TW467743B - Method and compositions for inhibiting protein kinases - Google Patents

Description

Λ 6 7 7 Λ 3 a? Β7 五、發明説明（1 ) 發明節圍 本發明係關於蛋白質激_ (特別是酪胺酸激酶）之抑 制劑，及其於分析激酶和其基質及於與激酶有關的程序（ 如：細胞生長）之抑制上之應用。 發明背畺 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 具酪胺酸特徵的蛋白質激酶（酪胺酸激酶）是一組能 夠催化三磷酸腺甙之末端磷酸酯轉移到蛋白質基質中之酪 胺酸殘基上的酵素。已經證實其中的一者是與病毒基因（ 致癌基因）有關的酪胺酸激酶，它會使細胞變形（即， PP60v— src 和 pp98v-fps)。後來得知 這些病毒基因產物具有正常的細胞抗衡部分（即， pp6〇v — src 和 pp98v— fps)。鑑別出的 第三種類型的酪胺酸激酶被稱爲生長因子受體，它包括胰 島素、表皮生長因子（EGF)、血小板衍生出的生長因 子（PDGF)、纖維織母細胞生長因子（FGF)和 P 1 8 5HER- 2受體。咸信所有的這些酪胺酸激酶藉 由基質加磷氧基作用而在多種細胞功用的訊息傳遞因子轉 移上扮演著重要的角色。 雖然尙未瞭解訊息傳遞因子轉移的確實結構，但是已 經知道酪胺酸激酶在細胞增生、癌之形成和細胞分裂上扮 演著重要的角色。 使細胞暴於一或多種生長因子（如：FGF、EGF 和PDGF)下，可達到細胞增生的目的。這些生長因子 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） -4 - d67 743 A7 __ B7 __ 五、發明説明（2 ) I.l·—.-------- f (請先閲讀背面之注意事項再填寫本瓦) 與其相對應的受體作用，這些受體包含具有酪胺酸激酶酵 素活性的細胞外部分、半透膜部分和胞體漿部分。咸信細 胞增生之抑制是發生在生長因子的細胞表面與其受體的細 胞外表面結合時。生長因子-受體結合導致受體變成二聚 體，結果發生受體的自主性加磷氧基作用*增進了受體的 酵素活性及基質的加磷氧基作用》最近，已經證實：一般 是利用酪胺酸激酶生長因子受體由細胞表面將訊息傳送到 細胞核》此方式包含以生長因子爲媒介的蛋白質活化作用 ，此造成蛋白質激酶分裂，導致複製因子的加磷氧基作用 ，使得細胞分裂所含的基因變得有規律。 經濟k邺中央標率局員工消費合作社印製 受體自主性加磷氧基作用和細胞外基貪的加磷氧基作 用是生化反應，它須要生長因子傳達訊息及細胞複製。已 經證實：以改變位址指向方式來消除多種受體（包括 EGF受體、FGF受體和PDGF受體）的蛋白質酪胺 酸激酶活性，會使受體的生物活性完全消失。此外，蛋白 質激酶抑制劑（如：‘staurosporin、K 2 5 2 a和 tyrophostins)會封阻酷胺酸激酿受體酵素活性，中止細 胞外訊息傳遞和細胞增生情況。這些研究證實酪胺酸加磷 氧.基作用在訊息傳送中所扮演的角色藉由生長因子受體來 達成並證實抑制酪胺酸激酶活性的化合物可用以調整細胞 增生作用。 多種疾病狀態之特徵在於細胞增生施控》這些疾病含 括了各種類型的細胞，這疾病包括癌症、乾癬、肺纖維變 性、絲球體腎炎、動脈硬化和血管成形術之後的再狹窄。 本紙張尺度適用中國國家標準（€.灿）六4規格（2】0父297公釐) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 467743 A7 B7 五、發明説明（3 ) 活體研究證實可用酪胺酸激酶抑制劑來治療這些疾病。已 經證實酪胺酸激酶抑制劑對於E G F受體的選擇性可用以 封阻動物的腫瘤形成，因此證實在治療人類癌症（特別是 乳癌）方面，它們可以直接抑制腫瘤細胞生長。此外，解 除血管內覆組織生長因子（V E G F )受體酪胺酸激酶之 活性可以抑制腫瘤轉移及其相關的血管生成，此顯示酪胺 酸激酶抑制劑於血管生成期間中止個別情況上之用途》 在絲球體性腎炎的實驗模式中|腎小球環間膜細胞增 生，使PDGF提高2 0倍》中和PDGF以免酪胺酸激 酶抑制劑的活化作用，此可控制一般發生的腎病變。這些 研究顯示：能夠封阻P D F G受體的酪胺酸激酶抑制劑可 用以治療人體絲球體性腎炎。 心臟病學中一個主要未獲解決的問題是血管成形術之 後的再狹窄。美國每年約有4 0 0，0 0 0人進行血管成 形術手術，其中的3 0 - 4 0%在第一年間就會遭遇再狹 窄問題。再狹窄情況包含動脈硬化的動脈再度阻塞，此常 因平滑肌細胞增生（以PDGF和EGF之類的生長因子 爲媒介）而起。動物的再狹窄情況中，封阻PDGF或 E G F受體的酪胺酸激酶活性之活化作用就能避免平滑肌 細胞增生及形成新血管內膜。這些研究顯示：能夠封阻 P D G F或F G F受體的酪胺酸激酶抑制劑可用以治療人 類的再狹窄問題。 目前的癌症化學療法係使用NDA合成抑制劑（如： 阿黴素（adrimycin)、氟脲喃D定（fluorouracil)和分 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） I- — — — n —Λ/y — (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁> 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 467743 A7 __B7 , 五、發明説明（4 ) 化細胞架構的化合物（常春鹼（vinblastine))。這些 化合物的抑制活性並非僅針對癌細胞，因此極具毒性，只 是腫瘤細胞會因爲分裂最爲迅速使其D N A代謝最具活性 ，所以最容易受到前述抑制劑的攻擊。少數類型的癌症是 以特定的荷爾蒙衍生物來治療。但是，這些情況是例外情 況，各種癌症的主要化學療法都一樣。 1 9 8 0年代早期就已經知道2 0至3 0%的癌症會 形成具有特徵的腫瘤，所形成的腫瘤是生長因子受體或它 們的突變同系物，且其具有蛋白質激酶（PTK)活性。 此PTK活性視受體或其突_同系物而定，且會對於經由 P TK作用進行的細胞增生造成影響。此外，這些受體（ 正常或突變的）具有特徵性PTK活性及明顯的基質特性 。這些受體之一是表皮生長因子（E G F )受體及其主變 同系物V — ERB — B。 與生長因子受體之P TK活性有關的上述研究之結果 建議吾等以能夠抑制E G F之P TK活性的各種化學物質 來治療癌症。此可參考，如：Japanese patent No. 62-39523 、 62-39558 、 62 -42923矛口 62-42925 ° 例女口 ，前述 Japanese Laid-open Patent No. SH06 2 -3 9558提出使用 α_氰基_ 2，5 —二羥基肉桂醯胺作爲PTK有效抑制 劑組成物中之活性化合物= 作爲腫瘤生長抑制劑之用的肉桂基丙二腈及各種苯伸 甲基丙二腈化合物掲示於Gal等人的Biological Action of Ma1onon i tr i1es. I. The Effect of Substituted 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2〗0X2_97公釐） ^^1- 1 In 1^1 ^ ^^1 ·1 (請先閲讀背面之注意事頃再填寫本頁) 訂 冓 -7 - 4 6 7 7 4 3 A7 _B7 __ 五、發明説明（5 )

Malononitriles on the Growth of Transplated Tumors in Mice, Cancer Research, 12:565-72, 1952 e 發明概沭 據此，本發明的目的是要提出新穎且有效的激酶抑制 劑配方* . · · ·.. 本發明的另一個目的是要提出舊有之已知毒性低的組 成物之他種用途。 本發明的這些及其他目的藉由提出抑制蛋白質激酶之 方法而達成，此方法之步驟包含：使含有該激酶的組成物 與下面所示的式（I)分子接觸： IL - - - - 1 - - -I j\)>v I . (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 其中：

Ri是H、低碳烷基或低碳烷醯基； R2是11、低碳烷基或低碳烷醯基； R3和尺4 一起代表順式雙鍵或—〇 —，或者，：R 和分別代表Η或OR ; R.5 是、= S 或—Η、一 OR ; R6和尺7 —起代表順式雙鍵或-0 —，或者，R 和R τ分別代表Η或0 R ;

Rs和尺0 —起代表順式雙鍵或一 〇_，或者，R 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ -8 — 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 467 7^3 a? _B7_ 五、發明説明（6 ) 和Re分別代表Η或OR ;而 每個R分別代表Η、低碳烷基或低碳烷醣基。 本發明亦係針對用以控制晡乳動物之與激酶有關的疾 病之藥用組成物，此藥用組成物中包含式（I )化合物及 藥用上可被接受之載體，及控制與激酶有關的疾病之方法 ，其中包€含將其量具控制效果之其式如前述者的化合物施 用在罹患與激酶有關之疾病的晡乳動物上。此處所謂的> 哺乳動ter包括人類及他種晡乳動物》此處的a藥用"包 括鑛> 醫學用途，特別是用於豢養的動物，如：牛、綿羊、 豬、山羊、狗、貓、兔、田鼠、沙鼠、大頰鼠和鼷鼠。' 由此說明書及所附的申請專.利範圔可以明瞭本發明的 其他特點及優點。 附圖概述 參考下面的詳述及本說明書之附圖更夠瞭解本發明， 其中： 圖1是化合物2 9 2對於HR5細胞中的 冷一P D G F R自主性磷酸化反應之影響》 圖2是化合物2 9 2對於PDGFR誘發的〔3H〕 胸腺核试;添入HS 6 8細胞中之影響。 特定賨施例之榴沭 本發明係關於目前已知的化合物及一些與目前已知的 化合物有關、在此首次被鑑別出的化合物的新用途。此化 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X_297公釐）

Q —y *** (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

Mr 4 6 7 7 4 3 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（7 ) 合物係關於zeaen.oP它是macrolide，是含有稠合在鄰苯 二酚上的1 4員酯環。2 5年以前就已經知道此類化合物 ，它主要被用來作爲牛飼料添加物。此可參考，如： Kuiper-Goodman.等人， 'Risk Assessment of the Mycotox i n Zeara1enone^，Regulatory Toxicology and Pharmacology, L，253-306 (1987); Bennett等人， Use of the Anabolic Agent Zearno1 Resorcyli c Acid Lactone ) as a Growth Promoter for Cattle^ ， The Veterinary Record， pp. 235-239 (1974年3月 16日） ;Wi 1 1 emart等人， ^ A RAL Compound as an Anabolic in Cattle# ， Veterinary Research Communications, !_，35-44 (1987);及 Roche 等人，"^Resorcylic Acid Lactone as an Anabolic Agent in Cattle# ， Veterinary Research Communication, I., 45-50 (1983) 。這些化合物的其他已知用途是作爲雌激素。此可參考， 如：Sheffield等人，^Zeranol (jS-Resorcylic Acid Lactone), A Common residous Componet of Natrua1 Foodstuffs, Stimulates Developmental Growth of the Mouse Mammary G1 and^ ，Cancer Letters, 2 8. 7 7-83 ( 1 9 8 5 ) ; Mast r i 等人，^ I η V i vo Oestrogen i c i ty and Binding Characteristics of a -zearalano1 ( P1 4 9 6 ) to Different Cl asses of Oestrogen Binding Proteins in Rat Liver〃 , J. Steroid Biochem.， 23(3 )，2 7 9-2 8 9 ( 1 9 8 5 ); Edward等人， Murine Macrophage 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2I0X 297公釐） 1卜.II 裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本莧) -訂 10. -10 - A7 B7 467743 五、發明説明（8 )

Activation with Resorcyclic Acid Lactones C RALs)： Comparison with Diethy1stilbestrol and \Ί β ~ Estradiol*' , I mmunopharmaco 1 ogy, 17_, 107-118 ¢1989 )；及 Katzene 1.1 enbogen等人， 、Zeara 1 enones : Characterization of the Estrogen i c Potencies and

Receptor Interactions of a Series of Fungal β - * · · . resorcylic Acide Lactones〃 ， Endocrinology, 105. 33-40 (1979)。但是，它們未曾被用於或者知道可用來作 爲激酶抑制劑，一種重要的生化控制分子。通常，此化合 物之表示式爲： (請先閲请背面之注$項再填寫本頁)

其中

R R 是Η 是Η 低碳烷基或低碳烷醯基 低碳烷基或低碳烷醯基 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 R3和尺4 一起代表順式雙鍵或—0 —，或者 R 和 R 4 分別代 表 Η 或 0 R ； 1 R 5 是= 0 、 S 或- -Η - — OR ； R 0和R Ύ 一 +Π 起i 代 表順式 雙 m 或-0 — ，或 者，R s 和 R 7 分別代 表 Η 或 0 R ； 1 R s和R 9 —^ 起 代 表順式 雙 鍵 或—0 — ，或 者，R 8 和 R θ 分別代 表 Η 或 0 R ； :而 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） Α7 Β7 467743 五、發明説明（9 ) 每個R分別代表Η、低碳烷基或低碳烷醯基。 現在發現到這些化合物及含有彼之藥用組成物可用以 與激酶結合並抑制激酶。此用途詳述於下文中。 用語夕宙義 除非特別聲明，否則說明書中所用的這些用語之意義 ' ·. 如下： a烷基"是指直鏈或帶有支鏈之具約1至約6個碳原 子的飽和脂族烴。^低碳烷基'是指直鏈或帶有支鏈之具 約1至4個碳原子的上述烷基，如：甲基、乙基、丙基、 異丙基、丁基、異丁基、第二_ 丁基或特丁基。鹵化烷基 ，特別是氟化烷基（如：C F 3 、C H 2 C F 3和 C F2C F3)含括在烷基定義內 "烷氧基"是指其烷基如前述者的烷氧基。以低碳烷 氧基爲佳。其實例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙 氧基和正丁氧基》 "醯基"是將有機酸、羧酸中的酸羧基移走所衍生出 的有機基團。較佳的醯基是低碳烷羧酸基，如‘·乙醯基和 丙醯基。苄醯基亦佳 "鹵素"是指鹵素原子。較佳者包括氯、溴和氟》 結構 結構之實例列於下面的表中。表中的實例化合物1是 此說明書中實例部分的化合物2 9 2。 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4规格（2ΙΟΧ2_97公釐） —Γ------裝-- {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準扃員工消費合作社印製 -12 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印聚 Λ 6 7 7 4 3 a? Β7 五、發明説明（10 )

表1 實例 R 1 2 3 4 5 a 7 8 9 1 Me H = — 〇 OH OH = — 2 Me CO Me -0- —0 — 0 OH OH — 3 Η H = 0 一0 — -0- = = 4 Me H = = 0 OH OH OH OH 5 Me H = = 0 OH OH H H 6 Me H = 0 H H = — 7 Me H = = H，OH H H H H 8 CF3CO E t = S H H = — 9 Me CO Me CO -0- -0 — S H H = 10 H i -P r OH OH S OH OH = = 11 H H H H 〇 H H H H 12 H H OH OH 0 OH OH OH OH 13 H H OMe OMe 0 OH OH — — 14 t — B u CF3 — = 0 OH OH = = 1 5 H H = — s OBu OH OH 〇H . 16 Me CO H OH OH 0 OH OCOMe OMe OMe 1 7 i P n CO Me — — s = OH OH (請先閲绩背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適财國國家操準_ ) Μ規格（21〇Χ靖） 467743 A7 ___B7_ 五、發明説明（11 ) 附表夕註解 =(相鄰的兩行）代表所指之相鄰的碳間有雙鍵 _〇-（相鄰的兩行）代表所指之相鄰的碳間有環氧 基

Me —甲基；Et —乙基；Pr —丙基；i pr —異 丙基；Βιχ — 丁基；SBu —第二丁基；iBu —異丁基 ;tBu —特丁基；lPh-Ι —戊基；2Pn — 2 -戊 基；3Pn — 3 -戊基；2MB — 2 -甲基丁基；ipn 一異戊基（3 —甲基丁基）；11?11_新戊基（2，2 — 二甲基丙基）；1 IMP — 1，1-二甲基丙基； 12MP— 1 ，2 —二甲基丙基；MeC〇 —乙醯基（其 餘的醯基衍生物以相同的方式命名）。 對掌中心的立體化學及雙鍵之幾何性暂 本發明之方法所用的化合物可以含有高至3 C - C 雙鍵一 R3 - Κ·4、Re— 和 Re—R^。R3— Κ·4 雙鍵（ 若有的話）必須呈順式以使所得的分子在所提到的情況下 能具有活性。R 0_ R 7和R 8_ R 9雙鍵（若有的話）以反 式爲佳。 碳3、5、6 ' 8、9、1 1和1 2本身具有對掌中 心（macrolide環系統；參考表I )。因爲立體化學設計 (R和S )與特定位置上的取代基本質有關，特定位置上 較佳的立體化學形式視取代基而定地爲R或S。各個對掌 中心的絕對立體化學構型以其對掌中心與自然生成的二羥 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' —14 - 經濟部中央標率局員工消費合也社印製 4 6 7 743 A7 B7 五、發明説明（12) 基苯酸衍生物具有相同的相對構形者（也是最容易以合成 修飾法製得者）爲佳。但是’合成技巧可用以轉變對掌中 心（如：3^^2置換反應），且這樣的技巧可用以製備非 天然生成的所欲異構物。因爲將一個對掌中心（或兩個對 掌中心）引至已含有對掌中心（如C 3處的對掌中心）的 化合物中，會製得非對映異構物（而非對掌異構物），所 製得的物種可藉一般的物理技巧加以分離，所以，希望特 定的位置上具有特別的立體化學性質時，可以將多種技術 用於立體特異合成法或用以合成非對映異構物°兩個較隹 的對掌中心指向是：當8和9位置上都有0H基團時，8 位置上的C爲S構形且9位置上的C爲S構形，及3位置 上的C爲S構形者。 任何情況下，非對映異構物混合物之存在都不會對本 發明造戒負面影響，非活性非對映異構物（若存在的話） 之作用方式與有任何他種非活性物質（如：藥用載體）存 在的時候相同。 化合物之製備及產製 本發明所用的化合物是二羥基苯酸內酯，可藉已知的 技巧製得及修飾。這些化合物中的一些是生物的發酵產物 ，其他的可由初始生物產物之化學修飾而得。表1中的化 合物1之生物產製法述於下面的實例中。他種生物和化學 合成技述於多篇美國專利案中*包括U S P N 3，373，030、3，511，454、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐）_ 15 _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

467743 A7 B7 五、發明説明（13) 3，810，918、3，836，544 和 3，925，423，這些都併入本說明中以資參考。這 些專利案的最後一者因爲巧係關於使用容易取得的起始物 以一般方式合成出本發明之化合物的方法，所以特別有用 舉例言之，如U.S. Patent No. 3，196,019所述者， 使用適當的發酵法，培養微生物Gibberella zeae ( Gordon)可得到反式一6 — ( 1 0 —經基一6 -氧—反一 1--f--碳基）一jS —二經基苯酸內酯（zearalenone) 。可以根據U.S. Patent 3, 239, 354之步驟，將鍵結在6 一（10 —經基—6 —氧一反一1— Η—礙基）一二 羥基苯酸內酯上的不飽和碳予以氫化。可以將6 ~ ( 1 0 _羥基一 6 —氧一反一1 一Η 碳基）_ jS _二翔基苯酸 的酮基還原成相對應的醇（藉由U.S. patent No, 3,239,34 1所述的步驟）或伸甲基（藉由U.S. patent No. 3，237,3 41所述的步驟）》羥基上的氫被烷基、烷醇、芳 基或芳烷基加以置換的反應揭示於U.S. patent No. 經濟部中央標準局員工消費合作社印黎 (請先閲請背面之注意事項再填寫本頁〕 3，239,342 和 3,239,347。以波長 2 8 0 0 - 3 5 0 0 A的 光照射而造成雙鍵之順-反式轉變的方法述於1 9 7 2年 12月21日提出申請、現已過期的U.S. patent application No. 317,117。非對映異構物之分離述於 U.S. patent No. 3, 687, 982。所有的這些專利說明書都 併入本說明中以資參考。這些化合物可直接以合成產物形 式用於本發明中。苯基或macorol ide環上的各種取代基可 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） 16 - A7 467743 B7 五、發明説明（14) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 存在於起始化合物中，或者可以在形成縮合產物之後，藉 此技藝中已知之用於取代的方法或用以轉化基團的方法將 取代基引至其中。如果取代基本身具反應性，那麼取代基 本身可藉此技藝中已知的技巧加以保護。可使用此技藝中 習知的各種取代基。關於這些可資利用的取代基之實例可 參考 T.W.Green, ^ Protective Groups i n Organic S y η t h e s ί s 〃，J ο h η W i 1 e y a η d S ο η s，1 9 8 1 β —級醇可藉 此技藝中已知的氧化劑氧化成羧酸或醛，二級醇可以被氧 化成酮。因此，取代反應或置換反應可用來在起始物、中 間產物或最終產物分子上提供多種取代基。對於用以製造 本發明之化合物的生物和人工合成技巧有詳細描述的科學 文獻之實例包括下面所列者，所列出的這些文獻皆併入本 說明中以資參考：

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Nair 等人， Metobo 1 i tes of Pyr enomycetes 17 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X2.97公釐） 4 6 7 743 A7 B7 五、發明説明（15 ) XIII:1 Structure of ( + ) Hypothemyc i n, an Antibiotic Macro 1i de from Hypomyces tr i chotheco i desA , Tetrahedron Letters, 2 1:20 0 1 -2012 (1980),

Ellestad 等人， ^ New Zearal. enone Related Macrolides and Isocoumarins from and Unidentified fungus^ , J. org. Chem., 43(12):2339-2343 (1978), Gatenbeck Sten, ' The Biosin thesis of Oxytetracyc1i ne^ ， Biochemical and Biophysical research Communications^ , 6(6):422-426 (1961/62),

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Bollinger 等人，* V i er neue Metabo 1 i te von Giber a. 11 zeae ： 5-Formyl-zearalenon, 7, ~

Dehydrozeara1enon，8' -Hydroxy- und 8' ~ep i-Hydroxy-zearalenon^ , Helvetica Chimica Acta, 55(8):305-306 (1972)， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4规格（21〇X297公釐） -I i- Γ— n ^J\) V ϋ I - (请先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部令央標準局負工消費合作社印製 18 -

附件2:第84111358號專利申請案^年》月^ 46774^ 中文說明書修正頁 民國9〇年3 ^_______ 五、發明說明（16)

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Communications pp. 761-762 (1967), and

McCpra等人， The Constitution of Monorde, an Antibiotic with Tranqu i1i s i ng Act i on ^ ,

Tetrahedron Letters 15:869-875 (1964)。 作爲激醅抑制劑之用 本發明之化合物都可以在治療用途上作爲激酶抑制劑 以控制晡乳動物之與激酶有關的疾病，特別是可用以控制 與酪胺酸激酶有關的疾病。二羥基苯酸衍生物對於這三種 類型（此三種已知的類型於下文中討論）的蛋白質激酶中 的那一者之特異抑制效果比對於其他類型更佳是決定使用 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐〉 ----------11裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ----訂-----I----'' 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -19 - 4 6 7 743 A7 B7 補充 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（17) 選用何種特定彳έ合'物的依據之一。與酪胺酸激酗有關的疾 病包括細胞過度增生疾病，此疾病由酪胺酸激酶酵素活性 異常所引發/持續。範例包括癌症、動脈硬化、抗血管生 成（如：腫瘤生長、糖尿病、視網膜病）。雖然他種類型 的激酶與特定疾病的相關資料比較少，但是在此技藝中已 經知道在治療上所用的蛋白質酪胺酸激酶（ρτκ)抑制 化合物最好具有選擇性，對於他種類型的激酶來說也是如 此 β 此類 Ρ Τ Κ 抑制劑 quercetin、qenistein 和 staurosporin會抑制除了酪胺酸激酶以外的多種其他蛋白 質激酶，因此它們缺乏特異性且具有高度生物毒性。因此 ，測定生物毒性的例行分析可用以鑑別P T K抑制劑（或 他種激酶類型的抑制劑），會發現這些抑制劑會因爲缺乏 選擇性而造成所不欲的副作用。 三種一般類型的蛋白質激酶之不同點在於其作爲基質 的胺基酸不同：分別是在酪胺酸上加磷氧基的激酶、在酪 胺酸和蘇胺酸上加磷氧基的激酶及在絲胺酸和蘇胺酸上加 磷氧基的激酶。關於選擇性的進一步試驗’應測試化合物 對於這些蛋白質激酶之酵素活性的抑制能力。關於酪胺酸 特定蛋白質激酶述於前文中的背景部分。在絲胺酸和蘇胺 酸上加磷氧基的激酶（最常見的情況）的力子包括R FA 、蛋白質激酶A、蛋白質激酶C和TGF —点受體。 ME K激酶是一種能夠在酪胺酸和蘇胺酸上加磷氧基的激 酶。 在下面關於激酶抑制劑之使用的討論中’此討論針對 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝--------訂i Ι\ά. 私紙張尺度適用中國國家棵準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 20 -

五、發明說明j 18) (.請先間讀背面之注意事項再填寫本頁> 酪胺酸激酗，因爲此激酶最容易受藥物控制。但是，應該 瞭解到，若已經知道作用的特異性，則此處所提到之作爲 酪胺酸激酶抑制劑的化合物也可用以抑制他種激酶類型。 經由實例中所提到的激酶活性分析（或者以不同的激酶代 替實例中所討論的激酶進行相同的實驗），可得知二羥基苯 酸系化合物是否對於特別類型的激酶具有特異性。爲了要 避免過度重覆，下面的討論中以酪胺酸激酶作爲他種類型 激酶之代表來進行討論。因此，除非特別聲明，否則都請參 考A酪胺酸激酶"或，ΡΤΚΛ>的特定用途，在特別的情 況下，以對於任何激酶類型都具有特異性的化合物爲例。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 欲使能夠抑制Ρ ΤΚ或他種激酶類型之一的化合物能 夠用於醫療上，它們必須對於完整的細胞具有活性才行》 已經知道根據抑制經分離之酵素製劑爲基礎所鑑知之ΡΤΚ 抑制劑，其對於抑制天然Ρ ΤΚ的效果欠佳或全然無效。 沒有活性是因爲Ρ Τ Κ抑制劑無法通過細胞膜而達到活性 位址或者是它們無法抑制有高濃度腺甙三磷酸（ΑΤΡ) 或他種因素存在之細胞中的Ρ ΤΚ。已有多種方法能夠測 定Ρ ΤΚ抑制完整細胞上對抗生長因子受體酪胺酸激酶之 能力。細胞的生長因子之處理使得相關的受體迅速地進行 自主性加磷氧基反應，使用抗磷酸激酶抗體便能測得此情 況。同樣地，可以測定其他的細胞外訊息傳遞情況，包括 鈣流通量、肌醇磷酸鹽代謝和細胞的DNA合成。最後， 有療效的Ρ Τ Κ抑制劑必須要能夠封阻所不欲的生長因子 作用所造成的細胞增生情況而且必須要容易偵測才行》 本紙張尺度適用中圈國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公« ) -21 467743 A7 B7 五、發明説明（19) 理論上，本發明之化合物在水及在疏水中度的溶劑中 之溶解度有助於它們穿過細胞膜。各種不溶性化合物在活 體外試驗時，顯示明顯的激酶抑制性。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明之化合物可以游離酸、鹽或水合物形式使用。 所有的形式都在本發明之範圍內。可形成鹼鹽，此形式爲 較便利使用的形式；實施上，鹽形式的用童相當於酸形式 的用量。可用以製備此鹽的鹼包括在與游離酸合併時可形 成藥用上可接受之鹽類（即，對動物器官而言，藥用鹽類 中的陰離子不具有毒性）者，因此緣自游離酸的有利性質 不會因爲陽離子所引起的副作用而蒙受損失。雖然以此酸 化合物之藥用上可接受的鹽類爲佳，所有的鹽類仍可作爲 游離酸形式的來源，即使特別的鹽類目前僅爲中間產物（ 如：當鹽類_僅因純化或鑑定目的而形成或利用離子交換程 序而被用來作爲製造藥用上可接受的載體時之中間產物） 亦然。 經濟部中央標準局負工消費合恨社印製 本發明之化合物具有特定抑制劑活性，可作爲具有治 療價值的蛋白質酪胺酸激酶抑制劑，作爲細胞抗增生劑用 以處理某些情況，包括，如：乾癬和再狹窄。預期本發明 特別可用以治療血管硬化》用以處理一些情況（如：血管 硬化）時，某些人被列爲高危險群，如：因爲遺傳、環境 或病史》本發明之化合物可用以避免或延遲這些狀況的發 生或復發，亦可用以處理這些狀況。 本發明之化合物可以施用在各種哺乳類豢養物上*即 ，可以與各種藥用上可接受的惰性載體以片劑、膠囊、錠 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2ί〇Χ297公釐） _ 22 - 467743 A7 B7 五、發明説明（2〇 ) 劑、硬粒、粉末、噴劑、甘香酒劑、糖.獎或滴眼露及類似 的形式以所選施用形式（如：口服、或非經腸）方式施用 。此處所謂的非經腸施用途徑包括：靜脈內、肌肉內、皮 下、眼部、滑膜內、經表皮（包括皮膚、眼部、舌下和頰 )、局部（包括眼部、真皮、直腸、利用吹氣法由鼻部吸 入的氣凝膠）及直腸系統。 此活性化合物可以口服施用，如：與惰性稀釋劑或與 可消化可食用載體一併施用，或者可以包封在硬或軟膠囊 中•或者可以壓成錠，或者可以直接混入食物中。就口服 療劑而言，此活性化合物可以與賦形劑混合，以能被攝取 的片劑、口含錠.、啶劑、膠囊、佐藥、懸浮液、糖漿、雙 層扁片及類似物。這樣的組成物及製劑的活性化合物含量 應在0 . 1 %以上。當然可以改變組成物和製劑的百分比 ，其值介於約2至約6重量％之間。活性化合物的量使得 治療用的組成物具有適當的劑量。根據本發明之較佳的組 成物或製劑之製得方式使得口服製劑中含有約1至1 0 〇 毫克的活性化合物β 片劑、錠劑、丸劑、膠囊之類亦含有下列物質：黏合 劑（如：聚乙烯吡咯啉酮、西黃蓍膠、金合歡膠、蔗糖、 玉米澱粉或明膠）；賦形劑（如：磷酸鈣、檸檬酸鈉和碳 酸鈣）·；粉碎劑（如：玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、某些錯合 矽酸鹽、藻朊酸之類）；潤滑劑（如：月桂基硫酸鈉、滑 石和硬脂酸鎂）；甜味劑（如：蔗糖、乳糖或糖精）：或 調味劑（如：薄荷油、白珠樹油或櫻桃調味料）。類似類 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS > Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ^裝· *?τ 經濟部中央標準局員工消f合作社印製 -23 - 467743 A7 B7 五、發明説明（21 ) 型的固體組成物亦可作爲軟和硬充填的膠囊之填料；此處 所用較佳的材料亦包括乳糖或牛奶糖及高分子量的聚乙二 醇。當製劑是膠囊時，它除了上述類型的材料以外還可以 含有液態載體。各種其他的材料可以覆層形式存在，或者 用以修飾此製劑的物理形式。舉例言之，片劑、丸劑或膠 囊可覆以蟲膠、糖或此二者。糖漿或佐藥可以含有活性化 • · 合物、作爲甜味劑之用的蔗糖、作爲防腐劑之用的對羥基 苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯、染料、作爲調味劑之用 的櫻桃或柳橙調味料、乳化劑和/或懸浮劑及稀釋劑（如 :水、乙醇、丙二醇、甘油和各種類似的組合）。用以製 備任何製劑的任何材料都必須要具有藥用純度且其用量不 應具有毒性。此外，此活性化合物可以混入緩釋型製劑及 配方中。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 此活性化合物亦可以非經腸或腹膜內的方式施用。就 非經腸施用而言，所施用者可以是在芝麻油或花生油中之 溶液、丙二醇之水溶液、前述之相對應的水溶性鹼金屬或 鹼土金屬鹽之無菌水溶液。逭些水溶液以緩衝溶液爲佳， 必要時，先用足量的鹽水或葡萄糖使液態稀釋劑呈等滲透 壓狀態。游離鹼形式的活性化合物或藥用上可接受的鹽之 溶液可於水中製成，其中可以混有界面活性劑（如：羥芮 基纖維素）。亦可於甘油、液態丙二醇和其混合物及油中 形成分散液。在一般的儲存和使用情況下，這些製劑中可 含有防腐劑以免微生物生長。這些特別的水溶液特別適用 於靜脈、肌肉、皮下及腹膜內注射上。此處，所用的無菌 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） : ' 經濟部中央標率局員'X消費合作杜印製 ；4 $ 7 7 4 3 A7 B7 五、發明説明（22 ) 含水介質可藉嫻於此技藝之人士習知的技巧而輕易製得。 適用於注射的藥用形式包括無菌水溶液或分散液及作 爲暫時製劑之用之由無菌粉末製成的無菌往射溶液或分散 液。在所有的情況中，所用的形式須爲無菌且必須是容易 注射的液體。它必須穩定地處於製造及儲存的情況下，且 必須要能抵擋微生物（如：細菌和黴菌）的污染β此載體 ...... 可以是溶劑或分散介質，包括，如：水、甲醇、乙醇、多 元醇（如：甘油、丙二醇、液態聚乙二醇之類）、其適當 的混合物及植物油，藉由使用覆層（如：卵磷脂），藉由 使得分散液中維持所欲的粒徑及藉由使用界面活性劑，能 夠維持適當的流動性。各種抗菌劑及抗黴劑（如：對羥基 苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、乙基汞硫代水楊酸鈉（ thimerosal)之類）可以避免微生物作用。在許多情況中 ，最好是含有等滲透壓劑（如：糖或氯化鈉）。使用延緩 吸收劑（如：一硬脂酸鋁和明膠）可以延緩可注射組成物 之吸收。 無菌注射液之製法是：將所欲量的活性化合物混入內 含有所須之上述其他成份的適當溶劑中，繼而過濾殺菌。 通常，分散液的製法是藉由將經過殺菌的活性成份摻入已 含有基礎分散媒質及所欲之其他成份的無菌媒質中而製得 。以無菌粉末製備無菌注射溶液時，較佳的製備方法是以 真空乾燥或冷凍乾燥技巧處理前述之經過無菌過濾的溶液 ，形成活性成份粉末及所欲的其他成份。 在局部施用上，無菌的含水稀釋溶液（通常濃度約 本紙張尺度適用中國國家;^隼（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） ~ -25 - (請先閲资背面之注$項再填寫本頁)

經濟部中央標準肩員工消費合作社印製 4 6 7 7 4 3 a? __B7 五、發明説明（23 ) 0.1%至5%)及類似於上述的非經腸溶液在適用於逐 滴施用在眼睛上的容器中獲得。 本發明的治療用化合物可以單獨施用在或與藥用上可 接受的載體一起施用在哺乳動物上。如前面所述者，活性 成份與載體的相對比例由化合物的溶解度和化性、所選用 的施用方式及標準治療程序而定。 最適用以預防或治療的本療劑之劑量視施用方式'所 選用的化合物及特定病患接受治療時的生理狀況而定。通 常，一開始使用的劑量小*必要時，會微幅增加至達到最 適狀況爲止。根據以大頰鼠進行的生理研究結果得知：用 以治療病人的每日劑量通常約0 . 0 1毫克至約1 0 0毫 克/公斤體重，或者是約0 . 4毫克至約1 0克以上，此 劑量可於一天中單次或分.多次地施用。口服施用時所須的 劑量較髙β 這些化合物可以口服或非經腸施用，或、者以滴眼液形 式局部施用，每日施用量約0 . 1毫克至約1 0毫克/公 斤體重，可單次或分多次施用。在個特殊的情況下，當然 可由內科醫師建議使用超出此範圍的劑量。 在包含式I或其於藥用上可被接受之鹽類的藥用組成 物中，載體對活性成份之重量比通常爲1 : 4至4 : 1， 以1:2至2:1爲隹。但是，在特定的情況下，此比例 將視多種因素（如：活性組份之溶解度、所摻入的劑量及 精確施用方式）而定。 已經對本發明作了簡述，參考下列實例將能夠更瞭解 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2〖0_X_297^ ) 1 l^i ^^^1 ^^^1 ^^^1 ^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂_ -26 - 4 6 7 74 3 A7 _ B7__ 五、發明説明（24 ) 本發明，除非特別聲明，否則所提出的實例僅作爲說明之 用，不欲對本發明造成任何限制。 眚例 實例1 .化合物2 9 之製備 發酵.C 2 9 2 F E，Curvular ia種，在裝有生長培 養基（膠、4 . 0克/升酵母萃出物、1 〇 . 〇克/升麥 芽萃出物、4 . 0克/升蔗糖和0 · 〇〇 5毫升/毫升微 量元素）的perti盤中於2 8。0、8 0%濕度下培養。將 菌絲和玻璃珠浸在含.有4 . 5毫升1 〇%甘油和5%蔗糖 的溶液中，形成均勻懸浮液^含有3 0毫弁種子培養基（ 20.0克/升葡萄糖、15.0克/升藥用培養基、 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先Μ讀背面之注#項再填寫本頁) 3 · 0 克/升（NH4)2S04、0 · 03 克/升 ZnS04· 7H20、4 .0 克/升 CaC03、5 · 0 克/升酵母萃出物及加至1升的H2〇)的2 5 0毫升三 角瓶中添加1 - 2毫升經浸濕的菌絲β此種子瓶在迴轉式 振盪器中於250rpm、高度50毫升、28°C下培養 2天。 自種子瓶中取出1毫升母液移至位於2 5 0毫升三角 瓶中之pH7 . 0的30毫升發酵培養基（60 0克/ 升甘露糖醇、12 · 5克/升大豆粉、2 . 5克/升檸檬 酸、0 · 5克/升酵母萃出物及加至1升的H20)中’ 於類似的狀況下在迴轉式振盪器中培養5 - 6天。 茬取.此實例中，由2 5 0毫升振盪瓶得到1 5升發 本紙張尺度適用中國國家襟準（CNS ) A4规格（210X297公釐） -27 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4 67743 A7 __B7 _ 五、發明説明（25 ) 酵物，每個瓶中含有3 0毫升肉湯。在自振盪板移出後的 5分鐘之內將約1 5毫升的乙酸乙酯加入每一個瓶中。然 後，將每個瓶中的內容物加以合併，以抽氣濾經聚丙烯膜 的方式，將液體中的菌絲移走》使菌絲溶解於2升乙酸乙 酯中並迅速均化以瓦解細胞。過濾此混合物，保留濾液。 再重覆此步驟3次。得自菌絲的乙酸乙酯層與含水萃出物 合併，以硫酸鈉加以乾燥並過濾。以迴轉蒸發法將溶劑移 走之後，所得的渣質以真空幫浦乾燥一夜。粗萃出物產量 爲 2 . 5 6 5 克。 C P C分餾.粗萃出物於P C (含有"三重#線圈管 柱的高速對流層析）上進行CPC分餾。體積比爲1:3 :3的正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水混合並靜置一夜使其 沉積。下層抽至C P C管柱中作爲固定相。上層作爲流動 相。此管柱的轉動速率爲1 040 r pm，流率是3毫升 /分鐘。注射物爲溶解於5毫升上層液和5毫升下層液中 的4 0 0毫克粗萃取物。光二極管偵測器於2 7 0 nm偵 測代謝產物。具有活性的代謝產物於9 6至1 1 4分鐘時 與不具有活性的異構物一起被沖提出。這些餾份與另五個 由CPC分餾所得合併，得到75.6毫克兩種代謝產物 之混合物。 Η P L C分餾.前面所得到的混合物於下列條件下進 行Η P L C分餾：分析用C 18_管柱（8 X 1 0 0毫米， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐) —ί-------〇 裝-------訂-------- (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) -28 - A7 467743 _B7__ 五、發明説明（26)

Waters, Nocapak)流速1毫升/分鐘；每次注射 0.5毫克溶解於10毫升二甲亞碉（DMSO):於 270nm偵測；初條件：70%水/30%乙睛至 10 0%乙睛（線性梯度，時間長達8 0分鐘以上）； 16 . ’9 0分鐘出現第一個峰（不具有活性的代謝產物） ，1 8 . 74分鐘出現第二個峰（具有活性的代謝產物） 0 里横物之縳化及分離.C2 9 2FE形成兩種代謝產 物，其不同點在於大環中的兩個雙鍵之一之幾何形狀。將 得自CPC分餾的1 67毫克溶解於DMS0，所得溶液 之濃度爲1毫克/10毫升。50毫升（5毫克）以 HPLC (25公分X100公分，5毫升）分餾以便將 異構物加以分離。一開始的管柱條件爲3 5%甲醇/6 5 %水。流速爲8毫升/分鐘，利用時間長達2 5分鐘以上 的線性梯度使最終條件爲9 0%甲醇/10 %水。在這樣 的情況下，反式異構物（不具活性者）於1 1 · 3分鐘時 沖提出，順式異構物（具活性者）於1 2 . 2分鐘時沖提 出。分別收集每個峰並以迴轉式蒸發器加以乾燥。第一次 以HP L C分餾得到1 1. 7毫克的順式異構物和6 3毫 克的反式異構物》以質子NMR光譜儀測定順式異構物之 純度，再度使反式異構物懸浮於甲醇中（濃度爲5毫克/ 1 _ 5毫升）》將此溶液置於石英容器中並以紫外光照射 3 5 分鐘（Rayonet Photochemical Reactor低壓隶燈） 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 29 _ L.--------裝 II . -/ ·. (請先閲翁背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 A7 B7 467743 五、發明説明（27) {請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 。照光之後，溶液迴轉式蒸發器加以乾燥，懸浮於 〇1^5〇中（1毫克/10毫升），再於前述條件下進行 Η P L C分餾。重覆此步驟直到所有的反式異構物都經過 處理。順式異構物的總產量是2 4毫克。此化合物（ C292)的完整結構如下：

眚例2 .化合物2 9 2釾於蛋ή晳激酯酵素活件之抑制丨作 a. 經濟部中央標準局貝工消費合作社印聚 生長因子（如：P D G F、F D F和E G F )對於細 胞增生的刺激效果與其導致各個受體酪胺酸激酶之自主性 加磷氧基作用有關》因此，P T K抑制劑抑制由這些生長 因子誘發的細胞導生作用之能力與其封阻受體的自主性加 磷氧基作用之能力有直接的關係。測定石_ P D G F受體 的自主性加磷氧基作用時，使用中國.田鼠的卵巢細胞線（ HR5)(已經將其cDNA改變成人類/3 — PDGFR ).。將這些細胞以1 0，0 0 0細胞/槽的量植入微滴定 盤（Falcon 96 槽盤）中並於 P RM I (Gibco BRL)中與 1 0牛胎兒血清於3 7 °C培養3天，使其融合a將槽中的 培養基移走，以1 0 0毫升無血清的PRM I代替，於 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ -30 - Λ 67 74 3 Α? _______Β7_ 五、發明説明（28 ) 3 7 °C培養1 8小時。在槽中添加化合物（〇 . 〇 1 _ 30以Μ) ，15分鐘之後，添加PDGF B B ( 1 0 0微毫克/毫升），於3 7°C培養1 0分鐘。取出培 養基，在每一槽中添加5 〇毫升新製得的溶胞緩衝溶液（ 2 0 m M Tris(pH7.3)，15〇mM Na CJ? > 1 % Triton Χ-100» ImM PMSF、 lmM原釩酸納，1 0毫克/7毫升抑狀酶（aprotinin) 和1 0毫克/毫升亮肽素（leupeptin))，劇烈振動每 個槽，製得溶胞產物。此溶胞產物於2 6 0 O r pm離心 1 0分鐘而呈澄清，然後進行分析。 在獨立的微滴定盤中，藉由在每個槽中使0 . 5毫克 單株抗體 1B5B11 於 23mM T r i s ( p Η 8 . 0) 、68mM NaC^ ，14mM碳酸氫銨和 經濟部中央橾準局員工消費合作社印聚 (請先間讀背面之注意事項耳填寫本頁) 0 . 0 1 %疊氮化鈉於4 °C培養1 8小時而使阻抗— PDGF受體細胞外範圍的抗體1 B 5 B 1 1固定。固定 抗體之後，槽以25mM N—（2—羥乙基）哌嗪一 Ν' — (2 —乙基硫酸）（HEPES)pH7.6、 l〇〇mM NaC 芡和 0.2% Tween 20封阻，然後 立即添加瑢胞產物（已經以結合緩衝液（含0 · 3 %明膠 的封阻緩衝液）以1:2比例稀釋）《此溶胞產物與固定 之用以阻抗P DG F受體的抗體於室溫下培養2小時，槽 以200毫升清洗用緩衝液（PBS，0 · 01%

Tween 20)清洗 3 次。 欲偵測yS — PDGF受體加磷氧基 作用程度，添加濃度爲1.25毫克/毫升的抗加磷氧基 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -31 A7 B7 467743 五、發明説明（29) (請先閲讀背面之注意-Ϋ項再填寫本頁) 作用兔抗體.（Upstate Biotechnology., Inc.，（UBI))並 於3 7 °C培養1小時。將抗加磷氧基作用抗體移走之後， 此盤以與山葵結合的抗兔I gG (Boehringer Mannh_eim )以1 : 1 0 0 0的稀釋比例一起培養，然後添加過氧酶 培養基（厶8丁8111*)。使用微滴定盤記錄器於6 5 0 nm偵測產物之形成。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 在MDA MB 468 細胞（ATCC#HTB 1 3.2 )中測定E G F受體的自主性加磷氧基作用。將人 類的腫瘤細胞線覆於E G F受體上。這些細胞在6槽盤中 生長 * 於不含血清的 D u 1 b e c c 〇 s Μ 〇 d i f i e d E a g 1 e M e d i u m (DMEM)中培養18小時。於37°C下，使這些細胞 暴於各種濃度的化合物下達15分鐘，然後暴於EGF( 1 0 0毫微克/毫升）下1 0分鐘。將細胞刮下，在與用 於HR 5細胞之相同的緩衝液中製成溶胞產物，然後以習 用的SD S PAGE法進行分餾，繼而進行Wes ter η斑 痕分析。此時，將蛋白質轉移到硝基纖維素上，膜在 T r i s 鹽水（ρΗ7,0，0·1% Tween 20 * 5 96 乾乳）中被封阻。於室溫下，此膜以抗加磷氧基作用抗體 (UB I ，1微克/毫升）在結合緩衝液（TB S， 0.1% Tween 20，1%乾乳）中2小時以形成斑點。 使用與山羊抗兔_山葵過氧化酶結合的I gG ( Boehringer Mannheim)偵測。使用化學發光系統（ A m e r s h a m )顯影。 爲了要測定FGF受體_1_自主性加磷氧基作用， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' 經濟部中央標準局員X消費合作社印装 4 8 7^4-3 a7 B7 五、發明説明（30 ) 使用標準技巧使人類F G F受體一 1 c D N A穩定地固定 在CHO細胞中。這些溶胞產物在PRM I中生長至與 1 〇 %牛胎兒血清精合，培養基以不含血清的P RM I代 替，培養1 8小時，在有或無PTK抑制劑（濃度爲 〇 . 1 — 30#M)存在的情況下，以ySFGF (75微 毫克/毫升）於3 7 °C刺激1 0分鐘。在如前述之用於 E G F受體分析之相同的條件下製得溶胞產物。溶胞產物 與單株阻抗F G F受體- 1細胞外範圍的抗體（由 COR Tecrapeutics，South San Francisco, CA製造）一 起培養，以前面所述之用於EGF受體的方法，使用抗磷 酸酷胺酸（antiphosphotyrosine)對免疫受體進行 SDS — PAGE和Wes tern斑痕分析。如圖1所示者， 化合物2 9 2有效地抑制PDGF受體的自主性加磷氧基 作用，其I C50=6 _ 2nM，濃度>200nM時可達 到完全抑制的效果。這些結果由使用抗磷酸酪胺酸抗體的 HR 5細胞溶胞產物之SD S — PAGE和We stern斑痕 分析得到證實（數據未示）。以前認爲staurosporin是最 具效力的P D G F受體酪胺酸激酶抑制劑。直接比較時， 2 9 2 的效力是 s t a u r 〇 s ρ 〇 r i η 的 1 0 倍，是 s 1; a u r 〇 s ρ 〇 r i η 類似物（K252a)的45倍（參考下面的表2)。這 些結果證實2 9 2是完整細胞的PDGF受體自主性加磷 氣基作用之非常有效的抑制劑，它顯示此化合物在活體中 具有活性，容易達到治療濃度。 測定2 9 2對於PDFG受體酪胺酸激酶的抑制效果 本紙張尺度適用中國國家標準（C.NS ) A4規格d〇X297公着) (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) --------〇 裝. —33 — 4 67 743 五、發明説明（31 ) A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 是 否具 有 選 擇 性 1 評 估 它 對 於 與 Ε G F 和 F G F受 體 Use. 酪 胺 酸 激酶 相 當 接 近 者 所 造 成 之 影 響 〇 訝 異 地 發 現到： 直 到 2 9 2 濃 度 高 至 3 0 β m * 都 未 能 觀 察 到 它 會 抑制 Ε G F 或 F G F 受 體 之 白 主 性 加 磷 氧 基 作 用 > 但 此 兩 種受 體 會 被 K 2 5 2 a ( I C 5 0 = 1 m Μ ) 所 抑 制 ( 表 2 )° S r C Ρ Τ K 與 受 體 Ρ Τ Κ 之 具 有 酵 素 活性 的 部 分 中 有6 0 — 8 0 % 的 胺 基 酸 序 列 相 同 > 且 分 子 傳遞 訊 息 使 細 胞增 生 的 程 度 皆 爲 中 等 〇 和 受 體 Ρ T Κ 不 同 ，此 S r C 蛋 白質 不 含有 細 胞 外 或 透 膜 部 分 ) 因 此 jfnrt m 法 直 接作 爲 細 胞 外刺激 的 受 體 0 進 步 地 試 職 2 9 2 的 特 異 性 ，評 估 其 對 於 再度 合併 的 C — S r C ( UBI cata1c | g # 1 4 -1 17) 之 抑 制 能 力。 局 了 要 使 此 分 析 結 果 能 與 9 6 槽 微 滴 定板相 比 較 r 在 每一 個 槽 ( 2 3 m Μ T i r S 1 Ρ Η 8 0， 0 .6 8 m Μ Ν a C 1 4 m Μ 碳 酸 氫 銨 和0 • 0 1 % 曼氮 化 鈉 ) 中 添 加 0 « 5 毫 克 的 S r C — 基 質胜 肽 — 2 — (UBI ca t#12 -140 ) 〇 固 定 胜肽 之 .， 清 洗 此 槽， 然 後 以 2 5 m Μ Η Ε Ρ E S P Η 7 * 6 > 1 0 0 m Μ N a C 又 % 0 • 2 % Twe e η 2 0封阻< •在每個槽中添加 1 0 0 毫 升 反 應 混 合 物 ( 内 含 有 濃 度 0 - 0 3 —3 0 m Μ 試 驗化 合物 \ 5 0 m Μ A Τ P 和 1 0 單 位 的 c — S r C 於 5 0 m Μ Τ r i s r Ρ Η 7 2 5 m Μ Μ η C Si 2 - 5 m Μ Μ η C % 2 0 • 0 5 m Μ Ν a 3 V 0 4 = 1 0 0 m Μ Η E Ρ Ε S Ρ Η 7 T 5 % 甘 油 和0 0 5 % 壬基 苯 氧 基 聚 乙 氧 基 乙 醇 ( Ν Ρ 4 0 ) ) 中以 引 發 此 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格U10X：297公釐） 一 34 ~ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本買) :裝· 6 d 7743 a7 ___B7_ 五、發明説明（32 ) (請先間讀背面之注意事項再填窝本頁) 激酶反應。於37 °C培養20分鐘之後，藉由添加1 0 Si Si 5 0%醋酸以中止反應，清洗此槽，在前述用以偵 測加磷氧基化的P D G F受體的情況下，使用抗磷酸酪胺 酸抗體偵測酪胺酸加磷氧基化的基質。化合物2 9 2抑制 s r c激酶的I C5〇=l 0«αΜ，此濃度爲抑制 PDGF受體之自主性加磷氧基作用所須濃度的1 6 0倍 。另一方面，staurosporin和Κ 2 5 2 a封阻s r c激酶 的I C5。值分別是2〇nM至50nM〇這些結果顯示： 2 9 2對於抑制P D G F受體激酶活性具有高度選擇性， staurosporin和K 2 5 2 a抑制s r c激酶活性的能力差 不多或略高。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 staurosporin除了能有效地抑制受體酪胺酸激酶以外 ，也已經知道staurosporin能夠抑制蛋白質激酶C之活性 。已證實蛋自質激酶抑制劑對於阻抗多種酪胺酸激酶具有 廣泛的活性，亦能抑制絲胺酸/蘇胺酸激酶之活性。欲瞭 解2 9 2是否也會抑制絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶，在製 造商（UBI，Cat% #17 — 112)所描述的條 件下，使用U B I的非光活性激酶分析來進行蛋白質激酶 A (PKA)和蛋白質激酶C (PKC)分析》化合物 2 9 2與staurosporin及K 2 5 2 a比較，使這些化合物 的每一者於0 . 025 — 40/zM的濃度範圍內進行試驗 。如表2所示者，化合物2 9 2濃度爲4 0 μΜ時， PKC或PKA活性都不會降低至5 0%，此濃度比抑制 PDG F受體激酶活性所須濃度大6 0 0 0倍以上。對於 本紙張尺度逋用;^1國家標準（（：呢）八4規格（210父297公釐） -35 - 467743 A7 B7 五、發明説明（33 ) 絲胺酸/蘇胺酸激酶而言* 2 5 2 a是最具抑制效果者， 它抑制PKA活性的I C5O=70nM，抑制PKC活性 的 I C5t}= 1 〇 Ο nM ;而staurosporin 抑制此二種激酶 的I C50 = 7 0 _ 8 O nM。這些結果證實一些激酶抑制 劑（如：staurosporin和K 2 5 2 a )缺乏選擇性， 2 9 2對於P D G F受體的選擇性是對於他種受體酪胺酸 • · , . 激酶、s r c激酶和絲胺酸/蘇胺酸激酶的1 0 〇倍以上 。逭樣的選擇性大幅提髙了 2 9 2在治療至少有一部分係 因PDGF而引起的疾病（如：動脈硬化、某些癌症、絲 球體腎炎和血管成形術之後的再狹窄）之療效之選擇性。 (請先閲请背面之注$項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -36 - 4 67743 a? B7 五、發明説明（34 ) 表2 蛋白質激酶活性之抑制 I C50 UM〕 (請先閎讀背面之注意事頃再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 化合物 ^PDGFR E GF R F GFR s r c —激酶 PKA PKC 2 9 2 0.006 >30 >30 1.000 >40 >40 K2 5 2 a 0.270 1.0 未測定 0.020 0.070 0.100 staurosporin 0.070 未測定 未挪定 0.070 0.070 0. 080 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -37 — 4 67743 A7 B7 五、發明説明（35 ) 以2 9 2抑制細胞增生_ (請先閲請背面之注意事項再填窝本頁) 欲定出作爲P TK抑制劑之用的療效’必須證實它封 阻細胞增生（細胞增生係因應生長因子’此會引發因細胞 增生而發生的疾病）的能力。許多報導中指出PDGD與 多種疾病有關（如：絲球體腎炎、動脈硬化和再狹窄）’ 吾等試驗2 9 2於封阻P D G F誘發細胞增生作用的能力 。將人類主要的纖維織母細胞線HS68 (ATCC)以 1 5 0，0 0 0細胞/槽植入9 6槽盤中之含有1 0%牛 胎兒血清的DM EM中。此細胞於3 7°C培養7 — 1 0天 ，使它們融合及靜止。添加濃度爲5 — 1 2 0 nM的化合 物2 9 2 ; 3 0分鐘之後’添加5 0毫微克/毫升 P D G F B B以刺激這些細胞，並於3 7 °C培養1 8小 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 時。欲測定紐胞增生量，在每個槽中添加2 m C i的 〔3H〕_胸腺核甙並再培養5小時6然後以5 6%冷的三 氣乙酸（TCA)清洗此細胞·溶解於0 . 2N NaOH和〇 · 1%SDS中，測定〔3H〕胸腺核甙的 增加量，比較以DPGF BB處理的細胞及未經處理的 細胞，前者的胸腺核甙量提高5 - 10倍（數據未示）。 如圖2所示者，經化合物2 9 2封阻的DPGF BB於 1 6 nM時，胸腺核甙的量提高5 0%，其濃度爲1 2 0 η Μ時將會完全抑制絲狀分裂。2 9 2的濃度與封阻 HR 5細胞中之P D G F受體的加磷氧基作用所須用量有 密切的關聯存在。 欲測定2 9 2是否具有非特異的抗增生效用或具有生 本紙張尺度適用中國國家輕準（CMS ) A4規格（210X297公釐） -38 - A7 B7 4?ΤΤ43 五、發明説明（36 ) (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 物毒性，於組織培養的檩準條件下，測定它對於人類細胞 線（如：得自 ATCC 的 HS68、HS27、 CCD18和WS1)之影響。在有或無292、 s t a u r 〇 s ρ 〇 r i η 或 K252a (濃度 〇 . 01 — 30"Μ) 存在的情況下，細胞均勻地植入9 6槽微滴定盤（ Falcon)之含有1 0%牛胎兒血清（3 . 5 X 1 03細胞 /槽）的標準組織培養基中。然後使此細胞在標準組織培 養條件下成長96小時，同時以3.3%戊醛固定，以 H20清洗並以〇 . 〇 5%的甲基藍（Sigma)染色。染色 之後，清洗這些細胞，染料以3%HC i?沖出，使用盤記 錄器（Molecular Devices)測定6 6 5 nm處的吸收。 藉由比較有或無化合物存在時的讀數，可以知道細胞增生 的抑制百分比。如表3所示者，以濃度高至1 〇 的 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 2 9 2處理之，所測試的細胞線的細胞生長未減少，以濃 度爲3 0 Μ Μ的2 9 2處理之後，細胞生長僅略爲降低.（ 10-20%)。相反地，濃度爲ΙΟηΜ的 staurosporin完全封阻了所有細胞線的生長，濃度爲1 — 1 2 的K 2 5 2 a抑制了 5 0%的細胞成長，其中以 CCD 18細胞最爲敏感。這些結果證實： staurosporin是一種不具特異性的蛋白質激陶抑制劑，因 此它在抑制激酶活性所須的濃度下，具有非特異性抗增生 或生物毒性效果《另一方面，2 9 2在標準組織培養條件 下，濃度爲封阻P D G F誘發之細胞絲狀分裂所須濃度的 1 0 0 0倍以上的濃度下，也不會對H S 6 8細胞的生長 本紙張尺度適用中國國家標準（(：!^)八4^格（210父297公釐） -39 - 4 67743 a7 __B7五、發明説明（37) 造成影響。這些結果顯示：2 9 2於其濃度遠低於會引發 生物毒性之濃度的情況下，便能抑制P D G F受體激酶活 性而達到療效。 表3 在正常組織培養條件下，對於細胞增生的抑制效果 I c 5 〇 C ^ M ] 分析物種 CCD18 HS27 WS1 HS68 抑制劑 2 9 2 >30 >30 >30 >30 staurospor i η <0.01 <0.01 <0.01 <0. 01 Κ 2 5 2 a 1 12 5 5 —Γ-------裝 — I (請先閱讀背面之注$項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 此處所列之所有的文獻和專利說明書皆併入本文中以 資參考。 _本發明不限定於此處所示之特定實施例及描述，可以 在不違背本發明及所附之申請專利範圍之精神和特徵的情 況下作各種變化及修飾。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -40 -

Claims (1)

1. 六、申請專利範圍 附件一A : 第8 4 1 1 1 3 5 8號專利申請案 ...___________________________中文申請專利範圍修正本 I ! (请先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) |公告本j 民國9 0年3月修正 1 · 一種活體外特異地抑制蛋白質激酶的方法’其特 徵爲包括如下步驟： 使含有蛋白質激酶的組成物與如下式的分子接觸：

   其中： Ri是H、低碳烷基或低碳烷醯基； R2是Η、低碳烷基或低碳烷醯基； R3和R4 —起代表順式雙鍵或_〇—，或者， 和R4分別代表Η或OR : R5 是= 0、=S 或- H、一 OR; 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 Re和R7 —起代表順式雙鍵或一 〇 —，或者， 和R7分別代表Η或OR ; R8和119 —起代表順式雙鍵或一 〇—，或者，Re 和R9分別代表Η或OR ;而 每個R分別代表Η、低碳烷基或低碳烷醯基。 2 .如申請專利範圍第1項之方法，其中，Rn代表 I 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 743 Α8 BS C3 D8 六、申請專利範圍 c Η 3 。 3 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中，代表 Η。 4 .如申請專利範圍第1項之方法，其中，尺^和尺^ 代表雙鍵。 5 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中，Rs代表 =0 。 6 .如申請專利範圍第1項之方法，其中，r 6和R 7 分別代表Ο Η » 7 如申請專利範圍第1項之方法，其中，118和113 代表雙鍵。 8 _如申請專利範圍第1項之方法，其中，Ri代表 CH3’ r2代表Η，尺3和1^4代表雙鍵，115代表=〇， Re和分別代表0Η，Rs和Re代表雙鍵》 9 .如申請專利範團第1項之方法，其中，8位置上 的碳爲S構形且9位置上的碳爲S構形。 1 0 .如申請專利範圍第1項之方法，其中，3位置 上的碳爲S構形。 1 1 .如申請專利範圍第1項之方法，其中，該組成 物包含哺乳動物的體液。 1 2 ·如申請專利範圍第1 1項之方法，其中，該體 液是血液或血液的一部份。 3 .如申請專利範圍第1 1項之方法，其中，該激 酶是酪胺酸激酶β 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2扣χ 297公釐） ------------ :裳 i Ϊ ./· ·、 (锖先Mt«背面之注意事項再填寫本頁) :Li '5J. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 AS B8 C8 D8 467743 六、申誚專利輕^圍 八 1° 4 .如申請專利範圍第13項之方法，其中，該酪 胺酸激酶是PDGF受體。 1 5 .如申請專利範圍第1 1項之方法，其中，該方 法另包含在有或無該抑制劑存在的情況下，測定該體液中 的酪胺酸激酶活性及該組成物中的酪胺酸激酶或酪胺酸激 酶之基質濃度與該激酶活性的關係。 1 6 . —種用於控制哺乳動物之與激酶有關疾病的秦 學組成物，其特徵爲其包含能夠特異地抑制酪胺酸激酶之 有效量的下式化合物及其藥學上可接受之載劑， ---I--------. ·裝·-- (請先閱訝背面之注意事項再填寫本頁) Rn0 其中 or2 Ιό CH3 r3 16a 13a 13 12 10 |8 R5 Rt -5J R9 r6 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 111是1^、低碳烷基或低碳烷醯基； R2 、低碳烷基或低碳烷醢基： R3和尺4 一起代表順式雙鍵或一 0 —，或者，R 和R 4分別代表Η或0 R ; 是==0、= S 或-Η、- OR ; r6和只7 —起代表順式雙鍵或一 〇 —，或者，R 和R7分別代表Η或〇R ; R8和尺9 一起代表順式雙鍵或—◦一，或者 和R 9分別代表Η或0 R ;而 私紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21C1 x 297公楚）_ 3 一 R 467743 | D8 六、申請專利範圍 每個R分別代表Η、低碳烷基或低碳烷醯基。 1 7 .如申請專利範圍第1 6項之組成物，其中， R i代表C Η 3，R 2代表Η，R 3和R 4代表雙鍵，R 5代表 =0 ’ R 6和R 7分別代表〇 Η，R 8和R 9代表雙鍵。 1 8 ·如申請專利範圍第1 7項之組成物，其中，8 位置上的碳爲S構形且9位置上的碳爲S構形。 1 9 .如申請專利範圍第1 8項之組成物，其中，矛 位置上的碳爲S構形。 ---III------ I --- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）_ 4 —