CN110536685A - Sox18蛋白活性的抑制剂用于治疗血管生成相关疾病和/或淋巴管生成相关疾病 - Google Patents

Sox18蛋白活性的抑制剂用于治疗血管生成相关疾病和/或淋巴管生成相关疾病 Download PDF

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Abstract

本发明公开了本文所提供的式的化合物，其显示出抑制SOX18蛋白活性的功效，特别是有关SOX18结合DNA和/或特定蛋白质配偶体的能力。另外，本文提供了治疗诸如癌症转移和血管癌的血管生成相关疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关疾病、病症或病况的方法。

Description

SOX18蛋白活性的抑制剂用于治疗血管生成相关疾病和/或淋 巴管生成相关疾病
发明领域
本发明涉及医学治疗领域。更具体地，本发明涉及用于抑制SOX18转录因子活性的化合物。
发明背景
本文对背景技术的任何提及不应被解释为承认此类技术在澳大利亚或其他地方构成公知常识。
通过小分子直接调节转录因子(TF)仍然是一项长期的探索。早期结果仅限于核受体，其含有可被小分子靶向的配体结合结构域。这些发现已经转化为激素依赖性癌症的治疗应用(Perissi and Rosenfeld,2005)。目前的挑战是将核受体扩展到更广泛的转录因子，所述转录因子缺乏用于小分子药物的结合口袋。由于许多TF缺乏确定的三维结构，特别是其蛋白质-蛋白质结合结构域，重组表达TF的困难，以及缺乏测定其作用模式的测定技术，使得这项任务非常困难(Fontaine等，2015)。TF活性的调节通常通过改变它们在细胞核中的基因表达水平或浓度，或通过改变它们对DNA或伴侣蛋白的结合能力来实现，后者是实现TF选择性的更有希望的策略。一些关于破坏伴侣蛋白TF募集的小分子的出版物证明了这种方法的潜力(Miyoshi等，2011，Vassilev等，2004，Filippakopoulos等，2010，Vogler等，2009，Liu等，2014)。
在人基因组中的TF中，发育TF作为有吸引力的分子靶标是突出的，因为它们的表达通常在成人的特定病理条件下失调，然而在生理条件下是沉默的(例如，对于成年期表型维持是不需要的)(Boyadjiev和Jabs，2000，Darnell，2002，Lopez-Bigas等，2006，Vaquerizas等，2009)。一类发育因子，即SOX(SRY相关HMG-盒)TF，最近出现为干细胞编程的关键调节因子以及癌症相关病况中的分子开关(Sarkar和Hochedlinger，2013，Niwa等，2009)。先前在靶向SOX蛋白的尝试主要集中于SOX2(Narasimhan等，2011)(一种各种癌症中的潜在癌基因)(Bass等，2009)和SOX18(Klaus等，2016)(用于血管发育的一个关键分子开关)(Cermenati等，2008，Francois等，2008，Pennisi等，2000)。道森多金属氧酸盐已被证明可抑制SOX2DNA结合，然而，仅显示出对各种TF家族的低选择性，并且从未在任何体外或体内功能测定中进行过测试(Narasimhan等，2014，Narasimhan等，2011)。最近，SOX DNA诱饵已被用作SOX18 DNA结合和SOX18依赖性反式激活的选择性抑制剂。虽然这些诱饵显示出比非SOX TF更高的选择性，但它们自身不能扩散通过细胞膜，从而限制了它们的应用范围(Klaus等，2016)。SOX TF的药理学调节的一个未探索的方面与这些蛋白质如何募集其配偶体并因此通过一系列蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)调节转录有关。按理说，合成文库确实没有靶向PPI所需的结构多样性(Hopkins和Groom，2002，Feher和Schmidt，2003)。
转录因子(TF)的SOXF组(SOX7、SOX17和SOX18)是发育过程中内皮细胞分化的关键调节因子(Francois等，2008，Corada等，2013，Hosking等，2009，Matsui等，2006，Cermenati等，2008，Herpers等，2008)，因此，对于脉管系统的形成至关重要。SoxF基因的突变或缺失会使动静脉规格、血管完整性和淋巴管生成受损，并抑制癌症动物模型中的肿瘤生长和转移(Duong等，2012，Yang等，2013，Zhang等，2009，Young等，2006)。最近，高水平的SOX18与人患者的癌症预后不良相关(Eom等，2012，Pula等，2013，Jethon等，2015)。因此，SOX18蛋白功能的药理学抑制提供了用于治疗癌症中的血管反应的潜在途径以及血管癌中的潜在治疗靶标。
因此，仍然需要抑制SOX18蛋白活性(例如通过直接与其结合，或接近其DNA结合结构域)以扰乱例如SOX18-蛋白质配偶体募集和/或SOX18 DNA结合的化合物。
发明概述
本发明至少部分地基于以下发现：本文提供的式的某些合物具有抑制SOX18蛋白活性(特别是关于SOX18结合DNA和/或特定蛋白质配偶体的能力)的功效。通过扩展，进一步显示这些化合物在治疗血管生成相关疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关疾病、病症或病况诸如癌症转移和血管癌方面是有效的。
在本发明的第一方面，提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药：
其中，
R1选自OH和OR6，其中R6为C1–C4烷基；
R2选自H、COOR7和C(O)NR8R9，其中R7、R8和R9独立选自H和C1–C4烷基；
R3为L-A，其中L为选自C2–C8烷基、C2–C8烯基和C2–C8烷氧基烷基的接头，A选自任选取代的苯基和任选取代的萘基；
R4选自H、OR10、卤代和C1–C4烷基，其中R10选自H和C1–C4烷基；以及
R5选自H、OR11、卤代和C1–C4烷基，其中R11选自H和C1–C4烷基，
其中，该化合物用于抑制SOX18活性。
在实施方案中，R1选自OH和OMe。
合适地，R2选自H、COOH、COOMe和
优选地，R2选自COOH和
在实施方案中，R4选自H、OH、OMe、Cl和Me。
合适地，R5选自H、OH和OMe。
在某些实施方案中，R4和R5为H。
在实施方案中，L为选自C2–C6烷基、C2–C6烯基和C2–C6烷氧基烷基的接头。
在任何所述实施方案中，R3选自：
其中，虚线表示从相邻原子到式I的环的连接，所示结构包括其E/Z异构体。
在一个实施方案中，第一方面的化合物选自：
更优选地，第一方面的化合物选自：
合适地，就本方面的化合物而言，SOX18活性包括与DNA序列和/或蛋白质接触和/或结合。优选地，蛋白质选自SOX7、RBPJ、XRCC5、SOX18、ILF3、DDX17及其任意组合。
在本发明的第二方面中，提供了药物组合物，其包含第一方面的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，以及药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
在本发明的第三方面，提供了治疗或预防受试者的血管生成相关疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关疾病、病症或病况的方法，包括向受试者施用有效量的第一方面的化合物或其药学上有效的盐、溶剂化物或前药或第二方面的药物组合物从而治疗或预防血管生成和/或淋巴管生成相关的疾病、病症或病况的步骤。
在本发明的第四方面，提供了第一方面的化合物或其药学上有效的盐、溶剂化物或前药在制备用于治疗或预防血管生成相关的疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关的疾病、病症或病况的药物中的用途。
在提及第三和第四方面时，血管生成相关的疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关的疾病、病症或病况合适地是或包括眼科疾病、病症或病况。优选地，眼科疾病、病症或病况选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病、缺血性视网膜病、早产儿视网膜病、新生血管性青光眼、虹膜炎、角膜新生血管、睫状体炎、镰状细胞视网膜病、翼状胬肉、角膜损伤期间的血管反应及其任意组合。
在第三和第四方面的本发明的替代实施方案中，血管生成相关的疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关的疾病、病症或病况是或包括癌症。优选地，癌症选自前列腺癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肝癌、肝细胞癌、肉瘤、白血病、急性T细胞淋巴瘤、血管肿瘤及其任意组合。在特定实施方案中，第一方面的化合物或第二方面的药物组合物预防和/或抑制所述癌症的转移。
在两个前述方面的另外的实施方案中，血管生成相关的疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关的疾病、病症或病况合适地是或包括肾脏疾病、病症或病况。优选地，肾脏疾病、病症或病况选自慢性肾移植功能障碍、原发性肾纤维化病症、蛋白尿、糖尿病性肾病、肾炎及其任意组合。
在两个前述方面的另一个实施方案中，血管生成相关的疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关的疾病、病症或病况是或包括动脉粥样硬化。
在两个前述方面的另一个实施方案中，血管生成相关的疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关的疾病、病症或病况是或包括毛发稀少症-淋巴水肿-毛细血管扩张综合征。
在本发明的第五方面，提供了抑制或阻止受试者的癌症转移的方法，包括向受试者施用有效量的第一种化合物或其药学上有效的盐、溶剂化物或前药或第二方面的药物组合物从而抑制或阻止癌症转移的步骤。
合适地，癌症选自前列腺癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肝瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤、血管肿瘤(例如，血管肿、血管肉瘤、血管瘤)及其任意组合。
在本发明的第六方面，提供了抑制、阻止或降低受试者中SOX18活性的方法，包括向受试者施用有效量的第一种化合物或其药学上有效的盐、溶剂化物或前药或第二方面的药物组合物从而抑制、阻止或降低受试者中的SOX18活性的步骤。
合适地，SOX18活性包括与DNA序列和/或蛋白质接触和/或结合。优选地，蛋白质选自SOX7、RBPJ、XRCC5、SOX18、ILF3、DDX17及其任意组合。
附图简要说明
为了使本发明易于理解并付诸实践，现在将参考附图以举例的方式描述优选实施方案，其中：
图1：天然产物，SOX18-DNA结合的抑制剂。A.来自2688份0.25mg/mL的海洋提取物的高通量FP筛选的代表性数据集。对具有FAM标记的SOX应答元件(小鼠Prox1内含子1)的全长小鼠SOX18运行筛选。配体与SOX18的竞争性结合降低了FP指数(箭头指向红点活性提取物)。B.Sm1和Sm2的化学结构。C.Sm1和Sm2的FP浓度-响应曲线(全长小鼠SOX18，平均值±S.D.。N＝3)。
图2：结构类似物的聚焦文库和利用计算机聚集预测器(aggregation predictor)和临界胶束浓度(CMC)测定的复筛。A.第一组基于化合物Sm1和Sm2中明显的邻-羟基苯甲酸(水杨酸)基序。第二组基于相似的间苯二酚支架。第三组在于含有相似水杨酸或邻氨基苯甲酸支架的批准的NSAID。B.中性去垢剂Triton X100对照以及两种化合物Sm4和Sm10的典型CMC数据。C.Sm4、甲氯芬那酸、尼氟酸和氟芬那酸抑制SOX18-DNA结合。
图3：化合物与SOX蛋白相互作用，但不与DNA相互作用。A.、B.生物素化的双链DNA探针(约40个碱基对长，具有SOX18共有元件(A.)或无规序列(B.)，并且侧接基因组DNA)用于测试小分子DNA结合。将探针固定在SPR链霉抗生物素蛋白芯片上。阳性对照DAPI、溴化乙锭和放线菌素D以与文献一致的方式与DNA结合。小分子抑制剂(Sm4、5和14)不与共有序列或无规DNA结合。C.如通过从25℃加热至80℃的蛋白质复合物的差异静态光散射测量的，在Prox1-DNA、Sm4、5或Sm14存在的情况下SOX18[109]HMG片段的热稳定性。小分子的结合促进蛋白质稳定性(ΔTagg>3℃被认为是显著的稳定化)。Boltzmann曲线拟合标准化的光散射三重数据(拟合优度R2>0.97)。D.如通过基于FP的DNA结合竞争测定所测量的，Sm4抑制SOX2、6、9、11、15和18-HMG片段的DNA结合。
图4：Sm4、尼氟酸、氟芬那酸和甲氯芬那酸对SOX18蛋白质-蛋白质相互作用的影响。A.左图：如通过对XRCC6(阴性对照)以及已知与SOX18相互作用的两种蛋白质RBPJ和MEF2C进行α筛选所测试的SOX18成对蛋白质-蛋白质相互作用的热图。右图：蛋白质复合物的免疫共沉淀。在无细胞条件下，SOX18-mCherry-cMyc与GFP-RBPJ、GFP-MEF2C或仅GFP(阴性对照)共表达，并用GFP Nanotrap珠免疫沉淀。条带：1.RBPJ-GFP,2.MEF2C-GFP,3.SOX18-mCherry,4.GFP。B.Sm4、尼氟酸、氟芬那酸和甲氯芬那酸对SOX18与MEF2C和RBPJ的相互作用的影响。
图5：Sm4化学基序对SOX18 DNA结合抑制、SOX18-RBPJ结合抑制、细胞毒性和聚集的贡献。上图的表格描述了Sm14-44化合物，并以颜色编码方式总结了针对四种活性标记(即,蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质结合抑制、细胞毒性和聚集风险)获得的结果。第二个底部条形图详细说明在50μM和5μM(当可获得时)下SOX18-RBPJ蛋白质-蛋白质结合抑制结果(N＝4，平均值±SD)。(DNA结合抑制、细胞毒性和cLogP原始数据概述于表3中)。底部条形图说明如通过α筛选测定法测量的SOX18-RBPJ蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)的抑制。显示了在50μM(PBS对照、DMSO对照和Sm4的左条块)和5μM(Sm4-Sm44的右条块)处的结果。值得注意的是当化合物可获得时显示结果(N＝4，平均值±SD)。在α筛选测定中使用SOX18同二聚体和SOX18/RBPJ异二聚体形成作为读出来比较在5μM下测试的Sm4系列的PPI破坏。一些化合物优先破坏SOX18同二聚体的形成，而另一些化合物对SOX18异二聚体形成更具特异性，而另一些化合物则是同二聚体和异二聚体复合物的泛破坏因子。
图6：在SOX18-HMG与RBPJ之间的界面处对Sm4进行的计算机建模。对SOX18依赖性反式激活的体外抑制。A.、B.SOX18/Prox1DNA X射线晶体结构中Sm4的稳定结合势，将抑制剂置于蛋白质与DNA之间的“开放”口袋中。C.将SOX18/DNA结构对接到Notch转录复合物的结构中。D.用Sox18和含有与萤火虫萤光素酶基因合并的Vcam1启动子的载体瞬时转染的COS7细胞中的萤光素酶报告基因测定(Hosking等，2004)。在含有最大1％DMSO(v/v)的培养基中，用小分子以低于CC10(10％细胞毒性)的浓度处理细胞24小时。描述了对于Sm4和尼氟酸的结果。甲氯芬那酸和氟芬那酸在低于CC10的浓度下无活性。
图7：COX-1/2酶的抑制。SOX18抑制剂抑制COX-1和COX-2酶，包括甲氯芬那酸作为阳性对照。通过花生四烯酸转化产生的PGH2类前列腺素的量来测量COX酶的抑制。
图8：Sm14-44的NMR谱。
图9：SOX18相互作用组的定位和Sm4对相互作用的破坏。(A)结合染色质免疫沉淀-质谱(ChIP-MS)和放大的发光接近均相测定法(Amplified Luminescent ProximityHomogeneous Assay)(α筛选)法使SOX18依赖性蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)去卷积的实验策略的示意图。(B)对通过SOX18-cMyc ChIP-MS在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中鉴定的289种蛋白质的分子功能的GO-term分析。扣除在仅含Myc标签的转染细胞中发现的非特异性相互作用因子。具有核酸结合或蛋白结合能力(紫色)的蛋白质被考虑用于连续直接相互作用研究以增强鉴定直接相互作用因子的相似性。(C)左栏：如通过α筛选测试的关于ChIP-MS SOX18相关蛋白、内皮转录因子和阳性/阴性对照蛋白的选择的SOX18成对PPI的热图图示。右栏：如在100μM下测试的关于SOX18依赖性蛋白质-蛋白质相互作用的Sm4活性的热图图示。相互作用和破坏阈值在比例尺中用黑线表示。高于阈值的相互作用和破坏水平由‘+’区分，低于阈值由‘-’区分。加标签的蛋白质在蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)无细胞蛋白质表达系统中表达。(D)Sm4对SOX18 PPI破坏的代表性α筛选浓度-响应曲线。显示的数据是平均值±s.e.m.。
图10：SOX18 PPI的QC和Sm4的作用。(A)在HUVEC中利用抗-cMyc抗体从cMyc-SOX18的免疫沉淀鉴定的具有序列KAPILIATDVASRG(Muscat离子评分为51.6)的代表性带双电荷的DDX17肽的质谱波谱。(B)鉴定的选自ChIP-MS的SOX18肽和相互作用蛋白的覆盖率。(C)DDX17的氨基酸序列，其中鉴定的ChIP-MS肽以绿色表示。(D)蛋白质稀释优化的典型α筛选曲线，其显示SOX9-SOX9和SOX18-SOX18。峰(钩状效应)的存在表明相互作用并且代表连续结合研究的理想蛋白质浓度。蛋白质在蜥蜴利什曼原虫无细胞蛋白质表达系统中表达。(E)SOX18抑制剂Sm4的分子结构。(F)Sm4对SOX18 PPI破坏的α筛选浓度-响应曲线。显示的数据是平均值±s.e.m.。
图11：Sm4对SOXF PPI的差异破坏。左图显示了通过α筛选测量的SOXF、MEF2C和RBPJ与OCT4之间的蛋白质-蛋白质相互作用的矩阵。右图显示50μM Sm4对PPI的影响(蓝色＝无PPI/破坏，绿色/黄色＝低PPI/破坏，橙色/红色＝强PPI/完全破坏，灰色＝低于阈值的PPI，Sm4作用无法确定)。
图12：Sm4在体外选择性地影响SOX18转录输出。(A)全基因组TF ChIP-seq数据与来自转录组学数据的受Sm4影响的基因之间的相关性分析的示意图。研究了受Sm4影响的基因(紫色)的转录起始位点(TSS)周围的染色质的转录因子结合峰(灰色)，以计算给定转录因子的“从TSS到最近结合位点的距离”。这种与TSS的距离用作转录调节可能性的代表，因此使受Sm4影响的基因与转录因子之间存在关联(Cusanovich等，PLoS Genetics，2014；Verbist等，Drug Discov Today，2015)。包含在其中SOX18和SOX7以及可从Encode联盟获得的所有转录因子(GATA2、c-FOS、c-JUN、CTCF、EZH2、MAX和c-MYC)的ChIP-seq峰在HUVEC中进行的分析中。将一组随机基因作为如偶然发现的那样的对照分布进行分析。(B)受Sm4影响的基因被分组为下调(Sm4-下调)、未受影响(Sm4-未改变)和上调(Sm4-上调)。该图显示受Sm4影响的基因的TSS(紫色线，绝对倍数变化≥2)与SOX18以及对照转录因子SOX7和GATA2的结合位点的最接近基因组位置之间的距离的累积分布。将差异表达基因的TSS与给定转录因子的最接近结合事件的中值距离与从随机基因组(绿线)偶然预期的中值距离进行比较。Sm4下调的基因与SOX18峰显著更接近(粗体)，但不与SOX7或GATA2峰更接近。
图13：Sm4选择性的体外转录组范围分析。(A)从在HUVEC中进行的SOX18ChIP-seq峰(MEME软件)鉴定的最常见(top)基序。(B)已知的SOX18靶基因VCAM和PROX1的代表性ChIP-seq峰(箭头)的UCSC浏览器视图。(C)Sm4的转录组范围分析的条件。使用DEseq2在过表达SOX18的HUVEC中计算媒介物DMSO(SOX18oe)与接受25μM Sm4的细胞(Sm4)之间的差异表达(DE)。(D)一式四份RNA-seq样品的主成分分析。将来自相同条件(对照、SOX18oe、Sm4)的重复样品聚类在一起。(E)显示DESeq2与edgeR方法之间的比较的图，其标识SOX18oe与Sm4条件之间DE基因的显著性。具有DESeq2Log2倍数变化≥1或≤-1(虚线)的转录物被考虑用于进一步分析。(F)将受Sm4影响的基因(紫色)与给定转录因子的结合位点的最接近基因组位置之间的距离绘制为累积分布。从差异表达基因的TSS至转录因子结合事件的最近结合事件的中值距离表示为相对于偶然预期的中值距离的比率(随机基因，绿色)。
图14:c-JUN基序富集在SOX18结合位点中。(A)对SOX18ChIP-seq峰的HOMER基序分析揭示了c-JUN基序5'-TGAC/GTCA-3'的富集。(B)SOX18-c-JUN和SOX18-SOX18(阳性对照)的α筛选结合曲线，证明c-JUN具有在体外与SOX18直接相互作用的能力。蛋白质在蜥蜴利什曼原虫无细胞蛋白质表达系统中表达。
图15：Sm4在体外不干扰SOX9或SOX17活性。(A)SOX9同二聚体活性的基于细胞的报告基因测定。用Sox9和Col2a1:luc报告基因构建体转染COS-7细胞。Sox9过表达导致>8倍的Col2a1活化诱导。在高浓度的Sm4下未观察到变化。(B)SOX17活性的基于细胞的报告基因测定(Robinson等，2014)。用pTK-β-gal(pTK)或ECE1-TK-β-gal(ECE1)报告基因转染牛主动脉内皮细胞(BAEC)，测量SOX17(仅ECE1)的内源活性。在任何测试浓度下均未观察到变化。X轴上的数字是以μM表示的[Sm4]。
图16：Sm4在体内阻断SoxF转录活性。(A)携带tg(-6.5kdrl:eGFP)SoxF报告基因的60hpf斑马鱼幼体的横向明视野(顶部)和荧光(底部)图像。用DMSO(阴性对照)或1μM Sm4在晚期(20hpf)开始处理，或者针对sox7和sox18向幼体注射吗啉代(dMO sox7/18)。荧光强度如热图所示。比例尺200μm。(B)对处理的tg(-6.5kdrl:eGFP)幼体和sox7/18吗啉突变体(morphant)中的gfp转录物水平的qRT-PCR分析，显示该转基因的活性降低。(C)携带tg(Dll4in3:eGFP)SoxF/Notch报告基因的斑马鱼幼体的侧视图，所述报告基因具有Rbpj和SoxF转录因子的多个结合位点。从13hpf用针对rbpj的吗啉代注射幼体和/或用2μM Sm4处理幼体。(D)对tg(Dll4in3:eGFP)幼体中的gfp转录物的qRT-PCR分析，显示在Sm4处理的幼体中组合的SoxF/Notch活性的抑制。(E)从早期(16hpf)至72hpf用Sm4或DMSO对照处理的幼体中胚胎致死率的定量。(F)从16hpf用1.5μM Sm4处理的48hpf幼体的血管表型(动静脉分流)的外显率。(G)从16hpf用1.5μM Sm4处理的48hpf幼体的循环缺陷的外显率。(H)相对于DMSO对照(虚线)，在16hpf用1.5μM Sm4处理的幼体中48hpf时的内源性内皮转录物水平的qRT-PCR分析。显示的数据是平均值±s.e.m.。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图17：Sox9活性不受体内处理干扰。(A)处理时间线：在软骨形成过程中连续处理斑马鱼幼体4天。在整个实验过程中每天更新培养基以维持Sm4水平。(B)tg(col2a1:YFP)Sox9报告基因幼体标记软骨(Mitchell等，2013)。在Sm4存在的情况下YFP水平不受影响，并且未观察到软骨形成的变化。mc:麦克尔软骨，ch:角舌软骨，hs:咽弓舌颌骨(hyosymplectic)。(C)在整个软骨形成的一系列阶段中DMSO对照和Sm4处理的幼体中的yfp转录物水平的qRT-PCR。
图18：Sm4在体内干扰SoxF活性。(A)斑马鱼幼体中Sm4处理的时间线。SOXF报告基因研究的处理在20hpf开始，而对于表型研究，处理开始于在动静脉规范(arteriovenousspecification)的正确发育窗口之前开始，并在其期间起作用。(B)DMSO对照和Sm4处理的tg(fli1:eGFP,-6.5kdrl:mCherry)幼体的躯干区的侧视图和横切面。对照DMSO幼体形成明显分离的背主动脉(DA)和后主静脉(PCV)。在Sm4处理的幼体中，DA被紧缩和/或与PCV融合(箭头)。针对动脉标志物efnb2a的整体原位杂交显示48hpf时的Sm4处理的幼体中减少的表达和受损的DA形成(箭头)。对切片进行DAPI染色(呈蓝色)。比例尺明视野：0.5mm，荧光和原位25μm。(C)Sm4的浓度依赖性效应，显示72hpf时的主要表型(predominant phenotype):轻度(尾部弯曲)、中等(PCV的扩张)或严重(动静脉缺陷和/或循环缺陷)的定量。指示的时帧是指Sm4处理窗口和终点。(D)用Sm4(1.5μM)处理的幼体的心脏水肿频率的定量。(E)相对于DMSO对照(虚线)，Sm4处理的幼体中Sox18依赖性-6.5kdr1:mCherry和内源性内皮转录物水平的qRT-PCR分析，显示在24hpf时对动脉和静脉标志物的作用。将所有表达水平针对内皮标志物cdh5的表达进行标准化。显示的数据是平均值±s.e.m.。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图19：Sm4处理抑制转移和肿瘤血管形成。(A)乳腺癌转移的小鼠模型的时间线。在第0天接种4T1.2肿瘤，并在第12天切除。从第3天至第12天，每日一次口服施用Sm4(25mg/kg/日)、阿司匹林(25mg/kg/天)或媒介物对照(PBS)。进行独立实验以评估存活率和转移率。(B)在处理方案(第7天和第12天)期间Sm4的血浆浓度表明药物的良好全身性递送。(C)如通过原位杂交显示的SOX18在肿瘤脉管系统中的表达。比例尺100μm。(D)监测小鼠的存活率(每组n＝6-12只小鼠)。通过对数秩检验分析Sm4处理的小鼠相对于媒介物对照和阿司匹林的改善的存活率(p<0.001)。(E)在任何阶段没有发现肿瘤大小的显著差异。(F)在任何媒介物对照或Sm4处理的动物死于癌症负荷之前，在第28天定量肺表面上的转移性肿瘤结节。显示的数据是每组12-14只小鼠的平均值±s.e.m.。(G)调查整个肿瘤的300μm切片上的血管密度。明视野图像显示整体明视野图像显示肿瘤的整体形态(由虚线描画轮廓)和红细胞的存在，标记主要血管和出血区域(星号)。比例尺1mm。(H)内皮特异性标志物ERG和内皮粘蛋白(EMCN)的双重免疫荧光染色揭示了肿瘤内和周围区域的血管模式和穿透(penetrance)。左：整个肿瘤切片(比例尺1mm)，中间和右侧：加框区域的放大图(比例尺200μm)。(I)每种条件下n＝6个肿瘤的EMCN体积(血管密度)和ERG阳性细胞核(内皮细胞数)的定量。每个数据点代表每个肿瘤的3-4个代表性区域(图H中的加框区域)的平均值。显示了两种条件的平均值±s.e.m.。*p<0.05，**p<0.01。(J)与上图(D)类似，在施用媒介物或递增浓度的Sm4(即5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg和50mg/kg)后监测小鼠的存活率(每组n＝6-12只小鼠)。该实验确定Sm4改善的存活率是剂量依赖性的，并且该结果表明体内特异性的中靶接合(on-target engagement)。
图20：Sm4功效不是手术引起的炎症的结果。在第0天接种4T1.2肿瘤，并且在第12天进行手术，不切除肿瘤(n＝6)。(A)在PBS媒介物对照小鼠和Sm4处理的小鼠(25mg/kg/天)中监测存活率(n＝6)。没有观察到差异(对数秩检验)。(C)在假手术之前或之后在任何阶段未发现肿瘤大小的显著差异。
图21：Sm4损害血管穿透进入4T1.2肿瘤。对于用PBS媒介物或Sm4处理的小鼠，来自整个4T1.2乳腺肿瘤的连续振动切片(300μm)的明视野图像。主要血管和出血区域以红色区别。
图22：Sm4处理的小鼠具有降低的肿瘤血管密度。肿瘤切片上ERG和内皮粘蛋白(EMCN)的免疫荧光染色。显示了媒介物PBS和Sm4的两个代表性区域。详细的放大图显示ERG的不同核染色和EMCN的膜内皮染色。在Imaris中对具有相同XYZ维度的图像进行内皮细胞数量和血管体积的定量。选择阈值以准确捕获总EMCN+脉管系统和总ERG+细胞核(ERG计数和黄色的EMCN体积)。
图23：Sm4处理破坏肿瘤诱导的淋巴管生成。对于用PBS媒介物或Sm4(25mg/kg天)处理的小鼠，来自整个4T1.2乳腺肿瘤的连续振动切片(200μm)的淋巴管图像。淋巴管特异性标志物PROX1和平足蛋白(PDPN)以及血管EC标志物内皮粘蛋白(EMCN)的免疫荧光揭示了肿瘤内和周围区域的血管模式和穿透。对照组(上图)和Sm4处理组(下图)的整个肿瘤切片。每种条件下n≥6个肿瘤的PDPN+淋巴管区域(密度，上图)和PROX1+细胞核(淋巴管内皮细胞数，下图)的定量。比例尺左：0.5mm，右：0.1mm。显示了两种条件的平均值±s.e.m.。**p<0.01，***p<0.001.
图24：(A)单分子跟踪(SMT)实验的原理。SMT允许在活细胞中对转录因子诸如SOX18的染色质结合动力学进行实时成像。SMT确定SOX18蛋白的搜索模式，同时其扫描基因组以与其靶基因的特异性反应元件结合。(B)图B描述了实验工作流程，其涉及分子轨迹的二维跟踪和使用MATLAB的分析。SOX18分子与DNA(固定的)结合或不结合并在细胞核中自由扩散。在固定级分内，可以基于在染色质上的停留时间定义2个群体(特异性结合或非特异性结合)。(C)上图；Sm4以浓度依赖性方式以牺牲非特异性结合级分为代价增加SOX18特异性结合的级分。下图；Sm4增加特异性结合的SOX18级分的停留时间，同时减少非特异性结合的级分的停留时间。(D):上图；Sm4选择性地接合有助于其部分拯救的SOX18显性负性突变体Raop“Ragged Opossum”突变体，相反，其以浓度依赖性方式受益于非特异性结合级分而减少Raop特异性结合级分。下图；Sm4对特异性和非特异性结合的Raop级分的停留时间与对SOX18级分具有相同作用，但作用更明显。
详述
定义
在本专利说明书中，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”或类似术语旨在表示非排他性包含，使得包含元素列表的方法或组合物不仅仅包括这些元素，而且可能还包括未列出的其他元素。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
如本文中所用，术语“烷基”是指含有例如1至约8个碳原子，优选1至约7个碳原子，更优选1至约6个碳原子，甚至更优选1至约4个碳原子的直链或支链烷基取代基。此类取代基的实例可选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、己基、庚基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2-乙基丁基、3-乙基丁基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等。所提及的碳的数目涉及碳主链和碳分支化，但不包括属于任何取代基的碳原子，例如从主碳链分支的烷基或烷氧基取代基的碳原子。
术语“烯基”是指任选取代的不饱和直链或支链烃基，其具有2-8个碳原子，优选2-7个碳原子，更优选2-6个碳原子或2-4个碳原子并且具有至少一个碳-碳双键。适当时，烯基可具有指定数目的碳原子，例如，C2-C6烯基，其包括具有呈线性或分支排列的2、3、4、5或6个碳原子的烯基。所提及的碳数数目涉及碳主链和碳分支化，但不包括属于任何取代基的碳原子。此类取代基的实例可选自乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、仲丁烯基和叔丁烯基、戊烯基、己烯基、庚-1,3-二烯、己-1,3-二烯、壬-1,3,5-三烯等。
如本文中所用，术语“烷氧基烷基”意指通过氧原子连接的直链或支链烷基(即，烷基-O-烷基，另外也称为“醚”基)，其中烷基是如上所述的。在特定实施方案中，烷氧基烷基是指包含1-8个碳原子的氧连接基团(“C1-8烷氧基烷基”)。在另外的实施方案中，烷氧基烷基是指包含2至8个碳原子(“C2-8烷氧基烷基”)、2至6个碳原子(“C2-6烷氧基烷基”)、2至4个碳原子(“C2-4”烷氧基烷基“)或2至3个碳原子(“C2-3烷氧基烷基”)的氧连接的基团。所述碳原子数目是指整个烷氧基烷基/醚链中的那些碳原子。
如本文中所用，术语“任选取代的”是指可以从相关基团扩展的取代基，诸如苯基或萘基，并且可以包括诸如包括F、Cl和Br的卤代基团的此类官能团；C1-C4烷基；OR12，其中R12是C1-4烷基；以及NR13R14，其中R13和R14独立选自H和C1-C4烷基。
根据本发明的第一方面，提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药：
其中，
R1选自OH和OR6，其中R6为C1–C4烷基；
R2选自H、COOR7和C(O)NR8R9，其中R7、R8和R9独立选自H和C1–C4烷基；
R3为L-A，其中L为选自C2–C8烷基、C2–C8烯基和C2–C8烷氧基烷基的接头，A选自任选取代的苯基和任选取代的萘基；
R4选自H、OR10、卤代和C1–C4烷基，其中R10选自H和C1–C4烷基；以及
R5选自H、OR11、卤代和C1–C4烷基，其中R11选自H和C1–C4烷基，
其中，化合物用于抑制SOX18活性。
在实施方案中，R1选自OH和OMe。
合适地，R2选自H、COOH、COOMe和
优选地，R2选自COOH和
在实施方案中，R4选自H、OH、OMe、Cl和Me。
合适地，R5选自H、OH和OMe。
在某些实施方案中，R4和R5为H。
在实施方案中，L是选自C2–C6烷基、C2–C6烯基和C2–C6烷氧基烷基的接头。
在任何所述实施方案中，R3选自：
其中，虚线表示从相邻原子至式I的环的连接，所示结构包括其E/Z异构体。
在一个实施方案中，第一方面的化合物选自：
在一个优选实施方案中，本方面的化合物选自：
本领域技术人员应理解，SOX18是SOX(SRY相关HMG-盒)转录因子家族的成员。这些转录因子通常参与胚胎发育的调控和细胞命运的确定。特别地，SOX18蛋白在与其他蛋白质形成蛋白质复合物后可以起转录调节剂起作用。已经表明SOX18在毛发、血管和淋巴管发育中起作用。SASH1的其他名称可包括SRY-盒18、HLTS和HLTRS。参照SOX18基因的核苷酸序列或其编码的蛋白质的登录号的非限制性实例，如本领域所熟知的，在人中包括NG_008095.1、NM_018419.2和NP_060889.1。除非另有说明，否则如本文通常使用的，“SOX18”可以指SOX18核酸或编码的蛋白质。
合适地，被调节的SOX18活性是淋巴管生成(即，新的淋巴管从现有淋巴管的生长)、血管发生(即，胚胎循环系统的从头形成)和/或血管生成(即，血管从现有脉管系统的生长)的活性。为此，在第一方面的实施方案中，一种或多种式(I)的化合物可用于治疗、减少或预防淋巴管生成、血管生成和/或血管发生。
因此，一种或多种式(I)的化合物适当地具有预防和/或减轻血管生成相关疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关疾病、病症或病况的症状严重性的作用。
在一个实施方案中，SOX18活性包括与DNA序列和/或蛋白质接触和/或结合。在这方面，第一方面的化合物可以对血管生成相关疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关疾病、病症或病况的一种或多种潜在细胞信号传导途径产生影响，包括但不限于抑制SOX18DNA结合和/或蛋白质-蛋白质相互作用。
关于DNA结合，应当理解，SOX18是能够与DNA结合的转录因子，诸如通过其HMG盒与共有序列5'-AACAAAG-3'结合，从而通过该结合反式激活转录。此外，SOX18蛋白可在与一种或多种蛋白质形成蛋白质复合物后起转录调节剂起作用。
如本文中所用，“基因”是作为基因组的结构遗传单元的核酸，其可包括一个或多个编码氨基酸的核苷酸序列和一个或多个非编码核苷酸序列(包括启动子和其他5'非翻译序列、内含子、多腺苷酸化序列和其他3'非翻译序列，但不限于此)。在大多数细胞生物中，基因是包含双链DNA的核酸。
如本文中所用，术语“核酸”表示单链或双链DNA和RNA。DNA包括基因组DNA和cDNA。RNA包括mRNA、RNA、RNAi、siRNA、cRNA和自催化RNA。核酸也可以是DNA-RNA杂交体。核酸包含通常包含含有A、G、C、T或U碱基的核苷酸的核苷酸序列。然而，核苷酸序列可包括其他碱基，诸如肌苷、甲基胞嘧啶、甲基肌苷、甲基腺苷和/或硫尿苷，但不限于此。
“蛋白质”是指氨基酸聚合物。如本领域技术人员所理解的，术语“蛋白质”在其范围内还包括蛋白质的磷酸化形式(即磷蛋白)和/或蛋白质的糖基化形式(即糖蛋白)。“肽”是具有不超过五十(50)个氨基酸的蛋白质。“多肽”是具有不超过五十(50)个氨基酸的蛋白质。
还提供了SOX18的蛋白质“变体”，诸如天然存在的(例如等位基因变体)及其直向同源物。优选地，蛋白质变体与本文公开的或本领域已知的SOX18的氨基酸序列共享至少70％或75％，优选至少80％或85％或更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
如本文中所用，术语“蛋白质-蛋白质相互作用”或“PPI”是指两种或更多种蛋白质之间的紧密且稳定的缔合。其通常涉及形成非共价化学键，诸如氢键。PPI可以是二元的(两个蛋白质结合配偶体；二聚体)或三元的(tertiary)(三个或更多个蛋白质结合配偶体，例如三聚体)。PPI内的蛋白质(即结合配偶体)可以是相同的蛋白质(例如同二聚体或同三聚体)或不同的蛋白质(例如异二聚体或杂三聚体)。优选地，蛋白质相互作用是可逆的，使得SOX18与蛋白质或蛋白质亚基的解离可以在合适的条件下发生。优选地，此类力很弱，例如，具有μM范围的Kd，使得本发明的化合物可以破坏SOX18与蛋白质之间的相互作用。
优选地，蛋白质选自SOX7、RBPJ、XRCC5、SOX18、ILF3、DDX17及其任意组合。
鉴于上述情况，第一方面的化合物的一个有利方面是：取决于核心苯环周围的基团的选择，它们展示的临床效果可以根据基团的选择而在某种程度上被定制用于通过SOX18抑制DNA结合和/或特定蛋白质-蛋白质相互作用。
在一些实施方案中，可提供具有一个或多个手性中心的化合物。虽然本发明化合物的外消旋混合物可以是活性的、选择性的和生物可利用的，但分离的异构体也可以是令人感兴趣的。
本发明的化合物还包括本文所述的化合物的立体异构体，并且在适用的情况下，包含一种以上的本发明的化合物的组合物可包括单独的或以任何比例混合的此类立体异构体，例如E/Z异构体。立体异构体可包括但不限于对映异构体、非对映异构体、外消旋混合物及其组合。此类立体异构体可以使用常规技术(通过使对映体起始原料反应，或者通过分离本发明的化合物和前药的异构体)来制备和分离。异构体可包括几何异构体。几何异构体的实例包括但不限于跨越双键的反式异构体或顺式异构体(E/Z)。在本发明的化合物中设想了其他异构体。异构体可以以纯的形式使用或与本文所述的化合物的其他异构体混合使用。
本领域已知用于制备光学活性形式和确定活性的各种方法。此类方法包括本文所述的标准测试和本领域熟知的其他类似测试。可用于获得根据本发明的化合物的光学异构体的方法的实例包括以下：
i)晶体的物理分离，通过该方法，手动分离各个对映体的宏观晶体的。当存在单独的对映体的晶体(即，该材料是外消旋堆集体)并且晶体在视觉上不同时，该技术可以是特别使用的；
ii)同时结晶，通过该方法，将各个对映体分别从外消旋溶液中结晶的，只有当后者是固态的外消旋堆集体时才可能；
iii)酶促拆分，通过该方法，可通过对映体与酶的不同反应速率部分或完全分离外消旋物；
iv)酶促不对称合成，一种其中至少一个合成步骤使用酶促反应来获得所需对映体的对映体纯的或富集的合成前体的技术；
v)化学不对称合成，通过该方法，在产物中产生不对称性(即手性)的条件下从非手性前体合成所需的对映体，这可以使用手性催化剂或手性助剂实现；
vi)非对映异构体分离，通过该方法，将外消旋化合物与对映体纯的试剂(手性助剂)反应，所述试剂将各个对映异构体转化为非对映异构体。然后根据它们现在具有更明显的结构差异通过色谱法或结晶分离所得的非对映异构体，随后除去手性助剂以得到所需的对映异构体；
vii)一级和二级不对称转化，通过该方法，将来自外消旋物的非对映异构体平衡以在非对映异构体溶液中产生来自所需对映异构体的优势，或者非对映异构体从所需对映异构体中的优先结晶扰乱平衡，使得最终原则上所有将材料从所需的对映体转化为结晶非对映异构体。然后从非对映异构体中释放出所需的对映异构体；
viii)动力学拆分，其包括通过对映体在动力学条件下与手性、非外消旋试剂或催化剂的不等反应速率，部分或完全拆分外消旋物(或进一步拆分部分拆分的化合物)；
ix)由非外消旋前体进行的对映特异性合成，通过该方法，从非手性起始原料获得所需的对映体，并且其中立体化学完整性在合成过程中不受损害是或仅受到最小程度的损害；
x)手性液相色谱法，通过该方法，外消旋物的对映体由于它们与固定相的不同相互作用而在液体流动相中分离。固定相可以由手性材料制成，或者流动相可包含另外的手性材料以引起不同的相互作用；
xi)手性气相色谱法，通过该方法，使外消旋物挥发，并且由于它们在气态流动相中与含有固定的非外消旋手性吸附剂相的柱的不同相互作用而分离对映体；
xii)用手性溶剂萃取，通过该方法，可通过优先将一种对映体溶解到特定的手性溶剂中来分离对映体；以及
xiii)跨手性膜转运，通过该方法，外消旋体与薄膜屏障接触。屏障通常分离两种可混溶的流体，一种含有外消旋物，并且驱动力诸如浓度或压差导致穿过膜屏障的优先传输。分离因膜的非外消旋手性性质仅允许外消旋物的一种对映体通过而发生。
第一方面的化合物可以任选地提供在富集对映异构体或非对映异构体的组合物中，诸如对映异构体或非对映异构体的混合物，其中一种对映异构体或非对映异构体过量存在，特别地达到95％或更多，96％或更多，97％或更多，98％或更多，或99％或更多(包括100％)的程度。
视情况，第一方面的化合物可本身使用或以药学上可接受的酯、酰胺、盐、溶剂化物、前药或异构体的形式使用。例如，化合物可以作为药学上可接受的盐提供。如果使用，药物化合物的盐应该是药理学上和药学上可接受的，但非药学上可接受的盐可以方便地用于制备游离活性化合物或其药学上可接受的盐，并且不排除在本发明的范围之外。此类药理学上和药学上可接受的盐可使用文献中详述的标准方法，通过药物与有机酸或无机酸的反应来制备。
根据本发明的有用的化合物的药学上可接受的盐的实例包括酸加成盐。然而，非药学上可接受的酸的盐可用于例如化合物的制备和纯化。根据本发明的合适的酸加成盐包括有机酸和无机酸。优选的盐包括由盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸和羟乙基磺酸形成的那些盐。其它有用的酸加成盐包括丙酸、乙醇酸、草酸、苹果酸、丙二酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、水杨酸等。药学上可接受的盐的特定实例包括但不限于硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、苯甲酸甲酯、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸酯、苯丙酸酯、丁酸苯酯、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐和扁桃酸盐。
通过用合适的碱处理，可以将酸加成盐再转化成游离碱。可以存在于根据本发明有用的化合物或前药上的酸部分的碱性盐的制备可以使用药学上可接受的碱(诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、三乙胺等)以类似的方式制备。
根据本发明的化合物的酯可以通过官能化可能存在于化合物中的羟基和/或羧基来制备。酰胺和前药还可使用本领域技术人员已知的技术制备。例如，酰胺可以使用合适的胺反应物由酯制备，或者它们可以通过与氨或低级烷基胺反应由酸酐或酰氯制备。此外，本发明的化合物的酯和酰胺可通过在0℃至60℃的温度下与羰基化试剂(例如甲酸乙酯、乙酸酐、甲氧基乙酰氯、苯甲酰氯、甲基异氰酸酯、氯甲酸乙酯、甲磺酰氯)和合适的碱(例如，4-二甲基氨基吡啶、吡啶、三乙胺、碳酸钾)在合适的有机溶剂(例如，四氢呋喃、丙酮、甲醇、吡啶、N,N-二甲基甲酰胺)中反应来产生。
药学上可接受的溶剂化物的实例包括但不限于根据本发明的化合物与水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸或乙醇胺的组合。
根据本发明的第二方面，提供了药物组合物，其包含第一方面的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，和药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
合适地，药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂可以是或包括稀释剂、溶剂、pH缓冲剂、粘合剂、填充剂、乳化剂、崩解剂、聚合物、润滑剂、油、脂肪、蜡、涂料、粘度改性剂、助流剂等中的一种或多种。
由于溶解度提高，本发明化合物的盐形式可以是特别有用的。
稀释剂可包括微晶纤维素、乳糖、甘露醇、磷酸钙、硫酸钙、高岭土、干淀粉、糖粉等中的一种或多种。粘合剂可包括聚维酮、淀粉、硬脂酸、树胶、羟丙基甲基纤维素等中的一种或多种。崩解剂可包括淀粉、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、羟基乙酸淀粉钠等中的一种或多种。溶剂可包括乙醇、甲醇、异丙醇、氯仿、丙酮、甲基乙基酮、二氯甲烷、水等中的一种或多种。润滑剂可包括硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸钙、硬脂酸、硬脂酰富马酸钠、氢化植物油、山嵛酸甘油酯等中的一种或多种。助流剂可以是胶体二氧化硅、滑石或玉米淀粉等中的一种或多种。缓冲剂可包括磷酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂和碳酸盐缓冲剂，但不限于此。填料可包括一种或多种凝胶(包括明胶)、淀粉和合成聚合物凝胶，但不限于此。涂料可包含成膜剂、溶剂、增塑剂等中的一种或多种。合适的成膜剂可以是羟丙基甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、聚维酮、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇、丙烯酸酯等中的一种或多种。合适的溶剂可包括水、乙醇、甲醇、异丙醇、氯仿、丙酮、甲基乙基酮、二氯甲烷等中的一种或多种。增塑剂可以是丙二醇、蓖麻油、甘油、聚乙二醇、聚山梨醇酯等中的一种或多种。
参考The Handbook of Excipients第6版，编辑Rowe，Sheskey&Quinn(Pharmaceutical Press)，其提供了根据本发明可以是有用的赋形剂的非限制性实例。
应理解，药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂的选择将至少部分地取决于制剂的施用方式。仅举例来说，组合物可呈片剂、胶囊、扁囊剂、粉末、可注射液体、栓剂、缓释制剂、渗透泵制剂形式或对于施用是有效且安全的任何其它形式。
合适地，药物组合物用于治疗或预防如下所述的哺乳动物的疾病、病症或病况。优选地，药物组合物用于治疗或预防哺乳动物中的血管生成相关疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关疾病、病症或病况。
本发明的第三方面存在于治疗或预防受血管生成相关疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关疾病、病症或病况的方法，其包括施用有效量的第一方面的化合物或其药学上有效的盐、溶剂化物或前药或第二方面的药物组合物，从而治疗或预防血管生成和/或淋巴管生成相关的疾病、病症或病况的步骤。
本发明的第四方面提供了第一方面的化合物或其药学上有效的盐、溶剂化物或前药在制备用于治疗或预防疾病、病症或病况(诸如血管生成相关的疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关的疾病、病症或病况)的药物中的用途。
如本文通常使用的，术语“施用(administering)”或“施用(administration)”等描述了将化合物或组合物诸如通过特定途径或媒介物引入哺乳动物。施用途径可包括局部、肠胃外和肠内途径，包括口服、口腔、舌下、鼻、肛门、胃肠、皮下、肌肉内和皮内施用途径，但不限于此。
如本文中所用，“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)是指在血管生成相关疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关疾病、病症或病况开始发展后改善所述疾病、病症或病况的体征或症状的治疗性干预。关于血管生成相关疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关疾病、病症或病况，术语“改善”是指治疗的任何可观察的有益效果。治疗不必对受试者绝对有益。可使用普通技术人员已知的任何方法或标准来确定有益效果。
如本文中所用，“预防(preventing)”(或“预防(prevent)”或“预防(prevention)”)是指在血管生成相关疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关疾病、病症或病况的症状、方面或特征发作之前引发的，以便预防或减轻症状、方面或特征的作用(诸如施用治疗有效量的一种或多种本文所述的化合物)过程。应该理解，这种预防不必对受试者绝对有益。“预防性”治疗是出于降低发生血管生成相关疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关疾病、病症或病况的症状、方面或特征的风险的目的而向未表现出血管生成相关疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关疾病、病症或病况的体征或仅表现出早期体征的受试者施用的治疗。
如本文中所用，“有效量”是指足以预防所治疗的病况的症状发生或者使症状恶化停止或者治疗和缓解或至少减轻症状的严重性的相关化合物或组合物的量的施用。有效量将以本领域技术人员理解的方式随患者年龄、性别、体重等而变化。可通过常规试验确定合适的剂量或剂量方案。
如本文中所用，术语“受试者”或“个体”或“患者”可以指任何受试者，特别是脊椎动物受试者，甚至更特别是需要治疗的哺乳动物受试者。合适的脊椎动物包括但不限于灵长类动物、禽类、家畜动物(例如，绵羊、牛、马、驴、猪)、实验室试验动物(例如，兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、伴侣动物(例如，猫、狗)和圈养野生动物(例如，狐狸、鹿、澳洲野狗)。如本文中所述，优选的受试者是需要治疗血管生成相关疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关疾病、病症或病况的人。然而，应该理解，上述术语并不意味着必然存在症状。
如本文中所用，术语“血管生成相关疾病、病症或病况”表示与异常血管生长(包括过度血管生长)相关的任何病症。应理解，在某些疾病、病症或病况中，血管生成的控制会发生改变。许多此类疾病涉及病理性血管生成(即，不适当的、过度的或不期望的血管形成)，其支持疾病状态，并且在许多情况下，有助于与此类疾病相关的细胞和组织损伤。血管生成相关疾病、病症或病况(即，涉及病理性血管生成的那些)可以是多种多样的，并且可以包括例如各种类型的癌症、慢性炎性疾病和新血管形成疾病。慢性炎性疾病、病症或病况的实例包括但不限于炎性肠病，诸如克罗恩病和溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、狼疮、银屑病、动脉粥样硬化和糖尿病。
如本文中所用，术语“淋巴血管生成相关疾病、病症或病况”是指与异常淋巴管生长(包括过度淋巴管生长)相关的任何病症。淋巴管生成最终由生长因子、细胞因子和趋化因子的复杂网络控制，并且可在许多病理病况(包括但不限于癌症生长和转移、炎症和移植排斥)下发生(参见，例如，El-Chemaly,Ann N Y Acad Sci(2008)；Patel,SeminarsOphtalmol(2009)；El-Chemaly,Lymphatic Res Biol(2009)；Pepper,Clin Cancer Res(2001))。关于转移，癌细胞可通过淋巴管转移到淋巴结和远端器官，这通常代表癌细胞扩散到原发癌之外的第一步。
在第三和第四方面的一个实施方案中，血管生成相关疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关疾病、病症或病况是眼科疾病、病症或病况，特别是涉及新血管形成的那些，或者包括所述疾病、病症或病况。为此，血管生成和/或淋巴管生成可在眼科疾病、病症或病况诸如年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病、缺血性视网膜病、早产儿视网膜病、新生血管性青光眼、虹膜炎、角膜病、角膜新生血管形成、睫状体炎、镰状细胞视网膜病变、角膜损伤期间的血管反应和翼状胬肉的发展中起关键作用。随着这些眼科疾病、病症或病况进展，眼睛的血管不仅可过度增殖，而且新的血管也可变弱、渗漏并容易出血。为此，新的异常血管可能会出血并导致受试者随后失明。
在第三和第四方面的一个实施方案中，血管生成相关的疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关的疾病、病症或病况是癌症或包括癌症。为此，癌症的形成和转移通常涉及病理性血管生成。与健康组织类似，癌症需要新血管形成以提供营养物和氧气并去除细胞废物。因此，病理性血管生成对于癌症的生长和扩增是至关重要的。
如本文中通常所用，术语“癌症”、“肿瘤”、“恶性的”和“恶性”是指特征在于通常伴随有异常或不正常的分子表型的异常或不正常的细胞增殖、分化和/或迁移的疾病或病况，或指与疾病或病况相关的细胞或组织，所述分子表型包括一种或多种遗传突变或与肿瘤发生相关的其他遗传变化、肿瘤抑制基因表达或活性的丧失和/或异常或不正常的细胞表面标志物表达。
癌症可能包括任何侵袭性或潜在侵袭性癌症、肿瘤或其他恶性肿瘤，诸如在http://www.cancer.gov/cancertopics/alphalist的NCI癌症指数中列出的，包括所有主要癌症形式，诸如肉瘤、癌、淋巴瘤、白血病和胚细胞瘤，但不限于此。这些可包括乳腺癌，包括肺腺癌在内的肺癌，包括卵巢癌、宫颈癌、子宫癌和前列腺癌在内的生殖系统癌症、脑和神经系统癌症、头颈癌、包括结肠癌、结直肠癌和胃癌在内的胃肠道癌症、肝癌、肾癌、诸如黑素瘤和皮肤癌等的皮肤癌症、包括淋巴样癌和骨髓单核细胞癌在内的血细胞癌、诸如胰腺癌和垂体癌等的内分泌系统癌症、包括骨和软组织癌在内的肌肉骨骼癌、诸如血管瘤、血管肿和血管肉瘤等的血管癌或肿瘤，但不限于此。
在特定实施方案中，癌症选自前列腺癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肝瘤、肝细胞癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、血管肿瘤(诸如，血管瘤、血管肿、血管肉瘤)及其任意组合。
在一个特定实施方案中，第一方面的化合物或第二方面的药物组合物预防和/或抑制所述癌症的转移。
如本文中所用，“转移”或“转移性”是指将恶性癌细胞或肿瘤经由循环系统或淋巴系统或通过天然体腔，通常从肿瘤、癌症或瘤形成的原始病灶至身体中的远处部位，并随后在一个或多个新位置中发展一个或多个继发性肿瘤或其集落的迁移或转移。“转移灶”是指作为转移的结果而形成的继发性肿瘤或集落，并且包括微转移灶以及区域和远处转移灶。
应理解，病理性血管生成和淋巴管生成可在癌症转移中起重要作用。为此，原发性癌症中血管的形成不仅允许癌细胞进入血流并在整个身体内循环，而且还支持由已从原发性部位转移的癌细胞接种的转移性癌症的形成和生长。
在两个前述方面的另外的实施方案中，血管生成相关的疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关的疾病、病症或病况合适地是肾脏疾病、病症或病况或包括肾脏疾病、病症或病况。优选地，肾脏疾病、病症或病况选自慢性肾移植功能障碍、原发性肾纤维化病症、蛋白尿、糖尿病性肾病、肾炎和其任意组合。
在第三和第四方面的一个特定实施方案中，血管生成相关疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关疾病、病症或病况是动脉粥样硬化或包括动脉粥样硬化。为此，本领域技术人员应理解，动脉粥样硬化的病理变化可至少部分归因于慢性炎症和新生血管形成。此外，已证实了NF-κB依赖性致动脉粥样硬化炎症反应与SOX18调控之间的联系，表明SOX18可能在动脉粥样硬化的发展中起作用(Garcia-Ramirez等，2005)。Sox18也被证明在动脉粥样硬化斑块中过表达，因此可能是疾病病因的主要组成部分(Brown等，2014)。
在第三和第四方面的一个实施方案中，血管生成相关的疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关的疾病、病症或病况为毛发稀少症-淋巴水肿-毛细血管扩张综合征或包括所述疾病。在这方面，应当理解，毛发稀少症-淋巴水肿-毛细血管扩张综合征与SOX18基因的突变相关。
在第五方面，本发明提供了阻止或抑制受试者的癌症转移的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的第一方面的化合物或其药学上有效的盐、溶剂化物或前药或第二方面的药物组合物(从而抑制或阻止癌症转移)的步骤。
合适地，癌症是上文所述的癌症。
本发明的第六方面在于抑制、阻止或降低受试者中SOX18活性的方法，包括施用有效量的第一方面的化合物或其药学上有效的盐、溶剂化物或前药或第二方面的药物组合物，从而抑制、阻止或降低受试者中的SOX18活性的步骤。
合适地，SOX18活性包括与DNA序列和/或蛋白质接触和/或结合。优选地，蛋白质选自SOX7、RBPJ、XRCC5、SOX18、ILF3、DDX17及其任意组合。
在上述各个部分中提及的本发明的各种特征和实施方案在适当情况下加以必要修改用于其他部分。因此，在适当情况下，可将一个部分中指定的特征与的其他部分中指定的特征组合。
以下实验部分更详细地描述了本发明的某些化合物的表征及其功效。目的是说明本发明化合物的某些具体实施方案及其功效，而不以任何方式限制本发明。
实施例1
材料和方法
化合物制备
海洋提取物文库.将从澳大利亚和南极洲收集的海洋文库产生的正丁醇级分文库用于筛选。将活性级分分级分离成纯化合物，以与原始级分相同的方式重新测定。
处理在澳大利亚南部和南极洲收集的2688份海洋无脊椎动物和藻类样本文库，以生成适合高通量生物测定的提取物文库。将EtOH萃取物倾析，浓缩，并分配到n-BuOH和H2O相中，然后转移到深96孔板中，得到>10倍浓度的小分子，同时除去盐。在稀释10倍和100倍(2.5mg/mL和0.25mg/mL)后，使用n-BuOH级分(25mg/mL w/v的干燥残余物)用于筛选。将活性级分用己烷、CH2Cl2和MeOH研磨，并通过HPLC分级分离成纯化合物。以与级分相同的方式测定所有化合物。
从褐藻样品Caulocystis cephalornithos(CMB-01671)的原始含水EtOH提取物中纯化Sm1(6-十一烷基水杨酸)和Sm2(6-十三烷基水杨酸)。将褐藻样品Caulocystiscephalornithos(CMB-01671)的含水EtOH提取物真空(4.8g)浓缩并分配至n-BuOH(0.80g)和H2O(4.0g)可溶性物质中。将n-BuOH可溶性分配的等分试样(40mg)进行HPLC分级分离(Agilent Zorbax SB C18 5μm,250x 9.4mm柱，以4mL/分钟经10分钟从60％MeOH/H2O至100％MeOH进行梯度洗脱，然后经10分钟用100％MeOH洗脱，用等梯度的0.01％TFA改性剂洗脱)以得到6-十一烷基水杨酸(Sm1，5.9mg，RT 12.8min)和6-十三烷基水杨酸(Sm2，11mg，RT13.7min)。
Sm4-Sm14-聚焦文库.合成的类似物购自EndoTherm GmbH(Germany)和PrincetonBioMolecular Research(USA)，并通过HP-LC/MS分析纯度。
Sm15-Sm44 SAR文库。设计SAR文库以研究亲脂性尾部和水杨酸支架的可能取代基的作用。下面概述的六步合成从取代的苯甲酸开始，使用Wittig烯化反应引入脂质尾部。部分受保护的中间体也包括在SAR文库中。通过HPLC纯化所有化合物(纯度>90％，UV/ELSD/MS)。
i)SOCl2，回流，3h；Et2NH，CH2Cl2，0℃-RT，12h；ii)s-BuLi/TMEDA，-78℃，DMF；iii)AcOH/HCl；iv)NaH，THF，50℃，2h；v)BBr3，CH2Cl2；或48%aq HBr，回流5h：vi)Pd/C，H2 atm.，RT，lh
通用材料和方法.按原样使用试剂和无水溶剂(THF、二氯甲烷和乙腈)。使用通过UV检测的Merck硅胶60F-254，通过TLC监测反应进程。硅胶60(Merck40-63μm)用于柱色谱。除了具有荧光TLC板的UV光以外，还使用以下染色溶液：磷钼酸、茴香醛/EtOH。在氮气下进行需要无水条件的反应。收集NMR数据并在Varian Unity 400MHz或Bruker Avance 600MHz光谱仪上在298K下在d4-MeOH或CDCl3中校准。HPLC和常规质谱在Agilent Technologies1200系列仪器上获得，该仪器配有G1316A UV-Vis检测器、1200系列ELSD和6110四极杆ESI-MS。在Bruker MicroTOF质谱仪上进行高分辨率质谱(HRMS)。
制备N,N-二乙基苯甲酰胺的通用方法(4a-d)1.由各取代的苯甲酸制备取代的N,N-二乙基苯甲酰胺。将酸(5g,32.9mmol)与过量的亚硫酰氯(50mL)一起回流直至停止释放出氯化氢。减压除去过量的亚硫酰氯，并与甲苯(3×15mL)共蒸馏。将酰氯溶解在无水CH2Cl2(100mL)中并在0℃下滴加二乙胺(13.6mL,131.5mmol)，并在室温下搅拌过夜。将反应混合物用CH2Cl2(100mL)稀释，用水(50mL)、盐水溶液洗涤，并经无水MgSO4干燥。在旋转蒸发仪上除去有机层，得到粗化合物。通过快速柱色谱法纯化粗化合物，得到纯的二乙基苯甲酰胺。
定向邻位金属化反应的通用方法(5a-d)2.在-78℃下向TMEDA(0.55mL,3.7mmol)的无水THF(10mL)溶液中加入s-BuLi(2.6mL,3.7mmol,1.5M的环己烷溶液)并搅拌15分钟，然后加入1-甲氧基-N,N-二乙基苯甲酰胺(0.35g,1.7mmol)的THF(5mL)溶液。在相同温度下搅拌2小时后，缓慢加入无水DMF(0.52mL,6.8mmol)。将反应混合物逐渐升温至室温并搅拌30分钟。通过加入6N的HCl水溶液(10mL)淬灭反应，然后用乙酸乙酯(3x 15mL)萃取。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，并经MgSO4干燥。真空除去溶剂后，通过快速柱色谱法(正-己烷/乙酸乙酯，1/2)纯化残余物，得到产物。
裂解N,N-二乙基苯甲酰胺的通用方法(10a-d)3.将N,N-二乙基苯甲酰胺(1.3mmol)溶于冰AcOH(3mL)中，加入10％HCl水溶液(3mL)，将混合物回流12小时。冷却至室温后，减压除去乙酸，用H2O稀释，用EtOAc(30mL)萃取。将有机层用盐水洗涤，分离并经无水MgSO4干燥。减压除去溶剂，得到产物。
Wittig烯化反应的通用方法(12a-d)4.在0℃下向Wittig盐(1.0mmol)的THF(10mL)悬浮液中加入t-BuOK(2.0mmol)或NaH(2.0mmol)并搅拌30分钟。缓慢加入溶解在THF中的醛(0.8mmol)并在室温下搅拌过夜(在50℃下使用NaH进行反应，entry 2、4、5、6)。将反应用H2O淬灭并萃取到EtOAc(30mL)中。将有机层用盐水(20mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并真空浓缩，得到粗化合物。通过快速柱色谱法纯化粗化合物，得到纯的产物。
去甲基化的通用方法：方法A(使用BBr3)5.在-78℃下用BBr3(1.0M的CH2Cl2溶液，0.576mL，0.576mmol)处理化合物(74mg，0.192mmol)的CH2Cl2(70mL)溶液。将混合物在-78℃下搅拌2小时，然后用饱和NH4Cl水溶液(10mL)淬灭。将混合物温热至室温并用CH2Cl2(30mL)稀释。将有机层用盐水(10mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并真空浓缩。
去甲基化的通用方法：方法B(使用HBr)6.将化合物(100mg,0.192mmol)在48％的HBr水溶液(3.0mL)中的溶液加热至回流3小时。反应完成后，温热至室温并减压蒸发，得到粗残余物。将粗化合物用EtOAc(30mL)萃取并用H2O(20mL)洗涤。分离有机层，干燥(MgSO4)并浓缩，得到产物。
烯烃还原的通用方法(14a-d).向1:1的烯烃溶液(EtOAc:MeOH)中加入10％Pd/C(10mol％)并在H2气氛下在室温下搅拌2小时。反应完成后，通过硅藻土床过滤。将滤液减压除去溶剂，得到产物。
蛋白质制剂
小鼠SOX HMG片段.将小鼠SOX2(组B)、SOX11(组C)、SOX6(组D)、SOX9(组E)、SOX18(组F)和SOX15(组G)的HMG结构域从cDNA模板克隆(IMAGE cDNA克隆ID：Sox18:3967084；Sox9:5354229；Sox4:6822618)BP克隆到pDONRTM221pENTRY载体中，使用 LR技术(Ng等，2012)测序并重组至pETG20A或pHisMBP表达质粒中。将构建体转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)细胞(Luria-Bertani，100μg/ml氨苄青霉素)中。
全长小鼠SOX18.在Sf9细胞中重组表达N末端加标签的小鼠HIS-GST-SOX18，在GST树脂(GE Healthcare Life Sciences，Sweden)上纯化，并在Tris缓冲液(50mM Tris，500mMNaCl，10mM还原型谷胱甘肽，pH 8.0)中洗脱。PCR扩增小鼠Sox18的cDNA克隆并将其克隆到pOPIN-GST载体中，以产生N末端加标签的HIS-GST-SOX18。将经序列验证的构建体与flashBACULTRA(Oxford Expression Technologies,Oxford,United Kingdom)杆状病毒DNA共转染到草地贪夜蛾Sf9细胞上以获得重组表达的HIS-GST-SOX18。将Sf-900TM II无血清培养基中的前五高细胞(BTI-TN-5B1-4)以1.5×106个细胞/mL的细胞密度感染，感染复数(MOI)为5PFU/细胞，并在21℃孵育144小时，然后收获。将来自100mL表达培养物的细胞沉淀重悬于30mL磷酸盐裂解缓冲液(50mM磷酸钠，500mM氯化钠，1％Triton X-100，2mM氯化镁，一片cOmplete Protease Inhibitor Cocktail，pH 7.5)中并在冰上超声处理20秒。将细胞裂解物在4℃以17,000×g离心40分钟。将上清液与全能核酸酶(Benzonase Nuclease)(Merck Millipore)在室温下孵育1小时以进行DNA降解，然后与500μL GST树脂(GEHealthcare Life Sciences，Sweden)混合，并在室温下在旋转轮上孵育1小时。将样品以500×g离心1分钟以除去上清液中未结合的蛋白质。用50倍树脂体积(RV)洗涤缓冲液(50mM磷酸钠，500mM NaCl，pH7.5)进一步洗涤树脂，如上所述通过离心除去未结合的蛋白质。用3×1Rv洗脱缓冲液(50mM Tris，500mM NaCl，10mM还原型谷胱甘肽，pH 8.0)从树脂上洗脱结合的蛋白质，如上所述通过离心收集上清液。
使用荧光偏振(FP)的DNA结合竞争测定
利用小鼠全长SOX18或SOX-HMG片段在黑色384孔板中进行DNA结合竞争测定。使用荧光标记的Prox1-DNA元件进行所有实验。对照由游离标记的DNA(低FP毫极化指数，mP)、在蛋白质存在的情况下标记的DNA(阴性对照，高mP)以及在竞争过量的未标记的DNA存在的情况下的标记的DNA和蛋白质(阳性对照，低mP)组成。
使用30mM HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸)(pH 7.5，含100mM KCl，40mMNaCl，10mM NH4OAc，10mM胍，2mM MgCl2,0.5mM EDTA，0.01％Np-40)(用于小鼠全长SOX18)、Tris-NaCl(10mM Tris pH 8.0和100mM NaCl)(用于SOX-HMG片段)在黑色384孔板中以25μL进行DNA结合竞争测定。使用具有5'荧光素亚酰胺(FAM)标记(Sigma Proligo或InVitrogen)的40bp双链Prox1-DNA元件进行所有实验。在5nM标记的DNA存在的情况下，在200nM的小鼠全长SOX18和60nM的SOX-HMG片段下获得最佳结合水平。对照由游离标记的DNA(低FP毫极化指数，mP)、在蛋白质存在的情况下标记的DNA(阴性对照，高mP)以及在400倍竞争过量的未标记的DNA存在的情况下的标记的DNA和蛋白质(阳性对照，低mP)组成。取决于化合物，最终DMSO浓度范围为2％v/v至3.33％v/v。在混合蛋白质、DNA探针和化合物后，将板密封并在室温下在黑暗中快速摇动5分钟，在37℃下快速摇动10分钟，在室温下快速摇动30分钟，然后在Tecan M1000Pro(λexc＝485nm,λem＝525nm)上读取荧光偏振。所有实验以一式三份进行。
基于细胞的功能测定。
将猴肾成纤维细胞样细胞(COS-7)在含有FBS、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、非必需氨基酸和HEPES的DMEM(Life technologies,11995)中于37℃、5％CO2下培养。将细胞在96孔板中生长至80％汇合，并使用X-tremeGENE 9DNA转染试剂(Roche,06365787001)，用小鼠质粒pGL2Vcam 1启动子构建体(VC1889)和pSG5Sox18转染所述细胞(Hosking等，2004，Duong等，2014)。转染4-6小时后，将细胞与化合物在0.5％FBS培养基中再孵育24小时，然后进行裂解和萤光素酶测定(Perkin Elmer,6016711)。
无细胞表达和α筛选。
质粒制备和无细胞表达.用增强的GFP(GFP)、mCherry和cMyc(myc)标签对所有蛋白质进行遗传编码，并克隆到无细胞表达载体中(Gagoski等，2015，Sierecki等，2013)。如前所述制备具有翻译能力的蜥蜴利什曼原虫提取物(LTE)以共表达蛋白质对(Kovtun等，2011，Mureev等，2009)。
用增强的GFP(GFP)、mCherry和cMyc(myc)标签对蛋白质进行遗传编码，并克隆到无细胞表达Gateway destination载体中：N末端加GFP标签的(pCellFree_G03)、N末端加Cherry-cMyc标签的(pCellFree_G07)和C末端加Cherry-cMyc标签的(pCellFree_G08)(Gagoski等，2015)的载体。如前所述(Sierecki等，2013)，人RBPJ(BC020780)和MEF2C(BC026341)开放阅读框(ORF)来源于人ORFeome collection，1.1版和5.1版，以及HumanOrfeome collaboration OCAAcollection(Open Biosystems)，并在ARVEC facility，UQDiamantina Institute对其进行克隆。通过LR重组(Life Technologies,Australia)将entry克隆pDONOR223或pENTR201载体与表达质粒中的ccdB基因交换。合成了全长人SOX18基因，并使用Gateway PCR克隆实现至载体的转移。如前所述制备具有翻译能力的蜥蜴利什曼原虫提取物(LTE)(Kovtun等，2011，Mureev等，2009)。通过向LTE添加30nM的GFP模板质粒和60nM的Cherry模板质粒并在27℃下孵育3小时来共表达蛋白质对。
如前所述(Sierecki等，2014，Sierecki等，2013)进行α筛选。通过在LTE中表达蛋白质对并用稀释范围的缓冲液B中的测试化合物(0.3至300μM)或DMSO(0.7％DMSO终浓度)孵育1小时来进行破坏蛋白质-蛋白质相互作用(IC50)的测定。如下计算相互作用的百分比：(I_cpd/I_DMSO)x 100来自3个独立实验。
使用cMyc检测试剂盒和Proxiplate-384Plus板(PerkinElmer)，如前所述(Sierecki等，2014，Sierecki等，2013)进行α筛选。将共表达目标蛋白质的LTE裂解物在缓冲液A(25mM HEPES，50mM NaCl)中稀释。对于测定，将12.5μL(0.4μg)的缓冲液B(25mMHEPES,50mM NaCl,0.001％NP40,0.001％酪蛋白)中的抗cMyc包被的受体珠等分到每个孔中。然后加入2μL不同浓度的稀释样品和2μL的缓冲液A中的生物素标记的GFP-Nanotrap。将板在室温下孵育45分钟，然后加入2μL(0.4μg)的在缓冲液A中稀释的链霉抗生物素蛋白包被的供体珠稀释，并在室温下在黑暗中孵育45分钟。使用制造商推荐的设置(λexc＝680/30nm，持续0.18s，在37ms后λem＝570/100nm)在Envision板读数器(PerkinElmer)上测量α筛选信号。所得钟形曲线表示阳性相互作用，而扁平线表示蛋白质之间缺乏相互作用。以一式在份重复每个蛋白质对的测量。
根据该式计算结合指数：
I是最高信号水平(钩状效应曲线的顶部)，而Ineg是最低(背景)信号水平。将信号针对对于最强相互作用获得的Iref信号进行标准化。通过在LTE中表达蛋白质对并用稀释范围的浓度或单一浓度的缓冲液B中的测试化合物(0.3至300μM或50μM)或DMSO(0.7％DMSO终浓度)孵育1小时来进行破坏蛋白质-蛋白质相互作用(IC50)的测定。如下计算相互作用的百分比：使用3-参数非线性回归在GraphPad Prism 6.0版中拟合来自3个独立实验的数据。
免疫共沉淀(Co-IP)。
如前所述(Sierecki等，2014)进行免疫共沉淀。简言之，将SOX18-Cherry-cMyc与GFP-RBPJ、GFP-MEF2C或GFP构建体(作为阴性对照诱饵)在蜥蜴利什曼原虫无细胞蛋白表达系统中共表达。将NaCl加入到表达的蛋白质(200mM)中，并将样品与10μL GFP-nanotrap包被的珠粒(与MBP-GFP-Nanotrap偶联的NHS-活化的琼脂糖)在4℃下孵育30分钟，同时通过旋转轻轻混合。随后，用200μL洗涤缓冲液(含有0.1％Triton X-100和200mM NaCl的PBS)洗涤珠粒6次。通过在15μL 2x NuPAGE LDS上样缓冲液中于72℃加热3分钟从珠粒释放蛋白质，并在NuPage Novex 4-12％凝胶(Life Technologies,Australia)上进行分离。使用ChemiDoc MP系统(Bio-Rad,Australia)扫描凝胶的GFP和Cherry荧光。
临界胶束浓度(CMC)。
基于将荧光1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)至胶束中的掺入来测定临界胶束浓度(Chattopadhyay和London，1984)。将小分子和阳性对照(中性去垢剂Triton X100和阴离子去垢剂SDS)在低结合96孔板中从1000μM至0.1μM级联稀释。在200mM NaCl或FP缓冲液中进行稀释。将DPH以5μM补充到黑色384孔板中。在室温下孵育30分钟后测量荧光强度(λexc＝360nm，λem＝430nm)，以图形方式估计CMC转变。
细胞毒性测定。
如前所述(McMillian等，2002)，使用Alamar蓝测定细胞毒性。将COS-7细胞以每孔7000个细胞于具有10％FBS的DMEM培养基(Life Technologies Australia)中接种到黑壁透明底96孔板中。将来自ATCC的HepG2和HEK293细胞系以每孔5000个细胞在黑壁透明底384孔细胞培养板中接种在含有1％FBS的DMEM中。将细胞在37℃、5％CO2下培养24小时。加入化合物的连续稀释物，最终将DMSO浓度调节至0.5％v/v。将细胞再孵育24小时。将1％TritonX-100用作阴性对照，将0.5％DMSO用作阳性对照。向每个孔中加入5μM Alamar蓝，并在37℃孵育2小时后测量荧光(λexc＝560nm,λem＝590nm)。使用Prism软件分析数据。
使用表面等离子共振(SPR)进行直接DNA结合测定。
在HBS-EP缓冲液(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.005％v/v聚山梨醇酯20，pH 7.4)中的1％v/v的DMSO下测试化合物。将补充有1％v/v的DMSO的相同缓冲液用作流动相。DNA小沟结合剂DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)、DNA嵌入剂和小沟结合剂放线菌素D和DNA嵌入剂溴化乙锭用作阳性对照。使用购自Geneworks的单链反向平行DNA探针的标准退火程序(在100℃下5分钟，室温过夜并-20℃下储存)制备生物素化的(每个探针一个标签)双链DNA探针，并按照制造商的推荐将其固定在CM5-SA链霉抗生物素蛋白芯片上。对于化合物和放线菌素D，将运行缓冲液流动设定为25μL/分钟，循环由4分钟缔合，4分钟解离，然后用10秒的10mM Gly-HCl pH 2.5的脉冲进行再生，以及1分钟稳定化组成。DAPI不需要任何再生，而对于溴化乙锭，在稳定化之前需要40秒的25μL/分钟的0.5％v/v的SDS的脉冲进行再生。所有样品和对照循环以一式三份进行。根据制造商的推荐进行DMSO校准。每次注射后，用50％v/v的DMSO进行额外的流动系统洗涤以避免残留。实验在Biacore T200(GEHealthcare，USA)上进行，将一个流动池保留作为参考。
直接蛋白结合测定(热聚集)。
在存在和不存在Prox1-DNA或推定的小分子配体的情况下，使用小鼠SOX18-HMG(109aa)在Harbinger Biotech StarGazer上进行差异静态光散射研究。进行初始实验以评估聚集温度的变化不再依赖于浓度的化合物浓度。使用的终浓度范围为500μM(Sm4和Sm14)至1.5mM(Sm5)，这取决于将DMSO浓度限制为3％的必要性。以10μM的终浓度使用17bpProx1-DNA寡核苷酸。在存在配体的情况下以一式三份进行结合，并通过>2℃的Tagg(聚集温度)的增加检测结合。在一个单一运行中用相同的蛋白质批次测量Tagg。在含有3％v/v的DMSO的Tris-NaCl缓冲液(10mM Tris-HCL，150mM NaCl，pH 8)中进行，最终反应体积为45μl，小鼠SOX18-HMG浓度为154μM。在测量之前将这些试剂在室温下孵育1小时。将蛋白质以每分钟1℃的速率从25℃加热至80℃。将每个样品的总强度相对于温度作图，并通过非线性回归与Boltzmann方程拟合。
计算机模拟对接和分子动力学
配体-蛋白质对接.使用LeadIT/FlexX(BioSolveIT,Germany)进行Sm4至SOX18/DNA复合物的计算机模拟对接。通过从SOX18-HMG/Prox1-DNA(pdb:4Y60)的结构中去除所有水分子并将整个蛋白质/复合物定义为可能的结合位点来进行对接。分析了Sm4的最佳20个对接姿势并将其分组为4个簇。由于SOX18/DNA不包含经典的结合口袋，所以通过200ns长的MD模拟进一步验证每个姿势簇。MD模拟使用完整的SOX18/DNA结构来进行，其中Sm4具有不同的结合姿势。对MD模拟的分析显示所述姿势中的三种为不稳定的，其中Sm4在模拟的前3至14ns内破坏其与蛋白质的相互作用，保留在水溶剂中用于剩余的模拟。仅对于其中一个姿势中，MD模拟在整个200ns模拟期间为Sm4产生稳定的结合姿势。类似地，用不含DNA的Sm4和SOX18进行对接和MD模拟。然而，在MD模拟期间，4-姿势簇中均未产生稳定的结合取向。为了比较，在Sm4不存在的情况下，对SOX18/DNA和不含DNA的SOX18进行MD模拟，产生与具有Sm4配体的结构相似的构象和动态行为。
蛋白质-蛋白质对接.使用ClusPro在线服务器版本(cluspro.bu.edu)，对于Notch1转录复合物和SOX18-HMG的结构分别使用pdb:3V79和pdb:4Y60进行Notch1转录复合物与SOX18之间的蛋白质-蛋白质对接。在对接之前移除DNA分子，因为ClusPro无法处理它们，并且在对接后恢复。弃除具有冲突DNA分子的对接溶液。所得顶部对接姿势在50ns长的MD模拟中用作起始构象以优化对接姿势，并验证多蛋白复合物的稳定性。
MD模拟.使用AMBER MD软件“pmemd”，利用ff99SB力场(蛋白质和DNA)、TIP3(用于隐含水)以及应用周期边界条件(NTP)、颗粒网筛埃瓦尔德(particle-mesh Ewald)(PME)方法(用于远距离静电相互作用)、各向同性压力耦合和Langevin恒温器(gamma_ln＝1/ps)(用于温度耦合)进行任何MD模拟。模拟以2fs步长运行，使用SHAKE算法约束涉及氢的键。对于使用Sm4的MD模拟，将来自AMBER包的前室用于计算配体的力场参数。通过最小化结构并通过在5ns内缓慢减少位置约束平衡它们来进行所有MD模拟。以一式三份进行每个模拟，对于初始速度的分配使用不同的随机数。
COX1/COX2酶促测定
使用来自Cayman Chemical Company的COX1和COX2抑制剂筛选测定试剂盒(Ref#701090和701080)测量COX抑制活性。在2％v/v终DMSO中以单一200μM浓度一式四份地测试所有化合物。将化合物与绵羊COX1或人COX2在37℃预孵育10分钟，然后与COX底物花生四烯酸再孵育3分钟。加入浓盐酸终止反应。制备前列腺素标准曲线，并按照制造商的描述进行酶免疫测定。包括DMSO对照、使用热灭活的COX酶的100％抑制对照以及200μM的甲氯芬那酸阳性对照(强效非选择性COX1/2抑制剂)以供参考。将类前列腺素标准值相对于对数浓度绘制为logit(B/B0)，并使用GraphPad Prism 6.0版利与线性回归拟合。使用标准曲线线性拟合来计算每个样品浓度。
SOX18单分子追踪
图24B描绘了实验工作流程，其涉及分子轨迹的二维跟踪和使用MATLAB的分析，如Chen等(Cell 156,1274-1285；2014)中所概述的。我们注意到，固定的DNA结合级分(％，以饼图显示)有两种类型(特异性的和非特异性的),这取决于在同一DNA位置中的停留时间；如果时间短(平均少于1秒)，则这被认为是非特异性结合(即，与随机DNA位点的瞬时结合)，如果长时间(平均多于5-6秒)，则这被认为是特异性结合(即，具有转录效应的与靶DNA位点的更长结合)。固定DNA结合级分的停留时间(以条形图显示)也有两种类型，特异性的和非特异性的：SOX18分子与DNA非特异性地(平均少于1秒)或特异性地(平均多于5-6秒)结合的时间长度(以秒为单位)。在用SOX18-Halotag报告基因构建体转染HeLa细胞后进行单分子追踪。该表达载体使我们能够在添加配体后检测单分子的SOX18蛋白，所述配体在通过Halotag系统酶加工后变得发荧光。使用ZEISS ELYRA超分辨率显微镜，利用改进版的TIRF显微镜术(HiLo)进行实时成像。
结果
抑制SOX18-DNA结合的天然产物的筛选。
使用基于荧光偏振的测定法(FP)筛选海洋提取物文库的SOX18蛋白(全长鼠)与DNA结合的抑制剂。我们选择了具有共有SOX基序的荧光标记的寡核苷酸，所述基序存在于Prox1基因的第一个内含子中，其为SOX18的直接靶标(Francois等，2008)(图1A)。该文库包括2,000种纯化代谢物，以及2,688份海洋提取物，含有超过50,000种结构。该初步筛选鉴定了从不同门收集的16种活性提取物，即海绵(10种)、藻类(5种)和被囊类动物(1种)(命中率0.6％，初步筛选Z'-因子＝0.62)(Zhang等，1999)。随后基于一种或多种生物活性分子的效力和丰度对提取物去卷积进行优先次序区分，其中最具活性的提取物来自褐藻Caulocystis cephalornithos，产生两种活性化合物：6-十一烷基水杨酸(Sm1)和6-十三烷基水杨酸(Sm2)(图1B)。Sm1和Sm2的剂量反应筛选导致高微摩尔范围内的抑制作用(IC50)(图1C)。两种活性化合物均含有具有大脂族基团的水杨酸支架。
聚焦文库的设计与初步筛选。
在下一步中，我们设计了一个小型类似物文库来验证水杨酸(羟基苯甲酸)活性支架，并研究其结构-活性关系谱。选择(如图2A所示)还包括具有类似间苯二酚支架(用另外的羟基取代羧酸)的化合物，以及许多批准的含有相似水杨酸或邻氨基苯甲酸支架(用胺取代羟基)的NSAID。购买文库，并使用FP测定筛选SOX18-DNA结合的抑制。在该测定中，高亲和力蛋白质-DNA相互作用的破坏需要高微摩尔范围内的抑制剂浓度，在该范围内可发生聚集，尤其是在两亲性和高logP分子的情况下(Irwin等，2015)。因此，复筛化合物的临界胶束浓度(CMC)，以消除作为假阳性的形成聚集体的化合物或形成胶束的化合物(表1，第2列和第5列，以及图2B)。
CMC测定法消除了五种化合物：Sm3、Sm6、Sm7、Sm9和Sm10，显示了20μM和30μM下的CMC(表1，第2列)。其余部分未显示高达1000μM的胶束形成，并且包括在SOX18-DNA结合测定中。由于化合物供应不足，无法测定Sm1和Sm2的CMC。SOX18-DNA结合测定鉴定了7种IC50值低于1000μM的化合物，其中2种Sm4和Sm14与原始命中Sm1和Sm2(IC50约为350μM)相比，显示约100μM的改善的IC50值(表1，第1列；图2C)。有趣的是，所有三种邻氨基苯甲酸类似物、甲氯芬那酸、尼氟酸和氟芬那酸也显示IC50值在100-400μM范围内的活性(表1，第1列；图2C)。
为了精确地找到小分子的可能结合位点，用较短的以DNA结合为中心的蛋白质片段重复FP测定。SOX TF的DNA结合结构域由79个氨基酸长的高速泳动族(HMG)盒组成。109个氨基酸长的SOX18片段(SOX18[109])对应于残基69-177(通过小鼠SOX18编号)，其包括HMG盒(残基78-149)和分别为9个和28个氨基酸的N末端侧翼序列和C末端侧翼序列。使用SOX18[109]片段的FP测定显示与全长SOX18几乎相同的IC50值(数据未显示)，表明小分子干扰该蛋白质的109aa的部分。
结合选择性。
从分子的角度来看，SOX18-DNA结合的抑制剂可以通过直接与DNA或蛋白质相互作用或者在蛋白质与DNA之间的界面处相互作用起作用。即使是针对其它TF所报道的，小分子直接与DNA结合(Leung等，2013)也具有非特异性DNA结合，导致可能的遗传毒性、致突变性或致癌性的潜能。出于该原因，我们开发了确定活性化合物是否与DNA或蛋白质直接相互作用的直接结合测定。基于表面等离子体共振的方法被开发来分析小分子与固定在链霉抗生物素蛋白芯片表面上的生物素化的双链DNA的结合。该方法测量结合速率(kon)常数、解离(koff)常数和结合常数(KD)，并用于测量与两种不同DNA序列的结合：SOX结合位点共有DNA和无规DNA。嵌入剂溴化乙锭和放线菌素D以及小沟结合剂4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)用作非选择性DNA结合的阳性对照。所有阳性对照均显示KD与DNA序列无关，与文献一致。该分析显示，SOX18抑制剂均未显示出对共有序列或无规DNA的任何结合(图3A和3B)。
为了研究抑制剂是否与蛋白质直接相互作用，我们通过评估向蛋白质解折叠平衡的较高温度的偏移来测量所实现的SOX18热稳定性的增加(Shrake和Ross，1992，Shrake和Ross，1990，Brandts和Lin，1990，Fukada等，1983)。为此，我们使用静态光散射作为蛋白质-抑制剂复合物聚集的读数(Mittal等，2014，Senisterra等，2006，Senisterra等，2008，Senisterra和Finerty，2009，Senisterra等，2012)。使用仅有HMG的SOX18[109]片段和用SOX基序修饰的DNA探针作为阳性对照测量热稳定性。在饱和所有SOX18潜在结合位点的浓度(对于Sm4和Sm14分别为500μM，对于Sm5为1.5mM)下测试Sm4、Sm5和Sm14。在这些最大配体结合条件下，温度依赖性蛋白质聚集不再受结合位点占据的限制，并且对其进行测量直至达到平台。每种抑制剂显示超过3℃的Tagg的增加，与抑制剂与蛋白质的直接相互作用一致(图3C)。将两种结合研究结合在一起，结果表明小分子抑制剂与SOX18蛋白相互作用，而不与DNA直接相互作用。此外，来自FP测定和热稳定性测定的组合数据表明抑制剂-蛋白质相互作用位点位于SOX18-HMG盒中或最接近SOX18-HMG盒。
SOX DNA结合抑制选择性。
所有SOX蛋白的DNA结合结构域是高度保守的，与哺乳动物睾丸决定因子SRY的HMG结构域共享46％的序列同一性(Bowles等，2000，Gubbay等，1990)，而在HMG结构域两侧的SOX TF的其余结构域显示出低水平的相似性。为了研究SOX18抑制剂的选择性，使用含有已知的SOX基序5'AACAAT3'的荧光标记的寡核苷酸，在基于DNA结合FP的测定中使用来自不同SOX蛋白的仅有HMG的蛋白片段。不同的SOX TF包括：SOX2(组B)、SOX11(组C)、SOX6(组D)、SOX9(组E)、SOX18(组F)和SOX15(组G)。针对所有不同的SOX TF评估最具活性的抑制剂Sm4，其在所有情况下显示出DNA结合抑制(IC50约为200-300μM)，略微偏好于SOX18和SOX15(约200至220μM的IC50对比对于其他抑制剂的270至310μM)，表明对于DNA结合破坏，抑制剂在SOX TF中是非选择性的(图3D)。
脱靶分析。
COX抑制.水杨酸盐是一类重要的NSAID，其通过直接或间接抑制促炎性前列腺素的环加氧酶(COX)依赖性产生起作用(Pillinger等，1998)。在本研究中，我们鉴定了与COX抑制剂具有结构相似性的SOX18抑制剂，并且为了研究NSAID与新型SOX18抑制剂之间的任何功能重叠，我们在SOX18研究中包括结构相似的NSAID。类似地，我们研究了新型SOX18抑制剂是否会抑制COX1/2酶促活性。使用商业COX-1/2ELISA测定法并使用甲氯芬那酸作为阳性对照来评估Sm4、Sm5、Sm8、Sm11、Sm12、Sm13和Sm14的COX-1和COX-2抑制作用。直至200μM的浓度，SOX18抑制剂均未显示任何COX-1或COX-2抑制活性(图S1A，S1B)。
脱靶特征谱分析.我们使用Eurofins-CEREP/Panlabs小组的针对参与广泛的潜在脱靶效应的各种受体、酶和转运蛋白(包括G蛋白偶联受体(GPCR)、离子通道、膜受体、激酶和非激酶以及核受体)的放射性配体结合测定进一步探究了我们的先导Sm4的潜在不依赖于SOX18的效应(表4)。还使用一系列重组酶荧光测定法测试了许多表观遗传修饰物。在10μM时未观察到显著抑制(>50％)，表明Sm4选择性和用于进一步药物开发的潜能。
SOX18蛋白质-蛋白质相互作用
据报道，SOX转录因子的高度保守的HMG结构域参与蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质相互作用(Agresti和Bianchi，2003，Prokop等，2012，Huang等，2015)。因此，直接与HMG结构域结合或最接近HMG结构域的化合物具有直接或通过SOX18蛋白构象的变构改变调节SOX18-DNA和SOX18-蛋白相互作用的潜力。为了研究我们的小分子调节SOX18-蛋白质相互作用的潜力，我们选择了两个已知参与内皮细胞转录调控的SOX18 PPI：MEF2C(据报道在GST-下拉试验中与SOX18结合(Hosking等，2001))以及RBPJ(据报道与SOX18在遗传上相互作用，而尚未鉴定直接结合(Sacilotto等，2013))。另外，选择作为非结合配偶体的XRCC6(ATP依赖性DNA解螺旋酶II)作为阴性对照。
我们使用无细胞表达系统表达标记的蛋白质来分析PPI抑制，并将其与α筛选技术(放大的发光接近均相测定法)组合，使我们能够测量标记的蛋白质的接近度(Sierecki等，2013)。该方法证实了SOX18与其已知配偶体MEF2C之间的直接成对相互作用，并揭示了SOX18和RBPJ之间的直接PPI(图4A，左图)。使用标准免疫共沉淀进一步验证了直接的物理相互作用(图4A，右图)。接下来，我们研究了我们最高效的小化合物Sm4以及甲氯芬那酸、尼氟酸和氟芬那酸破坏SOX18-MEF2C或SOX18-RBPJ相互作用的能力。Sm4以42.3μM的IC50破坏SOX18-RBPJ相互作用，但对SOX18-MEF2C相互作用没有影响(图4B，左上图和右上图)。相反，氟芬那酸破坏SOX18-MEF2C相互作用(IC50为29.1μM)，而仅微弱地破坏SOX18-RBPJ相互作用(IC50为约444μM)(图4B，左上图和右下图)。另一种NSAID对任何PPI几乎没有影响或没有影响。
SAR文库
已用单独的类似物文库更详细地研究了SOX18-DNA结合的水杨酸类型的抑制剂与SOX18/RBPJ PPI的结构-活性关系(SAR)。该文库被设计成探究一些Sm4和其他水杨酸盐独特特征的重要性，所述独特特征包括：水杨酸芳环的电子密度、β羟基羧酸基序的两个酸性氢的重要性、与亲脂性尾部的饱和键联或乙烯键联以及亲脂性尾部的结构和亲脂性。我们合成了30种类似物Sm15-Sm44(图5)，筛选其对DNA与仅有HMG的SOX18[109]片段的结合的抑制和对SOX18-RBPJ相互作用的破坏(上图和下图)。此外，还使用上述α筛选测定法测试了许多这些类似物(即Sm4、Sm17至Sm24、Sm26、Sm31、Sm34、Sm37和Sm40至Sm42)对SOX18-SOX18同二聚化相互作用的破坏。如图5所示，Sm4、Sm17至Sm23、Sm26、Sm31、Sm34、Sm37、Sm40和Sm41在浓度为5μM时对SOX18-SOX18同二聚化表现出一定的抑制活性。还筛选该文库的针对两种细胞系HEK293和HepG2的一般细胞毒性，以评估它们的开发潜力(表3)。
使用计算机模拟预测器“FAF-Drugs3”(http://fafdrugs3.mti.univ-paris-diderot.fr/)(Baell和Holloway,2010,Lagorce等，2008)分析了潜在的PAINS(泛测定干扰化合物)化学部分，所述化学部分常见于混杂的频繁命中者中，其在许多生化高通量筛选中用作假阳性。总共只有3种化合物被PAINS部分标记(Sm14、Sm40和Sm44)。Sm14含有亚甲基-噻唑酮基序或反应性α,β-不饱和羰基，而Sm40和Sm44均含有氧化不稳定的儿茶酚基团(表2)。虽然Sm40和Sm44在FP测定中没有活性，但是除了结合测定之外未对Sm14进行测定。另外，使用“Aggregator Advisor”数据库分析新文库的潜在聚集体，然而没有一个显示与已知聚集体的相似性，并且全都显示出中等亲脂性，logP值低于5.8(表3)。
用于SOX18-DNA结合抑制的SAR.活性数据显示SOX18-DNA结合抑制的一定清晰的SAR，其中通过β羟基或羧酸两者或任一者的任何醚化、酯化或酰胺化降低或消除活性。有趣的是，即使其降低了化合物的抑制活性，也可容忍用羟基取代羧酸。类似地，被小的给电子基团对位取代的水杨酸对显示类似的活性具有耐受性；然而，降低的酸度似乎增加细胞毒性。对于芳族尾部，用苯基取代萘基(Sm22)完全消除了所有活性。从该小的文库中，只有Sm20(一种Sm4的不饱和类似物)显示出与Sm4类似的SOX18-DNA结合抑制活性和低细胞毒性(图5)。
用于SOX18-RBPJ蛋白-蛋白结合抑制的SAR.首先在50μM下测试类似物。然后在较低的5μM下重新测试显示超过50％抑制的化合物。将活性在含有或不含铅化合物Sm4的媒介物溶剂存在的情况下现SOX18-RBPJ的对照水平进行比较，也在两种浓度下进行测试。如从图4B(右上图)中描绘的IC50图所预期的，Sm4在50μM下的抑制几乎完成(11.9±5.6％，图5，底部小图)并且在5μM下处于边缘。在50μM的高浓度下，所有测试化合物的一半显示出强活性，然而，仅Sm18、Sm19、Sm26、Sm34和Sm40在5μM下保持高活性，其中Sm26保持适度活性。有趣的是，这五种高效的PPi抑制剂中没有一种也抑制蛋白质-DNA结合。
抑制SOX18-RBPJ蛋白质-蛋白质相互作用的模式不如在SOX18-DNA相互作用的抑制中那样清楚。几种含有乙烯基萘的化合物具有PPI抑制活性；然而，不清楚活性是否是由于增加接头的刚性而导致的还是由于乙烯基-芳族基团作为迈克尔受体的反应性而导致的。该文库的一个独特特征是PPI活性不需要游离羧酸盐，因为二乙基酰胺或含聚羟基/甲氧基的化合物在50μM下显示PPI抑制，但不抑制DNA结合。最后，PPI与DNA结合抑制之间几乎没有重叠，Sm4和Sm20除外，它们抑制DNA和PPI两者。
结构调查
最近通过X射线晶体学(Klaus等，2016)解析了与含有SOX基序的DNA结合的小鼠SOX18-HMG结构域的三维结构，显示出与其他HMG结构域的高度相似性。然而，在Sm4存在的情况下共结晶与DNA结合的SOX18HMG结构域的尝试未能鉴定抑制剂的结合口袋，因为没有检测到抑制剂的电子密度。这可能归因于Sm4的蛋白质/DNA破坏特性。为了评估Sm4的可能结合位点，我们使用SOX18/DNA晶体结构进行计算机模拟对接和分子动力学计算。在SOX18-HMG结构域中没有确定的结合口袋的情况下，计算机模拟对接产生了几种可能的结合姿势，通过分子动力学(MD)模拟进一步验证所述结合姿势。这些模拟确定了一个在200ns的整个模拟时间内保持稳定的结合姿势。相比之下，在所有其他姿势中，抑制剂在3至14ns后破坏其蛋白质相互作用，保留在周围溶剂中而没有蛋白质接触。类似地，使用不含DNA的SOX18-HMG结构未发现稳定的Sm4结合姿势。
在SOX18/DNA结构中Sm4的稳定结合姿势将抑制剂置于蛋白质与DNA之间的溶剂可接近的口袋中，在X射线晶体结构中所述口袋原本被水分子占据。Sm4主要极性相互作用是利用Arg136和Lys147，其与dG15交换其相互作用，并且对His143具有一定的诱导的构象变化，使其侧链朝向Sm4旋转(图6A、B)。然而，没有观察到其他主要的构象变化，所述构象变化将直接解释Sm4的DNA结合抑制模式。
为了研究SOX18的可能的蛋白质-蛋白质相互作用位点，我们使用计算机模拟蛋白质-蛋白质对接，结合MD模拟，构建SOX18/DNA与其蛋白质配偶体RBPJ的复杂模型。对于RBPJ，我们使用于2012年(Choi等人，2012)阐明的人Notch转录复合物的一部分的X射线晶体结构。该部分包含锚蛋白(ANK)重复结构域、Notch细胞内结构域的RBPJ-J相关分子(RAM)结构域(与共激活因子MAML1结合的)，以及与其共有DNA结合的转录因子RBPJ。将SOX18/DNA结构对接到该Notch转录复合物的结构中，随后进行MD模拟以进行优化，得到如图6C所示的复杂模型。该模型表明RBPJ/SOX18复合物可以由HMG结构域介导，并且能够形成不受两种DNA分子干扰的蛋白质复合物。实际上，来自RBPJ和SOX18的两条DNA链几乎彼此平行取向，类似于核小体上的DNA取向。另外，HMG结构域的C和N末端尾部都朝向溶剂取向，允许添加缺失的SOX18结构域而不直接干扰RBPJ复合物。
SOX18与RBPJ之间的相互作用由螺旋3的C末端部分和来自HMG结构域的C末端尾部的残基(残基Gln138、Arg141、Asp142和His143)提供。因此，该蛋白质-蛋白质界面与该区域的DNA结合界面相对。将Sm4的假定结合位点定位到RBPJ/SOX18复合物上将抑制剂定位于螺旋-3和C末端尾部的SOX18 DNA结合区，与其主要蛋白质-蛋白质界面相对，表明Sm4的结合可能会扰乱蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用。
SOX18转录活性的调节
为了进一步评估SOX18抑制剂的功能效果，我们使用基于体外细胞的报告系统作为SOX18转录活性的读出。用含有与萤光素酶报告基因和SOX18表达载体融合的Vcam-1启动子片段的构建体转染COS-7细胞。将Sm4(我们在PPI破坏特异性方面的先导化合物)连同以及甲氯芬那、尼氟胺和氟芬那酸在该基于细胞的测定中进行测试。在这四种小分子中，Sm4显示出对SOX18转录活性的最有效抑制，其中IC50值为5.2μM(图6D)。在可观察到任何浓度依赖性SOX18抑制之前，达到了甲氯芬那酸和氟芬那酸的细胞毒性。所有其他测试化合物显示出较低的效力(20μM<IC50<50μM，表1，第3列)。
Sm4在与体外抑制其转录活性所需的浓度范围相似的浓度范围内选择性扰乱特定PPI的观察表明该小化合物的作用方式可能是通过干扰蛋白质配偶体募集。
使用单分子跟踪(SMT)评估SM4的SOX18靶接合.SMT技术使我们能够在活细胞的细胞核中实时显现SOX18蛋白在单分子分辨率下对其染色质上的靶基因的搜索模式。可以使SM 4对SOX18染色质结合动力学的扰动可视化的这一事实清楚地证明了SM4的中靶接合。在没有任何细胞毒性的浓度下观察到这种效应。SM4的作用导致SOX18在染色质上在特定位点处停留更长时间，蛋白质动力学的这种变化可能是由SM4损害的SOX18蛋白质-蛋白质相互作用的变化(如先前通过α筛选测定所示的)的结果。转录因子作用模式由蛋白质-蛋白质相互作用的代码驱动，该代码指示基因靶标选择性。如果此代码被改变，则转录因子活性无效。
讨论
转录因子是具有DNA结合结构域、多个蛋白质配偶体(在某些情况下甚至是内源配体)的蛋白质。TF的活性依赖于这种类型的相互作用的概念为发现调节其功能的分子开辟了不同的途径，诸如筛选蛋白质-DNA或蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂。尽管关于TF参与其中的遗传途径的信息很多，但关于它们的分子作用模式，特别是关于多种蛋白质配偶体的募集，很少有报道。因此，直到最近，DNA结合抑制剂的筛选提供了寻找TF调节剂的主要选择，即使DNA结合结构域在TF家族中高度保守并且构成具有低选择性潜力的区域。
在这项研究中，我们使用高通量DNA结合测定筛选化学上多样化的天然产物文库，鉴定能够抑制转录因子SOX18的DNA结合的化合物。筛选鉴定出两种具有相似结构的化合物，两者均具有水杨酸核心和亲脂性尾部。围绕两种活性化合物设计的聚焦文库鉴定了更广泛的具有不同程度的活性的类似化合物，证明这些化合物形成SOX18DNA结合抑制剂簇。通过聚焦文库，我们进一步证明了抑制活性是由小化合物与蛋白质的结合而不是与DNA本身的结合导致的。活性分子与SOX18蛋白相互作用，在结合时增加其热稳定性。此外，使用SOX18全长或仅有HMG盒的蛋白，我们证明了化合物直接与DNA结合域或其紧邻区域相互作用。
我们之前认为，使用DNA结合的破坏作为过滤器会产生因HMG盒的高水平序列保守性而在SOX转录因子之间具有低选择性的化合物。与此一致，当我们使用高浓度(200-300μM)时，我们的先导化合物Sm4能够破坏各种SOX蛋白的各种HMG盒的DNA结合活性。SOX蛋白的HMG盒由三个α-螺旋组成，其中两个提供DNA结合的主要界面。然而，据报道SOX9HMG盒也参与蛋白质-蛋白质相互作用(Huang等，2015，Agresti和Bianchi，2003，Prokop等，2012)，其中第三个α-螺旋被建议作为用于配偶体蛋白质的主要界面。在这项研究中，我们应用蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)检测的体外方法来研究TF蛋白质配偶体募集的破坏。转录因子SOX18的直接蛋白质-蛋白质相互作用仅在MEF2C中有报道(Hosking等，2001)，而与RBPJ的遗传相互作用仅示于Dll4基因的反式激活中(Sacilotto等，2013)。两种蛋白质在无细胞/α筛选和免疫共沉淀测定中显示与SOX18的直接结合。重要的是，一些小分子差异性地破坏特定的PPI。因此，具有水杨酸支架的Sm4在破坏SOX18/RBPJ复合物方面具有更高的选择性，而具有邻氨基苯甲酸支架的氟芬那酸对SOX18/MEF2C复合物具有更高的选择性。另外，计算机模拟对接为Sm4提供了推定的结合口袋，其靠近HMG盒的C末端尾部，楔入DNA与蛋白质的第三螺旋之间。该位置表明，像Sm4这样的抑制剂能够改变SOX18蛋白的构象，不仅影响DNA结合，还影响与蛋白质配偶体诸如RBPJ的相互作用表面。
进一步研究小化合物对SOX18转录活性的影响，揭示了当与萤光素酶报告基因融合时，Sm4能够阻断SOX18依赖性Vcam-1启动子活性。氟芬那酸对SOX18转录阻断仅显示很小的作用。该报告基因测定在用Sox18和萤光素酶表达载体转染的COS-7细胞中进行，因此限制了对SOX18内源性配偶体募集的潜在破坏的解释。然而，Sm4对SOX18调控的转录的抑制是小分子可干扰基于细胞的环境中的转录因子活性的明确指标。
扩展文库的合成和筛选进一步表明一些用于抑制SOX18/DNA结合的清楚的结构-活性关系。虽然在亲脂性尾部及其接头中可以耐受一定程度的变异，但羟基或羧酸基团必须保持其氢键供给能力，因为任何酯、醚或酰胺都会消除活性。用对位取代的给电子基团改变羧酸几乎没有作用，用羟基(间苯二酚支架)取代酸也是如此，两者保留了它们抑制SOX18DNA结合的能力。选择具有邻氨基苯甲酸支架的化合物作为水杨酸支架与NSAID化合物的化学相似性的延伸。虽然该研究表明，SOX18抑制剂对COX1或COX2没有抑制活性，但一些NSAID化合物显示出SOX18 DNA结合抑制作用。然而，SOX18-蛋白结合抑制(SOX18-MEF2C抑制而不是SOX18-RBPJ)的差异表明不同的结合或作用模式。
化合物抑制TF转录活性的功效取决于细胞核中TF和化合物两者的浓度。TF的浓度在细胞核中可达到几乎毫摩尔水平(Chen等，2014)，而化合物浓度取决于其分配通过细胞膜和细胞核的能力。对于初始药物发现，在均相测定中测量IC50提供更多信息(即，构建SAR模型)，其中定义了化合物浓度。然而，为了进一步的药物优化，还需要考虑化合物向细胞核中的渗透，使用预测模型或基于细胞的测定，测量化合物的有效抑制浓度(IC50)。
开发TF抑制剂时要考虑的另一个因素是哪种PPI主要受化合物影响。蛋白质-蛋白质相互作用(包括TF之间的相互作用)相对较弱。例如，p32与HDM2之间的相互作用具有低至中微摩尔范围的KD(Dawson等，2003，Chen等，2013)。相比之下，抗体-抗原相互作用或内源性肽配体与受体(例如EGF-EGFR)之间的相互作用要强得多，其中KD在低纳摩尔至高皮摩尔范围内(Mian等，1991，Lax等，1988)。类似地，蛋白质与DNA之间的相互作用处于低纳摩尔范围内，主要是由于带负电荷的DNA与通常带正电荷的DNA结合结构域之间的强静电相互作用而导致。Sm4能够抑制SOX18/DNA和SOX18/RBPJ相互作用，然而，对较弱的PPI的抑制作用更大。
开发TF抑制剂的一个重要考虑因素是选择性抑制PPI的能力，特别是因为TF能够募集六种不同的蛋白质配偶体(Gamper和Roeder，2008)。尽管TF本质上是无序的(Wright和Dyson，2015)，但这些蛋白质显示出不同的蛋白质-蛋白质界面的结构域模块性(Reichmann等，2005)。这意味着一些相互作用共享结构相似性，同时激活不同的下游途径。与其他调节蛋白和酶(诸如激酶)类似，需要考虑TF蛋白-蛋白抑制的选择性特征谱。尽管可能不希望阻断所有PPI，但是单一PPI抑制可能无法实现最大功效，但通过同时抑制所选蛋白质配偶体的亚组的募集可实现最大功效。
总之，这项研究将水杨酸衍生物鉴定为SOX18抑制的主要药效团，并且将Sm4鉴定为先导化合物。未来的药物优化应该遵循蛋白质-DNA结合和PPI测定的线索来进行，以进一步提高选择性和效力。
表1：聚焦文库化合物在体外抑制SOX18-DNA结合和SOX18依赖性反式激活的能力。
*：与已知聚集体类似
#：无已知聚集体，“高”LogP；可能的聚集体
关于上表1，在第一列中，使用可变Hill斜率曲线拟合来估计化合物FP IC50。在基于FP的DNA结合竞争测定中测试不同的浓度范围(0.2-200μM，10-500μM，10μM-3mM)，其中DMSO浓度范围为0至3.33％v/v。实验以三个独立的重复进行。第二列概括了化合物Sm1-14在盐水(200mM NaCl)或荧光极化缓冲液(30mM HEPES pH7.5，100mM KCl，40mM NaCl，10mMNH4OAc，10mM胍盐，2mM MgCl2，0.5mM EDTA，0.01％NP-40))中开始形成胶束时的阈值浓度。第三和第四列概括了基于细胞的萤光素酶SOX18依赖性反式激活的50％抑制浓度-IC50-以及COS7成纤维细胞中所有活性化合物的细胞毒性-CC50-。在最后一列中，我们使用“Aggregator Advisor”(Irwin等，2015)来基于已知聚集体的物理性质(CLog P>3)和与12,600种化合物-强文库的相似性预测聚集体(*：与已知聚集体类似的化合物，#：与任何已知聚集体不相似，但由于“高”LogP可能存在风险。：无聚集的预测风险。)。
表2——PAINS分析
就含有PAINS亚结构对化合物Sm1-Sm44的评估，列出发现的具有可能的混杂结合结构的三种化合物。
表3——DNA结合和细胞毒性
Sm15-Sm44抑制SOX18/DNA结合(FP)和对两种哺乳动物细胞系的细胞毒性的实验数据。还显示以cLogP表示的预测的亲脂性。
表4——Sm4的脱靶活性谱
使用来自Eurofins CEREP/Panlabs(France,USA,Taiwan)的Hit软件包表征Sm4在10uM时的脱靶活性谱。
表5——合成的化合物Sm15-Sm44的化学表征
化合物Sm15-Sm44的化学分析.通过HPLC(ESI-MS/UV/ELSD)测定化合物纯度，并通过HighRes MS(ESI microTOF-LC)测定其分子式。1H和13C NMR实验用于确认结构(参见附录A)。
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实施例2
转录因子SOX18的药理学靶向延迟了小鼠的乳腺癌
材料和方法
实验再现性
除非另有说明，否则本研究中的所有数据和统计分析均从至少三个独立实验生成。每个实验中都包括技术重复以降低背景噪声并检测技术异常。未将不同实验条件的样品暴露于任何特定的随机化方法，在非盲法条件下评估组。
用于无细胞表达的质粒制备。
此处使用的遗传编码的标签是增强型GFP(GFP)、mCherry(Cherry)和cMyc(myc)。将蛋白质分别克隆到以下无细胞表达Gateway目标载体中：N末端加GFP标签的(pCellFree_G03)、N末端加Cherry-cMyc标签的(pCellFree_G07)和C末端加Cherry-cMyc标签的(pCellFree_G08)载体(Gagoski等，2015)。对应于人SOX7(BC071947)、SOX17、RBPJ(BC020780)和MEF2C(BC026341)的开放阅读框架(ORF)来源于如前所述的人ORFeomecollection 1.1版和5.1版或人Human Orfeome collaboration OCAA collection(OpenBiosystems)，并在ARVEC facility，UQ Diamantina Institute克隆。通过LR重组(LifeTechnologies,Australia)将entry克隆pDONOR223或pENTR201载体与表达质粒中的ccdB基因交换。合成(IDT)了全长人SOX18基因，并使用Gateway PCR克隆实现至载体的转移。
无细胞蛋白质表达
如前所述(Mureev等，2009，Kovtun等，2011)制备具有翻译能力的蜥蜴利什曼原虫提取物(LTE)。通过向LTE添加30nM的GFP模板质粒和60nM的Cherry模板质粒并在27℃下孵育3小时来共表达蛋白质对。
α筛选测定
使用cMyc检测试剂盒和Proxiplate-384Plus板(PerkinElmer)，如前所述(Sierecki等，2014)进行α筛选测定。测量每个样品的连续稀释物。将共表达目标蛋白质的LTE裂解物在缓冲液A(25mM HEPES，50mM NaCl)中稀释。对于测定，将12.5μL(0.4μg)的缓冲液B(25mM HEPES，50mM NaCl，0.001％NP40,0.001％酪蛋白)中的抗-cMyc包被的受体珠等分至每个孔中。然后加入2μL稀释的样品和2μL的缓冲液A中的生物素标记的GFP-Nanotrap。将板室温下孵育45分钟。然后，加入2μL(0.4μg)的在缓冲液A中稀释的链霉抗生物素蛋白包被的供体珠，然后在室温下在黑暗中孵育45分钟。使用制造商的推荐的设置(激发：680/30nm，持续0.18s，发射：在37ms后570/100nm)在Envision Multilabel板读数器(PerkinElmer)上获得α筛选信号。所得钟形曲线表示阳性相互作用，而扁平线反映蛋白质之间缺乏相互作用。使用单独的平板将每个蛋白质对的测量重复至少三次。根据该式计算结合指数：BI＝[(I-I_neg)/(I_ref-I_neg)]x 100。
对于每一个实验，I是最高信号水平(钩状效应曲线的顶部)，而Ineg是最低(背景)信号水平。将信号针对对于SOX18与其自身相互作用获得的值Iref信号进行标准化。
对于PPI破坏测定，将LTE中表达的蛋白质对与单独的100μM Sm4或DMSO(0.7％DMSO终浓度)一起孵育1小时。还将100μM Sm4或DMSO加入到缓冲液B中。根据该式计算PPI：(1-I_Sm4/I_DMSO)x100。
对于IC50测定，测定相同但使用Sm4的稀释范围(0.3至300μM)。根据该式计算相互作用的百分比：I_Sm4/I_DMSO x 100。使用3参数非线性回归，在GraphPad Prism(RRID:SCR_007370)6.0版中拟合来自至少3次独立实验的数据。
细胞培养和转染
COS-7细胞购自ATCC(CRL-1651，RRID：CVCL_0224)，将其在37℃、5％CO2下于含有添加的FBS、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、非必需氨基酸和HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸)的DMEM(Life technologies,11995)中培养。将COS-7细胞转染4-6小时，并再孵育24小时，然后进行裂解和萤光素酶测定(Perkin Elmer,6016711)。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自Lonza Australia(CC-2519A)。将用于ChIP-MS、ChIP-seq和RNA-seq分析的HUVEC转染7小时并再孵育14小时。在小分子处理期间，将细胞在含有低血清(0.4％FBS)的培养基中生长。在37℃、5％CO2下于根据EGM-2bullet试剂盒说明书(Lonza,CC-3162)补充的EGM-2培养基中培养HUVEC。将细胞在35mm培养皿中生长至80-90％汇合，并按照制造商的说明使用X-tremegene 9DNA转染剂(Roche,06365787001)，利用质粒小鼠pSG5Sox18、质粒pSG5cMyc-Sox18或质粒cMyc转染所述细胞。所有细胞系经测试对于支原体污染呈阴性。
染色质免疫沉淀
如前所述(Schmidt等，2009)进行ChIP实验。使用抗cMyc(Cell Signaling,#2276,RRID:AB_2314825)对过表达加cMyc标签的SOX18的HUVEC进行免疫沉淀。
ChIP-seq和分析
IP后，使用TruSeq ChIPseq试剂盒(Illumina,IP-202-1012)，使用0.5μM通用反向PCR引物和含有选择的指标序列的正向PCR引物在50μL 1x NEBNext高保真PCR Master Mix(New England Biolabs,M0541)中进行DNA扩增。PCR循环次数的范围为13至18，这取决于ChIP效率。使用AMPure珠(1.8倍体积)纯化PCR产物，并在20μL重悬浮缓冲液(Tris-Acetate10mM pH 8)中洗脱。使用用于Illumina测序平台的KAPA文库定量试剂盒(KAPABiosystems，KK4824)定量文库，并按照制造商的方案在HiSeq2500上对50bp单端读数进行测序。使用bowtie将Illumina fastq文件映射到GRCh37/UCSC hg19基因组拼接(genomeassembly)，并使用MACS2.1.0版，使用输入调用峰。为了避免由于cMyc表位引起的假阳性峰调用，与SOX18-cMyc ChIP-seq并行地进行仅用cMyc表位的ChIP-seq，并且在这些实验条件下调用的峰被减至在SOX18-cMyc条件下调用的峰。基因组区域富集注释工具(GREAT，RRID：SCR_005807)用于分析顺式调控区的功能意义。Chip-seq数据可在ArrayExpress数据库(www.ebi.ac.uk/arrayexpress，RRID：SCR_002964)中以登录号E-MTAB-4480(SOX7)和E-MTAB-4481(SOX18)获得。
ChIP-MS(RIME)
如前所述(Mohammed等，2013)进行ChIP-MS实验。将SOX18-cMyc与阴性对照(仅cMyc)之间共同的肽进行分箱(bin)，并且仅在SOX18-cMyc转染的细胞中唯一检测到的肽被考虑用于分析。
RNA-seq和分析
使用TruSeq链式总RNA文库制备试剂盒(Illumina)处理一式四份样品以用于全转录组测序。使用STAR比对器(Dobin等，2013)将读数映射至hg19参考人类基因组，并且仅考虑独特对齐的读数。使用htseq_count(HTseq包)(Anders，Pyl和Huber 2015)将转录分配到基因，并使用DEseq2(Love，Huber和Anders 2014)计算差异表达。具有调整的p值<0.05的基因被认为是显著的。
在过表达SOX18的细胞中在Sm4处理与DMSO对照之间鉴定了差异表达的基因，并将其分离成上调和下调(DOWN)基因。它们的转录起始位点(TSS)的位置与转录因子结合事件的位置相关，所述转录因子结合事件的位置可以从ENCODE联盟(RRID：SCR_006793)和我们在本研究中进行的SOX18和SOX7ChIP-seq实验获得。为了确保TSS是独立的，只允许TSS分配到1个ChIP-seq峰。将具有≥2倍绝对倍数变化(log2FC≥1或≤-1)的转录物包括来用于进行TSS分析的距离。将TSS与结合事件之间的中位距离与一组随机选择的基因的预期距离进行比较以获得中值比。对照组基因选自HUVEC中表达的基因库，使得它们具有相似的表达水平分布。为了确保SOX18和任何其他分析的转录因子对基因的潜在共同调控没有引入偏倚，我们扣除了来自其他转录因子的分析的具有SOX18峰的基因。还进行了反向分析，扣除了来自SOX18的分析的含有c-JUN峰的基因。RNA-seq数据可在ArrayExpress数据库(www.ebi.ac.uk/arrayexpress)中以登录号E-MTAB-4511获得。
定量RT-PCR
使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen，74106)根据制造商方案提取总RNA，包括柱上DNA消化。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Life Technologies，4368813)从1μg纯化的RNA合成cDNA。使用SYBR green(Life Technologies，4312704)方法以至少3个生物重复的技术性一式三份进行靶cDNA的扩增和定量。使用ViiA 7实时PCR系统在384孔板中以10μL进行反应。管家基因(用于tg(Dll4in3:eGFP)的β-肌动蛋白、用于tg(-6.5kdrl:eGFP)的ef1α、用于tg(fli1a:eGFP,-6.5kdrl:mCherry)的chd5、用于HUVEC的RPL13和GAPDH)基于它们在整组实验条件下的表达稳定性来选择，或者基于它们的血管表达来选择以针对内皮细胞含量进行标准化。使用LinRegPCR计算引物效率，并使用ViiA7软件和Q基因PCR分析模板分析扩增数据。
斑马鱼水产养殖和分析
如先前所述(Hogan等，2009)维持斑马鱼，并且涉及动物的所有程序符合University of Queensland的动物伦理委员会的指导方针(IMB/030/16/NHMRC/ARC/HF)或经当地伦理审查批准并获得英国内政部许可(PPL 30/2783和PPL 30/3324)。先前(Sacilotto等，2013，Duong等，2014，Lawson和Weinstein 2002)描述了Tg(-6.5kdrl:eGFP)、tg(fli1a：eGFP，-6.5kdrl:mCherry)和tg(Dll4in3:GFP)。
通过分别用25μg/mL或5μg/mL链霉蛋白酶处理2小时或过夜来进行去绒毛。使用0.01％三卡因麻醉斑马鱼幼体。将代表性的幼体包埋在0.5％低熔点琼脂糖中并且用ZeissLSM 710共聚焦显微镜成像。
斑马鱼原位杂交和横截面分析
如前所述(Thisse和Thisse 2008)用针对dab(Song等，2004)和ephrinB2a(Durbin等，1998)的探针模板进行全标本包埋斑马鱼(28和48hpf)原位杂交。在添加70％甘油之前去除卵囊。对于横切片，将整个幼体包埋在4％琼脂糖中，使用Leica VT1000S振动切片机以150μm切片。在Olympus BX-51明视野显微镜(ISH)和Zeiss LSM 510共聚焦显微镜上进行成像。对于荧光图像，在包埋前对幼体进行DAPI染色。
小分子处理和吗啉代注射
在低浓度DMSO(≤1％v/v)存在的情况下进行使用推定的小分子抑制剂和相应的对照条件的所有处理，以获得可靠的均质溶液，并且由10mM DMSO原液制备所述低浓度DMSO。对于细胞培养，在转染后直接将小分子添加到新鲜培养基中，并将细胞在该培养基中生长直至收获细胞的时间点。对于涉及斑马鱼的体内实验，通过更换培养基在指定的时间点开始化合物处理，并且在实验期间每天更新培养基+化合物。必要时，与小分子平行进行PTU处理(0.003％)以阻止色素形成。将以前发表并验证的针对sox7、sox18(Herpers等，2008)和rbpj(Sacilotto等，2013)的吗啉代寡聚物以5ng注射到单细胞斑马鱼受精卵中以进行利用tg(6.5kdrl:eGFP)和tg(fli1a:eGFP,-6.5kdrl:mCherry)进行的实验，并且对于利用tg(Dll4in3:eGFP)进行的实验，利用0.125-0.15pmol的亚最佳浓度。
小鼠和小鼠模型
BALB/c野生型(WT)购自Walter和Eliza Hall Institute for Medical Research并且在6至10周龄之间使用。将小鼠4T1.2乳腺癌细胞在5％CO2培养箱中于含有10％FBS的完全RPMI中培养。如前所述(Mittal等，2014)，将5x 104个4T1.2肿瘤细胞接种到BALB/c WT小鼠的第四乳房脂肪垫中。简言之，在肿瘤植入后第3天，用25mg/kg的体重的Sm4、阿司匹林或媒介物PBS每天口服强饲小鼠，持续10天。用数字卡尺将肿瘤尺寸测量为两个垂直直径的乘积。在第7天和第12天从小鼠收集血浆，使用4000Qtrap LC-MS/MS系统质谱仪分析Sm4浓度。在第12天，将小鼠麻醉以手术切除原发性肿瘤，或将小鼠进行手术操作而不切除原发性肿瘤，并且伤口用手术夹闭合。将肿瘤收集在福尔马林中以用于组织学。在第28天收获肺并将其在Bouin溶液中固定24小时，在解剖显微镜下计数转移性肿瘤结节。在未收获肺的实验中监测小鼠的存活率。将每实验6至14只小鼠的组用于实验肿瘤测定，以确保检测生物学差异的足够能力。所有实验均得到QIMR Berghofer医学研究所动物伦理委员会(P1505)的批准。
为了定量肿瘤中的脉管系统，将固定的组织包埋在4％琼脂糖中，并在LeicaVT1000S振动切片机上以300μm贯穿切片。在载玻片上收集切片并成像用于对灌注血管的穿透进行明视野分析。随后，使用抗小鼠内皮粘蛋白(目录号sc-53941,RRID:AB_2100038)、ERG(目录号ab92513,RRID:AB_2630401)、PROX1(AngioBio目录号11-002,RRID:AB_10013720)和平足蛋白(AngioBio目录号11-033,AB_2631191)抗体对切片进行免疫荧光染色。通过在Zeiss LSM 710共聚焦显微镜上使用10倍物镜沿z轴获取一系列图像来对全肿瘤切片进行成像。随后，使用20倍物镜在每个肿瘤的3-4个分开的区域捕获高分辨率图像，以解释肿瘤内血管密度的异质性并使偏倚性最小化。将具有相同尺寸(1274.87μm x 1274.87μm x 89.05μm)的原始图像文件加载到Imaris(Bitplane,RRID:SCR_007370)，并使用“斑点”功能处理以计数ERG或PROX1-阳性细胞核和“表面”处理以计算内皮粘蛋白或平足蛋白阳性血管的体积或面积。对于每个肿瘤(n＝6)，对来自多个区域的计数求平均值，并将数据绘制在Graphpad Prism 6中。
BALB/c野生型(WT)购自Walter and Eliza Hall Institute for MedicalResearch并且在6至10周龄之间使用。将小鼠4T1.2乳腺癌细胞在5％CO2培养箱中在含有10％FBS的完全RPMI中培养。如前所述(Mittal等，2014)，将5x 104个4T1.2肿瘤细胞接种到BALB/c WT小鼠的第四乳房脂肪垫中。简言之，在肿瘤植入后第3天，用范围为5mg/kg至50mg/kg的体重或媒介物PBS的不同剂量的Sm4每天口服强饲小鼠，持续10天。用数字卡尺将肿瘤尺寸测量为两个垂直直径的乘积。在第12天，将小鼠麻醉以手术切除原发肿瘤，并用手术夹闭合伤口。将肿瘤收集在福尔马林中以用于组织学。在每个实验6至12只小鼠的组中监测小鼠的存活率，以确保检测生物学差异的足够能力。所有实验均得到QIMR Berghofer医学研究所动物伦理委员会(P1505)的批准。
结果和讨论
SOX蛋白通过募集特定的相互作用配偶体来激活个体靶基因(Sarkar和Hochedlinger 2013)，但迄今为止仅鉴定了SOXF组的两种蛋白质-蛋白质相互作用(SOX18-MEF2C和SOX17-OCT4)(Hosking等，2001，Jauch等，2011)。我们首先使用无偏蛋白质组学技术的组合绘制了SOX18相互作用组(SOX18相互作用配偶体的网络)。染色质免疫沉淀与质谱联用(ChIP-MS)为与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中染色质结合的SOX18相关的蛋白质(Mohammed等，2013)提供了第一通过筛选，然后，α筛选使用体外翻译的全长蛋白质将SOX18依赖性复合物解析为成对相互作用(图9A)(Mureev等，2009，Kovtun等，2011，Sierecki等，2013，Sierecki等，2014，Gambin等，2014)。ChIP-MS分析揭示了289种蛋白质，所述蛋白质代表多种基因本体(GO)类的分子功能，所述功能与SOX18直接或间接相关(图9B和10A-C)。为了增加我们鉴定直接相互作用物的机会，我们专注于已知为核酸和/或蛋白质结合的蛋白质(图9B，紫色)。从该子集中，我们选择8种已知的转录因子、解螺旋酶、共抑制因子、RNA结合和DNA修复分子(图10A、B)。使用α筛选，我们观察到SOX18与其自身相互作用，并且还与DDX1、DDX17、ILF3、STAT1、TRIM28和XRCC5形成成对相互作用(图9C，左栏'+'和图10D)。
另外，我们研究了能够调节内皮细胞功能的6种众所周知的TF(ESR1、NR2F2、RBPJ、SOX7、SOX17和CTNNB1)和唯一鉴定的SOX18蛋白配偶体MEF2C的潜在成对相互作用(Hosking等，2001年)。将充分表征的SOX9同二聚体(Bernard等，2003)作为阳性对照包括在内以验证α筛选信号(图10D)。发现SOX18与所有测试的内皮转录因子相互作用，可能的例外是SOX17和CTNNB1，其显示出低于任意阈值的结合亲和力(图9C，'-')。
鉴定了能够与SOX18相互作用的一系列蛋白质后，我们继续测试小分子化合物Sm4(图10E)对这些相互作用的活性。在高通量筛选中鉴定了Sm4(其源自在褐藻Caulocystiscephalornithos中发现的天然产物)的潜在的SOX18阻断剂(参见实施例1)。我们发现Sm4显著破坏了12个经过验证的SOX18相互作用中的6个(图9C，右栏)，其中IC50值范围为3.3μM(对于SOX18-RBPJ二聚体)至65.9μM(对于SOX18-RBPJ二聚体)(图9D和图10F)。为了评估Sm4对不同SOXF成员的差异效应，我们探索了所有三种SOXF蛋白与MEF2C、RBPJ和OCT4之间的另一组PPI(图11)。与SOCT18一样，SOX7能够与RBPJ和SOX18本身相互作用，这两种相互作用至少部分被Sm4破坏。我们进一步发现，所有三种SOXF蛋白都可以与OCT4形成异二聚体，而只有SOX17-OCT4相互作用受Sm4影响。重要的是，SOX7和SOX17都不具备形成同二聚体的能力，因此Sm4作用模式的这一组分对SOX18-SOX18相互作用具有高度特异性。SOX9同二聚化不受Sm4干扰，进一步证实了这一点。这些结果表明，Sm4选择性倾向于SOX18相关PPI的一个亚组，但具有干扰SOX7或SOX17蛋白质配偶体募集的能力。Sm4的这一特性在防止SOXF冗余机制方面是潜在有利的(Hosking等，2009，Jethon等，2016)。
为了评估SOX18 PPI破坏如何转化为转录失调，我们接下来在HUVEC中进行基因组范围的RNA-seq和ChIP-seq分析的组合。从SOX18ChIP-seq峰确定的最常见的结合基序对应于之前报道的SOX基序5'-AACAAT-3'(图13A)，该GOIP-seq数据集的有效性通过GO术语分析和已知SOX18靶基因诸如Prox1和Vcam1的鉴定得以进一步证实(图13B)(Francois等，2008，Hosking等，2004)。我们比较了过表达SOX18的细胞中Sm4处理对DMSO对照的全局转录效应(图13C-E)，并用SOX18ChIP-seq数据集覆盖了这个差异表达基因列表。使用这个叠加，我们计算了基因的转录起始位点(TSS)与TF结合事件之间的距离，将其作为直接转录调控的可能性的指标。为了能够分析该距离如何被Sm4改变，我们建立了随机基因的TSS与SOX18结合事件之间的参考距离(图12A)。与此同时，我们对SOX7(内部生成的)以及可从ENCODE联盟获得的所有7种转录调节因子(GATA2、c-FOS、c-JUN、CTCF、EZH2、MAX、c-MYC)进行了相同的分析。这使我们能够区分SOX18的转录靶向与对其他内皮特异性转录因子的潜在脱靶效应。
累积的SOX18峰至TSS的距离证明，总体上，SOX18峰与Sm4下调的基因的TSS的距离比与随机分布的TSS的距离近3.6倍(p值<0.001)(图12B，左上)。这些结果间接表明受Sm4影响的基因通过对SOX18转录活性的特定影响而失调。对于所测试的另外7种转录因子，没有观察到这种相关性(图12B和13F)，表明Sm4对这些TF活性没有脱靶效应。有趣的是，Sm4下调的基因的TSS与c-JUN结合事件近2.05倍(p值＝0.011，补充文件1c)。虽然只有微小的显著性，但这可表明由SOX18和c-JUN对这一亚组的Sm4下调的基因进行的可能的共调控。事实上，对SOX18ChIP-seq峰中已知基序的分析揭示了c-JUN结合基序的过表达(3.23％的SOX18峰，p值＝1e-302)，并且α筛选分析进一步证实SOX18和c-JUN可进行物理相互作用(图14)。我们发现所测试的另外的TF的表达水平未被Sm4处理改变。这是一个重要的观察结果，因为其证明了不存在Sm4的情况下由这些转录因子的转录水平的脱靶调控引入的偏倚性。
为了解决Sm4对SOX TF家族成员的潜在转录脱靶效应的问题，我们关注于密切相关的SOXF和SOXE蛋白。在基于细胞的报告基因测试中任何测试浓度(≤50μM)下，Sm4都不影响SOX17或SOX9蛋白的转录活性(图15)(Robinson等，2014，Lefebvre等，1997)。总之，这些结果强有力地证明Sm4选择性地靶向SOX18介导的转录而不是其他关键的内皮转录因子和SOX蛋白。
为了研究Sm4是否也能够在体内干扰Sox18转录激活，我们使用tg(-6.5kdrl:eGFP)转基因斑马鱼报告基因品系，其先前已被验证为Sox7和Sox18的组合活性的读出(Duong等，2014)。我们在受精后(hpf)20小时处理这些幼体并观察到Sm4处理显著降低了SOX18依赖性egfp转录水平(61％)，这与使用吗啉代寡核苷酸(MO)的组合sox7/18耗尽的效应类似(图16A、B)。重要的是，这些斑马鱼胚胎正常发育，我们没有发现毒性的证据。
然后我们使用第二转基因斑马鱼报告基因品系tg(Dll4in3:eGFP)，其含有位于dll4基因的内含子3中的调控元件。该Dll4in3增强子的活性不能完全概括内源性dll4表达(Wythe等，2013,Sacilotto等，2013)(Wythe等，2013和Sacilotto等，2013)，但其确实提供了有用的工具来研究Sox7、Sox18和Notch效应子Rbpj的组合活性。组合遗传干扰sox7、sox18和rbpj已被证明可以消除Dll4in3的活化，而单一或双重MO敲低具有更加温和得多的作用(Sacilotto等，2013)。这种轻度抑制作用通过单独用Sm4处理来概括(图16C，D)。另外，当将亚最佳剂量的rbpj MO注射与Sm4处理组合时，抑制作用显著增加11.5％(图16C，D)。这些数据显示Sm4干扰Sox7/18和Rbpj对Dll4in3增强子的协同激活。作为体内阴性对照，我们使用Sox9依赖性tg(col2a1：yfp)报告基因品系，并观察到受精后2至6天的连续Sm4处理不会扰乱Sox9的转录活性或软骨形成过程(图17)。总之，这支持了提出的Sm4在体内作为选择性SOX18抑制剂的作用机制。
为了进一步证明体内Sox18功能的小分子抑制，我们接下来研究了Sm4处理是否能够引起血管表型，类似于sox7/sox18遗传上破坏的斑马鱼的血管表型(Hermkens等，2015)。该表型的特征在于动静脉规范缺陷，动脉标志物的表达水平降低(Cermenati等，2008，Herpers等，2008，Pendeville等，2008)。我们在始于16hpf在相关发育窗口期间用1.5μMSm4处理携带动脉/静脉报告基因tg(fli1a:eGFP,-6.5kdrl:mCherry)的斑马鱼幼体(图18A)。这些幼体以背主动脉(DA)为代价获得扩张的后主静脉(PCV)(图16E-G和图18B)，具有动静脉分流和不完全的躯干循环(图18C，D)。24hpf和48hpf时的血管标志物的qRT-PCR分析揭示了与DMSO(特别是efnb2a、hey1和efnb4a)相比的Sm4处理的条件下的动脉和静脉基因的显著失调(图16H和18E)。
由于动静脉规范中的SoxF冗余，A/V畸变表型通常仅在Sox7和Sox18功能的双重丧失中观察到。由于Sm4似乎在体外部分干扰Sox7-Rbpj和Sox7-Sox18 PPI，因此我们转向对Sox7特异性表型以评估该TF活性在体内是否被Sm4抑制。sox7基因破坏的标志是由侧背动脉形成的头部短循环环路(Mohammed等，2013)，这导致面部扰动循环(Hermkens等，2015)。在Sm4的存在的情况下，我们观察到暗示部分Sox7功能丧失的表型的LDA的轻微畸变。然而，头部的血液循环在Sm4处理的幼体中不受影响，表示短循环环路尚未完全形成。该表型支持以下结论：Sox7活性在小化合物存在的情况下仅受到部分影响。总的来说，这些结果与在体外观察到的全基因组抑制效应一致，证明Sm4在体内选择性地干扰Sox18转录活性和SoxF介导的血管形成。
作为Sm4在治疗相关环境中的抗血管生成潜能的最终证明，我们接下来评估其在乳腺癌的临床前模型中的功效。用高转移性4T1.2乳腺癌细胞接种到BALB/c小鼠的乳房脂肪垫，使肿瘤的植入进行3天，之后用25mg/kg/天的Sm4、阿司匹林或媒介物PBS开始处理(图19A)。因阿司匹林与Sm4的结构相似性而选择其作为阴性对照。维持每日处理，持续10天，之后切除原发性肿瘤并监测对疾病潜伏期的影响(图19A)。作为靶标接合的间接指示，我们首先通过原位杂交确认Sox18在4T1.2肿瘤脉管系统中表达(图19B)。接下来我们继续测量处理过程中的Sm4生物利用度。在2个不同的时间点在血浆中始终检测到m4，平均浓度随时间推移从38.3μg/mL增加至55.2μg/mL(图19C)。
PBS媒介物或阿司匹林处理的小鼠死于4T1.2肿瘤负荷，其中中位潜伏期分别为33天和34天(图19D)，而Sm4处理的小鼠总体存活率显著增加，中位潜伏期为44天(p值<0.01)。如图20I的Sm4剂量响应的评估所示，增加Sm4的浓度导致4T1.2接种小鼠的总体存活率进一步提高。例如，用50mg/kg的Sm4处理小鼠导致73天的中位潜伏期对比媒介物处理的小鼠的40天的中位潜伏期。
为了进一步研究可能引起这种效应的因素，在处理期间监测肿瘤的尺寸，以及自发性肺转移灶的形成。虽然Sm4处理未改变原发性肿瘤的尺寸(图19E)，但我们发现在肿瘤接种后第28天肺转移灶的平均数量减少了67％(图19F)。
为了排除由于手术引起的炎症反应的任何贡献，我们通过进行假手术(而不切除肿瘤)来复制该研究(图20A、B)。该方法证实在手术后期间，Sm4处理不影响原发性肿瘤生长，并证明Sm4与手术诱导的炎症的联合作用不太可能是存活率增加的原因。
为了建立转移率与肿瘤诱导的血管反应之间的相关性，我们研究了肿瘤内和肿瘤周围区域的血管密度(图19G和21)。对整个肿瘤进行切片，并且明视野显微镜检查显示血管覆盖率的整体下降，如红细胞的存在所示的(图19G，星号)。使用内皮细胞标志物ERG(核)和内皮粘蛋白(EMCN，膜)的免疫荧光染色的进一步分析显示在Sm4处理的小鼠的肿瘤中，内皮细胞数量(48％，p值<0.05)以及血管体积(55％，p值<0.01)显著减少(图19H，I和22)。使用淋巴特异性标志物PROX1和平足蛋白(PDPN)，我们还评估了Sm4对肿瘤诱导的淋巴管生成反应的影响，并发现在处理的条件下肿瘤相关淋巴管的密度大大降低(65％，p值<0.01)，以及淋巴管内皮细胞的数量大大减少(70％，p值<0.001)(图23)。这种对Sm4处理的淋巴反应与实体癌的淋巴扩散期间SOX18功能丧失的所述淋巴反应一致(Duong等，2012)。总之，这表明Sm4通过干扰肿瘤诱导的新血管形成和相关的转移来改善诱导的乳腺癌的结果。
血管生成和淋巴管生成的诱导是实体癌的标志，并且是实现肿瘤转移性传播的关键步骤。针对靶转录因子的常规方法集中于干扰失调以促进肿瘤细胞转化的癌基因(Gormally等，2014，Illendula等，2015，Moellering等，2009，Zhang等，2012)。此处，我们验证了新颖的互补策略，其依赖于靶向来自宿主血管的发育转录因子，所述转录因子可促进转移性扩散。我们的结果提供了概念证明：用Sm4靶向转录因子SOX18是干扰乳腺癌临床前模型中的转移性扩散的有效分子策略。
在整个说明书中，目的是描述本发明的优选实施方案，而不是将本发明限制于任何一个实施方案或特征的特定集合。因此，本领域技术人员将理解，根据本公开内容，在不背离本发明的范围的情况下，可在所例示的特定实施方案中进行各种修改和改变。
本文提及的所有计算机程序、算法、专利和科学文献均通过引用并入本文。
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Claims (25)

1.式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药：
其中，
R1选自OH和OR6，其中R6为C1–C4烷基；
R2选自H、COOR7和C(O)NR8R9，其中R7、R8和R9独立选自H和C1–C4烷基；
R3为L-A，其中L为选自C2–C8烷基、C2–C8烯基和C2–C8烷氧基烷基的接头，并且A选自任选取代的苯基和任选取代的萘基；
R4选自H、OR10、卤代和C1–C4烷基，其中R10选自H和C1–C4烷基；以及
R5选自H、OR11、卤代和C1–C4烷基，其中R11选自H和C1–C4烷基，
其中，所述化合物用于抑制SOX18活性。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R1选自OH和OMe。
3.根据权利要求中1或2所述的化合物，其中R2选自H、COOH、COOMe和
4.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R4选自H、OH、OMe、Cl和Me。
5.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R5选自H、OH和OMe。
6.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R4和R5为H。
7.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中L为选自C2–C6烷基、C2–C6烯基和C2–C6烷氧基烷基的接头。
8.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R3选自：
其中，虚线表示从相邻原子至式I的环的连接，并且所示结构包括其E/Z异构体。
9.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中化合物选自：
10.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述SOX18活性包括与DNA序列和/或蛋白质接触和/或结合。
11.根据权利要求10所述的化合物，其中所述蛋白质选自SOX7、RBPJ、XRCC5、SOX18、ILF3、DDX17及其任意组合。
12.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，以及药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
13.治疗或预防受试者的血管生成相关疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关疾病、病症或病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至11中任一项所述的化合物或其药学上有效的盐、溶剂化物或前药或根据权利要求12所述的药物组合物，从而治疗或预防所述血管生成相关疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关疾病、病症或病况的步骤。
14.根据权利要求1至11中任一项所述的化合物或其药学上有效的盐、溶剂化物或前药在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防血管生成相关疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关疾病、病症或病况。
15.根据权利要求13所述的方法或权利要求14所述的用途，其中所述血管生成相关疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关疾病、病症或病况是眼科疾病、病症或病况或包括眼科疾病、病症或病况。
16.根据权利要求15所述的方法或用途，其中所述眼科疾病、病症或病况选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病、缺血性视网膜病、早产儿视网膜病、新生血管性青光眼、虹膜炎、角膜新生血管、睫状体炎、镰状细胞视网膜病、翼状胬肉、角膜损伤期间的血管反应及其任意组合。
17.根据权利要求13所述的方法或根据权利要求14所述的用途，其中所述血管生成相关疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关疾病、病症或病况是癌症或包括癌症。
18.根据权利要求17所述的方法或用途，其中所述癌症选自前列腺癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肝癌、肝细胞癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、血管肿瘤及其任意组合。
19.根据权利要求17或18所述的方法或用途，其中所述化合物或药物组合物阻止和/或抑制所述癌症的转移。
20.根据权利要求13所述的方法或根据权利要求14所述的用途，其中所述血管生成相关疾病、病症或病况和/或淋巴管生成相关疾病、病症或病况是肾脏疾病、病症或病况或包括肾脏疾病、病症或病况。
21.根据权利要求20所述的方法或用途，其中所述肾脏疾病、病症或病况选自慢性肾移植功能障碍、原发性肾纤维化病症、蛋白尿、糖尿病性肾病、肾炎及其任意组合。
22.抑制或阻止受试者的癌症转移的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至11中任一项所述的化合物或其药学上有效的盐、溶剂化物或前药或根据权利要求12所述的药物组合物，从而抑制或阻止所述癌症转移的步骤。
23.抑制、阻止或降低受试者中SOX18活性的方法，其包括所述向受试者施用有效量的根据权利要求1至11中任一项所述的化合物或其药学上有效的盐、溶剂化物或前药或根据权利要求12所述的药物组合物，从而抑制、阻止或降低所述受试者中的SOX18活性的步骤。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述SOX18活性包括与DNA序列和/或蛋白质接触和/或结合。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述蛋白质选自SOX7、RBPJ、XRCC5、SOX18、ILF3、DDX17及其任意组合。
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