KR100654172B1

KR100654172B1 - 효소반응에 의한 진세노사이드 Ｍｃ 및 진세노사이드Ｍｃ-1의 제조방법

Info

Publication number: KR100654172B1
Application number: KR1020050045155A
Authority: KR
Inventors: 오진환; 황표하; 이은옥; 김은숙; 허율
Original assignee: 주식회사 비티진
Priority date: 2005-05-27
Filing date: 2005-05-27
Publication date: 2006-12-06
Also published as: KR20060122577A

Abstract

본 발명은 인삼에 다량 함유되어 있는 진세노사이드 Rc[20-O-[α-L-아라비노퓨라노실(1→6)-β-D-글루코피라노실]-3-O-[β-D-글루코피라노실(1→2)-β-D-글루코피라노실]-20(S)-프로토파낙사디올]로부터 효소반응에 의하여 간단한 방법으로 진세노사이드 Mc-1 [20-O-[α-L-아라비노퓨라노실(1→6)-β-D-글루코피라노실]-3-O-[β-D-글루코피라노실]-20(S)-프로토파낙사디올]과 Mc[20-O-[α-L-아라비노퓨라노실(1→6)-β-D-글루코피라노실]-20(S)-프로토파낙사디올]를 제조하는 방법에 관한 것이다.

효소반응, 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Mc, 진세노사이드 Mc-1

Description

효소반응에 의한 진세노사이드 Ｍｃ 및 진세노사이드 Ｍｃ-1의 제조방법{A preparation method of ginsenoside Mc and Mc-1}

도 1은 본 발명의 진세노사이드 Mc-1 및 Mc의 반응식을 나타낸 것이다.

본 발명은 인삼에 다량 함유되어 있는 진세노사이드 Rc[20-O-[α-L-아라비노퓨라노실(1→6)-β-D-글루코피라노실]-3-O-[β-D-글루코피라노실(1→2)-β-D-글루코피라노실]-20(S)-프로토파낙사디올]로부터 효소반응에 의하여 간단한 방법으로 진세노사이드 Mc-1 [20-O-[α-L-아라비노퓨라노실(1→6)-β-D-글루코피라노실]-3-O-[β-D-글루코피라노실]-20(S)-프로토파낙사디올] 및 진세노사이드 Mc[20-O-[α-L-아라비노퓨라노실(1→6)-β-D-글루코피라노실]-20(S)-프로토파낙사디올]를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 좀더 상세히는 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase), 펙티나제(pectinase), 셀룰라제(cellulase), 락타제(lactase) 또는 헤스퍼리디나제(hesperidinase) 중 1종 이상의 효소를 촉매로 하여 진세노사이드 Rc로부터 진세노사이드 Mc-1 및 Mc를 높은 수율로 제조하는 방법에 관한 것이 다.

진세노사이드 Mc-1이나 Mc는 주로 홍삼에 미량 함유되어 있는 진세노사이드로서, 진통작용, 코티코스테론 분비 촉진작용, 신장 사구체 비대 억제 작용, 간세포의 지질과산화 억제 작용, 골수세포, DNA, RNA, 단백질 및 지질 합성촉진작용 (大村裕等 The Ginseng Review,16, 68(1993); Dong et al.Natural Medicines 50(2),128(1996); Yamamoto M et al. Proc. of the 4th Int'lGinseng Symp, 13(1984); Oura H et al. Proc of the 5th Int'l Ginseng Symp, 1(1988); Can. J. Physiol. Pharmacol. 80: 1030-1033(2002)) 등의 기능이 있는 디올계열의 진제노사이드 Rc를 섭취했을 때 체내 대사물질로서 진세노사이드 Mc-1과 Mc이 생성된다.

생성된 진세노사이드 Mc-1과 Mc는 장관에서부터 혈중으로 흡수되고, 뇨 및 분변 중에 배설되는 것이 확인되었다. 즉, Mc-1과 Mc가 진세노사이드 Rc의 흡수 본체중 하나임이 입증된 것이다(Eun-Ah Bae. Biol. Pharm. Bull. 25, 743, 2002). 또한 진세노사이드 Mc-1과 Mc가 진세노사이드 Rc보다 더 향상된 약리 활성을 가질 것이라 예상되나 지금까지 진세노사이드 Mc-1과 Mc는 그 양이 너무나 미미해 다각도의 약리 활성적 연구가 시행되지 못하고 있다.

진세노사이드 Mc-1 및 Mc의 종래기술로 한국특허 제164266호는 프리보텔라오리스와 비피도박테리움 K-506, 박테리오드 HJ-15, 박테리오드 JY-6, 푸조박테리움 K-60 등과 같은 장내세균에 의한 대사산물을 분리정제하는 방법으로 진세노사이드 Mc를 제조하며, 이를 제암제로 사용하는 방법에 대하여 기재하고 있다.

그러나 장내 세균의 배양은 힘들고 오랜 시간이 걸리며, 수율이 낮고, 여러 가지 2차 대사산물이 생성된다는 점 때문에 고순도로 정제하는데 어려움이 있다. 예로서 진세노사이드 Rc 100mg을 장내세균과 반응시킨 후 대사산물로부터 진세노사이드 Mc 25mg(수율 27.8%)을 얻은 바 있다.

또한, 중국공개특허공보 제2144779.9호는 파낙사디올계 진세노사이드를 효소 가수분해하여 진세노사이드 Mc, C-Y, Mx를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 효소로는 글루코시다제(glucosidase)를 사용하였다. 상기 방법 또한 여러종류의 진세노사이드가 함께 제조되므로 각각을 분리정제하는 데 어려움이 따른다.

따라서, 진세노사이드 Mc-1과 Mc를 고순도, 고수율로 생산해 내는 기술을 개발하여 이들의 약리 활성적 연구가 가능하도록 하고, 더 나아가 의약품으로 개발을 할 수 있도록 대량생산을 위한 제조방법이 시급하다.

본 발명의 목적은 진세노사이드 Rc에 대해 높은 효소활성을 나타내는 효소를 선택하고 반응시킴으로써 진세노사이드 Mc-1 및 Mc를 손쉽게 대량 생산할 수 있는 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자는 아스퍼질러스 속 또는 페니실리움 속 미생물에서 효소를 분리하여 인삼에 다량 함유된 진세노사이드 Rc로부터 진세노 사이드 Mc-1 및 Mc를 제조하였으며, 진세노사이드 Mc-1 및 Mc의 수율이 각각 40%이상으로 확인되었다.

본 발명은 파낙사디올계 진세노사이드인 진세노사이드 Rc[20-O-[α-L-아라비노퓨라노실(1→6)-β-D-글루코피라노실]-3-O-[β-D-글루코피라노실(1→2)-β-D-글루코피라노실]-20(S)-프로토파낙사디올]를 알파-갈락토시다제(α-galactosidase), 펙티나제(pectinase), 셀룰라제(cellulase), 락타제(lactase) 또는 헤스퍼리디나제(hesperidinase) 중 선택된 1종 이상의 효소와 반응시키는 것을 특징으로 하는 효소반응에 의한 진세노사이드 Mc[20-O-[α-L-아라비노퓨라노실(1→6)-β-D-글루코피라노실]-20(S)-프로토파낙사디올] 및 진세노사이드 Mc-1[20-O-[α-L-아라비노퓨라노실(1→6)-β-D-글루코피라노실]-3-O-[β-D-글루코피라노실]-20(S)-프로토파낙사디올]의 제조방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 효소반응에 사용된 알파-갈락토시다제(α-galactosidase), 펙티나제(pectinase), 셀룰라제(cellulase), 락타제(lactase) 또는 헤스퍼리디나제(hesperidinase)의 효소가 피치아 속, 페니실리움 속 또는 아스퍼질러스 속 유래인 것을 특징으로 한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 효소반응의 반응조건이 반응온도 10~80℃, pH 2.0~8.0, 기질농도 0.001~10중량%, 효소농도 0.0001~10중량%, 반응시간 5~1500시간 인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제조방법은 진세노사이드 Rc를 반응기질로 하여 수용성 용매 또는 수용성 용매와 유기용매와의 혼합용매에 용해시켜 알파-갈락토시다제(α-galactosidase), 펙티나제(pectinase), 셀룰라제(cellulase), 락타제(lactase) 또는 헤스퍼리디나제(hesperidinase) 중 선택된 1종 또는 2종 이상과 효소반응시켜 진세노사이드 Mc와 Mc-1을 제조한다.

상기 수용성 용매로는 물, 초산, 인산, 시트레이트 또는 시트레이트-인산완충용액을 사용하며 pH는 2~8 범위로 조절하며, 유기용매로는 저급알코올, 아세톤, 아세토니트릴, 디옥산 또는 디메틸설폭사이드 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 제조방법으로 생산된 진세노사이드 Mc-1 및 Mc의 물리화학적인 성상은 다음과 같다. 표 1은 진세노사이드 Mc-1 및 Mc의 탄소스팩트럼을 나타낸 그래프이다.

생성물들의 물리화학적 성질

1) 진세노사이드 Mc-1

성상: 무색니들(colorless needle)

녹는점: 208-209℃

¹H-NMR(Pyridine) δ: 3.39(1H, dd, J=10.55.2Hz, H-3), 0.80(1H, d, J=11.8Hz, H-5), 3.93(1H, ddd-like, H-12), 5.32(1H, t, J=7.2Hz, H-24), 0.92(3H, s, Me-18), 0.89(3H, s, Me-19), 1.69(3H, s, Me-21), 1.67(3H, s, Me-26), 1.67(3H, s, Me-27), 1.21(3H, s, Me-28), 1.01(3H, s, Me-29), 0.99(3H, s, Me-30), 4.89(1H, d, J=7.8Hz H-1'-3-glu), 5.10(1H, d, J=7.8Hz H-1''-20-glu), 5.61(1H, J=1.8Hz, H-1'''-6''-Araf)

2) 진세노사이드 Mc

성상: 무색 니들(colorless needle)

녹는점: 180-183℃

¹H-NMR(d₅-Pyridine) δ: 3.39(1H, dd, J=10.5, 5.1Hz, H-3), 0.80(1H, d, J=11.1Hz, H-5), 3.93(1H, ddd-like, H-12), 5.32(1H, t, J=7.2Hz, H-24), 0.92(3H, s, Me-18), 0.89(3H, s, Me-19), 1.69(3H, s, Me-21), 1.68(3H, s, Me-26), 1.67(3H, s, Me-27), 1.21(3H, s, Me-28), 1.01(3H, s, Me-29), 0.99(3H, s, Me-30), 5.10(1H, d, J=7.8Hz H-1''-20-glu), 5.61(1H, J=1.7Hz, H-1'''-6-Araf).

carbon No.	Mc-1	Mc	carbon No.	Mc-1	Mc
Aglycone moiety			20-Glucopyranosyl moiety
C-1	39.0	39.5	C-1''	96.9	98.1
C-2	26.0	28.3	C-2''	74.2	75.1
C-3	89.5	78.2	C-3''	77.1	79.2
C-4	39.2	39.5	C-4''	70.8	72.2
C-5	56.4	56.5	C-5''	74.5	76.5
C-6	18.1	18.8	C-6''	67.5	68.5
C-7	34.7	35.2	6'-Arabiofuranosyl moiety
C-8	39.8	40.2	C-1'''	108.7	110.1
C-9	49.9	50.4	C-2'''	83.7	83.5
C-10	36.8	37.4	C-3'''	77.4	79.0
C-11	30.3	30.8	C-4'''	84.6	86.3
C-12	70.5	70.3	C-5'''	61.8	62.8
C-13	48.5	49.5	3-Glucopyranosyl moiety
C-14	51.2	51.5	C-1'	105.5
C-15	29.6	30.9	C-2'	77.7
C-16	26.1	26.7	C-3'	76.5
C-17	51.7	51.8	C-4'	70.6
C-18	15.5	16.3	C-5'	75.2
C-19	15.1	16.1	C-6'	61.6
C-20	83.7	83.2
C-21	21.3	22.4
C-22	35.6	36.2
C-23	22.8	23.2
C-24	124.9	126.1
C-25	131.1	131.0
C-26	24.7	25.8
C-27	16.8	17.9
C-28	27.3	28.7
C-29	15.6	16.4
C-30	16.2	17.5

(실시예 1)

진세노사이드 Rc 1g을 0.05M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시켜 전체를 100ml로 정용한 다음 여기에 아스퍼질러스 속에서 분리한 알파-갈락토시다제 0.2g을 첨가하여 50℃의 온도조건하에서 교반하면서 5일간 반응시켰다. 상기 반응물을 박층 크로마토그래피로 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면 반응을 종료한 다음 수포화 부탄올로 추출한 후 감압농축시켰다. 농축액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올-물=16:5:1)를 이용해 분리한 결과 진세노사이드 Mc-1 384mg 및 진세노사이드 Mc 315mg을 얻었다. 이때 각각의 수율은 진세노사이드 Mc-1 45.2%, 진세노사이드 Mc 45.1%였다.

(실시예 2)

진세노사이드 Rc 1g을 0.05M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시켜 전체를 100ml로 정용한 다음 여기에 아스퍼질러스 속에서 분리한 펙티나제 0.2g을 첨가하여 50℃의 온도조건하에서 교반하면서 5일간 반응시켰다. 상기 반응물은 박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면 반응을 종료하고 수포화 부탄올로 추출한 후 감압농축하였다. 농축액은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올-물=16:5:1)를 이용해 분리하여 진세노사이드 Mc-1 388mg을, 진세노사이드Mc 310mg을 얻었다. 이때 각각의 수율은 45.6%, 44.3%였다.

(실시예 3)

진세노사이드 Rc 1g을 0.05M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시켜 전체를 100ml로 정용한 다음 여기에 페니실리움속에서 분리한 셀룰라제 0.2g을 첨가하여 50℃의 온도 조건하에서 교반하면서 5일간 반응시켰다. 상기 반응물을 박층 크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면 반응을 종료한 다음 수포화 부탄올로 추출하고 감압농축시켰다. 농축액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올-물=16:5:1)를 이용해 분리한 결과 진세노사이드 Mc-1 380mg 및 진세노사이드 Mc 320mg을 얻었다. 이때 각각의 수율은 44.7%, 45.8%였다.

(실시예 4)

진세노사이드 Rc 1g을 0.05M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시켜 전체를 100ml로 정용한 다음 여기에 아스퍼질러스속에서 분리한 락타제 0.2g을 첨가하여 50℃의 온도 조건하에서 교반하면서 5일간 반응시켰다. 상기 반응물을 박층 크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면 반응을 종료한 다음 수포화 부탄올로 추출하고 감압농축하였다. 농축액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올-물=16:5:1)를 이용해 분리한 결과 진세노사이드 Mc-1 386mg와 진세노사이드 Mc 317mg을 수둑하였다. 이때 각각의 수율은 45.4%, 45.3%였다.

(실시예 5)

진세노사이드 Rc 1g을 0.05M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시켜 전체를 100ml로 정용한 다음 여기에 아스퍼질러스속에서 분리한 헤스퍼리디나제 0.2g을 첨가하여 50℃의 온도조건하에서 교반하면서 5일간 반응시켰다. 상기 반응물은 박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면 반응을 종료하고 수포화 부탄올로 추출한 후 감압농축하였다. 상기 농축액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올-물=16:5:1)를 이용해 분리한 결과 진세노사이드 Mc-1 386mg과 진세노사이드 Mc 317mg을 수득하였다. 이때 각각의 수율은 45.4%, 45.3%였다.

본 발명에 의한 제조방법은 인삼에 다량으로 함유되어 있는 파낙사디올(panaxadiol)계 진세노사이드인 Rc로부터 효소를 이용하여 당을 가수분해시키는 간단한 반응으로 40%이상의 수율로 진세노사이드 Mc-1 및 진세노사이드 Mc를 대량 생산하여 제공할 수 있다.

Claims

파낙사디올(panaxadiol)계 진세노사이드인 진세노사이드 Rc를 알파-갈락토시다제(α-galactosidase), 펙티나제(pectinase) 또는 셀룰라제(cellulase) 중 선택된 1종 이상의 효소와 반응시키는 것을 특징으로 하는 효소반응에 의한 진세노사이드 Mc 및 진세노사이드 Mc-1의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 효소는 피치아 속, 페니실리움 속 또는 아스퍼질러스 속 유래인 것을 특징으로 하는 효소반응에 의한 진세노사이드 Mc 및 진세노사이드Mc-1의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 효소반응의 반응조건은 반응온도 20~55℃, pH 2.0~8.0, 기질농도 0.001~10중량%, 효소농도 0.0001~10중량%, 반응시간 5~1500시간인 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Mc 및 진세노사이드 Mc-1의 제조방법.