CN1165481A - 抑制蛋白激酶的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

披露了一种选择性地抑制一种激酶的方法，该方法包括让含有一种激酶的组合物与式(I)所示的一种分子接触，式(I)中R1是H，低级烷基、或低级烷酰基；R2是H，低级烷基、或低级烷酰基；R3和R4共同表示一个顺式双键或-O-，或者R3与R4各自单独为H或OR；R5是=O、=S、或-H、-OR；R6和R7共同表示一个双键或-O-，或者R6与R7各自单独为H或OR；R8和R9共同表示一个双键或-O-，或者R8与R9各自单独为H或OR；而每个R单独为H、低级烷基或低级烷酰基。

Description

抑制蛋白激酶的方法和组合物
本发明涉及蛋白激酶、特别是酪氨酸激酶的抑制剂，及其在激酶及其底物的分析中的应用和在抑制依赖于激酶的过程、如细胞生长中的应用。
酪氨酸特异性蛋白激酶(酪氨酸激酶)代表了这样一族酶：其能够催化腺苷三磷酸的末端磷酸向蛋白质底物上的酪氨酸残基转移。被鉴定的这一类酶的第一批成员是与病毒基因(被称为癌基因)相关的酪氨酸激酶，所述基因可进行细胞转化(即：pp60v-src和pp98v-fps)。后来证实，存在这些病毒基因产物的正常细胞对应物(即pp60c-src和pp98c-fps)。被鉴定的第三类酪氨酸激酶是那些被称作生长因子受体的激酶，包括胰岛素受体、表皮生长因子(EGF)受体、血小板衍生生长因子(PDGF)受体、成纤维细胞生长因子(FGF)受体和p185HER-2受体。据信，所有上述酪氨酸激酶都能通过底物磷酸化的方式在若干细胞功能的信号传导中起着重要作用。
尽管信号传导的确切机理尚有待于阐明，不过，业已证实酪氨酸激酶是有关细胞增殖、癌的发生和细胞分化的重要作用因子。
用一种或几种生长因子处理细胞，可触发细胞的复制，所述生长因子的例子有FGF、EGF、和PDGF。这些生长因子能与其相应的受体发生特异性相互作用，所述受体包括一个胞外结构域、一个跨膜结构域和一个胞质结构域，其具有酪氨酸激酶的酶促活性。据信，当一种生长因子与细胞表面上的、其受体的胞外结构域结合时，可启动细胞增殖。这种生长因子-受体结合能诱发受体的二聚化，从而导致受体的自磷酸化、所述受体的酶活性增加和底物磷酸化。最近，已查清将信号从细胞表面传导至胞核的常见途径，而且证实是通过酪氨酸激酶生长因子受体的作用而实现的。该途径涉及由生长因子介导的ras蛋白质的激活，由此可启动一个蛋白激酶级联系统，导致能调节与细胞分裂有关的基因表达的转录因子的磷酸化。
受体自磷酸化和胞内底物磷酸化是生长因子信号传导和细胞增殖所必须的生化反应。业已通过定点诱变消除若干种受体的蛋白酪氨酸激酶活性的方式证实了这一点。所述受体包括EGF受体、FGF受体和PDGF受体，所以诱变可导致这些受体生物学活性的完全丧失。而且，那些能阻断受体酪氨酸激酶活性的蛋白激酶抑制剂，如星形胞菌素、K252a和酪氨酸磷酸化抑制剂可以阻止胞内信号传导和细胞增殖。以上研究证实了酪氨酸磷酸化作用在由生长因子受体进行的信号传导方面所起的重要作用，并且证实了能抑制酪氨酸激酶活性的化合物也可用于调节细胞增殖。
很多疾病都是以细胞增殖失控为特征。所述疾病涉及各种细胞类型，包括癌症、牛皮癣、肺纤维化、肾小球性肾炎、粥样硬化和血管成形术之后的再狭窄。业已在若干体内研究中证实可将酪氨酸激酶抑制剂用于治疗上述疾病。已证实能选择性抑制EGF受体的酪氨酸激酶抑制剂可抑制动物体内的肿瘤生成，从而证实了将其直接用于抑制接受治疗的人体肿瘤，特别是乳瘤的瘤细胞生长的潜在用途。另外，还证实通过阻止血管内皮生长因子(VEGF)受体酪氨酸激酶的激活，可抑制肿瘤转移和与之相关的血管生成，这表明可将酪氨酸激酶抑制剂用于抑制在癌发生期间所出现的各种症状。
在肾小球性肾炎的实验模型中，与肾小球细胞增殖相关的是，PDGF受体表达提高了20倍。中和能阻止其酪氨酸激酶受体激活的PDGF，可限制正常发生的肾退化量。这些研究表明，能抑制PDGF受体的酪氨酸激酶抑制剂可能具有治疗人的肾小球性肾炎的潜力。
介入心脏学的一个主要未决问题是在冠状血管成形术之后的再狭窄。目前，在美国每年要做将近400,000例血管成形术，有30～40％在第一年因为再狭窄而失效。再狭窄的过程涉及粥样硬化动脉的再阻塞，这种再阻塞在多数情况下是因平滑肌细胞的增殖而引起，而平滑肌细胞的增殖又是由诸如PDGF和FGF之类的生长因子介导的。在再狭窄的动物模型中，能阻止PDGF或FGF受体酪氨酸激酶活性的活化作用的抗体，可以阻止平滑肌细胞增殖及新血管内膜的形成。以上研究表明，能阻止PDGF或FGF受体功能的酪氨酸激酶抑制剂可用于治疗人的再狭窄疾病。
目前，癌症的化疗利用DNA合成的抑制剂(例如阿霉素、氟尿嘧啶)和能破坏细胞骨架的化合物(长春花碱)。这类化合物的毒性很强，因为其抑制活性并不局限于癌细胞，然而，所不同的是，肿瘤细胞更容易遭受上述抑制剂的攻击，因为这类细胞分裂的更快，因而其DNA代谢也更为活跃。用特异的激素衍生物对少数几种类型的癌症进行了治疗。不过，这只是一些例外情况，对于大多数各类癌症的化疗是非特异性的。
在本世纪的八十年代初期，人们发现20～30％的癌能表达特征性的癌基因产物，这些产物是生长因子受体或其突变的同系物，而且，这些产物具有蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性。该PTK活性对于其受体或其癌基因同系物来说是固有的，并能通过其PTK结构域影响细胞增殖。另外，上述受体(正常的或突变的)各自表现出特有的PTK活性，这种PTK活性具有独特的底物专一性。所述受体之一是表皮生长因子(EGF)受体及其致癌的同系物V-ERB-B。
针对生长因子受体的PTK活性所取得的上述进展的结果是，提出了用各种能够抑制EGF的PTK活性的化学物质治疗癌症的方案。例如，可参考日本专利Nos.62-39523、62-39558、62-42923和62-42925。例如，上述日本特许公开专利昭62-39558披露了将α-氰基-2，5-二羟基肉桂酰胺作为活性化合物用于作为PTK有效抑制剂的组合物中。
Gal等披露了将肉桂基丙二腈和各种亚苄基丙二腈用作肿瘤生长抑制剂的方案，见Studies on the Biological Action of Malononitriles.I.TheEffect of Substituted Malononitriles on the Growth of TransplantedTumors in Mice，Cancer Research，12：565-72，1952。
因此，本发明的一个目的是提供新的、有用的激酶抑制剂配方。
本发明的另一个目的是为具有得到认可的低毒性的原有组合物提供其它用途。
通过提供一种抑制蛋白激酶的方法已实现上述目的及其它目的。该方法包括让一种含有所述激酶的组合物与下式(I)所示的一种分子接触：式中：
R1是H、低级烷基或低级烷酰基；
R2是H、低级烷基或低级烷酰基；
R3和R4共同代表一个顺式双键或-O-，或者R3与R4各自单独为H或OR；
R5是＝O、＝S、或-H、OR；
R6和R7共同代表一个双键或-O-，或者R6与R7各自单独为H或OR；
R8和R9共同代表一个双键或-O-，或者R8与R9各自单独为H或OR；以及
各个R单独表示H、低级烷基或低级烷酰基。
本发明还涉及用于控制哺乳动物的激酶依赖性疾病的药用组合物，该组合物包括由可以药用的载体携带的式(I)化合物；还涉及一种控制激酶依赖性疾病的方法，该方法包括给患有激酶依赖性疾病的哺乳动物服用激酶依赖性疾病控制量的上述式(I)的化合物。这里，“哺乳动物”具有常用的含义，它包括人及其它哺乳动物。药用用途意在包括兽用，特别是用于家养动物，如牛、绵羊、猪、山羊、狗、猫、兔、仓鼠、沙鼠、大鼠和小鼠。
由说明书和权利要求书中可以看出其它特征和优点。
通过结合附图阅读以下的详细说明可以更好地理解本发明，这些附图构成本发明的一部分。其中：
图1表示化合物292对β-PDGFR在HR5细胞中自磷酸化作用的影响。
图2表示化合物292对PDGFBB-诱导的[3H]胸苷掺入HS68细胞的影响。
本发明涉及早先已知的化合物的新用途，还涉及在本发明中首次被鉴定的与早先已知的化合物相关的某些化合物。所述化合物涉及玉米烯醇(zeaenol)，而且是含有与邻苯二酚环融合的14员酯环的大环内酯。这些化合物的发现至今已超过25年时间，一直是主要被用作牲畜的饲料添加剂。例如，可参见以下文献：Kuiper-Goodman等，“Risk Assessment of the Mycotoxin Zearalenone”，Regulatory Toxicology and Pharmacology 7：253-306(1987)；Bennett等，“Use of the Anabolic Agent Zearnol(Resorcylic Acid Lactone)as agrowth Promoter for Cattle”，The Veterinary Record，pp.235-239(1974年，3月16日)；Willemart等，“A RAL Compound as an Anabolic inCattle”，Veterinary Research Communications 7：35-44(1987)；和Roche等，“Resorcylic Acid Lactone as an Anabolic Agent in Cattle”，Veterinary Research Communications 7：45～50(1983)。这类化合物的其它已知活性是作为雌激素剂。例如，可参考以下文献：Sheffield等，“Zeranol(β-Resorcylic Acid Lactone)，A Common ResidousComponent of Natural Foodstuffs，Stimulates Developmental Growth ofthe Mouse Mammary Gland”，Cancer Letters，28：77-83(1985)；Mastri等，“In Vivo Oestrogenicity and Binding Characteristics of α-Zearalanol(P1496)to Different Classes of Oestrogen Binding Proteinsin Rat Liver”，J.Steroid Biochem.23(3)：279-289(1985)；Edward等，“Murine Macrophage Activation with  Resorcyclic Acid Lactones(RALs)：Comparison with Diethylstilbestrol and 17β-Estradiol”，Immunopharmacology 17：107-118(1989)；和Katzenellenbogen等；“Zearalenones：Characterization of EstrogenicPotencies and Receptor Interactions of a Series of Fungal β-ResorcylicAcid Lactones”，Endocrinology 105：33-40(1979)。然而，以前并没有将这些化合物用作激酶抑制剂或知道其可以作为激酶抑制剂，它是一种重要的生化控制分子。一般，该化合物的化学式如下：其中：
R1是H、低级烷基或低级烷酰基；
R2是H、低级烷基或低级烷酰基；
R3和R4共同表示一个顺式双键或-O-，或者R3与R4各自单独为H或OR；
R5是＝O、＝S或-H、OR；
R6和R7共同表示一个双键或-O-，或者R6与R7各自单独为H或OR；
R8和R9共同表示一个双键或-O-，或者R8与R9各自单独为H或OR；以及
各个R单独为H、低级烷基或低级烷酰基。
现已发现，上述化合物和含有这类化合物的药用组合物可用于与激酶结合并抑制激酶。下面将对这种用途做更详细的说明。术语定义
除非另有说明，上文所使用的及在整个说明书中所使用的下列术语应被理解成具有下述含义：
“烷基”是指饱和脂族烃，它可以是直链或是支链的，含有大约1～大约6个碳原子。“低级烷基”是指具有1～4个碳原子的上述烷基，可以是直链或是支链的，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲-丁基或叔-丁基。卤代烷基，特别是氟代烷基，如CF3、CH2CF3和CF2CF3包括在烷基的定义内。
“烷氧基”是指一个烷基-氧基，其中的“烷基”如上文所述。优选低级烷氧基。典型的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、n-丙氧基、i-丙氧基或n-丁氧基。
“酰基”是通过除去有机酸，羧酸的酸性羟基而产生的有机基团。优选的酰基为低级烷基羧酸基团，如乙酰基和丙酰基。苯甲酰基也较理想。
“卤”是指卤原子。优选的卤基包括氯、溴和氟。结构
在下表中列出了典型结构。该表中的示例化合物1为本说明书实施例部分的化合物292。
                                                 表1
示例                                                       R
    1     2     3     4     5     6     7     8     9
    1     Me     H     =     =     O     OH     OH    =     =
    2     MeCO     Me     -O-     -O-     O     OH     OH    =     =
    3     H     H     =     =     O     -O-     -O-    =     =
    4     Me     H     =     =     O     OH     OH    OH     OH
    5     Me     H     =     =     O     OH     OH    H     H
    6     Me     H     =     =     O     H     H    =     =
    7     Me     H     =     =     H，OH     H     H    H     H
    8     CF3CO     Et     =     =     S     H     H    =     =
    9     MeCO     MeCO    -O-    -O-     S     H     H    =     =
    10     H     i-Pr     OH     OH     S     OH     OH    =     =
    11     H     H     H     H     O     H     H    H     H
    12     H     H     OH     OH     O     OH     OH    OH     OH
    13     H     H     OMe     OMe     O     OH     OH    =     =
    14     t-Bu     CF3     =      =     O     OH     OH    =     =
    15     H     H     =      =     S     OBu     OH    OH     OH
    16     MeCO     H     OH     OH     O     OH     OCOMe    OMe     OMe
    17     iPnCO     Me     =      =     S     =      =    OH     OH
表的注释
＝(在相邻的栏中)表示相邻的被指明碳原子间的双键。
-O-(在相邻的栏中)表示相邻的被指明碳原子间的环氧化物
Me-甲基；Et-乙基；Pr-n-丙基；iPr-异丙基；Bu-n-丁基；sBu-仲丁基；iBu-异丁基；tBu-叔丁基；1Pn-1-戊基；2Pn-2-戊基；3Pn-3-戊基；2MB-2-甲基丁基；iPn-异戊基(3-甲基丁基)；nPn-新戊基(2，2-二甲基丙基；11MP-1，1-二甲基丙基；12MP-1，2-二甲基丙基；MeCO-乙酰基(其余酰基衍生物以相同方式命名)。手性中心的立体化学和双键的几何学
用于本发明方法的化合物可含有最多达3个C-C双键-R3-R4、R6-R7和R8-R9。如果存在R3-R4双键的话，其必须是顺式的，以使所得到的分子以上述方式起作用。当存在R6-R7和R8-R9双键时，其最好是反式的。
在碳原子3、5、6、8、9、11和12(大环内酯编号系统；见式I)上存在潜在的手性中心。由于立体化学结构(R和S)因特定位置上的取代基的性质不同而异，所以特定位置上的优选立体化学将根据取代基的性质而为R或S。各个手性中心的绝对立体化学构型最好是这样的：其中，各手性中心具有与一种或另一种天然存在的二羟基苯甲酸衍生物(通过合成改性的方法制备这种衍生物最为容易)一样的相对构型。然而，合成技术可用于转化手性中心(例如，SN2置换反应)，而且可将这种技术用于制备非天然的异构体，如果需要这种异构体的话。当在特定的位置需要特定的立体化学结构时，有多种方法可用于进行立体有择合成或合成非对映体，由于向业已含有一个手性中心的一个分子(如C3上的手性中心)上引入一个单一的手性中心(或手性中心对)会导致非对映体的产生(而非产生对映体)，因此，可用普通的物理技术将其分离。两种优选的手性中心取向为：当8位和9位碳原子上都有OH基时，8位上的碳原子为S构型，9位上的碳原子也为S构型；3位上的碳原子为S构型。
无论如何，非对映体混合物的存在通常都不会损害本发明，因为无活性的非对映体的存在(如果有的话)只会产生与存在任何其它无活性材料(如药用载体)一样的作用。化合物的制备和生产
用于本发明的化合物是二羟基苯甲酸内酯，可以用已知技术进行制备和改性。这些化合物中的某一些可以作为发醇的生物制品购买，其它的可以通过对原始的生物制品进行化学改性的方式获得。表1中化合物1的生物制品将在以下的实施例中加以说明。其它生物及化学合成技术披露于若干美国专利中，包括USPN 3,373,030；3,551,454；3,810,918；3,836,544；和3,925,423，这些专利全都被收作本发明的参考文献。上述专利中的最后一项特别有用，因为它提供了一种用于从易得的原材料生产本发明化合物的通用方法。
例如，采用如在美国专利US3,196,019中披露的合适发酵方法，通过培养玉米赤霉(Gibberella zeae)(Gordon)微生物可以获得反式玉米赤霉烯酮。举例来说，可以用US3,239,354中披露的方法对内酯玉米赤霉烯酮环上的不饱和碳键进行氢化。可用US3,239,341的方法把玉米赤霉烯酮的酮基还原成相应的醇，或用US3,237,341的方法将其还原成亚甲基。在美国专利US3,239,342和3,239,347中披露了用烷基、链烷醇、芳基或芳烷基取代羟基上的氢的方法。在US317,117中披露了以2800-3500A的光波辐射进行双键的顺-反转化的方法，该专利的申请日为1972年12月21日，现已放弃。US3,687,982中披露了分离右环十四酮酚(zearalanol)的非对映体的方法。所有上述专利文件都被收作本文的参考文献，作为以合成方式生产用于本发明的化合物的方法的现有技术。
在原始化合物苯基或大环内酯环上可以存在各种取代基，或是在形成缩合产物之后用本领域公知的取代方法或将一种基团转化成另一种基团的方法将取代基加上去。如果取代基本身是活性的，则可以用本领域公知的技术对其加以保护。可以采用本领域已知的各种保护基。上述可用保护基的很多例子可从“Protective Groupsin Organic Synthesis”(T.W.Green，John Wiley and Son，1981)一书中找到。可用本领域已知的氧化剂将伯醇氧化成羧酸或醛，而把仲醇氧化成酮。因此，可采用取代或置换反应为原材料、中间产物或终产物提供各种取代基。
能提供用于制备本发明化合物的生物及合成技术细节的科技文献的例子如下，这些文献均被收作本发明的参考文献：
Sugawara等，“Zearalenone Derivatives Produced by theFungus Drechslera Portulacae”，Phytochemistry，31(6)1987-1990(1992)，
El Sharkawy等，“Microbial transformation of Zaeralenone.2.Reduction，Hydroxylation，and Methylation Products”，J.Org.Chem.，53：515-519(1988)，
Agatsuma等，“Revised structure and Sterochemistry ofHypothemycin”，Chem.Pharm.Bull.41(2)：373-375(1993)，
Nair等，Metobolites of Pyrenomycetes XIII：1“Structure of(+)Hypothemycin，an Antibiotic Macrolide from Hypomycestrichothecoides”，tetrahedron Letters，21：2001-2012(1980)，
Ellestad等，New Zearalenone Related Macrolides andIsocoumarins from and Unidentified fungus”，J.Org.Chem.，43(12)：2339-2343(1978)，
Gatenbeck Sten，“The Biosinthesis of Oxytetracycline”，Biochemical and Biophysical Research Communications”，6(6)：422-426(1961/62)，
Aver等，“Minor Metabolites of Monocillium Norinii”，Phytochemistry，5：1353-1355(1987)，
Hagler等，“Identification of Naturally Occurring Isomer ofZearlenol Produced by Fusarium roseum’Gibbosum’in riceCulture”，Applied and enVironmental Microbiology，37(5)：849-853(1979年5月)，
Urry等，“The Structure of Zearlenon”，Tetrahedron Letters，27：3109-3114(1966)，
Bollinger等，“Vier neue Metabolite Von Giberall Zeae：5-Formyl-zearalenon，7’-Dehydrozearalenon，8’-Hydroxy-und 8’-epi-Hydroxy-zearalenon”，Helvetica Chimica Acta，55(8)：305-306(1972)，
Ayer等，“The Isolation，Identification and Bioassay of theAntifungal Metabolites Produced by Monocillium nordinii，Can.J.Microbiol.26：766-773(1980)，
Mirrington等，“The Constitution of Radicicol”，TheTetrahedron Letters 7：365-370(1964)，
Shipchandler T.Mohammed，“Chemistry of Zearalenone andsome of its Derivatives”，Heterocycles，3(6)471-520(1975)，
Kuo等，“The resolution of(±)-Zearalenone.Determinationof the Absolute Configuration of the Natural Enantiomorph”，Chemical Communications pp.761-762(1976)，和
McCpra等，“The Constitution of Monorden，an Antibioticwith Tranquilising Action”，Tetrahedron Letters15：869-875(1964)。作为激酶抑制剂的用途
本发明的化合物均可方便地用于治疗用途，作为激酶抑制剂控制哺乳动物的激酶依赖性疾病，特别是与酪氨酸激酶相关的疾病。二羟基苯甲酸衍生物专一性地优选抑制三类蛋白激酶中的一种的能力，是决定一种具体化合物将被使用的方式的因素之一，所述优选性是相对其它类型(所述三类蛋白激酶将在下面讨论)而言的。酪氨酸激酶依赖性疾病包括超增殖疾病，是由异常的酪氨酸激酶活性引起/维持的。其例子包括癌症、粥样硬化和抗血管生成(例如，肿瘤生长、糖尿病性视网膜病)。尽管有关其它类型激酶与特殊疾病之间关系的资料很少，但本领域一般认为应优先选用药用型蛋白酪氨酸激酶(PTK)抑制化合物，对于其它类型的激酶来说也是如此。PTK抑制剂槲皮素、染料木黄酮和星形孢菌素除了能抑制酪氨酸激酶外，还能抑制很多其它蛋白激酶，因为这些抑制剂缺乏特异性，因而细胞毒性很大。因此，可将用于测定细胞毒性的常规方法用于鉴定PTK抑制剂(或其它类型激酶的抑制剂)，这种抑制剂由于缺乏选择性而倾向于产生不理想的副作用。
根据作为其底物的氨基酸已鉴定了三大类蛋白激酶：能将酪氨酸磷酸化的激酶，能将酪氨酸和苏氨酸磷酸化的激酶和能将丝氨酸和苏氨酸磷酸化的激酶。作为对选择性更详细的测试，应当测试其抑制各种此类蛋白激酶的酶促活性的能力。在背景技术部分披露了酪氨酸特异性蛋白激酶。能将丝氨酸和苏氨酸磷酸化的激酶的例子(最常见的类型)包括RAF、蛋白激酶A、蛋白激酶C和TGFβ受体。能将酪氨酸和苏氨酸磷酸化的激酶的例子为激酶MEK。
在下面的对激酶抑制剂的应用的讨论中，讨论的焦点为酪氨酸激酶，因为这种激酶是最便于进行药用控制的。不过，应当理解，本文一切关于将一种化合物用作酪氨酸激酶抑制剂的讨论同样也适用于对其它激酶类型之一有特异性的化合物的用途，一旦作用的特异性被查清的话。用在实施例中所提供的激酶活性分析方法(或其它同类方法，其中用不同的激酶取代了实施例中所讨论的激酶)能够很方便地测定一种二羟基苯甲酸化合物是否对一种特定类型的激酶有特异性。为避免不必要的重复，下面的讨论是以酪氨酸激酶作为其它类型激酶的例子讨论其用途。因此，有关“酪氨酸激酶”或“PTK”的一种特殊用途或用于特定场合的资料应当作为一种对任何类型激酶有特异性的化合物用途的一个例子，除非在本文中另作说明或指示。
为了使能抑制PTK或其它类型激酶之一的化合物用于治疗目的，它应当对完整的细胞具有活性。业已知道，PTK抑制剂的鉴定是基于其抑制所提取的酶制剂的能力，当把这种抑制剂用于抑制天然PTKs时具有弱活性或无活性。这种活性的缺乏或是由于PTK抑制剂不能穿过细胞膜到达其作用位点，或是由于它不能在腺苷三磷酸(ATP)浓度高并可能有其它因素影响的细胞内抑制PTKs。有几种方法可用于测定PTK抑制剂对生长因子受体酪氨酸激酶在完整细胞上的作用的活性。用生长因子处理细胞会导致相应受体的迅速自磷酸化，和受体底物的磷酸化，利用抗磷酸酪氨酸抗体可以测定所述反应。而且，还可以测定其它胞内信号反应，包括钙流动、肌醇磷酸代谢和细胞DNA合成。最后，治疗用PTK抑制剂还必须能够阻止细胞增殖，这是生长因子活动的有害的结果，容易进行监测。
从理论上讲，本发明化合物在水中和在轻度疏水的溶剂中的可溶性会增强其通过细胞膜的可能性。不过，在体外试验中，各种不溶性化合物也表现出对激酶的明显抑制作用。
本发明的化合物可以游离酸的形式、盐的形式和水合物的形式使用。一切形式均落入本发明的范围。可制成碱性盐，并简化一种更便于服用的形式；在实践中，使用盐的形式的效果与采用酸的形式相当。可用于制备所述盐的碱优选包括那些在与所述游离酸结合时生成可以药用的盐的碱。可以药用的盐是指在这种盐的药用剂量下，其阴离子对动物机体是无毒的，因此，游离酸所具有的有益特性不会因为阳离子的副作用而被破坏。尽管优选所述酸性化合物的可以药用的盐，所有的盐均可用作所述游离酸形式的来源，即使特定的盐本身只需作为一种中间产物，例如，当所述盐只是为纯化和鉴定目的生产时，或者当其在通过离子交换方法制备一种可以药用的盐时被用作一种中间产物。
本发明范围内的化合物具有作为蛋白酪氨酸激酶的特异抑制剂的活性，其具备作为细胞抗增殖剂的治疗价值，可用于治疗某些疾病，例如，包括牛皮癣和再狭窄。预计，本发明特别适于粥样硬化的治疗。对于某些疾病，如粥样硬化的治疗来说，某些人可能由于诸如遗传、环境或病史原因而被定为高危。本发明范围内的化合物可用于预防或延缓上述疾病的发生或复发，或是治疗这些疾病。
本发明的化合物可以各种形式用于哺乳动物宿主，即，可将其与各种可以药用的惰性载体混合，制成片剂、胶囊、锭剂、糖锭、硬糖、粉、喷雾剂、酏剂、糖浆、注射液或滴眼液，所采用的形式取决于所选择的服用途径，如口服或肠胃外服用。就肠胃外服用而言，包括以下途径：静脉内、肌内、皮下、眼内、滑膜内、经上皮(包括经表皮、眼、舌下和颊)、局部(包括眼、表皮、眼、直肠、通过吹入法和气雾剂由鼻吸入)和直肠系统。
所述活性化合物可以口服，如与一种惰性稀释剂或一种可吸收的食用载体一起服下，或将其封在硬或软的包膜明胶囊里，或将其压成片剂，或将其直接混进食物中。对于口服治疗来说，可将所述活性化合物与赋形剂混合，并以可以食用的片剂、口腔片、糖锭、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。所述组合物和制剂应当含有至少0.1％的活性化合物。当然，所述组合物及制剂的百分比可以变化，而且通常占重量单位的约2-约6％。在这种治疗用组合物中活性化合物的量是这样的，即，便于获得合适的剂量。本发明的优选组合物或制剂被制成含有约1～1000mg活性化合物的口服单位剂型。
片剂、糖锭、丸剂、胶囊等也可以含有以下成分：一种粘接剂，如聚乙烯吡咯烷酮，黄蓍胶、阿拉伯胶、蔗糖、玉米淀粉或明胶；一种赋形剂，如磷酸钙、柠檬酸钠和碳酸钙；一种崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、某些复合硅酸盐、藻酸等；一种润滑剂，如月桂基硫酸钠、滑石和硬脂酸镁；一种增甜剂，如蔗糖、乳糖或糖精；或一种调味剂，如薄荷、冬青油或樱桃香料。类似形式的固体组合物也可作为填料用于软的和硬的填充型明胶囊中；用于此目的的优选材料也包括乳糖及高分子量聚乙二醇。当所用单位剂型为胶囊时，除上述类型的材料之外，它还可以含有一种液体载体。各种其它材料可作为包衣剂存在，或者对所述单位剂型的物理形态加以改进。例如，可用紫胶、糖或同时用紫胶和糖对片剂、丸剂或胶囊进行包衣。糖浆或酏剂可以含有活性化合物、作为增甜剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟苯甲酸甲酯和丙酯、一种染料、诸如樱桃香料或橙香料之类的调味剂、乳化剂和/或悬浮剂、以及诸如水、乙醇、丙二醇、甘油之类的稀释剂及其各种类似组合。当然，用于制备任何剂型的任何材料都应当是药物纯级的，而且在使用剂量下基本无毒。另外，还可将所述活性化合物混合到缓释制剂和配方中。
所述活性化合物也可以经肠胃外服用或腹膜内使用。为了肠胃外服用，可使用由芝麻油或花生油或丙二醇水溶液所制成的溶液，或上文所列举的相应水溶性碱金属或碱土金属盐的无菌水溶液。如果必要，可对所述水溶液进行缓冲，并首先用足够的盐或葡萄糖使液体稀释剂等渗。可以用水制备作为游离碱或可以药用的盐的活性化合物的溶液，该溶液与一种表面活性剂，如羟丙基纤维素混合。还可以在甘油、液体聚乙二醇和其混合物以及在油中制备分散剂。在正常的储存和使用条件下，上述制剂中含有防止微生物生长的防腐剂。所述特殊水溶液尤为适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内注射使用。就此而言，所用无菌水介质可以用本领域技术人员所熟知的标准技术方便地得到。
适于注射用的药物形式包括无菌水溶液或分散剂和用于临时制备无菌注射液或分散剂的无菌粉。所有剂型都必需是无菌的，而且其流动性必需达到易注射的程度。在生产及储存条件下它必须稳定，而且必需防止微生物如细菌和真菌的感染作用。所述载体可以是一种溶剂或分散介质，例如含有水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、其适当的混合物和植物油。通常采用诸如卵磷脂之类的包衣剂可以维持适当的流动性，通过维持分散剂中所需的粒度并通过使用表面活性剂。可以用各种抗细菌剂和抗真菌剂实现防止微生物活动的目的，例如用苯甲酸、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、乙基汞硫代水杨酸钠等。在很多情况下最好含有等渗剂，如糖或氯化钠。通过使用缓吸收剂，如单硬脂酸铝和明胶可延长注射组合物的吸收。
无菌注射液可以这样制备：以所需要的量将所述活性化合物与适当溶剂混合，并视需要加入上文所列举的各种其它成分，随后进行过滤消毒。一般，分散剂是这样制备的：将无菌的活性成分加入一种无菌媒介物中，该媒介物中含有碱性分散介质及所需的选自上文中所列举的其它成分。对于用于制备无菌注射液的无菌粉来说，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，用这些技术生产出活性成分及选自前述的其无菌滤液中的任何其它所需成分。
为了局部使用，在适于滴到眼中的容器里制备不同于上述肠胃外溶液的稀的无菌水溶液(浓度通常为0.1％～5％)。
可以给哺乳动物单独服用所述治疗化合物，或与可以药用的载体一起使用。如上所述，活性成分与载体的相对比例取决于以下因素：所述化合物的溶解性和化学性质，所选择的服用途径和标准的制药技术。
最适于预防或治疗的本发明治疗剂的剂量将随以下因素而变化：服用方式、所选用的具体化合物和接受治疗的特定患者的生理特点。通常，首先使用小剂量，如果需要，再一点一点地增加剂量，直到在当时情况下达到最佳治疗效果。根据用大鼠进行生理研究的结果，人的治疗剂量一般为约0.01～约100mg/公斤体重/日，或者约0.4mg～约10g或更高，不过，可以不同的剂量单位在一天中一次服下或分几次服下。口服要求较高的剂量。
所述化合物可以口服或肠胃外服用，或作为滴眼液局部使用，剂量为约0.1～10mg公斤体重/日，为单剂量或均分剂量。当然，在特殊场合下，可由主治医师决定使用超出上述范围的剂量。
在一种含有式I化合物或其可以药用的盐的药用组合物中，载体与活性成分的重量比通常在1∶4～4∶1的范围内，最好在1∶2～2∶1范围内。不过，在任何特定情况下所选用的比例取决于以下因素，如活性化合物的可溶性、采用的剂量和服用途径。
以上对本发明作了大致说明，通过以下的实施例可以更好地理解本发明。这些实施例只是用于说明目的的，不应视为是对本发明的限定，除非特别指明如此。实施例例1 化合物292的制备
发酵在28℃和80％的湿度下，在装有生长培养基(含有4.0g/L酵母提取物的琼脂、10.0g/L麦芽提取物、含有0.005ml/ml微量元素的4.0g/L葡萄糖)的培养皿中生长弯孢菌(Curvulariasp.)C292FE。在装有4.5ml含10％甘油和5％乳糖的溶液的试管中用玻璃珠浸渍菌丝体，制成均匀的悬浮液。在装有30ml接种培养基(20.0g/L葡萄糖、15.0g/L pharmamedia、3.0g/L(NH4)2SO4、0.03g/L ZnSO4·7H2O、4.0g/L CaCO3、5.0g/L酵母提取物，并加H2O至1L)的体积为250ml的三角瓶中接种1-2ml浸渍的菌丝体。将接种的三角瓶放在转动摇床上，以250rpm的转速在28℃温育2天，振幅50mm。
将1ml取自接种三角瓶的试样转移到30ml发酵培养基中(60.0g/L甘露醇、12.5g/L大豆粉、2.5g/L柠檬酸0.5g/L酵母提取物，加水至1L)，pH7.0，该培养基装在250ml三角瓶中，并在类似条件下在转动摇床上温育5-6天。
提取在本例中，将15L发酵液装在体积为250ml的摇瓶里，每只摇瓶装30ml上清液。在把摇瓶从摇床上取出后在5分钟内将约15ml的乙酸乙酯试样加入每只摇瓶中。合并各摇瓶中的内含物，并通过聚丙烯滤膜吸滤滤去液体中的菌丝体。将菌丝体放入2L乙酸乙酯中，并进行简单地匀浆，以便将细胞破碎。过滤混合物，保留滤液。重复上述过程3次以上。用10L乙酸乙酯在分液漏斗中分别提取水层。合并来自菌丝体的乙酸乙酯层和水相提取物，在硫酸钠上干燥并过滤。通过旋转蒸发除去溶剂，然后将所得残余物在真空泵上干燥过夜。粗提取物产量为2.565g。
CPC分馏在一个PC上对粗提取物进行CPC分馏，包括带有“三股”螺旋柱的高速反流层析。以1∶3∶3∶3的体积比混合n-己烷、乙酸乙酯、甲醇和水，并使其沉降过夜。将下层作为固定相泵至CPC柱中。将上层作为流动相。柱的转速为1,040rpm，并采用3ml/分钟的流速。注入溶解在5ml上相和5ml下相中的400mg粗提取物。用一台光电二极管阵检测器在270nm波长下测代谢物。一种活性代谢物在96～114分钟随无活性的异构体一起被洗脱。将这些级分同来自另5个CPC的级分合并，得到75.6mg所述两种代谢物的混合物。
HPLC分馏  对上面所得到的混合物进行HPLC分馏，采用以下条件：分析C18-柱(8×100mm，Waters，Novapak)；流速：1mL/分；将0.5mg溶解在10ml二甲基亚砜(DMSO)中制成每个加注样；在270nm波长下监测；起始条件：70％水/30～100％乙腈，用80分钟以上时间施加一个线性梯度；峰1(无活性代谢物)在16.90分洗脱，峰2(活性代谢物)在18.74分钟洗脱。
异构体的转化和分离C292FE产生的两种代谢物仅在大环上两个双键之一的几何结构上有所不同。将167mg得自CPC分馏的产物溶在DMSO中，使其浓度为1mg/10mL。为了分离上述异构体，通过HPLC(Resolve 25cm×100cm，5mL)分馏50mL(5mg)试样。起始柱条件为：35％甲醇/65％水。用8ml/分的流速用25分钟以上的时间施加一个线性梯度，使终浓度为90％甲醇/10％水。在上述条件下，反式异构体(无活性)在11.3分钟被洗脱，随后顺式异构体(活性)在12.2分钟被洗脱。分别收集每个峰，并通过旋转蒸发干燥。第一轮HPLC分馏得11.7mg顺式异构体和63mg反式异构体。用质子NMR光谱法测顺式异构体的纯度，而将反式异构体以5mg/1.5mL的浓度重新悬浮于甲醇中。将该溶液放入一个石英容器中并用紫外线照射35分钟(RayonetPhotochemical Reactor低压汞灯)。照射之后对该溶液进行旋转干燥，再悬浮于DMSO(1mg/10mL)中，并用上述条件进行另一轮HPLC分馏。重复上述过程直至所有反式异构体都被利用。顺式异构体的总产量为24mg。该化合物(C292)的完整结构如下：例2 用化合物292抑制蛋白激酶的酶促活性
由诸如PDGF、FGF和EGF之类的生长因子对细胞增殖的刺激作用，取决于其对相应的受体酪氨酸激酶自磷酸化的诱导。因此，PTK抑制剂对由所述生长因子诱导的细胞增殖的抑制能力直接与其阻止受体自磷酸化的能力相关。为了测定βPDGF受体的自磷酸化，采用中国仓鼠卵巢细胞系HR5，该细胞系已被设计成能稳定地超量表达转染的cDNA，该cDNA编码人βPDGFR。将所述细胞以10,000个细胞/孔的浓度接种在微量滴定板(Falcon 96孔板)上，并在37℃温度下在含10％胎牛血清的RPMI(GibcoBRL)中温育3天，在此期间达到铺满。将上述培养基从孔中取出并换上100ml无血清的RPMI，并在37℃继续培养18小时。在加PDGF BB(100ng/ml)之前15分钟将化合物(0.01-30μM)加至孔中，并在37℃继续温育10分钟。将上述培养基倒出，并向每个孔中加50ml新配制的裂解缓冲液(20mM Tris，pH7.3，150mM NaCl，1％ Triton X-100，1mM PMSF，1mM原钒酸钠，10mg/ml抑蛋白酶肽和10mg/ml亮抑蛋白酶肽)，剧烈振动滴定板，以制备细胞裂解液。在对其进行分析之前，以2600rpm的速度离心10分钟将裂解液澄清。
在另一个微量滴定板上，固定抗βPDGF受体胞外区的单克隆抗体1B5B11：在4℃下在每孔中将0.5mg的抗体温育18小时，所用溶液含有23mM Tris(pH8.0)，68mM NaCl，14mM碳酸氨铵和0.01％叠氮钠。在抗体被固定之后，在加入细胞裂解液之前，用25mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)pH7.6，100mM NaCl，和0.2％Tween 20封闭上述孔，已按1∶2的比例用结合缓冲液(含有0.3％明胶的封闭缓冲液)对所述细胞裂解液进行稀释。在室温下将细胞裂解液与固定化的抗βPDGF受体的抗体一起温育2小时，并用200ml洗涤缓冲液(PBS，0.01％Tween 20)将上述孔洗3遍。为了测βPDGF受体的磷酸化程度，以1.25mg/ml的浓度加入兔抗磷酸酪氨酸抗体(Upstate Biotechnology公司，UBI)，并在37℃温育1小时。在去掉抗磷酸酪氨酸抗体之后，将所述滴定板与山羊辣根缀合的抗兔IgG(Boehringer Mannheim)一起培养，在加入过氧化物酶底物(ABTSTM)之前以1∶1000的比例稀释上述抗体。用一台微量滴定板读数器(Molecular装置)在650nm下监测产物的形成。
在MDA MB468细胞(ATCC#HTB132)-人乳腺瘤细胞系，其能超量表达EGF受体-中测定EGF受体的自磷酸化。将该细胞在6孔板上生长至铺满，并在无血清的Dulbeccos ModifiedEagle培养基(DMEM)中温育18小时。用各种浓度的化合物处理所述细胞15分钟，然后在37℃用EGF(100ng/ml)处理10分钟。刮去细胞，并用与HR5细胞相同的缓冲液制备裂解液，然后通过常规SDS PAGE进行分级分离，再进行Western印迹分析。为此，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并在Tris缓冲的盐溶液(pH7.0)，0.1％Tween20，5％奶粉中封闭该膜。在室温下，在结合缓冲液(TBS，0.1％Tween20；1％奶粉)中使该膜吸附抗磷酸酪氨酸抗体(UBI，1μg/ml)2小时。用一种山羊抗-兔-辣根过氧化物酶缀合的IgG(Boehringer Mannbeim)进行检测。用一种化学发光系统(Amersham)使所得印迹显影。
为了测FGF受体-1的自磷酸化，用标准技术使人FGF受体-1cDNA在CHO细胞中稳定地超量表达。使所述细胞在含有10％胎牛血清的RPMI中长至铺满，用无血清RPMI取代前面的培养基，并继续培养18小时，然后在有或没有浓度为0.1～30μM PTK抑制剂的条件下在37℃用βFGF(75ng/ml)刺激10分钟。用与上述相同的条件制备细胞裂解液，以进行EGF受体分析。将细胞裂解液与一种抗FGF受体-1胞外结构域的单克隆抗体(在CORTherapeutics制备，南旧金山，加拿大)一起温育，用SDS-PAGE处理免疫沉淀的受体，用抗磷酸酪氨酸抗体进行Western印迹分析，方法与上述分析EGF受体的方法相同。
如图1所示，化合物292能有效地阻止βPDGF受体的自磷酸化，IC50＝6.2nM，当浓度＞200nM时观察到完全抑制。上述结果得到了SDS-PAGE及用抗磷酸酪氨酸抗体对HR5细胞裂解液进行Western印迹分析的证实(未显示数据)。星形孢菌素是以前披露的最有效的PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂。在进行直接比较时，发现292的效力比星形孢菌素多10倍，比星形孢菌素类似物K252a高45倍(见表2)。以上结果表明，292是在完整细胞中抑制PDGF受体自磷酸化的十分有效的抑制剂，这说明该化合物在体内具有活性，而且能很容易地达到治疗浓度。
为了确定292是否有选择地抑制PDGF受体酪氨酸激酶，评价了其对密切相关的EGF和FGF受体酪氨酸激酶的作用。令人吃惊的是，当292的浓度高达30μM时也测不到其对EGF或FGF受体自磷酸化的抑制作用，而EGF受体能被K252a抑制(IC50＝1mM)(表2)。
src PTK家族与受体PTKs相关，因为这些蛋白质在其酶促酪氨酸激酶结构域有60-80％的氨基酸序列相同，而且介导胞内的信号传导，使细胞增殖。与受体PTKs不同，src蛋白不具备胞外结构域或跨膜结构域，因此不能直接作为胞外刺激的受体。为了进一步检验292的特异性，测定了其抑制重组c-src(UBI目录第14-117号)活性的能力。为了用一个96孔微量滴定板进行所述试验，向每一孔中加0.5mg src-底物肽-2(UBI cat#12-140)，所述底物肽被溶解在含23mM Tris(pH8.0)、68mM NaCl、14mM碳酸氨铵和0.01％叠氮钠的溶液中。在对所述肽进行固定化之后，洗涤这些孔，然后用25mM HEPES(pH7.6)、100mM NaCl、0.2％Tween 20进行封闭。向每一孔中加100ml反应混合物，以便启动激酶反应，该反应混合物中含有浓度为0.03-30mM的试验化合物，50mM ATP和溶于50mM Tris中的10单位的c-src；pH7，25mM MnCl2；5mM MnCl；0.05mM Na3VO4；100mMHEPES pH7；5％甘油和0.05％  基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40)。在37℃温育20分钟，然后加入10μl50％乙酸终止反应，洗涤所述孔，并用抗磷酸酪氨酸抗体检测酪氨酸磷酸化的底物，检测条件与上述检测磷酸化PDGF受体的方法相同。化合物292能抑制src激酶，其IC50＝1.0μM，这一浓度比抑制PDGF受体自磷酸化所需浓度高出160倍。另一方面，星形孢菌素和K252a能抑制src激酶活性，其IC50值分别为70nM和20nM。上述结果表明，292抑制PDGF受体激酶活性的选择性很高，而星形孢菌素和K252a在抑制src激酶活性的效力方面相同或更高。
尽管星形孢菌素能有效地抑制受体酪氨酸激酶，但星形孢菌素最初被发现却是因为它有有效抑制蛋白激酶C的活性。这表明，蛋白激酶抑制剂的活性范围可能很宽，可以抑制多种酪氨酸激酶及关系不太密切的丝氨酸/苏氨酸激酶。为了研究292抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的可能性，用UBI’s非放射性激酶分析法分析蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)，采用生产商推荐的条件(UBI，Cat#17-112)。比较化合物292和星形孢菌素和K252a，在0.025～40μM的浓度范围内试验上述各种化合物。如表2所示，化合物292在40μM的浓度下也不能使PKC或PKA的活性下降50％，而这一浓度已高出抑制PDGF受体激酶活性所需浓度6000倍以上。K252a被证明是所述丝氨酸/苏氨酸激酶最有效的抑制剂，其对PKA的IC50为70nM，对PKC的IC50为100nM，而星形孢菌素抑制这两种激酶的IC50＝70～80nM。以上结果表明，尽管某些激酶抑制剂如星形孢菌素和K252a缺乏选择性，但292对PDGF受体的选择性比对其它受体酪氨酸激酶、src激酶和丝氨酸/苏氨酸激酶高出100倍。这种选择性极大地增强了292用于治疗某些据信至少部分由PDGF介导的疾病的冶疗效力，这些疾病包括粥样硬化、某些癌症、肾小球性肾炎和血管成形术之后的再狭窄。
                        表2
                 蛋白激酶活性的抑制
                     IC50[μM]化合物     βPDGFR   EGFR   FGFR   src-激酶   PKA   PKC292          0.006   ＞30   ＞30   1.000     ＞40   ＞40K525a        0.270    1.0   ND1   0.020     0.070  0.100星形孢菌素   0.070    ND    ND     0.070     0.070  0.080ND1-未测定用292抑制细胞增殖
为了测定一种PTK抑制剂潜在的治疗用途，重要的是证实该抑制剂通过作用于一种生长因子的方式抑制细胞增殖的能力，这种生长因子参与增殖紊乱的发病。由于许多文献都报导PDGF与诸如肾小球性肾炎、癌症、粥样硬化和再狭窄之类的疾病有关，我们试验了292抑制由PDGF诱发的细胞增殖的能力。将人原代成纤维细胞系HS68(ATCC)以150,000个细胞/孔的浓度展布于96孔培养皿中，所用培养基含有10％胎牛血清(用DMEM配制)。将所述细胞在37℃温育7-10天，在此期间细胞变得铺满并静止。以5-120nM的浓度加入化合物292，30分钟后加入50ng/ml PDGFBB刺激细胞，并在37℃下继续培养18小时。为了测细胞增殖的水平，向每孔加2m Ci的[3H]胸苷，再继续培养5小时。然后用5％的冷三氯乙酸(TCA)洗涤细胞，溶于0.2N NaOH、0.1％SDS中，并测[3H]胸苷的掺入量。与未处理细胞(未显示数据)相比，用PDGF BB处理的细胞其胸苷掺入量通常增加5-10倍。如图2所示，化合物292抑制PDGF BB诱发的胸苷掺入，使掺入量减少50％的浓度为16nM，而当浓度为120nM时能完全抑制细胞分裂。上述292的浓度非常接近抑制HR5细胞中PDGF受体磷酸化所需的浓度。
为了测定292是否能产生非特异性的抗增殖效果或是否有细胞毒性，在标准的组织培养条件下测定其对人细胞系(如HS68，HS27，CCD18和WS1，获自ATCC)增殖的作用。将细胞稀疏地接种于含有10％胎牛血清的标准组织培养基中，在有或没有浓度为0.01～30μM的292、星形孢菌素或K252a的条件下，以3.5×103个细胞/孔的浓度在96孔微量滴定板(Falcon)上进行培养。然后让所述细胞在标准组织培养条件下生长96小时，此时用3.3％戊二醛将其固定，用H2O洗涤，并用0.05％的亚甲基蓝(Sigma)染色。染色之后洗涤细胞，并用3％HCl洗涤染料，并用一个板读数器(Molecular Devices)在665nM波长处监测吸收值。通过比较在有化合物的条件下获得的吸收值和在无抑制剂条件下获得的吸收值，测定其抑制细胞增殖的百分比。如表3所示，用浓度达10μM的292处理被试验的细胞系之后，所述细胞系中没有一个的细胞生长减少，当292的浓度为30μM时细胞生长略有下降(10-20％)。相反，星形孢菌素在10nM的浓度下能完全抑制所有细胞系的生长，而K252a在1～12μM的浓度范围内能使最敏感的CCD18细胞的细胞生长下降50％。以上结果表明，星形孢菌素是非特异性蛋白激酶抑制剂，而且，它还能以抑制激酶活性所需要的同一浓度产生非特异性的抗增殖或细胞毒性效果。另一方面，292在标准组织培养条件下，在浓度比抑制PDGF诱发的这些细胞的细胞分裂所需浓度高出1000倍时，对HS68细胞的生长也没有影响。以上结果表明，通过抑制PDGF受体激酶活性以达到治疗效果所需要的292浓度远远低于能引起细胞毒性的浓度。
                   表3
      在正常组织培养条件下抑制细胞增殖
               IC50[μM]
试验        CCD18   HS27    WS1     HS68
抑制剂
292         ＞30    ＞30    ＞30    ＞30
星形孢菌素  ＜0.01  ＜0.01  ＜0.01  ＜0.01
K252a         1       12      5       5
本文所引用的所有文献和专利申请都被作为本申请相关程度相同的参考文献，就如同具体和专门地指出各个文献或专利申请被收作参考一样。
应当理解，本发明并不局限于本文所给出并描述的实施例，在不超出由以下权利要求书所限定的新构思的实质和范围的条件下，可以做出各种变化和改进。

Claims (22)

1.一种抑制蛋白激酶的方法，包括：用一种如下式所示的分子接触含有一种蛋白激酶的组合物其中：
R1是H、低级烷基或低级烷酰基；
R2是H、低级烷基或低级烷酰基；
R3和R4共同表示一个顺式双键或-O-，或者R3与R4各自单独为H或OR；
R5是＝O，＝S、或-H，-OR；
R6和R7共同表示一个双键或-O-，或者R6与R7各自单独为H或OR；
R8和R9共同表示一个双键或-O-，或者R8与R9各自单独为H或OR；和
每个R单独表示H、低级烷基或低级烷酰基。
2.如权利要求1的方法，其中R1为CH3。
3.如权利要求1的方法，其中R2为H。
4.如权利要求1的方法，其中R3和R4表示一个双键。
5.如权利要求1的方法，其中R5为＝O。
6.如权利要求1的方法，其中R6和R7各自为OH。
7.如权利要求1的方法，其中R8和R9表示一个双键。
8.如权利要求1的方法，其中R1表示CH3，R2表示H，R3和R4表示一个双键，R5表示＝O，R6和R7各自表示OH，而R8和R9表示一个双键。
9.如权利要求1的方法，其中位置8上的碳原子为S构型，位置9上的碳原子也为S构型。
10.如权利要求1的方法，其中位置3上的碳原子为S构型。
11.如权利要求1的方法，其中所述组合物包括哺乳动物的体液。
12.如权利要求11的方法，其中所述体液是血或血的组分。
13.如权利要求11的方法，其中所述激酶是酪氨酸激酶。
14.如权利要求11的方法，其中所述酪氨酸激酶是PDGF。
15.如权利要求11的方法，其中该方法还包括在有或没有所述抑制剂的条件下测定所述体液中酪氨酸激酶的活性，并确定所述激酶活性与该组合物中酪氨酸激酶浓度或酪氨酸激酶底物浓度之间的关系。
16.如权利要求1的方法，其中所述接触是在体内进行。
17.一种药用组合物，包括一种如下式所示的化合物：其中：
R1是H、低级烷基或低级烷酰基；
R2是H、低级烷基或低级烷酰基；
R3和R4共同表示一个顺式双键或-O-，或者R3与R4各自单独为H或OR；
R5是＝O、＝S、或-H、-OR；
R6和R7共同表示一个双键或-O-，或者R6与R7各自单独为H或OR；
R8和R9共同表示一个双键或-O-，或者R8与R9各自单独为H或OR；和
每个R单独表示H、低级烷基或低级烷酰基；该化合物的用量为能有效地抑制酪氨酸激酶，还包括一种可以药用的载体。
18.如权利要求17的组合物，其中R1表示CH3，R2表示H，R3和R4表示一个双键，R5表示＝O，R6和R7各自表示OH，而R8和R9表示一个双键。
19.如权利要求18的组合物，其中位置8上的碳原子为S构型，而位置9上的碳原子也为S构型。
20.如权利要求19的组合物，其中位置3上的碳原子为S构型。
21.一种用于控制哺乳动物激酶依赖性疾病的药用组合物，包括含于一种可以药用的载体中的权利要求1所述的化合物。
22.一种用于控制激酶依赖性疾病的方法，包括给患有激酶依赖性疾病的动物服用一种激酶依赖性疾病控制量的权利要求1所述的化合物。
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