CN115068490A - 人参皂苷ck在制备脓肿分枝杆菌或/和结核分枝杆菌的抑菌剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了人参皂苷CK在制备脓肿分枝杆菌或/和结核分枝杆菌的抑菌剂中的应用，属于医药技术领域。本发明通过对西洋参提取物组分进行鉴定，发现人参皂苷CK能够抑制脓肿分枝杆菌和结核分枝杆菌的生长，不低于250μg/mL的皂苷CK能抑制脓肿分枝杆菌90%以上的生长及其生物膜的形成，不低于125μg/mL的皂苷CK能抑制结核分枝杆菌90%以上的生长及其生物膜的形成，人参皂苷CK可应用于制备抑制脓肿分枝杆菌或/和结核分枝杆菌产品中。

Description

人参皂苷CK在制备脓肿分枝杆菌或/和结核分枝杆菌的抑菌 剂中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及人参皂苷CK在制备脓肿分枝杆菌或/和结核分枝杆菌的抑菌剂中的应用。
背景技术
人参属植物(包括西洋参、亚洲人参与三七)被广泛研究用于治疗呼吸道感染疾病，尤其是治疗流感、肺炎的有效性已经得到验证。人参属植物的主要活性成分皂苷、多糖等都可能是发挥抑菌作用的部分。本研究重点关注皂苷部分，皂苷是由糖与皂苷元构成，人参皂苷特指人参属植物的主要药理皂苷成分，以区别于其他植物。在生人参或加工人参中已分离鉴定出40多种人参皂苷，根据其苷元骨架主要分为达玛烷、齐墩果酸及奥克梯隆醇型。达玛烷型是主要的人参皂苷，分为原人参二醇及原人参三醇型：二醇型包括人参皂苷Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc及Rd等，西洋参中二醇型皂苷与三醇型皂苷的比例为3-4:1。稀有人参皂苷CK、Rk1等属于由原人参二醇型皂苷(Rb1、Rb2和Rc等人参皂苷主要活性成分)经微生物代谢或水解后的次级代谢产物，人参皂苷CK的结构式为：
Figure BDA0003709230100000011
生物活性研究表明人参皂苷CK是一个多靶点、高活性化合物，其不但在抗肿瘤、抗炎、保肝和抗过敏方面体现了良好的活性，而且在神经系统及免疫系统方面也具有很好的调节作用，具有抑制肿瘤细胞增殖和炎症、抗致癌和抗癌、抗过敏、缓解老年痴呆症的症状、抗糖尿及抗氧化因子促进胰岛素分泌、保护肝脏和皮肤的作用。
通常细菌以浮游和生物膜两种生长状态生存，为抵御各种环境压力或出于群体策略，如抗生素、强酸/碱环境、被宿主免疫细胞吞噬等，单一或多种细菌会聚集成团块，形成生物学特性不同于浮游菌的生物膜，增强其毒力或耐药能力。已有研究表明皂苷Rb2对头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌有很强的抗菌活性(MIC<1μg/mL)针对同样的细菌，皂苷Rb1抑菌效果弱于Rb2，经检索，目前未有人参皂苷CK对分枝杆菌属细菌的抗菌活性的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供人参皂苷CK在制备脓肿分枝杆菌或/和结核分枝杆菌的抑菌剂中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
人参皂苷CK在制备抑制脓肿分枝杆菌或/和结核分枝杆菌产品中的应用。
人参皂苷CK在抑制脓肿分枝杆菌或/和结核分枝杆菌中的应用。
人参皂苷CK在抑制脓肿分枝杆菌或/和结核分枝杆菌生物膜形成中的应用。
人参皂苷CK在制备预防和治疗脓肿分枝杆菌或/和结核分枝杆菌所致疾病的药物中的应用。
进一步地，人参皂苷CK来源于西洋参提取物的代谢物。
进一步地，所述产品为抑菌剂。
进一步地，所述抑菌剂的活性成分为人参皂苷CK。
进一步地，所述人参皂苷的浓度不低于125μg/mL。
本发明具有以下优点：本发明通过对西洋参提取物组分进行鉴定，发现西洋参提取物中的人参皂苷CK能够抑制脓肿分枝杆菌和结核分枝杆菌的生长不低于250μg/mL的皂苷CK能抑制脓肿分枝杆菌90％以上的生长及其生物膜的形成，不低于125-μg/mL的皂苷CK能抑制结核分枝杆菌90％以上的生长及其生物膜的形成，人参皂苷CK可应用于制备抑制脓肿分枝杆菌或/和结核分枝杆菌产品中。
附图说明
图1为西洋参提取物经LC-MS非靶向代谢物鉴定成分图，图中，1：为人参皂苷Rk1，2：为人参皂苷Rb1，3：为人参皂苷Rb2，4：为人参皂苷CK，5：为拟人参皂苷F11。
图2为5种人参皂苷抑制标准脓肿分枝杆菌浮游菌，其中，a-f：15.6-500μg/mL的人参皂苷抑制脓肿分枝杆菌标准株浮游菌的微孔板图与柱状图；b：皂苷Rb1；c：皂苷Rb2；d：皂苷CK；e：皂苷Rk1；f：拟人参皂苷F11。
图3为CK抑制标准脓肿分枝杆菌生物膜形成的生物量分析，其中，a：不同浓度CK与脓肿分枝杆菌共培养抑制生物膜形成的宏观图片；b-c：结晶紫染色各组生物膜总生物量(****：p<0.0001)。
图4为5种人参皂苷抑制结核分枝杆菌浮游菌，其中，a-f：15.6-500μg/mL的人参皂苷抑制结核分枝杆菌H37Ra浮游菌的微孔板图与柱状图；b：皂苷Rb1；c：皂苷Rb2；d：皂苷CK；e：皂苷Rk1；f：拟人参皂苷F11。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：实施例1：抑制脓肿分枝杆菌实验
一、材料和方法
(一)实验材料
1、菌株与药物
脓肿分枝杆菌标准菌株(ATCC 19977)购自美国模式培养物集存库；脓肿分枝杆菌临床分离株7株(MAB-S1、MAB-S2、MAB-S3、MAB-R1、MAB-R2、MAB-R3、MAB-R4)由四川大学华西第四医院微生物室提供，菌株相关操作均在生物安全二级实验室按照实验室生物安全通用要求(GB 19489-2008)完成。
中药提取物干粉西洋参提取物均购自中国西安汇林生物科技有限公司；5种人参皂苷-人参皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1,C54H92O23，批号：drk-1076-950519)，人参皂苷Rb2(Ginsenoside Rb2,C53H90O22，批号：drk-1067-940913)，人参皂苷CK(20(S)-GinsenosideCK,C36H62O8，批号：drk-1070-941126)，人参皂苷Rk1(Ginsenoside Rk1,C42H70O12，批号：drk-0079-950920)及拟人参皂苷F11(Pseudoginsenoside F11,C42H72O14，批号：drk-1204-950604)均购自成都德锐可生物科技有限公司。
2主要试剂配制
西洋参提取物(PQE)溶解于无菌水，配制为400mg/mL的储存浓度，经0.22μm的滤膜过滤除菌；人参皂苷溶解于DMSO，配制为50mg/mL的储存浓度，置于-20℃冰箱备用。
(二)实验方法
1、西洋参提取物组分鉴定
PQE组分由Nexera UPLC系统串联Q-Exactive质谱仪进行鉴定。称取10mg PQE粉末状样本，加入内标(L-2-氯苯丙氨酸，0.3mg/mL；甲醇配置)15μL，400μL的甲醇-水(V:V＝1：4)；涡旋1min后冰浴超声30min；13000rpm，4℃离心10min，吸取150μL上清液，使用0.22μm的有机相过滤器过滤后，转移到LC进样小瓶，进行LC-MS分析。采用色谱柱(1.8μm，2.1*100mm)，柱温45℃；二元梯度洗脱系统包括(A)水(含0.1％甲酸，v/v)和(B)乙腈(含0.1％甲酸，v/v)，使用以下梯度：0min，5％B；2min，5％B；4min，30％B；8min，50％B；10min，80％B；14min，100％B；15min，100％B；15.1min，5％B和16min，5％B。流速为0.35mL/min；进样量为2μL(PQE的浓度为24μg/μL)；离子源：ESI；样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式；质量范围从m/z 125到1000；全质谱扫描的分辨率为70000，HCD MS/MS扫描的分辨率为17500；碰撞能量为10、20和40eV；质谱仪的操作如下：喷雾电压，3500V(+)和3500V(-)；鞘内气体流速，40任意单位(+)和35任意单位(-)；辅助气体流速，10任意单位(+)和8任意单位(-)；毛细管温度，320℃。
2、皂苷单体对标准脓肿分枝杆菌的抑菌活性测定
结合西洋参提取物组分鉴定结果以及文献中西洋参的有效成分，本次选取了5种人参皂苷，分别为人参皂苷Rb1、Rb2、Rk1、CK以及拟人参皂苷F11。为了研究该5种人参皂苷对标准脓肿分枝杆菌是否具有类似西洋参提取物的抑菌活性，采用微孔板阿玛尔蓝法测定MIC。皂苷浓度依次是500-15.6μg/mL对倍稀释(共6个浓度)，同时设置西洋参提取物与当归提取物组(浓度依次是200-6.25mg/mL，对倍稀释，共6个浓度)，生长对照与溶剂对照组等操如下：
菌悬液制备：接种环挑取复苏活化后的单个菌落在10mL 7H9肉汤培养基中，37℃摇床恒温振摇至菌液生长到对数生长期：以培养基作空白对照管，测得OD在600nm波长下吸光度约为0.5时，取菌液与新鲜7H9肉汤培养基稀释制备菌悬液备用(约1×105CFU/mL)。
采用96孔板(平底)微量稀释法测定药物的最小抑菌浓度。以第一孔(25μg/mL的卡那霉素)作抑菌对照，第十二孔(10μL的DMSO溶剂)作生长对照，第二至第十一孔依次为二倍稀释的10个药物浓度梯度实验组，将各药物稀释到制备好的菌悬液中。浓度依次是500、250、125、62.5、31.25、15.6μg/mL，每孔总体积200μL，每个浓度设置复孔。将接种好的微孔板放置于5％CO2培养箱37℃培养1d后测试生长对照，加入1％的Resazurin溶液培养过夜，观察颜色是否已由蓝色变为红色，若已变为红色，此时在剩余所有孔中加入1％的Resazurin溶液培养过夜。采用多功能微孔板分析仪测定540/590nm处的荧光值，以抑菌对照为本底，计算药物不同浓度下对标准脓肿分枝杆菌的生长抑制率，抑制率大于等于50％对应的最低药物浓度为该药对细菌的MIC50，抑制率大于等于90％对应的最低药物浓度为该药对细菌的MIC90。
3、CK对标准脓肿分枝杆菌生物膜形成总生物量影响
为了证实对标准脓肿分枝杆菌具有抑菌活性的人参皂苷单体是否具有类似西洋参提取物抑制标准脓肿分枝杆菌生物膜形成的作用，在获得CK对标准脓肿分枝杆菌的MIC后，设置0MIC、0.5MIC及1MIC(0、125与250μg/mL)为CK作用于标准脓肿分枝杆菌生物膜形成的终浓度，其余生物膜培养及结晶紫测定生物膜生物量操作分别同实验方法3.1、3.2。
4、统计分析
数据表示为平均值±标准偏差。使用单因素方差分析对统计数据进行分析。使用Prism(GraphPad Prism 8.0,USA)进行图表和统计分析，P<0.05时认为差异具有统计学意义。
二、实验结果
1、西洋参提取物组分鉴定LC-MS分析
原始数据经代谢组学处理软件Progenesis QI v2.3软件(Nonlinear Dynamics,Newcastle,UK)进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化，其主要参数为：precursor tolerance：5ppm，product tolerance：10ppm，product ion threshold：5％。基于精确的质荷比(M/z)、次级碎片和同位素分布，使用EMDB、PMDB、自建数据库做定性分析，使用人类代谢组数据库(HMDB)、Lipidmaps(V2.3)、Metlin、与HDMB库比对无法识别出峰对应的部分成分(物质峰与代谢物统计见表1)；植物化学鉴定结果表明PQE中存在二酯萜类、三萜类、甾体糖苷、碳水化合物、黄烷、短链酮酸及其衍生物、胆甾烷类固醇、豆甾烷和脂肪酸。图1中的LC色谱图显示了与提取物中存在的代谢物相对应的保留时间和峰。根据代谢物精确质荷比及相对应的保留时间，Rk1的分子量和化学式与Rg5相同，而CK的分子量和化学式与Rh2相同。
表1物质峰与代谢物统计表
Figure BDA0003709230100000051
2、皂苷单体对标准脓肿分枝杆菌的抑菌活性测定
利用微量稀释法以及平板涂布法测试了5种可获得人参皂苷纯品对标准菌株的体外抑菌以及杀菌活性。测定结果如图2所示，图2-a，显示人参皂苷CK以及对照PQE对脓肿分枝杆菌有一定的杀菌活性，而对照当归提取物(Angelica sinensis extract，ASE)在200mg/mL时未展现对脓肿分枝杆菌的抗菌活性。根据荧光值定量计算可得：250-500μg/mL的皂苷CK能抑制该菌90％以上的生长；500μg/mL的其他四种皂苷仅能抑制该菌约50％以下的生长(图2b、2c、2e、2f)；MBC结果显示CK在1MIC(250μg/mL)时能够杀死99.9％的脓肿分枝杆菌(表2)。
表2PQE及皂苷单体对标准脓肿分枝杆菌浮游菌的抑菌活性
Figure BDA0003709230100000061
3、CK对标准脓肿分枝杆菌的生物膜形成总生物量影响
如图3所示，各组经CK处理后脓肿分枝杆菌生物膜的宏观图像如图3a所示：无药对照孔在气液交界面形成一层生物膜；250、125μg/mL的CK处理导致孔中几乎没有肉眼可见的生物膜形成，仅底部残余松散的白色絮状物(为CK析出结晶状态)。结晶紫染色测定生物膜的结果如图3b所示：对照组孔内壁附着大量与生物膜结合的结晶紫染料，其余两孔内仅有少量紫色。酶标仪定量结果表明，0.12、0.25mg/mL的CK均显著降低了(与对照组相比分别降低80％与86％)脓肿分枝杆菌的生物膜总生物量(图3c)。
实施例2：抑制结核分枝杆菌实验
一、材料和方法
(一)实验材料
1、菌株与药物
结核分枝杆菌减毒株H37Ra(ATCC 25177)购自中国上海晶诺生物公司，菌株相关操作均在生物安全二级实验室按照实验室生物安全通用要求(GB 19489-2008)完成。
药物与实施例1。
(二)实验方法
1、皂苷单体对结核分枝杆菌的抑菌活性测定
结合西洋参提取物组分鉴定结果以及文献中西洋参的有效成分，本次选取了5种人参皂苷，分别为人参皂苷Rb1、Rb2、Rk1、CK以及拟人参皂苷F11。为了研究该5种西洋参人参皂苷对结核分枝杆菌是否具有类似西洋参提取物的抑菌活性，进行了微孔板阿玛尔蓝法测定MIC。皂苷浓度依次是500-15.6μg/mL，对倍稀释(共6个浓度)，同时设置当归提取物组(浓度依次是50-1.56mg/mL，对倍稀释后共6个浓度)，生长对照与溶剂对照组等操作同实施例1实验方法。
2、统计分析
同实施例1的统计方法。
二、实验结果
1、皂苷单体对H37Ra的抑菌活性
在进行了西洋参粗提物抑制结核分枝杆菌及其生物膜的形成后，同样测试了5种可获得人参皂苷单体对标准菌株的体外抑菌以及杀菌活性。测定结果见图4，图4a显示人参皂苷CK、Rb1、Rb2及Rk1对H37Ra有一定的体外抑菌活性，而对照当归提取物(ASE)在200mg/mL时未展现对H37Ra的杀菌活性。根据荧光值定量计算可得：125-500μg/mL的皂苷CK能抑制该菌90％以上的生长；Rb1、Rb2及Rk1在500μg/mL时依然能达到90％以上的抑制率；而测试最高浓度500μg/mL的F11仅能抑制该菌50％的生长(图4b-f)；MBC结果显示CK以及Rk1在1MIC(即250μg/mL与500μg/mL)时能够杀死99.9％的标准脓肿分枝杆菌(表3)。
表3PQE及皂苷单体对标准结核分枝杆菌浮游菌的抑菌活性
Figure BDA0003709230100000071
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.人参皂苷CK在制备抑制脓肿分枝杆菌或/和结核分枝杆菌产品中的应用。
2.人参皂苷CK在抑制脓肿分枝杆菌或/和结核分枝杆菌中的应用。
3.人参皂苷CK在抑制脓肿分枝杆菌或/和结核分枝杆菌生物膜形成中的应用。
4.人参皂苷CK在制备预防和治疗脓肿分枝杆菌或/和结核分枝杆菌所致疾病的药物中的应用。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，人参皂苷CK来源于西洋参提取物的代谢物。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为抑菌剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑菌剂的活性成分为人参皂苷CK。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述人参皂苷CK的浓度不低于125 μg/mL。
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