CN103509842A

CN103509842A - 一种提高人参皂苷ck产量的制备方法

Info

Publication number: CN103509842A
Application number: CN201210224267.XA
Authority: CN
Inventors: 冯美卿; 张春燕; 周珮; 周伟; 叶丽; 史训龙; 周超群
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2012-06-30
Filing date: 2012-06-30
Publication date: 2014-01-15

Abstract

本发明属于生物医药技术领域。涉及一种提高人参皂苷CK产量的制备方法，具体涉及通过微生物转化代谢过程中的调控提高转化产物产量的提高人参皂苷CK产量的制备方法。本发明通过代谢调控提高底物浓度和转化产物的产量。对亲代菌株紫外诱变进行改造，并且在高浓度三七茎叶皂苷培养基中培养，定向筛选，得到耐受三七茎叶总皂苷1-6%的菌株。本发明方法通过菌种诱变和代谢调控，可显著提高底物浓度和转化物产量，最终转化率可达43.63%，人参皂苷Compound K的产量提高80%以上。本发明方法对微生物转化的工业应用有实际意义。

Description

一种提高人参皂苷CK产量的制备方法

技术领域：

本发明属于生物医药技术领域。涉及一种提高人参皂苷CK产量的制备方法，具体涉及通过微生物转化代谢过程中的调控提高转化产物产量的提高人参皂苷CK产量的制备方法。

背景技术：

我国传统的名贵中草药人参的药用历史悠久。现代医药学研究表明，从人参中分离出来的人参皂苷是人参的主要药效成分，具有广泛的药理活性，对多种疾病具有防治效果。研究显示，天然的人参皂苷中Rb1、Rg1、Re等含量较高，而Rd、Rh1、Rh2等含量较少，人参皂苷Compound K（CK）在天然中不存在，为人参皂苷在肠道内转化后发挥药理活性的产物。但是由于人参皂苷本身在植物中含量较低，转化产物所发挥的药理活性达不到临床应用的要求，因此，长期以来Compound K的制备方法一直是本领域的研究热点。

由于人参皂苷母核结构上3位和20位糖苷键的不平衡性——即中性条件下3位糖苷键容易断裂，酸或碱性条件下20位糖苷键易断裂，生物转化因其区域选择性和反应温和专一因而在制备稀有人参皂苷方面具有独特优势。本发明之前的研究（本实验室）已从野山参土壤中分离筛选得到了高效转化菌株Paecilomyces bainiersp.229（授权专利号：ZL20041008000.0），并选用廉价易得的二醇型三七茎叶总皂苷作为底物，通过发酵条件的优化，使转化率达到了72.9%，但是，其中尚存在底物浓度偏低、生产周期长的问题，因过量皂苷对微生物细胞生长不利，底物投料浓度仅为0.5%。微生物转化底物浓度低为制约其应用的重要因素，因此，本申请发明人拟采用提高底物浓度、对微生物转化过程进行代谢调控以显著提高转化产物的产量。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种提高人参皂苷CK产量的制备方法。

本发明方法中，通过代谢调控提高底物浓度和转化产物的产量；对亲代菌株 Paecilomyces bainier紫外和化学诱变剂联合诱变进行改造，并且在高浓度三七茎叶皂苷培养基中培养，进行定向筛选、得到耐受1-6%三七茎叶总皂苷的的菌株，最终转化率可达43.63%，是优化前（19.9%）的2.2倍；将优化条件应用于投料量为1.0%时，最终转化率达到61%，同样发酵体积可使人参皂苷Compound K的产量提高80%以上。

具体而言，本发明的提高人参皂苷CK产量的制备方法，其特征在于，其包括步骤：

1、对亲代菌株进行诱变改造

所述亲代菌株为从野山参生长土壤分离到的拟青霉菌Paecilomyces Bainier，转化底物为人参皂苷Rb1、Rd、Re、Rc。

本发明中，诱变方法采用紫外诱变、化学诱变、紫外诱变和化学诱变剂联合诱变；化学诱变剂为LiCl、硫酸二乙酯、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、亚硝基胍。紫外诱变时间0到10min，化学诱变剂浓度0-10mg/ml.

2，定向筛选、对诱变菌株采用耐高浓度底物进行定向筛选，获得耐受1-6%三七茎叶总皂苷的的菌株；

3、选择表面活性剂

本发明中，通过添加表面活性剂、抑制细胞壁、细胞膜合成的物质，改善诱变株通透性；本发明的实施例中选用Tween80、Tween40、Tween20、Triton X-100、Span60、SDS、氨苄青霉素或甘氨酸改善细胞通透性；本发明中优选表面活性剂Tween80；

所述的Tween80、Tween40、Tween20、Triton X-100、Span60浓度为1-6‰，氨苄青霉素浓度为100-500mg/L、甘氨酸浓度为0.1-1.0%，添加时间接种时、转化开始时和转化24h。

4、确定表面活性剂最佳加入时间

分别在接种时、投加底物时（即开始转化时）、转化后8h（即Rd达到最高值时）、转化后24h（即CK开始产生时）、转化后36h（即CK产生12h时）五个时间点加入2‰的Tween80

5、确定表面活性剂浓度

本发明中优选Tween80的最佳浓度为4‰

6、确定诱导剂浓度

本发明中，添加诱导剂为Rb1、Rd、Re、Rc，添加时间为转化菌培养24-48h，诱导剂浓度为1-5‰。

7、利用优化的代谢条件进行人参皂苷转化，

利用诱变株对人参皂苷进行转化，菌种接入培养瓶生长36-48h，接种入发酵瓶，同时添加1-6‰的吐温，培养12-24h之后，加入1-5‰的底物作诱导，继续生长24-36h，以1-2.5%投料，控制pH值为5.0，28℃，转化72h。

本发明的突出效果在于,通过对诱变株进行诱导剂的筛选、细胞通透性的改善等手段进行相关代谢调控，在底物浓度为1.5%的投料量下，最终转化率可达43.63%，是优化前（19.9%）的2.2倍；将优化条件应用于投料量为1.0%时，最终转化率达到61%，同样发酵体积可使人参皂苷Compound K的产量提高80%以上。

本发明方法通过菌种诱变和代谢调控，可显著提高底物浓度和转化物产量，对微生物转化的工业应用有实际意义。

附图说明：

图1：诱变株转化不同浓度底物的效果。

图2：不同时间转化Rb1生成各人参皂苷的量。

图3：不同时刻加入Tween80对CK产量的影响。

图4：不同浓度Tween80对CK产量的影响。

图5：不同诱导剂浓度对于CK产量的影响。

图6：不同时间添加诱导剂对CK产量的影响。

图7：发酵条件优化前后转化率的变化。

具体实施方式

实施例1亲代菌株的诱变

菌株：人参皂苷转化菌为Paecilomyces Bainiersp.229，筛选生长情况良好且CK转化率较高的菌株作为亲代菌株。

培养基：马铃薯培养基（马铃薯20%，葡萄糖2%配制成汤液），分装于10×150mm试管中，每管4ml，加入30mg/ml(3%)三七茎叶皂苷以及不同浓度LiCl，121℃，灭菌20min。

诱变：复壮的新鲜斜面用0.9%的生理盐水洗下孢子，制成10⁷个孢子/ml的孢子悬浮液，转移至直径9cm的平板中，平板里放入回形针作为搅拌子。紫外下分别照射0，2min，4min，6min和8min，取0.1ml紫外照射后的孢子悬浮液加入上述已灭菌的培养基中，28℃培养，观察并记录菌的生长情况。

表1菌株的生长情况

Figure 201210224267X100002DEST_PATH_IMAGE001

筛选：观察菌生长情况，将菌体生长旺盛的试管挑选出来，取0.1ml加入含培养基平板中，继续培养，挑取单菌落，对纯化后的菌株进行摇瓶筛选。

实施例2底物浓度的确定

诱变菌株在28℃、200r/min条件下，摇床培养48h之后，分别加入浓度为0.5%、1%、1.5%、2.0%、2.5%的底物，继续转化72h，检测菌体内CK的含量。结果如图1所示。

实施例3表面活性剂的选择

由于转化终产物在微生物体内不断积累会引起反馈抑制，也会对菌产生一定毒性，解决方式之一可通过添加表明活性剂来改善细胞膜的通透性，促进底物向胞内转移，产物向胞外转移，进而提高产率。选择Tween40，Tween80，Tween20，SDS，Span60和Triton X-100等低毒性的表面活性剂对细胞膜通透性的改善情况进行了考察。最终，选择最优的表面活性剂Tween80。

实施例4表面活性剂最佳加入时间的确定

表面活性剂加入的时间会直接影响效果，分别在接种时、投加底物时（即开始转化时）、转化后8h（即Rd达到最高值时）、转化后24h（即CK开始产生时）、转化后36h（即CK产生12h时）五个时间点加入2‰的Tween80,结果如图3所示。

Tween80最佳的添加时间为接种时，在转化8h时加入Tween80对于CK产量有明显提高。

实施例5表面活性剂最佳浓度的确定

在接种时，分别加入2‰、3‰、4‰、5‰的Tween80，另取一组在接种时和转化后8h各加入2‰的Tween80。结果如图4所示,Tween80的最佳浓度为4‰。且发现：在接种时加入4‰Tween80较在两个时间点（接种时和转化8h）分别加入2‰Tween80更为有效。

实施例6诱导剂的作用

在菌生长时添加底物对提高菌的产酶水平有促进作用，但添加诱导剂时有一个适宜的浓度，太低时诱导效果可能不明显，太高则可能对微生物的生长有负面影响，而在菌的不同生长时期进行诱导，所产生的效果也不同。研究结果显示用底物作为诱导剂，有助于底物的转化和CK产量的提高。

实施例7诱导剂最佳浓度的确定

在接种后12h，分别投入浓度为0.5‰、1‰、2‰、3‰、4‰的底物。结果如图5所示。

实施例8确定诱导剂最佳加入时间

分别在接种时、接种后12h、接种后24h、接种后36h投入1‰底物，结果如图6所示。

实施例9利用优化的代谢条件进行人参皂苷转化

结果如图7所示，底物浓度为1%时，转化率达61%，底物浓度为1.5%时，转化率为43.63%。以10L发酵体积计算,初始菌株三七总皂苷投料量为50g，转化后产CK为12.26g，诱变株三七总皂苷投料量100g和150g,CK产量可达20.52g和22.02g，分别提高67%和80%（三七总皂苷中，人参皂苷Rb1含量为60%）。

表2CK产量

Figure 201210224267X100002DEST_PATH_IMAGE002

结果表明，本发明通过菌种诱变和代谢调控，可显著提高底物浓度和转化物产量，对微生物转化的工业应用有实际意义。

Claims

1.一种提高人参皂苷CK产量的制备方法，其特征在于，通过对亲代菌株进行诱变改造、定向筛选、添加诱导剂以及改善细胞通透性的相关代谢调控，提高人参皂苷Compound K的产量；包括步骤：

1）对亲代菌株进行诱变改造；

2）对诱变菌株采用耐高浓度底物进行定向筛选，获得耐受1-6%三七茎叶总皂苷的的菌株；

3)选择表面活性剂；

通过添加表面活性剂、抑制细胞壁、细胞膜合成的物质，改善诱变株通透性；

4)确定表面活性剂最佳加入时间；

5)确定表面活性剂浓度；

6)确定诱导剂浓度；

7)利用优化的代谢条件进行人参皂苷转化。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲代菌株为从野山参生长土壤分离到的拟青霉菌Paecilomyces Bainier，转化底物为人参皂苷Rb1、Rd、Re、Rc。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱变方法采用紫外诱变、化学诱变或紫外诱变和化学诱变剂联合诱变；化学诱变剂为LiCl、硫酸二乙酯、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤或亚硝基胍；紫外诱变时间为0到10min，化学诱变剂浓度为0-10mg/ml。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂选自Tween80、Tween40、Tween20、Triton X-100、Span60、SDS、氨苄青霉素或甘氨酸。

5.按权利要求4所述的方法，其特征在于，所述择表面活性剂Tween80、Tween40、Tween20、Triton X-100、Span60的浓度为1-6‰，所述的氨苄青霉素浓度为100-500mg/L、甘氨酸浓度为0.1-1.0%，添加时间为接种时、转化开始时和转化24h。

6.按权利要求4所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂中2‰的Tween80添加时间为接种时、投加底物时、转化后8h、24h、36h加入。

7.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述添加的诱导剂为Rb1、Rd、Re或Rc，添加时间为转化菌培养24-48h，诱导剂浓度为1-5‰。