CN102093452B

CN102093452B - 氢化型人参皂苷苷元及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN102093452B
Application number: CN2011100282038A
Authority: CN
Inventors: 孙妙囡; 孙德军
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-01-26
Filing date: 2011-01-26
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2031-01-26
Also published as: CN102093452A

Abstract

本发明公开了氢化型人参皂苷苷元及其制备方法与应用。本发明所提供的氢化型人参皂苷苷元，其结构式如式I所示，其中R表示氢或羟基。本发明所提供的氢化型人参皂苷苷元DDA和DTA均具有抑制肿瘤生长和增强机体免疫力的作用，极具开发潜力。

Description

氢化型人参皂苷苷元及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及氢化型人参皂苷苷元及其制备方法与应用。

背景技术

人参及其同属植物的抗肿瘤作用始于上世纪80年代，Kikuchi发现红参的提取物能显著抑制肿瘤细胞的增殖，延长荷瘤小鼠的生存期。此后，在人参中先后发现人参皂苷Rg3、Rg1、Rh1、Rh2等抗肿瘤成分，这些成分中二醇型抗肿瘤活性＞三醇型，相同类型皂苷的苷元＞单糖苷型＞二糖苷型。

天然人参皂苷较难吸收，但由天然皂苷转化而来的低极性皂苷、甙元或两者的衍生物是天然人参皂苷发挥其药效的原形。近年来，低极性皂苷及其衍生物的抗肿瘤研究非常活跃，已发现它们在具有多种抗肿瘤作用的同时，基本无毒副作用。

长谷川秀夫(日本公开特许8-291194)报道的制备方法为：酸水解天然或3位羟基游离的人参皂苷，水解产物经常规和色谱分离后仅获得Δ²⁰⁽²²⁾-PPD和Δ²⁰⁽²²⁾-PPT单品。酸水解人参皂苷的主要产物为侧链环化的人参二醇和人参三醇，因而，该专利所提供的制备Δ²⁰⁽²²⁾-PPD和Δ²⁰⁽²²⁾-PPT方法定向转化率低，产物收率低、分离纯化难度高，不适应工业生产。

中国专利CN1249076C报道了新的化合物：3β，12β-二羟-20(21)，24(25)-二烯-达玛烷[dammar-3β，12β-dihydroxyl-20(21)，24(25)-diene，简称Δ²⁰⁽²¹⁾-PPD]和3β，6α，12β-三羟-达玛烷[dammar-3β，6α，12β-trihydroxyl-20(21)，24(25)-diene，简称Δ²⁰⁽²¹⁾-PPT]。Δ²⁰⁽²¹⁾-PPD和Δ²⁰⁽²¹⁾-PPT分别是Δ²⁰⁽²²⁾-PPD和Δ²⁰⁽²²⁾-PPT构型异构体，具有Δ²⁰⁽²²⁾-PPD和Δ²⁰⁽²²⁾-PPT类似的生物活性，生产制备方便，可实现工业批量制备，能有效解决Δ²⁰⁽²²⁾-PPD和Δ²⁰⁽²²⁾-PPT的供给短缺的矛盾。但该专利由于含有二烯键，结构不稳定，生物利用度较差，其抗肿瘤效果仍有很大提高余地。

发明内容

本发明的一个目的是提供氢化型人参皂苷苷元。

本发明所提供的氢化型人参皂苷苷元，其结构式如式I所示：

式I

其中R表示氢或羟基。

本发明的另一个目的是提供所述化合物的制备方法。

本发明所提供的所述化合物的制备方法包括如下步骤：

(1)将人参破碎，加入有机溶剂i进行回流提取，取有机相，去除有机溶剂i，即得到人参总皂苷；

(2)将步骤(1)得到的人参总皂苷用有机溶剂ii溶解，得到皂苷溶液；向所述皂苷溶液中加入有机溶剂ii的碱溶液进行反应，进行第一次静置，离心后收集沉淀；用水将所述沉淀制成悬浊液，向所述悬浊液中加入有机溶剂ii的碱溶液进行反应，进行第二次静置，分别收集上清和沉淀；将所述上清蒸干后即得到人参三醇型皂苷，将所述沉淀干燥后即得到人参二醇型皂苷；

(3)分别向步骤(2)得到的人参三醇型皂苷和人参二醇型皂苷中加入有机溶剂iii进行热解反应，分别得到反应产物I和反应产物II；用水分别将反应产物I和反应产物II制成悬浊液I和悬浊液II，进行萃取i，分别得到20，24位双键型三醇型人参皂苷和20，24位双键型二醇型人参皂苷；

(4)将步骤(3)得到的20，24位双键型三醇型人参皂苷和20，24位双键型二醇型人参皂苷分别进行氢化反应，分别得到氢化后的产物I和氢化后的产物II；

(5)分别将步骤(4)得到的氢化后的产物I和氢化后的产物II与酶溶于酸水溶液中，进行水解反应，分别得到反应液I和反应液II，分别离心反应液I和反应液II，分别收集沉淀I和沉淀II，用水分别将所述沉淀I和沉淀II制成悬浊液I和悬浊液II，进行萃取ii，均取有机相，由悬浊液I萃取得到的有机相即为权利要求1所述化合物，其中R表示羟基；由悬浊液II萃取得到的有机相即为权利要求1所述的化合物，其中R表示氢；所述酶为葡聚糖苷酶和/或葡萄糖苷酶和/或蜗牛酶。

所述步骤(1)中，所述破碎为破碎成过40目筛的小块；所述人参与所述有机溶剂i的质量比为1∶10；所述回流提取的次数为3次，每次所述回流提取的时间为1小时，每次所述回流提取的温度为80℃；

所述步骤(2)中，所述皂苷溶液的质量百分比浓度为10％；所述皂苷溶液与所述有机溶剂ii的碱溶液的体积比为1∶1；所述第一次静置的时间为24h，所述第一次静置的温度为25℃；所述第二次静置的时间为12h，所述第二次静置的温度为25℃；

所述步骤(3)中，所述人参三醇型皂苷与所述有机溶剂iii的质量比为5∶1；所述人参二醇型皂苷与所述有机溶剂iii的质量比为5∶1；所述热解反应的温度为120℃；所述热解反应的时间为5小时；

所述步骤(4)中，所述氢化反应包括如下a)或b)或c)所述的步骤：

a)将步骤(3)得到的20，24位双键型三醇型人参皂苷和20，24位双键型二醇型人参皂苷分别用有机溶剂ii溶解，分别得到溶解液I和溶解液II，分别向溶解液I和溶解液II加入催化剂i，通入氢气，进行第一步氢化反应，去除催化剂i，分别得到氢化反应液I和氢化反应液II，蒸干后分别得到干燥物I和干燥物II；分别向干燥物I和干燥物II中加入有机溶剂ii溶解，加入催化剂ii，通入氢气，进行第二步氢化反应，去除有机溶剂ii和催化剂ii，分别得到氢化后的提取物I和氢化后的提取物II；

b)将步骤(3)得到的20，24位双键型三醇型人参皂苷和20，24位双键型二醇型人参皂苷分别用有机溶剂ii溶解，分别得到溶解液I和溶解液II，分别向溶解液I和溶解液II加入催化剂i，通入氢气，进行氢化反应A，去除有机溶剂ii和催化剂i，分别得到氢化后的提取物I和氢化后的提取物II；

c)将步骤(3)得到的20，24位双键型三醇型人参皂苷和20，24位双键型二醇型人参皂苷分别用有机溶剂ii溶解，分别得到溶解液I和溶解液II，分别向溶解液I和溶解液II加入催化剂ii，通入氢气，进行氢化反应B，去除有机溶剂ii和催化剂ii，分别得到氢化后的提取物I和氢化后的提取物II；

所述步骤(5)中，所述酸水溶液为乙酸水溶液；所述水解反应的温度为15℃-100℃或15℃或40℃或100℃，时间为2小时-24小时或2小时或12小时或24小时；所述水解反应体系的pH值为2-6或2或4.5或6。

所述步骤(1)中，所述有机溶剂i为体积百分比为70％的乙醇水溶液；

所述步骤(2)中，所述有机溶剂ii为体积百分比为95％的乙醇水溶液；所述有机溶剂ii的碱溶液为含有NaOH的乙醇溶液；所述含有NaOH的乙醇溶液是由NaOH水溶液和乙醇水溶液混合制成；所述NaOH水溶液与所述乙醇水溶液的体积比为3∶200；所述NaOH水溶液的浓度为11mol/L；所述乙醇水溶液为体积百分比为95％的乙醇水溶液；

所述步骤(3)中，所述有机溶剂iii为体积百分比为45％的丙二酸水溶液；所述萃取i是使用二氯甲烷进行的；

所述步骤(4)中，所述溶解的温度为35℃；所述催化剂i为雷尼镍；所述催化剂ii为钯/碳；所述第一步氢化反应或所述氢化反应A的温度为25℃，时间为3小时；所述第二步氢化反应或所述氢化反应B的温度为25℃，时间为3小时；

所述步骤(5)中，所述酶的用量为10U/g氢化后的产物I或10U/g氢化后的产物II；所述乙酸水溶液的浓度为0.1mol/L；所述萃取ii是使用乙酸乙酯进行的。

本发明的又一个目的是提供用于抗肿瘤或增强机体免疫力的药物。

本发明所提供的用于抗肿瘤或增强机体免疫力的药物，其活性成分为如下1)、2)或3)所示：

1)权利要求1所述的化合物，其中R为氢；

2)权利要求1所述的化合物，其中R为羟基；

3)1)所示化合物和2)所示化合物的混合物。

所述药物包括药学上可接受的载体。

所述抗肿瘤为抑制肿瘤细胞的生长；

所述肿瘤为肺腺癌、红白血病、肉瘤和肝癌；

所述肿瘤细胞为人肺腺癌A549细胞株、人红白血病K562细胞株、小鼠肉瘤S180细胞株和小鼠肝癌H22细胞株。

所述化合物在制备抗肿瘤或增强机体免疫力的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

所述抗肿瘤为抑制肿瘤细胞的生长；

所述抑制肿瘤细胞的生长为抑制肿瘤的瘤重和/或抑制肿瘤细胞的数目；

所述增强机体免疫力为增强机体内吞噬细胞的吞噬能力。

所述肿瘤为肺腺癌、红白血病、肉瘤和肝癌；

所述肿瘤细胞为人肺腺癌A549细胞株、人红白血病K562细胞株、小鼠肉瘤S 180细胞株和小鼠肝癌H22细胞株。

本发明所提供的抗肿瘤的药物组合物中，以DDA和DTA为活性成分的制剂可单独使用，也可与目前市场上的放疗和化疗药物联合使用，或制备成复方制剂使用。

本发明所提供的氢化型人参皂苷苷元DDA和DTA与任何法定药用配合剂和赋形剂制成各种药用剂型的制剂。

本发明所提供的抗肿瘤的药物组合物中，制剂剂型可为口服、注射或局部用药剂型。

本发明所提供的氢化型人参皂苷苷元DDA和DTA可分别使用，也可联用使用，其总有效剂量为0.1mg-15mg/Kg体重/天。

本发明所提供的氢化型人参皂苷苷元DDA和DTA均具有抑制肿瘤生长和增强机体免疫力的作用，极具开发潜力。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、氢化型人参皂苷苷元I(3β，12β--达玛烷[dammar-3β，12β-dihydroxyl-alkane，简称-DDA)的制备

方法I

一、制备方法

氢化型人参皂苷苷元I(3β，12β--达玛烷[dammar-3β，12β-dihydroxyl-alkane，简称-DDA)的制备方法，包括如下步骤：

(1)取人参(Panax ginseng C.A.Mey)(购于长春市参茸公司)500g，破碎成过40目筛的小块，加入5000g的70％乙醇水溶液(体积百分比)在80℃回流提取1小时，重复3次，回收乙醇，得人参总皂苷。

(2)称取10g步骤(1)得到的人参总皂苷，加入100g 95％乙醇水溶液(体积百分比)，充分溶解，得到质量百分比浓度为10％的皂苷溶液。按照体积比为1∶1的比例将含NaOH的乙醇溶液(取11mol/L的NaOH溶液1.5ml，加入到100ml 95％乙醇(体积百分比)中，充分混匀，即得到含NaOH的乙醇溶液)缓慢滴加到皂苷溶液中，在25℃下静置24h。3800rpm离心15分钟。收集沉淀，放入烧杯中，加入80℃纯水10ml，在70℃搅拌15分钟，得到悬浊液，向悬浊液中缓慢滴加上述含NaOH的乙醇溶液，边滴加边搅拌，直至出现大量沉淀，在25℃下静置12h，收集沉淀，105℃真空干燥，即得到人参二醇型皂苷。

(3)取步骤(2)得到的人参二醇型皂苷5g，加入1g 45％丙二酸水溶液(体积百分比)，浸湿混匀，置于高压锅中，120℃热解5小时，得到反应产物I。向反应产物I中加入5ml水，形成悬浊液，用二氯甲烷萃取3次。萃取后取水相，减压回收二氯甲烷，水相中加入30％乙醇250ml，树脂柱吸附，30％乙醇洗去杂质，90％乙醇洗脱。减压回收乙醇至干，即得到20，24位双键型二醇型人参皂苷。

(4)于三口瓶中加入5g步骤(3)得到的20，24位双键型二醇型人参皂苷，加入100ml95％乙醇水溶液(体积百分比)，加热至35℃，搅拌至全部溶解(操作时应在广口小容器中溶解)，加入催化剂雷尼镍(Raney-Ni，25％)(购自长春金泰试剂有限公司)，通入氢气，在25℃下反应3小时，过滤收集催化剂Raney-Ni(催化剂Raney-Ni用酒精覆盖保存)，即得到氢化反应液，蒸干后得到干燥物，向干燥物中加入100ml 95％乙醇，加热至35℃，搅拌至全部溶解(操作时应在广口小容器中溶解)，加入催化剂钯/碳(Pd/C)(购自长春金泰试剂有限公司)，赶走空气，通入氢气，在25℃下进行氢化反应3小时，使烯键还原为烷键，过滤反应后的反应液，回收催化剂Pd/C，减压回收正丁醇，去除乙醇和催化剂钯/碳后即得到氢化后的产物。

(5)将步骤(4)得到的氢化后的产物与葡聚糖苷酶溶于0.1mol/L的乙酸水溶液中(pH 4.5)，葡聚糖苷酶的用量为10U/g氢化后的产物；在40℃水浴中水解24h(水解反应体系的pH值为4.5)，得到反应液；离心反应液、收集沉淀，用水将沉淀物制成悬浊液(水与沉淀物的质量比为10∶1)，乙酸乙酯萃取悬浊液3次，合并3次的乙酸乙酯液，取有机相，减压除乙酸乙酯后，得到反应产物。

二、鉴定

DDA化合物测定的结构表征数据结果如下：

¹³C NMR(300MHz，CDCl3)：

137.2(C-1)，131.3(C-2)，84.5(C-3)，80.3(C-4)，76.8(C-5)，62.6(C-6)，60.1(C-7)，57.2(C-8)，56.6(C-9)，53.8(C-10)，46.2(C-11)，44.9(C-12)，45.1(C-13)，43.3(C-14)，40.1(C-15)，40.1(C-16)，37.4(C-17)，37.3(C-18)，34.3(C-19)，33.5(C-20)，.521(C-21)，33.5(C-22)，33.8(C-23)，33.8(C-24)，34.3(C-25)，23.7(C-26)，23.4(C-27)，23.2(C-28)，21.8(C-29)，21.5(C-30)。

DDA的特性如下：

(1)结构式为如下式II所示：

(2)分子式：C₃₀H₅₄O₂；

式II

化学名称：3β，12β--达玛烷[dammar-3β，12β-dihydroxyl-alkane；

(3)无臭、无色、针状结晶体；

(4)易溶于甲醇、乙醇、正丁醇、异丙醇、正丙醇、吡啶、二甲亚砜、乙酸乙酯、乙醚、和丙酮；可溶于氯仿、氯化甲烷、苯、己烷和石油醚。

方法II

一、制备方法

(1)与方法I中步骤(1)相同。

(2)与方法I中步骤(2)相同。

(3)与方法I中步骤(3)相同。

(4)于三口瓶中加入5g步骤(3)得到的20，24位双键型二醇型人参皂苷，加入100ml95％乙醇水溶液(体积百分比)，加热至35℃，搅拌至全部溶解(操作时应在广口小容器中溶解)，加入催化剂雷尼镍(Raney-Ni，25％)(购自长春金泰试剂有限公司)，通入氢气，在25℃下反应3小时，使烯键还原为烷键，过滤反应后的反应液，回收催化剂雷尼镍，减压回收正丁醇，去除乙醇和催化剂雷尼镍后即得到氢化后的产物。

(5)除以下方法外，其余方法均与方法I中步骤(5)相同：将步骤(4)得到的氢化后的产物与葡萄糖苷酶溶于0.1mol/L的乙酸水溶液(pH值为2)中，葡萄糖苷酶的用量为1U/200g氢化后的产物；在15℃水浴中水解2小时(水解反应体系的pH值为2)，得到反应液。

二、鉴定

鉴定结果与方法I无显著差异。

方法III

一、制备方法

(1)与方法I中步骤(1)相同。

(2)与方法I中步骤(2)相同。

(3)与方法I中步骤(3)相同。

(4)于三口瓶中加入5g步骤(3)得到的20，24位双键型二醇型人参皂苷，加入100ml95％乙醇水溶液(体积百分比)，加热至35℃，搅拌至全部溶解(操作时应在广口小容器中溶解)，加入催化剂钯/碳(Pd/C)(购自长春金泰试剂有限公司)，通入氢气，在25℃下反应3小时，使烯键还原为烷键，过滤反应后的反应液，回收催化剂Pd/C，减压回收正丁醇，去除乙醇和催化剂Pd/C后即得到氢化后的产物。

(5)除以下方法外，其余方法均与方法I中步骤(5)相同：将步骤(4)得到的氢化后的产物与蜗牛酶溶于0.1mol/L的乙酸水溶液(pH值为6)中，蜗牛酶的用量为1U/200g氢化后的产物；在100℃水浴中水解12小时(水解反应体系的pH值为6)，得到反应液。

二、鉴定

鉴定结果与方法I无显著差异。

实施例2、氢化型人参皂苷苷元II(3β，6α，12β-三羟-达玛烷[dammar-3β，6α，12β-trihydroxyl-alkane，简称-DTA)的制备

方法I

一、制备方法

氢化型人参皂苷苷元I(3β，6α，12β-三羟-达玛烷[dammar-3β，6α，12β-trihydroxyl-alkane，简称-DTA)的制备方法，包括如下步骤：

(2)称取10g步骤(1)得到的人参总皂苷，加入100g 95％乙醇水溶液(体积百分比)，充分溶解，得到质量百分比浓度为10％的皂苷溶液。按照体积比为1∶1的比例将含NaOH的乙醇溶液(取11mol/L的NaOH溶液1.5ml，加入到100ml 95％乙醇(体积百分比)中，充分混匀，即得到含NaOH的乙醇溶液)缓慢滴加到皂苷溶液中，在25℃下静置24h。3800rpm离心15分钟。收集沉淀，放入烧杯中，加入80℃纯水10ml，在70℃搅拌15分钟，得到悬浊液，向悬浊液中缓慢滴加上述含NaOH的乙醇溶液，边滴加边搅拌，直至出现大量沉淀，在25℃下静置12h，收集上清液，将上清液倒入烧杯中，蒸干，即得到人参三醇型皂苷。

(3)取步骤(2)得到的人参三醇型皂苷5g，加入1g 45％丙二酸水溶液(体积百分比)，浸湿混匀，置于高压锅中，120℃热解5小时，得到反应产物I。向反应产物I中加入5ml水，形成悬浊液，用二氯甲烷萃取3次。萃取后取水相，减压回收二氯甲烷，水相中加入30％乙醇250ml，树脂柱吸附，30％乙醇洗去杂质，90％乙醇洗脱。减压回收乙醇至干，即得到20，24位双键型三醇型人参皂苷。

(4)于三口瓶中加入5g步骤(3)得到的20，24位双键型三醇型人参皂苷，加入100ml95％乙醇水溶液(体积百分比)，加热至35℃，搅拌至全部溶解(操作时应在广口小容器中溶解)，加入催化剂雷尼镍(Raney-Ni，25％)(购自长春金泰试剂有限公司)，通入氢气，在25℃下反应3小时，过滤收集催化剂Raney-Ni(催化剂Raney-Ni用酒精覆盖保存)，即得到氢化反应液，蒸干后得到干燥物，向干燥物中加入100ml 95％乙醇，加热至35℃，搅拌至全部溶解(操作时应在广口小容器中溶解)，加入催化剂钯/碳(Pd/C)(购自长春金泰试剂有限公司)，赶走空气，通入氢气，在25℃下进行氢化反应3小时，使烯键还原为烷键，过滤反应后的反应液，回收催化剂Pd/C，减压回收正丁醇，去除乙醇和催化剂钯/碳后即得到氢化后的产物。

(5)将步骤(4)得到的氢化后的产物与葡聚糖苷酶溶于0.1mol/L的乙酸水溶液中(pH 4.5)，葡聚糖苷酶的用量为1U/200g氢化后的产物；在40℃水浴中水解24h(水解反应体系的pH值为4.5)，得到反应液；离心反应液、收集沉淀，用水将沉淀物制成悬浊液(水与沉淀物的质量比为10∶1)，乙酸乙酯萃取悬浊液3次，合并3次的乙酸乙酯液，取有机相，减压除乙酸乙酯后，得到反应产物。

方法II

一、制备方法

(1)与方法I中步骤(1)相同。

(2)与方法I中步骤(2)相同。

(3)与方法I中步骤(3)相同。

(4)于三口瓶中加入5g步骤(3)得到的20，24位双键型三醇型人参皂苷，加入100ml95％乙醇水溶液(体积百分比)，加热至35℃，搅拌至全部溶解(操作时应在广口小容器中溶解)，加入催化剂雷尼镍(Raney-Ni，25％)(购自长春金泰试剂有限公司)，通入氢气，在25℃下反应3小时，使烯键还原为烷键，过滤反应后的反应液，回收催化剂雷尼镍，减压回收正丁醇，去除乙醇和催化剂雷尼镍后即得到氢化后的产物。

二、鉴定

鉴定结果与方法I无显著差异。

方法III

一、制备方法

(1)与方法I中步骤(1)相同。

(2)与方法I中步骤(2)相同。

(3)与方法I中步骤(3)相同。

(4)于三口瓶中加入5g步骤(3)得到的20，24位双键型三醇型人参皂苷，加入100ml95％乙醇水溶液(体积百分比)，加热至35℃，搅拌至全部溶解(操作时应在广口小容器中溶解)，加入催化剂钯/碳(Pd/C)(购自长春金泰试剂有限公司)，通入氢气，在25℃下反应3小时，使烯键还原为烷键，过滤反应后的反应液，回收催化剂Pd/C，减压回收正丁醇，去除乙醇和催化剂Pd/C后即得到氢化后的产物。

二、鉴定

DTA化合物测定的结构表征数据结果如下：

¹³C NMR(300MHz，CDCl₃)：

138.2(C-1)，131.2(C-2)，84.5(C-3)，80.4(C-4)，77.5(C-5)，74.5(C-6)，67.1(C-7)，58.4(C-8)，57.8(C-9)，54.9(C-10)，53.6(C-11)，53.4(C-12)，46.2(C-13)，45.5(C-14)，45.3(C-15)，45.6(C-16)，40.7(C-17)，37.3(C-18)，37.3(C-19)，37.2(C-20)，.33.5(C-21)，33.7(C-22)，33.8(C-23)，33.8(C-24)，37.5(C-25)，23.9(C-26)，23.6(C-27)，23.9(C-28)，23.8(C-29)，21.7(C-30)

DTA的特性如下：

(1)结构式为如下式III所示：

式III

(2)分子式：C₃₀H₅₄O₃；

化学名称：3β，6α，12β-三羟-达玛烷[dammar-3β，6α，12β-trihydroxyl-alkane；

(3)无臭、无色、针状结晶体；

(4)易溶于甲醇、乙醇、正丁醇、异丙醇、正丙醇、吡啶、二甲亚砜、乙酸乙酯、乙醚、及丙酮；可溶于氯仿、氯化甲烷、苯、己烷及石油醚。

实施例3、氢化型人参皂苷苷元用于抑制A549和K562细胞生长的活性。

一、方法

以人肺腺癌A549细胞株(购自吉林省肿瘤研究所)和人红白血病K562细胞株(购自吉林省肿瘤研究所)为实验用细胞株，分别取DMEM培养液培养的肺腺癌A549细胞株和人红白血病K562细胞株的对数生长期细胞(2.0×10⁵/mL)100μl，接种在96孔板内，在DMEM培养液中，37℃、5％CO₂培养24h。分别将DDA和DTA溶于DMEM培养液，分别配制成六种浓度20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml的DDA药物溶液和DTA药物溶液，用前超声波混匀；分别加入三组溶液：A组：10μl上述六种不同浓度的DDA药物溶液；B组：10μl上述六种不同浓度的DTA药物溶液；C组：5μl上述六种不同浓度的DDA药物溶液和5μl上述六种不同浓度的DTA药物溶液。分别得到三组药物溶液：a组：每孔中DDA的浓度分别为2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml；b组：每孔中DTA的浓度分别为2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml；c组：每孔中DDA和DTA的浓度分别为1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml。

分别得到以下实验组：A549细胞DDA组、K562细胞DDA组；A549细胞DTA组和K562细胞DTA组；A549细胞DDA+DTA组、K562细胞DDA+DTA组。

同时以加入Rh2(吉林省宏久生物科技有限公司)药物溶液作为阳性对照，加入Rh2的浓度为4μg/ml、8μg/ml、12μg/ml、16μg/ml、20μg/ml、24μg/ml。

阴性对照组则加入等体积的培养液；以上各组细胞培养48小时后，检测各组在560nm处的OD值，按MTT法求生长抑制率和IC₅₀：

生长抑制率(％)＝[1-实验组OD值/对照组OD值]×100％；

IC₅₀是生长抑制率为50％时的药物浓度。

二、结果

实验结果如表1所示。

表1DDA和DTA对肺腺癌A549细胞株和人红白血病K562细胞株的抑制作用

结果表明，氢化型人参皂苷苷元DDA和DTA与人参皂苷Rh2相比，对人肺腺癌A549细胞株和人红白血病K562细胞株的生长具有较强的抑制作用，该抑制肿瘤细胞生长的作用是通过抑制肿瘤细胞的数目实现的。

实施例4、氢化型人参皂苷苷元DDA抑制小鼠肉瘤S180和小鼠肝癌H22

一、DDA对小鼠肉瘤(S₁₈₀)的抑瘤实验

1、方法

给昆明小鼠(18-22g)(购自吉林大学实验动物中心)接种小鼠肉瘤S₁₈₀(瘤株购自吉林省肿瘤研究所)，10天后取其瘤组织，切成0.2×0.2×0.2cm³大小，在昆明小鼠右前肢腋下皮下植入1块肉瘤组织块，待出现腹水时，进行如下实验：选择腹水生长良好的瘤源动物，脱颈椎处死。在无菌条件下抽取腹水，计数肿瘤细胞，用无菌生理盐水稀释混匀，得到S₁₈₀混悬液，置冰水中存放。

于昆明小鼠右前肢腋下皮下注射S₁₈₀混悬液0.2ml(约2×10⁶个瘤细胞)。动物移植瘤细胞后24小时，随机分组、编号、称体重，开始依组别不同给予药物治疗。每批次实验均各分4组，分别作为：空白对照组，给与等体积生理盐水；氢化人参皂苷苷元DDA高剂量组10mg/kg、氢化人参皂苷苷元DDA中剂量组5mg/kg和氢化人参皂苷苷元DDA低剂量组2mg/kg腹腔给药；连续用药10天。末次给药后24小时，称重后脱颈椎处死，剥取瘤体组织称重。按下列公式计算瘤重抑制率和进行统计学(t检验)处理。

瘤重抑制率(％)＝[(空白对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重]×100

2、结果

实验结果见表2。

表2氢化人参皂苷苷元DDA对移植性小鼠S₁₈₀瘤体生长的影响

结果表明，氢化人参皂苷苷元DDA腹腔给药对小鼠肉瘤₁₈₀(S₁₈₀)有明显的抑瘤作用，有一定的量效依赖关系，在高剂量组时抑瘤作用较强，瘤重抑制率达72.23％。

二、DDA对小鼠移植性肝癌(H₂₂)的抑瘤实验

1、方法

给昆明小鼠(18-22g)(购自吉林大学实验动物中心)接种肝癌H₂₂(瘤株购自吉林省肿瘤研究所)，10天后取其瘤组织，切成0.2×0.2×0.2cm³大小，在昆明小鼠右前肢腋下皮下植入1块肉瘤组织块，待出现腹水时，进行如下实验：选择腹水生长良好的瘤源动物，脱颈椎处死。在无菌条件下抽取腹水，计数肿瘤细胞，用无菌生理盐水稀释混匀，得到H₂₂混悬液，置冰水中存放。

于昆明小鼠右前肢腋下皮下注射H₂₂混悬液0.2ml(约2×10⁶个瘤细胞)。动物移植瘤细胞后24小时，随机分组、编号、称体重，开始依组别不同给予药物治疗。每批次实验均各分4组，分别作为：空白对照组，给予等体积生理盐水；氢化人参皂苷苷元DDA高剂量组10mg/kg、氢化人参皂苷苷元DDA中剂量组5mg/kg和氢化人参皂苷苷元DDA低剂量组2mg/kg腹腔给药；连续用药10天。末次给药后24小时将动物称重后脱颈椎处死，剥取瘤体组织称重，并按前述公式计算瘤重抑制率和进行统计学(t检验)处理。

2、结果

实验结果见表3。

表3氢化人参皂苷苷元DDA对移植性小鼠肝癌H22瘤体生长的影响

结果表明，氢化人参皂苷苷元DDA高剂量腹腔给药对移植性小鼠肝癌(H₂₂)的有较好的抗癌作用，并有一定的量效依赖关系，在高剂量组时抑瘤作用较强，瘤重抑制率可达71.82％以上(P均＜0.05)。

实施例5、氢化型人参皂苷苷元免疫增强作用

一、氢化型人参皂苷苷元DDA免疫增强作用

1、方法

将昆明小鼠(购自吉林大学实验动物中心)随机分为4组。第I组为溶剂对照组，每日给每只小鼠腹腔注射生理盐水0.5ml，共注射15日；第II-IV组为实验组，每日给每只小鼠腹腔注射DDA溶液0.5ml(第II组：DDA的注射剂量为10mg/kg；第III组：DDA的注射剂量为6.6mg/kg；第IV组：DDA的注射剂量为3.3mg/kg)，共注射15日。第16日(从开始注射DDA溶液计起)对各组小鼠尾静脉注射墨汁(长春欧亚百货商都)(4倍稀释)0.1ml/10g小鼠，分别于注射后第2min和第10min(从注射墨汁后开始计起)用抗凝过的平口毛细管从小鼠眼眶内静脉丛取血20μl，并迅速加人到2ml 0.1％碳酸钠溶液中并摇匀，以紫外可见分光光度计600nm波长处测吸光度(OD)值。颈椎脱臼法处死小鼠，取肝、脾称重。由于碳颗粒的清除速率与其剂量呈指数函数的关系，即吞噬速率与血碳浓度呈正比，以血碳浓度的对数值为纵坐标，取血时问为横坐标，按公式K＝(lgODl-lgOD2)/(t2-t1)，求出吞噬速率(K)，式中K表示吞噬速率，ODl、OD2为两次血样的光密度值，t1和t2为两次采血时间。K值的大小除与吞噬细胞的吞噬活性有关外，还与小鼠肝、脾重量有关。因此，K值需经下列公式校正：

α＝K×W/WL.S

式中α为校正后的吞噬指数，W为小鼠体重，WL.S为肝、脾重量。α值表明小鼠单核吞噬细胞系统吞噬清除碳粒的功能。

2、结果

实验结果见表4。

表4氢化型人参皂苷苷元DDA小鼠巨噬细胞吞噬测定结果

结果表明，DDA各剂量组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数α均较溶剂对照组升高。说明DDA具有较好免疫增强活性。

二、氢化型人参皂苷苷元DTA免疫增强作用

1、方法

处理方法与上述步骤一中的方法相同，4组小鼠分别为：第II组：DTA的注射剂量为10mg/kg；第III组：DTA的注射剂量为6.6mg/kg；第IV组：DTA的注射剂量为3.3mg/kg。

2、结果

实验结果见表5。

表5氢化型人参皂苷苷元DTA小鼠巨噬细胞吞噬测定结果

结果表明，DTA各剂量组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数α均较溶剂对照组升高。说明DTA具有较好免疫增强活性。

Claims

1.式Ⅰ所示化合物在制备增强机体免疫力的药物中的应用，

式Ⅰ，其中R表示氢或羟基。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述增强机体免疫力为增强机体内吞噬细胞的吞噬能力。

3.式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

（1）将人参破碎，加入有机溶剂ⅰ进行回流提取，取有机相，去除有机溶剂ⅰ，即得到人参总皂苷；所述破碎为破碎成过40目筛的小块；所述有机溶剂ⅰ为体积百分比为70%的乙醇水溶液；所述人参与所述有机溶剂ⅰ的质量比为1:10；每次所述回流提取的时间为1小时，每次所述回流提取的温度为80℃；所述回流提取的次数为3次；

（2）将步骤（1）得到的人参总皂苷用有机溶剂ⅱ溶解，得到皂苷溶液；所述有机溶剂ⅱ为体积百分比为95%的乙醇水溶液；所述皂苷溶液的质量百分比浓度为10%；

向所述皂苷溶液中加入有机溶剂ⅱ的碱溶液进行反应，进行第一次静置，离心后收集沉淀；所述有机溶剂ⅱ的碱溶液是由NaOH水溶液和乙醇水溶液混合制成；所述NaOH水溶液与所述乙醇水溶液的体积比为3：200；所述NaOH水溶液的浓度为11mol/L；所述乙醇水溶液为体积百分比为95%的乙醇水溶液；所述皂苷溶液与所述有机溶剂ⅱ的碱溶液的体积比为1:1；所述第一次静置的时间为24h，所述第一次静置的温度为25℃；

用水将所述沉淀制成悬浊液，向所述悬浊液中加入所述有机溶剂ⅱ的碱溶液进行反应，进行第二次静置，分别收集上清和沉淀；将所述上清蒸干后即得到人参三醇型皂苷，将所述沉淀干燥后即得到人参二醇型皂苷；所述第二次静置的时间为12h，所述第二次静置的温度为25℃；

（3）分别向步骤（2）得到的人参三醇型皂苷和人参二醇型皂苷中加入有机溶剂ⅲ进行热解反应，分别得到反应产物Ⅰ和反应产物Ⅱ；所述有机溶剂ⅲ为体积百分比为45%的丙二酸水溶液；所述人参三醇型皂苷与所述有机溶剂ⅲ的质量比为5：1；所述人参二醇型皂苷与所述有机溶剂ⅲ的质量比为5：1；所述热解反应的温度为120℃；所述热解反应的时间为5小时；

用水分别将反应产物Ⅰ和反应产物Ⅱ制成悬浊液Ⅰ和悬浊液Ⅱ，进行萃取ⅰ，分别得到20,24位双键型三醇型人参皂苷和20,24位双键型二醇型人参皂苷；所述萃取ⅰ是使用二氯甲烷进行的；

（4）将步骤（3）得到的20,24位双键型三醇型人参皂苷和20,24位双键型二醇型人参皂苷分别进行氢化反应，分别得到氢化后的产物Ⅰ和氢化后的产物Ⅱ；

所述氢化反应包括如下a）或b）或c）所述的步骤：

a）将步骤（3）得到的20,24位双键型三醇型人参皂苷和20,24位双键型二醇型人参皂苷分别用有机溶剂ⅱ溶解，分别得到溶解液Ⅰ和溶解液Ⅱ，分别向溶解液Ⅰ和溶解液Ⅱ加入催化剂ⅰ，通入氢气，进行第一步氢化反应，去除催化剂ⅰ，分别得到氢化反应液Ⅰ和氢化反应液Ⅱ，蒸干后分别得到干燥物Ⅰ和干燥物Ⅱ；分别向干燥物Ⅰ和干燥物Ⅱ中加入有机溶剂ⅱ溶解，加入催化剂ⅱ，通入氢气，进行第二步氢化反应，去除有机溶剂ⅱ和催化剂ⅱ，分别得到氢化后的提取物Ⅰ和氢化后的提取物Ⅱ；

b）将步骤（3）得到的20,24位双键型三醇型人参皂苷和20,24位双键型二醇型人参皂苷分别用有机溶剂ⅱ溶解，分别得到溶解液Ⅰ和溶解液Ⅱ，分别向溶解液Ⅰ和溶解液Ⅱ加入催化剂ⅰ，通入氢气，进行氢化反应A，去除有机溶剂ⅱ和催化剂ⅰ，分别得到氢化后的提取物Ⅰ和氢化后的提取物Ⅱ；

c）将步骤（3）得到的20,24位双键型三醇型人参皂苷和20,24位双键型二醇型人参皂苷分别用有机溶剂ⅱ溶解，分别得到溶解液Ⅰ和溶解液Ⅱ，分别向溶解液Ⅰ和溶解液Ⅱ加入催化剂ⅱ，通入氢气，进行氢化反应B，去除有机溶剂ⅱ和催化剂ⅱ，分别得到氢化后的提取物Ⅰ和氢化后的提取物Ⅱ；

所述溶解的温度为35℃；所述催化剂ⅰ为雷尼镍；所述催化剂ⅱ为钯/碳；所述第一步氢化反应或所述氢化反应A的温度为25℃，时间为3小时；所述第二步氢化反应或所述氢化反应B的温度为25℃，时间为3小时；

（5）分别将步骤（4）得到的氢化后的产物Ⅰ和氢化后的产物Ⅱ与酶溶于酸水溶液中，进行水解反应，分别得到反应液Ⅰ和反应液Ⅱ，分别离心反应液Ⅰ和反应液Ⅱ，分别收集沉淀Ⅰ和沉淀Ⅱ，用水分别将所述沉淀Ⅰ和沉淀Ⅱ制成悬浊液Ⅰ和悬浊液Ⅱ，进行萃取ⅱ，均取有机相，由悬浊液Ⅰ萃取得到的有机相即为式I所示化合物，其中R表示羟基；由悬浊液Ⅱ萃取得到的有机相即为式I所示化合物，其中R表示氢；所述酶为葡聚糖苷酶和/或葡萄糖苷酶和/或蜗牛酶；所述萃取ⅱ是使用乙酸乙酯进行的；所述酸水溶液为乙酸水溶液；所述水解反应的温度为15℃-100℃，时间为2小时-24小时；所述水解反应体系的pH值为2-6；所述酶的用量为10U/g氢化后的产物Ⅰ或10U/g氢化后的产物Ⅱ；所述乙酸水溶液的浓度为0.1mol/L；所述萃取ⅱ是使用乙酸乙酯进行的；

式Ⅰ，其中R表示氢或羟基。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中，所述水解反应的温度为15℃或40℃或100℃，时间为2小时或12小时或24小时；所述水解反应体系的pH值为2或4.5或6。