CN101928700B - 蛋白激酶pftk1单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗人蛋白激酶PFTK1的特异性单克隆抗体及其制备方法。该单克隆抗体具有与蛋白激酶结合的特异性强的特点。为研究蛋白激酶PFTK1生理生化功能提供了检测工具。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白激酶PFTK1单克隆抗体及其制备方法，属于免疫化学领域。
背景技术
细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependant Kinase，CDK)是一类细胞周期调控蛋白激酶的总称，这类蛋白激酶与相关周期蛋白结合后发挥生理生化功能。CDK1(又名Cdc2)是这个家族中的重要成员。PFTK1是一种CDK1相关蛋白激酶，最近的研究发现它的相关周期蛋白是cyclinD3，由于这类蛋白激酶与癌症的发生发展密切相关，因此它的生理学作用引起人们广泛的关注。单抗作为PFTK1的重要检测工具，对揭示与PFTK1功能具有重要意义。但目前国内外尚无商品化的PFTK1单抗，因此制备PFTK1单抗对科研及临床应用具有重要意义。
发明内容
为解决上述问题，首先本发明提供了一种PFTK1多肽序列，其是人工合成的多肽片段，命名为P，可作为半抗原，该多肽序列包含SPSSPTSPKFGKADSYEKLEKL的保留序列。
本发明同时还提供了上述半抗原与常规蛋白载体偶联后得到的免疫抗原和检测抗原。
将半抗原P分别与小鼠钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)偶联，得到KLH-P和BSA-P，以KLH-P做免疫抗原，以BSA-P做检测抗原。免疫抗原用于免疫小鼠，检测抗原用于检测免疫小鼠血清和杂交瘤细胞上清及腹水中抗体效价。
本发明还提供了一株能稳定分泌抗PFTK1的单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为4E7。
本发明目的还在于提供一种鼠源性抗PFKT1单克隆抗体。其优选采用单克隆抗体制备方法，并以人工合成的多肽P与血蓝蛋白KLH偶联物为免疫抗原制备而得。具有灵敏性高、特异性强、实用性好的特点。
本发明还提供了抗PFTK1某段抗原表位的单克隆抗体的制备方法。其包括如下步骤：
1)制备免疫原：将人工合成的1条多肽片段分别与KLH和BSA偶联，以KLH-P做免 疫抗原，以BSA-P做检测抗原。免疫抗原用于免疫小鼠，检测抗原用于检测免疫小鼠血清和杂交瘤细胞上清及腹水中抗体效价。
2)免疫：采用常规方法，初次免疫用弗氏完全佐剂与免疫抗原以等比例混合乳化，皮下和腹腔混合方式免疫BALB/c小鼠；之后以不完全佐剂与免疫抗原乳化，腹腔注射小鼠，免疫剂量与初次免疫相同，融合前，腹腔注射无佐剂抗原。
3)筛选：用酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清。
4)细胞融合、筛选及克隆化：选抗血清效价最高的鼠取脾细胞与骨髓瘤细胞体外融合，经亚克隆获得稳定分泌抗PFTK1的单克隆抗体细胞株。
5)单克隆抗体的提取与纯化：采用体外制备腹水法，提取单克隆抗体，将克隆化的细胞株体外扩大培养后，打入经产小鼠腹腔，产生大量腹水，采用优球蛋白沉淀法纯化单克隆抗体。
以上述方法人工合成肽段与大分子蛋白偶联物作为免疫原，制备得到抗PFTK1表位的单抗，特异性强、灵敏性高，为科学研究提供检测工具，为开发免疫检测试剂盒奠定基础。
另一方面，本发明还提供了一种蛋白激酶PFTK1的免疫检测试剂盒。其优选含有上述检测抗原利/或鼠源性抗PFKT1单克隆抗体的。可优选是ELISA检测试剂盒。
附图说明
附图1 SDS-PAGE法鉴定人工抗原合成结果
附图2 杂交瘤4E7分泌的抗体亚类亚型鉴定结果
附图3 抗体特异性检测
附图4 小鼠腹水纯化电泳图
具体实施方式
1 材料
PFTK1的120-141位的氨基酸序列，Hysbio Ltd公司提供；KLH、BSA、HRP-羊抗小鼠IgG、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT、HT，Sigma公司；抗体亚型鉴定试剂盒，Southernbiotech公司；胎牛血清，PAA公司；DMEM培养基，Invitrogen公司；骨髓瘤sp2/0，北京协和医院；酶标板，Corning公司；细胞培养板，Nunc公司；实验动物为6-8周龄的balb/c 雌性小鼠，维通利华有限公司。重组GST-PFTK1(1-139肽段)，英国MRC提供。
2方法
2.1人工抗原的合成
免疫抗原的合成：称取15mg KLH溶于1mL 0.01mol/L的PBS(pH7.4)中，再准确称取10mg半抗原，溶于1mL 0.01mol/L的PBS(pH7.8)中，将多肽逐滴加入KLH中，磁力搅拌下，充分混匀。在冰水浴条件下，缓缓加入1％戊二醛溶液(终浓度达到0.5％)，于黑暗中室温反应2个小时，然后将上述溶液用G-25凝胶层析柱洗脱除盐。
检测抗原的合成：将免疫抗原合成中的15mg KLH换为10mg BSA，以下方法同免疫抗原的合成。
免疫抗原用于免疫小鼠，检测抗原用于检测免疫小鼠血清和杂交瘤细胞上清及腹水的抗体效价。
2.2动物免疫
初次免疫用弗氏完全佐剂与免疫抗原以等比例混合乳化，皮下和腹腔混合方式注射雌性BALB/c小鼠5只，每只剂量为50μg；之后每隔2周，以不完全佐剂与免疫抗原乳化，腹腔注射小鼠，免疫剂量与初次免疫相同。第3次免疫7d后采血，用间接ELISA法检测动物血清效价，取血清效价高的小鼠脾细胞进行融合，融合前3d，腹腔注射无佐剂抗原50μg。
2.3杂交瘤细胞株的建立
取对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0与免疫小鼠脾细胞，骨髓瘤与脾细胞的比例为1∶5，采用PEG法进行细胞融合，在96孔板筛选，培养，克隆。阳性孔经有限稀秆法连续克隆3次后扩大培养，用于制备腹水。
2.4单克隆抗体的扩大制备
采用8-10周龄的雌性BALB/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油，每只0.5ml，1周后每只小鼠腹腔注射1×106个杂交瘤细胞悬液，7-9d后采集腹水。
2.5单克隆抗体鉴定
2.5.1单克隆抗体亚型的鉴定
采用southernbiotech公司的单克隆抗体亚型鉴定试剂盒分析其亚类亚型。
2.5.2特异性的测定
采用Western-Blot法鉴定，方法参照沈关心的《抗体技术试验指南》。
3结果与讨论
3.1 SDS-PAGE电泳法鉴定人工抗原合成结果
载体蛋白与多肽(P)发生偶联后，其分子量必然会增加，偶联的多肽量越多，其分子量增加的越大，附图1为载体蛋白BSA与多肽偶联前后凝胶电泳图，从附图1中，1为蛋白marker；2为BSA；3为BSA-P；4为KLH；5为KLH-P，从图中可以看出，BSA、KLH与多肽偶联后分子量有所增加，表明偶联成功，但BSA-P、KLH-P分子量并不单一，原因可能是每分子蛋白与多肽偶联的数量不等所致。
3.2单克隆抗体制备结果
测定3免小鼠血清，取效价最高的小鼠进行细胞融合，筛选阳性细胞株，克隆化，得到两株能稳定分泌抗PFTK1的单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为4E7，其保藏号为CGMCCNo.3140。
3.3杂交瘤细胞上清液及小鼠腹水效价测定结果
杂交瘤细胞4E7上清液效价结果分别为1∶1280，小鼠腹水效价结果均为1∶32000。
3.4抗体亚类亚型鉴定结果
如附图2所示，经southernbiotech试剂盒鉴定，杂交瘤4E7分泌抗体亚类均为IgM，轻链类型均为κ型。
3.5抗体特异性鉴定结果
附图3中第1泳道为GST，分子量为26kDa第2泳道为GST与PFTK1(1-139)多肽片段的重组蛋白，其分子量40kDa。如附图3所示抗体4E7与抗原(GST-PFTK1)在分子量40kDa有特异性结合，在分量为26kDa没有任何条带，表明抗体能够识别PFTK1，特异性很好。
3.6抗体纯化结果
如附图4所示，1为marker，2、3、4为纯化后蛋白，上样量分别为10ul、20ul和5ul，5为小鼠腹水稀释10倍上样。经分析，IgM重链分子量为69，轻链分子量为27，由于IgM是一个五聚体，总分子量应该为961kDa。从附图4中可以看出，优球蛋白法纯化IgM能够得到高纯度的IgM，达到86.8％。
实施例1
1)制备免疫原：人工合成的1条多肽片段，命名为P，分别与KLH和BSA偶联，以KLH-P做免疫抗原，以BSA-P做检测抗原。免疫抗原用于免疫小鼠，检测抗原用于检测免 疫小鼠血清和杂交瘤细胞上清及腹水中抗体效价。
2)免疫：采用常规方法，初次免疫用弗氏完全佐剂与免疫抗原以等比例混合乳化，皮下和腹腔混合方式免疫BALB/c小鼠；之后每隔2周，以不完全佐剂与免疫抗原乳化，腹腔注射小鼠，免疫剂量与初次免疫相同，融合前3d，腹腔注射无佐剂抗原。
3)筛选：用酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清。
4)细胞融合、筛选及克隆化：选抗血清效价最高的鼠取脾细胞与骨髓瘤细胞体外融合，经三次亚克隆获得稳定分泌抗PFTK1的单克隆抗体细胞株。
5)单克隆抗体的提取与纯化：采用体外制备腹水法，提取单克隆抗体，将克隆化的细胞株体外扩大培养后，打入经产小鼠腹腔，产生大量腹水，采用优球蛋白沉淀法纯化单克隆抗体。
Claims (6)
1.一种PFTK1蛋白激酶的多肽，其特征在于该多肽的氨基酸序列为SPSSPTSPKFGKADSYEKLEKL。
2.一种PFTK1免疫抗原，其特征在于是由如权利要求1所述的多肽与KLH偶联得到的。
3.一种PFTK1检测抗原，其特征在于是由如权利要求1所述的多肽与BSA偶联得到的。
4.一种能稳定分泌抗PFTK1的单克隆抗体的杂交瘤细胞4E7，保藏号CGMCC No.3140。
5.一种鼠源性抗PFKT1单克隆抗体，其是由权利要求2所述免疫抗原制备得到的。
6.一种蛋白激酶PFTK1的免疫检测试剂盒，其含有如权利要求5所述的鼠源性抗PFKT1单克隆抗体。
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| CN1165481A (zh) * | 1994-10-28 | 1997-11-19 | 科西雷佩蒂斯公司 | 抑制蛋白激酶的方法和组合物 |
| CN1345798A (zh) * | 2000-09-26 | 2002-04-24 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 新的人Cdc2相关蛋白激酶、其编码序列及用途 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Valerie Besset 等.The identification and characterization of expression of Pftaire-1,a novel Cdk family member,suggest its function in the mouse testis and nervous system.《Molecular Reproduction and Development》.1998,第50卷(第1期),18-29. * |
Also Published As
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| CN101928700A (zh) | 2010-12-29 |
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