CN1302811A - 化合物(i)、提取方法及在制备治疗急性缺血性脑血管病药中的应用 - Google Patents

Abstract

一种化合物(I),其提取方法及其在制备治疗急性缺血性脑血管病药中的应用。取人参属植物人参或三七的主根和/或须根,经工业酒精提取、正丁醇提取总皂甙、经硅胶柱色谱和反相柱色谱纯化,得化合物(I)。该化合物在制备治疗急性缺血性脑血管病的药物中得以应用。

Description

化合物(Ⅰ)，提取方法及在制备 治疗急性缺血性脑血管病药中的应用

本发明涉及一种化合物，特别是一种天然化合物，其提取方法及其在制备治疗急性缺血性脑血管病药中的应用。

急性缺血性脑血管病是严重危害人类健康的疾病，其发病率呈逐渐增加趋势。当脑缺血发生，脑组织细胞很快地出现能量代谢障碍，从而导致神经末梢大量释放出以谷氨酸为主的兴奋性神经递质，然后，激活NMDA及非NMDA受体，引起一系列导致脑损伤、脑梗死的病理变化。通过受体激活，促进大量Ca²⁺内流，细胞内Ca²⁺超负荷是使脑细胞死亡的关键因素及共同的通路。当缺血的脑组织在恢复血流供应时，又可产生再灌注损伤。这种脑组织缺血性再灌注后产生的脑损伤是脑梗死形成的另一个主要途径，往往与Ca²⁺内流增加，Ca²⁺超负荷相关。细胞内Ca²⁺超负荷，大量Na⁺内流及氧自由基剧增又可导致神经细胞凋亡，后者是缺血性脑细胞坏死的重要形式，是形成脑梗死的机理之一。

目前对急性缺血性脑血管病(急性缺血脑卒中、急性脑梗死)仍未有理想的治疗药物。针对上述发病机理，最常用的治疗方法是，在发病超早期或早期使用溶栓药(如tpA等)或降纤药物(如蛇毒降纤酶，巴曲酶及ancrode等)。通过溶解血栓使脑组织缺血区重新恢复血流供应。然而随着缺血区的血液重供应，必不可避免地产生脑细胞缺血/再灌注损伤。其临床疗效仍有待评估。此外，临床还采用脑保护药，阻断缺血后细胞坏死的不同机理，延长细胞生存能力，也可用于病危患者预防，促进后期神经元功能恢复，以达到治疗目的。该领域是当今研究的热点。目前可用的脑保护药有：1．Ca²⁺通道拮抗药：此类药物主要是通过阻断电压依赖性Ca²⁺通道，抑制细胞Ca²⁺内流，减轻细胞内Ca²⁺超负荷，达到治疗目的；临床应用的药物包含尼莫地平(nimodipine)及氟桂利嗪类。但急性缺血性脑血管病中导致脑组织损害的细胞内Ca²⁺超负荷主要是与受体操纵的Ca²⁺通道相关，故这类阻断电压依赖性Ca²⁺拮抗药，治疗效果仍有待证实。2．稳定细胞膜药物：胞磷胆碱，其疗效仍有待证实。至于其他脑保护药，如谷氨酸拮抗剂，Na⁺通道拮抗剂，γ-氨基丁酸增强剂等，在理论上有一定依据，但至今还未被临床研究证实其疗效。

人参、三七是中国名贵中药，作为活血化瘀药方广泛应用于治疗与中医“血瘀证”相关的疾病，如冠心病、偏头痛等，取得良好的疗效。但对其中治疗急性缺血性脑血管病的有效成分的研究较少，更无从知道其治疗“血瘀症”的作用机理。

本发明的目的就是为了克服目前无治疗效果好、毒副作用小的急性缺血性脑缺血管病的治疗药物的缺点，提供一种治疗效果好，毒副作用小的治疗急性缺血性脑血管病的药物。

本发明的另一个目的就是为提供三七、人参中提取的一种化合物及其提取方法，该化合物具有抗脑缺血/再灌注损伤、治疗急性缺血性脑血管病的作用。

本发明是这样实现的。

本发明的化合物[以下称化合物(Ⅰ)]化学名为：20-(S)-原人参二醇-3-[O-β-D-吡喃葡萄糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖]-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷20(S)-protopanaxadiol-3-[O-β-D-glucopyranosyl(1→2)-β-D-glucopyranosyl]-20-O-β-D-glucopyranoside化学结构式：

本发明的提取工艺步骤主要为：取人参属植物人参或三七的主根和/或须根。

1．生药经粉碎，以工业酒精(如含80％～90％乙醇浓度)冷提1次，再热提0～3次，合并滤液，经回收乙醇后，加正丁醇提取得粗总皂甙。

2．粗总皂甙先经硅胶柱色谱用梯度洗脱液分离，如以氯仿(85％～60％)-甲醇(15％～30％)-水(0％-10％)按不同比例配制洗脱液，进行梯度洗脱，以柱体积的1/3～1/5为1份收集洗脱液，以TLC检测，收集Rf值与对照相近似组分，合并后，回收溶剂，得到煎膏状浓缩液。

3．煎膏状浓缩液用适量甲醇溶解后，于C₈～C₁₈反相柱用梯度洗脱液分离及纯化，共进行一至两次反相柱色谱，如采用甲醇(50％～100％)-水(50％～0％)不同比例的洗脱液进行梯度洗脱，以柱体积的1/3～1/5为1份洗脱液，经TLC检测，收集所需组分。在第一次反相柱色谱后，单体纯度可达90％，第二次反相柱色谱后，单体纯度已达95％，最佳时可达98％以上的纯度。收集液经回收甲醇，再静置24h以上，即析出白色沉淀。倾去上层液后的沉淀于真空干燥处理，即得到所需高纯度化合物(Ⅰ)。

取化合物(Ⅰ)单体，检测其理化性质，进行元素分析，测定其质谱、红外、紫外光谱、¹H、¹³C核磁共振，其条件和结果为：

理化性质：白色或微黄色粉末，熔点209-214℃，易溶于低级醇、丙酮、氯仿、热水。

比旋度[α]_D ²²+19.38°(c=1.03,MeOH)

元素分析：C₄₈H₈₂O₁₈·3H₂O，计算(％)C57.62，H8.79，实验(％)C57.32，H8.93

FAB-MS(m/e)：969[M+Na]⁺,946[M]⁺,789[M+Na-180]⁺,721[789-68]⁺,627[789-163+H]⁺，587[789-179-Na]⁺,407[789-341-H₂O-Na]⁺,203[180+Na]⁺,145[180-2H₂O+H]⁺,109(基峰)

IR(ν^KBr _maxcm^-1)：3395[s,b,ν(OH,H₂O)], 2945、2882[s,ν(CH₃,CH₂,CH)],1651[m,b,ν(C=C)+ν(OH)],1454[m,ν(CH₃)+ν(CH₂)],1384[m,ν(CH₃)+ν(CH)],1082、1032[s,ν(C-O)]

¹H-NMR[C₅D₅N，谱宽5037.5Hz(10ppm)]共有82个质子峰，其中甙元含50个，葡萄糖和木糖含32个。在0.8-1.6ppm之间有8个甲基，0.789、1.070、1.245ppm峰为连在8位和4位碳上的18-CH₃、29-CH₃和28-CH₃峰；0.84(2×CH₃)和1.598ppm(3×CH₃)峰为连在10、14位和25、20位碳上的19-CH₃、30-CH₃和26-CH₃、27-CH₃、21-CH₃峰。3.24ppm峰为3位连氧的叔碳质子峰，4.04ppm峰包含12位连羟基的叔碳质子峰。5.24ppm峰为24位烯氢峰。3.8～5.3ppm峰组主要为葡萄糖和木糖的CH、CH₂质子峰。5.7～7.9ppm宽峰组为糖环中的11个羟基质子峰。其氢谱数据如下：δ：0.65(1H,d,J=11.5Hz,5-H),0,73(1H,q,J=11Hz,1-H),0.789(3H,s,18-CH₃),0.84(6H,s,19、30-CH₃),1.00(3H,t,J=12Hz,CH₃),1.07(3H,s,29-CH₃),1.21(1H,t,J=7.5Hz,-H),1.245(3H,s,28-CH₃),1.34(3H,m,6、11、15-H)，1.52(3H,m,1、9、15-H)，1.598(9H,s,21、26、27-CH₃),1.81(3H,m,J=10.5Hz,2、16、22-H),1.94(2H,t,J=10Hz,13、16-H),2.16(1H,d,J=12.5Hz,2-H),2.21(1H,m,23-H),2.34(1H,t,J=11Hz,22-CH),2.44(1H,s(br),23-H),2.50(1H,q,J=9Hz,17-H),3.24(1H,dd,J=8,3.5Hz,3位连氧CH),3.87(1H,s,OH),3.94(1H,t,J=8Hz,20-glc-2H),4.04(4H,q,J=8Hz,12-H,OH,glc-2H),4.11(2H,t,J=9Hz,3-glc-2H,20-glc-3H),4.18(3H,m,J=8Hz,CH),4.24(4H,m,J=9Hz,CH),4.41(3H,m,J=11.5Hz,CH),4.50(1H,d,J=11Hz,CH),4.86(1H,d,J=7.5Hz,20-glc-1H),5.12(1H,d,J=8Hz,glc-1H),5.24(1H,t,24-H),5.29(1H,d,J=7.5Hz,3-glc-1H),5.61(1H,s,CH),5.71(1H,s(br),OH),6.08(1H,s(br),OH),6.28(1H,s(br),OH),7.03(3H,s(br),OH),7.22(3H,s(br),OH),7.49(1H,s(br),OH),7.84(1H,s(br),OH)

¹³C-NMR[C₅D₅N,500MHz，谱宽26016.3Hz(200ppm)]共48个有效峰，由DEPT谱确定CH₃碳峰8个，CH₂碳峰12个，CH碳峰22个，季碳峰6个，其中甙元30个碳峰，余下的18个分属3个吡喃糖。其碳谱数据如下：δ:15.88(q,CH₃),16.19(q,CH₃),16.50(q,CH₃),17.27(q,CH₃),17.72(q,CH₃),18.35(t,CH₂),22.37(q,CH₃),23.17(t,CH₂),25.70(q,CH₃),26.55(t,CH₂),26.63(t,CH₂),28.00(q,CH₃),30.71(t,CH₂),30.71(s,C),35.06(t,CH₂),35.96(t,CH₂),36.81(s,C),39.11(t,CH₂),39.60(s,C),39.93(s,C),49.29(d,CH),50.08(d,CH),51.35(s,C),51.65(d,CH),56.32(d,CH),62.65(t,CH₂),62.73(t,CH₂),62.73(t,CH₂),70.18(d,CH),71.38(d,CH),71.54(d,CH),71.54(d,CH),74.97(d,CH),76.85(d,CH),77.67(d,CH),77.88(d,CH),78.05(d,CH),78.05(d,CH),78.16(d,CH),78.97(d,CH),83.17(d,CH),83.26(d,CH),88.94(d,CH),98.12(d,CH),104.93(d,CH),105.76(d,CH),125.82(d,CH),130.86(s,C)

UV(λ_max,nm):200.80

经7％H₂SO₄及50％乙酸水解，证明甙元为人参二醇，糖部份为葡萄糖，有1分子葡萄糖结合于C20位。

化合物(Ⅰ)对大鼠局部性脑缺血/再灌注损伤的治疗作用结果为：采用SD大鼠局部性脑缺血/再灌注损伤模型观察化合物(Ⅰ)的治疗作用，试验结果表明，静脉注射50mg/kg,10mg/kg及2mg/kg剂量的化合物(Ⅰ)，均能明显减少大脑中动脉栓塞/再灌注引起的脑组织坏死区面积、减轻神经细胞坏变及神经纤维变性、减少氧自由基的生成、减轻脑组织水肿程度及脑电幅度下降程度、改善受试动物的行为障碍，其治疗作用呈剂量依赖性。主要药效学试验结果同时说明，化合物(Ⅰ)的治疗作用优于阳性对照药物尼莫地平。

具体实施如下：

实验动物

采用longa法制备大脑中动脉栓塞/再灌注损伤大鼠模型。静脉注射25％乌拉坦(0.4ml/100g体重)麻醉动物，用加热灯保持鼠体温37±0.5℃(肛温)。将大鼠仰卧固定于方板上，颈部正中切口，通过显微外科技术，分离左颈总动脉及其分叉，游离颈外动脉。电凝切断颈外动脉发出的枕动脉、甲状腺上动脉、咽外动脉，再向头端游离颈外动脉，用5-0丝线尽量靠远端结扎颈外动脉。用血管夹夹闭颈外动脉的起始部，在血管夹与结扎线之间，用5-0丝线穿过颈外动脉打松结。靠近结扎剪断颈外动脉，把一根长5cm的头端成鼓锤状3-0单丝尼龙线置入颈外动脉，扎紧颈外动脉上的丝线避免出血。去掉血管夹，将尼龙线缓慢推入颈内动脉，调整方向将尼龙线插进颅腔，感受到阻力时即达大脑前动脉。从颈内动脉起始部开始计算，尼龙线插入深度一般在20～21mm时，大脑中动脉起始处被阻断，同时也阻断了来自前脑动脉、颈内动脉及后脑动脉的侧枝血流。然后将松结于颈外动脉残端的丝线再打三结结扎，缝合切口，把尼龙线引出皮肤切口处，以便拔出形成再灌注时使用。拔出尼龙线时，动作缓慢轻柔，感到阻力后即停止抽拔，此时已表明栓塞的尼龙线膨大的头端已经退至颈外动脉的残端内，再灌注已形成。

(2)试验分组

各组实验中，化合物(Ⅰ)及对照药物均采用静脉注射方式给药，注射容量相同。

动物用随机抽样分组。

本实验规定栓塞缺血1小时后形成再灌注，再灌注5小时后观察规定指标。并设实验分组如下：

			给药剂量		注射时间
							组别	动物数量	观察指标	化合物(Ⅰ)mg/kg	尼莫地平μg/kg	1．栓塞后分钟	2．再灌注后分钟
Ⅰ	10	1、2、3	50	10	10	5
							Ⅱ	10	1、2、3	50	10	30	30
Ⅲ	10	1、2、3	10	20	10	5
							Ⅳ	10	1、2、3	2	40	10	5
Ⅴ	10	4、5	50	20	10	5

观察指标

1．脑梗塞范围测定：

开颅取全脑，去除嗅球、小脑及脑干，以2.7mm为间隔将大脑冠状切成厚度相等的6个切片。从额端向枕端依次定为1、2、3、4、5、6，每个切片的额端为A面，枕端为B面。将切片2、3、4放入1％TTC(氯化三苯基四氮唑，使用时用蒸馏水溶解并避光保存)中，避光，在37℃水浴中染色10分钟。正常组织内含脱氢酶与TTC反应呈红色，梗塞组织因脱氢酶丢失不能与TTC产生反应而呈白色。组织与TTC反应呈现的白色显色程度反映了梗塞脑组织的变性坏死程度。脑组织梗塞范围通过全自动图象分析系统(型号：IPAS-C，德国Kontror公司)测定，组织变性坏死程度可通过该分析系统用灰度表示出来，程度越严重灰度越大。本实验采用切片2、3测定值的平均数作为每动物梗塞区范围的测定结果。

2．脑组织含水量测定：

参考Gotoh法，快速取出鼠脑，把左右大脑半球用十万分之一电子自动天平分别称重，然后置160℃烤箱内烤干至恒重，分别称量大脑半球干重，按以下公式计算脑组织含水量：

含水量(％)=[(湿重-干重)/湿重]×100％

3．病理检查：

经TTC染色后的脑片置10％福尔马林中固定，经脱水、浸蜡、包埋、切片等步骤后采用常规苏木素伊红(HE)染色，显示神经细胞坏变；采用髓鞘染色显示神经纤维是否脱髓鞘及脱髓鞘程度。

4．脑电图描记：

将一根针电极置于额顶区，另一电极置于栓塞侧的鼠耳皮下，作为参考电极，用日本光电公司8导生理记录仪记录栓塞前后的皮层外脑电变化。

5．生化试验：

大鼠38只，脑缺血/再灌注损伤后随机分对照组(等容量生理盐水)、尼莫地平治疗组(40μg/kg)及化合物(Ⅰ)治疗组(50mg/kg)，于堵塞脑缺血后10分钟及再灌注后5分钟，分二次舌下iv给药。缺血1小时，再灌注5小时后按Gotoh方法，快速剥出大鼠脑，将左、右大脑半球分别称重，然后置-70℃冰箱保存。

将待测组织(约0.3～0.5)用生理盐水洗净，然后用冷蒸馏水(4℃)在玻璃匀浆器上制成10％匀浆。在0℃,1500转/分离心15分钟，取上清液进行超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量测定。

(1)SOD测定(邻苯三酚自氧化法)：取15ml试管，依次加入pH8.2Tris-HCl缓冲液4.5ml，双蒸水4.3ml，样本匀浆液0.1ml,7mmol/L邻苯三酚0.1ml(空白管加10mmol/L HCl 0.1ml)。将空白管校零。用紫外分光光度计(UV 1601 PC，日本岛津公司)，在波长325nm，狭缝2，测定吸光度变化。然后按以下公式求出SOD活性单位。(2)MDA测定：按下表程序进行

试剂(ml)	测定管	空白管	标准管
				10％组织匀浆	0.2	-	-
MDA标准液	-	-	0.2
				8.1％SDS	0.2	0.2	0.2
20％醋酸缓冲液(pH3.5)	1.5	1.5	1.5
				1％TBA	1.5	1.5	1.5
蒸馏水	1.0	1.0	1.0

摇匀加盖，95℃水浴加热60min，冷却后，3000r/min离心15min。取上清液用分光光度计532nm波长测定吸光度值，然后在MDA的标准曲线上求得MDA含量。

6．参考Longa方法，于再灌注后5小时观察行为变化进行评分。评分标准如下：无行为改变，0分；右前肢不能伸直，1分；偏向右侧但无主动打圈，2分；右侧行走，3分；原地右旋转，4分；右偏瘫，5分。

实验结果

1．对梗塞面积的影响：

实验结果表明，2～50mg/kg化合物(Ⅰ)能够减轻脑缺血/再灌注所致的脑组织损伤，明显减小脑组织栓塞面积，减轻受损脑组织的坏死程度。其治疗作用呈剂量依赖性。尼莫地平治疗组表现出减小脑组织梗塞面积的倾向，但是只有在40μg/kg高剂量组才与盐水组有统计学上的显著性差异(p＜0.05)，但总的治疗作用弱于化合物(Ⅰ)的治疗组。

2．对脑电影响：

实验结果表明，盐水组大脑动脉栓塞1小时，再灌注5小时后脑电幅度明显减低。50mg/kg及10mg/kg剂量的化合物(Ⅰ)能明显改善脑电的变化，脑电幅度的降低明显减小(p＜0.01)。2mg/kg剂量组有改善脑电变化的倾向，但统计学上没显著性差异。尼莫地平在剂量为40μg/kg剂量组时能表现出改善脑电变化的作用(p＜0.05)。

3．对神经细胞及神经纤维病理变化的影响：

实验结果表明，静脉注射50mg/kg、10mg/kg及2mg/kg化合物(Ⅰ)均可减轻神经细胞的坏变数目及神经纤维变性的程度，其保护作用呈剂量依赖性并强于尼莫地平。

4．对行为改变的影响：

实验结果表明，生理盐水对照组行为评分为3.3±1.0；尼莫地平组为2.9±1.2(P＞0.05，与生理盐水比较)。化合物(Ⅰ)治疗组为1.9±0.8(P＜0.01，与生理盐水组比较)。化合物(Ⅰ)治疗组能明显改善由脑组织损伤所致的严重行为障碍。尼莫地平治疗组与盐水组比较没有统计学上的显著性差异。

5．对SOD活性及MDA含量的影响：

实验结果表明生理盐水组的SOD活性明显降低，从正常对照组(假手术组)的70.30±24.7u/g明显降至46.7±16.6u/g(P＜0.05)。用化合物(Ⅰ)治疗组及尼莫地平治疗组的SOD活性与正常对照组比较无统计学上的显著性差异(P＞0.05)。盐水组的MDA含量为87.7±27.5nmol/mg组织重，与正常对照组(假手术组)(60.0±14.8nmol/mg组织重)相比，明显升高(P＜0.01)。化合物(Ⅰ)治疗组和尼莫地平治疗组可使MDA含量降下近至正常组，分别为65.8±19及67.0±21.8nmol/mg组织重(与正常组比较P＞0.05)。

6．对脑组织含水量的影响：

实验结果表明，静脉注射化合物(Ⅰ)能明显减少因脑缺血/再灌注引起的梗塞区脑组织含水量增加。而20μg/kg尼莫地平虽有减少倾向，但与生理盐水组比较统计学上没有显著性差异。

结论

实验结果表明，静脉注射50mg/kg、10mg/kg及2mg/kg剂量的化合物(Ⅰ)均能明显减少大脑中动脉栓塞/再灌注引起的脑组织坏死面积、减轻神经细胞坏变及神经纤维变性、减轻脑组织水肿程度、减少氧自由基的生成及脑电幅度下降程度、改善受试动物的行为障碍，其治疗作用呈剂量依赖性并优于阳性对照药物尼莫地平。

综合以上资料表明，化合物(Ⅰ)对脑栓塞/再灌注引起的脑组织损伤坏死有明显的治疗作用。可用于治疗急性缺血性脑血管病。

化合物(Ⅰ)的急性毒性试验的结果为：

小鼠  静脉给药   LD50  356.18mg/kg

                 95％可信限为：346.01～366.64mg/kg

      肌肉注射   LD50  583.96mg/kg

                 95％可信限为：564.77～603.79mg/kg

化合物(Ⅰ)的慢性试验的结果为：

大鼠ⅳ化合物(Ⅰ)14天，主要引起大鼠注射局部尾静脉内膜炎。病变的损伤程度与药物剂量成正相关。10、30mg/kg有轻微局部刺激，100mg/kg为有毒剂量。

三致试验结果表明，化合物(Ⅰ)无三致作用，即无致畸、致癌、致突变作用。骨髓微核试验表明，化合物(Ⅰ)并不诱发骨髓嗜多染红细胞微核的形成。

总之，化合物(Ⅰ)对脑缺血/再灌注损伤有良好的治疗作用，且毒性作用小，临床上可应用于急性缺血性脑血管疾病、中风、脑出血、脑栓塞引起的脑缺血/再灌注引起的脑细胞损伤、坏死的治疗。

药理实理表明，化合物(Ⅰ)具有与目前临床使用的Ca²⁺通道阻断剂的不同特性，后者只对电压依赖性Ca²⁺通道有阻断作用，而对受体操纵Ca²⁺通道极少作用。相反，化合物(Ⅰ)只对受体操纵Ca²⁺通道有特异阻断。急性缺血性脑血管病相关的Ca²⁺内流增多，主要与受体操纵Ca²⁺通道相关，化合物(Ⅰ)是通过这一新作用靶点，干扰促使脑细胞死亡的共同通路-Ca²⁺内流增多，胞内Ca²⁺超负荷，达到治疗脑缺血/再灌注损伤、脑梗死的目的。因而其治疗效果好。

化合物(Ⅰ)治疗急性缺血性脑血管病，通常采用以下治疗方案：制备成粉针剂或注射液，肌注或静脉注射10～30mg/次，每12小时一次，7～14天为一疗程。也可以采用口服剂型，不过剂量应加倍。也可以与其它药物作成复方制剂，如与溶栓药(如tpA等)复方，如与降纤药物(蛇毒降纤酶等)复方，如与胞磷胆碱复方等，能达到增强作用甚至协同治疗效果。

化合物(Ⅰ)在3位上的葡萄糖基减少一个，也具有类似的效果，即为化合物20-(S)-原人参二醇-3-[O-β-D-吡喃葡萄糖]-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。化合物(Ⅰ)在3位上的一个葡萄糖基为其它的单糖取代，如鼠李糖等，也具有相类似的效果。

化合物(Ⅰ)也可以制备成琥珀酸盐衍生物(如钾、钠)供药用。

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1，取三七的主根和须根，粉碎，1kg生药粉末用含乙醇85％的工业酒精冷浸过夜，滤过，残渣再用85％酒精热提3次，每次2h，取滤液合并，回收乙醇后，浓缩液经正丁醇提取得粗总皂甙。将粗总皂甙在65×1300mm的色谱柱(装填100～200目的柱层析硅胶1200g)上，依次用氯仿(83％)-甲醇(16％)-水(1％)、氯仿(76％)-甲醇(22％)-水(2％)、氯仿(68％)-甲醇(28％)-水(4％)，氯仿(65％)-甲醇(30％)-水(5％)、氯仿(61％)-甲醇(33％)-水(6％)等不同比例的洗脱液进行梯度洗脱，每550ml为1份收集洗脱液，以TLC检测，Rf相近组分合并后，回收溶剂，得到煎膏状浓缩液。将煎膏状浓缩液用少量甲醇溶解后，于C18反相柱分离及纯化，依次用甲醇(60％)-水(40％)、甲醇(65％)-水(35％)、甲醇(70％)-水(30％)、甲醇(80％)-水(20％)、甲醇(85％)-水(15％)、甲醇(100％)-水(0％)不同比例的洗脱液进行梯度洗脱，以每份100ml收集洗脱液，经TIC检测，收集与标准品R_f值相同的组分。经回收甲醇浓缩后，再按上述方法经第二次反相柱纯化。收集液回收甲醇，再静置24h，即析出白色沉淀。倾去上层液，沉淀物于40℃真空干燥，即得到纯度达98％的单体3.0g。

实施例二，取人参的主根和须根，其余同实施例1。

实施例三，取三七的主根和须根，第一次梯度洗脱液为氯仿(80％～55％)-乙酸乙酯(15％～30％)-水(5％～15％)，极性逐渐增强，反相柱纯化梯度洗脱液为乙醇(60％～100％)-水(40％～0％)，极性逐渐减弱。

本发明的各实施例经二次柱层析洗脱，均达到较高的单体纯度。本发明不限于上述实施例。

Claims (9)

1．一种化合物(Ⅰ)，化学名为20-(S)-原人参二醇-3-[O-β-D-吡喃葡萄糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖]-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，其结构式为：

2．一种如权利要求1所述的化合物(Ⅰ)的提取方法，取人参属植物人参或三七的主根和/或须根，提取工艺步骤依次包括：

(1)生药经粉碎，以工业酒精冷提1次，再热提0～3次，合并滤液，经回收乙醇后，加正丁醇提取得粗总皂甙；

(2)粗总皂甙先经硅胶柱色谱用梯度洗脱液分离，以TLC检测，收集Rf值与对照相近似组分，合并后，回收溶剂，得到煎膏状浓缩液；

(3)煎膏状浓缩液用适量甲醇溶解后，于C₈～C₁₈反相柱用梯度洗脱液分离及纯化，共进行一至二次反相柱色谱，以柱体积的1/3～1/5作为1份洗脱液，经TLC检测，收集所需组分；收集液经回收甲醇，再静置24h以上，即析出白色沉淀；倾去上层液后的沉淀于真空干燥处理，即得到高纯度单体。

3．根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的提取方法，其特征在于硅胶柱色谱的梯度洗脱液为氯仿(85％～60％)-甲醇(15％～30％)-水(0％～10％)，极性逐渐增强。

4．根据权利要求2或3所述化合物(Ⅰ)的提取方法，其特征在于硅胶柱色谱的梯度洗脱液依次为氯仿(83％)-甲醇(16％)-水(1％)、氯仿(76％)-甲醇(22％)-水(2％)、氯仿(68％)-甲醇(28％)-水(4％)，氯仿(65％)-甲醇(30％)-水(5％)、氯仿(61％)-甲醇(33％)-水(6％)。

5．根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的提取方法，其特征在于C₈～C₁₈柱色谱的梯度洗脱液为甲醇(50％～100％)-水(50％～0％)，极性逐渐减弱。

6．根据权利要求2或5所述的化合物(Ⅰ)的提取方法，其特征在于C₈～C₁₈反相柱色谱的梯度洗脱液依次为甲醇(60％)-水(40％)、甲醇(65％)-水(35％)、甲醇(70％)-水(30％)、甲醇(80％)-水(20％)、甲醇(85％)-水(15％)、甲醇(100％)-水(0％)。

7．化合物(Ⅰ)应用于制备治疗急性缺血性脑血管病的药物。

8．根据权利要求7所述的化合物(Ⅰ)应用于制备治疗急性缺血性脑血管病的药物，其特征在于剂型为粉针剂或注射液。

9．根据权利要求7所述的化合物(Ⅰ)应用于制备治疗急性缺血性脑血管病的药物，其特征在于化合物(Ⅰ)与其它药物复方制成复方制剂。