 Wochen alt, Gewicht 20 g) wurden als Versuchstiere in Gruppen von je 9 Stück verwendet, welchen Sarcoma 180 (Inoculum: 1 x 106 Zellen/S.C.) transplantiert wurden. 24 Stunden nach der Transplantation wurden der ersten und zweiten Gruppe 50 mg/kg und 500 mg/kg Ginsenosid Rgl beziehungsweise Rbl oral verabreicht. Diese Untersuchungen wurden während 7 aufeinanderfolgenden Tagen fortgesetzt.
5 Tage nach beendeter Verabreichung wurden die Tumoren von allen Mäusen entfernt, ein Vergleich der Tumorgewichte zwischen der Kontrollgruppe (ohne Behandlung) und jeder Testgruppe (TesttumorgewichtjKontrolltumorgewicht) durchgeführt und vergleichende Zahlen und Unterdrükkungsmasse berechnet. Als Referenz wurden 250 mg/kg PSK (Markenname *Crestin*, Kureha Chemical Industry Co., Ltd., Japan) unter denselben Bedingungen peritoneal verabreicht, und die Wirkungen mit den obigen Testresultaten verglichen.
Resultate
Die folgende Tabelle zeigt die durchschnittlichen Vergleichszahlen der Tumorgewichte (Testtumorgewicht/Kontrolltumorgewicht) und das Mass an Unterdrückung zwischen der Kontrollgruppe und der Testgruppe.
Medikamente Durchschnittliches Mass an
Gewicht Testtumor/ Unter
Kontrolltumor drückung
Saponin-Substanz
50 mg/kg (oral) 0,54 46%
500 mg/kg (oral) 0,76 24%
50 mg/kg (peritoneal) 0,62 38% Ginsenosid Rgl 50 mg/kg (oral) 0,48 52% Ginsenosid Rbl 50 mg/kg (oral) 0,87 13% Crestin 250 mg/kg (peritoneal) 1,16 0% Zweite Methode
Sarcoma 180 (2 x 105-Zellen/S.C.) wurde auf Mäuse in Gruppen von je 9 Stück unter denselben Bedingungen wie bei der ersten Methode transplantiert. 24 Stunden nach der Transplantation wurden dieselben Dosen an Saponin-Substan, Ginsenosid Rgl, Ginsenosid Rbl und Crestinjeder Gruppe wie bei der ersten Methode an 12 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht.
2 Tage nach Beendigung der Behandlung wurden die Tumoren entfernt. Der Vergleich der durchschnittlichen Tumorgewichte zwischen der Kontrollgruppe und der Testgruppe wurde durchgeführt und das Mass an Unterdrükkung berechnet.
Resultate
Die folgende Tabelle zeigt den Vergleich der durchschnittlichen Tumorgewichte und das Mass an Unterdrükkung.
Medikamente Durchschnittliches Mass an
Gewicht Testtumor/ Unter
Kontrolltumor drückung Saponin-Substanz 50 mg/kg (oral) 0,75 25% 500 mg/kg (oral) 0,70 30% 50 mg/kg (peritoneal) 0,97 3% Ginsenosid Rgl 50 mg/kg (oral) 0,61 39% Ginsenoid Rbl 50 mg/kg (oral) 0,89 11% Crestin 250 mg/kg (peritoneal) 1,06 0% Dritte Methode
Sarcoma 180(1 x 106-Zellen/S.C.) wurde auf Mäuse in Gruppen von je 9 Stück unter denselben Bedingungen wie bei der ersten Methode transplantiert. 24 Stunden nach der Transplantation wurden 50 mg/kg der Saponin-Substanz, 50 mg/kg Ginsenosid Rgl, 50 mgXkg Ginsenosid Rbl auf oraler Weise verabreicht und 5 KE/kg Bicibanil (Chugai Pharm.
Co., Ltd., Japan), beziehungsweise 5 ml/kg Maruyama vaccine peritoneal injiziert. Diese Tests wurden während 8 aufeinanderfolgenden Tagen fortgesetzt. 5 Tage nach Beendigung der Behandlung wurden die Tumoren aller Testtiere entfernt, der Vergleich der durchschnittlichen Tumorgewichte mit der Kontrollgruppe durchgeführt und das Mass an Unterdrückung für jedes Medikament berechnet.
Resultate Medikamente Tumorgewicht (Durchschnitt Verhältnis durchschnitt- Mass an für 9 Mäuse liches Gewicht Unter
Testtumor/Kontrolltumor drückung Saponin-Substanz 50 mg/kg (oral) 1,72+0,006 g 0,78 22% Ginsenosid Rg1 50 mg/kg (oral) 1,28#0,61 Ginsenosid Rb1 50 mg/kg (oral) 1,99#0,59 Bicibanil 5 KE/kg (peritoneal) 1,99+0,62 0,90 10% Maruyama-Vaccin 5 ml/kg (peritoneal) 2,38i0,59 1,08 0%
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in which
R5 is the ss-D-glucopyranosyl group and R6 is the t3-D-glucopyranosyl (l o2) -ss-D-glucopyranosyl group.
2. Antitumor agent according to claim 1, characterized in that it contains a compound of formula II.
3. Antitumor agent according to claim 2, characterized in that a compound of formula II is the 20S-Protopanaxatriol-6.20-di-O-ss-D-glucopyranoside.
4. Antitumor agent according to claim 2, characterized in that a compound of formula II is the 20S Protopanaxatriol-6-O-a-L-rhamnopyranosyl- (1 glucopyranoside.
5. Antitumor agent according to claim 1, characterized in that it contains a compound of formula 1.
6. Antitumor agent according to claim 5, characterized in that the compound of formula I 20S-Protopanaxadiol-3- (O-ss-D-glucopyranosyl- (1 o2) -ss-D-glucopyranoside) -20- (O-ss- D-glucopyranosyl- (1 # 2) -ss-D-glucopyranoside; 20S-protopanaxadiol-3- (O-ss-D-glucopyranosyl- (1 <2) -ss-D-glucopyranoside) -20- (OaL-arabinopyranosyl -( 1
D-glucopyranoside) or 20S-protopanaxadiol-3- (O-ss-D-glucopyranosyl- (1) 2) -ss-D-glucopyranoside) -20- (O-ss-D-xylopyranosyl- (1 # 6) - ss-D-glucopyranoside).
7. Antitumor agent according to claim 1, characterized in that it contains the active ingredients in the form of an extract containing the compounds I and / or II and / or III.
The present invention relates to novel anti-tumor agents which contain specific saponins and are useful in the treatment of tumors, including canker sores, in mammals and humans.
It is known that Panax-Ginseng C.A. Meyer, which belongs to the Araliaceaen, is widely used as a tonic, anti-inflammatory, diuretic, hypotensive or anti-diabetic agent. Recently studies on those saponins contained in the roots of Panax Ginseng have shown that pharmacological effects are exerted. However, Panax-Ginseng saponins have not previously been reported to have anti-tumor or anti-cancer activity.
The present invention relates to an antitumor agent as defined in claim 1.
The active ingredient can be obtained from the underground parts of Panax species from Araliacean, preferably from the root of Panax-Gienseng. Other examples of Panax species underground parts that can be used to obtain the saponin substance are the roots of Panaxjaponicum C.A. Meyer, Panax quinquefolium Linne, Panax pseudoginseng Wallich and Panax notoginseng Burkill, which are similar plants to Panax ginseng.
The active components can be obtained by subjecting the underground parts of the Panax species to extraction and isolation and subsequent cleaning, or by subjecting sections of the underground parts of the Panax species to tissue engineering and then extracting and cleaning them. This generally gives a saponin substance which is a mixture which essentially contains sapones and can be obtained by the processes mentioned above and described below.
Such saponins are chemically referred to as ginsenosides.
The method for obtaining the saponin substance from Panax species is, for example, the following: a root of Panax species, such as Panax ginseng, is generally treated with a conventional fat-dissolving organic solvent to remove the wax layer, and then extracted with water or a lower aliphatic alcohol or a mixture thereof. The extract is concentrated and dissolved, for example in n butanol. After adding water, the solution is shaken and left to stand. After the insoluble substances have been removed, the n-butanol layer is evaporated to dryness and the residue is again dissolved in a lower aliphatic alcohol. The solution is stirred into ethyl ether and the resulting precipitate is collected by filtration (see Japanese Laid-Open Publication No.
48-5016).
An extract obtained in this way essentially contains only saponins (ginsenosides) and as such can be used as an active ingredient for the present invention.
This saponin substance generally contains a mixture of the compounds of the formulas I and / or II and / or III, it being possible for these compounds to differ in their type and amount, depending on the type and the cultivation time of the Panax types used as raw material.
The physico-chemical properties of this saponin substance as a whole are as follows: light yellow or brown powder with a bitter taste; easily soluble in water, methanol, diluted methanol, soluble in ethanol and insoluble in chloroform, ethyl ether and carbon tetrachloride.
Hydrolysis of the saponin substance by means of acid always produces glucose from the water-soluble part and panaxadiol (C30H52O3, melting point 205 "C) and / or panatratriol (C30H52O4, melting point 238 to 239 C) from the water-insoluble part.
The saponin substance can be obtained by tissue culture, for example as follows: a piece of tissue from a root of Panax species is placed in a medium which consists of 500 ml / liter of Knop culture solution (calcium sulfate 100 mg / liter, potassium nitrate 250 mg / Liter, magnesium sulfate 250 mg / liter, dipotassium hydrogen phosphate 250 mg / liter), 1 ml / liter Heller mineral solution, 5% glucose, 10 - 6 g / liter vitamin B, 10 - 6 g / liter biotin, 10-6 g / Contains liters of kinetin and 1% agar; The culture takes place at 26 "C.
The callus formed is placed in the same medium from which saponin substance is extracted and purified in a similar manner as above.
The saponin substance generally contains at least one of the ginsenosides represented by the formulas I or II and, depending on the circumstances, ss-D-glucopyranosyloleanate- (3) -ss-D-glucopyranosyl (1 -t o2) -ss-D- glucopyranodiside of formula III.
EMI3.1
R1 means the ss-D-glucopyranosyl- (1 # 2) -ss-D-gluco-
pyranosyl group,
R2 means the ss-D-glucopyranosyl- (1 # 6) -ss-D-glucopyranosyl-, α-L-arabinopyranosyl- (1 # 6) -ss-D-glucopyranosyl-, ss-D- Xylopyranosyl (1 # 6) -ss-D-glucopyranosyl, a L-arabinofuranosyl (1 # 6) -ss-D-glucopyranosyl or ss-D glucopyranosyl group.
EMI3.2
R3 means the aL-rhamnopyranosyl- (l # 2) -ss-D-glucopyranosyl-, ss-D-glucopyranosyl- (1 # 2) -ss-D-glucopyranosyl-, ss-D-glucopyranosyl- or ? -L-rhamnopyranosyl- (1 # 2) -ss-D-glucopyranosyl group, and
R4 means hydrogen or the ss-glucopyranosyl group.
EMI3.3
Rs represents the ss-D-glucopyranosyl group;
R6 means the ss-D-glucopyranosyl (1 o2) -ss-D-glucopyranosyl group.
The saponins, which are represented by the formulas I and II, belong to the Danmaran glycosides of triterpene. Since such saponins of the formulas I and II are currently found as specific constituents of the roots of Panax Ginseng, it is believed that they represent the essential components which give the pharmacological action as an anti-tumor agent.
Specific examples of compounds of the formula I are: 20S-protopanaxadiol-3- (O-ss-D-glucopyranosyl- (1 1 glucopyranoside) -20- (O-ss-D-glucopyranosyl- (1 glucopyranoside) (= ginsenoside Rb1) ; 20S-Protopanaxadio1-3- (O-ss-D-glucopyranosyl- (1 glucopyranoside) -20- (OaL-arabinopyranosyl- (1st
D-glucopyranoside) (= ginsenoside Rb2); 20S-Protopanaxadiol-3 - (O-ss-D-glucopyranosyl- (l o glucopyranoside) -20- (O-? -L-arabinofuranosyl- (1
D-glucopyranoside) (= ginsenoside Rc); 20S-Protopanaxadiol-3- (O-ss-D-glucopyranosyl- (1 <2) -ss-D-glucopyranoside) -20- (OpD-xylopyranosyl- (1 <6) -ss-D-glucopyranoside) (= ginsenoside Rb3) and 20S-Protopanaxadiol-3- (O-ss-D-glucopyranosyl- (1 ¯2) -ss-D-glucopyranoside) -20- (O-ss-D-glucopyranoside) (= Gin senoside Rd).
Specific examples of the compounds of formula II are: 20S-Protopanaxatriol-6- (O-a-L-rhamnopyranosyl- (l
D-glucopyranoside) -20- (O-ss-D-glucopyranoside) -20- (O-ss-
D-glucopyranoside) (= ginsenoside Re); 20S-protopanaxatriol-6-O-ss-D-glucopyranosyl- (1 ¯2) -ss-D-glucopyranoside (= ginsenoside Rf); 20S-protopanaxatriol-6-20-di-O-ss-D-glucopyranoside (= ginsenoside Rg1); 20S-protopanaxatriol-6-O-a-L-rhamnopyranosyl- (1 o2) -ss-
D-glucopyranoside (= ginsenoside Rg2), and 20S-protopanaxatriol-6- (O - $ - D-glucopyranosyl- (1st
D-glucopyranoside) -20-O-ss-D-glucopyranoside (= Gin senoside-20-gluco-Rf).
In addition to the saponins of formulas I, II and III, Panax ginseng contains a saponin, which is referred to as ginsenoside Ra, whose basic structure appears to correspond to that of formula I, and a further saponin, which is referred to as ginsenoside Rh, whose basic structure is that of Formula II appears to correspond (see Chem. Pharm. Bull., 22 (2), 421 to 428 [1974] and Yakugakuzasshi 94 (2), 252 to 260 [19743).
The saponin substance can contain further saponins, the chemical structure of which has not yet been elucidated.
Each of the compounds described above can be isolated and purified from the saponin substance obtained by the above-mentioned methods, for example by chromatography on a silica gel column, using, for example, chloroform / methanol / water, chloroform / methanol / ethyl acetate / Water or n butanol / acetic acid / water is used, or by high performance liquid chromatography. From the economic point of view, however, it is preferred to use a mixture of the saponins instead of the individual compounds.
However, it was found that ginsenoside Rgl and ginsenoside Rg2 in particular have a very high antitumor activity and exert a particular action against cancer cells. Furthermore, the group ginsenoside Rb ,, ginsenoside Rb2 and ginsenoside Rb3 has similar properties to the ginsenosides Rgl and Rg2.
A preferred object of the present invention is an antitumor agent which contains ginsenoside Rg, or gin senoside Rg2 or a mixture thereof.
Another preferred antitumor agent is one which contains ginsenoside Rbl, ginsenoside Rb2 or ginsenoside
Rb3 or a mixture thereof.
The new anti-cancer agents are also characterized by the fact that they have very few side effects.
Although the dose of anti-tumor agent according to the present invention varies depending on the disease conditions and the patient, when administered orally in adults, it is generally about 50 to 1000 mg / day, calculated as saponin substance, preferably 100 to
300 mg / day administered in two or three parts. The oral dose of the active components such as ginsenoside Rg ,, Rg2, Rbl, Rb2 and Rb3 is lower than that of saponin
Substance, for example 50 to 250 mg / day.
The antitumor agent according to the invention contains the saponin substance or individual compounds of the saponin substance, generally mixed with solid or liquid pharmaceutically acceptable carriers.
The antitumor agents according to the invention are generally used in oral administration forms, such as, for example, powders, tablets, capsules, dragees, granules, liquids (solutions, fluid extracts, syrups and the like). However, they can also be administered parenterally in the form of injections or infusions or locally in the form of ointments, liquids, powders, pastes, sprays or the like, and as suppositories. For external use, the saponin substance is generally used in 1 to 10% hydrophilic or hydrophobic ointment.
The agents according to the invention are suitable for the treatment of various tumors, including cancerous ulcers in the stomach, intestine, breast, uterus, oral cavity, esophagus, gallbladder, biliary tract, pancreas, prostate, lung, liver, tongue and skin, or kidney, brain and thymic tumors or Sarcoma.
Solid or liquid pharmaceutical carriers can be selected from the commonly used products. It is expedient to design the preparation in such a way that it contains a unit dose of saponin substance.
Examples of pharmaceutically acceptable carriers suitable for powder for oral administration include lactose, starch, dextran, calcium phosphate, calcium carbonate, synthetic or natural aluminum silicate, magnesium oxide, anhydrous aluminum hydroxide, magnesium stearate, sodium hydrogen carbonate, dry yeast and the like.
For powder for external use, zinc oxide, talc, starch, kaolin, boric acid, zinc stearate, magnesium stearate, magnesium carbonate, precipitated calcium carbonate, bismuth subnitrate, aluminum sulfate, potassium sulfate and the like are suitable as carriers. Liquid carriers are, for example, water, glycerin, propylene glycol, sorbitol and the like.
Suitable carriers for ointments are, for example, hydrophobic or hydrophilic bases (including water-soluble emulsions or suspensions) which are coated with fats, fatty oils, lanolin, white or yellow petrolatum, glycerin, wax, Japanese wax, paraffin, liquid paraffin, resin, higher alcohols , Plastics, glycols, water and surfactants can be combined.
When administered intraperitoneally to mice, an astonishingly low LD 50 of the saponin substance according to the invention was found, namely 637 mg / kg, and no haemolytic effect was observed.
In the following the invention will be described in more detail with the help of some examples for the isolation of the active components as well as with pharmacological and clinical tests.
insulation
1) 10 kg of dried roots of Panax-Ginseng C. A.
Meyer (4 years old) were chopped into small pieces and extracted three times with 100 liters of methanol for 3 hours with heating. The combined extracts were concentrated to a volume of 10 liters. The concentrate was introduced gradually and in very small portions into 100 liters of ethyl ether with stirring. The resulting precipitate was filtered off and dried until no ether smell was perceptible. The residue was treated three times with 10 liters of n-butanol saturated with water while heating on a water bath for 1 hour.
The solution obtained was washed three times with 3 liters of water saturated with n-butanol, whereby impurities such as saccharides or dyes passed into the water phase and were removed. The separated phase of the solution in n-butanol, which was saturated with water, was evaporated to dryness under reduced pressure and below 80 ° C. The residue was taken up in 3 liters of methanol and the solution was stirred into 60 liters of ethyl ether, whereupon the mixture was stirred for The precipitate was filtered off and dried under reduced pressure and below 60 ° C. in order to obtain 260 g of the saponin substance from Panax ginseng.
2) 50 g of the saponin substance obtained above was subjected to column chromatography on a column with an inner diameter of 8 cm made of 1 kg of silica gel 60 (70 to 230 mesh, product of E. Merck) and with the lower layer of chloroform / methanol / water (65:35:10) eluted at a flow rate of 2 ml / minute. Fractions of 300 ml each were obtained. Fractions Nos. 12 to 30 were combined and evaporated under reduced pressure to give 11.4 g of a residue.
These 11.4 g of residue were subjected to a further column chromatography on a column with an inner diameter of 5 cm from 500 g of silica gel 60 (70 to 230 mesh) and with the lower layer of chloroform / methanol / ethyl acetate / water (2: 2: 4: 1) eluted. The flow rate was 1 ml / minute and 100 ml fractions were collected. Fractions Nos. 59 to 70 were combined and evaporated to dryness under reduced pressure to give 3.4 g of crude ginsenoside Rg1. The product was further purified by chromatography on a 5 cm internal column of silica gel 60 (230 to 400 mesh, 500 g) using the bottom layer of chloroform / ethyl acetate / methanol / water (2: 4: 2: 1) for elution. Fractions of 50 ml each were obtained which contained only ginsenoside Rg1.
The detection of the gene senoside Rg1 was carried out by thin layer chromatography on Kiegelgel F 254 with chloroform / methanol / water (65:35: as developer, whereby a single red-violet spot at Rf of about 0.75 was obtained, which was mixed with a solution of 1% Ce (SO4) z- 1% H2SO4 was sprayed and heated for 5 minutes at 10 C. When using chloroform / ethyl acetate / methanol / water (2: 4: 2: 1) as developer, ginsenoside Rg1 gave an Rf value of about 0; 20. The fractions, which only contained ginsenoside Rgl, were evaporated to dryness under reduced pressure. The residue was dissolved in 100 ml of methanol, treated with activated carbon and filtered.
The filtrate was concentrated to 200 ml and stirred in 200 ml of ethyl ether. The resulting precipitate was separated off by centrifugation and dried at a temperature below 50 ° C., 900 mg of ginsensoside Rg from the melting point 194 to 196.5 ° C. and [a] DI95 c = + 329 (pyridine, C = 0.923) as a white crystalline powder were obtained.
3) Fractions Nos. 62 to 72 from the above first column chromatography were evaporated to dryness under reduced pressure to obtain 4.8 g of a residue. The product was purified by column chromatography on silica gel 60 (230 to 400 mesh, 500 g with an inner diameter of 5 cm) using the bottom layer of chloroform / methanol / water (65:35:10) for elution. The product consisted of ginsenoside Rbl, which was obtained by thin layer chromatography on silica gel F 254 and development with the lower layer of chloroform / methanol / water (65:35: 10) and spraying with 1% Ce (SO4) 2/10% H2SO4 solution gave a spot with Rf = 0.25.
The fractions which had such a spot were condensed, dried and the residue was dissolved in methanol. The methanol solution was removed with activated carbon and the filtrate evaporated to dryness to give 3.1 g of ginsenoside Rbl.
The product was a colorless, crystalline powder with a melting point of 197 to 198 ° C., [a], 22; C +12.42 (methanol, C = 0.91).
Clinical examination
case 1
Gastric cancer was diagnosed in a male patient of 62 years of age by patho-histological diagnosis, but the patient refused gastric resection (gastrectomy) and had no surgery. 200 mg / day of the saponin substance obtained by the isolation method described above was administered to the patient in two separate doses in the empty stomach. At the beginning of the treatment, the patient's body weight was 36 kg, the arthrocyte number 4.15 x 106 / mm2, the leucocyte number 6600 / mm2. The patient was pale and suffered from severe epigastric pain, and the presence of a tumor could be determined by palpation.
After one month of treatment, the epigastric pain had disappeared, the body weight increased to 41 kg, the complexion became good and radioscopic palpation (X-ray microscopy) of the stomach showed only a small depression, which was diagnosed as a gastric ulcer. After another month of uninterrupted treatment, the feeling of tiredness completely disappeared, the appetite increased and the body weight was 42.5 kg. The number of aryocytes was 4.4 x 106 / mm 2 and the leucocyte number 6900 / mm 2. At this point in time, only one scar from a gastric ulcer could be determined by endoscopy as well as by physiological examination, and a physiological examination of the scar region showed no malignant (malignant) results.
After administration of the saponin substance, no evidence of the acute or subacute toxicity of the saponin substance was found, either in subjective symptoms or during the examination.
This is a case in which the two-month administration of the saponin substance showed exceptionally good effects
Case 2
The patient was 52 years old and had gastric cancer accompanied by carcinomatous peritonitis. The cancer was spread all over the stomach and caused infiltration into the pancreas, peritoneum, schnitzler and small intestine. This was a case in which gastric resection was impossible. The patient complained as subjective symptoms of abdominal pain and nausea after meals and suffered from habitual constipation, accompanied by very severe abdominal pain before emptying.
Since the patient had a pale appearance and was very weak, 200 mg / day of the saponin substance was administered to the empty stomach in two separate doses. After two weeks of treatment, the abdominal pain began to subside and the patient's intake of food (semi-liquid food) was increased. After five weeks of treatment, a weight gain of 1 kg was registered and the abdominal pain was reduced to such an extent that it only occurred occasionally. In contrast, the pain before defecation was unchanged and there was no noticeable change in the nausea after meals.
Case 3
A 44-year-old patient had breast cancer, accompanied by metastases in the first lumbar vertebrae. The patient complains of severe lumbago (pain in the lower back) and difficulty walking. For treatment with the saponin substance, 100 mg / day of the drug was administered in two divided doses on an empty stomach. At the beginning of the treatment, the number of arthocytes was 3.8 x 106 / mm 2 and the leucocyte number was 6000 / mm 2, the aryrocyte sedimentation rate being 20 mm after 1 hour and 46 mm after 2 hours. After a week of treatment, the pain in the lower back began to subside somewhat and the face began to turn a good color, after 5 weeks the pain had completely disappeared and the patient was able to walk again.
At this time, the aryrocyte number was 4 x 106 / mm 2 and the leucocyte number was 6400 / mm 2 with an arthrocyte sedimentation rate of 16 mm after 1 hour and 36 mm after 2 hours. In addition, the X-ray examination of the bone area affected by metastases showed no progress of the metastases. Despite an improved appetite, no change in the patient's body weight has been observed since the start of ginseng saponin administration. In the course of the five-week treatment, no symptoms were ascertained that could have been attributed to side effects of the administered product.
Case 4
A male patient of 62 years had colon cancer accompanied by metastasis to the abdominal cavity; a tumor in the area of the navel was detectable by palpation and the patient complained of subjective symptoms, namely in the lower back and pain in the anal region when he was on the move; the arthrocyte number was 4.15 x 106 / mm2, the leucocyte number 7300 / mm2, the X-ray examination showed no metastasis in the lungs. In the same way as in case 3
100 mgj day of saponin substance administered in an empty stomach in two divided doses. After four weeks of treatment, the pain in the lower back began to decrease and the appetite increased. The pain in the anal area during defecation has not been satisfactorily resolved.
At this point in time, the arthrocyte number was 4.39 x 106 / mm 2 and the leucocyte number was 8900 / mm 2, the number being lymphocytes. The dose was increased to 200 mg / day (in two separate portions) and administered continuously for 4 weeks.
The results obtained show that the tumor in the umbilical region had been reduced to a size that was barely palpable, and the pain in the lower back area completely disappeared.
Case 5
In a male patient of 54 years, progressive gastric cancer was diagnosed by X-ray, endoscopic and pathohistological examination of the stomach. Gastrectomy was not performed due to the patient's weakness and at the patient's request. 200 mg / day ginsenoside Rgl was administered in two doses every day on an empty stomach. At the start of the administration, the body weight was 42 kg.
The patient had a pale complexion and a constant feeling of fullness in the stomach (gastric infection), loss of appetite (anorexia), strong feeling of pressure in the epigastric area, and the presence of a tumor could be determined by palpation. In contrast, no metastases were observed in other organs.
After four weeks of treatment, the stomach infection disappeared, the epigastric pain was relieved and at the same time the appetite improved, the face began to turn a good color and the body weight rose to 45.4 kg. The erythrocyte number was 4.35 x 106 / mm 2 and the leucocyte number 6850 / mm 2. The presence of a tumor could no longer be determined by palpation.
The radiographic examination showed only a small depression.
After eight weeks of treatment, the body weight reached 47 kg, the arryrocyte number was 4.42 x 1 06 / mm2 and the leucocyte number 7000 / mm2. The feeling of tiredness was gone and the epigastric pain was completely eliminated.
After twelve weeks of treatment, the body weight had increased to 48.4 kg, the arryrocyte number was 4.5 x 106 / mm 2 and the leucocyte number 7100 / mm 2.
The patient recovered to such an extent that only the scar of the ulcer could be determined using endoscopic and physiological examination, and a physiological examination of the scar region showed no malignant results. The patient was discharged from the hospital and only treated on an outpatient basis.
During a three-month treatment, no side effects were observed that could have been attributed to the administration of ginsenoside Rg1.
Case 6
A 45-year-old patient suffered from colon cancer.
As a subjective symptom, the patient complained of pain in the anal region when defecating, she had a pale complexion and suffered from loss of appetite, severe weakness and pain in the lower back (lumbago). The patient's chair was bloody and had a putrifying smell. A scan of the umbilical region revealed the presence of a tumor and the subsequent X-ray examination of the intestine, the proctoscopy or the like showed the presence of an intestinal cancer. No metastases were observed in other organs. 200 mg / day ginsenoside Rgl was then administered to the empty stomach in two divided doses. At the beginning of the treatment, the body weight was 38 kg, the arryrocyte number was 4.1 × 10 6 / mm 2 and the leucocyte number was 6100 / mm 2.
After four weeks of treatment, the appetite improved, the face began to show a good color, the constipation and diarrhea had almost completely disappeared, the pain in the lower back was reduced, the bloody stool no longer appeared and the putrifying smell was much weaker. The body weight had risen to 40 kg, the arryrocyte number was 4.3 x 106 / mm 2 and the leucocyte number 6300 / mm 2.
After 8 weeks of treatment, the tumor in the umbilical region was no longer palpable. Both the lumbago and the pain in the anal area when defecating were completely gone. The body weight was 42.5 kg, the arryrocyte number 4.45 x 106 / mm2 and the leucocyte number 6500 / mm2. The patient's condition had improved a lot.
Pharmacological examination A) Effects on cultivated Morris hepatoma cells (1) The effects of the saponin substance (ginsenosides) on cultivated cells of Morris hepatoma (MH1Cl) were investigated
The hepatoma cells were grown in standard medium containing 20 µg / ml of the saponin substance.
After 180 days, light microscopy showed a remarkable change in the morphological appearance: almost all changed cells appeared larger; the cytoplasm with numerous fine grains had grown in comparison with the volume of the nucleus, the ratio of nucleus to cytoplasm was about 1: 3, and the intercellular space was clearly visible.
In addition, it was confirmed with the aid of the method of colony formation in soft agar suspension culture, which is one of the proofs for neoplatic transformation, that the colony formation rate due to the saponin substance-changed cells is below V4 of the hepatoma cells (MH1Cl) as a control. (The remarkable drop in colony formation in soft agar can be interpreted as the phenotypic conversion of the hepatoma cells by the saponin substance).
(ii) The changes in the marker enzyme activities of the MH1C1 hepatoma cells which had been converted by the saponin substance were observed. (The urea cycle is an appropriate metabolic cycle in the liver cells, and the various enzymes associated with the urea cycle are very important as marker enzymes for cultured liver cells).
The uptake of L-3H-ornithine by the hepatoma cells (MH1C1) was 358.3 dpm / 105 cells in complete medium and 1781.1 dpm / l05 cells in arginine-free medium. In the hepatoma cells converted by saponin substance, the uptake of L-3H-ornithine was 699.0 dpm / 105 cells in complete medium, which increased to 4075.6 dpm / 105 cells in arginine-free medium.
The activities of succinate cytochrome C reductase increased approximately 2.0 times in the hepatoma cells converted by the saponin substance.
The above enzyme activities were carried out according to the Odashima method with a modification of the method by Leffert et al. were examined and were observed after 180 days of culture in the media with 20 μg / ml saponin substance.
From the above facts it can be concluded that the metabolic activity of the urea cycle of the cells converted by the saponin substance had increased markedly compared to normal cells.
Furthermore, both tests (i) and (ii) were also carried out using ginsenoside Rgl, and the results obtained are similar to those when using the saponin substance.
B) Animal experiments with Sarcoma 180
Investigation methods and results:
First method ddY mice (female, 6 weeks old, weight 20 g) were used as experimental animals in groups of 9, which Sarcoma 180 (Inoculum: 1 x 106 cells / S.C.) Were transplanted. 24 hours after the transplant, the first and second groups were given 50 mg / kg and 500 mg / kg ginsenoside Rgl and Rbl, respectively, orally. These investigations were continued for 7 consecutive days.
5 days after the end of the administration, the tumors were removed from all mice, a comparison of the tumor weights between the control group (without treatment) and each test group (test tumor weight and control tumor weight) was carried out, and comparative numbers and suppression mass were calculated. As a reference, 250 mg / kg of PSK (brand name * Crestin *, Kureha Chemical Industry Co., Ltd., Japan) was administered peritoneally under the same conditions, and the effects were compared with the above test results.
Results
The following table shows the average comparative numbers of tumor weights (test tumor weight / control tumor weight) and the degree of suppression between the control group and the test group.
Medication Average level
Weight test tumor / sub
Control tumor depression
Saponin substance
50 mg / kg (oral) 0.54 46%
500 mg / kg (oral) 0.76 24%
50 mg / kg (peritoneal) 0.62 38% ginsenoside Rgl 50 mg / kg (oral) 0.48 52% ginsenoside Rbl 50 mg / kg (oral) 0.87 13% crestin 250 mg / kg (peritoneal) 1, 16 0% Second method
Sarcoma 180 (2 x 105 cells / S.C.) Was transplanted to mice in groups of 9 under the same conditions as in the first method. 24 hours after the transplantation, the same doses of saponin-substan, ginsenoside Rgl, ginsenoside Rbl and crestinine as in the first method were administered on 12 consecutive days.
The tumors were removed 2 days after the end of treatment. The comparison of the average tumor weights between the control group and the test group was carried out and the degree of suppression was calculated.
Results
The following table shows the comparison of the average tumor weights and the degree of suppression.
Medication Average level
Weight test tumor / sub
Control tumor depression saponin substance 50 mg / kg (oral) 0.75 25% 500 mg / kg (oral) 0.70 30% 50 mg / kg (peritoneal) 0.97 3% ginsenoside Rgl 50 mg / kg (oral) 0.61 39% Ginsenoid Rbl 50 mg / kg (oral) 0.89 11% Crestin 250 mg / kg (peritoneal) 1.06 0% Third method
Sarcoma 180 (1 x 106 cells / S.C.) Was transplanted to mice in groups of 9 under the same conditions as in the first method. 24 hours after the transplantation, 50 mg / kg of the saponin substance, 50 mg / kg ginsenoside Rgl, 50 mgXkg ginsenoside Rbl were administered orally and 5 KE / kg bicibanil (Chugai Pharm.
Co., Ltd., Japan), or 5 ml / kg of Maruyama vaccine peritoneally injected. These tests were continued for 8 consecutive days. 5 days after the end of the treatment, the tumors of all test animals were removed, the average tumor weights were compared with the control group and the degree of suppression was calculated for each medication.
Results Medication Tumor Weight (Average Ratio Average - Mass Under for 9 Mouse Weight
Test tumor / control tumor saponin substance 50 mg / kg (oral) 1.72 + 0.006 g 0.78 22% ginsenoside Rg1 50 mg / kg (oral) 1.28 # 0.61 ginsenoside Rb1 50 mg / kg (oral) 1.99 # 0.59 Bicibanil 5 KE / kg (peritoneal) 1.99 + 0.62 0.90 10% Maruyama vaccine 5 ml / kg (peritoneal) 2.38i0.59 1.08 0%