JP4541548B2 - 薬剤組成物及び使用方法 - Google Patents

Description

【０００１】
本出願は、1998年6月19日付出願の米国仮出願第60/090,053号に関連し、且つその優先権の利益を享受するものであり、且つ当該出願の内容の全ては引用により本出願に取り込まれる。加えて、本出願の明細書の全体に亘り引用される全ての特許、出願特許公開及び他の文献の内容の全てが本出願に引用により取り込まれる。本願明細書に開示される発明は、NIH補助金（NIH grant） CA-23108, RO1 CA 54494, RO1 CA 62275, KO1 CA 75154, NS 28767及びDOD/AMRD 奨学金（award） 1796-1-6163に基づく米国政府の支援の下でなされたものである。従って、米国政府は、本願発明についての一定の権利を有することができる。
本発明は、ガン、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、関節リューマチ、及び他の炎症性疾患等の疾患の防止または治療に有用なことが判明している化合物に関する。
【０００２】
ガン防止における主要なニーズの一つは、化学防御のための有効で、安全な新しい薬剤の開発である。特に、発ガンのプロセスに含まれることが知られている機構をターゲットにした化学防御薬剤に対するニーズが存在する。近年、発ガンに関連する炎症の機構の研究及び新しい化学防御薬剤の開発の基礎としてのこのような機構の使用に関心が復活している。
【０００３】
炎症と発ガンが関連する現象であるという概念がこれらの２つのプロセスを機構的な手法で結び付けることを試みる多くの研究の主題であった（Sporn and Roberts, 1986; Ohshima and Bartsch, 1994）。アルギニン及びアラキドネートの各々からのＮＯ及びプロスタグランジンの恒常的な合成を仲介する酵素は、炎症または発ガンに対して比較的ににほとんど重要性を有しない。対照的に、誘導性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）及び誘導性シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）の双方は、負傷または病原菌への組織の応答において重要な役割を有する（Moncada et al., 1991; Nathan and Xie, 1994; Siebert and Masferrer, 1994; Tamir and Tannebaum, 1996）。これらの誘導性酵素は、炎症性プロセス、負傷の最終的修復、及び発ガンの不可欠の構成要素である。ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２の生理活性は、生物体にはっきりした利益を提供する一方、ｉＮＯＳまたはＣＯＸ−２の異常または過剰発現は、多くの病気のプロセスの病原、特に中枢神経系の慢性変性、発ガン、敗血症性ショック、心筋症、関節リューマチにかかわりがある。
【０００４】
スクアレンの環化により植物中で生合成されるトリテルペノイドは、多くのアジアの国で薬用の目的に使用される。ウルソール酸及びオレアノール酸のような一部のものは、抗炎症性で抗発ガン性であることが知られている（Huang et al., 1994; Nishino et al., 1988）。しかしながら、これらの天然起源の分子の生物活性は比較的弱く、それゆえこれらの効能を増進する新しい類似体の合成が試みられている（Honda et al., 1997; Honda et al., 1998）。いくつかのこのような合成類似体は、ＩＦＮ−γまたはＬＰＳにより刺激されたマクロファージにおけるｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２のデノボ生成を抑制することができることが以前に報告された（Suh et al., 1998）。多くの器官における発ガンのエンハンサーとしてのｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２の役割は、増大する注目を集めている（Ohshima et al., 1994; Tamir et al., 1996; Takahashi et al., 1997; Ambs et al., 1998; Tsujii et al., 1998; Oshima et al., 1996; Hida et al., 1998; Huang et al., 1998）。それゆえ、これらの酵素の合成または活性の抑制が化学防御の標的である（Oshima et al., 1998; Kawamori et al., 1998）。分化を誘起する、あるいは前悪性あるいは悪性細胞の増殖を抑制する薬剤は、ガンの化学防御、並びに化学療法への別な機構的なアプローチとなる。
【０００５】
（発明の要約）
本発明は、ガン、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症等の疾患の防止または治療の方法及び組成物を提供する。本発明の方法は対象に式：
【化１３】

（ここで、ＡまたはＢは単結合または二重結合であり、Ｃ₁₁またはＣ₁₂は有機あるいは無機の置換部分＝Ｘを有し、Ｒ₁は１から１０により表される６員環のいずれかの位置で置換されていてもよい有機あるいは無機の部分であり、Ｒ₂及びＲ₃は水素または有機あるいは無機部分であって、ここでＲ ₂ 基は式で表される構造のいずれかの位置で置換されていてもよく、且つｎは０から１００の数である）の治療化合物を投与することを含む。
【０００６】
本発明は、更に式：
【化１４】

（ここで、ＡまたはＢは二重結合であって、Ａが二重結合である場合には、Ｃ₁₁は有機あるいは無機の置換部分＝Ｘを有し、またＢが二重結合である場合には、Ｃ₁₂は有機あるいは無機の置換部分＝Ｘを有し、Ｒ₁は１から１０により表される６員環のいずれかの位置で置換されていてもよい有機あるいは無機の部分であり、Ｒ₂及びＲ₃は水素または有機あるいは無機部分であって、ここでＲ ₂ 基は式（Ｉ）で表される構造のいずれかの位置で置換されていてもよく、且つｎは０から１００の数である）を有する治療組成物及びそれらの使用方法に関する。
【０００７】
従って、実施の形態として、本発明の組成物及び方法は、ガン、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の神経変性疾患（ＮＤＤｓ）、炎症性疾患、例えば、クローン疾患及び潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患及び関節リューマチ（ＲＡ）等の疾患の防止または治療に有用である。本発明の方法は、対象におけるこのような症状を防止または治療するために使用される。この方法は、少なくとも一部、本発明で開示された化合物がｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２遺伝子の転写または翻訳を抑制し、その過剰発現が過剰のＮＯ及び／またはプロスタグランジンの生成と結び付けられるという発見に基づいている。
【０００８】
更なる面として、本発明は、マクロファージ中のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）誘導ＮＯ生成を調節するのに有効なトリテルペノイド組成物に関し、上記組成物は少なくとも０．６μＭ未満、好ましくは０．００１μＭ未満のＩＣ₅₀値を有する。
【０００９】
もう一つの面として、疾患を防止または治療するように、医薬として有効な量の式（Ｉ）の組成物を対象に投与することを含んでなる、ｉＮＯＳまたはＣＯＸ−２遺伝子の過剰発現を特徴とする疾患の防止または治療の方法が提供される。このような疾患は、ガン、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、及び筋萎縮性側索硬化症等の神経変性疾患、及び関節リューマチを含む。
【００１０】
更なる面として、対象においてｉＮＯＳまたはＣＯＸ−２遺伝子の転写または翻訳を調節する方法は、ｉＮＯＳまたはＣＯＸ−２遺伝子の転写または翻訳を調節するように、医薬として有効な量の式（Ｉ）の組成物を対象に投与することを含んでなる。更なるもう一つの面として、過剰のＮＯまたはプロスタグランジンの生成を調節するように、医薬として有効な量の式（Ｉ）の組成物を対象に投与することを含んでなる過剰のＮＯまたはプロスタグランジンの生成を調節する方法が提供される。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本発明の更なる説明の前に、本明細書、実施例及び添付のクレームで使用され
る語を便宜のためにここに集める。
【００１２】
定義
本願で使用される「有機部分」という語は、アルキル、アルキルアミノ、アルコキシ、アリール、アラルキル、アリールオキシ、アルキルチオ、及びアルキルカルボキシル等の炭素をベースとする官能基を含むことを意図する。
【００１３】
本願で使用される「無機部分」という語は、水素、ハロ、アミノ、ニトロ、チオール、及びヒドロキシル等の非炭素をベースとする基または要素を含むことを意図する。
【００１４】
本願で使用される「電子吸引部分」という語は、本技術分野で公知であり、水素よりも電子吸引性が大きい基を指す。種々の電子吸引基が公知であり、ハロゲン（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨード基）、ニトロ、シアノ、−ＮＲ₃ ⁺、−ＳＲ₂ ⁺、−ＮＨ ₃ ⁺ 、−ＳＯ₂Ｒ、−ＳＯ₂Ａｒ、−ＣＯＯＨ、−ＯＡｒ、−ＣＯＯＲ、−ＯＲ、−ＣＯＲ、−ＳＨ、−ＳＲ、−ＯＨ、−Ａｒ及び−ＣＨ＝ＣＲ₂を含む（式中、Ａｒはアリールであり、Ｒは任意の適当な有機あるいは無機部分、好ましくはアルキル部分を表す）。
【００１５】
本願で使用される「ハロ置換アルキル部分」という語は、少なくとも一つの水素の代わりにハロゲン部分を有するアルキル部分を含むことを意図する。「アミノ」という語は−ＮＨ₂を意味し、「ニトロ」という語は−ＮＯ₂を意味し、「ハロゲン」という語は−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉを表し、「チオール」という語は−ＳＨを意味し、また「ヒドロキシル」という語は−ＯＨを意味する。かくして、本願で使用される「アルキルアミノ」という語は、アミノ基が付いている上記に定義されているようなアルキル基を意味する。こ本願で使用される「アルキルチオ」という語は、スルフヒドリル基が付いている上記に定義されているようなアルキル基を意味する。本願で使用される「アルキルカルボキシル」という語は、カルボキシル基が付いている上記に定義されているようなアルキル基を意味する。
【００１６】
「芳香族基」という語は、一つあるいはそれ以上の環を含む不飽和環状炭化水素を含むことを意図する。芳香族基は、ゼロから４個のヘテロ原子を含んでもよい５及び６員単環の基、例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン及びピリミジンなどを含む。芳香環は、一つあるいはそれ以上の環位置で例えば、ハロゲン、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキルアミノ、低級アルキルカルボキシル、ニトロ、ヒドロキシル、−ＣＦ₃、−ＣＮなどにより置換されていてもよい。
【００１７】
「アルキル」という語は、直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、及びシクロアルキル置換アルキル基を含む、飽和脂肪族基を指す。
【００１８】
更に、本明細書及びクレームで使用される「アルキル」（「低級アルキル」を含む）という語は、「非置換アルキル」及び「置換アルキル」の双方を含むことを意図し、後者は炭化水素骨格の一つあるいはそれ以上の炭素上の水素を置換する部分を有するアルキル部分を指す。このような部分は、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリ−ルアミノ、ジアリールアミノ、アルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロ環、アラルキル、または芳香族あるいはヘテロ芳香族部分を含むことができる。炭化水素鎖上で置換された部分は、適切ならば、それ自身置換され得ることは当業者ならば理解するであろう。シクロアルキルは、例えば上記の部分によって、更に置換され得る。「アラルキル」部分は、アリールにより置換されたアルキルである（例えば、フェニルメチル（ベンジル））。
【００１９】
本願で使用される「アルコキシ」という語は、−Ｏ−アルキル（アルキルは上記されている）の構造を有する部分を指す。
【００２０】
本願で使用される「アリール」という語は、ゼロから４個のヘテロ原子を含んでもよい５及び６員単環の芳香族基、例えば、置換あるいは非置換のベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン及びピリミジンなどを含む。
アリール基は、また、ナフチル、キノリル、インドリル等の多環縮合芳香族基を含む。芳香環は、一つあるいはそれ以上の環位置で例えば、アルキル基について上述されたような部分により置換され得る。好ましいアリール基は、非置換及び置換フェニル基を含む。
【００２１】
本願で使用される「アリールオキシ」という語は、−Ｏ−アリール（アリールは上記されている）の構造を有する基を指す。
【００２２】
本願で使用される「アミノ」という語は、式−ＮＲ_aＲ_b（式中、Ｒ_a及びＲ_bは各々独立に水素、アルキル、アリール、またはヘテロ環であり、あるいはＲ_a及びＲ_bは、それらが付いている窒素原子と一緒になって、環中に３から８個の原子を有する環状部分を形成する）の非置換または置換部分を指す。かくして、「アミノ」という語は、特記しない限り、ピペリジニルあるいはピロリジニル基等の環状アミノ部分を含むことを意図する。「アミノ置換アミノ基」は、Ｒ_a及びＲ_bの少なくとも一つがアミノ基により更に置換されているアミノ基を指す。
【００２３】
本願で使用される「対象」という語は本願に記載されるある状態が起こり得る生体を含むことを意図する。例は、ヒト、猿、牛、羊、山羊、犬、猫、マウス、ねずみ、及びこれらのトランスゲニック種を含む。好ましい実施の形態として、対象は霊長類である。更に好ましい実施の形態として、霊長類はヒトである。対象の他の例は、マウス、ねずみ、犬、猫、山羊、羊、豚、及び牛等の実験動物を含む。実験動物は、疾患用の動物モデル、例えばアルツハイマー型の神経病理を持つトランスジェニックマウスとすることができる。対象は、パーキンソン病、またはアルツハイマー病、等の神経変性疾患に罹っているヒトとすることができる。
【００２４】
本願で使用される「ＩＣ₅₀」という語は得られる最大応答の５０％である阻害性用量を指す。本願で使用される他の略号は次の通りである。ＣＤＤＯ，２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアナ−１，９−ジエン−２８酸；ＤＭＳＯ，ジメチルスルホキサイド；ｉＮＯＳ，誘導性一酸化窒素シンターゼ；ＣＯＸ−２，シクロオキシゲナーゼ−２；ＮＧＦ，神経成長因子；ＩＢＭＸ，イソブチルメチルキサンチン；ＦＢＳ，ウシ胎仔血清；ＧＰＤＨ，グリセロール３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ；ＲＸＲ，レチノイドＸレセプター；ＴＧＦ−β，トランスフォーミング成長因子−β；ＩＦＮ−γ，インターフェロン−γ；ＬＰＳ，バクテリア内毒素性リポポリサッカライド；ＴＮＦ−α，腫瘍壊死因子−α；ＩＬ−１β，インターロイキン−１β；ＧＡＰＤＨ，グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ；ＭＴＴ，３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド；ＴＣＡ，トリクロロ酢酸。
【００２５】
この化合物は、経口により、あるいは皮下、静脈内、腹腔内などの投与（例えば、注射により）により投与されてもよい。投与経路に依って、活性化合物は、酸の作用及び化合物を不活性化する他の自然条件から保護するために、ある材料中に被覆されることができる。
【００２６】
非経口以外の投与により治療化合物を投与するためには、化合物を不活性化を防止する材料により被覆すること、あるいはそのような材料と共供与することが必要である。例えば、治療化合物は、適切なキャリア例えば、リポソームまたは希釈剤中で対象に投与される。医薬として許容しうる希釈剤は、食塩水及びバッファー水溶液を含む。リポソームは、水中−油中−水型ＣＧＦエマルジョン並びに従来のリポソームを含む（Strejan et al., (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27）。
【００２７】
治療化合物は、また、非経口、腹腔内、髄腔内あるいは大脳内に投与される。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物中で、また油中で分散剤を製造することができる。貯蔵及び使用の通常条件下で、調合物は微生物の成長を防止するために保存剤を含む。
【００２８】
注射の使用に好適な医薬組成物は、無菌水溶液（水溶性である場合には）または分散剤及び無菌注射液または分散剤の即席調合のための無菌パウダーを含む。すべての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動的でなければならない。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、バクテリア及びカビ等の微生物の汚染作用に抗して保存されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコールなど）、これらの好適な混合物、及び植物油を含む溶剤または分散媒体とすることができる。レシチン等のコーティングの使用により、分散剤の場合必要とされる粒子サイズの維持により、また界面活性剤の使用により、適当な流動性を維持することができる。種々の抗菌剤及び抗カビ剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサルなどにより、微生物の作用の防止が得られる。多くの場合、等張剤、例えば砂糖、塩化ナトリウム、またはマンニトール及びソルビトール等のポリアルコールを組成物中に含むことが好ましい。組成物中に吸収遅延剤、例えばアルミニウムモノステアレートまたはゼラチンを含むことにより、注射用組成物のゆっくりした吸収をもたらすことができる。
【００２９】
治療化合物を、必要に応じて上に挙げた成分の一つまたは組み合わせと共に、適切な溶剤中に必要とされる量で取り込ませ、その後濾過無菌化を行うことにより、無菌注射液を作製することができる。一般に、基本的な分散媒体及び上に挙げた成分のうち必要とされる他の成分を含む無菌キャリア中に治療化合物を取り込ませることにより、分散剤を作製することができる。無菌注射液作製用の無菌パウダーの場合には、好ましい製造方法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、それは、前に濾過した無菌溶液から活性成分（すなわち、治療化合物）に加えて追加の所望の成分の粉末を生成する。
【００３０】
治療化合物、例えば、不活性希釈剤または吸収性食用キャリアと共に経口的に投与され得る。治療化合物及び他の成分は、また、硬いあるいは柔らかいゼラチンカプセルに包み、錠剤に圧縮され、あるいは対象の食物中に直接に包含される。経口的な治療的投与には、治療化合物は賦形剤と共に包含され、経口錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、サスペンジョン、シロップ、ウエハー等の形で使用されてもよい。勿論、組成物及び調合物中の治療化合物のパーセンテージは多様であってもよい。治療上有用な組成物中の治療化合物の量は、好適な用量が得られるような量である。
【００３１】
投与の容易さ及び用量の均一さのために非経口組成物を服用単位の形に配合することが特に得策である。本願で使用される服用単位の形は、治療を受ける対象に対する一回の用量として適する物理的に分けられた単位を指し、各単位は、必要とされる医薬キャリアと一緒にして所望の薬剤効果を生み出すように計算された予め定められた量の治療化合物を含む。本発明の服用単位の形に対する規格は、（ａ）治療化合物の独自の特徴と得るべき特定の薬剤効果、及び（ｂ）対象における選ばれた状態の治療に対してこのような治療化合物を混和する本技術分野に固有な制約により決定され、それらに直接依存する。
【００３２】
活性化合物は、対象における状態と関連する状態を治療するのに充分な治療上有効な用量で投与される。「治療上有効な用量」は、好ましくは、治療を受けない対象に比べて、感染対象における状態の症状を少なくとも約２０％、更に好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約６０％、更により好ましくは少なくとも約８０％低減する。例えば、化合物の効能は、実施例及び図で示されるモデルシステム等、ヒトの病気を治療する効能を予測するような動物モデルシステムにおいて評価され得る。
【００３３】
本発明は式
【化１５】

（式中、ＡまたはＢは単結合または二重結合であり、Ｃ₁₁またはＣ₁₂は有機あるいは無機の置換部分＝Ｘを有し、Ｒ₁は１から１０により表される６員環のいずれかの位置で置換されていてもよい有機あるいは無機の部分であり、Ｒ ₂ 及びＲ ₃ は水素または有機あるいは無機部分であって、ここでＲ ₂ 基は式で表される構造のいずれかの位置で置換されていてもよく、且つｎは０から１００の数である）を有する物質組成物を特徴とする。
【００３４】
本発明は、更に式
【化１６】

（式中、ＡまたはＢは二重結合であって、Ａが二重結合である場合には、Ｃ₁₁は有機あるいは無機の置換部分＝Ｘを有し、またＢが二重結合である場合には、Ｃ₁₂は有機あるいは無機の置換部分＝Ｘを有し、Ｒ₁は１から１０により表される６員環のいずれかの位置で置換されていてもよい有機あるいは無機の部分であり、Ｒ ₂ 及びＲ ₃ は水素または有機あるいは無機部分であって、ここでＲ ₂ 基は式（Ｉ）で表される構造のいずれかの位置で置換されていてもよく、且つｎは０から１００の数である）を有する物質組成物を特徴とする。
【００３５】
Ｒ₁は電子吸引基、例えばシアノ、アリール、及びハロ置換アルキル部分であってもよい。好ましくは、Ｒ₁は、シアノ、ハロ、または−ＯＲ’（式中、Ｒ’はＨまたは有機部分、例えばアセチルまたはカルボキシル基である）を含んでもよい。Ｒ₁は１から１０の位置により表される６員環のいずれかで置換されていてもよいが、好ましい実施の形態としては、Ｒ₁は位置２にあり、更に好ましい実施の形態としては、Ｒ₁は位置２のシアノである。
【００３６】
式（Ｉ）の更に好ましい実施の形態としては、Ｂは二重結合であり、ＸはＯであり、Ｒ₃は−ＯＨであり、Ｒ₁は好ましくは位置２のシアノである。好ましい化合物の例は、３，１１−ジオキソオレアナ−１，１２−ジエン−２８酸（3,11-dioxoolean-1,12-dien-28oic acid）、２−シアノ−３，１１−ジオキソオレアナ−１，１２−ジエン−２８酸（2-cyano-3,11-dioxoolean-1,12-dien-28oic acid）及び２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアナ−１，９−ジエン−２８酸（2-cyano-3,12-dioxoolean-1,9-dien-28oic acid）を含む。
【００３７】
もう一つの面として、本発明は、マクロファージ中のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）誘導ＮＯ生成を調節するのに有効なトリテルペノイド組成物を特徴とし、上記組成物は少なくとも０．６μＭ未満、好ましくは０．００１μＭ未満のＩＣ₅₀値を有する
【００３８】
もう一つの面として、疾患を防止または治療するように、医薬として有効な量の式（Ｉ）の組成物を対象に投与することを含んでなる、ｉＮＯＳまたはＣＯＸ−２遺伝子の過剰発現を特徴とする疾患の防止または治療の方法が提供される。好ましい実施の形態としては、この疾患は、ガン、神経変性疾患、及び関節リューマチを含む。更に好ましい実施の形態としては、神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、及び筋萎縮性側索硬化症を含む。ガンは、乳ガン、前立腺ガン、結腸ガン、脳腫瘍、及び骨ガンを含む。
【００３９】
もう一つの面として、本願発明は、過剰のＮＯまたはプロスタグランジンの生成を調節するように、医薬として有効な量の式（Ｉ）の組成物を対象に投与することを含んでなる、過剰のＮＯまたはプロスタグランジンの生成を調節する方法を特徴とする。
【００４０】
もう一つの面として、本願発明は、ｉＮＯＳまたはＣＯＸ−２遺伝子の転写または翻訳を調節するように、医薬として有効な量の式（Ｉ）の組成物を対象に投与することを含んでなる、対象においてｉＮＯＳまたはＣＯＸ−２遺伝子の転写または翻訳を調節する方法を特徴とする。
【００４１】
もう一つの面として、本願発明は、神経変性疾患を防止または治療するように、医薬として有効な量の式（Ｉ）の組成物を対象に投与することを含んでなる、神経変性疾患の防止または治療の方法を特徴とする。好ましい実施の形態として、神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、及び筋萎縮性側索硬化症を含む。
【００４２】
本発明の化合物は、好ましい実施の形態として、下記
【化１７】

（式中、Ｒ_xは任意の有機あるいは無機部分、好ましくはメチルを表し、Ｙは好ましくはヒドロキシルである）に示されるようなトリテルペノイド構造をベースとする式（Ｉ）に示される５個の環構造をベースとする化合物である。
【００４３】
トリテルペノイドは、ステロイドのように、スクアレンの環化により天然に生成し、ウルソール酸（ＵＡ）及びオレアノール酸（ＯＡ）等、すべての３０個の炭素原子を分子中に保持している。ＯＡ及びＵＡは多数の薬理活性を有することが知られているが、これらの天然起源の分子の効能は比較的弱い。しかしながら、本願明細書に開示されているようなＯＡ及びＵＡの誘導体は、ＯＡ及びＵＡよりも効能が大きい。
【００４４】
好ましい実施の形態として、このような化合物はウルソール酸及びオレアノール酸の誘導体を含む。特に好ましい実施の形態として、ＯＡ、例えば２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアナ−１，９−ジエン−２８酸（ＣＤＤＯ）の誘導体
【化１８】

は、ヒトの乳ガンの細胞成長の抑制に有効であり、図で詳述するように、マクロファージにおける一酸化窒素及びプロスタグランジンの生成の抑制、ヒトの乳ガンの細胞成長の阻害、ねずみの前立腺細胞における一酸化窒素の生成の抑制、及びヒトの結腸繊維芽細胞におけるプロスタグランジン生成の抑制等の多数のビトロアッセイシステムにおいて極めて効能が高いことが見出された。
【００４５】
これらの化合物は、ガン、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、関節リューマチ、炎症性腸疾病及び病原が一酸化窒素またはプロスタグランジンの過剰な生成を含むと考えられるすべての他の病気の防止及び治療に有用である。
【００４６】
ｉＮＯＳまたはＣＯＸ−２のいずれかの異常あるいは過剰発現が結腸における発ガンを含む多くの病気のプロセスの病原においてかかわりあいがあるとされてきた。かくして、ＣＯＸ−２に対する遺伝子の過剰発現は、結腸の発ガンにおける初期の中心的なイベントである（Prescott and White, 1996 ; Dubois et al., 1996）。ＡＰＣ（線腫様ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｉ）遺伝子における欠陥を持つマウスは、若年で多数の腸ポリープにかかり、ＣＯＸ−２酵素レベルにおける顕著な上昇がこれらのポリープに見出されている。これらの動物の知見は、多くのヒトの原発性結腸ガン及び結腸ガン細胞株におけるＣＯＸ−２ｍＲＮＡ及び蛋白質の上昇したレベルの知見と関連し（Prescott and White, 1996）、ＣＯＸ−２の上昇は、通常、前新生物細胞の死に導くアポトーシスの抑制に導くと考えられる（Tsujii and DuBois, 1996）。ＣＯＸ−２遺伝子のノックアウト及びこのノックアウトを持つマウスとＡＰＣ遺伝子において損傷を持つポリープ形成マウスとの引き続く交配により、腸腫瘍形成へのＣＯＸ−２の機能の関連が示された。ＣＯＸ−２ノックアウトは、その子孫においてポリープの数の劇的な減少を起こした（Oshima et al., 1996）。更に、選択的ＣＯＸ−２インヒビターまたは非選択的ＣＯＸ−１／ＣＯＸ−２インヒビターによる実験動物の治療は、腸ガンの化学防御への有力なアプローチであると報告されている（Marnett, 1992; Oshima et al., 1996; Boolbol et al., 1996; Reddy et al., 1996; Sheng et al., 1997）。発ガンにおけるｉＮＯＳの役割に関しては、ＮＯは強力な突然変異誘発物質であり、一酸化窒素はまたＣＯＸ−２を活性化することができることが明白である（Tamir and Tannebaum, 1996）。更に、発ガン物質のアゾキシメタンにより誘導されたラットの結腸腫瘍でのｉＮＯＳが顕著に増加する（Salvemini et al., 1993,1994）。
【００４７】
ＭＳは中枢神経系の炎症性状態であることが知られている（Williams, Ulvestad and Hickey, 1994; Merrill and Beneviste, 1996; Genain and Nauser, 1997）。炎症性、酸化的、あるいは免疫的機構がＭＳ，ＡＤ，ＰＤ，及びＡＬＳの病原に含まれているかもしれない（Bagasra et al., 1995; Griffin et al., 1995; McGeer and McGeer, 1995; Good et al., 1996; Simonian and Coyle, 1996; Kaltschmidt et al., 1997）。反応性星状細胞及び活性化小膠細胞は、ＮＤＤ／ＮＩＤの因果関係においてかかわりがあるとされてきた。酵素、ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２の各々の生成物としてＮＯ及びプロスタグランジンの双方を合成する細胞として小膠細胞に特別な強調がなされている。これらの酵素のデノボ生成は、インターフェロン−ガンマまたはインターロイキン−１等の炎症性サイトカインにより促進される。一方、ＮＯの過剰な生成は、神経系のニューロン及び希突起膠細胞を含む多くの器官の細胞及び組織中の炎症性カスケード及び／または酸化的損傷を導き、結果として、ＡＤ及びＭＳ、及び恐らくはＰＤ及びＡＬＳを発現する（Coyle and Puttfarcken, 1993; Goodwin et al., 1995; Beal, 1996; Good et al., 1996; Merrill and Benvenist, 1996; Simonian and Coyle, 1996; Vodovotz et al., 1996）。疫学データは、アラキドネートからのプロスタグランジンの合成を阻止するＮＳＡＩＤの慢性的な使用は、ＡＤの進行に対するリスクを顕著に低下させることを示している（McGeer et al., 1996; Stewart et al., 1997）。かくして、ＮＯ及びプロスタグランジンの生成を阻止する薬剤がＮＤＤの防止及び治療へのアプローチにおいて使用される。
【００４８】
ここに更に開示されるのは、次の３つの重要な性質を有する、新しい合成オレアネートトリテルペノイド、ＣＤＤＯの合成及び生物活性である。
１）悪性及び非悪性細胞の双方における分化の誘導のための有効な薬剤である。
２）それは、多くの悪性及び前悪性細胞の増殖のインヒビターとしてナノモルレベルで活性である。
３）それは、炎症性酵素、ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２のデノボ合成の抑制においてこれ迄のいかなるトリテルペノイドよりも１００から５００倍の効力がある。
これらの３つの作用は有用な新しい化学防御薬剤の開発に重要であり、これらは、また、それ自体、悪性腫瘍の治療に関連がある。
【００４９】
本発明の実施には、特記しない限り、当業界の技術の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学における通常の技術が使用される。このような方法は文献で充分説明されている。
例えば、Genetics; Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, J. et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)); Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Ed., ed. by Ausubel, F. et al. (Wiley, NY (1995)); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. (1984)); Mullis et al. 米国特許番号: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984)); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London (1987)); Handbook OfExperimental Immunology, Volumes I- IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds. (1986)); and Miller, J. Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1972))、を参照。
【００５０】
本発明は、次の実施例により例示されるが、これは本発明を更に限定するものとは考えられるべきでない。背景を含めて本出願を通して引用される、すべてのリファレンス、発行特許及び公開された特許出願はここに引用として取り込まれる。実施例及び図において記述されているモデルにおける本発明の治療化合物の効能の例示はヒトにおける効能を予測している。
【００５１】
（実施例）
実施例１
化合物を下記のように合成した。
【化１９】

【化２０】

【００５２】
ＴＨＦ（Clinton et al., 1961）中のナトリウムメトキサイドの存在下、ＯＡ（化合物９）（Simonsen and Ross, 1957）をエチルホルメートによりホルミル化することにより、化合物１０を調製した。酢酸エチル中でフェニルセレニルクロライドにより化合物１０のＣ−１に二重結合を導入し、引き続いて３０％過酸化水素を添加することによって、化合物７を得た（Sharpless et al., 1973）。エタノール水溶液中でヒドロキシルアミンを添加することにより、化合物１０から化合物１１を合成した。化合物１１をナトリウムメトキサイドにより開裂することにより、化合物１２を得た（Johnson and Shelberg, 1945）。アルカリ加水分解の後、ジョーンズ酸化することにより、化合物１３（Picard et al., 1939）から化合物１４を調製した。ベンゼン中ナトリウムメトキサイドの存在下化合物１４をエチルホルメートによりホルミル化することにより、化合物１５を調製した。ヒドロキシルアミンを添加することにより、化合物１５から化合物１６を合成した。１６をナトリウムメトキサイドにより開裂することにより、化合物１７を得た。酢酸エチル中でフェニルセレニルクロライドにより化合物１７のＣ−１に二重結合を導入し、引き続いて３０％過酸化水素を添加し、その後ＤＭＦ（Dean, P. D. G., 1965）中ヨウ化リチウムによりハロゲノリシス（halogenolysis）を行うことによって、化合物６（ＣＤＤＯ）を調製した。
【００５３】
マウスのマクロファージにおけるＩＦＮ−γ誘導ＮＯ生成に及ぼすこれらの化合物及びデキサメタソンの阻害活性を下記の表１に示す。アッセイに次の手順を使用した。４日前に４％チオグリコレートを腹腔内に注射したメスのマウスからマクロファージを収穫した。９６穴の組織培養プレート中にこれらの細胞を播種し、阻害試験化合物の存在下あるいは不存在下で４ｎｇ／ｍＬＩＮＦ−γとともにインキュベートした。４８時間後、ＮＯ生成を求めた（グリース反応により亜硝酸塩として測定）。このアッセイの詳細は、Ｄｉｎｇら、１９９０、Ｂｏｇｄａｎ、１９９２に示されている。化合物６（ＣＤＤＯ）は、デキサメタソンに類似して優れた阻害活性（ＩＣ₅₀，１ｎＭ）を示した。
【００５４】
【表１】

【００５５】
すべての新化合物６−８は、高分解能質量スペクトル及び元素分析を含めて満足なスペクトルデータを示した。
【００５６】
次の実施例のために、ＤＭＳＯ中でＣＤＤＯ（０．０１Ｍ）のストック溶液を作製し、−２０℃で凍結した。細胞培地に添加する前にＤＭＳＯ中連続希釈を行った。初代ラット小膠細胞及び海馬ニューロンを単離し、Ｆｌａｒｉｓら、１９９３及びＲｅｎとＦｌａｎｄｅｒｓ、１９９６に記述されているように培養した。
【００５７】
実施例２：骨髄性白血病細胞、ＰＣ１２褐色細胞腫細胞、及び３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞における分化の誘導
ＣＤＤＯは、ＮＣＩ小児腫瘍学部門（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｒａｎｃｈ）の化学療法耐性の患者に由来する、不充分に分化したＬＣＤＢ急性骨髄性白血病細胞株に単球分化を誘導する。図１１は、ＲＰＭＩ１６４０／２％ＦＢＳ中に、単独で（１１Ａ）、２．５ｎｇ／ｍｌＴＧＦ−β１（１１Ｂ）と共に、１０ ^−８ Ｍ ＣＤＤＯ（１１Ｃ）と共に、あるいはＴＧＦ−β１及びＣＤＤＯ（１１Ｄ）の双方と共に播種されたＬＣＤＢ細胞を図示する。４８時間後、サイトスピンスライドプレパラート（cytospin slide preparations）を作製し、α−ナフチルアセテートエステラーゼ活性（Ｓｉｇｍａのキット）について染色した。格子付きの皿中のＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ及び５％ウマ血清中で（Smith et al., 1997）、単独で（１１Ｅ）、１００ｎｇ／ｍｌ７Ｓ ＮＧＦ（１１Ｆ）と共に、１０ ^−６ ＭＣＤＤＯ（１１Ｇ）と共に、あるいはＮＧＦ及びＣＤＤＯ（１１Ｈ）の双方と共に、ＰＣ１２細胞を５日間培養した。三度細胞を蒔き、少なくとも２つの別な細胞のプレーティングにおいて、各処理に対して類似の結果を観察した。細胞及び神経突起のサイズの定量的な像分析についての方法が記述されている（De la Torre et al., 1997）。図１１Ｅのコントロール細胞は直径がほぼ１０μｍである。３Ｔ３−Ｌ１細胞をＤＭＥＭ／５％子牛血清中でコンフルエントな状態まで育成し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中ＣＤＤＯ（図１２Ａ）により、あるいはＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中ＣＤＤＯ及び／またはＬＧ１００２６８（図１２Ｂ）により一度処理した。その後２日毎に、ＣＤＤＯまたはＬＧ１００２６８の添加なしで、培地をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳに変えた。８日目（図１２Ａ）または６日目（図１２Ｂ）に細胞を収集し、３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨの消費に対する標準のアッセイを用いて、ＧＰＤＨを溶解物中で測定した（Wise and Green, 1979）。これらの細胞は単球／マクロファージマーカー、α−ナフチルエステラーゼを発現しない（図１１Ａ）。しかしながら、４８時間内に、ＣＤＤＯ（１０ ^−８ Ｍ）は、組織化学的に決定されるように、この酵素の活性を誘導した（図１１Ｃ）。ＴＧＦ−β１によるＬＣＤＢ細胞の処理（２．５ｎｇ／ｍｌ）は、また、α−ナフチルエステラーゼ活性を誘導し（図１１Ｂ）、双方の薬剤を使用する場合には相加的な効果があった（図１１Ｄ）。ＣＤＤＯは、それ自身であるいはＴＧＦ−β１と組み合わせて、ヒト単球白血病株、ＴＨＰ−１、及びヒト前骨髄性白血病株、ＮＢ４（データは示さず）に対して分化効果を有することが示された。
【００５８】
ニューロン成長及び分化の研究に、ラット褐色細胞腫細胞株、ＰＣ１２は、広く使用されてきた。ＮＧＦによるこれらの腫瘍細胞の処理は、多大な神経突起成長と共に、ニューロン表現型を誘導することが知られている（Greene and Rischler, 1976; Guroff 1985）。ＣＤＤＯは、ＮＧＦのこれらの効果を著しく増強する。図１１Ｅ及びＦは、ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）による神経突起成長の誘導を示す。ＣＤＤＯ（１０ ^−６ Ｍ）はそれ自身神経突起形成を誘導しないが、それは、細胞をして、大きな、平らな形状をとらしめる（図１１Ｇ）。ＮＧＦと組み合わせて使用する場合、ＣＤＤＯ（図１１Ｈ）は初代神経突起／細胞の数をほぼ倍加させ（１．２±０．２Ｓ．Ｅ．Ｍ．から２．１±０．１、ｐ＜０．００１）、神経突起の長さの３倍以上（２８±６から９９±９ミクロン、ｐ＜０．００１）の増加と、神経突起分枝／細胞の５倍の増加（０．２３±０．０６から１．１３±０．０８、ｐ＜０．００１）を引き起こす。かくして、ＣＤＤＯは、細胞サイズ、並びに神経突起樹枝状分岐の程度と複雑性を増加させることにより、ＰＣ１２細胞のニューロン分化を増進させる。
【００５９】
ＣＤＤＯが分化を誘導する第３の細胞のタイプは、３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞である。これらの非腫瘍性繊維芽細胞は、インシュリン、デキサメタソン、及びＩＢＭＸ（Green and Kehinde, 1974; Bernlohr et al., 1984）の組み合わせにより古典的に誘導されて、脂肪細胞を形成する。１０^-8Ｍの低用量でのＣＤＤＯ（図１２Ａ）による処理（添加されたインシュリン、デキサメタソン及びＩＢＭＸの不存在下で）は、トリグリセライド合成におけるキー酵素として知られている、マーカーのＧＰＤＨ（Wise and Green, 1979）の誘導により測定されるように、脂肪細胞分化を引き起こした。酵素アッセイによる結果は、脂肪滴に対するオイルレッドＯ染色により確かめられた（データは示さず）。更に、ＣＤＤＯはＲＸＲ選択的レチノイドのＬＧ１００２６８（Boehm et al., 1995）と共に相乗的に作用して、脂肪細胞の分化を促進する（図１２Ｂ）。
【００６０】
実施例３：ＣＤＤＯによる多くの悪性及び前悪性細胞の増殖の阻害
細胞増殖のインヒビターは、有用な化学防御及び化学治療薬剤であることが知られている。極めて攻撃的な白血病及び悪性腫瘍、並びに非腫瘍性組織に由来する広範な多様な細胞に対して、ＣＤＤＯを試験した。Ｄａｎｉｅｌｐｏｕｒら、１９９４に記述されているように、ＮＲＰ−１５２細胞を成長させた。１７−β−エストラジオール（１０ｐＭ）を添加したフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ １６４０／１０％炭除去したＦＢＳ中でＭＣＦ−７細胞を成長させた。プレーティング時、トリテルペノイドを添加し、７２時間後³Ｈ−チミジン（１μＣｉ／穴）を添加し、２時間の最終インキュベーションを行った。細胞をＴＣＡ（１０％）により沈殿させ、洗浄し、可溶化した後チミジンの取り込みを測定した。図１３で使用されたシンボルは、ＣＤＤＯ（中黒の正方形）、ＴＰ−８２（○）、及びオレアノール酸（●）である。
【００６１】
２つの細胞タイプ、ヒトＭＣＦ−７乳癌及びラットＮＲＰ−１５２非悪性前立腺上皮についての典型的な用量−応答曲線を図１３に示す（Danielpour et al., 1994）。ＣＤＤＯは、これらの細胞におけるチミジンの取り込みを抑制することにおいて、ナノモルの範囲において極めて活性であり、一方、ＴＰ−８２は著しく低活性であり、オレアノール酸は１μＭあるいはそれ以下の濃度で実質的に活性がない。
【００６２】
他のガン細胞について得られた結果を表２に示す。（１）エストロゲン受容体ネガティブの乳ガン細胞のいくつかの株はＣＤＤＯに敏感である。エストロゲン受容体ポジティブのＭＣＦ−７細胞も同様である。（２）たとえ、腫瘍細胞がＳｍａｄ−４／ＤＰＣ4突然変異を有し、それゆえ、ＴＧＦ−βの成長阻害作用に敏感でないとしても（Schutte et al., 1996; Zhou et al., 1998; Heldin et al., 1997）、ＳＷ６２６卵巣悪性腫瘍、ＣＡＰＡＮ−１及びＡｓＰｃ−１膵臓悪性腫瘍、及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞の場合に見られるように、これらはなおＣＤＤＯに応答する。（３）特に骨髄系統の多くの白血病細胞はＣＤＤＯに極めて敏感であることに注目されたい。
【００６３】
【表２】

【００６４】
実施例４：ＣＤＤＯによるｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２のデノボ合成の阻害
ＣＤＤＯは、酵素のｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２のデノボ生成を誘導するいくつかの炎症性サイトカインの能力を阻害することにおいて高活性である（図１４）。図１４（Ａ）はウエスターンブロットを図示する。初代マウスマクロファージ、ＩＦＮ−γ，１０ｎｇ／ｍｌ、ＬＰＳ，２ｎｇ／ｍｌをトリテルペノイドまたはデキサメタソンと一緒に培養物に添加した（濃度はμＭで示す）。細胞を１２時間で収集した。図１４（Ｂ）はＲＡＷ２６４．７マクロファージ様細胞株のノーザンブロットを図示する。ＩＦＮ−γ，１０ｎｇ／ｍｌ、ＬＰＳ，１ｎｇ／ｍｌ、ＴＮＦ−α，１０ｎｇ／ｍｌをＣＤＤＯまたはデキサメタソンと一緒に培養物に添加した。ＲＮＡを１２時間後に調製した。ＧＡＰＨＤＨをローディングコントロールとして使用した。図１４（Ｃ）は初代マクロファージにおけるＮＯ及びＰＧＥ _２ の生成の抑制を図示する。ＮＯの試験には、ＣＤＤＯ（中黒の正方形）、デキサメタソン（○）、ＴＰ−８２（□）、またはオレアノール酸（中黒の三角形）と一緒に、細胞をＩＦＮ−γ，１０ｎｇ／ｍｌにより処理した。４８時間後、上澄みをグリース反応によりＮＯについて分析した。ＰＧＥ _２ の試験には、同じセットのインヒビターと一緒に、細胞をＩＦＮ−γ，５ｎｇ／ｍｌ、及びにＬＰＳ，５ｎｇ／ｍｌにより処理した。４８時間後、ＰＧＥ _２ をイムノアッセイにより上澄み中で測定した。ＮＯ及びＰＧＥ _２ に対するコントロール値（阻害なし）は、それぞれ４．７ｎｍｏｌ／２×１０⁵細胞及び２．２ｎｇ／ｍｌ／２×１０⁵細胞であった。図１４（Ｄ）及び１４（Ｅ）は、ＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で成長させた ^１８ Ｃｏ細胞を図示する（ヒト結腸筋繊維芽細胞）。他の方法はマウスマクロファージについて上記に報告したのと同じである。図１４（Ｄ）は、ＩＬ−１β（３０ｐｇ／ｍｌ）による誘導の後のＣＯＸ−２ｍＲＮＡの抑制に対する用量−応答を示すノーザンブロットを図示する。ＩＬ−１と一緒にＣＤＤＯを添加した。図（Ｅ）においては、ウエスターンブロットは、ＣＯＸ−２蛋白質の抑制を示す。ＩＬ−１β（３０ｐｇ／ｍｌ）と一緒にＣＤＤＯを添加した。また、ＣＤＤＯによる細胞上清におけるＰＧＥ _２ の蓄積性の生成の抑制も示される。
【００６５】
ＣＤＤＯのこれらの効果は、初代マウスマクロファージ、マウスマクロファージ様腫瘍細胞株（ＲＡＷ２６４．７）、及び非腫瘍性ヒト結腸繊維芽細胞において見られる。図１４（Ａ）は、初代マクロファージでのｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２蛋白質の発現についてのウエスターンブロットを示す。ＩＦＮ−γまたはＬＰＳ等の炎症性メディエーターにより刺激される迄、ｉＮＯＳまたはＣＯＸ−２の発現もこれらの細胞では検出することができない。１μＭまたはそれ以下の濃度のＣＤＤＯは、ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２蛋白質双方の発現を阻害した。図１３に見られるように、再度、ＣＤＤＯのＣ−２上のニトリル機能の重要性を図１４（Ａ）に示す。図１４（Ｂ）は、ＣＤＤＯ（１０ ^−６ Ｍ）がＲＡＷ２６４．７細胞におけるｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２の双方に対するｍＲＮＡ発現のレベルを７５％以上低下させたことを表すノーザンブロットを示す。初代マクロファージにおいて測定されるように、ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２に及ぼす上記の効果はまた酵素生成物、ＮＯ及びＰＧＥ _２ それぞれの蓄積性の生成に反映されている図１４（Ｃ）。ＣＤＤＯによる顕著な阻害が１０^-9Ｍという低いレベルで見られ、これはＴＰ−８２またはオレアノール酸よりも著しく活性であった。しかしながら、これらの２つの酵素の合成が既に誘導されたＲＡＷ細胞に添加する場合、ＮＯまたはプロスタグランジンの生成に直接の効果を持たないので、ＣＤＤＯは、ｉＮＯＳまたはＣＯＸ−２の酵素活性の直接のインヒビターでない（データは示さず）。同様に、ＣＤＤＯの作用は、糖質コルチコイド受容体に結合することが知られている糖質コルチコイド拮抗薬のＲＵ−４８６により阻害されない（データは示さず）。これらの点で、ＣＤＤＯは、以前に試験された他のオレアノール酸誘導体と同じである（Suh et al., 1998）。
【００６６】
ＣＤＤＯがＣＯＸ−２のデノボ生成の高有効性のインヒビターである第２のタイプの細胞は、結腸繊維芽細胞である。結腸発ガンにおける間質性細胞ＣＯＸ−２の重要性のためにこれらの細胞を選択した（Oshima el al., 1996）。ＣＤＤＯは、ＩＬ−１による非腫瘍性 ^１８ Ｃｏ細胞の処理によって引き起こされるＣＯＸ−２ｍＲＮＡ及び蛋白質の誘導を阻害した（図１４Ｄ，Ｅ）。再度、この作用は培地中のＰＧＥ _２ レベルの低下に反映された。ＣＤＤＯは、ＩＦＮ−γ、ＬＰＳ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−１等の薬剤によりＣＯＸ−２の誘導を効果的に阻害するが、ＣＯＸ−２のインデューサーとしてＴＰＡを使用する場合には無効である。これは、１８Ｃｏ細胞、並びにヒト乳房上皮細胞株、１８４Ｂ５／ＨＥＲ（Zhai et al., 1993）に見られた。
【００６７】
実施例５：ラット脳細胞におけるＣＤＤＯによるｉＮＯＳの抑制及び細胞死の防止
ガン及びアルツハイマー病の発生における炎症性メディエーターの役割、並びに細胞生き残りとアポトーシスに対する異常プログラムは今真剣な研究が行われている（McGeer and McGeer, 1995; Merrill and Benveniste, 1996; Akama et al., 1998）。この実施例ではＣＤＤＯを、培養小膠細胞（脳のレジデントマクロファージ）におけるｉＮＯＳのデノボ生成のサプレッサーとして並びにβ−アミロイドにより誘導される細胞死から培養海馬ニューロンを保護する能力を試験した。ＣＤＤＯは、初代マクロファージ培養において、初代腹膜マクロファージ培養について上記に報告されたものと類似ので作用することが見出された。かくして、ＬＰＳ（５ｎｇ／ｍｌ）は、初代小膠細胞培養においてｉＮＯＳを誘導し、１８時間内にＮＯの生成において２７倍の増加を引き起こした。１０^-6または１０^-7ＭでのＣＤＤＯによるこれらの培養の付随する処理はこの誘導を、それぞれ７３％及び５２％阻害した。我々は、また、アルツハイマー病（Selkoe, 1997）の中心的病原であるこのペプチドβ−アミロイドの神経毒作用において、ＮＯが関連付けられているので（Akama et al., 1998）、ＣＤＤＯが、このペプチドβ−アミロイドにより誘導される細胞死から培養海馬ニューロンを保護する可能性を探究した。１６日ラット胚から海馬ニューロンを単離し、培養し、ＣＤＤＯにより２４時間処理し、その後にβ−アミロイドペプチドフラグメント、アミノ酸２５−３５を、１０μＭの最終濃度で添加した。β−アミロイド単独によるこの投与は、ＭＴＴアッセイにより測定されるように、培養中２４時間内に培養物中の半分以上のニューロンの死を引き起こした。しかしながら、ＣＤＤＯ（１０^-8及び１０^-7Ｍ）によるニューロン培養の前処理はこの細胞死を完全に防止し、一部のＣＤＤＯの防止活性は１０^-10Ｍという低用量にあることが判明した。
【００６８】
要約
上記に見られるように、ＣＤＤＯ等の本発明の化合物は、広範囲の作用を有する強力な、多機能分子であり、これらの多くはガン等の疾患の防止または治療に潜在的に有用である。エストロゲン受容体ポジティブ及びネガティブの乳ガン、骨髄性白血病、及びＳｍａｄ−４突然変異を持ついくつかの悪性腫瘍由来のものを含むヒト腫瘍細胞株の増殖が阻害される。マウス腹膜マクロファージ、ラット脳細胞小膠細胞、またはヒト結腸筋繊維芽細胞において酵素、誘導性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）、または誘導性シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）のデノボ形成を誘導する、インターフェロン−γ、インターフェロン−１、または腫瘍壊死因子−α等の種々の炎症性サイトカインの能力が抑制される。また、脳海馬ニューロンはβ−アミロイドにより誘導される細胞死から保護される。上記は、本発明の化合物、例えばＣＤＤＯは、悪性腫瘍の化学防御または化学治療に、並びに神経保護にインビボで有用であることを示す。
均等物
本願明細書に記載される特定の態様は、例示によるものであり、本願発明を限定するためのものではない。本願発明の重要な特徴は、本願発明の範囲を超えることなく様々な態様で実施され得る。当業者であれば、普通の実験を用いるだけで、本願明細書に記載される特定の手順の多数の均等物を認識し、確かめることができるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒト結腸筋繊維芽細胞 ^１８ Ｃｏ細胞におけるインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）誘導ＣＯＸ−２発現及びプロスタグランジンＥ _２ （ＰＧＥ _２ ）を抑制する点での本発明の組成物の２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアナ−１，９−ジエン−２８酸（ＣＤＤＯ）（「ＴＰ−１５１」と表示）の効力を図示する。
（4/14/98 ラット小膠細胞（１０ ^６ 細胞／ウェル）、１８時間インキュベーション、ＬＰＳ（５ｎｇ／ｍｌ）を誘導物質として用いた。）
【図２】 ラット脳細胞小膠細胞（脳マクロファージ細胞）におけるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）により誘導されたＮＯ生成に及ぼす種々の化合物の効力の比較であり、ＴＰ−１５１の活性がデキサメサソン、糖質コルチコイドのそれに有利であることを示し、神経変性疾患を防止または治療するのに本発明の組成物がどのように使用されるかを示す。「ＴＰ−８２」は３，１１−ジオキソオレアナ−１，９−ジエン−２８酸を指す。
【図３】 アルツハイマー病に関与する、β−アミロイドペプチドにより誘導される毒性に対してラットの海馬ニューロンを防止する点でのＴＰ−１５１の効力を図示する。
（4/30/98ニューロン培養物を、重大な神経毒性を引き起こすβ−アミロイドフラグメント２５−３５に曝した。ＴＰ−１５１による２４時間の前処理が、この毒性をブロックした。ＭＴＴ減少（細胞生存能力についてのマーカー）は、５９０ｎｍで測定された。）
【図４】 前立腺ガンの防止または治療に関連して、正常なラット前立腺細胞（ＮＲＰ１５２）の成長を阻害する点でのＴＰ−１５１の効力を図示する。
（ＮＲＰ１５２細胞を、２４ウェル−組織培養プレートに、ウェルあたり15,000細胞の密度で播種した。細胞付着後（約２時間）、化合物を添加した。細胞を、７２時間培養し、ついで ^３ Ｈチミジン取り込み（２時間−パルス）に供した。）
【図５】 正常なラット前立腺細胞（ＮＲＰ１５２）におけるｉＮＯＳ蛋白質の発現を調節する点でのＴＰ−１５１の効力を図示する。
（ＮＲＰ１５２細胞を、ＴＰ１５１の異なる濃度の存在下または不存在下に、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＬＰＳとＴＰＡで１２時間処理した。細胞溶解物を得て、ＩＮＯＳ発現についてのウェスタン分析に使用した。）
【図６】 乳ガンの防止または治療に関連して、ＭＣＦ−７細胞（乳ガン細胞株）におけるエストロゲン刺激増殖を阻害する点でのＴＰ−１５１を含む種々の化合物の効力の比較を図示する。
【図７】 炎症性コンポーネントによる状態の防止または治療に関連して、マウス初代マクロファージにおけるＬＰＳ及びＩＦＮ−γにより誘導されるＮＯ生成を阻害する点でのＴＰ−１５１を含む種々の化合物の効力の比較を図示し、ＴＰ−１５１の活性がデキサメサソンのそれに有利であることを示す。
（初代マウスマクロファージにおけるＮＯアッセイ
ＩＦＮ−γ（５ｎｇ／ｍｌ）及びＬＰＳ（５ｎｇ／ｍｌ）；９６穴プレート中２Ｘ１０ ^５ 細胞／ウェル；４８時間インキュベーション。トリテルペノイドは、１０μＭから０．１ｐＭの濃度で試験した。）
【図８】 マウス初代マクロファージにおけるＩＦＮ−γにより誘導されるＮＯ生成を阻害する点での種々の化合物の効力の比較を図示する。
（5/3/98初代マウスマクロファージにおけるＮＯアッセイ
ＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ）；９６穴プレート中２Ｘ１０ ^５ 細胞／ウェル；４８時間インキュベーション。トリテルペノイドは、１０μＭから０．１ｐＭの濃度で試験した。）
【図９】 マウス初代マクロファージにおけるＬＰＳ及びＩＦＮ−γにより誘導されるＰＧＥ _２ 生成を阻害する点での種々の化合物の効力の比較を図示する。
（5/3/98初代マウスマクロファージにおけるＰＧＥ２アッセイ
ＩＦＮ−γ（５ｎｇ／ｍｌ）及びＬＰＳ（５ｎｇ／ｍｌ）；９６穴プレート中２Ｘ１０ ^５ 細胞／ウェル；４８時間インキュベーション。トリテルペノイドは、１０μＭから０．１ｐＭの濃度で試験した。）
【図１０】 マウス初代マクロファージにおけるＩＦＮ−γ及びＬＰＳにより誘導されるｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２の発現を抑制する点での種々の化合物の効力の比較を図示する。
（5/6/98初代マウスマクロファージにおけるＣＯＸ−２及びｉＮＯＳ蛋白質のウェスタン分析
ＩＦＮ−γ（５ｎｇ／ｍｌ）及びＬＰＳ（５ｎｇ／ｍｌ）で１８時間インキュベーション。
全ての化合物は、μＭの濃度で試験した。）
【図１１−１】 ＬＣＤＢ白血病細胞（Ａ−Ｄ）、ＰＣ１２細胞（Ｅ−Ｈ）におけるＣＤＤＯによる分化の誘導を示す。
【図１１−２】 ＬＣＤＢ白血病細胞（Ａ−Ｄ）、ＰＣ１２細胞（Ｅ−Ｈ）におけるＣＤＤＯによる分化の誘導を示す。
【図１２】 ３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞におけるＣＤＤＯによる分化の誘導を示す。
【図１３】 ＣＤＤＯ（中黒の正方形）、ＴＰ−８２（○）、及びオレアノール酸（●）によるＮＲＰ１５２及びＭＣＦ−７細胞における細胞成長の抑制に対する用量−応答曲線を図示する。
【図１４】 マウスマクロファージ及びヒト結腸繊維芽細胞におけるｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２の誘導に及ぼすトリテルペノイドの阻害効果を示す。

Claims (11)

1. 下記式を有する化合物：
   

   

   式中、
   Ｒ ₁ は、−ＣＮ、-ＣＯＯＨまたは-ＣＯＯＲ（ここで、Ｒは、アルキルである。）であり、
   Ｒ₂ は、メチルであり、及び
   Ｒ ₃ は、−ＯＨ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノまたは−ＮＲ _a Ｒ _b （ここで、Ｒ _a は、水素またはアルキルであり、Ｒ _b は、アルキルまたはフェニルである。）である。
2. Ｒ₁が−ＣＮであり、Ｒ₂がメチルであり、及びＲ₃が−ＯＨである、請求項１に記載の化合物。
3. Ｒ₁が−ＣＮであり、Ｒ₂がメチルであり、及びＲ₃が−ＯＭｅである、請求項１に記載の化合物。
4. 下記式を有する請求項１に記載の化合物。
   

   
5. 下記式を有する請求項１に記載の化合物。
   

   
6. 下記式を有する化合物：
   

   

   式中、
   Ｒ₁は、−ＣＮ、-ＣＯＯＨまたは-ＣＯＯＭｅであり、
   Ｒ₂は、メチルであり、及び
   Ｒ₃は、−ＯＨ、アルコキシ、アミノまたはアルキルアミノである。
7. 下記式を有する請求項６に記載の化合物。
   

   
8. 下記式を有する請求項６に記載の化合物。
   

   
9. 下記式を有する化合物：
   

   

   式中、
   Ｒ₁は、−ＣＮであり、
   Ｒ₂は、メチルであり、及び
   Ｒ₃は、−ＯＨまたはアルコキシである。
10. 下記式を有する請求項９に記載の化合物。
    

    
11. 下記式を有する請求項９に記載の化合物。
    

    

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