CN1508146A - 一种新型抗肿瘤人参皂苷 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新的人参皂苷，化合物名称为20－O－β－D－木糖(1→6)－β－D－葡萄糖－20(s)－原人参二醇[20－O－β－D－xylopyranosyl(1→6)－β－D－glucopyranosyl－20(S)－protopanaxadiol，简称Mx]，及含有Mx为活性成分的新抗肿瘤制剂。Mx及其制剂具有诱导肿瘤细胞分化、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长、逆转肿瘤多药耐药性、抑制肿瘤新生血管生成、抑制肿瘤的浸润和转移、增强机体免疫力和降低化疗药物毒副作用等抗肿瘤活性，开发潜力和应用价值很大。

Description

一种新型抗肿瘤人参皂苷

技术领域：

本发明涉及20-O-β-D-木糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(s)-原人参二醇[20-O-β-D-xylopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl 20(S)-protopanaxadiol，简称Mx]，特别以Mx和含有Mx为活性成分的新颖抗肿瘤制剂。Mx具有诱导肿瘤细胞分化、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长、逆转肿瘤多药耐药性、抑制肿瘤新生血管生成、抑制肿瘤的浸润和转移、增强机体免疫力和降低化疗药物毒副作用等抗肿瘤活性。

背景技术：

人参皂苷具有多种药效功能，如抗肿瘤和免疫调节、改善微循环、调节消化机能、安神、抗衰老、抗紧张、预防消化道溃疡、提高生命质量、增强记忆力和学习能力等。但天然人参皂苷几乎不能被肠道直接吸收入血，并且，药代动力学行为较差。

近来，先后发现多种由天然人参皂苷经生物转化而来的代谢产物如20-O-β-D-葡萄糖-20(S)-原人参二醇[20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol，简称C-K]，20-O-α-L-阿拉伯糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(S)-原人参二醇[20-O-α-L-arabinopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl20(S)-protopanaxadiol，简称C-Y]和20-O-α-L-阿拉伯糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(S)-原人参二醇[20-O-α-L-arabinofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl20(S)-protopanaxadiol，简称Mc]。它们分别被证明是相应天然人参皂苷的口服吸收形式。Hasegawa等研究发现C-K在抗肿瘤方面具有诱导肿瘤细胞分化、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长、抑制肿瘤诱导的新生血管形成、抗击肿瘤的浸润和转移等多种生物活性；另外，C-K具有良好的药代动力学行为且基本无毒或毒性很低，目前，在韩国已进入III期临床研究。源于天然人参皂苷Rb₂和Rc的代谢产物C-Y和Mc具有与C-K相似的药效活性。

由于天然人参或天然人参皂苷口服后几乎不直接吸收，口服后上述三种可吸收的代谢产物是通过人体肠道菌的转化而来。因机体的人参皂苷肠道菌代谢能力存在个体差异，因此，理论上，直接使用转化物可以避免吸收障碍，使临床上易于掌握有效剂量，。

Hasegawa将天然人参皂苷与肠道菌一起体外厌氧培养，从培养液中分离得到C-K，并申请了美国专利(5,919,770)。由于厌氧培养时，C-K不是唯一产物、C-K转化率率低，因此，分离纯化繁琐，后处理不易。此外，厌氧培养条件苛刻也使成本大大生高。有柚皮苷酶、橙皮苷酶水解制备C-K的方法，但该法有下列缺陷：水解时间长、酶的用量大，酶的来源不易，因此，不适于工业制备。

我们先前的研究开发了在工艺及成本上均有优势的C-K酶法制备方法(中国专利，申请号01133410.X)和微生物发酵方法(中国专利，申请号02132403.4)。两项技术发明较之肠道菌和柚皮苷酶、橙皮苷酶的制备技术有多种优势。利用上述技术，以三七茎叶中富含的人参皂苷Rb₃为原料，本发明的发明人发现了Mx这一具有抗肿瘤活性的新化合物，Mx具有与C-K相似的生物活性，而较之人参，三七及其茎叶在我国具有更加明显的资源优势，因此，可以预见本发明具有极大的开发和应用价值。

发明的技术内容：

本发明提供了具有如下结构式I的20-O-β-D-木糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(s)-原人参二醇[20-O-β-D-xylopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl-20(S)-proto-panaxadol]，以下简称Mx。

Mx的特性如下：

(1)结构式

                                 结构式I

(2)分子式：C₄₁H₇₀O₁₂

(3)熔点：℃

(4)旋光性：[α]_D ²⁰+°(C＝1.0，甲醇)

(5)IR(KBr)cm^-1：

(6)FAB-MS m/z：(M-H)

(7)¹³C-NMR(d₅-吡啶)    δppm：39.5(C-1)，28.3(C-2)，78.2(C-3)，39.5(C-4)，56.5(C-5)，18.8(C-6)，35.2(C-7)，40.2(C-8)，50.4(C-9)，37.4(C-10)，30.8(C-11)，70.3(C-12)，49.5(C-13)，51.5(C-14)，30.9(C-15)，26.7(C-16)，51.8(C-17)16.3(C-18)，16.1(C-19)，83.2(C-20)，22.4(C-21)，36.2(C-22)，23.2(C-23)，126.1(C-24)，131.0(C-25)，25.8(C-26)，17.9(C-27)，28.7(C-28)，16.4(C-29)，17.5(C-30)

20-吡喃葡萄糖基的¹³C-NMR(d₅-吡啶)δppm：97.8(C-1′)，74.9(C-2′)，78.9(C-3′)，71.6(C-4′)，76.9(C-5′)，69.0(C-6′)

6’-吡喃木糖基的¹³C-NMR(d₅-吡啶)δppm：105.0(C-1″)，74.3(C-2″)，77.4(C-3″)，70.7(C-4″)，66.0(C-5″)

(8)无臭、无色、针状结晶体(甲醇-水体系中结晶)

(9)易溶于甲醇、乙醇、正丁醇、异丙醇、正丙醇、吡啶、二甲亚砜。

Mx具有诱导肿瘤细胞分化、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长、逆转肿瘤多药耐药性、抑制肿瘤新生血管生成、抑制肿瘤的浸润和转移、增强机体免疫力和降低化疗药毒副等抗肿瘤活性，具极大的开发潜力。

本发明还提供了含有Mx为活性成分的新颖抗肿瘤制剂。

本发明所提供的新颖抗肿瘤制剂中，Mx的有效剂量为1-50mg/Kg/天。

本发明所提供的新颖抗肿瘤制剂中，Mx可与任何法定药用赋形剂和配合剂制成各种药用剂型的制剂。

本发明所提供的新颖抗肿瘤制剂中，以Mx为活性成分的制剂可单独使用，也可与目前市场上的任何化疗药(包括激素类、烷化剂类、铂类、抗代谢类、拓扑异构酶抑制剂类、抗微丝微管类、诱导分化类及其它)联合使用，或制成复方制剂使用。

本发明所提供的新颖抗肿瘤制剂中，制剂剂型可为口服、注射或局部用药剂型。

本发明所提供的新抗肿瘤制剂中，口服剂型可为片剂、粉剂、悬浊液、乳浊液、胶囊、颗粒剂、糖衣片、药丸、液体、醑剂、糖浆或柠檬水剂等。

本发明所提供的新颖抗肿瘤制剂中，注射剂型可为水剂、悬浊液或溶液等。

本发明所提供的新颖抗肿瘤制剂中，局部用药剂型可为软膏、固体、悬浊液、水剂、醑剂、粉剂、糊剂、栓剂、气溶胶、泥敷剂、涂抹剂、洗剂、灌肠剂或乳剂等。

本发明所提供的新颖抗肿瘤制剂中，赋形剂可以是下列中的一种或多种：(a)、口服剂型的粉状赋形剂如乳糖、结晶纤维素、淀粉、糊精、磷酸钙、碳酸钙、合成或天然的二氧化铝、干燥的氢氧化铝，硬脂酸镁、碳酸氢钠等；(b)、局部用药剂型的粉状赋形剂如氧化锌、滑石、淀粉、高陶土、硼酸盐粉末、硬脂酸锌、硬脂酸镁、碳酸镁、沉淀碳酸钙、碱式没食子酸铋和硫酸钾铝粉末生等；(c)、液体用赋形剂如水、甘油、丙二醇、甜味糖浆、乙醇、脂肪油、乙烯甘油、聚乙二醇、山梨醇；软膏用赋形剂，如混合脂肪，脂肪油、羊毛脂、凡士林、甘油、蜡、日本蜡、石蜡、硫酸石蜡、树脂、高级醇、塑料、乙二醇、水或表面活性剂(包括脂溶基、水溶基和悬浮基)等。

具体实施方式：

实施例1：Mx的制备

人参皂苷Rb₃(500mg)蜗牛酶(84mg)溶于磷酸-柠檬酸缓冲液(32mL，pH4.5，离子强度为0.001mol·L^-1，含10％的乙醇)中，40℃水浴中水解1天；离心反应液收集沉淀，用水将沉淀物制成悬浊液，用乙酸乙酯萃取(10mL×5)，合并乙酸乙酯液，减压除乙酸乙酯后获Mx(193mg)。

实施例2：片剂配方实例

Mx(30mg)与乳糖、结晶纤维素和1％硬脂酸镁的混合物均匀混合，经压片机制成每片为200mg的片剂。

实施例3：注射剂配方实例

无菌操作下，将Mx(15mg)和多乙氧基醚的溶液灌入小瓶，除水份后，获注射用制剂。

实施例4：抑制MCF-7和K562细胞生长的活性

a)、方法：以人乳腺癌MCF-7细胞株和人红自血病K562细胞株为实验用细胞株，取对数生长期细胞(2.5×10⁵/mL)接种在96孔板内，由高至低浓度加入药物溶液，对照组则加入等体积RPM1640培养液。药物作用48小时后，按MTT法求生长抑制率和IC₅₀：

生长抑制率(％)＝[1-实验组OD值/对照组OD值]×100％

  IC₅₀是生长抑制率为50％时的药物浓度。

b)、实验结果：如表1所示。

      表1.Mx对MCF-7和K562细胞生长的抑制作用

                           IC₅₀(μM)

                          MCF-7              K562

          ADM            1.4±0.1            2.6±0.2

          Mx             47±9               32±5

      C-K            41±9               27±7

      C-Y            90±14              50±8

      Mc             97±11              57±6

结果表明Mx对两种肿瘤细胞株具有生长抑制作用，IC₅₀分别为47μM和32μm。

实施例5：Mx对肿瘤细胞浸润渗透能力的影响

a)、方法：采用transwell浸润渗透方法，依Cancer Res.，47，3239，1987操作。transwell是一个插件，可插入标准24孔板中某一孔的上部。在transwell插件培养腔的底部有8μm大的孔径，由一滤膜隔断，在滤膜上用5μg的martigel模拟纤维粘连蛋白涂于表面，形成上下两培养腔室的屏障。HT1080人腺肉瘤细胞株，经Mx(1-1000μM)处理30分钟后置于transwell的培养腔(细胞数为每100μL  1×10⁵)内，上下均加入600μL含0.1％小牛血清的MEM培养液，4小时孵育后，取下24孔板，用乙醇固定孔内细胞，HE染色，光镜计数，获浸润渗透细胞数。将处理前后的细胞数进行比较，求渗透抑制率和ED₅₀。

渗透抑制率(％)＝[1-实验组渗过的细胞数/对照组渗过的细胞数]×100％

ED₅₀＝渗透抑制率为50％时的药物浓度。

b)、实验结果：如表2所示。

            表2.Mx对肿瘤细胞基底膜渗透能力的抑制

                         ED₅₀(μM)

                 对照

                 RGSD        4000

                 Mx          7.2

                 C-K         4.1

                 C-Y         35

                 Mc          52

结果表明：Mx较RGSD(Arg-Gly-Asp-Ser，已知具有抑制肿瘤转移活性的多肽)具有更强的抑制活性，在50％渗透抑制作用时的浓度(ED50)为7.2μM。

实施例6：逆转肿瘤多药耐药性

a)、方法：以人乳腺癌阿霉素耐药株MCF-7/ADM及其敏感株MCF-7/S人红白血病阿霉素耐药株K562/A及其敏感株K562/S为实验用细胞株(以敏感细胞株的IC₅₀为基数，耐药细胞株对阿霉素的耐药倍数MCF-7为30倍，K562为62倍)，用MTT法考察化合物在无毒剂量下化合物对阿霉素IC₅₀(阿霉素耐药株)影响，根据下列公式计算耐药倍数。

耐药倍数＝耐药细胞IC₅₀/敏感细胞IC₅₀；

b)、实验结果：如表3所示。

              表3.Mx对肿瘤多药耐药性的逆转作用

              浓度                    耐药倍数

                         (μM)    MCF-7/A      K562/A

          control                 30.1         62.5

          Verapamil       8       6.6          11.0

          Mx              6       13.3         33.7

          C-K             6       14.8         36.3

          C-Y             6       18.4         39.0

          Mc              6       16.4         37.8

          PPD             12      26.1         52.2

结果表明：Mx对两种多药耐药性肿瘤细胞株的逆转活性≥50％。

Claims (9)

1、一种具有如下结构式I的人参皂苷20-O-β-D-木糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(s)-原人参二醇[20-O-β-D-xylopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol，简称Mx]：

                         结构式I

2、按照权利要求1所述的化合物Mx，其特征在于：Mx具有诱导肿瘤细胞分化、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长、逆转肿瘤多药耐药性、抑制肿瘤新生血管生成、抑制肿瘤的浸润和转移、增强机体免疫力和降低化疗药物毒副作用等抗肿瘤活性。

3、一种抗肿瘤药物，其特征在于：以Mx为有效成分，剂量为1-50mg/Kg/天。

4、按照权利要求3所述抗肿瘤药物，其特征在于：所述的Mx与任何法定药用赋形剂和配合剂制备成各种药用剂型的制剂。

5、按照权利要求3所述抗肿瘤药物，其特征在于：所述的Mx与目前市场上的任何化疗药，包括激素类、烷化剂类、铂类、抗代谢类、拓扑异构酶抑制剂类、抗微丝微管类、诱导分化类及其它，制备成复方制剂。

6、按照权利要求4所述抗肿瘤药物，其特征在于：所述剂型为口服、注射或局部用药剂型中的任何一种。

7、按照权利要求6所述抗肿瘤药物，其特征在于：所述口服剂型包括片剂、粉剂、悬浊液、乳浊液、胶囊、颗粒剂、糖衣片、药丸、液体、醑剂、糖浆和柠檬水剂等。

8、按照权利要求6所述抗肿瘤药物，其特征在于：所述注射剂型包括水剂、悬浊液和溶液。

9、按照权利要求6所述抗肿瘤药物，其特征在于：所述局部用药剂型包括软膏、固体、悬浊液、水剂、醑剂、粉剂、糊剂、栓剂、气溶胶、泥敷剂、涂抹剂、洗剂、灌肠剂和乳剂等。