DE69510696T2

DE69510696T2 - 2-(2-amino-3-methoxyphenyl)-4-oxo-4h-(1)-benzopyran für die behandlung von proliferativer erkrankungen

Info

Publication number: DE69510696T2
Application number: DE69510696T
Authority: DE
Inventors: Alexander Bridges; Alan Saltiel
Original assignee: Warner Lambert Co LLC
Current assignee: Warner Lambert Co LLC
Priority date: 1995-01-24
Filing date: 1995-11-27
Publication date: 1999-12-23
Anticipated expiration: 2015-11-28
Also published as: US5525625A; EP0805807B1; CA2208075A1; DK0805807T3; EP0805807A1; JPH10512878A; MX9704649A; AU4245696A; NZ297320A; GR3031295T3; ATE181913T1; ES2137554T3; ZA96528B; WO1996022985A1; AU690400B2; DE69510696D1

Description

TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Flavonverbindung mit Hemmwirkung auf die doppeltspezifische Kinase MEK, welche folglich die Proliferation transformierter Zellen, insbesondere solcher, die durch das humane Oncogen Ras transformiert wurden, blockiert.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Krebs ist im allgemeinen eine Erkrankung des intrazellulären Signalsystems oder des Signalwandlermechanismus. Normale Zellen antworten auf zahlreiche extrazelluläre Ursachen durch Proliferation oder sonstige Änderung ihrer Stoffwechselaktivität. Das Signalwandlersystem empfängt solche Signale an der Zelloberfläche und übersetzt sie in eine Nachricht, die von der Zelle für eine nachfolgende Steuerung von Prozessen in der Cytoplasma-, Kern-, Cytoskelett- und Membranbiochemie entziffert wird. Krebs wird normalerweise durch eine Reihe von Defekten in diesen Signalproteinen hervorgerufen und resultiert aus einer Änderung entweder in ihrer ihnen innewohnenden Aktivität oder in ihren zellulären Konzentrationen. Häufig führen diese Defekte zu einem Konstitutionszustand, in welchem der Zellkern ein unangebrachtes Signal zur Proliferation empfängt. Dies kann über die verschiedensten Mechanismen erfolgen. Die Zelle kann einen Wachstumsfaktor produzieren, der eine Bindung mit seinen eigenen Rezeptoren eingeht. Dies führt zu einer autokrinen Schleife, die kontinuierlich eine Proliferation stimuliert. In den Zelloberflächen (Tyrosinkinase)-Rezeptoren können Mutationen auftreten, die in Abwesenheit eines Liganden zu einer Kinaseaktivierung führt.
Andererseits können zahlreiche Oberflächenkinasen auf der Zelloberfläche überexprimiert werden, was zu einer angebebracht starken Antwort auf ein schwaches Signal führt. Eine Mutation oder Überexpression zahlreicher intrazellulärer Signalproteine kann zu ähnlichen, in der Zelle entstehenden Pseudomitogensignalen führen. Einige der üblichsten derartigen Mutationen treten in den Genen mit Codierung für das Ras-Protein, ein bei Bindung an GTP aktiviertes und bei Bindung an GDP inaktiviertes G-Protein, auf.
Die genannten Wachstumsfaktorrezeptoren und zahlreiche andere mitogene Rezeptoren führen bei Aktivierung zu einer Umwandlung von Ras aus dem GDP-gebundenen Zustand in den GTP- gebundenen Zustand. Dieses Signal ist eine absolute Voraussetzung für die Proliferation in den meisten Zelltypen. Defekte in diesem Signalsystem, insbesondere bei der Deaktivierung des Ras·GTP-Komplexes, sind bei Krebsarten üblich und führen zur chronischen Aktivierung der beschriebenen Signalkaskade unterhalb von Ras.
Aktiviertes Ras führt seinerseits zur Aktivierung einer Kaskade von Serin/Threonin-Kinasen. Eine der Kinasengruppen, von der bekannt ist, daß sie zu ihrer eigenen Aktivierung ein aktives Ras·GTP erfordert, ist die Raf-Familie. Diese aktiviert ihrerseits Mek, die dann MAP-Kinase aktiviert. Die Aktivierung von MAP-Kinase durch Mitogene dürfte für die Proliferation von wesentlicher Bedeutung sein. Eine kontinuierliche Aktivierung dieser Kinase reicht für die Induktion einer zellulären Transformation aus. Eine Blockade der stromabwärts gerichteten Ras-Signalgebung, beispielsweise durch Einsatz eines dominanten negativen Raf-1-Proteins, kann eine Mitogenese ungeachtet einer Induktion durch Zelloberflächenrezeptoren oder oncogene Ras-Mutanten vollständig hemmen. Obwohl Ras als solches keine Proteinkinase ist, nimmt es höchstwahrscheinlich über einen Phosphorylierungsmechanismus an der Aktivierung von Raf und sonstigen Kinasen teil. Nachdem sie einmal aktiviert sind, phosphorylieren Raf und sonstige Kinasen MEK an zwei eng benachbarten Serinresten, 5218 und 5222 in Falle von MEK-1, die die Voraussetzung für eine Aktivierung von MEK als Kinase sind. MEK phosphoryliert seinerseits MAP-Kinase sowohl auf einem Tyrosin-, Y¹&sup8;&sup5;, als auch einen Threoninrest, T¹&sup8;³, die durch eine einzige Aminosäure getrennt sind. Diese doppelte Phosphorylierung aktiviert MAP-Kinase um das mindestens 100-fache, so daß sie nunmehr die Phosphorylierung einer großen Anzahl von Proteinen einschließlich einiger Transkriptionsfaktoren und sonstiger Kinasen zu katalysieren vermag. Zahlreiche dieser MAP-Kinasephosphorylierungen wirken mitogenetisch aktivierend hinsichtlich des Zielproteins, und zwar ungeachtet dessen, ob dieses eine weitere Kinase, ein Transkriptionsfaktor oder ein sonstiges zelluläres Protein ist. MEK wird auch durch einige von Raf-1 verschiedene Kinasen einschließlich MEKK aktiviert und scheint selbst eine signalhaltige Kinase zu sein. Soweit derzeit bekannt, ist MEK in hohem Maße für die Phosphorylierung von MAP-Kinase spezifisch. In der Tat wurde bis heute kein anderes Substrat für MEK als MAP-Kinase aufgefunden. MEK phosphoryliert keine Peptide auf der Basis der MAP-Kinasephosphorylierungssequenz oder phosphoryliert auch nicht denaturierte MAP-Kinase. MEK dürfte mit MAP-Kinase vor ihrer Phosphorylierung auch eine starke Assoziation eingehen. Dies legt nahe, daß eine Phosphorylierung von MAP-Kinase durch MEK eine vorherige starke Wechselwirkung zwischen den beiden Proteinen erfordern kann. Beide, dieses Erfordernis und die unübliche Spezifität von MEK, lassen vermuten, daß es in ihrem Wirkmechanismus gegenüber anderen Proteinkinasen genügend Unterschiede geben kann, so daß selektive MEK-Inhibitoren, die möglicherweise über allosterische Mechanismen und nicht über die übliche Blockade der ATP-Bindungsstelle arbeiten, aufgefunden werden können.
Diese Erfindung stellt eine Verbindung bereit, die einen hochspezifischen Inhibitor für die MEK-Kinaseaktivität darstellt. Sowohl bei Enzymtests als auch Vollzellen hemmt die Verbindung die Phosphorylierung von MAP-Kinase durch MEK und verhindert dadurch die Aktivierung der MAP-Kinase in Zellen, in denen die Ras-Kaskade aktiviert wurde. Die Ergebnisse dieser Enzymhemmung sind eine Umkehr des transformierten Phänotyps einiger Zelltypen. Die diesbezügliche Bestimmung erfolgte sowohl aufgrund der Fähigkeit der transformierten Zellen, in verankerungsunabhängiger Weise zu wachsen, als auch aufgrund der Fähigkeit einiger transformierter Zellinien zur Proliferation unabhängig von externen Mitogenen.
Die hochselektive MEK-Hemmaktivität der erfindungsgemäßen Verbindung ist aus verschiedenen Gründen überraschend. Zum ersten ist die Verbindung ein Mitglied der als Flavone bekannten Verbindungsklasse, von der zahlreiche Mitglieder nicht unterscheidende Inhibitoren einer großen Anzahl von Proteinkinasen darstellen. Somit ist der Grad an Selektivität für diese Verbindung unerwartet. So beschreiben beispielsweise Cushman et al. in "J. Med. Chem." 1991, 34 : 798- 806, Protein-Tyrosin-Kinasehemmaktivitäten für die verschiedensten Flavonoide. Zum zweiten stellen einige enge Analoge zu der erfindungsgemäßen Verbindung schlechte MEK-Inhibitoren dar. Schließlich wurde bislang noch nicht über selektive MEK-Inhibitoren berichtet. So beschreiben beispielsweise Cunningham et al. in "Anti-Cancer Drug Design" 1992, 7 : 365- 84, Oxford University Press, 1992, die Aktivität verschiedener Flavone einschließlich eines Stellungsisomers zu der erfindungsgemäßen Verbindung, die (nur) eine geringe Selektivität zeigten.
Weiterhin ist auch die hochselektive Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindung auf die Mitogenese unerwartet. MAP-Kinase wird durch zahlreiche, nichtmitogene und nichtmitogene Zellantworten vermittelnde Zellreize aktiviert. So führt bei spielsweise eine Insulinbehandlung von Adipocyten zu einer Hochregulierung des Glucosetransports und sowohl der Glykogen- als auch Lipidsynthese und ferner zu einer Hochregulierung der MAP-Kinaseaktivität. Es wurde vermutet, daß die MAP-Kinaseaktivierung für die Stoffwechseleffekte von Insulin erforderlich ist. Die erfindungsgemäße Verbindung hemmt eine Aktivierung der insulinstimulierten MAP-Kinase, sie beeinflußt jedoch nicht den insulinstimulierten Glucosetransport oder die Lipid- und Glykogensynthese in Maus-3T3- Ll-Adipocyten. Dies belegt, daß die von ihr verursachte Blockade für mitogene Wirkungen gegenüber einer Stoffwechselregulierung selektiv sein kann.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäß wird die Verbindung 2-(2-Amino-3-methoxyphenyl)-4-oxo-4H-[1]benzopyran der Formel:
bereitgestellt.
Gegenstand der Erfindung sind ferner die pharmazeutisch akzeptablen Säureadditionssalze und Solvate des betreffenden Benzopyrans.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist eine Arzneimittelzubereitung, umfassend das Benzopyran oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder Solvat desselben zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Streckmittel hierfür.
Eine weitere Ausführungsform ist ein Verfahren zur Hemmung von MEK-Kinase mit zweifacher Spezifität durch Verabreichen einer MEK-Kinase hemmenden Menge des Benzopyrans an ein Säugetier.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Behandlung von Krebs durch Verabreichen an einen einer solchen Behandlung bedürfenden Patienten einer gegen Krebs wirksamen Menge des erfindungsgemäßen Benzopyrans. Hierzu gehört auch ein Verfahren zur Behandlung der proliferativen Erkrankungen einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Psoriasis, Restenose, Autoimmunerkrankungen und Atherosklerose.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Bei der erfindungsgemäßen Verbindung handelt es sich um 2- (2-Amino-3-methoxyphenyl)-4-oxo-4H-[1]benzopyran. Wie bereits ausgeführt, handelt es sich hierbei um ein Flavon, das auch als 2'-Amino-3'-methoxyflavon bezeichnet werden kann. Die Verbindung läßt sich nach irgendeinem der verschiedenen zur Flavonherstellung einschlägig bekannten Syntheseverfahren herstellen. So beschreibt beispielsweise die US-A-3 816 466 die Umsetzung eines 2-Hydroxyacetophenonderivats mit einem Benzaldehyd in Gegenwart einer Base zur Bildung des entsprechenden Flavons.
Die erfindungsgemäße Verbindung wird vorzugsweise durch Umsetzen von 2-Hydroxyacetophenon mit einem Benzoylchlorid, insbesondere 2-Nitro-3-methoxybenzoylchlorid, zu einem Propandion, insbesondere 1-(2-Hydroxyphenyl)-3-(2-nitro-3- methoxyphenyl)-propan-1,3-dion, hergestellt. Das Propandion läßt sich ohne Schwierigkeiten zu einem Benzopyran, insbesondere 2-(2-Nitro-3-methoxyphenyl)-4-oxo-4H(-[1]benzopyran, cyclisieren. Der Nitrorest der Benzopyranderivatgruppe wird durch katalytische Hydrierung zu einer Aminogruppe redu ziert, wobei die erfindungsgemäße Verbindung erhalten wird. Der allgemeine Reaktionsverlauf wird durch das folgende Reaktionsschema I dargestellt. REAKTIONSSCHEMA I
Die folgenden detaillierten Beispiele veranschaulichen die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindung.

Herstellung von 2-Methoxy-2-nitrobenzoylchlorid

Oxalylchlorid (2 ml, 24 mmol) und DMF (0,4 ml) werden in eine Suspension von 3-Methoxy-2-nitrobenzoesäure (4 g, 20 mmol) in 200 ml Dichlormethan eingetragen. Nachdem das Reaktionsgemisch 3 h bei 25ºC unter Stickstoff gerührt worden ist, werden die Reaktionslösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, wobei 3-Methoxy-2-nitrobenzoylchlorid (4,3 g, quantitativ) als gelber Feststoff erhalten wird.
¹H-NMR (DMSO) δ 7,80 (1H, d, J = 8 Hz), 7,65 (1H, t, J = 9 Hz), 7,42 (1H, d, J = 10 Hz).

Herstellung von 1-(2-Hydroxyphenyl)-3-(3-methoxy-2-nitrophenyl)propan-1,3-dion

Ein mit einem mechanischen Rührer ausgestatteter 300 ml fassender Dreihalsrundkolben wird mit Kalium-tert.-butoxid (2,5 g, 22 mmol) beschickt. Nach dem Abkühlen des Kolbens auf 0ºC wird trockenes THF (10 ml) eingegossen. Zu der Lösung wird langsam innerhalb von 30 min unter Aufrechterhalten einer Temperatur unter 5ºC 2-Hydroxyacetophenon (3,5 ml, 18,6 mmol) in THF (10 ml) zugegeben. Die hierbei erhaltene gelbe Paste wird auf 25ºC erwärmt und 35 min lang verrührt. Dann wird das Gemisch auf 0ºC gekühlt und langsam innerhalb von 15 min unter Aufrechterhalten einer Temperatur unter 5ºC mit 3-Methoxy-2-nitrobenzoylchlorid (4,3 g, 20 mmol) in THF (15 ml) versetzt. Nachdem das Gemisch auf 25ºC erwärmt worden war, wird es 1 h lang verrührt. Dann wird das Gemisch auf 5ºC gekühlt und mit festem Kalium-tert.-butoxid (2,5 g, 22 mmol) versetzt, wobei eine dunkelbraune Paste entsteht. Nach Zugabe von THF (30 ml) wird das Gemisch 3 h auf Rückflußtemperatur erwärmt. Nach dem Abkühlen auf 25ºC wird das Gemisch mit 3 N-HCl versetzt, bis der pH-Wert unter 2 fällt. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei ein brauner fester Rückstand erhalten wird. Der braune Feststoff wird in CH&sub2;Cl&sub2; (200 ml) und H&sub2;O (50 ml) gelöst, mit gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung (200 ml), gesättigter Salzlake (200 ml) und H&sub2;O (200 ml) gewaschen. Die organische Schicht wird getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 1-(2-Hydroxyphenyl)-3-(3-methoxy-2-nitrophenyl)propan- 1,3-dion (5,52 g, 79%) als tautomeres Gemisch erhalten wird.

Herstellung von 2-(3-Methoxy-2-nitrophenyl)-4-oxo-4H- [1]benzonyran

Eine Lösung von Eisessig (15 ml), konzentrierter Schwefelsäure (180 ml) und 1-(2-Hydroxyphenyl)-3-(3-methoxy-2-nitrophenyl)propan-1,3-dion (770 mg, 2,43 mmol) wird 2,5 h auf Rückflußtemperatur erwärmt. Die heiße Lösung wird auf zerkleinertes Eis und H&sub2;O (200 ml) gegossen, worauf das Ganze 30 min kräftig verrührt wird. Die Lösung wird in einem Kühlschrank abgekühlt. Der hierbei entstandene Feststoff wird abfiltriert und mit H&sub2;O gewaschen, wobei 2-(3-Methoxy- 2-nitrophenyl)-4-oxo-4H-[1]benzopyran (510 mg, 70%) als brauner Feststoff erhalten wird.
¹H-NMR (DMSO): δ 8,02 (1H, d, J = 8, 0 Hz), 7,81 (1H, t, J = 6,9 Hz), 7,74 (1H, t, J = 8,2 Hz), 7,59 (1H, t, J = 8,4 Hz), 7,51 (1H, t, J = 7,4 Hz), 7,42 (1H, d, J = 8,3 Hz), 6,81 (1H, s), 3,92 (3H, s).

Herstellung von 2-(2-Amino-3-methoxyphenyl)-4-oxo-4H- [1]benzopyran

2-(3-Methoxy-2-nitrophenyl)-4-oxo-4H-[1]benzopyran (1,73 g, 5,8 mmol) in Methanol (50 ml) und THF (50 ml) wird unter Druck mit RaNi (0,5 g) hydriert. Die Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt und aus Toluol umkristallisiert, wobei 2-(2-Amino-3-methoxyphenyl)-4-oxo-4H-[1]benzopyran (900 mg, 58%) als Feststoff erhalten wird.
¹H-NMR (DMSO): δ 8,07 (1H, d,J = 8,0 Hz), 7,83 (1H, t, J = 6,9 Hz), 7,70 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,51 (1H, t, J = 7,0 Hz), 7,09 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,00 (1H, d, J = 7,0 Hz), 6,71 (1H, t, J = 8,0 Hz), 6,56 (1H, s), 5,30 (2H, s), 3,85 (3H, s).
Die Erfindung umfaßt ferner pharmazeutisch akzeptable Säureadditionssalze der erfindungsgemäßen Verbindung. Solche Salze werden durch Umsetzen der erfindungsgemäßen Verbindung mit einer äquimolaren Menge einer anorganischen Säure, wie Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel- oder Phosphorsäure, und ähnlicher anorganischer Säuren hergestellt. Zur Salzbildung können auch organische Säuren, beispielsweise Essig-, Milch-, Malein-, Methansulfon-, Bernstein- und Benzoesäure, und ähnliche organische Säuren verwendet werden.
Bevorzugte Salze sind das Hydrochlorid und das Acetat. Es können auch Solvate, wie Hydrate und Alkoholate (beispielsweise mit Ethanol), verwendet werden.
Die erfindungsgemäße Verbindung eignet sich zur Behandlung von Krebs durch seine selektive Hemmung der doppeltspezifischen Proteinkinase MEK. Die erfindungsgemäße Verbindung wurde im Rahmen einer Anzahl biologischer Tests, die normalerweise zur Bestätigung der Hemmung von Proteinen und Kinasen und zur Bestimmung mitogener und metabolischer Antworten auf eine solche Hemmung herangezogen werden, getestet.

Enzymtests

Kaskadentest für Inhibitoren des MAP-Kinasepfads

Der Einbau von ³²P in Myelinbasisprotein (MBP) wurde in Gegenwart eines p44MAP-Kinase enthaltenden Glutathion-S- Transferasefusionsproteins (GST-MAPK) und eines p45MEK enthaltenden Glutathion-S-Transferasefusionsproteins getestet (GST-MEK). Die Testlösung enthielt 20 mM HEPES, pH- Wert: 7,4, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM MnCl&sub2;, 1 mM EGTA, 50 uM [γ- ³²P]ATp, 10 ug GST-MEK, 0,5 ug GST-MAPK und 40 ug MBP in einem Endvolumen von 100 ul. Die Reaktionen wurden nach 20 min durch Zusatz von Trichloressigsäure und Filtrieren durch eine GF/C-Filtermatte gestoppt. Auf der Filtermatte zurückgehaltener ³²P wurde unter Verwendung einer 1205-Betaplatte bestimmt. Die Verbindungen wurden mit 10 uM auf ihre Fähigkeit zur Hemmung des Einbaus von ³²P getestet.
Um sicherzustellen, ob Verbindungen GST-MEK oder GST-MAPK hemmten, bediente man sich zweier zusätzlicher Protokolle. Beim ersten Protokoll wurden die Verbindungen in GST-MEK enthaltende Röhrchen eingetragen, worauf GST-MAPK, MBP und [γ-³²P]ATP zugegeben wurden. Beim zweiten Protokoll wurden die Verbindungen in sowohl GST-MEK als auch GST-MAPK enthaltende Röhrchen eingetragen, worauf MBP und [γ-³²P]ATP zugegeben wurden. Verbindungen, die bei beiden Protokollen Aktivität zeigten, wurden als MAPK-Inhibitoren eingeordnet, während Verbindungen, die lediglich beim ersten Protokoll aktiv waren, als MEK-Inhibitoren eingeordnet wurden.

In-vitro-MAP-Kinasetest

Die Hemmaktivität wurde auch bei direkten Tests bestätigt. Für MAP-Kinase wurde 1 ug GST-MAPK mit 40 ug MBP 15 min lang bei 30ºC in einem 50 mM Tris (pH-Wert: 7,5), 10 uM MgCl&sub2;, 2 uM EGTA und 10 uM [γ-³²P]ATP enthaltenden Endvolumen von 50 ul inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von Laemmli- SDS-Probenpuffer gestoppt. Phosphoryliertes MBP wurde durch Elektrophorese auf einem 10% Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die in MBP eingebaute Radioaktivität wurde auf autoradiographischem Wege und anschließend durch Ausschneiden der Banden mit nachgeschalteter Szintillationszählung bestimmt.

In-vitro-MEK-Test

Zur Bestimmung der direkten MEK-Aktivität wurden 10 ug GST- MEK1 mit 5 ug eines Glutathion-S-Transferasefusionsproteins mit p44MAP-Kinase mit einer Lysin-zu-Alanin-Mutation in Stellung 71 (GST-MAPK-KA) inkubiert. Die betreffende Mutation beseitigt die Kinaseaktivität von MAPK, so daß lediglich die auf den MEK-Zusatz zurückzuführende Kinaseaktivität zurückbleibt. Die Inkubationen erfolgten während 15 min bei 30ºC in einem 50 um Tris (pH-Wert: 7,5), 10 uM MgCl&sub2;, 2 uM EGTA und 10 uM [γ-³²P]ATP enthaltenden Endvolumen von 50 ul. Die Reaktion wurde durch Zusatz von Laemmli-SDS-Probenpuffer abgestoppt. Phosphorylierte GST-MAPK-KA wurde durch Elektrophorese auf einem 10% Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die in GST-MAPK-KA eingebaute Radioaktivität wurde auf autoradiographischem Wege und anschließend durch Ausschneiden der Banden mit nachgeschalteter Szintillationszählung bestimmt. Weiterhin wurde eine künstlich aktivierte MEK mit Serin-zu- Glutamat-Mutationen in den Stellungen 218 und 222 (GST-MEK- 2E) benutzt. Wurden diese Stellen phosphoryliert, wurde die MEK-Aktivität erhöht. Die Phosphorylierung an diesen Stellen läßt sich durch Mutation der Serinreste zu Glutamat nachahmen. Für diesen Test wurden 5 ug GST-MEK-2E in demselben Reaktionspuffer wie oben beschrieben 15 min bei 30ºC mit 5 ug GST-MAPK-KA inkubiert. Die Reaktionen wurden - wie beschrieben - beendet und analysiert.

Vollzellen-MAP-Kinasetest

Um zu bestimmen, ob Verbindungen dazu fähig waren, die Aktivierung von MAP-Kinase in Vollzellen zu blockieren, bediente man sich des folgenden Protokolls: Zellen wurden auf eine Vielzahl von Ausnehmungen aufweisenden Platten ausgestrichen und bis zum Zusammenfließen wachsen gelassen. Dann wurde über Nacht den Zellen Serum entzogen. Auf die Zellen wurde dann 30 min lang die betreffende Verbindung oder Träger (DMSO) in den gewünschten Konzentrationen einwirken gelassen, worauf ein Wachstumsfaktor, beispielsweise PDGF (100 ng/ml) zugegeben wurde. Nach fünfminütiger Behandlung mit dem Wachstumsfaktor wurden die Zellen mit PBS gewaschen und dann mit einem Puffer aus 70 mM NaCl, 10 mM HEPES (pH-Wert: 7,4), 50 uM Glycerinphosphat und 1% Triton X-100 lysiert. Die Lysate wurden durch zehnminütiges Zentrifugieren mit 13.000 · g geklärt. 5 ug der erhaltenen Überstände wurden während 15 min bei 30ºC in einem 50 mM Tris (pH-Wert: 7,4), 10 mM MgCl&sub2;, 2 mM EGTA und 30 uM [γ-³²P]ATP enthaltenden Endvolumen von 25 ul mit 10 ug von Mikrotubulus-assoziiertem Protein-2 (Map2) inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zusatz von Laemmli-Probenpuffer beendet. Phosphoryliertes Map2 wurde auf 7,5%igen Acrylamidgelen aufgetrennt. Die eingebaute Radioaktivität wurde auf autoradiographischem Wege und anschließendes Ausschneiden der Banden mit nachgeschalteter Szintillationszählung bestimmt.
Bei Bewertung nach dem beschriebenen Protokoll zeigte die erfindungsgemäße Verbindung eine IC&sub5;&sub0; von 7 uM gegen mit NGF stimulierte PC-12-Zellen und von 3 uM gegen mit Insulin stimulierte 3T3-L1-Zellen.

Immunfällung und Antiphosphotyrosinimmunoblots

Zur Bestimmung des Tyrosinphosphorylierungsstatus von zellulärer MAP-Kinase wurden Zellen lysiert und endogene MAP-Ki nase wurde mit einem speziellen Antikörper immungefällt. Der gebildete Immunniederschlag wurde wie folgt auf die Anwesenheit von Phosphotyrosin analysiert: Zusammengeflossenen Zellen wurde über Nacht Serum entzogen und danach wurden sie - wie oben beschrieben - mit Verbindungen und Wachstumsfaktoren behandelt. Dann wurden die Zellen abgekratzt und 2 min bei 13.000 · g pelletisiert. Das erhaltene Zellpellet wurde in 100 ul an 1%igem SDS mit 1 mM NaVO&sub4; resuspendiert und gelöst. Nach abwechselndem Kochen und Verwirbeln zur Denaturierung von zellulärem Protein wurden 900 ul RIPA-Puffer (50 mM Tris (pH-Wert: 7,4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% Desoxycholat und 10 mM EDTA) zugegeben. Dann wurde dieses Gemisch mit 60 ul Agaroseperlen, die mit Kaninchenimmunoglobulin G gekoppelt waren, und 60 ul Pansorbinzellen versetzt, um das Lysat von Proteinen mit unspezifischer Bindung zu säubern. Dieses Gemisch wurde 15 min bei 4ºC inkubiert und danach 10 min bei 13.000 · g zentrifugiert. Der angefallene Überstand wurde in frische Röhrchen überführt und mit 10 ul eines gegen ein Fragment von MAP-Kinase gezüchteten polyklonalen Antiserums mindestens 1 h bei 4ºC inkubiert. Nach Zugabe von 70 ul einer Aufschlämmung von mit Protein G und Protein A gekoppelten Agaroseperlen wurde die Inkubation weitere 30 min bei 4ºC fortgesetzt. Die Perlen durch fünfminütiges Zentrifugieren mit 13.000 · g pelletisiert und dreimal mit 1 ml RIPA-Puffer gewaschen. Zu dem fertigen Perlenpellet wurde Laemmli-Probenpuffer zugegeben. Dieses Gemisch wurde 5 min lang aufgekocht und danach auf einem 10% Acrylamidgel aufgetrennt. Die Proteine auf dem Gel wurden auf eine Nitrocellulosemembran überführt. Unspezifische Bindungsstellen auf der Membran wurden durch Inkubieren mit 1% Ovalbumin und 1% Rinderserumalbumin in TBST (150 mM NaCl, 10 mM Tris (pH-Wert: 7,4) und 0,05% Tween 20) blockiert. Danach wurde die Membran mit einem handelsüblichen, gegen Phosphotyrosin gerichteten Antikörper inkubiert. Der an die Membran gebundene Antikörper wurde durch Inku bieren mit ¹²&sup5;I-Protein A und anschließende Autoradiographie nachgewiesen.

Zellwachstumstest

³H-Thymidineinbau

Zellen wurden auf mit einer Mehrzahl von Ausnehmungen versehenen Platten ausgestrichen und fast bis zum Zusammenfließen wachsen gelassen. Die Medien wurden danach entfernt und durch Wachstumsmedien mit 1% Rinderserumalbumin ersetzt. Nach 24-stündiger Serumstarvation wurden Verbindungen und spezielle Wachstumsfaktoren zugegeben, worauf weitere 24 h lang inkubiert wurde. Während der letzten 2 h wurde dem Medium ³H-Thymidin zugesetzt. Zur Beendigung der Inkubationen wurde das Medium entfernt. Die Zellschichten wurden zweimal mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Nach der letzten Wäsche wurde eiskalte 5%ige Trichloressigsäure zugegeben. Nachdem die Zellen 15 min bei Raumtemperatur inkubiert worden waren, wurde die Trichloressigsäurelösung entfernt. Die Zellschicht wurde dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Nach der letzten Wäsche wurde die Zellschicht durch Zusatz von 2% Natriumdodecylsulfat in Lösung gebracht. Die Radioaktivität in dieser Lösung wurde durch Szintillationszählung bestimmt.
Die erfindungsgemäße Verbindung zeigte bei Bewertung nach dem vorliegenden Protokoll die folgende Hemmung eines PDGF- stimulierten Thymidineinbaus:
Zell typ Thymidineinbau IC&sub5;&sub0; uM
Balb 3T3 8
K-Balb 3T3 10
Auf Seite 16, Zeile 16
Bei 3T3-L1-Adipocytenzellen, bei welchen die Hemmung eine MAPK-Aktivierung durch Insulin mit einer IC&sub5;&sub0; von 3 uM blockiert, besaß die Verbindung keine Wirkung auf die insulinstimulierte Aufnahme von radioaktiv markierter 2-Desoxyglucose oder auf die insulinstimulierte Synthese von entweder Lipid oder Glykogen bei einer 10-uM-Konzentration. Dies belegt, daß der Inhibitor eine Selektivität zwischen den mitogenen und metabolischen Wirkungen von Insulin zeigt, und belegt weiter, daß der Inhibitor weniger toxisch ist als ein Inhibitor, der diese überraschende Selektivität nicht zeigt.

Einschichtenwachstum

Zellen wurden auf eine Mehrzahl von Ausnehmungen aufweisenden Platten in einer Konzentration von 10-20.000 Zellen/ml ausgestrichen. 48 h nach der "Aussaat" wurden die Verbindungen dem Zellwachstumsmedium zugesetzt und es wurde zwei weitere Tage lang inkubiert. Danach wurden die Zellen durch Inkubieren mit Trypsin aus den Ausnehmungen entfernt und mit einem Coulter-Zähler ausgezählt.

Wachstum in Weichagar

Zellen wurden unter Verwendung eines Wachstumsmediums mit 0,3% Agar in einer Konzentration von 5-10.000 Zellen/Schale in 35 mm große Schalen ausgesät. Nach dem Abschrecken zur Verfestigung des Agars wurden die Zellen in einen Inkubator mit einer Temperatur von 37ºC überführt. Nach 7- bis 10- tägigem Wachstum wurden sichtbare Kolonien mit Hilfe eines Präpariermikroskops manuell ausgezählt. Unterschiedliche Wirkung auf Zelltypen bei Tests mit ankerabhängigem (Einschichten)-Wachstum und ankerunabhängigem (Klonogenizität auf Weichagar) Wachstum.
Zugabereihenfolgeexperimente bestätigten, daß der Inhibitor MEK und nicht MAP-Kinase hemmt. Experimente, die die Phosphorylierung einer Kinasedefektmutante von MAP-Kinase als Substrat (dergestalt, daß keine Autophosphorylierung der MAP-Kinase unter Komplizierung der Interpretation stattfinden kann) untersuchten, bestätigen, daß der Inhibitor MEK mit einer IC&sub5;&sub0;, die im wesentlichen zu derjenigen bei dem Kaskadentest ermittelten identisch ist, hemmt.
Der Inhibitor hemmt die folgenden Kinasen in einer Konzentration von 50 uM nicht nennenswert.
MAP-Kinase
Proteinkinase C (Rattenhirnhomogenat-c-PKC-Gemisch)
v-Src
EGFR-Tyrosinkinase
NGFR (trk-A)-Tyrosinkinase
PDGFRβ-Tyrosinkinase
PI-3-Kinase
E. coli-Histidinkinase NRII
RAF
Eine kinetische Analyse belegt, daß der Inhibitor mit ATP nicht konkurriert. Dies bedeutet, daß er keine Bindung mit der ATF-Bindungsstelle des Enzyms eingeht. Dies ist vermutlich die Erklärung dafür, warum diese Verbindung die unspezifische Kinasehemmaktivität, die für die meisten an die ATP-Bindungsstelle bindenden und mit ATP konkurrierenden Flavonkinaseinhibitoren typisch ist, nicht zeigt.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann zur Behandlung von an Krebs und sonstigen proliferativen Erkrankungen leidenden und einer solchen Behandlung bedürfenden Patienten benutzt werden. Die Verbindung eignet sich in idealer Weise zur Behandlung von Psoriasis, Restenose, Autoimmunerkrankungen und Atherosklerose. Die Verbindung gelangt im allgemeinen als Arzneimittelzubereitung, in der das Benzopyran in einer Konzentration von etwa 5 bis etwa 95 Gew.-% enthalten ist, zum Einsatz. Die Verbindung kann für eine Verabreichung auf üblichen oralen, parenteralen, topischen, rektalen oder ähnlichen Wegen hergerichtet werden. Die Verbindung wird mit üblichen Verdünnungsmitteln, Streckmitteln und Trägern, wie sie routinemäßig in der Medizin verwendet werden, beispielsweise mit Polyolen, wie Glycerin, Ethlyenglykol, Sorbitol 70, Mono- und Difettsäureestern von Ethylenglykol, verschnitten werden. Stärkesorten und Zucker, wie Maisstärke, Saccharose, Lactose und dgl., können für feste Zubereitungen benutzt werden. Solche festen Zubereitungen können die Form von Tabletten, Oblatenkapseln, Pillen, Kapseln und dgl., aufweisen. Aromatisierungsmittel, wie Pfefferminzöl, Wintergrünöl und dgl. können eingearbeitet werden.
Typische Dosen für das aktive Benzopyran sind solche, die bei der Behandlung von Krebs oder sonstigen Säugetiere beeinträchtigenden proliferativen Störungen wirksam sind. Die Dosen reichen im allgemeinen von etwa 0,1 bis etwa 50 mg pro kg Körpergewicht. Solche Dosen werden ein- bis etwa viermal täglich oder nach Bedarf zu einer wirksamen Behandlung von Krebs, Psoriasis, Restenose oder sonstigen proliferativen Störungen gegeben.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Abgabe der erfindungsgemäßen Verbindung ist oral über eine Tablette, Kapsel, Lösung oder einen Sirup. Ein weiteres Verfahren ist die parenterale Verabreichung, insbesondere über eine intravenöse Infusion einer Lösung des Benzopyrans in isotonischer Kochsalzlösung oder 5%iger wäßriger Glucose.
Im folgenden werden typische erfindungsgemäß bereitgestellte Zubereitungen angegeben: Zubereitung von 50-mg-Tabletten
Das Benzopyran, die Lactose und die Maisstärke (für die Mischung) werden bis zur Gleichmäßigkeit gemischt. Die Maisstärke (für die Paste) wird in 600 ml Wasser suspendiert und unter Erwärmen verrührt, um eine Paste zu bilden. Die Paste dient zur Granulierung des Pulvergemischs. Das Granulat wird durch ein Sieb #8 gesiebt und bei 120ºF getrocknet. Das trockene Granulat wird durch ein Sieb #16 gesiebt. Dem Gemisch wird 1% Magnesiumstearat als Gleitmittel zugesetzt, worauf das Ganze zu Tabletten verpreßt wird.

Zubereitung einer oralen Suspension

Bestandteil Menge
2-(2-Amino-3-methoxyphenyl)-4-oxo-4H-[1]- benzopyranmonohydrat 500 mg
Sorbitlösung (70% NF) 40 ml
Natriumbenzoat 150 mg
Saccharin 10 mg
Roter Farbstoff 10 mg
Kirschgeschmack 50 mg
Destilliertes Wasser aufgefüllt auf 100 ml
Die Sorbitlösung wird in 40 ml destilliertes Wasser eingetragen, worauf das Flavon darin suspendiert wird. Dann werden das Saccharin, das Natriumbenzoat, der Aromastoff und der Farbstoff zugegeben und gelöst. Das Volumen wird mit destilliertem Wasser auf 100 ml eingestellt. Jeder ml Sirup enthält 5 mg der erfindungsgemäßen Verbindung.

Zubereitung einer parenteralen Lösung

In eine Lösung von 700 ml Propylenglykol und 200 ml Wasser zu Injektionszwecken werden 20,0 g 2-(2-Amino-3-methoxyphenyl)-4-oxo-4H-[1]benzopyranmonoacetat eingetragen. Das Volumen der Lösung wird durch Zusatz von Wasser zu Injektionszwecken auf 1000 ml aufgefüllt. Die Zubereitung wird wärmesterilisiert, in 50-ml-Ampullen zu jeweils 2,0 ml (40 mg Flavon) abgefüllt und unter Stickstoff versiegelt.
Die derart hergerichtete erfindungsgemäße Verbindung wird an ein Säugetier, das einer Behandlung für eine proliferative Störung, wie Krebs, Psoriasis, Restenose, Atherosklerose und Autoimmunerkrankungen, bedarf, in einer zur Behandlung der betreffenden Störung wirksamen Rate und Dosis verabreicht. Typische erfindungsgemäß behandelbare Krebsarten sind Brustkrebs, Kolonkrebs, Prostatakrebs, Hautkrebs und dgl. Die Verbindung eignet sich hervorragend auch zur Behandlung von Psoriasis, Restenose und Atherosklerose.

Claims

1. Die Verbindung 2-(2-amino-3-methoxyphenyl)-4-oxo-4H- [1]benzopyran oder ein pharmazeutisch akzeptables Säureadditionssalz oder ein Solvat davon.

2. Die Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei das pharmazeutisch akzeptable Salz mit einer anorganischen Säure hergestellt ist.

3. Die Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei das pharmazeutisch akzeptable Salz mit einer organischen Säure hergestellt ist.

4. Eine Arzneimittelzubereitung enthaltend eine Verbindung gemäß Anspruch 1 zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff, Verdünnungsmittel oder Excipient.

5. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Arzneimitteln für die Behandlung von Krebs, Psoriasis oder Restenose oder für die Inhibierung des Enzyms MEK.