DE69524628T2

DE69524628T2 - Verfahren und mittel zur inhibierung von proteinkinasen

Info

Publication number: DE69524628T2
Application number: DE69524628T
Authority: DE
Inventors: A. Giese; Nathalie Lokker
Original assignee: COR Therapeutics Inc
Current assignee: COR Therapeutics Inc
Priority date: 1994-10-28
Filing date: 1995-10-26
Publication date: 2002-08-08
Anticipated expiration: 2015-10-27
Also published as: PT788356E; US5728726A; EP0788356B9; WO1996013259A3; US5795910A; US5674892A; CN1165481A; TW467743B; DK0788356T3; KR970706812A; WO1996013259A2; DE69524628D1; MX9703113A; EP0788356A2; ATE210439T1; CA2203757A1; JPH10508024A; ES2170172T3; EP0788356B1; AU4278996A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Inhibitoren von Proteinkinasen, insbesondere Tyrosinkinasen, bei der Analyse von Kinasen und deren Substraten sowie bei der Hemmung von von Kinasen abhängigen Prozessen, wie z. B. Zeilvermehrung.

Hintergrund der Erfindung

Tyrosin-spezifische Proteinkinasen (Tyrosinkinasen) stellen eine Familie von Enzymen dar, die die Übertragung des terminalen Phosphats von Adenosintriphosphat auf Tyrosinreste in Proteinsubstraten. Die ersten identifizierten Vertreter dieser Klasse waren mit viralen Genen (Onkogene genannt) assoziierte Tyrosinkinasen, die zur Zelltransformation in der Lage waren (nämlich pp60v-src und pp98v-fps). Später wurde gezeigt, dass es zu diesen viralen Genprodukten normale zelluläre Gegenstücke gab (nämlich pp60c- src und pp98c-fps). Eine dritte Kategorie von identifizierten Tyrosinkinasen sind jene, die als Wachstumsfaktor-Rezeptoren bezeichnet werden und Insulin-, Epidermis-Wachstumsfaktor- (EGF-), "Platelet-derived growth factor"- (PDGF-), Fibroblasten-Wachstumsfaktor- (FGF-) und p185HER-2-Rezeptor umfassen. Von allen diesen Tyrosinkinasen wird angenommen, dass sie durch Substratphosphorylierung eine entscheidende Rolle bei der Signaltransduktion für eine Reihe von Zellfunktionen spielen.
Obwohl der genaue Mechanismus der Signaltransduktion noch aufgeklärt werden muss, wurde gezeigt, dass Tyrosinkinasen Faktoren sind, die wichtige Beiträge bei Zellvermehrung, Carcinogenese und Zelldifferenzierung leisten.
Zellreplikation kann durch Versetzen von Zellen mit einem oder mehreren Wachstumsfaktoren ausgelöst werden; Beispiele dafür sind FGF, EGF und PDGF. Derartige Wachstumsfaktoren wechselwirken auf spezielle Weise mit ihren zugehörigen Rezeptoren, wobei die Rezeptoren eine extrazelluläre Domäne, eine Transmembrandomäne und eine Cytoplasmadomäne, welche die enzymatische Aktivität der Tyrosinkinase besitzt, umfassen. Es wird angenommen, dass die Initiation der Zellvermehrung erfolgt, wenn sich ein Wachstumsfaktor an die extrazelluläre Domäne seines Rezeptors an der Zelloberfläche bindet. Diese Bindung des Wachstumsfaktors an den Rezeptor induziert eine Dimerisierung des Rezeptors, was zur Autophosphorylierung des Rezeptors, einer Erhöhung der enzymatischen Aktivität des Rezeptors und zur Substrat-Phosphorylierung führt. Neuerdings wurde ein gemeinsamer Weg der Signalisierung von der Zelloberfläche zum Kern identifiziert, und es wurde gezeigt, dass dieser von Tvrosinkinase-Wachstumsfaktor-Rezeptoren genutzt wird. Dieser Weg umfasst die durch Wachstumsfaktor mediierte Aktivierung des ras-Proteins, das eine Protein-Kinase-Kaskade initiiert, die zur Phosphorylierung von Transkriptionsfaktoren führt, welche die Expression von an der Zellteilung beteiligten Genen regulieren.
Die Rezeptor-Autophosphorylierung und die Phosphorylierung von intrazellulären Substraten sind biochemische Vorgänge, die für die Wachstumsfaktor-Signalisierung und Zellvermehrung erforderlich sind. Dies wurde durch Eliminieren der Tyrosinkinase-Proteinaktivität einer Reihe von Rezeptoren, einschließlich des EGF-Rezeptors, des FGF-Rezeptors und des PDGF-Rezeptors, durch stellengerichtete Mutagenese gezeigt, was zum vollständigen Verlust der biologischen Aktivität der Rezeptoren führte. Auch verhindern Proteinkinase-Inhibitoren, wie z. B. Staurosporin, K252a und die Tyrphostine, welche die enzymatische Aktivität von Tyrosinkinase-Rezeptoren blockieren, die intrazelluläre Signalisierung und die Zellvermehrung. Diese Studien bestätigen die essenzielle Rolle der Tyrosin-Phosphorylierung bei der Signalisierung durch die Wachstumsfaktor-Rezeptoren und zeigen, dass Verbindungen, welche die Tyrosinkinase-Aktivität hemmen, zur Regulierung der Zellvermehrung eingesetzt werden können.
Zahlreiche Krankheitszustände sind durch unkontrollierte Zellvermehrung gekennzeichnet. Diese Krankheiten betreffen eine Vielzahl von Zelltypen und umfassen Leiden wie Krebs, Psoriasis, Lungenfibrose, Glomerulonephritis, Atherosklerose und auf Gefäßplastik folgende Restenose. Die Nützlichkeit von Tyrosinkinase-Inhibitoren bei der Behandlung derartiger Leiden wurde durch eine Reihe von in vivo-Studien belegt. Von Tyrosinkinase-Inhibitoren mit Selektivität für die EGF-Rezeptorfamilie wurde gezeigt, dass sie bei Tieren die Tumorbildung blockieren, wodurch ihr potenzieller Nutzen bei der direkten Unterdrückung des Tumorzellenwachstums zur Behandlung von Krebs beim Menschen, insbesondere von Brustkrebs, unter Beweis gestellt wurde. Auch wurde gezeigt, dass Tumor-Metastasen und die zugehörige Gefäßbildung durch Verhinderung der Aktivierung der Gefäßendothelwachstumsfaktor- (VEGF-) Rezeptor-Tyrosinkinase gehemmt werden kann, was die Nützlichkeit von Tyrosinkinase-Inhibitoren beim Blockieren getrennter Vorgänge, die während der Carcinogenese passieren, andeutet.
In Versuchsmodellen von Glomerulonephritis hängt ein 20facher Anstieg der PDGF-Rezeptor-Expression mit der Mesangialzellvermehrung zusammen. Eine Neutralisierung von PDGF, was die Aktivierung seines Tyrosinkinase-Rezeptors verhindert, schränkt das normalerweise auftretende Ausmaß an Nierendegeneration ein. Diese Studien zeigen, dass ein Tyrosinkinase-Inhibitor, der den PDGF-Rezeptor blockiert, Potenzial für die Behandlung von Glomerulonephritis beim Menschen besitzt.
Ein ungelöstes Hauptproblem bei der intervenierenden Cardiologie ist auf Herzkranzgefäßplastik folgende Restenose. Von den gegenwärtig in den USA durchgeführten nahezu 400.000 Gefäßplastiken pro Jahr scheitern 30-40% innerhalb des ersten Jahres aufgrund von Restenose. Der Prozess der Restenose umfasst die Reokklusion einer atherosklerotischen Arterie, wozu es in vielen Fällen aufgrund der Vermehrung von Glattmuskelzellen kommt, die durch Wachstumsfaktoren, wie z. B. PDGF und FG F, mediiert wird. Bei Restenose-Tiermodellen verhindern Antikörper, welche die Aktivierung der PDGF- oder FGF-Rezeptor-Tyrosinkinase-Aktivität blockieren, die Vermehrung der Glattmuskelzellen und die Bildung von Neointima. Diese Studien weisen darauf hin, dass Tyrosinkinase- Inhibitoren, welche die PDGF- oder FGF-Rezeptorfunktion blockieren, bei der Behandlung von Restenose beim Menschen von Nutzen sein könnten.
Gegenwärtig verwendet die Chemotherapie gegen Krebs Inhibitoren der DNA-Synthese (z. B. Adriamycin, Fluoruracil) und Verbindungen, die das Zellskelett zerstören (Vinblastin). Diese Verbindungen sind stark toxisch, da ihre inhibitorische Aktivität nicht auf Krebszellen beschränkt ist, wobei jedoch festzuhalten ist, dass Tumorzellen von den obigen Inhibitoren eher angegriffen werden, da sich diese Zellen rascher teilen und ihr DNA-Metabolismus daher aktiver ist. Einige Arten von Krebs werden mit spezifischen Hormonderivaten behandelt. Diese Fälle stellen jedoch die Ausnahme dar, denn die chemotherapeutische Behandlung der Mehrheit der verschiedenen Arten von Krebs ist nichtspezifisch.
In den frühen Achtzigerjahren wurde bekannt, dass 20-30% der Krebsarten charakteristische Onkogen-Produkte exprimieren, die Wachstumsfaktorrezeptoren oder mutierte Homologe davon sind und Protein-Tyrosin-Kinase- (PTK-) Aktivität zeigen. Die PTK-Aktivität ist dem Rezeptor bzw. dem Onkogen-Homolog davon zu Eigen und beeinflusst über die PTK-Domäne die Zellvermehrung. Weiters zeigt jeder dieser Rezeptoren (ob normal oder mutiert) eine charakteristische PTK-Aktivität mit einer speziellen Substratspezifität. Einer dieser Rezeptoren ist Epidermiswachstumsfaktor- (EGF-) Rezeptor und sein Onkogen-Homolog V-ERB-B.
Als Ergebnis der obigen Entwicklungen bezüglich der PTK-Aktivität von Wachstumsfaktorrezeptoren wurde vorgeschlagen, Krebs mit verschiedenen chemischen Substanzen zu behandeln, die in der Lage sind, die PTK-Aktivität von EGF zu hemmen. Siehe beispielsweise die JP-A-62-39523, 62-39558, 62-42923 und 62-42925. Beispielsweise offenbart das obige offengelegte japanische Patent SHO 62-39558 α-Cyano-2,5-dihydroxycinnamamid als Wirkkomponente in als PTK-Inhibitoren wirksamen Zusammensetzungen.
Die Verwendung von Cinnamylmalononitril und verschiedenen Benzylidenmalononitril-Verbindungen als Inhibitoren des Tumorwachstums wird von Gal et al., "Studies on the Biological Action of Malononitriles. I. The Effect of Substituted Malononitriles on the Growth of Transplanted Tumors in Mice", Cancer Research 12, 565-72 (1952), geoffenbart.
Die EP-A-0.251.813 offenbart die Verwendung der Resorcylsäurelacton- (RAL-) Derivate Zearalenon, Zearalanon, Zearalen, Zearalan, Zearalenol, Zearalanol, Didesoxyzearalan und pharmazeutisch annehmbarer Salze davon zur Verabreichung an Wirbeltiere zur nichtspezifischen Stimulierung des Immunsystems.
Die EP-A-0.6O6.044 offenbhart Verbindungen der allgemeinen Formel
und deren Verwendung als Inhibitoren der Cytokinfreisetzung und IL-1-Antagonisten und zur Behandlung von Leiden mit einer mit übermäßiger Cytokinfreisetzung in Zusammenhang stehenden oder diese umfassenden Ätiologie. Sie offenbart auch, dass bei den verwandten Verbindungen Zearalenon und Radicicol und Derivaten davon die Cytokinfreisetzung hemmende Eigenschaften festgestellt wurden und dass sie ähnliche pharmazeutische Anwendungsgebiete besitzen.

Offenbarung der Erfindung

Gemäß vorliegender Erfindung wird die Verwendung einer nachstehend definierten Verbindung zur Verwendung in einem Verfahren zur Hemmung einer Proteinkinase bereitgestellt, Folgendes umfassend:
das In-Kontakt-Bringen einer eine Protein-Kinase enthaltenden Körperflüssigkeit eines Säugetiers mit der Verbindung der Formel:
worin:
R&sub1; H, eine gegebenenfalls halogenierte, unverzweigte oder verzweigte C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppe oder eine C&sub1;-C&sub4;-Alkanoylgruppe ist;
R&sub2; H, eine gegebenenfalls halogenierte, unverzweigte oder verzweigte C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppe oder eine C&sub1;-C&sub4;-Alkanoylgruppe ist;
R&sub3; und R&sub4; gemeinsam eine cis-Doppelbindung oder -O- darstellen oder R&sub3; und R&sub4; jeweils unabhängig voneinander H oder OR darstellen;
R&sub5; =O, =S oder -H, -OR ist;
R&sub6; und R&sub7; gemeinsam eine Doppelbindung oder -O- darstellen oder R&sub6; und R&sub7; jeweils unabhängig voneinander H oder OR darstellen;
R&sub8; und R&sub9; gemeinsam eine Doppelbindung oder -O- darstellen oder R&sub8; und R&sub9; jeweils unabhängig voneinander H oder OR darstellen; und
alle R jeweils unabhängig von den anderen H, eine gegebenenfalls halogenierte, unverzweigte oder verzweigte C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppe oder eine C&sub1;-C&sub4;-Alkanoylgruppe darstellen.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung einer oben definierten Verbindung zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zum Regulieren einer von Kinase abhängigen Erkrankung, umfassend das Verabreichen einer die von Kinase abhängige Erkrankung bekämpfenden Menge der Verbindung an ein Säugetier, das an einer von Kinase abhängigen Erkrankung leidet.
In dieser Schrift hat "Säugetier" die übliche Bedeutung und umfasst neben anderen Säugetieren auch den Menschen. Unter pharmazeutischen Verwendungszwecken sind auch veterinärmedizinische Anwendungen zu verstehen, insbesondere die Verwendung für Haus- und Hoftiere, wie z. B. Rinder, Schafe, Schweine, Ziegen, Hunde, Katzen, Kaninchen, Hamster, Springmäuse, Ratten und Mäuse.

Kurzbeschreibung der Abbildungen

Zum besseren Verständnis der Erfindung wird auf die folgende detaillierte Beschreibung in Kombination mit den Zeichnungen Bezug genommen, die einen Teil der vorliegenden Beschreibung bildet, worin:
Fig. 1 den Effekt von Verbindung 292 auf die β-PDGFR-Autophosphorylierung in HR5- Zellen zeigt; und
Fig. 2 den Effekt von Verbindung 292 auf die PDGF-BB-induzierten [³H]-Thymidin-Aufnahme in HS68-Zellen zeigt.

Beschreibung spezifischer Ausführungsformen

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Verwendung von bereits bekannten Verbindungen sowie bestimmte, mit bereits bekannten Verbindungen verwandte Verbindungen, die hierin erstmals identifiziert werden. Die Verbindungen sind mit Zeaenol verwandt und sind Makrolide, die einen 14-gliedrigen Esterring, fusioniert an einen Catechinring, enthalten. Verbindungen dieser Klasse sind seit über 25 jahren bekannt und wurden hauptsächlich als Rinderfutter-Zusatzstoffe eingesetzt. Siehe beispielsweise Kuiper-Goodman et al., "Risk Assessment of the Mycotoxin Zearalenon", Regulatory Toxicology and Pharmacology 7, 253-306 (1987); Bennett et al., "Use of the Anabolic Agent Zearnol (Resorcylic Acid Lactone) as a Growth Promotor for Cattle", The Veterinary Record, S. 235-239 (16. März 1974); Willemart et al., "A RAL Compound as an Anabolic in Cattle", Veterinary Research Communications 7, 35-44 (1987); und Roche et al., "Resorcylic Acid Lactone as an Anabolic Agent in Cattle", Veterinary Research Communications 7, 45-50 (1983). Andere bekannte Aktivitäten dieser Verbindungen sind jene als Östrogen-Mittel. Siehe beispielsweise Sheffield et al., "Zeranol (β-Resorcylic Acid Lactone), A Common residuous Component of Natural Foodstuffs Stimulates Developmental Growth of the Mouse Mammary Gland", Cancer Letters 28, 77-83 (1985); Mastri et al., "In Vivo Oestrogenicity and Binding Characteristics of α-Zearalanol (P1496) to Different Classes of Oestrogen Binding Proteins in Rat Liver", J. Steroicl Biochem. 23(3), 279-289 (1985); Edward et al., "Murine Macrophage Activation vith Resorcylic Acid Lactones (RALs): Comparison with Diethylstilbestrol and 17β-Estradiol", Immunopharmacology 17, 107-118 (1989); und Katzenellenbogen et al., "Zearalenones: Characterization of the Estrogenic Potencies and Receptor Interactions of a Series of Fungal β-Resorcyfic Acid Lactones", Endocrinology 105, 33-40 (1979). Sie wurden jedoch bisher nicht als Inhibitoren von Kinase, einem wichtigen biochemischen Steuerungsmelokül, eingesetzt, noch war bekannt, dass sie dazu geeignet sind. Allgemein entsprechen die Verbindungen der Formel
worin:
R&sub1; H, Niederalkyl oder Niederalkanoyl ist;
R&sub2; H, Niederalkyl oder Niederalkanoyl ist;
R&sub3; und R&sub4; gemeinsam eine cis-Doppelbindung oder -O- darstellen oder R&sub3; und R&sub4; jeweils unabhängig voneinander H oder OR darstellen;
R&sub5; =O, =S oder -H, -OR ist;
R&sub6; und R&sub7; gemeinsam eine Doppelbindung oder -O- darstellen oder R&sub6; und R&sub7; jeweils unabhängig voneinander H oder OR darstellen;
R&sub8; und R&sub9; gemeinsam eine Doppelbindung oder -O- darstellen oder R&sub8; und R&sub9; jeweils unabhängig voneinander H oder OR darstellen; und
alle R jeweils unabhängig von den anderen H, Niederalkyl oder Niederalkanoyl darstellen.
Es wurde nun entdeckt, dass diese Verbindungen und selbige enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen zur Bindung an Kinase und zu deren Hemmung verwendet werden können. Derartige Anwendungszwecke werden nachstehend detaillierter beschrieben.

Begriffsdefinitionen

Wie zuvor und in der gesamten Offenbarung gebraucht sind die nachstehenden Begriffe folgendermaßen zu verstehen:
"Alkyl" bezeichnet einen gesättigten, aliphatischen Kohlenwasserstoff, der entweder unverzweigt oder verzweigt sein kann und etwa 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatome enthält. "Niederalkyl" bezeichnet eine obige Alkylgruppe, die 1 bis etwa 4 Kohlenstoffatome aufweist und unverzweigt oder verzweigt sein kann, wie z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec-Butyl oder tert-Butyl. Halogenierte Alkylgruppen, insbesondere fluorierte Alkylgruppen, wie z. B. CF&sub3;, CH&sub2;CF&sub3; und CF&sub2;CF&sub3;, sind in der Definition der Alkylgruppen enthalten.
"Alkoxy" bezeichnet eine Alkyloxy-Gruppe, worin "Alkyl" die zuvor beschriebene Bedeutung hat. Niederalkoxygruppen werden bevorzugt. Beispiele für diese Gruppen umfassen Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, i-Propoxy und n-Butoxy.
"Alkanoyl" (oder "Acyl") bezeichnet einen von einer organischen Säure, einer Carbonsäure, durch Entfernung der sauren Hydroxylgruppe abgeleiteten organischen Rest. Bevorzugte Acylgruppen sind Niederalkylcarbonsäure-Gruppen, wie z. B. Acetyl und Propionyl. Auch Benzyl wird bevorzugt.
"Halo" bzw. "Halogen" bezeichnet ein Halogenatom. Bevorzugt Halogene umfassen Chlorid, Bromid und Fluorid.

Struktur

Beispielhafte Strukturen sind in der nachstehenden Tabelle angeführt. Beispielverbindung 1 in dieser Tabelle ist Verbindung 292 aus dem Experimentellen Teil dieser Beschreibung. Tabelle 1

Fußnoten zur Tabelle

= in benachbarten Spalten) stellt eine Doppelbindung zwischen angegebenen benachbarten Kohlenstoffatomen dar.
-O- (in benachbarten Spalten) stellt Epoxide zwischen angegebenen benachbarten Kohlenstoffatomen dar.
Me - Methyl; Et - Ethyl; Pr - n-Propyl; iPr - Isopropyl; Bu - n-Butyl; sßu - sec-Butyl; iBu- Isobutyl; tBu - tert-Butyl; 1Pn - 1-Pentyl; 2Pn - 2-Pentvl; 3Pn - 3-Pentyl; 2MB - 2-Methylbutyl; iPn - Isopentyl (3-Methyl butyl); nPn - Neopentyl (2,2-Dimethylpropyl); 11MP - 1,1-Dimethylpropyl; 12MP - 1,2-Dimethylpropyl; MeCO - Acetyl (die übrigen Acylderivate sind auf dieselbe Weise abgekürzt).

Stereochemie chiraler Zentren und Doppelbindungsgeometrie

Die im Verfahren gemäß vorliegender Erfindung eingesetzten Verbindungen können bis zu 3 C-C-Doppelbindungen enthalten: R&sub3;-R&sub4;, R&sub6;-R&sub7; und R&sub8;-R&sub0;. Die R&sub3;-R&sub4;-Doppelbindung muss, falls vorhanden, cis sein, damit das resultierende Molekül auf die angeführte Weise aktiv sein kann. Die R&sub6;-R&sub7;- und R&sub8;-R&sub9;-Doppelbindungen sind, falls vorhanden, vorzugsweise trans.
Potenzielle chirale Zentren liegen an den Kohlenstoffen 3, 5, 6, 8, 9, 11 und 12 vor (Makrolid-Nummerierungssystem; siehe Formel I). Da stereochemische Bezeichnungen (R und S) je nach Art des Substituenten an einer bestimmten Position variieren, ist die bevorzugte Stereochemie einer bestimmten Stelle je nach Substituent R oder S. Absolute stereochemische Konfigurationen der einzelnen chiralen Zentren sind vorzugsweise jene, bei denen die chiralen Zentren dieselben relativen Konfigurationen aufweisen wie bei dem einen oder anderen der natürlich vorkommenden Resorcylsäure-Derivate (und sind somit durch synthetische Modifikationen ganz leicht herzustellen). Es existieren jedoch Syntheseverfahren zur Inversion chiraler Zentren (z. B. SN&sub2;-Substitutionsreaktionen), und derartige Verfahren können zur Herstellung von in der Natur nicht vorkommenden Isomeren eingesetzt werden, falls derartige Isomere gewünscht werden. Wenn an einer bestimmten Stelle eine spezielle Stereochemie gewünscht wird, stehen zahlreiche Verfahren entweder zur stereochemischen Synthese oder zur Synthese von Diastereomeren zur Verfügung, da die Einführung eines einzelnen chiralen Zentrums (wie z. B. des chiralen Zentrums an C3) zur Erzeugung von Diastereomeren (und nicht Enantiomeren) rührt, die mittels normaler physikalischer Verfahren getrennt werden können. Zwei bevorzugte Orientierungen chiraler Zentren sind jene, bei denen der Kohlenstoff an Position 8 in S-Konfiguration und der Kohlenstoff an Position 9 in S-Konfiguration vorliegen, wenn an beiden Stellen OH-Gruppen hängen, sowie jene, bei denen der Kohlenstoff an Position 3 in S-Konfiguration vorliegt.
Auf jeden Fall beeinträchtigt das Vorliegen von Diastereomer-Gemischen die Erfindung nicht, da die Gegenwart inaktiver Diastereomere (sofern vorhanden) sich lediglich auf dieselbe Weise auswirkt wie die Gegenwart jeglichen anderen inaktiven Materials (wie z. B. eines pharmazeutischen Trägers).

Herstellung und Produktion der Verbindungen

Die gemäß vorliegender Erfindung eingesetzten Verbindungen sind Resorcylsäurelactone und können nach bekannten Verfahren hergestellt und modifiziert werden. Manche dieser Verbindungen sind als biologische Fermentationsprodukte erhältlich, und andere können durch chemische Modifizierung der ursprünglichen biologischen Produkte erhalten werden. Die biologische Produktion von Verbindung 1 in Tabelle 1 ist in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Andere biologische und chemische Syntheseverfahren werden in einer Reihe von US-Patenten beschrieben, einschließlich der US-A- 3.373.030; 3.551.454; 3.810.918; 3.836.544; und 3.925.423, die allesamt hierin durch Verweis aufgenommen sind. Das letzte dieser Patente ist besonders nützlich, da es eine allgemeine Synthesevorschrift zur Herstellung von Verbindungen der Erfindung aus leicht erhältlichen Ausgangsmaterialien angibt.
Beispielsweise kann trans-Zearalenon durch Kultivierung des Mikroorganismus Gibberella zeae (Gordon) nach einem geeigneten Fermentationsverfahren erhalten werden, wie es z. B. in der US-A-3.196.019 beschrieben wird. Beispielsweise kann die ungesättigte Kohlenstoffbindung im Zearalenonlactonring gemäß dem Verfahren der US-A- 3.239.354 hydriert werden. Die Ketongruppe von Zearalenon kann nach dem Verfahren der US-A-3.239.341 zum entsprechenden Alkohol oder nach dem Verfahren der US-A- 3.237.341 zu einer Methylengruppe reduziert werden. Die Substitution des Wasserstoffs der Hydroxylgruppen durch eine Alkyl-, Alkanol-, Aryl- oder Arylalkylgruppe wird in den US-A-3.239.342 und 3.239.347 geoffenbart. Cis-trans-Umwandlung von Doppelbindungen unter Verwendung von Bestrahlung mit 2.800 bis 3.500 Ångström wird in der mittlerweile fallen gelassenen US-Patentanmeldung Nr. 317.117, eingereicht am 21. Dezember 1972, geoffenbart. Die Trennung von Diastereomeren von Zearalenol wird in der US-A-3.687.982 geoffenbart. Alle diese Patentschriften sind hierin als Beispiele für den gegenwärtigen Stand der Technik der synthetischen Produktion von gemäß vorliegender Erfindung einsetzbaren Verbindungen durch Verweis aufgenommen.
In den Ausgangsverbindungen können verschiedene Substituenten am Phenyl- oder Makrolid-Ring vorliegen, oder sie können nach der Bildung des Kondensationsprodukts nach auf dem Gebiet bekannten Verfahren der Substitution oder durch Überführung einer Gruppe in eine andere hinzugefügt werden. Wenn die Substituenten selbst reaktiv sind, können die Substituenten selbst nach auf dem Gebiet bekannten Verfahren geschützt werden. Dazu kann eine Vielzahl von allgemein bekannten Schutzgruppen eingesetzt werden. Beispiele für zahlreiche dieser möglichen Gruppen finden sich in "Protective Groups in Organic Synthesis" von T. W. Green, John Wiley and Sons, 1981. Primäre Alkohole können mit bekannten Oxidationsmitteln oxidiert werden, um Carbonsäuren oder Aldehyde zu bilden, und sekundäre Alkohole können zu Ketonen oxidiert werden. Somit können Substitutions- oder Austauschreaktionen eingesetzt werden, um eine Vielfalt von Substituenten im gesamten Molekül des Ausgangsmaterials, von Zwischenprodukten oder des Endprodukts bereitzustellen.
Beispiele für wissenschaftliche Publikationen, die Details bezüglich biologischer und synthetischer Verfahren zur Herstellung von Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung liefern, sind beispielsweise die folgenden, die allesamt durch Verweis hierin aufgenommen sind:
Sugawara et al., "Zearalenone Derivatives produced by the Fungus Drechslera Portulacae", Phytochemistry 31 (6), 1987-1990 (1992).
El Sharkawy et al., "Microbial transformation of Zearalenone. 2. Reduction, Hydroxylation, and Methylation Products", J. Org. Chem. 53, 515-519 (1988).
Agatsuma et al., "Revised structure and Stereochemistry of Hypothemycin", Chem. Pharm. Bull. 41 (2), 373-375 (1993).
Nair et al., "Metabolites of Pyrenomycetes XIII: Structure of (+) Hypothemycin, an Antibiotic Macrolide from Hypomyces trichothecoides", Tetrahedron Letters 21, 2001- 2012 (1980).
Ellestad et al., New Zearalenone Related Macrolides and Isocoumarins from an Unidentified Fungus", J. Org. Chem. 43(12), 2339-2343 (1978).
Gatenbeck Sten, "The Biosynthesis of Oxytetracycline", Biochemical and Biophysical Research Communications 6(6), 422-426 (1961/62).
Ayer et al., "Minor Metabolites of Monocillium Norinii", Phytochemistry 5, 1353-1355 (1987).
Hagler et al., "Identification of Naturally Occurring Isomer of Zearlenol Poduced by Fusarium roseum 'Gibbosum' in Rice Culture", Applied and Environmental Microbiology 37(5), 849-853 (Mai 1979).
Urry et al., "The Structure of Zearlenon", Tetrahedron Letters 27, 3109-3114 (1966).
Bollinger et al., "Vier neue Metabolite von Giberall zeae: 5-Formyl-zearalenon, 7'-Dehydrozearalenon, 8'-Hydroxy- und 8'-epi-Hydroxy-zearalenon", Helveiica Chimica Acta 55(8), 305-306 (1972).
Ayer et al., "The Isolation, Identification, and Bioassay of the Antifungal Metabolites Produced by Monocillium nordinii", Can. J. Microbiol. 26, 766-773 (1980).
Mirrington et al., "The Constitution of Radicicol", The Tetrahedron Letters 7, 365-370 (1964).
Shipchandler T. Mohammed, "Chemistry of Zearalenone and some of its Derivatives", Heterocycles 3(6), 471-520 (1975).
Kuo et al., "The resolution of (±)-Zearalenone. Determination of the Absolute Configuration of the Natural Enantiomorph", Chemical Communications, S. 761-762 (1967).
McCpra et al., "The Constitution of Monorden, an Aniibiotic with Tranquilising Action", Tetrahedron Letters 15, 869-875 (1964).

Verwendung als Kinaseinhibitoren

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind alle einfach für therapeutische Anwendungen als Kinaseinhibitoren zur Bekämpfung von kinaseabhängigen Erkrankungen bei Säugetieren zu adaptieren, insbesondere von jenen, die mit Tyrosinkinase in Zusammenhang stehen. Die Fähigkeit eines Resorcylsäure-Derivats, einen der drei Typen von Proteinkinasen gegenüber den anderen Klassen bevorzugt spezifisch zu hemmen (die drei Klassen werden nachstehend besprochen), ist einer der Faktoren, die die Umstände bestimmen, unter denen die jeweiligen Verbindungen eingesetzt werden. Tyrosinkinaseabhängige Erkrankungen sind u. a. hyperproliferative Leiden, die aufgrund von abnormaler Tyrosinkinase-Enzymaktivität initiiert werden bzw. Anhalten. Beispiele dafür umfassen Krebs, Atherosklerose und Antiangiogenese (z. B. Tumorwachstum, diabetische Retinopathie). Obwohl kaum Informationen über die Beziehung anderer Klassen von Kinasen zu spezifischen Erkrankungen zur Verfügung stehen, ist auf dem Gebiet bekannt, dass für therapeutische Zwecke einsetzbare Protein-Tvrosinkinase (PTK) hemmende Verbindungen selektiv sein sollten, was auch für die anderen Kinaseklassen gilt. Die PTK-Inhibitoren Quercetin, Genistein und Staurosporin hemmen neben Tyrosinkinasen auch zahlreiche andere Proteinkinasen und sind wegen ihrer mangelnden Spezifität stark cytotoxisch. Daher können Standardtests zur Messung der Cytotoxizität zur Identifizierung von PTK-Inhibitoren (oder Inhibitoren anderer Klassen von Kinasen) herangezogen werden, die unerwünschte Nebenwirkungen aufgrund von mangelnder Selektivität haben.
Drei allgemeine Klassen von Proteinkinasen wurden auf Basis der ihnen als Substrat dienenden Aminosäure(n) identifiziert: Kinasen, die Tyrosin phosphorylieren, Kinasen, die Tyrosin und Threonin phosphorylieren, sowie Kinasen, die Serin und Threonin phosphorylieren. Als detaillierterer Test auf Selektivität sollten Verbindungen auf ihre Fähigkeit, die Enzymaktivität einer Reihe dieser Proteinkinasen zu hemmen, getestet werden. Tyrosinspezifische Proteinkinasen werden in der Einleitung beschrieben. Beispiele für Kinasen, die Serin und Threonin phosphorylieren (die häufigste Klasse), umfassen RAF, Proteinkinase A, Proteinkinase C und TGF-β-Rezeptor. Die Kinase MEK ist ein Beispiel für Kinasen, die Tyrosin und Threonin phosphorylieren.
In der folgenden Beschreibung der Anwendungsmöglichkeiten von Kinaseinhibitoren konzentriert sich die Diskussion auf Tyrosinkinasen, da selbige jene Kinasen sind, die für den pharmazeutischen Einsatz am leichtesten verfügbar sind. Es versteht sich jedoch, dass, wenn hierin von der Verwendung einer Verbindung als Tyrosinkinase-Inhibitor die Rede ist, sich dies ebenso auf die Verwendung einer Verbindung bezieht, die für eine der anderen Kinaseklassen spezifisch ist, sofern die Spezifität cler Wirkung bekannt ist. Ob eine Resorcylsäure-Verbindung für eine bestimmte Klasse von Kinasen spezifisch ist, kann unter Verwendung der in den Beispielen beschriebenen Kinaseaktivitätstests (oder eines ansonsten identischen Tests, der die im Beispiel genannte Kinase durch eine andere ersetzt) leicht bestimmt werden. Um allzu häufige Wiederholungen zu vermeiden, betrifft die folgende Beschreibung Tyrosinkinasen als Beispiele dafür, was auch mit anderen Klassen von Kinasen erfolgen kann. Somit sind Verweise auf "Tyrosinkinase" oder "PTK" bei bestimmten Anwendungszwecken oder in bestimmten Situationen als Beispiel für die Verwendung einer für beliebige Vertreter der Kinaseklassen spezifischen Verbindung zu verstehen, sofern dies nicht anders angegeben wird oder sich aus dem Zusammenhang ergibt.
Damit Verbindungen, die PTK oder eine der anderen Kinasen hemmen, von therapeutischem Nutzen sind, sollten sie auf intakten Zellen aktiv sein. Es ist bekannt, dass PTK-Inhibitoren, die auf Basis ihrer Fähigkeit, isolierte Enzympräparate zu hemmen, identifiziert wurden, oftmals nur schwache oder keinerlei Aktivität bei der Hemmung nativer PTKs zeigen. Dieser Aktivitätsmangel beruht entweder auf der Unfähigkeit der PTK-lnhibitoren, die Zellmembran zu passieren, um die Stelle ihrer Wirkung zu erreichen, oder auf ihrer Unfähigkeit, PTKs in Zellen zu hemmen, wo hohe Konzentrationen an Adenosintriphosphat (ATP) herrschen oder andere Faktoren zum tragen kommen. Verschiedene Methoden zur Bestimmung der Aktivität von PTK-Inhibitoren gegen Wachstumsfaktorrezeptor-Tyrosinkinasen auf intakten Zellen sind einfach zugänglich. Wachstumsfaktor-Behandlung von Zellen führt zur raschen Autophosphorylierung des entsprechenden Rezeptors sowie zur Phosphorylierung der Substrate des Rezeptors, und diese Vorgänge sind unter Verwendung von Antiphosphotyrosin-Antikörpern messbar. Es können auch weitere intrazelluläre Signalisierungsvorgänge gemessen werden, einschließlich des Kalziumflusses, des Inositphosphat-Stoffwechsel und der zellulären DNA-Synthese. Schließlich muss ein therapeutisch nutzbarer PTK-Inhibitor in der Lage sein, Zellvermehrung zu blockieren, die das unerwünschte Resultat der Wirkung von Wachstumsfaktoren und leicht zu überwachen ist.
Es wird theoretisch angenommen, dass die Löslichkeit der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sowohl in Wasser als auch in schwach hydrophoben Lösungsmitteln die Wahrscheinlichkeit des Passierens der Zellmembran erhöhen. Verschiedene unlösliche Verbindungen zeigten bei in vitro Tests jedoch signifikante Kinasehemmung.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in Form der freien Säure, eines Salzes und als Hydrat eingesetzt werden. Alle Formen liegen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung. Es können auch basische Salze gebildet werden, die einfach eine praktischere Form der Verwendung darstellen; in der Praxis entspricht die Verwendung der Salzform naturgemäß der Verwendung der Säureform. Die zur Bildung der Salze einsetzbaren Basen sind beispielsweise jene, die bei Kombination mit der freien Säure pharmazeutisch annehmbare Salze bilden, d. h. Salze, deren Anionen in pharmazeutischen Dosen der Salze für den tierischen Organismus nicht toxisch sind, so dass die der freien Säure innewohnenden günstigen Eigenschaften nicht durch von den Kationen herrührende Nebenwirkungen beeinträchtigt werden. Obwohl pharmazeutisch annehmbare Salze der Säureverbindung bevorzugt werden, sind alle Salze geeignete Quellen der Form der freien Säure, selbst wenn das jeweilige Salz selbst nur als Zwischenprodukt benötigt wird, beispielsweise wenn das Salz lediglich zum Zwecke der Reinigung und Identifizierung gebildet wird oder wenn es als Zwischenprodukt zur Herstellung eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes durch Ionenaustauschverfahren dient.
Verbindungen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung, die Aktivität als spezifische Inhibitoren, wie z. B. Protein-Tyrosinkinase-Inhibitoren, zeigen, sind als Zellvermehrungshemmer zur Behandlung bestimmter Leiden, einschließlich von z. B. Psoriasis und Restenose, von therapeutischem Wert. Es wird erwartet, dass die Erfindung insbesondere zur Behandlung von Atherosklerose anwendbar sein wird. Im Zuge der Behandlung gewisser Leiden, z. B. von Atherosklerose, können bestimmte Personen mit hohem Risiko identifiziert werden, beispielsweise aufgrund von genetischen, Umwelt- oder historischen Faktoren. Verbindungen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung können zur Verhinderung oder der Verzögerung des Auftretens oder des erneuten Auftretens derartiger Leiden eingesetzt werden, oder um das Leiden auf andere Art und Weise zu behandeln.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können an einen Säugetierwirt in einer Vielzahl von Verabreichunsformen verabreicht worden, d. h. sie können mit verschiedenen pharmazeutisch annehmbaren inerten Trägern in Form von Tabletten, Kapseln, Pastillen, Pillen, Bonbons, Pulvern, Sprays, Elixieren, Sirupen, Injektionslösungen oder Augentropfen und dergleichen - je nach dem gewählten Verabreichungsweg (z. B. oral oder parenteral) - kombiniert werden. Parenterale Verabreichung umfasst in dieser Hinsicht die Verabreichung auf folgendem Weg: intravenös, intramuskulär, subkutan, intraokular, intrasynovial, transepithelial (einschließlich transdermal, ophthalmisch, sublingual und bukkal), topisch (einschließlich ophthalmisch, dermal, okular, rektal, durch Naseninhalation mittels Einblasung und Aerosol) sowie rektal systemisch.
Die aktive Verbindung (der Wirkstoff) kann beispielsweise zusammen mit einem inerten Verdünner oder mit einem zulässigen essbaren Träger oral verabreicht oder in Gelatine- Hart- oder -Weichkapseln eingeschlossen oder zu Tabletten verpresst oder direkt in Nahrungsmittel miteinbezogen werden. Zur oralen Verabreichung kann der Wirkstoff mit einem Exzipienten kombiniert und in Form von Tabletten zum Verschlucken, Lutschtabletten, Pillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirupen, Oblaten und dergleichen eingesetzt werden. Derartige Zusammensetzungen und Präparate sollten zumindest 0,1% Wirkstoff enthalten. Der in den Zusammensetzungen und Präparaten enthaltene Prozentsatz kann natürlich variieren und geeigneterweise zwischen etwa 2 und etwa 6 Gew.-% der Einheit betragen. Die Menge an Wirkstoff in derartigen therapeutisch nützlichen Zusammensetzungen ist eine solche, dass eine geeignete Dosierung erzielt wird. Bevorzugte Zusammensetzungen oder Präparate gemäß vorliegender Erfindung werden so hergestellt, dass eine orale Dosiseinheitform zwischen etwa 1 und etwa 1.000 mg Wirkstoff enthält.
Die Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und dergleichen können auch Folgendes enthalten: Bindemittel, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon, Tragantgummi, Akaziengummi, Saccharose, Maisstärke oder Gelatine; Exzipienten, wie z. B. Kalziumphosphat, Natriumcitrat und Kalziumcarbonat; Auflösungsbeschleuniger, wie z. B. Maisstärke, Kartoffelstärke, Maniokstärke, bestimmte komplexe Silikate, Alginsäure und dergleichen; Schmiermittel, wie z. B. Natriumlaurylsulfat, Talk und Magnesiumstearat; Süßungsmittel, wie z. B. Saccharose, Lactose oder Saccharin; oder Geschmacksstoffe, wie z. B. Pfefferminz, Wintergrünöl oder Kirschgeschmack. Fest Zusammensetzungen einer ähnlichen Art werden auch als Füller in gefüllten Weich- und Hartkapseln aus Gelatine eingesetzt; bevorzugte Materialien in diesem Zusammenhang umfassen auch Lactose oder Milchzucker sowie hochmolekulare Polyethylenglykole. Wenn die Dosierungsform eine Kapsel ist, kann diese zusätzlich zu Materialien der obigen Typen einen flüssigen Träger enthalten. Verschiedene andere Materialien können als Überzüge oder zur sonstigen Modifizierung der physischen Form der Dosierungseinheit vorgesehen sein. Beispielsweise können Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Schellack, Zucker oder beidem beschichtet sein. Ein Sirup oder Elixier kann den Wirkstoff, Saccharose als Süßungsmittel, Methyl- und Propylparabene als Konservierungsmittel, einen Farbstoff, Geschmacksstoffe, wie z. B. Kirsch- oder Orangengeschmack, Emulgatoren und/oder Suspendiermittel, sowie Verdünner, wie z. B. Wasser, Ethanol, Propylenglykol, Glycerin und verschiedene ähnliche Kombinationen enthalten. Selbstverständlich sollte jegliches zur Herstellung beliebiger Dosierungsformen verwendete Material pharmazeutisch rein und in den eingesetzten Mengen im Wesentlichen nicht toxisch sein. Außerdem kann der Wirkstoff in Retard- Präparate und -Formulierungen eingemischt werden.
Der Wirkstoff kann auch parenteral oder intraperitoneal verabreicht werden. Für die parenterale Verabreichung können Lösungen in Sesam- oder Erdnussöl oder in Propylenglykol, sowie sterile wässrige Lösungen der entsprechenden, zuvor aufgelisteten, wasserlöslichen Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze eingesetzt werden. Derartige wässrige Lösungen sollten gegebenenfalls geeignet gepuffert sein und der flüssige Verdünner zunächst mit ausreichenden Mengen an Kochsalzlösung oder Glucose isotonisch gestellt werden. Lösungen des Wirkstoffs in Form einer freien Base oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes können in Wasser hergestellt werden, dass mit einem geeigneten Tensid, wie z. B. Hydroxypropylcellulose, vermischt wurde. Es kann auch eine Dispersion in Glycerin, flüssigen Polyethylenglykolen und Gemischen davon, sowie in Ölen hergestellt werden. Unter normalen Lagerungs- und Einsatzbedingungen enthalten diese Präparate ein Konservierungsmittel, um die Vermehrung von Mikroorganismen zu verhindern. Diese speziellen wässrigen Lösungen sind besonders für intravenöse, intramuskuläre, subkutane und intraperitoneale Injektionen geeignet. In diesem Zusammenhang sind die sterilen wässrigen Medien allesamt leicht durch Standardverfahren zugänglich, die Fachleuten auf dem Gebiet allgemein bekannt sind.
Die zur Injektion geeigneten pharmazeutischen Formen umfassen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver zur unmittelbaren Herstellung von sterilen Injektionslösungen oder -dispersionen. In allen Fällen muss die Form steril und in einem Ausmaß fließfähig sein, dass sie leicht mit einer Spritze aufgezogen werden kann. Sie muss unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung stabil und gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen konserviert sein. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium sein, wie z. B. Wasser, Ethanol, Polyol (z. B. Glycerin, Propylenglykol, flüssiges Polyethylenglykol und dergleichen), ein geeignetes Gemisch davon und Pflanzenöl. Die geeignete Fließfähigkeit kann beispielsweise durch Verwendung eines Überzugs, wie z. B. Lecithin, durch Beibehaltung der erforderlichen Teilchengröße im Falle von Dispersionen und durch Verwendung von Tensiden gewährleistet werden. Die Verhinderung des Einflusses von Mikroorganismen kann mithlife verschiedener antibakterieller und antifungaler Mittel erfolgen, wie z. B. Parabenen, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und dergleichen. In vielen Fällen wird bevorzugt, Isotoniermittel miteinzubeziehen, wie z. B. Zucker oder Natriumchlorid. Verzögerte Absorption der Injektionszusammensetzungen kann durch Verwendung von die Absorption verzögernden Mitteln erzielt werden, wie z. B. Aluminiummonostearat und Gelatine.
Sterile Injektionslösungen werden durch Einmischen des Wirkstoffs in der erforderlichen Menge in das geeignete Lösungsmittel mit verschiedenen cler oben erwähnten anderen Bestandteile, je nach Bedarf, gefolgt von Sterilfiltration hergestellt. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch Einmischen des sterilen Wirkstoffs in ein steriles Vehikel hergestellt, welches das grundlegende Dispersionsmedium und die erforderlichen übrigen Bestandteile, ausgewählt aus den zuvor erwähnten, enthält. Im Falle von sterilen Pulvern zur Herstellung von sterilen Injektionslösungen sind bevorzugte Herstellungsverfahren Vakuumtrocknung und Gefriertrocknung, die ein Pulver des Wirkstoffs plus jeglicher zusätzlich gewünschter Bestandteile aus der zuvor sterilfiltrierten Lösung davon liefern.
Zur topischen Verabreichung werden verdünnte, wässrige Lösungen (üblicherweise mit einer Konzentration von etwa 0,1 bis 5%), die ansonsten den obigen parenteralen Lösungen ähnlich sind, in Behältern hergestellt, die zur tropfenweisen Verabreichung an das Auge geeignet sind.
Die therapeutischen Verbindungen der vorliegenden Erfindung können einem Säugetier alleine oder in Kombination mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern verabreicht werden. Wie zuvor erwähnt werden die relativen Anteile des Wirkstoffs und des Trägers durch die Löslichkeit und chemischen Eigenschaften der Verbindung, den gewählten Verabreichungsweg und die übliche pharmazeutische Praxis bestimmt.
Die Dosierung der vorliegenden Therapeutika, die bestens für die Prophylaxe oder Behandlung geeignet sind, variiert je nach Art der Verabreichung, der jeweils gewählten Verbindung und den physiologischen Eigenschaften des jeweils behandelten Patienten. Im Allgemeinen werden anfangs schwache Dosen eingesetzt, die falls erforderlich in kleinen Schritten erhöht werden, bis unter den gegebenen Umständen die optimale Wirkung erzielt wird. Die therapeutische Dosis beim Menschen beträgt, basierend auf physiologischen Studien bei Ratten, etwa 0,01 mg bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht und Tag oder etwa 0,4 mg bis etwa 10 g und mehr, obwohl sie in Form von mehreren unterschiedlichen Dosierungseinheiten einmal bis mehrmals pro Tag verabreicht werden kann. Orale Verabreichung erfordert höhere Dosen.
Die Verbindungen werden entweder oral oder parenteral oder topisch als Augentropfen in Dosierungen im Bereich von etwa 0,1 bis 10 mg/kg Körpergewicht und Tag in einer einzigen Dosis oder in mehreren Teildosen verabreicht. Selbstverständlich können in bestimmten Situationen je nach Ermessen des behandelnden Arztes auch Dosen außerhalb dieses Bereichs eingesetzt werden.
In einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon umfasst, liegt das Gewichtsverhältnis zwischen Träger und Wirkstoff normalerweise im Bereich von 1 : 4 bis 4 : 1, vorzugsweise 1 : 2 bis 2 : 1. In allen Fällen hängt das gewählte Verhältnis jedoch von Faktoren wie der Löslichkeit des Wirkstoffs, der angestrebten Dosis und der genauen Art der Verabreichung ab.
Nun, da die Erfindung allgemein beschrieben wurde, wird zum besseren Verständnis auf die folgenden detaillierten Beispiele Bezug genommen, die lediglich zur Illustration angeführt sind.

BEISPIELE

Beispiel 1) Herstellung von Verbindung 292

Fermentation

C292FE, eine Curvularia-Spezies, wurde in einer Petrischale, die Wachstumsmedium enthielt (Agar mit 4,0 g/l, Hefeextrakt, 10,0 g/l, Malzextrakt, 4,0 g/l, Glucose mit 0,005 ml/ml Spurenelementen), bei 28ºC und 80% r.L. gezüchtet. Das Myzel wurde mit Glasperlen in einem Röhrchen mazeriert, das 4,5 ml einer Lösung mit Glycerin und 5 0/0 Lactose enthielt, um eine homogene Suspension zu bilden. Ein 250 ml Erlenmeyerkolben, der 30 ml Saatmedium (20,0 g/l, Glucose, 15,0 g/l Pharmamedia, 3,0 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,03 g/l, ZnSO&sub4;·7H&sub2;O, 4,0 g/l CaCO&sub3;, 5,0 g/l, Hefeextrakt und H&sub2;O auf 1 l) enthielt, wurde mit 1-2 ml des mazerierten Myzels beimpft. Der Saatkolben wurde auf einer Umlaufschüttelmaschine bei 28ºC 2d lang bei 250 U/min mit einer Amplitude von 50 mm inkubiert.
1 ml-Allquoten wurden aus dem Saatkolben in 30 ml Fermentationsmedium (60,0 g/l Mannit, 12,5 g/l, Sojamehl, 2,5 g/l, Citronensäure, 0,5 g/l, Hefeextrakt und H&sub2;O auf 1 l) mit pH 7,0 in 250 ml Erlenmeyerkolben übergeführt und 5-6d lang auf einer Umlaufschüttelmaschine unter ähnlichen Bedingungen inkubiert.

Extraktion

In diesem Beispiel wurden 15 l Fermentationslösung in 250 ml-Schüttelflaschen bereitgestellt, wobei jede Flasche 30 ml Kulturlösung enthielt. Eine Aliquote von etwa 15 ml Ethylacetat wurde jeder Flasche innerhalb 1 min nach Entnahme aus dem Schütteltablett zugesetzt. Der Inhalt aller Flaschen wurde anschließend vereinigt und das Myzel aus der Flüssigkeit mittels Nutschen durch ein Polypropylenfilter abfiltriert. Das Myzel wurde in 2 l Ethylacetat aufgenommen und kurz homogenisiert, um die Zellen zu zerstören. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat aufbewahrt. Dieser Vorgang wurde weitere drei Mal wiederholt. Die wässrige Phase wurde in einem Scheidetrichter mit 10 l Ethylacetat getrennt extrahiert. Die Ethylacetatphasen vom Myzel und der wässrigen Extrakte wurden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Nach Entfernung des Lösungsmittel mittels Rotationsverdampfer wurden die erhaltenen Rückstände an einer Vakuumpumpe über Nacht getrocknet. Es wurden 2,565 g Rohextrakt erhalten.

CPC-Fraktionierung

Der Rohextrakt wurde einer CPC-Fraktionierung auf einem Hochgeschwindigkeits-Gegenstrom-Chromatographen von PC, Inc., der eine "Tripple"-Spiralsäule enthielt, unterzogen. Ein Volumsverhältnis zwischen n-Hexan, Ethylacetat, Methanol und Wasser von 1 : 3 : 3 : 3 wurde zusammengemischt und über Nacht ruhen gelassen. Die untere Phase wurde als Stationäre Phase in die CPC-Säule gepumpt. Die obere Phase wurde als mobile Phase verwendet. Die Säule wurde mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 1.040 U/min und einer Durchflussgeschwindigkeit von 3 ml/min betrieben. Die injizierte Menge betrug 400 mg Rohextrakt, gelöst in 5 ml oberer und 5 ml unterer Phase. Ein Photodiodenarray-Detektor detektierte die Metaboliten bei 270 nm. Ein aktiver Metabolit eluierte bei 96 bis 114 min zusammen mit einem inaktiven Isomer. Diese Fraktionen wurden mit jenen aus fünf weiteren CPC-Fraktionierungen vereinigt, um 75,6 mg des Gemischs der beiden Metaboliten zu erhalten.

HPLC-Fraktionierung

Das oben erhaltene Gemisch wurde HPLC-Fraktionierung unter den folgenden Bedingungen unterzogen: analytische C&sub1;&sub8;-Säule (8 · 100 mm, Waters, Novapak); Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min. 0,5 mg gelöst in 10 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) pro Injektion; bei 270 nm verfolgt; Anfangsbedingungen: 70% Wasser/30% Acetonitril zu 100 % Acetonitril innerhalb von 80 min als linearer Gradient; Peak 1 (inaktiver Metabolit) eluierte bei 16,90 min. und Peak 2 (aktiver Metabolit) eluierte bei 18,74 min.

Umwandlung und Trennung der Isomere

C292FE produzierte zwei Metaboliten, die sich nur in der Geometrie einer der beiden Doppelbindungen im Makrozyklus unterschieden. 167 mg, die aus der CPC-Fraktionierung erhalten worden waren, wurden in DMSO in einer Konzentration von 1 mg/10 ml gelöst. Aliquoten von 50 ml (5 mg) wurden anschließend mittels HPLC (Resolve 25 cm · 100 cm; 5 ml) fraktioniert, um die Isomeren zu trennen. Die Anfangsbedingungen der Säule waren 35% Methanol/65% Wasser. Ein linearer Gradient innerhalb von 25 min zur Endkonzentration von 90% Methanol/10% Wasser wurde bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 8 ml/min angelegt. Unter diesen Bedingungen eluierte das trans-Isomer (inaktiv) bei 11,3 min. gefolgt vom cis-Isomer (aktiv) bei 12,2 min. jeder Peak wurde getrennt gesammelt und mittels Rotationsverdampfer getrocknet. Die erste Runde von HPLC-Fraktionierungen lieferte 11,7 mg des cis-Isomers und 63 mg des trans-Isomers. Das cis-Isomer wurde mittels ¹H-NMR-Spektroskopie auf Reinheit untersucht, wahrend das trans-Isomer in einer Konzentration von 5 mg/1,5 ml in Methanol gelöst wurde. Diese Lösung wurde in einen Quarzbehälter eingefüllt und 35 min lang mit UV- Licht bestrahlt (Photochemischer Reaktor von Rayonet mit Niederdruck-Quecksilberdampflampe). Nach der Bestrahlung wurde die Lösung mittels Rotationsverdampfer getrocknet, in DMSO resuspendiert (1 mg/10 ml) und einer weiteren Runde von HPLC- Fraktionierungen unter den oben beschriebenen Bedingungen unterzogen. Dieses Verfahren wurde wiederholt, bis das gesamte trans-Isomer aufgebraucht war. Die Gesamtausbeute an cis-Isomer betrug 24 mg. Die vollständige Struktur dieser Verbindung (C292) ist nachstehend angegeben.

Beispiel 2) Hemmung der Proteinkinase-Enzymaktivität durch Verbindung 292

Die Stimulierung der Zellvermehrung durch Wachstumsfaktoren wie PDGF, FGF und EGF hängt von ihrer Induktion der Autophosphorylierung der Tyrosinkinasen des jeweiligen Rezeptors ab. Daher steht die Fähigkeit eines PTK-Inhibitors, die durch diese Wachstumsfaktoren induzierte Zellvermehrung zu hemmen, steht in direktem Zusammenhang mit seiner Fähigkeit, die Rezeptor-Autophosphorylierung zu blockieren. Zur Messung der β-PDGF-Rezeptor-Autophosphorylierung wurde die Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zelllinie HRS eingesetzt, die bearbeitet worden war, um die für Humanβ-PDGFR kodierende cDNA überzuexprimieren. Diese Zellen wurden mit 10.000 Zellen/Napf in Mikrotiterplatten (96-Napf-Platten von Falcon) ausgesät und bei 37ºC in RPMI (Gibco BRL) zusammen mit 10% Rinderfötenserum 3d lang inkubiert, wonach Konfluenz erreicht war. Das Medium wurde aus den Näpfen entfernt, durch 100 ml serumfreies RPMI ersetzt, und die Inkubation wurde bei 37ºC 18 h lang fortgesetzt. Verbindungen (0,01 bis 30 pM) wurden den Näpfen 15 min vor der Zugabe von PDGF BB (100 ng/ml) zugesetzt, und die Inkubation wurde bei 37ºC 10 min lang fortgesetzt. Das Medium wurde abgegossen, 50 ml frisch zubereiteter Lysepuffer (20 mM Tris mit pH 7,3, 150 mM NaCl, 1 Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mM Natriumorthovanadat, 10 mg/ml Aprotinin und 10 mg/ml Leupeptin) wurde jedem Napf zugesetzt, und die Platte wurde heftig geschüttelt, um Zelllysate zu erzeugen. Die Lysate wurden anschließend mittels Zentrifugation bei 2.600 U/min für 10 min geklärt, gefolgt von ihrer Analyse.
In einer getrennten Mikrotiterplatte wurde der gegen die extrazelluläre Domäne des β- PDGF-Rezeptors gerichtete monoklonale Antikörper 1B5B11 durch Inkubation von 0,5 mg Antikörper pro Napf bei 4ºC innerhalb von 18 h in 23 mM Tris mit pH 8,0, 68 mM NaCl, 14 mM Ammoniumbicarbonat und 0,02% Natriumazid immobilisiert. Nach der Antikörper-Immobilisierung wurden die Näpfe mit 25 mM N-(2-Hydroxyethyl)piperazino-N¹-(2-ethansulfonsäure) (HEPES) mit pH 7,6, 100 mM NaCl und 0,2% Tween 20 blockiert, worauf unmittelbar die Zugabe von Zelllysat folgte, das zuvor in Bindungspuffer 1 : 2 verdünnt worden war (Blockierpuffer mit 0,3% Gelatine). Das Zelllysat wurde mit dem immobilisierten Antikörper gegen β-PDGF-Rezeptor 2 lang bei Raumtemperatur inkubiert und die Näpfe dreimal mit 200 ml Waschpuffer (PBS, 0,01% Tween 20) gewaschen. Um das Ausmaß an Phosphorylierung des β-PDGF-Rezeptors zu messen, wurde ein Anti-Phosphotyrosin-Kaninchenantikörper von Upstate Biotechnology, Inc. (UBI) in einer Konzentration von 1,25 mg/ml zugesetzt und 1 h lang bei 37ºC inkubiert. Nach Entfernung des Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers wurden die Platten mit an Meerrettich-Peroxidase konjugiertem Anti-Kaninchen-Ziegen-IgG (Boehringer Mannheim) in einer Verdünnung von 1 : 1000 inkubiert, gefolgt von der Zugabe von Peroxidase-Substrat (ABTSTM). Die Produktbildung wurde bei 650 nm unter Verwendung eines Mikrotiterplattenlesers (Molecular Devices) verfolgt.
Die EGF-Rezeptor-Autophosphorylierung wurde in MDA MB 468-Zellen (ATCC Nr. HTB 132) gemessen, einer Human-Brusttumor-Zelllinie, die den EGF-Rezeptor überexprimiert. Diese Zellen wurden in 6-Napf-Platten bis zur Konfluenz gezüchtet und in serumfreiem "Dulbeccos Moditied Eagle Medium" (DMEM) 18 h lang inkubiert. Die Zellen wurden bei 37ºC 15 min lang verschiedenen Konzentrationen der Verbindungen und anschließend 10 min lang EGF (100 ng/ml) ausgesetzt. Die Zellen wurden abgeschabt und Lysate im gleichen Puffer wie für die HR5-Zellen hergestellt, gefolgt von Fraktionierung mittels herkömmlicher SDS-PAGE und Western Blot-Analyse. Dazu wurden die Proteine auf Nitrocellulose übertragen und die Membran in Tris-Puffer-Kochsalzlösung mit pH 7,0, 0,1 Wo Tween 20, 5% Trockenmilch, blockiert. Die Membran wurde mit Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (UBI, 1 ug/ml) in Bindepuffer (TBS, 0,1% Tween 20; 1% Trockenmilch) 2 h lang bei Raumtemperatur geblottet. Detektion erfolgte unter Verwendung eines an Meerrettich-Peroxidase konjugierten Anti-Kaninchen-Ziegen-IgG (Boehringer Mannheim). Der Blot wurde unter Verwendung eines Chemolumineszenz-Systems (Amersham) entwickelt.
Zur Messung der FGF-Rezeptor 1-Autophosphorylierung wurde die Human-FGF-Rezeptor 1-cDNA gemäß Standardtechniken in CHO-Zellen stabil überexprimiert. Diese Zellen wurden in RPMI mit 10% Rinderfötenserum bis zur Konfluenz gezüchtet, das Medium wurde durch serumfreies RPMI ersetzt und die Inkubation 18 h lang fortgesetzt, gefolgt von Stimulierung mit ßFGF (75 ng/ml) für 10 min bei 37ºC in Abwesenheit oder Gegenwart von PTK-Inhibitoren in einem Konzentrationsbereich von 0,1 bis 30 pM. Zelllysate wurden unter denselben Bedingungen wie zuvor für den EGF-Rezeptor-Test beschrieben hergestellt. Die Lysate wurden mit einem gegen die extrazelluläre Domäne des FGF-Rezeptors 1 gerichteten monoklonalen Antikörper (hergestellt von COR Therapeutics, South San Francisco, CA, USA) inkubiert, und der immungefällte Rezeptor wurde wie zuvor für den EGF-Rezeptor beschrieben SDS-PAGE und Western Blot-Analyse mit Anti-Phosphotyrosin-Antikörpern unterzogen.
Wie in Fig. 1 gezeigt blockierte Verbindung 292 wirksam die β-PDGF-Rezeptor-Autophosphorylierung mit einer IC&sub5;&sub0; von 6,2 nM, und bei Konzentrationen von über 200 nM wurde vollständige Hemmung beobachtet. Diese Ergebnisse wurden durch SDS-PAGE und Western Blot-Analyse von HR5-Zelllysaten unter Verwendung von Anti-Phosphotyrosin-Antikörpern bestätigt (Daten nicht dargestellt). Staurosporin ist der wirksamste bereits beschriebene PDGF-Rezeptor-Tyrosininase-Inhibitor. Im direkten Vergleich erwies sich 292 als 10fach wirksamer als Staurosporin und 45fach wirksamer als das Staurosporin-Analog K252a (siehe nachstehende Tabelle 2). Diese Ergebnisse zeigen, dass 292 ein höchst wirksamer Inhibitor der PDGF-Rezeptor-Autophosphorylierung in intakten Zellen ist, was darauf hinweist, dass diese Verbindung in vivo aktiv ist und dass therapeutische Konzentrationen leicht ermittelbar sein sollten.
Zur Ermittlung, ob 292 die PDGF-Rezeptor-Tyrosinkinase selektiv hemmt, wurde ihre Wirkung auf die eng verwandten EGF- und FGF-Rezeptor-Tyrosinkinasen bestimmt. Überraschenderweise wurde sogar bei hohen Konzentrationen von 292 von 30 uM keine nachweisbare Hemmung von EGF oder FGF festgestellt, während der EGF-Rezeptor von K252a (IC&sub5;&sub0; = 1 mM) gehemmt wurde (Tabelle 2).
Die src-PTK-Familie ist mit den Rezeptor-PTKs verwandt, da diese Proteine 60 bis 80% Aminosäuresequenz-Identität in ihren enzymatischen Tyrosinkinase-Domänen zeigen und ebenfalls die intrazelluläre Signalisierung mediieren, die zur Zeilvermehrung führt. Anders als die Rezeptor-PTKs enthalten die src-Proteine keine extrazelluläre oder Transmembran-Domäne und fungieren daher nicht direkt als Rezeptoren für extrazelluläre Stimuli. Um die Spezifität von 292 weiter zu untersuchen, wurde ihre Fähigkeit zur Hemmung von rekombinantem c-src (UBI, Katalog-Nr. 14-117) bestimmt. Zur Anpassung dieses Tests an ein 96-Napf-Mikrotiterplatten-Format wurden jedem Napf 0,5 mg src-Substrat Peptid-2 (UBI, Katalog-Nr. 12-140) in 23 mM Tris mit pH 8,0, 68 mM NaCl, 14 mM Ammoniumbicarbonat und 0,01% Natriumazid zugesetzt. Nach der Peptid-Immobilisierung wurden die Näpfe gewaschen und anschließend mit 25 mM HEPES mit pH 7,6, 100 mM NaCl, 0,2% Tween 20 blockiert. Die Kinasereaktion wurde durch Zugabe von 100 ml Reaktionsgemisch, das die 0,03 bis 30 mM Testverbindung, 50 mM ATP und 10 Einheiten c-src in 50 mM Tris mit pH 7; 25 mM MnCl&sub2;; 5 mM MnCl&sub2;; 0,05 mM Na&sub3;VO&sub4;; 100 mM HEPES mit pH 7; 5% Glycerin und 0,05% Nonylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40) enthielt. Nach 20-minütiger Inkubation bei 37ºC wurden die Reaktionen durch Zugabe von 10 ul 50%iger Essigsäure gestoppt, die Näpfe gewaschen und Anti-Phosphotyrosin-Antikörper dazu verwendet, das tyrosin-phosphorylierte Substrat unter denselben Bedingungen wie zuvor für die Bestimmung des phosphorylierten PDGF-Rezeptors beschrieben zu detektieren. Verbindung 292 hemmte src-Kinase mit einer IC&sub5;&sub0; von 1,0 uM, was eine 160fach höhere Konzentration darstel Ite als jene, die zur Hemmung der PDGF-Rezeptor-Autophosphorylierung erforderlich war. Andererseits blockierten Staurosporin und K252a die src-Kinase-Aktivität mit IC&sub5;&sub0;-Werten von 70 nM bzw. 20 nM. Diese Ergebnisse zeigen, dass, während 292 hochselektiv die PDGF-Rezeptor-Kinase-Aktivität hemmt, Staurosporin und K252a in gleichem oder sogar stärkerem Ausmaß die src-Kinase-Aktivität hemmen.
Trotz der Tatsache, dass Staurosporin wirksam Rezeptor-Kinasen hemmt, wurde Staurosporin ursprünglich entdeckt, weil es wirksam die Proteinkinase C-Aktivität hemmte. Das zeigt, dass Proteinkinase-Inhibitoren ein breites Aktivitätsspektrum gegen eine Vielzahl von Tyrosinkinasen und auch gegen die weitschichtiger verwandten Serin/Threonin-Proteinkinasen aufweisen können. Um die Möglichkeit, dass 292 auch Serin/Threonin-Proteinkinasen hemmt, zu untersuchen, wurden unter Verwendung von UBIs nichtradioaktivem Kinasetest Protein-Kinase A- (PKA-) und Protein-Kinase C- (PKC-) Tests unter den vom Hersteller angeführten Bedingungen durchgeführt (UBI, Katalog-Nr. 17- 112). Verbindung 292 wurde mit Staurosporin und K252a verglichen, indem jede dieser Verbindungen über einen Konzentrationsbereich von 0,025 bis 40 uM getestet wurden. Wie in Tabelle 2 angegeben erzielte Verbindung 292 in einer Konzentration von 40 uM, was mehr als das 6000fache der zur Hemmung der PDGF-Rezeptor-Kinaseaktivität erforderlichen Konzentration darstellt, weder 50%ige Reduktion der PKA-Aktivität noch der PKC-Aktivität. K252a erwies sich als wirksamster Inhibitor dieser Serin/Threonin-Kinasen mit einer IC&sub5;&sub0; von 70 nM für PKA und 100 nM für PKC, während Staurosporin beide Kinasen mit einer IC&sub5;&sub0; von 70 bis 80 nM hemmte. Diese Ergebnisse zeigen, dass, während gewisse Kinaseinhibitoren wie Staurosporin und K252a Selektivität vermissen lassen, 292 mehr als 100fach selektiver für PDGF-Rezeptor ist als für andere Rezeptor- Tyrosinkinasen, src-Kinasen und Serin/Threonin-Kinasen. Eine derartige Selektivität erhöht das therapeutische Potenzial von 292 für die Behandlung von Krankheiten, von denen angenommen wird, dass sie zumindest teilweise von PDGF mediiert werden, wie z. B. Atherosklerose, bestimmte Formen von Krebs, Glomerulonephritis und auf Gefäßplastik folgende Restenose, beträchtlich. Tabelle 2 Hemmung der Proteinkinase-Aktivität IC&sub5;&sub0; [uM]
¹ NB = nicht bestimmt

Hemmung der Zellvermehrung durch 292

Bei der Bestimmung des potenziellen therapeutischen Nutzens eines PTK-Inhibitors ist es wichtig, die Fähigkeit des Inhibitors aufzuzeigen, die Zellvermehrung als Reaktion auf einen Wachstumsfaktor zu blockieren, der an der Mediierung eines proliferativen Leidens beteiligt ist. Da sich in der Literatur zahlreiche Berichte finden, die eine Beteiligung von PDGF an Erkrankungen wie Glomerulonephritis, Krebs, Atherosklerose und Restenose implizieren, haben die Anmelder 292 auf ihre Fähigkeit getestet, PDGFinduzierte Zellvermehrung zu hemmen. Eine menschliche Primärfibroblasten-Zelllinie (HS68) (ATCC) wurde in 96-Napf-Schalen mit 150.000 Zellen pro Napf in einem Medium ausplattiert, das 10% Rinderfötenserum in DMEM enthielt. Die Zellen wurden bei 37ºC 7 bis 10 d lang inkubiert, wonach sie konfluent und im Ruhezustand vorlagen. Verbindung 292 wurde in einem Konzentrationsbereich von 5 bis 120 nM zugesetzt; 30 min später wurden die Zellen durch Zugabe von 50 ng/ml PDGF BB stimuliert, und die Inkubation wurde bei 37ºC 18 h lang fortgesetzt. Um das Ausmaß der Zeilvermehrung zu bestimmen, wurden 2 mCi [³H]-Thymidin jedem Napfzugegeben und die Inkubation weitere 5 h lang fortgesetzt. Die Zellen wurden anschließend mit 5%iger kalter Trichloressigsäure (TCA) gewaschen, in 0,2 n NaOH, 0,1% SDS, solubilisiert und die Menge an aufgenommenem [³H]-Thymidin wurde bestimmt. Routinemäßig war bei mit PDGF BB behandelten Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen ein 5- bis 10facher Anstieg der Thymidinaufnahme zu beobachten (Daten nicht dargestellt). Wie in Fig. 2 gezeigt blockierte Verbindung 292 die PDGF BB-induzierte Thymidinaufnahme um 50% bei 16 nM und hemmte bei 120 nM die Mitogenizität vollständig. Diese Konzentrationen von 292 korrelieren sehr eng mit jenen, die zum Blockieren der PDGF-Rezeptor-Phosphorylierung in HR5-Zellen erforderlich waren.
Um zu bestimmen, ob 292 nichtspezifische antiproliferative Wirkung zeigt oder cytotoxisch ist, wurde ihre Wirkung auf die Vermehrung von Human-Zelllinien (z. B. HS68, HS 27, CCD18 und WS1; erhalten von der ATCC) unter Standard-Gewebekulturbedingungen bestimmt. Zellen wurden in Standard-Gewebekulturmedium, das 10% Rinderfötenserum enthielt, mit 3,5 · 10³ Zellen pro Napf in einer 96-Napf-Mikrotiterplatte (Falcon) in Abwesenheit oder Gegenwart von 292, Staurosporin oder K252a in einem Konzentrationsbereich von 0,01 bis 30 uM spärlich ausgesät. Die Zellen wurden anschließend unter Standard-Gewebekulturbedingungen 96 h lang sich vermehren gelassen, wonach sie mit 3, 3%igem Glutaraldehyd fixiert, mit H30 gewaschen und mit 0,05%igem Methylenblau (Sigma) eingefärbt wurden. Nach dem Einfärben wurden die Zellen gewaschen, der Farbstoff mit 3%iger HCl eluiert und das Absorptionsvermögen bei 665 nm unter Verwendung eines Plattenlesers (Molecular Devices) aufgezeichnet. Der Prozentsatz der Hemmung der Zellvermehrung wurde durch Vergleich des in Gegenwart der Verbindung beobachteten Absorptionsvermögens mit dem in Abwesenheit von Inhibitor beobachteten Absorptionsvermögen bestimmt. Wie in Tabelle 3 angegeben war nach der Behandlung mit 292 in Konzentrationen von bis zu 10 uM keine Zunahme der Zellvermehrung irgendeiner der getesteten Zelllinien zu beobachten, und bei 30 uM erfolgte nur eine leichte Zunahme (10-20%). Im Gegensatz dazu blockierte Staurosporin die Vermehrung aller Zelllinien bei 10 nM vollständig, und K252a hemmte die Zellvermehrung im Konzentrationsbereich von 1 bis 12 uM um 50%, wobei CCD 18-Zellen die empfindlichsten waren. Diese Ergebnisse zeigen, dass Staurosporin, das ein nichtspezifischer Proteinkinase-Inhibitor ist, in denselben Konzentrationen, die zur Hemmung der Kinaseaktivität erforderlich sind, auch nichtspezifische antiproliferative oder cytotoxische Wirkung zeigt. Andererseits zeigte 292 in einem Konzentrationsbereich, der das 1000fache des zum Blockieren der PDGF-induzierten Mitogenese dieser Zellen erforderlichen darstellt, unter Standard-Gewebekulturbedingungen keinerlei Wirkung auf die Vermehrung von HS68-Zellen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Hemmung der PDGF-Rezeptor-Kinase-Aktivität zur Erzielung einer therapeutischen Wirkung mit 292-Konzentrationen erfolgen sollte, die veit unter jenen liegen, die cytotoxische Wirkung zeigen. Tabelle 3 Hemmung der Zellvermehrung unter normalen Gewebekulturbedingungen IC50 [uM]
Es versteht sich, dass die Erfindung nicht auf die hierin beschriebenen spezifischen Ausführungsformen beschränkt ist, sondern dass verschiedene Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der folgenden Ansprüche abzuweichen.

Claims

1. Verwendung einer nachstehend definierten Verbindung zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Hemmung einer Protein-Kinase, Folgendes umfassend:

das In-Kontakt-Bringen einer eine Protein-Kinase enthaltenden Körperflüssigkeit eines Säugetiers mit der Verbindung der Formel:

worin:

R&sub1; H, eine gegebenenfalls halogenierte, unverzweigte oder verzweigte C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppe oder eine C&sub1;-C&sub4;-Alkanoylgruppe ist;

R&sub2; H, eine gegebenenfalls halogenierte, unverzweigte oder verzweigte C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppe oder eine C&sub1;-C&sub4;-Alkanoylgruppe ist;

R&sub3; und R&sub4; gemeinsam eine cis-Doppelbindung oder -O- darstellen oder R&sub3; und R&sub4; jeweils unabhängig voneinander H oder OR darstellen;

R&sub5; =O, =S oder -H, -OR ist;

R&sub6; und R&sub7; gemeinsam eine Doppelbindung oder -O- darstellen oder R&sub6; und R&sub7; jeweils unabhängig voneinander H oder OR darstellen;

R&sub8; und R&sub9; gemeinsam eine Doppelbindung oder -O- darstellen oder R&sub8; und R&sub9; jeweils unabhängig voneinander H oder OR darstellen; und

alle R jeweils unabhängig von den anderen H, eine gegebenenfalls halogenierte, unverzweigte oder verzweigte C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppe oder eine C&sub1;-C&sub4;-Alkanoylgruppe darstellen.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin R&sub1; für CH&sub3; steht.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin R&sub2; für H steht.

4. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin R&sub3; und R&sub4; eine Doppelbindung darstellen.

5. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin R&sub5; für =O steht.

6. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin R&sub6; und R&sub7; jeweils für OH stehen.

7. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin R&sub8; und R&sub9; eine Doppelbindung darstellen.

8. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Kohlenstoff an Position 8 eine S-Konfiguration aufweist und der Kohlenstoff an Position 9 S-Konfiguration aufweist.

9. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Kohlenstoff an Position 3 S-Konfiguration aufweist.

10. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Körperflüssigkeit Blut oder eine Blutfraktion ist.

11. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Kinase eine Tyrosin-Kinase ist.

12. Verwendung nach Anspruch 11, worin die Tyrosin-Kinase PDGF-Rezeptor ist.

13. Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, worin das Verfahren Weiters das Messen der Tyrosin-Kinase-Aktivität in der Körperflüssigkeit in Gegenwart oder Abwesenheit des lnhibitors und das Korrelieren der Kinase-Aktivität mit der Tvrosin-Kinase-Konzentration oder dem Substrat für Tvrosin-Kinase in der Zusammensetzung umfasst.

14. Vervveng nach einem der vorangegange!!gangenen Ansprüche, worin das In-Kontakt- Bringen in vivo erfolgt.

15. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zum Regulieren einer von Kinase abhängigen Erkrankung, umfassend das Verabreichen einer die von Kinase abhängige Erkrankung bekämpfenden Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 an ein Säugetier, das an einer von Kinase abhängigen Erkrankung leidet.