JP2023011613A - 血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病の処置のためのｓｏｘ１８タンパク質活性の阻害剤 - Google Patents

血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病の処置のためのｓｏｘ１８タンパク質活性の阻害剤 Download PDF

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Abstract

【課題】ＳＯＸ１８タンパク質活性を阻害する化合物を提供する。【解決手段】式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容できる塩、溶媒和物若しくはプロドラッグを提供する。JPEG2023011613000036.jpg47170（Ｒ１はＯＨ又はＯＲ６；Ｒ６はＣ１～Ｃ４アルキル；Ｒ２はＨ、ＣＯＯＲ７又はＣ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９；Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は各々独立にＨ又はＣ１～Ｃ４アルキル；Ｒ３はＬ－Ａ；ＬはＣ２～Ｃ８アルキル、Ｃ２～Ｃ８アルケニル又はＣ２～Ｃ８アルコキシアルキル；Ａは置換/非置換のフェニル又は置換／非置換のナフチル；Ｒ４はＨ、ＯＲ１０、ハロ又はＣ１～Ｃ４アルキル；Ｒ１０はＨ又はＣ１～Ｃ４アルキル；Ｒ５はＨ、ＯＲ１１、ハロゲン又はＣ１～Ｃ４アルキル；Ｒ１１はＨ又はＣ１～Ｃ４アルキル）【選択図】なし

Description

本発明は、医療の分野に関する。より詳細には、本発明は、ＳＯＸ１８転写因子活性の阻害における使用のための化合物に関する。
本明細書における背景技術に対する任意の参照は、そのような技術がオーストラリアまたはそれ以外の場所における通常の一般的知識を構成することの承認として解釈されるべきではない。
小分子による転写因子（ＴＦ）の直接調節は、長い間探求されている。
初期の成果は、小分子により標的可能なリガンド結合ドメインを含む核受容体に限定されていた。
これらの知見は、ホルモン依存性癌の治療的用途へ翻訳される（ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）（ＰｅｒｉｓｓｉおよびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ、２００５）。
現在の課題は、核受容体を越えて、小分子薬物の結合ポケットを欠く、より広い範囲の転写因子に到達することである。
この課題は、多くのＴＦが決まった三次元構造、特にそれらのタンパク質－タンパク質結合ドメイン、の不足（ｌａｃｋ）、ＴＦを、組換えにより発現することの困難さ、およびそれらの作用機序を研究するためのアッセイ技術の不足（ｌａｃｋ）により困難である（Ｆｏｎｔａｉｎｅら、２０１５）。
ＴＦ活性の調節は、一般に、核内でのそれらの遺伝子発現レベルまたは濃度を変化させることにより、またはＤＮＡ若しくはパートナータンパク質のいずれかに対するそれらの結合能力を変化させることにより達成され、後者はＴＦ選択性を達成するより有望な戦略である。
パートナータンパク質のＴＦ採用（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）を邪魔する（ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ）小分子に関するいくつかの出版物は、この手法の可能性を証明するものである（Ｍｉｙｏｓｈｉら、２０１１、Ｖａｓｓｉｌｅｖら、２００４、Ｆｉｌｉｐｐａｋｏｐｏｕｌｏｓら、２０１０、Ｖｏｇｌｅｒら、２００９、Ｌｉｕら、２０１４）。
ヒトゲノムにおけるＴＦの中でも、発達ＴＦ（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ＴＦｓ）は、それらの発現が、多くの場合、成人において特定の病理学的条件下で調節不全とされる一方、生理学的条件下で発現停止される（たとえば、成人期における表現型維持には必要とされない）ため、魅力的な分子標的として注目（ｓｔａｎｄ ｏｕｔ）されている（ＢｏｙａｄｊｉｅｖおよびＪａｂｓ、２０００、Ｄａｒｎｅｌｌ、２００２、Ｌｏｐｅｚ－Ｂｉｇａｓら、２００６、Ｖａｑｕｅｒｉｚａｓら、２００９）。
発達因子（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｆａｃｔｏｒｓ）の１つのクラス、ＳＯＸ（ＳＲＹ関連のＨＭＧ－ボックス）ＴＦは、最近、幹細胞プログラミングの重要なレギュレーター、および癌関連状態における分子スイッチであることが明らかとなった（ＳａｒｋａｒおよびＨｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ、２０１３、Ｎｉｗａら、２００９）。
ＳＯＸタンパク質を標的とする以前の試みでは、主として、様々な癌における潜在的な癌遺伝子（Ｂａｓｓら、２００９）である、ＳＯＸ２（Ｎａｒａｓｉｍｈａｎら、２０１１）、および、血管発達のための重要な分子スイッチである（Ｃｅｒｍｅｎａｔｉら、２００８、Ｆｒａｎｃｏｉｓら、２００８、Ｐｅｎｎｉｓｉら、２０００）、ＳＯＸ１８（Ｋｌａｕｓら、２０１６）、に焦点を当てていた。
Ｄａｗｓｏｎポリオキソメタレートは、ＳＯＸ２のＤＮＡ結合を阻害することが示されているが、様々なＴＦファミリーに対して低い選択性のみを示し、そして、インビトロまたはインビボでの機能的アッセイのいずれでも全く試験されなかった（Ｎａｒａｓｉｍｈａｎら、２０１４、Ｎａｒａｓｉｍｈａｎら、２０１１）。
より最近になって、ＳＯＸのＤＮＡデコイ（ＳＯＸ ＤＮＡ ｄｅｃｏｙｓ）が、ＳＯＸ１８ のＤＮＡ結合およびＳＯＸ１８－依存性転写促進の選択的阻害剤として使用されている。
これらのデコイは、非ＳＯＸのＴＦよりも高い選択性を示すが、それ自体では細胞膜を通して拡散することができず、それらの適用範囲は限定されている（Ｋｌａｕｓら、２０１６）。
ＳＯＸのＴＦの薬理学的調節の、研究されていない態様は、これらのタンパク質がどのようにそれらのパートナーを採用（ｒｅｃｒｕｉｔ）し、そして、その結果、様々なタンパク質－タンパク質相互作用（ＰＰＩ）の範囲を介して転写を調節するかに関する。
おそらく、合成ライブラリーは、標的ＰＰＩに必要な構造的多様性を有さない（ＨｏｐｋｉｎｓおよびＧｒｏｏｍ、２００２、ＦｅｈｅｒおよびＳｃｈｍｉｄｔ、２００３）。
転写因子（ＴＦ）のＳＯＸＦグループ（ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７およびＳＯＸ１８）は、発達（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）中の内皮細胞分化の重要なレギュレーターであり（Ｆｒａｎｃｏｉｓら、２００８、Ｃｏｒａｄａら、２０１３、Ｈｏｓｋｉｎｇら、２００９、Ｍａｔｓｕｉら、２００６、Ｃｅｒｍｅｎａｔｉら、２００８、Ｈｅｒｐｅｒｓら、２００８）、そして、したがって、脈管構造の形成に重要である。
ＳｏｘＦ遺伝子の突然変異または欠失は、動静脈特定化（ａｒｔｅｒｉｏｖｅｎｏｕｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、血管完全性およびリンパ脈管新生を損ない、癌の動物モデルにおいて腫瘍成長および転移を阻害する（Ｄｕｏｎｇら、２０１２、Ｙａｎｇら、２０１３、Ｚｈａｎｇら、２００９、Ｙｏｕｎｇら、２００６）。
より最近になって、高いレベルのＳＯＸ１８が、ヒト患者における癌の不十分な予後に関連付けられた（Ｅｏｍら、２０１２、Ｐｕｌａら、２０１３、Ｊｅｔｈｏｎら、２０１５）。
したがって、ＳＯＸ１８タンパク質機能の薬理学的阻害は、癌における血管応答の管理、および血管癌における潜在的な治療的標的のための潜在的な手段を提示する。
したがって、たとえば、ＳＯＸ１８タンパク質に直接結合し、またはそのＤＮＡ結合ドメインの近接に直接結合して、たとえば、ＳＯＸ１８－タンパク質パートナーの採用（ＳＯＸ１８－ｐｒｏｔｅｉｎ ｐａｒｔｎｅｒ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）および／またはＳＯＸ１８のＤＮＡ結合を攪乱する（ｐｅｒｔｕｒｂ）ことにより、ＳＯＸ１８タンパク質活性を阻害する化合物が依然として必要とされている。
本発明は、少なくとも部分的に、本明細書で提供される式の特定の化合物が、ＳＯＸ１８タンパク質活性の阻害、特に、ＳＯＸ１８がＤＮＡおよび／または特定のタンパク質パートナーに結合する能力に関連して、有効性を有するという発見に基づくものである。
その延長線上で、これらの化合物は、更に、癌転移および血管癌等の血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態の処置に有効であることが示される。
本発明の第１の態様では、式（Ｉ）、またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物若しくはプロドラッグを提供する：
Figure 2023011613000001
 （式中、
Ｒ１は、ＯＨおよびＯＲ６からなる群から選択され、
Ｒ６はＣ１～Ｃ４アルキルであり；
Ｒ２は、Ｈ、ＣＯＯＲ７およびＣ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９からなる群から選択され、
Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、独立してＨおよびＣ１～Ｃ４アルキルから選択され；
Ｒ３は、Ｌ－Ａであり、
Ｌは、Ｃ２～Ｃ８アルキル、Ｃ２～Ｃ８アルケニルおよびＣ２～Ｃ８アルコキシアルキルから選択されるリンカーであり、そして、
Ａは、所望により置換されたフェニルおよび所望により置換されたナフチル（ｎａｐｔｈｙｌ）から選択され；
Ｒ４は、Ｈ、ＯＲ１０、ハロおよびＣ１～Ｃ４アルキルからなる群から選択され、
Ｒ１０は、ＨおよびＣ１～Ｃ４アルキルから選択され；そして、
Ｒ５は、Ｈ、ＯＲ１１、ハロおよびＣ１～Ｃ４アルキルからなる群から選択され、
Ｒ１１は、ＨおよびＣ１～Ｃ４アルキルから選択され、
前記化合物は、ＳＯＸ１８活性の阻害に使用されるためのものである。
実施形態において、Ｒ１は、ＯＨおよびＯＭｅからなる群から選択される。
好適には、Ｒ２は、Ｈ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅおよび
Figure 2023011613000002
 からなる群から選択される。
好ましくは、Ｒ２は、ＣＯＯＨおよび
Figure 2023011613000003
 から選択される。
実施形態において、Ｒ４は、Ｈ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＣｌおよびＭｅからなる群から選択される。
好適には、Ｒ５は、Ｈ、ＯＨおよびＯＭｅからなる群から選択される。
特定の実施形態において、Ｒ４およびＲ５はＨである。
実施形態において、Ｌは、Ｃ２～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニルおよびＣ２～Ｃ６アルコキシアルキルから選択されるリンカーである。
列挙した実施形態のいずれかにおいて、
Ｒ３は：
Figure 2023011613000004
 からなる群から選択される。
式中、破線は、隣接する原子から式Ｉの環への結合を示し、示される構造は、そのＥ／Ｚ異性体を含む。
一実施形態において、第１の態様の化合物は：
Figure 2023011613000005
Figure 2023011613000006
Figure 2023011613000007
からなる群から選択される。
より好ましくは、第１の態様の化合物は：
Figure 2023011613000008
Figure 2023011613000009
Figure 2023011613000010
からなる群から選択される。
好適には、本態様の化合物に関連して、ＳＯＸ１８の活性は、ＤＮＡ配列および／またはタンパク質に対する接触および／または結合を含む。
好ましくは、タンパク質は、ＳＯＸ７、ＲＢＰＪ、ＸＲＣＣ５、ＳＯＸ１８、ＩＬＦ３、ＤＤＸ１７およびそれらの任意の組み合わせからなるリストから選択される。
本発明の第２の態様では、第１の態様の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物若しくはプロドラッグと、薬学的に許容できる担体、希釈剤および／または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
本発明の第３の態様では、対象における、血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態の処置または予防方法を提供し、この方法は、有効量の第１の態様の化合物、若しくはその薬学的に有効な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグ、または第２の態様の医薬組成物を対象に投与することにより、血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態を処置または予防することを含む。
本発明の第４の態様では、血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態の処置または予防のための医薬の製造における、第１の態様の化合物、またはその薬学的に有効な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグの使用を提供する。
第３および第４の態様の参照において、血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態は、好適には、眼科疾病、疾患若しくは状態でありまたはこれらを含む。
好ましくは、眼科疾病、疾患または状態は、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、虚血性網膜症、未熟児の網膜症、血管新生緑内障、虹彩血管新生（ｉｒｉｔｉｓ ｒｕｂｅｏｓｉｓ）、角膜血管新生、毛様体炎、鎌状細胞網膜症、翼状片、角膜損傷中の血管応答およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
第３および第４の態様の本発明の代替的な実施形態では、血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態は、癌でありまたは癌を含む。
好ましくは、癌は、前立腺癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、腎癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、黒色腫、肝細胞腫、肝細胞癌腫、肉腫、白血病、急性Ｔ細胞リンパ腫、血管新生物およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
特定の実施形態では、第１の態様の化合物または第２の態様の医薬組成物は、前記癌の転移を予防および／または阻害する。
前述した２つの態様の更なる実施形態では、血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態は、腎疾病、疾患若しくは状態でありまたはそれを含む。
好ましくは、腎疾病、疾患または状態は、慢性腎移植片機能不全、原発性腎線維化疾患（ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、蛋白尿、糖尿病性腎症、腎炎症およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
前述した２つの態様の別の実施形態では、血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態は、アテローム性動脈硬化症でありまたはそれを含む。
前述した２つの態様の更に別の実施形態では、血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態は、乏毛症・リンパ水腫・毛細血管拡張症症候群（Ｈｙｐｏｔｒｉｃｈｏｓｉｓ－Ｌｙｍｐｈｅｄｅｍａ－Ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）でありまたはそれを含む。
本発明の第５の態様では、対象における癌の転移の阻害または予防方法を提供し、この方法は、有効量の第１の態様の化合物、若しくはその薬学的に有効な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグ、または第２の態様の医薬組成物を対象に投与することにより、癌の転移を阻害または予防するステップを含む。
好適には、癌は、前立腺癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、腎癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、黒色腫、肝細胞腫、肉腫、白血病、リンパ腫、血管新生物（たとえば、血管腫、血管肉腫、血管腫）およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
本発明の第６の態様では、対象におけるＳＯＸ１８活性の阻害、予防または低減方法を提供し、この方法は、有効量の第１の態様の化合物、若しくはその薬学的に有効な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグ、または第２の態様の医薬組成物を対象に投与することにより、対象におけるＳＯＸ１８活性を阻害、予防または低減するステップを含む。
好適には、ＳＯＸ１８活性は、ＤＮＡ配列および／またはタンパク質に対する接触および／または結合を含む。
好ましくは、タンパク質は、ＳＯＸ７、ＲＢＰＪ、ＸＲＣＣ５、ＳＯＸ１８、ＩＬＦ３、ＤＤＸ１７およびそれらの任意の組み合わせからなるリストから選択される。
本発明を容易に理解でき、実際的効果に移るために、ここで好ましい実施形態を付随する図面を参照して実施例により説明する。
は、天然産物、ＳＯＸ１８－ＤＮＡ結合の阻害剤を示す。Ａは、０．２５ｍｇ／ｍＬの２６８８海産物抽出物のハイスループットＦＰスクリーニングからの代表的なデータセットである。そのスクリーニングは、ＦＡＭ標識ＳＯＸ応答エレメント（マウスＰｒｏｘ１ イントロン １）を有する完全長マウスＳＯＸ１８に対して行った。ＳＯＸ１８に対するリガンドの競合的結合は、ＦＰ指数を低下させる（赤点の活性抽出物を指す矢印）。Ｂは、Ｓｍ１およびＳｍ２の化学構造である。Ｃは、Ｓｍ１およびＳｍ２のＦＰ濃度応答曲線（完全長マウスＳＯＸ１８、平均±Ｓ．Ｄ．Ｎ＝３）である。 は、構造類似体にフォーカスしたライブラリー、およびインシリコ凝集予測因子を用いた対抗スクリーニング（ｃｏｕｎｔｅｒ－ｓｃｒｅｅｎ）、および臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）アッセイである。Ａは、第１のグループは、化合物Ｓｍ１およびＳｍ２に明らかなオルト－ヒドロキシ安息香酸（サリチル酸）モチーフに基づく。第２のグループは、同様のレゾルシノール骨格に基づく。第３のグループは、同様のサリチル酸またはアントラニル酸骨格を含む承認されたＮＳＡＩＤからなる。Ｂは、中性洗剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００のコントロール並びに２つの化合物Ｓｍ４およびＳｍ１０に関する典型的なＣＭＣデータである。Ｃは、Ｓｍ４、メクロフェナム酸、ニフルミン酸およびフルフェナミン酸によるＳＯＸ１８－ＤＮＡ結合阻害である。 は、構造類似体にフォーカスしたライブラリー、およびインシリコ凝集予測因子を用いた対抗スクリーニング（ｃｏｕｎｔｅｒ－ｓｃｒｅｅｎ）、および臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）アッセイである。Ａは、第１のグループは、化合物Ｓｍ１およびＳｍ２に明らかなオルト－ヒドロキシ安息香酸（サリチル酸）モチーフに基づく。第２のグループは、同様のレゾルシノール骨格に基づく。第３のグループは、同様のサリチル酸またはアントラニル酸骨格を含む承認されたＮＳＡＩＤからなる。Ｂは、中性洗剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００のコントロール並びに２つの化合物Ｓｍ４およびＳｍ１０に関する典型的なＣＭＣデータである。Ｃは、Ｓｍ４、メクロフェナム酸、ニフルミン酸およびフルフェナミン酸によるＳＯＸ１８－ＤＮＡ結合阻害である。 は、ＳＯＸタンパク質と相互作用するが、ＤＮＡとはしない化合物である。ＡおよびＢは、ゲノムＤＮＡに隣接した、ＳＯＸ１８コンセンサスエレメント（Ａ）またはスクランブル配列（Ｂ）を有する、ビオチン化二本鎖ＤＮＡプローブ（およそ４０塩基対長）を使用して、小分子のＤＮＡ結合を試験した。プローブは、ＳＰＲストレプトアビジンチップに固定化した。ポジティブコントロールＤＡＰＩ、臭化エチジウム、およびアクチノマイシンＤは、文献と一致した方法でＤＮＡに結合する。小分子阻害剤（Ｓｍ４、５および１４）は、コンセンサス、またはスクランブルＤＮＡに結合しない。Ｃは、２５から８０℃に加熱したタンパク質複合体の差分静的光散乱（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｔａｔｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）により測定した、Ｐｒｏｘ１－ＤＮＡ、Ｓｍ４、５またはＳｍ１４のいずれかの存在下でのＳＯＸ１８［１０９］ＨＭＧ断片の熱安定性である。小分子の結合により、タンパク質安定性が促進される（ΔＴａｇｇ＞３℃は、有意な安定化と見なされる）。正規化した光散乱三重データのボルツマン曲線適合（適合度Ｒ２＞０．９７）。Ｄは、ＦＰベースのＤＮＡ結合競合アッセイを用いて測定したように、Ｓｍ４はＳＯＸ２、６、９、１１、１５および１８－ＨＭＧ断片のＤＮＡ結合を阻害する。 は、ＳＯＸ１８タンパク質－タンパク質相互作用に対する、Ｓｍ４、ニフルミン酸、フルフェナム酸およびメクロフェナム酸の効果である。Ａの左パネルは、ＸＲＣＣ６（ネガティブコントロール）並びにＳＯＸ１８、ＲＢＰＪおよびＭＥＦ２Ｃと相互作用することが既知の２つのタンパク質に関する、ＡＬＰＨＡＳｃｒｅｅｎにより試験したＳＯＸ１８ペアワイズタンパク質－タンパク質相互作用のヒートマップである。Ａの右パネルは、タンパク質複合体の共免疫沈降である。ＳＯＸ１８－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｃＭｙｃを、細胞フリー条件下で、ＧＦＰ－ＲＢＰＪ、ＧＦＰ－ＭＥＦ２ＣまたはＧＦＰのみ（ネガティブコントロール）のいずれかと共に共発現させ、そして、ＧＦＰ Ｎａｎｏｔｒａｐビーズを用いて免疫沈降させた。バンドは以下の通りである：１．ＲＢＰＪ－ＧＦＰ、２．ＭＥＦ２Ｃ－ＧＦＰ、３．ＳＯＸ１８－ｍＣｈｅｒｒｙ、４．ＧＦＰ。Ｂは、ＭＥＦ２ＣおよびＲＢＰＪとの、ＳＯＸ１８の相互作用に対する、Ｓｍ４、ニフルミン酸、フルフェナム酸およびメクロフェナム酸の効果を示す。 は、ＳＯＸ１８のＤＮＡ結合阻害、ＳＯＸ１８－ＲＢＰＪ結合阻害、細胞毒性および凝集に対する、Ｓｍ４化学モチーフの寄与である。上パネルの表は、Ｓｍ１４～４４化合物を示し、そして、４つの活性マーカー、即ちタンパク質－ＤＮＡおよびタンパク質－タンパク質結合阻害、細胞毒性並びに凝集リスクに関して得られた結果を色コードでまとめる。第２の下の棒グラフは、入手可能な場合、５０μＭおよび５μＭでのＳＯＸ１８－ＲＢＰＪタンパク質－タンパク質結合阻害結果を詳細する（Ｎ＝４、平均±ＳＤ）。（ＤＮＡ結合阻害、細胞毒性およびｃＬｏｇＰ生データを表３にまとめる）。下の棒グラフは、ＡＬＰＨＡＳｃｒｅｅｎアッセイにより測定したＳＯＸ１８－ＲＢＰＪタンパク質－タンパク質相互作用（ＰＰＩ）阻害を示す。結果は５０μＭ（ＰＢＳ Ｃｔｒｌ、ＤＭＳＯ ＣｔｒｌおよびＳｍ４は左側の棒グラフ）および５μＭ（Ｓｍ４～Ｓｍ４４は右側の棒グラフ）にて示す。結果は、化合物が入手可能な場合に示されることに留意されたい（Ｎ＝４、平均±ＳＤ）。ＡＬＰＨＡＳｃｒｅｅｎアッセイにおける読み取りとしての、ＳＯＸ１８ホモ二量体およびＳＯＸ１８／ＲＢＰＪヘテロ二量体形成を用いた、５μＭで試験したＳｍ４シリーズのＰＰＩにおける邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）の比較である。いくつかの化合物は、ＳＯＸ１８ホモ二量体形成を優先的に邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔ）した一方、いくつかのその他は、ＳＯＸ１８ヘテロ二量体形成に対してより特異的であり、そして、いくつかのその他は、ホモ－およびヘテロ二量体複合体の両方の汎攪乱物（ｐａｎ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒｓ）である。 は、ＳＯＸ１８のＤＮＡ結合阻害、ＳＯＸ１８－ＲＢＰＪ結合阻害、細胞毒性および凝集に対する、Ｓｍ４化学モチーフの寄与である。上パネルの表は、Ｓｍ１４～４４化合物を示し、そして、４つの活性マーカー、即ちタンパク質－ＤＮＡおよびタンパク質－タンパク質結合阻害、細胞毒性並びに凝集リスクに関して得られた結果を色コードでまとめる。第２の下の棒グラフは、入手可能な場合、５０μＭおよび５μＭでのＳＯＸ１８－ＲＢＰＪタンパク質－タンパク質結合阻害結果を詳細する（Ｎ＝４、平均±ＳＤ）。（ＤＮＡ結合阻害、細胞毒性およびｃＬｏｇＰ生データを表３にまとめる）。下の棒グラフは、ＡＬＰＨＡＳｃｒｅｅｎアッセイにより測定したＳＯＸ１８－ＲＢＰＪタンパク質－タンパク質相互作用（ＰＰＩ）阻害を示す。結果は５０μＭ（ＰＢＳ Ｃｔｒｌ、ＤＭＳＯ ＣｔｒｌおよびＳｍ４は左側の棒グラフ）および５μＭ（Ｓｍ４～Ｓｍ４４は右側の棒グラフ）にて示す。結果は、化合物が入手可能な場合に示されることに留意されたい（Ｎ＝４、平均±ＳＤ）。ＡＬＰＨＡＳｃｒｅｅｎアッセイにおける読み取りとしての、ＳＯＸ１８ホモ二量体およびＳＯＸ１８／ＲＢＰＪヘテロ二量体形成を用いた、５μＭで試験したＳｍ４シリーズのＰＰＩにおける邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）の比較である。いくつかの化合物は、ＳＯＸ１８ホモ二量体形成を優先的に邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔ）した一方、いくつかのその他は、ＳＯＸ１８ヘテロ二量体形成に対してより特異的であり、そして、いくつかのその他は、ホモ－およびヘテロ二量体複合体の両方の汎攪乱物（ｐａｎ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒｓ）である。 は、ＳＯＸ１８－ＨＭＧおよびＲＢＰＪの間の界面における、Ｓｍ４のインシリコモデリングである。インビトロでのＳＯＸ１８依存性転写促進の阻害である。ＡおよびＢは、タンパク質とＤＮＡの間の「開放」ポケット内に阻害剤を置く、ＳＯＸ１８／Ｐｒｏｘ１ ＤＮＡ Ｘ線結晶構造におけるＳｍ４に関する安定な結合ポーズである。Ｃは、Ｎｏｔｃｈ転写複合体の構造内へのＳＯＸ１８／ＤＮＡ構造のドッキングを示す。Ｄは、Ｓｏｘ１８およびホタルルシフェラーゼ遺伝子に融合したＶｃａｍ１プロモーターを含むベクターで一過的にトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞における、ルシフェラーゼレポーターアッセイ（Ｈｏｓｋｉｎｇら、２００４）である。最大１％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を含む培養培地中で、ＣＣ１０（１０％細胞毒性）未満の濃度で、小分子を用いて、細胞を２４時間処理した。結果を、Ｓｍ４およびニフルミン酸に関して示す。メクロフェナム酸およびフルフェナミン酸は、ＣＣ１０未満の濃度で不活性であった。 は、ＣＯＸ－１／２酵素阻害を示す。ポジティブコントロールとしてのメクロフェナム酸を含むＳＯＸ１８阻害剤によるＣＯＸ－１およびＣＯＸ－２酵素の阻害を示す。ＣＯＸ酵素の阻害は、アラキドン酸変換から生じたＰＧＨ２プロスタノイドの量により測定される。 は、Ｓｍ１４～４４のＮＭＲスペクトルを示す。 は、Ｓｍ１４～４４のＮＭＲスペクトルを示す。 は、Ｓｍ１４～４４のＮＭＲスペクトルを示す。 は、Ｓｍ１４～４４のＮＭＲスペクトルを示す。 は、Ｓｍ１４～４４のＮＭＲスペクトルを示す。 は、Ｓｍ１４～４４のＮＭＲスペクトルを示す。 は、Ｓｍ１４～４４のＮＭＲスペクトルを示す。 は、Ｓｍ１４～４４のＮＭＲスペクトルを示す。 は、Ｓｍ１４～４４のＮＭＲスペクトルを示す。 は、Ｓｍ１４～４４のＮＭＲスペクトルを示す。 は、Ｓｍ１４～４４のＮＭＲスペクトルを示す。 は、Ｓｍ１４～４４のＮＭＲスペクトルを示す。 は、Ｓｍ１４～４４のＮＭＲスペクトルを示す。 は、Ｓｍ１４～４４のＮＭＲスペクトルを示す。 は、Ｓｍ１４～４４のＮＭＲスペクトルを示す。 は、ＳＯＸ１８の網羅的相互作用（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ）およびＳｍ４による相互作用の邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔ）のマッピングを示す。（Ａ）クロマチン免疫沈降－質量分析（ＣｈＩＰ－ＭＳ）および増幅ルミネッセンス近接均質アッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ）（ＡＬＰＨＡ－Ｓｃｒｅｅｎ）方法を組み合わせた、ＳＯＸ１８依存性タンパク質－タンパク質相互作用（ＰＰＩ）を解析（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅ）するための実験戦略の概略を示す。（Ｂ）ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において、ＳＯＸ１８－ｃＭｙｃ ＣｈＩＰ－ＭＳにより特定された、２８９タンパク質に関する分子機能に関するＧＯ－ｔｅｒｍ分析を示す。Ｍｙｃ－ｔａｇのみをトランスフェクトされた細胞に見出された非特異的相互作用物質を減算した。継続的直接相互作用研究に関して、直接の相互作用物を特定する可能性を向上させるために、核酸結合またはタンパク質結合能力を有するタンパク質（紫色）を考慮した。（Ｃ）左列：ＣｈＩＰ－ＭＳ ＳＯＸ１８関連タンパク質、内皮転写因子およびポジティブ／ネガティブコントロールのタンパク質の選択に関して、ＡＬＰＨＡ－Ｓｃｒｅｅｎにより試験されたＳＯＸ１８ペアワイズＰＰＩのヒートマップ表示である。右列：１００μＭで試験した、ＳＯＸ１８依存性タンパク質－タンパク質相互作用に対する、Ｓｍ４活性のヒートマップ表示である。相互作用および邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）の閾値は、スケールバーにて黒線で示す。閾値を上回る相互作用および邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）のレベルは、「＋」で画定され、閾値を下回るレベルは「－」で画定される。タグ化タンパク質は、リーシュマニア・タレントラエ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ）細胞フリータンパク質発現システム内で発現させた。（Ｄ）Ｓｍ４によるＳＯＸ１８のＰＰＩを邪魔すること（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）に関する代表的なＡＬＰＨＡ－Ｓｃｒｅｅｎ濃度応答曲線を示す。示されるデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍである。 は、ＳＯＸ１８のＰＰＩのＱＣおよびＳｍ４の効果を示す。（Ａ）ＨＵＶＥＣにおいて、抗ｃＭｙｃ抗体を用いた、ｃＭｙｃ－ＳＯＸ１８免疫沈降から特定された、配列ＫＡＰＩＬＩＡＴＤＶＡＳＲＧを有する、代表的な二重荷電ＤＤＸ１７ペプチド（Ｍｕｓｃａｔイオンスコア５１．６）に関する質量分析スペクトル。（Ｂ）ＣｈＩＰ－ＭＳから選択された、ＳＯＸ１８および相互作用タンパク質の特定されたペプチドの適用範囲。（Ｃ）緑色で示された、特定されたＣｈＩＰ－ＭＳペプチドを有する、ＤＤＸ１７のアミノ酸配列。（Ｄ）ＳＯＸ９－ＳＯＸ９およびＳＯＸ１８－ＳＯＸ１８を示す、タンパク質希釈最適化に関する、典型的なＡＬＰＨＡ－Ｓｃｒｅｅｎ曲線である。ピーク（フック効果）の存在は、相互作用を示し、そして、継続的結合研究のための理想的なタンパク質濃度を表す。タンパク質は、リーシュマニア・タレントラエ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ）細胞フリータンパク質発現システム内で発現された。（Ｅ）ＳＯＸ１８阻害剤であるＳｍ４の分子構造。（Ｆ）Ｓｍ４による、ＳＯＸ１８のＰＰＩの邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）に関する、ＡＬＰＨＡ－Ｓｃｒｅｅｎ濃度応答曲線。示されるデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍである。 は、Ｓｍ４による、ＳＯＸＦのＰＰＩの異なる邪魔（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）を示す。左パネルは、ＡＬＰＨＡＳｃｒｅｅｎにより測定した、ＳＯＸＦ、ＭＥＦ２ＣおよびＲＢＰＪおよびＯＣＴ４の間のタンパク質－タンパク質相互作用のマトリクスを示す。右パネルは、ＰＰＩに対する５０ｕＭのＳｍ４の効果を示す（青色＝ＰＰＩ／邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）なし、緑色／黄色＝低いＰＰＩ／邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）、橙色／赤色＝強いＰＰＩ／完全邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）、灰色＝閾値未満のＰＰＩ、Ｓｍ４効果は決定できない）。 は、Ｓｍ４は、インビトロで、ＳＯＸ１８転写出力に選択的に影響を及ぼすことを示す。（Ａ）ゲノムワイドＴＦ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータとトランスクリプトミクスデータからのＳｍ４影響遺伝子との間の相関分析の概略図。Ｓｍ４影響遺伝子（紫色）の転写開始部位（ＴＳＳ）の付近のクロマチンを、転写因子結合ピーク（灰色）に関して研究して、所定の転写因子に関する最も近い結合部位までの「ＴＳＳからの距離」を計算した。このＴＳＳからの距離を、転写調節の可能性の代理物として使用し、そして、かくしてＳｍ４影響遺伝子と転写因子との関連性を形成した（Ｃｕｓａｎｏｖｉｃｈら、ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１４；Ｖｅｒｂｉｓｔら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ、２０１５）。ＳＯＸ１８およびＳＯＸ７、およびＥｎｃｏｄｅコンソーシアムから入手可能な全転写因子（ＧＡＴＡ２、ｃ－ＦＯＳ、ｃ－ＪＵＮ、ＣＴＣＦ、ＥＺＨ２、ＭＡＸおよびｃ－ＭＹＣ）のＣｈＩＰ－ｓｅｑピークが、ＨＵＶＥＣにおいて行われた分析に含まれた。遺伝子のランダムグループを、偶然により見出されるように、コントロール分布として分析した。（Ｂ）Ｓｍ４影響遺伝子を、下方調節（Ｓｍ４－下方）、非影響（Ｓｍ４－不変）および上方調節（Ｓｍ４－上方）にグループ化した。プロットは、Ｓｍ４影響遺伝子（紫色の線、絶対倍数変化≧２）のＴＳＳと、ＳＯＸ１８、並びにコントロール転写因子ＳＯＸ７およびＧＡＴＡ２に関する結合部位の最も近いゲノム位置までの距離の累積的な分布を示す。差次的に発現した遺伝子のＴＳＳから特定の転写因子の最も近い結合イベントまでの距離の中央値を、ランダムな遺伝子セットから偶然に予想される距離の中央値（緑色の線）と比較した。Ｓｍ４下方調節遺伝子は、ＳＯＸ１８ピークに有意に近く（太字）、しかしＳＯＸ７またはＧＡＴＡ２ピークには近くなかった。 は、インビトロでのＳｍ４選択性のトランスクリプトーム全体の分析（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ－ｗｉｄｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）を示す。（Ａ）ＨＵＶＥＣで行われた、ＳＯＸ１８ ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク（ＭＥＭＥソフトウエア）から特定されたトップモチーフである。（Ｂ）既知のＳＯＸ１８標的遺伝子ＶＣＡＭおよびＰＲＯＸ１に関する、代表的なＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク（矢頭）のＵＣＳＣブラウザビューである。（Ｃ）は、Ｓｍ４のトランスクリプトーム全部の分析に関する条件である。ＳＯＸ１８過剰発現ＨＵＶＥＣにおいて、ＤＥｓｅｑ２を使用して、ビヒクルＤＭＳＯ（ＳＯＸ１８ｏｅ）と２５μＭのＳｍ４（Ｓｍ４）を受容した細胞の間の差次的発現（ＤＥ）を計算した。（Ｄ）４重ＲＮＡ－ｓｅｑサンプルの主要成分分析である。同じ条件（コントロール、ＳＯＸ１８ｏｅ、Ｓｍ４）クラスターからの合わせた反復サンプルである。（Ｅ）ＤＥＳｅｑ２およびｅｄｇｅＲ方法の比較を示すプロットであり、ＳＯＸ１８ｏｅおよびＳｍ４条件の間のＤＥ遺伝子の有意性をマークキングする。ＤＥＳｅｑ２のＬｏｇ２倍数変化≧１または≦－１（破線）を有する転写産物を、更なる分析について考慮した。（Ｆ）Ｓｍ４の影響を受ける遺伝子（紫色）と、特定の転写因子の結合部位の最も近いゲノム位置との間の距離は、累積分布としてプロットされる。差次的に発現した遺伝子のＴＳＳから転写因子の結合イベントの最も近い結合イベントまでの距離の中央値は、偶然に予想される中央値の距離に対する比率として表されました（ランダム遺伝子、緑色）。 は、ｃ－ＪＵＮモチーフがＳＯＸ１８結合部位内で濃縮されていることを示す。（Ａ）ＳＯＸ１８ ＣｈＩＰ－ｓｅｑピークに関するＨＯＭＥＲモチーフ分析は、ｃ－ＪＵＮモチーフ５’－ＴＧＡＣ／ＧＴＣＡ－３’の濃縮を明らかにした。（Ｂ）ＳＯＸ１８－ｃ－ＪＵＮおよびＳＯＸ１８－ＳＯＸ１８（ポジティブコントロール）に関するＡＬＰＨＡ－Ｓｃｒｅｅｎ結合曲線を示し、ｃ－ＪＵＮは、インビトロで、ＳＯＸ１８と直接相互作用する能力を有することを示す。タンパク質は、リーシュマニア・タレントラエ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ）細胞フリータンパク質発現システム内で発現した。 は、Ｓｍ４は、インビトロで、ＳＯＸ９またはＳＯＸ１７活性を妨害しないことを示す。（Ａ）ＳＯＸ９ホモ二量体活性に関する細胞ベースのレポーターアッセイを示す。ＣＯＳ－７細胞を、Ｓｏｘ９およびＣｏｌ２ａ１：ｌｕｃレポーターコンストラクトでトランスフェクトした。Ｓｏｘ９過剰発現は、Ｃｏｌ２ａ１活性化の＞８倍の誘導をもたらした。高濃度のＳｍ４で変化は観察されなかった。（Ｂ）ＳＯＸ１７活性に関する細胞ベースのレポーターアッセイ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、２０１４）を示す。ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）を、ｐＴＫ－β－ｇａｌ（ｐＴＫ）またはＥＣＥ１－ＴＫ－β－ｇａｌ（ＥＣＥ１）レポーターでトランスフェクトし、ＳＯＸ１７（ＥＣＥ１のみ）の内因性活性を測定した。いずれの試験濃度でも変化は観察されなかった。ｘ軸上の数字は、μＭでの［Ｓｍ４］である。 は、Ｓｍ４は、インビボでＳｏｘＦ転写活性を遮断することを示す。（Ａ）ｔｇ（－６．５ｋｄｒｌ：ｅＧＦＰ）ＳｏｘＦレポーターを保有する、６０ｈｐｆのゼブラフィッシュ幼生の側方明視野（上）および蛍光（下）画像を示す。処置は、後期（２０ｈｐｆ）に、ＤＭＳＯ（ネガティブコントロール）若しくは１μＭのＳｍ４のいずれかで開始し、または、幼生には、ｓｏｘ７およびｓｏｘ１８（ｄＭＯ ｓｏｘ７／１８）の両方に対して、モルホリノを用いて注入した。蛍光強度は、ヒートマップとして示される。スケールバーは、２００μｍである。（Ｂ）処置したｔｇ（－６．５ｋｄｒｌ：ｅＧＦＰ）幼生およびｓｏｘ７／１８モルファントにおけるｇｆｐ転写産物レベルに関するｑＲＴ－ＰＣＲ分析であり、この導入遺伝子に関する活性の低下を示す。（Ｃ）ＲｂｐｊおよびＳｏｘＦ転写因子に関する多数の結合部位を持つｔｇ（Ｄｌｌ４ｉｎ３：ｅＧＦＰ）ＳｏｘＦ／Ｎｏｔｃｈレポーターを保有するゼブラフィッシュ幼生の側面画像である。幼生に、ｒｂｐｊに対するモルホリノを注入し、および／または幼生を１３ｈｐｆから２μＭのＳｍ４で処置した。（Ｄ）ｔｇ（Ｄｌｌ４ｉｎ３：ｅＧＦＰ）幼生におけるｇｆｐ転写産物についてのｑＲＴ－ＰＣＲ分析であり、Ｓｍ４処置幼生における組み合わされたＳｏｘＦ／Ｎｏｔｃｈ活性の抑圧を示す。（Ｅ）Ｓｍ４またはＤＭＳＯコントロールで、初期段階（１６ｈｐｆ）から７２ｈｐｆまで処置した幼生における胚死亡率の定量化を示す。（Ｆ）１６ｈｐｆから１．５μＭのＳｍ４で処置した４８ｈｐｆ幼生における血管表現型（動静脈シャント）の浸透率を示す。（Ｇ）１６ｈｐｆから１．５μＭのＳｍ４で処置した４８ｈｐｆ幼生における血行路欠陥の浸透率を示す。（Ｈ）ＤＭＳＯコントロール（点線）に対する、１６ｈｐｆに、１．５μＭのＳｍ４で処置した幼生における、４８ｈｐｆでの内因性内皮転写産物レベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示す。示されるデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 は、Ｓｏｘ９活性は、インビボでの処置により攪乱（ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ）されないことを示す。（Ａ）処置の予定表：ゼブラフィッシュ幼生を軟骨形成中、４日間継続して処置した。実験全体を通して培地を毎日リフレッシュして、Ｓｍ４のレベルを維持した。（Ｂ）軟骨（ｃａｒｔｉｌａｇｅ）を示す、ｔｇ（ｃｏｌ２ａ１：ＹＦＰ）Ｓｏｘ９レポーター幼生（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、２０１３）を示す。ＹＦＰレベルは、Ｓｍ４の存在下で影響を受けず、そして、軟骨形成における変化は観察されなかった。ｍｃ：メッケル軟骨（Ｍｅｃｋｅｌ’ｓ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、ｃｈ：角舌骨（ｃｅｒａｔｏｈｙａｌ）、ｈｓ：舌顎骨（ｈｙｏｓｙｍｐｌｅｃｔｉｃ）。（Ｃ）軟骨形成全体の一連の段階における、ＤＭＳＯコントロールおよびＳｍ４処置幼生のｙｆｐ転写産物レベルのｑＲＴ－ＰＣＲ。 は、Ｓｍ４は、インビボでＳｏｘＦ活性を妨害することを示す。（Ａ）ゼブラフィッシュ幼生におけるＳｍ４処置の予定表である。ＳＯＸＦレポーター遺伝子研究のための処置を、２０ｈｐｆで開始した一方、表現型研究の場合、動静脈特定化の正しい発達時間中（ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｒｉｇｈｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｗｉｎｄｏｗ ｆｏｒ ａｒｔｅｒｉｏｖｅｎｏｕｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に作用するように、処置をそれに先行して開始した。（Ｂ）ＤＭＳＯコントロールおよびＳｍ４処置ｔｇ（ｆｌｉ１：ｅＧＦＰ、－６．５ｋｄｒｌ：ｍＣｈｅｒｒｙ）幼生の躯幹領域（ｔｒｕｎｋ ｒｅｇｉｏｎ）の側面像（Ｌａｔｅｒａｌ ｖｉｅｗ）および横行部分（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ｓｅｃｔｉｏｎ）。コントロールＤＭＳＯ幼生は、明瞭に分離した背側大動脈（ｄｏｒｓａｌ ａｏｒｔａ、ＤＡ）および後主静脈（ＰＣＶ）を形成した。Ｓｍ４処置幼生では、ＤＡが狭窄し、および／またはＰＣＶに融合した（矢頭）。動脈マーカーｅｆｎｂ２ａに対するホールマウントインサイチューハイブリダイゼーションは（Ｗｈｏｌｅ ｍｏｕｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、４８ｈｐｆのＳｍ４処置幼生において、発現の低下およびＤＡ形成の不全を示した（矢）。切片をＤＡＰＩ染色した（青色で）。スケールバー明視野：０．５ｍＭ、蛍光およびインサイチュー２５μｍ。（Ｃ）Ｓｍ４の濃度依存性効果、７２ｈｐｆにおける優勢な表現型の定量化を示す：軽度（尾湾曲）、中度（ＰＣＶの拡張）または重度（動静脈欠陥および／または血行路欠陥（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｄｅｆｅｃｔ））。示した時間枠は、Ｓｍ４処置時間および終点を指す。（Ｄ）Ｓｍ４（１．５μＭ）で処置した幼生における心臓浮腫の頻度の定量化。（Ｅ）ＤＭＳＯコントロール（点線）に対する、Ｓｍ４処置幼生におけるＳｏｘ１８依存性－６．５ｋｄｒｌ：ｍＣｈｅｒｒｙおよび内因性内皮転写産物レベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、２４ｈｐｆにおける動脈および静脈マーカーに対する効果を示す。全ての発現レベルを内皮マーカーｃｄｈ５の発現に対して正規化した。示されるデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 は、転移および腫瘍血管新生は、Ｓｍ４処置により抑制されることを示す。（Ａ）乳癌転移に関するマウスモデルの予定表。４Ｔ１．２腫瘍を０日目に接種し、そして、１２日目に切除した。Ｓｍ４（２５ｍｇ／ｋｇ／日）、アスピリン（２５ｍｇ／ｋｇ／日）またはビヒクルコントロール（ＰＢＳ）を、３日目～１２日目に毎日経口投与した。独立して、実験を行って、生存および転移率を評価した。（Ｂ）処置スキームの過程中（７日目および１２日目）のＳｍ４の血漿濃度は、薬物の良好な全身送達を示す。（Ｃ）インサイチューハイブリダイゼーションにより示される、腫瘍の脈管構造内のＳＯＸ１８の発現。スケールバー１００μｍ。（Ｄ）マウスの生存を監視した（ｎ＝６～１２マウス／グループ）。ビヒクルコントロールおよびアスピリンの両方を超える、Ｓｍ４処置マウスにおける改善された生存が、Ｌｏｇ－ランク試験により分析された（ｐ＜０．００１）。（Ｅ）腫瘍サイズの有意な差異は、いかなる段階でも見出されなかった。（Ｆ）ビヒクルコントロールまたはＳｍ４処置動物のいずれかが癌負荷に屈する前に、肺の表面上の転移性腫瘍小結節を２８日目に定量化した。示されるデータは、１２～１４マウス／グループの平均±ｓ．ｅ．ｍである。（Ｇ）血管密度は、全腫瘍の３００μｍ切片で研究した。明視野の画像は、腫瘍の全体的な形態（破線で概略される）と、主な血管および出血範囲（星形）をマーキングする赤血球の存在とを示す。スケールバー１ｍＭ。（Ｈ）内皮特異的マーカーＥＲＧおよびエンドムチン（ＥＭＣＮ）に関する二重免疫蛍光染色は、腫瘍内および腫瘍周辺の領域内の血管パターン形成および浸透を明らかにする。左：全腫瘍切片（スケールバー１ｍＭ）、中央および右：取り囲んだ領域の引き伸ばし（スケールバー２００μｍ）。（Ｉ）ｎ＝６腫瘍／条件のＥＭＣＮ体積（血管密度）およびＥＲＧ－陽性核（内皮細胞の数）の定量化。各データポイントは、３～４つの代表的な領域（パネルＨの取り囲んだ領域）／腫瘍の平均を表す。両方の条件の平均±ｓ．ｅ．ｍを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｊ）上記のパネル（Ｄ）と同様、ビヒクルまたは増大する濃度のＳｍ４（即ち、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを投与した後にマウスの生存を監視した（ｎ＝６～１２マウス／グループ）。この実験は、Ｓｍ４により改善された生存が用量依存性であることを決定し、この結果は、インビボでの特異的オンターゲットの関与（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）を示唆する。 は、転移および腫瘍血管新生は、Ｓｍ４処置により抑制されることを示す。（Ａ）乳癌転移に関するマウスモデルの予定表。４Ｔ１．２腫瘍を０日目に接種し、そして、１２日目に切除した。Ｓｍ４（２５ｍｇ／ｋｇ／日）、アスピリン（２５ｍｇ／ｋｇ／日）またはビヒクルコントロール（ＰＢＳ）を、３日目～１２日目に毎日経口投与した。独立して、実験を行って、生存および転移率を評価した。（Ｂ）処置スキームの過程中（７日目および１２日目）のＳｍ４の血漿濃度は、薬物の良好な全身送達を示す。（Ｃ）インサイチューハイブリダイゼーションにより示される、腫瘍の脈管構造内のＳＯＸ１８の発現。スケールバー１００μｍ。（Ｄ）マウスの生存を監視した（ｎ＝６～１２マウス／グループ）。ビヒクルコントロールおよびアスピリンの両方を超える、Ｓｍ４処置マウスにおける改善された生存が、Ｌｏｇ－ランク試験により分析された（ｐ＜０．００１）。（Ｅ）腫瘍サイズの有意な差異は、いかなる段階でも見出されなかった。（Ｆ）ビヒクルコントロールまたはＳｍ４処置動物のいずれかが癌負荷に屈する前に、肺の表面上の転移性腫瘍小結節を２８日目に定量化した。示されるデータは、１２～１４マウス／グループの平均±ｓ．ｅ．ｍである。（Ｇ）血管密度は、全腫瘍の３００μｍ切片で研究した。明視野の画像は、腫瘍の全体的な形態（破線で概略される）と、主な血管および出血範囲（星形）をマーキングする赤血球の存在とを示す。スケールバー１ｍＭ。（Ｈ）内皮特異的マーカーＥＲＧおよびエンドムチン（ＥＭＣＮ）に関する二重免疫蛍光染色は、腫瘍内および腫瘍周辺の領域内の血管パターン形成および浸透を明らかにする。左：全腫瘍切片（スケールバー１ｍＭ）、中央および右：取り囲んだ領域の引き伸ばし（スケールバー２００μｍ）。（Ｉ）ｎ＝６腫瘍／条件のＥＭＣＮ体積（血管密度）およびＥＲＧ－陽性核（内皮細胞の数）の定量化。各データポイントは、３～４つの代表的な領域（パネルＨの取り囲んだ領域）／腫瘍の平均を表す。両方の条件の平均±ｓ．ｅ．ｍを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｊ）上記のパネル（Ｄ）と同様、ビヒクルまたは増大する濃度のＳｍ４（即ち、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを投与した後にマウスの生存を監視した（ｎ＝６～１２マウス／グループ）。この実験は、Ｓｍ４により改善された生存が用量依存性であることを決定し、この結果は、インビボでの特異的オンターゲットの関与（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）を示唆する。 は、Ｓｍ４有効性は、手術誘導炎症の結果ではないことを示す。４Ｔ１．２腫瘍を０日目に接種し、そして、腫瘍を切除することなく手術を１２日目に行った（ｎ＝６）。（Ａ）生存（ｎ＝６）を、ＰＢＳビヒクルコントロールマウスおよびＳｍ４処置マウス（２５ｍｇ／ｋｇ／日）にて監視した。差異は観察されなかった（Ｌｏｇ－ランク試験）。（Ｃ）偽手術の前または後の任意の段階で、腫瘍サイズに有意な差異は見られなかった。 は、４Ｔ１．２腫瘍への血管の浸透は、Ｓｍ４により損なわれることを示す。ＰＢＳビヒクルまたはＳｍ４で処置したマウスの全４Ｔ１．２乳房腫瘍からの連続ビブラトーム切片（３００μｍ）の明視野画像である。主血管および出血範囲は、赤色で特定される。 は、Ｓｍ４処置マウスは、腫瘍血管密度の低下を有することを示す。腫瘍切片に対するＥＲＧおよびエンドムチン（ＥＭＣＮ）に関する免疫蛍光染色である。ビヒクルＰＢＳおよびＳｍ４の両方に関する２つの代表的な領域を示す。詳細な引き延ばしにより、ＥＲＧに関する明瞭な核染色、およびＥＭＣＮに関する膜状内皮染色が示される。内皮細胞数および血管体積の定量化を、Ｉｍａｒｉｓにおいて、同一のＸＹＺ寸法を有する画像上で行った。総ＥＭＣＮ＋脈管構造および総ＥＲＧ＋核（ＥＲＧ数およびＥＭＣＮ体積は、黄色で示される）を正確に捕捉するために閾値を選択した。 は、Ｓｍ４処置は、腫瘍誘導リンパ脈管新生を邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｓ）する。ＰＢＳビヒクルまたはＳｍ４（２５ｍｇ／ｋｇ／日）で処置したマウスの全４Ｔ１．２乳房腫瘍からの連続ビブラトーム切片（２００μｍ）のリンパ管画像。リンパ特異的マーカーＰＲＯＸ１およびポドプラニン（ＰＤＰＮ）並びに血管ＥＣマーカー エンドムチン（ＥＭＣＮ）に関する免疫蛍光は、腫瘍内および腫瘍周辺の領域内の脈管パターン形成および浸透を明らかにする。コントロールグループ（上パネル）、およびＳｍ４処置グループ（下パネル）の全腫瘍切片。ｎ≧６腫瘍／条件のＰＤＰＮ＋リンパ管面積（密度、上グラフ）およびＰＲＯＸ１＋核（リンパ内皮細胞の数、下グラフ）の定量化。スケールバー左：０．５ｍｍ、右：０．１ｍｍ。両方の条件に関する平均±ｓ．ｅ．ｍを示す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 は、（Ａ）単分子追跡（ＳＭＴ）実験の原理を示す。ＳＭＴは、生細胞における、ＳＯＸ１８等の転写因子のクロマチン結合動態のリアルタイム画像化を可能にする。ＳＭＴは、ＳＯＸ１８タンパク質のサーチパターンを決定する一方、その標的遺伝子の特異的応答エレメントに結合するゲノムを走査する。（Ｂ）パネルＢは、分子軌跡の二次元追跡と、ＭＡＴＬＡＢを使用した分析とを含む実験ワークフローを示す。ＳＯＸ１８分子は、ＤＮＡに結合し（不動）、または結合せず、そして、核内を自由に拡散する。不動の画分内で、クロマチン上の滞在時間に基づいて、特異的結合または非特異的結合のいずれかの２集団を規定することが可能である。（Ｃ）上；Ｓｍ４は、非特異的結合画分を犠牲にして、ＳＯＸ１８特異的結合画分を濃度依存的に増大させる。下；Ｓｍ４は、特異的に結合したＳＯＸ１８画分の滞在時間を増大する一方、非特異的に結合した画分の滞在時間を低下させる。（Ｄ）：上；Ｓｍ４は、逆に、濃度依存的に非特異的結合画分の利益で、Ｒａｏｐ特異的結合画分を低下させるため、その部分的救済に寄与するＳＯＸ１８ドミナントネガティブ変異体Ｒａｏｐ「Ｒａｇｇｅｄ Ｏｐｏｓｓｕｍ」変異体に選択的に結合する。下；Ｓｍ４は、特異的におよび非特異的に結合したＲａｏｐ画分の滞在時間に対して、ＳＯＸ１８画分に対するものと同じ効果を有するが、効果はより顕著である。 は、（Ａ）単分子追跡（ＳＭＴ）実験の原理を示す。ＳＭＴは、生細胞における、ＳＯＸ１８等の転写因子のクロマチン結合動態のリアルタイム画像化を可能にする。ＳＭＴは、ＳＯＸ１８タンパク質のサーチパターンを決定する一方、その標的遺伝子の特異的応答エレメントに結合するゲノムを走査する。（Ｂ）パネルＢは、分子軌跡の二次元追跡と、ＭＡＴＬＡＢを使用した分析とを含む実験ワークフローを示す。ＳＯＸ１８分子は、ＤＮＡに結合し（不動）、または結合せず、そして、核内を自由に拡散する。不動の画分内で、クロマチン上の滞在時間に基づいて、特異的結合または非特異的結合のいずれかの２集団を規定することが可能である。（Ｃ）上；Ｓｍ４は、非特異的結合画分を犠牲にして、ＳＯＸ１８特異的結合画分を濃度依存的に増大させる。下；Ｓｍ４は、特異的に結合したＳＯＸ１８画分の滞在時間を増大する一方、非特異的に結合した画分の滞在時間を低下させる。（Ｄ）：上；Ｓｍ４は、逆に、濃度依存的に非特異的結合画分の利益で、Ｒａｏｐ特異的結合画分を低下させるため、その部分的救済に寄与するＳＯＸ１８ドミナントネガティブ変異体Ｒａｏｐ「Ｒａｇｇｅｄ Ｏｐｏｓｓｕｍ」変異体に選択的に結合する。下；Ｓｍ４は、特異的におよび非特異的に結合したＲａｏｐ画分の滞在時間に対して、ＳＯＸ１８画分に対するものと同じ効果を有するが、効果はより顕著である。 は、（Ａ）単分子追跡（ＳＭＴ）実験の原理を示す。ＳＭＴは、生細胞における、ＳＯＸ１８等の転写因子のクロマチン結合動態のリアルタイム画像化を可能にする。ＳＭＴは、ＳＯＸ１８タンパク質のサーチパターンを決定する一方、その標的遺伝子の特異的応答エレメントに結合するゲノムを走査する。（Ｂ）パネルＢは、分子軌跡の二次元追跡と、ＭＡＴＬＡＢを使用した分析とを含む実験ワークフローを示す。ＳＯＸ１８分子は、ＤＮＡに結合し（不動）、または結合せず、そして、核内を自由に拡散する。不動の画分内で、クロマチン上の滞在時間に基づいて、特異的結合または非特異的結合のいずれかの２集団を規定することが可能である。（Ｃ）上；Ｓｍ４は、非特異的結合画分を犠牲にして、ＳＯＸ１８特異的結合画分を濃度依存的に増大させる。下；Ｓｍ４は、特異的に結合したＳＯＸ１８画分の滞在時間を増大する一方、非特異的に結合した画分の滞在時間を低下させる。（Ｄ）：上；Ｓｍ４は、逆に、濃度依存的に非特異的結合画分の利益で、Ｒａｏｐ特異的結合画分を低下させるため、その部分的救済に寄与するＳＯＸ１８ドミナントネガティブ変異体Ｒａｏｐ「Ｒａｇｇｅｄ Ｏｐｏｓｓｕｍ」変異体に選択的に結合する。下；Ｓｍ４は、特異的におよび非特異的に結合したＲａｏｐ画分の滞在時間に対して、ＳＯＸ１８画分に対するものと同じ効果を有するが、効果はより顕著である。
定義
本特許明細書では、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、または同様の用語は、非排他的な包含を意味することが意図され、したがって、要素のリストを含む方法または組成物は、それらの要素のみを含むものではなく、列挙されていない他の要素も含み得る。
特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語の全ては、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書で使用される用語「アルキル」は、たとえば、１～約８個の炭素原子、好ましくは１～約７個の炭素原子、より好ましくは１～約６個の炭素原子、更により好ましくは１～約４個の炭素原子を含む直鎖または分枝状アルキル置換基を指す。
そのような置換基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソアミル、２－メチルブチル、３－メチルブチル、ヘキシル、ヘプチル、２－メチルペンチル、３－メチルペンチル、４－メチルペンチル、２－エチルブチル、３－エチルブチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル等からなる群から選択され得る。
参照される炭素数は炭素骨格および炭素分枝に関するが、任意の置換基に属する炭素原子、たとえば、主炭素鎖から分岐するアルキルまたはアルコキシ置換基の炭素原子を含まない。
用語「アルケニル」は、２～８個の炭素原子、好ましくは２～７個の炭素原子、より好ましくは２～６個の炭素原子または２～４個の炭素原子を有し、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を有する、所望により置換された不飽和の直鎖状または分枝状炭化水素基を指す。
適切な場合、アルケニル基は、特定数の炭素原子、たとえば、Ｃ２～Ｃ６アルケニルを含み得、これは直鎖状または分枝状配置における、２、３、４、５または６個の炭素原子を有するアルケニル基を含む。
参照される炭素数は、炭素骨格および炭素分枝に関するが、任意の置換基に属する炭素原子を含まない。
そのような置換基の例は、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、ｓ－およびｔ－ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプタ－１，３－ジエン、ヘキサ－１，３－ジエン、ノナ－１，３，５－トリエン等からなる群から選択され得る。
本明細書で使用される用語「アルコキシアルキル」は、酸素原子により連結された直鎖または分枝鎖アルキル基（即ち、「エーテル」基とも称されるアルキル－Ｏ－アルキル）を意味し、アルキルは上述されている。
特定の実施形態において、アルコキシアルキルは、１～８個の炭素原子（「Ｃ１～８アルコキシアルキル」）を含む、酸素結合基を指す。
更なる実施形態において、アルコキシアルキルは、２～８個の炭素原子（「Ｃ２～８アルコキシアルキル」）、２～６個の炭素原子（「Ｃ２～６アルコキシアルキル」）、２～４個の炭素原子（「Ｃ２～４アルコキシアルキル」）または２～３個の炭素原子（「Ｃ２～３アルコキシアルキル」）を含む酸素架橋基を指す。
列挙した炭素原子数は、アルコキシアルキル／エーテル鎖全体におけるものを指す。
本明細書で使用される用語「所望により置換された」は、フェニルまたはナフチル（ｎａｐｔｈｙｌ）基等の関連基から延び得る置換基を指し、Ｆ、ＣｌおよびＢｒを含むハロ；Ｃ１～Ｃ４アルキル；ＯＲ１２（Ｒ１２はＣ１～Ｃ４アルキルである）；およびＮＲ１３Ｒ１４（Ｒ１３およびＲ１４は、独立して、ＨおよびＣ１～Ｃ４アルキルから選択される）等の官能基を含み得る。
本発明の第１の態様によれば、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物若しくはプロドラッグが提供される：
Figure 2023011613000011
 式中、
Ｒ１は、ＯＨおよびＯＲ６からなる群から選択され、
Ｒ６はＣ１～Ｃ４アルキルであり；
Ｒ２は、Ｈ、ＣＯＯＲ７およびＣ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９からなる群から選択され、
Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、独立してＨおよびＣ１～Ｃ４アルキルから選択され；
Ｒ３は、Ｌ－Ａであり、
Ｌは、Ｃ２～Ｃ８アルキル、Ｃ２～Ｃ８アルケニルおよびＣ２～Ｃ８アルコキシアルキルから選択されるリンカーであり、そして、
Ａは、所望により置換されたフェニルおよび所望により置換されたナフチル（ｎａｐｔｈｙｌ）から選択され；
Ｒ４は、Ｈ、ＯＲ１０、ハロおよびＣ１～Ｃ４アルキルからなる群から選択され、
Ｒ１０は、ＨおよびＣ１～Ｃ４アルキルから選択され；そして、
Ｒ５は、Ｈ、ＯＲ１１、ハロおよびＣ１～Ｃ４アルキルからなる群から選択され、
Ｒ１１は、ＨおよびＣ１～Ｃ４アルキルから選択され、
化合物は、ＳＯＸ１８活性の阻害における使用のためのものである。
実施形態において、Ｒ１は、ＯＨおよびＯＭｅからなる群から選択される。
好適には、Ｒ２は、Ｈ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅおよび
Figure 2023011613000012
 からなる群から選択される。
好ましくは、Ｒ２は、ＣＯＯＨおよび
Figure 2023011613000013
 から選択される。
実施形態において、
Ｒ４は、Ｈ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＣｌおよびＭｅからなる群から選択される。
好適には、Ｒ５は、Ｈ、ＯＨおよびＯＭｅからなる群から選択される。
特定の実施形態において、Ｒ４およびＲ５はＨである。
実施形態において、Ｌは、Ｃ２～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニルおよびＣ２～Ｃ６アルコキシアルキルから選択されるリンカーである。
列挙した実施形態のいずれかにおいて、Ｒ３は：
Figure 2023011613000014
 からなる群から選択される。
式中、破線は、隣接する原子から式Ｉの環への結合を示し、示される構造は、そのＥ／Ｚ異性体を含む。
一実施形態において、第１の態様の化合物は：
Figure 2023011613000015
Figure 2023011613000016
Figure 2023011613000017
からなる群から選択される。
好ましい一実施形態において、本態様の化合物は：
Figure 2023011613000018
Figure 2023011613000019
Figure 2023011613000020
からなる群から選択される。
当業者は、ＳＯＸ１８が転写因子のＳＯＸ（ＳＲＹ関連のＨＭＧ－ボックス）ファミリーのメンバーであることを理解するであろう。
これらの転写因子は、典型的には、胚発達の調節および細胞運命の決定に関与する。
特に、ＳＯＸ１８タンパク質は、他のタンパク質とタンパク質複合体を形成した後、転写レギュレーターとして機能し得る。
ＳＯＸ１８は毛髪、血管、およびリンパ管発達に役割を果たすことが示されている。
ＳＡＳＨ１の別名としては、ＳＲＹ－ボックス１８、ＨＬＴＳおよびＨＬＴＲＳを挙げることができる。
ヒトにおけるＳＯＸ１８遺伝子のヌクレオチド配列、またはそのコードされたタンパク質を参照する受入番号の非限定的な例は、当該技術分野で十分理解されているように、ＮＧ＿００８０９５．１、ＮＭ＿０１８４１９．２およびＮＰ＿０６０８８９．１を含む。
本明細書で一般的に使用される「ＳＯＸ１８」は、特に明記しない限り、ＳＯＸ１８核酸またはコードされたタンパク質を指し得る。
好適には、調節されるＳＯＸ１８活性は、リンパ脈管新生（即ち、現存するリンパ管からの新たなリンパ管の成長）、脈管形成（即ち、胚循環系の新規形成）および／または血管新生（即ち、既存の血管構造からの血管の成長）のものである。これを目的として、第１の態様の実施形態では、式（Ｉ）の１つ以上の化合物は、リンパ脈管新生（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）および／または脈管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）の処置、低減または予防に有用であり得る。
したがって、式（Ｉ）の１つ以上の化合物は、好適には、血管新生－および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態の症状の重篤さの予防および／または軽減に効果を有する。
一実施形態において、ＳＯＸ１８活性は、ＤＮＡ配列および／またはタンパク質に対する接触および／または結合を含む。
この関連で、第１の態様の化合物は、ＳＯＸ１８ ＤＮＡ結合および／またはタンパク質－タンパク質相互作用の阻害を含むがこれに限定されない、血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態の、根底にある細胞シグナル伝達経路の１つ以上に対する効果を有し得る。
ＤＮＡ結合に関連して、ＳＯＸ１８は、そのＨＭＧボックスにより、ＤＮＡに、たとえば、コンセンサス配列５’－ＡＡＣＡＡＡＧ－３’に結合して、この結合を介して転写を転写促進することが可能な転写因子であると理解されるであろう。
更に、ＳＯＸ１８タンパク質は、１つ以上のタンパク質とタンパク質複合体を形成した後、転写レギュレーターとして機能することができる。
本明細書で使用される「遺伝子」は、非限定的に、１つ以上のアミノ酸コード化ヌクレオチド配列と、プロモーターおよび他の５’非翻訳配列、イントロン、ポリアデニル化配列および他の３’非翻訳配列を含む１つ以上の非コード化ヌクレオチド配列とを含み得る、ゲノムの構造的な遺伝子単位である核酸である。殆どの細胞生物において、遺伝子は、二本鎖ＤＮＡを含む核酸である。
本明細書で使用される用語「核酸」は、単鎖または二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを示す。
ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む。
ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｃＲＮＡおよび自己触媒ＲＮＡを含む。
核酸は、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドでもあり得る。
核酸は、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ塩基を含むヌクレオチドを一般に含むヌクレオチド配列を含む。
しかしながら、ヌクレオチド配列は、非限定的に、イノシン、メチルシトシン（ｍｅｔｈｙｌｙｃｙｔｏｓｉｎｅ）、メチルイノシン、メチルアデノシンおよび／またはチオウリジン等の他の塩基を含むことができる。
「タンパク質」は、アミノ酸ポリマーを意味する。
当業者が認識するように、用語「タンパク質」は、その範囲内に、タンパク質のリン酸化形態（即ち、リン酸化タンパク質）および／またはタンパク質のグリコシル化形態（即ち、糖タンパク質）も含む。
「ペプチド」は、５０以下のアミノ酸を有するタンパク質である。
「ポリペプチド」は、５０を超えるアミノ酸を有するタンパク質である。
天然に存在する（たとえば、アレル変異体）およびそのオルソログ等の、ＳＯＸ１８のタンパク質「変異体」も提供される。
好ましくは、タンパク質変異体は、本明細書に開示したまたは当該技術分野で既知のＳＯＸ１８のアミノ酸配列と、少なくとも７０％若しくは７５％、好ましくは少なくとも８０％若しくは８５％、またはより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を共有する。
本明細書で使用される用語「タンパク質－タンパク質相互作用」または「ΡＰＩ」は、２つ以上のタンパク質の間の密接なおよび安定した結合を指す。
これは通常、水素結合等の非共有化学結合の形成を含む。
ＰＰｌは、２成分（２つのタンパク質結合パートナー；二量体）または３成分（３つ以上のタンパク質結合パートナー、たとえば、三量体）であり得る。
ＰＰＩ内のタンパク質（即ち、結合パートナー）は、同じタンパク質（ホモ二量体またはホモ三量体等）または異なるタンパク質（ヘテロ二量体またはヘテロ三量体等）であり得る。
好ましくは、タンパク質相互作用は、好適な条件下で、タンパク質またはタンパク質サブユニットからのＳＯＸ１８の解離が起こり得るように、可逆的である。
好ましくは、そのような力は弱く、たとえば、μＭ範囲内のＫｄ’ｓを有し、したがって、本発明の化合物は、ＳＯＸ１８とタンパク質との間の相互作用を邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔ）することができる。
好ましくは、タンパク質は、ＳＯＸ７、ＲＢＰＪ、ＸＲＣＣ５、ＳＯＸ１８、ＩＬＦ３、ＤＤＸ１７およびそれらの任意の組み合わせからなるリストから選択される。
上記に鑑みれば、コアフェニル環の周囲の基の選択に応じて、ＳＯＸ１８によるＤＮＡ結合および／または特定のタンパク質－タンパク質相互作用の阻害に対して化合物が示す臨床効果を、基の選択に応じて幾分調整することができるのは、第１の態様の化合物の１つの利点である。
いくつかの実施形態では、１つ以上のキラル中心を有する化合物を提供することができる。本発明の化合物のラセミ混合物は、活性で、選択的およびバイオアベイラブルであり得るが、単離された異性体も関心対象であり得る。
本発明の化合物は、本明細書に記載する化合物の立体異性体も含み、１つを超える本発明の化合物を含む組成物は、適宜、そのような立体異性体、たとえば、Ｅ／Ｚ異性体を、個々にまたは任意の割合で混合されて含むことができる。
立体異性体は、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ混合物、およびそれらの組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。そのような立体異性体は、従来の技術を用いて、エナンチオマー出発物質を反応させることにより、または本発明の化合物およびプロドラッグの異性体を分離することにより調製および分離することができる。
異性体は、幾何異性体を含むことができる。幾何異性体の例としては、二重結合において、ｔｒａｎｓ異性体またはｃｉｓ異性体（Ｅ／Ｚ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の化合物の中で他の異性体が想定される。
異性体は、純粋な形態、または本明細書に記載する化合物の他の異性体との混合物のいずれかで使用することができる。
光学活性形態の調製と、活性の決定のための様々な方法が当該技術分野で既知である。そのような方法としては、本明細書に記載する標準的な試験、および当該技術分野で周知の他の同様の試験が挙げられる。本発明による化合物の光学異性体を得るのに使用できる方法の例としては、以下が挙げられる：
ｉ）個々のエナンチオマーの巨視的結晶を手動で分離する、結晶の物理的分離。この技術は、特に、別々のエナンチオマーの結晶が存在する（即ち、材料は集合体である）、および結晶が視覚的に区別される場合に使用することができる；
ｉｉ）個々のエナンチオマーがラセミ体の溶液から別々に結晶化される同時晶析。ラセミ体が固体状態の集合体である場合のみ可能である；
ｉｉｉ）エナンチオマーと酵素との反応速度の違いによる、ラセミ体の部分的または完全な分離である酵素的分離；
ｉｖ）合成の少なくとも１つのステップが、所望のエナンチオマーのエナンチオマー的に純粋なまたは富んだ合成前駆体を得るために酵素反応を用いる合成技術である酵素不斉合成；
ｖ）キラル触媒またはキラル補助剤を使用して達成され得る、生成物に不斉（即ち、キラリティー）をもたらす条件下で、所望のエナンチオマーがアキラルな前駆体から合成される化学不斉合成；
ｖｉ）個々のエナンチオマーをジアステレオマーに変換する、エナンチオマー的に純粋な試薬（キラル補助剤）とラセミ化合物を反応させるジアステレオマー分離。次いで、得られたジアステレオマーを、それらの現時点ではより異なる構造的差異により、クロマトグラフィーまたは結晶化により分離し、キラル補助剤を後に除去して所望のエナンチオマーを得る；
ｖｉｉ）ラセミ体からのジアステレオマーを平衡化して、所望のエナンチオマーからのジアステレオマーを溶液中で優勢にし、または所望のエナンチオマーからのジアステレオマーの優位な結晶化が平衡を攪乱（ｐｅｒｔｕｒｂｓ ）し、それにより最終的に、原則として全ての材料が所望のエナンチオマーからの結晶ジアステレオマーに変換される、第１および第２種不斉転換。
次いで、ジアステレオマーから所望のエナンチオマーが解放される；
ｖｉｉｉ）速度論的条件下でのキラル、非ラセミ試薬または触媒とのエナンチオマーの相異なる反応速度による、ラセミ体の部分または完全分割（または、部分的に分割された化合物の更なる分割）を含む速度論的分割；
ｉｘ）非キラル出発物質から所望のエナンチオマーが得られ、そして、立体化学的完全性は、合成の過程に亘って損なわれずまたは最小限にのみ損なわれる、非ラセミ前駆体からのエナンチオ特異的合成；
ｘ）ラセミ体のエナンチオマーが、固定相とのそれらの異なる相互作用により液体移動相中に分離される、キラル液体クロマトグラフィー。
固定相は、キラル材料から作製されてもよく、または移動相は、異なる相互作用を引き起こすために追加のキラル材料を含んでもよい；
ｘｉ）ラセミ体が揮発し、気体移動相中での固定非ラセミキラル吸着剤相を含むカラムとのそれらの異なる相互作用によりエナンチオマーが分離される、キラルガスクロマトグラフィー；
ｘｉｉ）特定のキラル溶媒への１つのエナンチオマーの優先的な溶解によりエナンチオマーが分離される、キラル溶媒を用いた抽出；並びに
ｘｉｉｉ）ラセミ体が薄膜バリアと接触して置かれる、キラル膜を通した輸送。バリアは一般に、一方がラセミ体を含む２つの混和性流体を分離し、濃度差または圧力差等の推進力により膜バリアを通した優先的な輸送が起きる。ラセミ体の一方のエナンチオマーのみを通過させる、膜の非ラセミキラル特性の結果として、分離が生じる。
第１の態様の化合物は、所望により、１つのエナンチオマーまたはジアステレオマーが過剰に存在し、特に、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上（１００％を含む）の程度まで過剰に存在する、エナンチオマー的にまたはジアステレオマー的に富んだ組成物、たとえば、エナンチオマーまたはジアステレオマーの混合物等で提供され得る。
第１の態様の化合物は、それ自体で使用され、または、適宜、薬学的に許容できるエステル、アミド、塩、溶媒和物、プロドラッグ若しくは異性体の形態で使用され得る。
たとえば、化合物は、薬学的に許容できる塩として提供されてもよい。
使用される場合、薬物化合物の塩は、薬理学的におよび薬学的に許容できる必要があるが、薬学的に許容できない塩は、遊離活性化合物またはその薬学的に許容できる塩の調製に都合よく使用することができ、本発明の範囲から除外されるものではない。
そのような薬理学的におよび薬学的に許容できる塩は、文献に詳細されている標準的な方法を用いて、有機または無機酸との薬物の反応により調製することができる。
本発明により有用な、化合物の薬学的に許容できる塩の例としては、酸付加塩が挙げられる。
しかしながら、薬学的に許容できない酸の塩も、たとえば、化合物の調製および精製に有用であり得る。
本発明による好適な酸付加塩としては、有機および無機酸が挙げられる。
好ましい塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、およびイセチオン酸から形成されるものを含む。
他の有用な酸付加塩は、プロピオン酸、グリコール酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸等を含む。
薬学的に許容できる塩の特定の例としては、硫酸塩、ピロ亜硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン－１，４－二酸塩、ヘキシン－１，６－二酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩（ｍｅｔｈｏｘｙｅｎｚｏａｔｅｓ）、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ－ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン－１－スルホン酸塩、ナフタレン－２－スルホン酸塩、およびマンデル酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。
酸付加塩は、好適な塩基を用いた処理により、遊離塩基に再変換することができる。本発明により有用な化合物またはプロドラッグ上に存在し得る酸部分の塩基性塩の調製は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリエチルアミン等の薬学的に許容できる塩基を使用して、同様の方法で調製することができる。
本発明による化合物のエステルは、化合物中に存在し得るヒドロキシルおよび／またはカルボキシル基の官能化により調製することができる。
アミドおよびプロドラッグも当該技術分野で既知の技術を用いて調製することができる。
たとえば、アミドは、好適なアミン反応関与体を用いてエステルから調製することができ、またはアンモニア若しくは低級アルキルアミンとの反応により無水物または酸塩化物から調製することができる。
更に、本発明の化合物のエステルおよびアミドは、好適な有機溶媒（たとえば、テトラヒドロフラン、アセトン、メタノール、ピリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド）中にて０℃～６０℃の温度でカルボニル化剤（たとえば、ギ酸エチル、無水酢酸、塩化メトキシアセチル、塩化ベンゾイル、イソシアン酸メチル、クロロギ酸エチル、塩化メタンスルホニル）および好適な塩基（たとえば、４－ジメチルアミノピリジン、ピリジン、トリエチルアミン、炭酸カリウム）と反応させることにより作製することができる。
薬学的に許容できる溶媒和物の例としては、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸またはエタノールアミンと組み合わせた本発明による化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の第２の態様によれば、第１の態様の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物若しくはプロドラッグと、薬学的に許容できる担体、希釈剤および／または賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。
好適には、薬学的に許容できる担体、希釈剤および／または賦形剤は、希釈剤、溶媒、ｐＨ緩衝液、結合剤、充填剤、乳化剤、錠剤崩壊剤、ポリマー、滑沢剤、油、脂肪、ワックス、コーティング、粘度調整剤、流動促進剤等の１つ以上であり得またはそれらを含み得る。
本発明の化合物の塩形態は、改善された溶解度に起因して特に有用であり得る。
希釈剤は、微結晶セルロース、乳糖、マンニトール、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、カオリン、乾燥澱粉、粉糖等の１つ以上を含み得る。
結合剤は、ポビドン、澱粉、ステアリン酸、ガム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等の１つ以上を含み得る。
錠剤崩壊剤は、澱粉、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、澱粉グリコール酸ナトリウム等の１つ以上を含み得る。
溶媒は、エタノール、メタノール、イソプロパノール、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン、塩化メチレン、水等の１つ以上を含み得る。
滑沢剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、ステアリルフマル酸ナトリウム、水素化植物油、ベヘン酸グリセリル（ベヘネート）等の１つ以上を含み得る。
流動促進剤は、コロイド状二酸化ケイ素、タルクまたはコーンスターチ等の１つ以上を含み得る。
緩衝液は、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液および炭酸緩衝液を含み得るが、それらに限定されない。
充填剤は、ゼラチン、澱粉および合成ポリマーゲルを含む１つ以上のゲルを含み得るが、それらに限定されない。
コーティングは、フィルム形成剤、溶媒、可塑剤等の１つ以上を含み得る。好適なフィルム形成剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポビドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリエチレングリコール、アクリレート等の１つ以上であり得る。
好適な溶媒は、水、エタノール、メタノール、イソプロパノール、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン、塩化メチレン等の１つ以上であり得る。
可塑剤は、プロピレングリコール、ヒマシ油、グリセリン、ポリエチレングリコール、ポリソルベート等の１つ以上を含み得る。
本発明により有用であり得る賦形剤の非限定的な例を提供する、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｅｄｓ．Ｒｏｗｅ、Ｓｈｅｓｋｅｙ ＆ Ｑｕｉｎｎ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ）が参照される。
薬学的に許容できる担体、希釈剤および／または賦形剤の選択は、少なくとも部分的に、製剤の投与モードに依存することが認識されるであろう。
単なる例として、組成物は、錠剤、カプセル剤、カプレット、散剤、注射用液体、坐薬、遅延放出製剤、浸透圧ポンプ製剤の形態、または投与に有効かつ安全な任意の他の形態であり得る。
好適には、医薬組成物は、下記に記載する哺乳動物における疾病、疾患または状態の処置または予防のためのものである。
好ましくは、医薬組成物は、哺乳動物における血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態の処置または予防のためのものである。
本発明の第３の態様は、有効量の第１の態様の化合物、若しくはその薬学的に有効な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグ、または第２の態様の医薬組成物を投与することにより、血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態を処置または予防するステップを含む、血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態の処置または予防方法に存在する。
本発明の第４の態様は、血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態等の疾病、疾患または状態の処置または予防のための医薬の製造における第１の態様の化合物、またはその薬学的に有効な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグの使用を提供する。
本明細書で一般的に使用される用語「投与している」または「投与」等は、たとえば、特定の経路またはビヒクル等によって化合物または組成物を哺乳動物に導入することを記述する。
投与の経路は、局所、非経口および経腸を含むことができ、経腸は、経口、頬側、舌下、経鼻、肛門、胃腸、皮下、筋内および皮内投与経路を含むが、それらに限定されない。
本明細書で使用される「処置（処理）している」（または「処置する」または「処置」）は、血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態の徴候または症状を、それらの発生開始後に回復させる治療的介入を指す。
血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態に関連した用語「回復させる」は、処置の任意の観察可能な有益な効果を指す。
処置は、対象に対して絶対的な有益である必要はない。
有益な効果は、当業者に既知の任意の標準的な方法を用いて決定することができる。
本明細書で使用される「予防している」（または「予防する」または「予防」）は、血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態の症状、態様または特徴の発症前に開始されて、症状、態様または特徴を予防または軽減する一連の行動（治療的有効量の本明細書に記載した化合物の１つ以上の投与等）を指す。
そのような予防は、対象に対して絶対的な有益である必要はないと理解するべきである。
「予防的」処置は、血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態の症状、態様または特徴を発生する危険性を低減する目的で、血管新生および／若しくはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患若しくは状態の徴候を示さない、または初期徴候のみを示す対象に投与される処置である。
本明細書で使用される「有効量」は、処置されている状態の症状の発生を予防する、または症状の悪化の停止をもたらす、または症状の重篤さを処置および緩和し若しくは少なくとも軽減するのに十分な、関連化合物または組成物の量の投与を指す。
有効量は、患者の年齢、性別、体重等によって、当業者が理解するように変動するであろう。適切な投与量または投与計画は、日常的な治験を介して確認され得る。
本明細書で使用される用語「対象」または「個人」または「患者」は、治療が望ましい任意の対象、特に脊椎動物対象、更に特には哺乳動物対象を指し得る。
好適な脊椎動物としては、霊長類、鳥類、家畜動物（たとえば、羊、雌牛、馬、ロバ、豚）、研究室試験動物（たとえば、兎、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、伴侶動物（たとえば、猫、犬）および捕獲された野生動物（たとえば、キツネ、シカ、ディンゴ）が挙げられるが、これらに制限されない。
好ましい対象は、本明細書に記載した血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態の処置を必要とするヒトである。
しかしながら、前述した用語は、症状が必ず存在することを暗示するものではないことが理解されるであろう。
本明細書で使用される用語「血管新生関連の疾病、疾患または状態」は、過剰な血管成長を含む異常な血管成長に関連した任意の疾患を示す。
血管新生の制御は、特定の疾病、疾患または状態において変更されていることが理解されるであろう。
そのような疾病の多くは、病理学的血管新生（即ち、不適当な、過剰なまたは望ましくない血管形成）を含み、病理学的血管新生は疾病状態を支持し、多くの場合、そのような疾病に関連した細胞および組織損傷に寄与する。
血管新生関連の疾病、疾患または状態（即ち、病理学的血管新生を含むもの）は、多数および様々であり得、たとえば、様々なタイプの癌、慢性炎症性疾病、および血管新生疾病を含み得る。
慢性炎症性疾病、疾患または状態の例としては、クローン病および潰瘍性大腸炎等の炎症性疾患、関節リウマチ、ループス、乾癬、アテローム性動脈硬化症および糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で一般的に使用される用語「リンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態」は、過剰なリンパ管成長を含む異常なリンパ管成長に関連した任意の疾患を示す。
リンパ脈管新生は、成長因子、サイトカインおよびケモカインの複雑なネットワークにより最終的に制御され、癌成長および転移、炎症並びに移植片拒絶を含むがこれらに限定されない多数の病理学的条件下で起こり得る（たとえば、Ｅｌ－Ｃｈｅｍａｌｙ、Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（２００８）；Ｐａｔｅｌ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ Ｏｐｈｔａｌｍｏｌ（２００９）；Ｅｌ－Ｃｈｅｍａｌｙ、Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ Ｒｅｓ Ｂｉｏｌ（２００９）；Ｐｅｐｐｅｒ、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００１）参照）。
転移に関連して、癌細胞は、リンパ管を介してリンパ節および遠隔器官に転移し得、これは多くの場合、原発癌を越える癌細胞の伝播の最初ステップである。
第３および第４の態様の一実施形態では、血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態は、眼科疾病、疾患または状態、特に血管新生を含むものでありまたはそれを含む。
これを目的として、血管新生および／またはリンパ脈管新生は、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、虚血性網膜症、未熟児の網膜症、血管新生緑内障、虹彩血管新生（ｉｒｉｔｉｓ ｒｕｂｅｏｓｉｓ）、角膜血管新生、毛様体炎、鎌状細胞網膜症、角膜損傷中の血管応答および翼状片等の眼科疾病、疾患または状態の発生に中心的な役割を果たし得る。これらの眼科疾病、疾患または状態が進行するにつれて、眼の血管は過剰に増殖し得るだけでなく、新しい血管は弱く、漏れやすく、出血する傾向もあり得る。そのため、新たな異常な血管は、出血し、続いて対象に失明をもたらす場合がある。
第３および第４の態様の一実施形態では、血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態は、癌でありまたは癌を含む。これを目的として、癌の形成および転移は、典型的には、病理学的血管新生を含む。健康な組織と同様に、癌は、栄養素および酸素を提供し、細胞老廃物を除去するために新たな血管形成を必要とする。したがって、病理学的血管新生は、癌の成長および拡大に重要である。
本明細書で一般的に使用される用語「癌」、「腫瘍」、「悪性」および「悪性腫瘍」は、多くの場合、発癌に関連した１つ以上の遺伝子突然変異若しくは他の遺伝子変化を含む無軌道な若しくは異常な分子表現型、腫瘍マーカーの発現、腫瘍抑制因子発現若しくは活性の喪失、および／または無軌道な若しくは異常な細胞表面マーカー発現が付随する、無軌道なまたは異常な細胞増殖、分化および／または転位により特徴付けられる、疾病若しくは状態、または疾病若しくは状態に関連した細胞若しくは組織を指す。
癌は、肉腫、癌腫、リンパ腫、白血病および芽細胞腫等の全ての主要な癌形態を含むがこれらに限定されない、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃａｎｃｅｒｔｏｐｉｃｓ／ａｌｐｈａｌｉｓｔにおけるＮＣＩ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｄｅｘに列挙されているもの等の任意の高悪性度のまたは潜在的に高悪性度の癌、腫瘍または他の悪性腫瘍を含むことができる。
これらは、
乳癌、肺腺癌を含む肺癌、
卵巣癌、頸部癌、子宮癌および前立腺癌を含む生殖器系の癌、
脳および神経系の癌、頭部および頸部癌、
結腸癌、結腸直腸癌および胃癌を含む胃腸癌、
肝癌、腎臓癌、黒色腫および皮膚癌腫等の皮膚癌、
リンパ系癌および骨髄単球性癌を含む血液細胞癌、
膵臓癌および下垂体癌等の内分泌系の癌、
骨および軟組織癌を含む筋骨格癌、
血管腫、血管腫および血管肉腫等の血管癌または新生物を含み得るが、それらに限定されない。
特定の実施形態において、癌は、前立腺癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、腎癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、黒色腫、肝細胞腫、肝細胞癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、血管新生物、たとえば、血管腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｍａ）、血管腫（ａｎｇｉｏｍａ）および血管肉腫並びにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
特定の一実施形態において、第１の態様の化合物または第２の態様の医薬組成物は、前記癌の転移を予防および／または阻害する。
本明細書で使用される「転移」または「転移性」は、循環若しくはリンパ系を介したまたは自然の体腔を介した、悪性癌細胞または新生物の、典型的には腫瘍、癌または新生物の一次病巣から身体内の遠隔部位への転位または移動、およびその後の１つ以上の新たな位置における１つ以上の二次腫瘍またはそのコロニーの発生を指す。
「転移」は、転移の結果として形成された二次腫瘍またはコロニーを指し、そして、微小転移と、局所および遠隔転移とを包含する。
病理学的血管新生およびリンパ脈管新生は、癌転移において重要な役割を果たし得ることが認識されるであろう。
これを目的として、原発癌における血管の形成は、癌細胞を血流に進入させ、身体全体に循環させるだけでなく、一次部位から転移した癌細胞により播種された転移性癌の形成および成長を支持する。
前述した２つの態様の更なる実施形態では、血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態は、腎疾病、疾患または状態でありまたはそれを含む。
好ましくは、腎疾病、疾患または状態は、慢性腎移植片機能不全、原発性腎線維化疾患、蛋白尿、糖尿病性腎症、腎炎症およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
第３および第４の態様の１つの特定の実施形態では、血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態は、アテローム性動脈硬化症でありまたはそれを含む。
これを目的として、アテローム性動脈硬化症における病理学的変化は、少なくとも部分的に、慢性炎症および血管新生に起因し得ることを、当業者は認識するであろう。
更に、ＮＦ－ｋＢ依存性アテローム生成的炎症性応答と、ＳＯＸ１８調節との間の関連性が示されており、ＳＯＸ１８はアテローム性動脈硬化症の発生に役割を果たし得ることが示唆される（Ｇａｒｃｉａ－Ｒａｍｉｒｅｚら、２００５）。
Ｓｏｘ１８は、動脈硬化巣において過剰発現していることも示されており、そして、したがって、疾病病因論の主要な構成要素であり得る（Ｂｒｏｗｎら、２０１４）。
第３および第４の態様の一実施形態では、血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態は、乏毛症・リンパ水腫・毛細血管拡張症症候群（Ｈｙｐｏｔｒｉｃｈｏｓｉｓ－Ｌｙｍｐｈｅｄｅｍａ－Ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）でありまたはそれを含む。
この関連で、乏毛症・リンパ水腫・毛細血管拡張症症候群（Ｈｙｐｏｔｒｉｃｈｏｓｉｓ－Ｌｙｍｐｈｅｄｅｍａ－Ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）は、ＳＯＸ１８遺伝子における突然変異に関連することが認識されるであろう。
第５の態様において、本発明は、対象における癌の転移の予防または阻害方法を提供し、この方法は、有効量の第１の態様の化合物、若しくはその薬学的に有効な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグ、または第２の態様の医薬組成物を対象に投与することにより、癌の転移を阻害または予防するステップを含む。
好適には、癌は、本明細書にて以前に記載したものである。
本発明の第６の態様は、対象におけるＳＯＸ１８活性を阻害、防止または低減する方法に存在し、この方法は、有効量の第１の態様の化合物、若しくはその薬学的に有効な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグ、または第２の態様の医薬組成物を投与することにより、対象におけるＳＯＸ１８活性を阻害、防止または低減するステップを含む。
好適には、ＳＯＸ１８活性は、ＤＮＡ配列および／またはタンパク質に対する接触および／または結合を含む。好ましくは、タンパク質は、ＳＯＸ７、ＲＢＰＪ、ＸＲＣＣ５、ＳＯＸ１８、ＩＬＦ３、ＤＤＸ１７およびそれらの任意の組み合わせからなるリストから選択される。
上記の個々の節に参照した本発明の様々な特徴および実施形態は、変更すべきところは変更して、適宜、他の節にも適用される。
その結果として、１つの節に詳細に記述された特徴は、他の節に詳細に記述された特徴と適宜組み合わせることができる。
以下の実験の節は、本発明の特定の化合物の特性、およびそれらの有効性をより詳細に記載する。
本発明は、本発明の化合物のある特定の実施形態およびそれらの有効性を、本発明を少しも限定することなく説明するものである。
実施例１
材料および方法
化合物の調製
海産物抽出物ライブラリー
オーストラリアおよび南極に亘って収集した海産物ライブラリーから生成したｎ－ブタノール画分のライブラリーをスクリーニングに使用した。
活性画分を純粋な化合物に分画し、これを元の画分と同じ方法で再アッセイした。
南オーストラリアおよび南極に亘って収集した海産物無脊椎動物および藻類の２６８８のサンプルのライブラリーを処理して、ハイスループットバイオアッセイに好適な抽出物ライブラリーを生成した。
ＥｔＯＨ抽出物をデカントし、濃縮し、そして、ｎ－ＢｕＯＨおよびＨ２Ｏ相に分配した後、深い９６ウェルプレートに移動し、＞１０倍濃度の小分子とした一方、塩を除去した。
ｎ－ＢｕＯＨ画分（乾燥残留物の２５ｍｇ／ｍＬ ｗ／ｖ）を、１０－および１００倍希釈（２．５および０．２５ｍｇ／ｍＬ）の後にスクリーニングに使用した。
活性画分をヘキサン、ＣＨ２Ｃｌ２およびＭｅＯＨ中で粉砕し、そして、ＨＰＬＣにより純粋な化合物に分画した。
全化合物を画分として同じ方法でアッセイした。
Ｓｍ１（６－ウンデシルサリチル酸）およびＳｍ２（６－トリデシルサリチル酸）を、元の褐藻類サンプルである、カウロシスティス・セファロルニトス（Ｃａｕｌｏｃｙｓｔｉｓ ｃｅｐｈａｌｏｒｎｉｔｈｏｓ）（ＣＭＢ－０１６７１）の水性ＥｔＯＨ抽出物から精製した。
褐藻カウロシスティス・セファロルニトス（Ｃａｕｌｏｃｙｓｔｉｓ ｃｅｐｈａｌｏｒｎｉｔｈｏｓ）（ＣＭＢ－０１６７１）のサンプルの水性ＥｔＯＨ抽出物を、真空下で濃縮し（４．８ｇ）、そして、ｎ－ＢｕＯＨ（０．８０ｇ）およびＨ２Ｏ（４．０ｇ）可溶性材料に分配した。
ｎ－ＢｕＯＨ可溶性分配物のアリコート（４０ｍｇ）を、ＨＰＬＣ分画（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ Ｃ１８ ５μＭ、２５０×９．４ｍｍカラム、６０％のＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ～１００％のＭｅＯＨで１０分間、次いで１００％のＭｅＯＨで１０分間の４ｍＬ／分の勾配溶出、アイソクラティック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）組成０．０１％のＴＦＡ修飾剤を含む）に供して、６－ウンデシルサリチル酸（Ｓｍ１、５．９ｍｇ、ＲＴ １２．８分）および６－トリデシルサリチル酸（Ｓｍ２、１１ｍｇ、ＲＴ １３．７分）を得た。
Ｓｍ４～Ｓｍ１４－フォーカスされたライブラリー
合成類似体を、ＥｎｄｏＴｈｅｒｍ ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＰｒｉｎｃｅｔｏｎ ＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＵＳＡ）から購入し、ＨＰ－ＬＣ／ＭＳにより純度に関して分析した。
Ｓｍ１５～Ｓｍ４４ ＳＡＲライブラリー
ＳＡＲライブラリーを設計して、サリチル酸骨格の親油性テールの役割および可能な置換基を研究した。
下記に概略した６ステップの合成は、置換安息香酸から開始し、ウィッティヒ（Ｗｉｔｔｉｇ）オレフィン化反応を用いて親油性テールを導入した。
部分的に保護された中間体もＳＡＲライブラリーに含まれていた。
全ての化合物は、ＨＰＬＣにより精製された（純度＞９０％、ＵＶ／ＥＬＳＤ／ＭＳ）。
Figure 2023011613000021
一般的な材料および方法
試薬および無水溶媒（ＴＨＦ、ジクロロメタンおよびアセトニトリル）を受け取ったままで使用した。
反応の進行を、ＵＶ検出を有するＭｅｒｃｋシリカゲル６０ Ｆ－２５４を使用したＴＬＣにより監視した。
シリカゲル６０（Ｍｅｒｃｋ ４０～６３μｍ）をカラムクロマトグラフィーに使用した。
以下の染色溶液を、ＵＶ光に加えて、蛍光ＴＬＣプレートと共に使用した：リンモリブデン酸、アニスアルデヒド／ＥｔＯＨ。
無水条件を必要とする反応は、窒素下で行った。
Ｖａｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ ４００ＭＨｚまたはＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ６００ＭＨｚ分光計上で、ｄ４－ＭｅＯＨまたはＣＤＣｌ３中で、２９８ＫでＮＭＲデータを収集および較正した。
Ｇ１３１６Ａ ＵＶ－Ｖｉｓ検出器、１２００ Ｓｅｒｉｅｓ ＥＬＳＤおよび６１１０四重極ＥＳＩ－ＭＳを装着したＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２００ Ｓｅｒｉｅｓ機器上で、ＨＰＬＣおよび所定の質量スペクトルを得た。
高分解能質量分析法（ＨＲＭＳ）は、Ｂｒｕｋｅｒ ＭｉｃｒｏＴＯＦ質量分析計で行った。
Ｎ，Ｎ－ジエチルベンズアミド（４ａ～ｄ）１の調製のための一般的手順
各々の置換安息香酸から置換Ｎ，Ｎ－ジエチルベンズアミドを調製した。
酸（５ｇ、３２．９ｍｍｏｌ）を、塩化水素の放出が停止するまで、過剰の塩化チオニル（５０ｍＬ）と共に還流した。
過剰の塩化チオニルを減圧下で除去し、そして、トルエン（３×１５ｍＬ）と共に共蒸留した。酸塩化物を、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に溶解し、ジエチルアミン（１３．６ｍＬ、１３１．５ｍｍｏｌ）を０℃で滴加し、そして、室温で一晩撹拌した。
反応混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈し、水（５０ｍＬ）、ブライン溶液で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥した。
有機層を、ロータリーエバポレーター上で除去して粗化合物を得た。
この粗化合物を、フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、純粋なジエチルベンズアミドを得た。
指向された（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）オルトメタル化反応（５ａ～ｄ）２のための一般的手順
ＴＭＥＤＡ（０．５５ｍＬ、３．７ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に、ｓ－ＢｕＬｉ（２．６ｍＬ、３．７ｍｍｏｌ、シクロヘキサン中１．５Ｍ）を－７８℃で加え、そして、１５分間撹拌した後、ＴＨＦ（５ｍＬ）中の１－メトキシ－Ｎ，Ｎ－ジエチルベンズアミド（０．３５ｇ、１．７ｍｍｏｌ）を加えた。
同温で、２時間撹拌した後、無水ＤＭＦ（０．５２ｍＬ、６．８ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。
反応混合物を、室温まで放置して温め、そして、３０分間撹拌した。
６ＮのＨＣｌ水溶液（１０ｍＬ）を加えることにより、反応をクエンチし、そして、酢酸エチル（３×１５ｍＬ）で抽出した。
合わせた有機層を、ブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、そして、ＭｇＳＯ４上で乾燥した。
真空下で溶媒を除去した後、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル、１／２）により精製して生成物を得た。
Ｎ，Ｎ－ジエチルベンズアミド（１０ａ～ｄ）の切断のための一般的手順３
Ｎ，Ｎ－ジエチルベンズアミド（１．３ｍｍｏｌ）を、氷酢酸（３ｍＬ）に溶解し、１０％ＨＣｌ水溶液（３ｍＬ）を加え、そして、混合物を１２時間還流した。
室温に冷却した後、酢酸を減圧下で除去し、水で希釈し、そして、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で抽出した。
有機層をブラインで洗浄し、分離し、そして、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥した。
溶媒を減圧下で除去して生成物を得た。
ウィッティヒオレフィン化反応に関する一般的手順（１２ａ～ｄ）４
ウィッティヒ塩（１．０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）中の懸濁液に、ｔ－ＢｕＯＫ（２．０ｍｍｏｌ）またはＮａＨ（２．０ｍｍｏｌ）を、０℃で加え、そして、３０分間撹拌した。
ＴＨＦに溶解したアルデヒド（０．８ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、そして、室温で一晩撹拌した（反応は、ＮａＨ、エントリー２、４、５、６を使用して、５０℃で行った）。
反応を、水でクエンチし、そして、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）中に抽出した。
有機層をブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮して粗化合物を得た。
この粗化合物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して純粋な生成物を得た。
脱メチル化に関する一般的手順：
方法Ａ（ＢＢｒ ３ を使用する）５
化合物（７４ｍｇ、０．１９２ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（７０ｍＬ）溶液を、－７８℃で、ＢＢｒ３（塩化メチレン中、１．０Ｍ、０．５７６ｍＬ、０．５７６ｍｍｏｌ）で処理した。
この混合物を、－７８℃で、２時間撹拌した後、そして、次いで、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１０ｍＬ）でクエンチした。
混合物を放置して、室温にし、そして、塩化メチレン（３０ｍＬ）で希釈した。
有機層をブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。
脱メチル化に関する一般的手順：
方法Ｂ（ＨＢｒを使用する）６
化合物（１００ｍｇ、０．１９２ｍｍｏｌ）の４８％ＨＢｒ水溶液（３．０ｍＬ）を、３時間加熱還流した。
反応の完了後、放置して室温に戻し、そして、減圧下で蒸発させて粗残留物を得た。
この粗化合物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で抽出し、水（２０ｍＬ）で洗浄した。
有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、そして、濃縮して生成物を得た。
オレフィンの還元に関する一般的方法（１４ａ～ｄ）。
オレフィンの１：１（ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ）溶液に、１０％のＰｄ／Ｃ（１０ｍｏｌ％）を加え、そして、水素雰囲気下で、室温で、２時間撹拌した。
反応の完了後、セライトベッドで濾過した。
濾液を減圧下で除去して、生成物を得た。
タンパク質の調製
マウスＳＯＸ ＨＭＧ断片
マウスＳＯＸ２（グループＢ）、ＳＯＸ１１（グループＣ）、ＳＯＸ６（グループＤ）、ＳＯＸ９（グループＥ）、ＳＯＸ１８（グループＦ）およびＳＯＸ１５（グループＧ）のＨＭＧドメインを、ｃＤＮＡ鋳型（ＩＭＡＧＥ ｃＤＮＡクローンＩＤ：Ｓｏｘ１８：３９６７０８４；Ｓｏｘ９：５３５４２２９；Ｓｏｘ４：６８２２６１８）から、ｐＤＯＮＲＴＭ２２１ ｐＥＮＴＲＹベクターにＢＰクローニングし、配列決定し、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎｇら、２０１２）を用いて、ｐＥＴＧ２０ＡまたはｐＨｉｓＭＢＰ発現プラスミドに組み入れた。
このコンストラクト（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）内に形質転換した。
完全長マウスＳＯＸ１８
Ｎ－末端タグ化マウスＨＩＳ－ＧＳＴ－ＳＯＸ１８を、Ｓｆ９細胞内で組換え的に発現させ、ＧＳＴ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｗｅｄｅｎ）上で精製し、そして、Ｔｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭの還元グルタチオン、ｐＨ８．０）中で溶出した。
マウスＳｏｘ１８のｃＤＮＡクローンをＰＣＲ増幅し、そして、ｐＯＰＩＮ－ＧＳＴベクターにクローニングして、Ｎ－末端タグ化ＨＩＳ－ＧＳＴ－ＳＯＸ１８を生成した。
配列を確認したコンストラクトを、フラッシュＢＡＣＵＬＴＲＡ（ｆｌａｓｈＢＡＣＵＬＴＲＡ）（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）のバキュロウイルスＤＮＡ（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ）と共にツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９細胞に共トランスフェクトして、組換え的に発現されたＨＩＳ－ＧＳＴ－ＳＯＸ１８を得た。
Ｓｆ－９００（商標）ＩＩ血清フリー培地中のＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）を、１．５×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で、５ＰＦＵ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させ、そして、２１℃で１４４時間インキュベートした後回収した。
１００ｍＬの発現培地からの細胞ペレットを、３０ｍＬのリン酸溶解緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭの塩化ナトリウム、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２ｍＭの塩化マグネシウム、１錠の完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（ｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）、ｐＨ７．５）に再懸濁し、そして、氷上で２０秒間超音波処理した。
細胞溶解物を、１７，０００×ｇ、４℃で、４０分間遠心分離した。
上清を、ＤＮＡ分解のために、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と共に、室温で、１時間インキュベートした後、５００μＬのＧＳＴ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｗｅｄｅｎ）と共に混合し、回転輪上で、室温で、１時間インキュベートした。
サンプルを、５００×ｇで、１分間、遠心分離して、上清中の非結合タンパク質を除去した。
樹脂を、更に、５０樹脂体積（ＲＶ）の洗浄緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄し、非結合タンパク質を上記のように遠心分離により除去した。
結合したタンパク質を、３×１ ＲＶ溶離緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭの還元グルタチオン、ｐＨ８．０）を用いて、樹脂から溶離し、上清を、上記のように遠心分離により収集した。
蛍光分極（ＦＰ）を用いたＤＮＡ結合競合アッセイ
ＤＮＡ結合競合アッセイを、黒色３８４ウェルプレート内で、マウス完全長ＳＯＸ１８、またはＳＯＸ－ＨＭＧ断片を用いて行った。
全ての実験は、蛍光標識Ｐｒｏｘ１－ＤＮＡエレメントを使用して行った。
コントロールは、フリー標識ＤＮＡ（低ＦＰミリ－分極指数、ｍＰ）、タンパク質の存在下の標識ＤＮＡ（ネガティブコントロール、高ｍＰ）、並びに競合する過剰の非標識ＤＮＡの存在下の標識ＤＮＡおよびタンパク質（ポジティブコントロール、低ｍＰ）からなっていた。
ＤＮＡ結合競合アッセイを、２５ｕＬで、黒色３８４ウェルプレート内で、マウス完全長ＳＯＸ１８の場合には、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸）（ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、４０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮＨ４ＯＡｃ、１０ｍＭのグアニジニウム、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のＮＰ－４０を有する）を使用し、また、ＳＯＸ－ＨＭＧ断片の場合には、Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ（１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０および１００ｍＭのＮａＣｌ）を使用して行った。
全ての実験は、５’フルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）標識（Ｓｉｇｍａ ＰｒｏｌｉｇｏまたはＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を有する、４０ｂｐ二本鎖Ｐｒｏｘ１－ＤＮＡエレメントを使用して行った。
最適結合レベルは、５ｎＭの標識ＤＮＡの存在下、２００ｎＭのマウス完全長ＳＯＸ１８および６０ｎＭのＳＯＸ－ＨＭＧ断片で得られた。
コントロールは、フリー標識ＤＮＡ（低ＦＰミリ－分極指数、ｍＰ）、タンパク質の存在下の標識ＤＮＡ（ネガティブコントロール、高ｍＰ）、並びに４００倍競合過剰の非標識ＤＮＡの存在下の標識ＤＮＡおよびタンパク質（ポジティブコントロール、低ｍＰ）からなっていた。
化合物に応じて、最終ＤＭＳＯ濃度は２～３．３３％ ｖ／ｖの範囲であった。
タンパク質、ＤＮＡプローブおよび化合物を混合した後、プレートを密閉し、そして、暗所内にて、室温で、５分間、３７℃で１０分間、および室温で３０分間、素早くかき混ぜた後、蛍光分極をＴｅｃａｎ Ｍ１０００Ｐｒｏ（λｅｘｃ＝４８５ｎｍ、λｅｍ＝５２５ｎｍ）上で読み取った。全ての実験は、３回行った。
細胞ベースの機能アッセイ
猿腎臓線維芽細胞様細胞（ＣＯＳ－７）を、ＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、非必須アミノ酸およびＨＥＰＥＳを有するＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１９９５）中で、３７℃、５％のＣＯ２で培養した。
細胞を、９６ウェルプレート内で、８０％のコンフルエンシーまで増殖させ、そして、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ９ ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、０６３６５７８７００１）を使用して、マウスプラスミドｐＧＬ２ Ｖｃａｍ １プロモーターコンストラクト（ＶＣ１８８９）およびｐＳＧ５ Ｓｏｘ１８をトランスフェクトした（Ｈｏｓｋｉｎｇら、２００４、Ｄｕｏｎｇら、２０１４）。
４～６時間のトランスフェクション後、溶解およびルシフェラーゼアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、６０１６７１１）の前に、細胞を、０．５％のＦＢＳ培地中の化合物と共に、更に２４時間インキュベートした。
細胞フリー発現およびＡＬＰＨＡスクリーニング
プラスミドの調製および細胞フリー発現
全てのタンパク質を、増強ＧＦＰ（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙおよびｃＭｙｃ（ｍｙｃ）タグで、遺伝子にコードし、そして、細胞フリー発現ベクターにクローニングした（Ｇａｇｏｓｋｉら、２０１５、Ｓｉｅｒｅｃｋｉら、２０１３）。
翻訳コンピテントのリーシュマニア・タレントラエ抽出物（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ ｅｘｔｒａｃｔ）（ＬＴＥ）を以前記載されたように調製して、タンパク質対を共発現させた（Ｋｏｖｔｕｎら、２０１１、Ｍｕｒｅｅｖら、２００９）。
タンパク質を増強ＧＦＰ（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙおよびｃＭｙｃ（ｍｙｃ）タグで遺伝子にコードし、そして、細胞フリーの発現Ｇａｔｅｗａｙデスティネーションベクター（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｇａｔｅｗａｙ ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ）にクローニングした：
Ｎ－末端ＧＦＰタグ化（ｐＣｅｌｌＦｒｅｅ＿Ｇ０３）、
Ｎ－末端Ｃｈｅｒｒｙ－ｃＭｙｃ（ｐＣｅｌｌＦｒｅｅ＿Ｇ０７）および、
Ｃ－末端Ｃｈｅｒｒｙ－ｃＭｙｃタグ化（ｐＣｅｌｌＦｒｅｅ＿Ｇ０８）（Ｇａｇｏｓｋｉら、２０１５）。
ヒトＲＢＰＪ（ＢＣ０２０７８０）およびＭＥＦ２Ｃ（ＢＣ０２６３４１）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、以前記載されたように、ヒトＯＲＦｅｏｍｅコレクション、バージョン１．１および５．１、並びにヒトＯｒｆｅｏｍｅ ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ ＯＣＡＡコレクション（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から調達し（Ｓｉｅｒｅｃｋｉら、２０１３）、そして、ＡＲＶＥＣ施設、ＵＱ Ｄｉａｍａｎｔｉｎａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにてクローニングした。
エントリークローンｐＤＯＮＯＲ２２３またはｐＥＮＴＲ２０１ベクターを、ＬＲ組換えにより、発現プラスミド内のｃｃｄＢ遺伝子と交換した（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オーストラリア）。
完全長ヒトＳＯＸ１８遺伝子を合成し、そして、ベクターへの移動は、Ｇａｔｅｗａｙ ＰＣＲクローニングを用いて実現した。
翻訳コンピテントのリーシュマニア・タレントラエ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ）抽出物（ＬＴＥ）を以前記載されたように調製した（Ｋｏｖｔｕｎら、２０１１、Ｍｕｒｅｅｖら、２００９）。
３０ｎＭのＧＦＰ鋳型プラスミドおよび６０ｎＭのＣｈｅｒｒｙ鋳型プラスミドをＬＴＥに加え、２７℃で３時間インキュベートすることにより、タンパク質対を共発現させた。
ＡＬＰＨＡＳｃｒｅｅｎを以前記載されたように行った（Ｓｉｅｒｅｃｋｉ ら、２０１４、Ｓｉｅｒｅｃｋｉら、２０１３）。
タンパク質－タンパク質相互作用（ＩＣ５０）の邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）に関するアッセイを、ＬＴＥ中でタンパク質対を発現させ、そして、緩衝液Ｂ中の希釈範囲の試験化合物（０．３～３００μＭ）またはＤＭＳＯ（０．７％ ＤＭＳＯ最終）と共に１時間インキュベートすることにより行った。相互作用の百分率は、３回の独立の実験から次のように計算した：
（Ｉ＿ｃｐｄ／Ｉ＿ＤＭＳＯ）×１００。
ｃＭｙｃ検出キットおよびＰｒｏｘｉｐｌａｔｅ－３８４ Ｐｌｕｓプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、ＡＬＰＨＡＳｃｒｅｅｎを以前記載されたように行った（Ｓｉｅｒｅｃｋｉら、２０１４、Ｓｉｅｒｅｃｋｉら、２０１３）。
関心対象のタンパク質を共発現しているＬＴＥ溶解物を、緩衝液Ａ（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ）中で希釈した。
アッセイのために、緩衝液Ｂ（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のＮＰ４０、０．００１％カゼイン）中の１２．５μＬ（０．４μｇ）の抗ｃＭｙｃ被覆アクセプタービーズを各ウェル内に等分した。続いて、異なる濃度の２μＬの希釈サンプル、および緩衝液Ａ中の２μＬのビオチン標識ＧＦＰ－Ｎａｎｏｔｒａｐを加えた。
プレートを、室温で、４５分間インキュベートした後、緩衝液Ａ中で希釈した２μＬ（０．４μｇ）のストレプトアビジン被覆ドナービーズを加え、そして、暗所内で、室温、４５分間、インキュベートした。
ＡＬＰＨＡＳｃｒｅｅｎシグナルを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で、製造業者の推奨設定（λｅｘｃ＝６８０／３０ｎｍで０．１８秒、３７ｍｓ後にλｅｍ＝５７０／１００ｎｍ）にしたがって、測定した。
得られた鐘形曲線は正の相互作用を示す一方、平坦な線は、タンパク質間の相互作用の欠如を反映する。
各タンパク質対の測定は、３回繰り返した。
結合指数は、下記にしたがって、計算された。
Figure 2023011613000022
Ｉは最大シグナルレベル（フック効果曲線の頂部）であり、Ｉｎｅｇは最小（バックグラウンド）シグナルレベルである。
シグナルを、最強の相互作用に関して得られたＩｒｅｆシグナルに対して正規化した。
タンパク質－タンパク質相互作用（ＩＣ５０）の邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔ）に関するアッセイは、ＬＴＥ中でタンパク質対を発現させ、そして、緩衝液Ｂ中の希釈範囲若しくは単一濃度の試験化合物（０．３～３００μＭまたは５０μＭ）またはＤＭＳＯ（０．７％ ＤＭＳＯ最終）と共に１時間インキュベートすることにより行われた。
相互作用の百分率は：
Figure 2023011613000023
 ×１００として計算した。
３回の独立した実験からのデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．０において、３－パラメーター非線形回帰を用いて適合させた。
共免疫沈降（共ＩＰ）。
共免疫沈降を、以前記載されたように行った（Ｓｉｅｒｅｃｋｉら、２０１４）。
手短には、ＳＯＸ１８－Ｃｈｅｒｒｙ－ｃＭｙｃを、リーシュマニア・タレントラエ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ）細胞フリーのタンパク質発現システム内で、ネガティブコントロールベイトとしてのＧＦＰ－ＲＢＰＪ、ＧＦＰ－ＭＥＦ２ＣまたはＧＦＰコンストラクトと共に共発現させた。
ＮａＣｌを発現タンパク質（２００ｍＭ）に加え、そして、サンプルを１０μＬのＧＦＰ－ナノトラップ被覆ビーズ（ＭＢＰ－ＧＦＰ－Ｎａｎｏｔｒａｐと結合したＮＨＳ活性化セファロース）と共に、回転による穏やかな混合を用いて、４℃で、３０分間、インキュベートした。
続いて、ビーズを２００μＬの洗浄緩衝液（０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および２００ｍＭのＮａＣｌを有するＰＢＳ）で６回洗浄した。
１５μＬの２ｘＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ負荷緩衝液中で、７２℃で、３分間加熱することにより、タンパク質をビーズから解放し、そして、ＮｕＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘ ４～１２％ゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オーストラリア）上で分離した。
ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、オーストラリア）を使用して、ゲルを、ＧＦＰおよびＣｈｅｒｒｙ蛍光に関して走査した。
臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）
ミセルへの蛍光剤、１，６－ジフェニル－１，３，５－ヘキサトリエン（ＤＰＨ）の組み入れに基づいて、臨界ミセル濃度を決定した（ＣｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙおよびＬｏｎｄｏｎ、１９８４）。
小分子およびポジティブコントロール（中性洗剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００および陰イオン性洗剤ＳＤＳ）を低結合９６ウェルプレート内で、１０００μＭから０．１μＭへカスケード希釈した。
希釈は、２００ｍＭのＮａＣｌまたはＦＰ緩衝液中で行った。ＤＰＨは、５μＭで、黒色３８４ウェルプレート内に補充した。
室温で３０分間のインキュベーション後に、蛍光強度（λｅｘｃ＝３６０ｎｍ、λｅｍ＝４３０ｎｍ）を測定して、ＣＭＣ推移をグラフにより概算した。
細胞毒性アッセイ。
アラマーブルーを使用して、細胞毒性を、以前記載されたように決定した（ＭｃＭｉｌｌｉａｎら、２００２）。
ＣＯＳ－７細胞を、黒色壁透明底９６ウェルプレート内で、１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ オーストラリア）中に、ウェル当たり、７０００細胞として播種した。
ＡＴＣＣのＨｅｐＧ２およびＨＥＫ２９３細胞株を、黒色壁透明底３８４ウェル細胞培養プレート内で、１％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ中、１ウェル当たり５０００細胞として播種した。
これらの細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。
段階希釈の化合物を加え、最終ＤＭＳＯ濃度を０．５％ｖ／ｖに調整した。
細胞を更に２４時間インキュベートした。１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００をネガティブコントロールとして使用し、そして、０．５％のＤＭＳＯをポジティブコントロールとして使用した。３７℃で、２時間のインキュベーション後、５μＭアラマーブルーを各ウェルに加え、そして、蛍光を測定した（λｅｘｃ＝５６０ｎｍ、λｅｍ＝５９０ｎｍ）。
データをＰｒｉｓｍソフトウエアを使用して分析した。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いた直接ＤＮＡ結合アッセイ
化合物を、ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のｖ／ｖポリソルベート２０、ｐＨ７．４）中の１％ｖ／ｖのＤＭＳＯにて試験した。１％ ｖ／ｖのＤＭＳＯで補充した同じ緩衝液を、移動相として使用した。
ＤＮＡ小溝バインダーである、ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）、ＤＮＡインターカレターおよび小溝バインダーである、アクチノマイシンＤ、およびＤＮＡインターカレターである、臭化エチジウムを、ポジティブコントロールとして使用した。
ビオチン化（プローブ当たり１つのタグ）二本鎖ＤＮＡプローブを、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓから購入した単鎖逆平行ＤＮＡプローブの標準的なアニーリングルーチン（１００℃で５分間、室温で一晩、および２０℃で保存）を用いて調製し、そして、製造業者の推奨にしたがって、ＣＭ５－ＳＡストレプトアビジンチップ上に固定化した。
流れる緩衝液の流速を２５μＬ／分に設定し、サイクルは、化合物およびアクチノマイシンＤの場合、４分間の会合、４分間の解離、その後の再生のための１０秒間の、１０ｍＭのＧｌｙ－ＨＣｌ、ｐＨ２．５のパルス、および１分間の安定化からなっていた。
ＤＡＰＩはいずれの再生も必要としなかったが、臭化エチジウムの場合、安定化の前に、０．５％ ｖ／ｖのＳＤＳの２５μＬ／分で、４０秒間のパルスを再生のために必要とした。
全てのサンプルおよびコントロールサイクルを、３回行った。
ＤＭＳＯ較正を製造業者の推奨にしたがって、行った。
各注入後、５０％ ｖ／ｖのＤＭＳＯを用いてフローシステムの追加の洗浄を行って、キャリーオーバーを回避した。
実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）上で行い、１つのフローセルを参照として保った。
直接タンパク質結合アッセイ（熱凝集）。
差分静的光散乱研究を、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＳｔａｒＧａｚｅｒ上で、Ｐｒｏｘ１－ＤＮＡまたは推定小分子リガンドのいずれかの存在および非存在下で、マウスＳＯＸ１８－ＨＭＧ（１０９ａａ）を使用して行った。
凝集温度の変化がもはや濃度に依存しない、化合物の濃度を評価するために初期実験を行った。
使用した最終濃度は、ＤＭＳＯの濃度を３％までに制限する必要性に応じて、５００μＭ（Ｓｍ４およびＳｍ１４）～１．５ｍＭ（Ｓｍ５）の範囲であった。
１７ｂｐ Ｐｒｏｘ１－ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、最終濃度１０μＭで使用した。
結合を３回行い、そして、リガンドの存在下、Ｔａｇｇ（凝集温度）の＞２℃の増大により検出した。
Ｔａｇｇは、同じタンパク質バッチを用いて、１回、測定した。
反応を、３％ ｖ／ｖのＤＭＳＯを有するＴｒｉｓ－ＮａＣｌ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８）中で、最終反応容積４５μＬで、１５４μＭのマウスＳＯＸ１８－ＨＭＧ濃度で行った。
これらは、測定前に室温で１時間インキュベートした。タンパク質を１℃／分の速度で２５℃から８０℃に加熱した。
総強度を各サンプルに関して温度に対してプロットし、そして、非線形回帰によりボルツマン方程式に適合させた。
インシリコドッキングおよび分子動力学
リガンド－タンパク質ドッキング
ＳＯＸ１８／ＤＮＡ複合体内へのＳｍ４のインシリコドッキングを、ＬｅａｄＩＴ／ＦｌｅｘＸ（ＢｉｏＳｏｌｖｅＩＴ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行った。
ドッキングは、ＳＯＸ１８－ＨＭＧ／Ｐｒｏｘ１－ＤＮＡ（ｐｄｂ：４Ｙ６０）の構造から全水分子を除去し、そして、タンパク質／複合体全体を可能な結合部位と規定することにより行った。
Ｓｍ４の最良の２０ドッキングポーズを分析し、そして、４つのクラスターに分類した。
ＳＯＸ１８／ＤＮＡは従来の結合ポケットを含まないため、各ポーズクラスターを更に２００ｎｓ長ＭＤシミュレーションにより検証した。
ＭＤシミュレーションは、その異なる結合ポーズにおいて、完全ＳＯＸ１８／ＤＮＡ構造を、Ｓｍ４と使用して行った。
ＭＤシミュレーションの分析により、ポーズの３つが不安定であり、Ｓｍ４を用いると、最初の３～１４ｎｓのシミュレーションで、タンパク質とのその相互作用を破壊、シミュレーションの残りの間、水溶媒中に残留することが明らかとなった。
ＭＤシミュレーションが生成したポーズの１つのみが、全２００ｎｓのシミュレーション中にＳｍ４の安定な結合ポーズを生成した。
同様に、Ｓｍ４、およびＤＮＡを有さないＳＯＸ１８を用いて、ドッキングおよびＭＤシミュレーションを行った。
しかしながら、４－ポーズクラスターのいずれも、ＭＤシミュレーション中に安定な結合配向を生成しなかった。
比較のために、Ｓｍ４を有さない、ＳＯＸ１８／ＤＮＡおよびＤＮＡを有さないＳＯＸ１８に関してＭＤシミュレーションを行い、Ｓｍ４リガンドを有する構造と同様の立体構造および動的挙動を生成した。
タンパク質－タンパク質ドッキング
Ｎｏｔｃｈ１転写複合体とＳＯＸ１８との間のタンパク質－タンパク質ドッキングを、ＣｌｕｓＰｒｏオンラインサーバーバージョン（ｃｌｕｓｐｒｏ．ｂｕ．ｅｄｕ）を用いて、
Ｎｏｔｃｈ１転写複合体およびＳＯＸ１８－ＨＭＧの構造に関して、それぞれｐｄｂ：３Ｖ７９およびｐｄｂ：４Ｙ６０を使用して行った。
ＤＮＡ分子を、ＣｌｕｓＰｒｏがそれらを処理できないため、ドッキング前に除去し、そして、ドッキング後に再建した。
クラッシュするＤＮＡ分子を有するドッキングソリューションは拒絶された。
得られたトップドッキングポーズを出発立体構造として、５０ｎｓ長ＭＤシミュレーションにて使用して、ドッキングポーズを最適化し、そして、多タンパク質複合体の安定性を検証した。
ＭＤシミュレーション
ＡＭＢＥＲ ＭＤソフトウエア「ｐｍｅｍｄ」を使用して、タンパク質およびＤＮＡにｆｆ９９ＳＢ力場を使用し、潜在的な水にＴＩＰ３を使用し、そして、周期的境界条件（ＮＴＰ）、長距離静電気相互作用に関して粒子メッシュエバルト（ＰＭＥ）法、温度カップリングに関して等方圧力カップリング（ｉｓｏｔｒｏｐｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）およびランジュバンサーモスタット（ｇａｍｍａ＿ｌｎ＝１／ｐｓ）を適用して、任意のＭＤシミュレーションを行った。
２ｆｓステップサイズを用いてシミュレーションを行い、ＳＨＡＫＥアルゴリズムを用いて水素に関与する結合を制約した。
Ｓｍ４を用いたＭＤシミュレーションの場合、ＡＭＢＥＲパッケージのＡｎｔｅｃｈａｍｂｅｒを使用して、リガンドに関する力場パラメーターを計算した。
全てのＭＤシミュレーションは、構造を最小化し、そして、位置拘束をゆっくり５ｎｓに亘って低下させることによりそれらを平衡化して行った。
各シミュレーションは、初期速度の割当てに異なる乱数を使用して３回行った。
ＣＯＸ１／ＣＯＸ２酵素アッセイ
Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ製のＣＯＸ１およびＣＯＸ２阻害剤スクリーニングアッセイキット（Ｒｅｆ＃ ７０１０９０および７０１０８０）を使用して、ＣＯＸ阻害活性を測定した。
全ての化合物を、２％ｖ／ｖの最終ＤＭＳＯ中の、単一の２００μＭ濃度で、４回試験した。
化合物を、ヒツジＣＯＸ１またはヒトＣＯＸ２と共に３７℃で１０分間プレインキュベートした後、ＣＯＸ基質アラキドン酸と共に更に３分間インキュベートした。
濃塩酸を添加することにより反応を停止した。
プロスタノイド標準曲線を準備し、そして、酵素イムノアッセイを製造業者の説明の通りに行った。
ＤＭＳＯコントロール、熱不活性化ＣＯＸ酵素を有する１００％阻害コントロール、および２００μＭメクロフェナム酸ポジティブコントロール（強力な非選択的ＣＯＸ１／２阻害剤）を参照のため含めた。
プロスタノイド標準値を、ロジット（Ｂ／Ｂ０）対ｌｏｇ濃度としてプロットし、そして、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．０を使用して、直線回帰に適合させた。
標準曲線線形適合を用いて各サンプル濃度を計算した。
ＳＯＸ１８単分子追跡
図２４Ｂは、Ｃｈｅｎら（Ｃｅｌｌ １５６、１２７４－１２８５；２０１４）に概略されるような、分子軌跡の二次元追跡と、ＭＡＴＬＡＢを使用する分析とを含む、実験的ワークフローを示す。
本発明者らは、不動のＤＮＡ結合部分（％、円グラフに示す）は、１つの同じＤＮＡの位置における滞在時間に応じて、特異的および非特異的の２つのタイプがあることに注目する；滞在時間が短時間（平均１秒未満）の場合、これは非特異的結合（即ち、ランダムＤＮＡ部位への一過性結合）と見なされ、そして、長時間（平均５～６秒を超える）の場合、これは特異的結合（即ち、転写効果を有する標的ＤＮＡ部位へのより長い結合）と見なされる。
不動のＤＮＡ結合部分の滞在時間（棒グラフで示す）も、特異的および非特異的の２つのタイプがある：ＳＯＸ１８分子がＤＮＡに非特異的に（平均１秒未満）または特異的に（平均５～６秒を超える）結合する、秒での時間長。
単分子追跡は、Ｈｅｌａ細胞をＳＯＸ１８－Ｈａｌｏｔａｇレポーターコンストラクトでトランスフェクトした後に行われる。
この発現ベクターにより、本発明者らは、Ｈａｌｏｔａｇシステムによる酵素処理後に、蛍光性となるリガンドの添加後、ＳＯＸ１８タンパク質の単一分子を検出することができる。
リアルタイムイメージングは、ＺＥＩＳＳ ＥＬＹＲＡ超分解能顕微鏡を使用したＴＩＲＦ顕微鏡法（ＨｉＬｏ）の修正バージョンを用いて行われる。
結果
ＳＯＸ１８－ＤＮＡ結合の阻害のための天然産物のスクリーニング
海産物抽出物ライブラリーを、蛍光分極に基づくアッセイ（ＦＰ）を用いて、ＤＮＡに対するＳＯＸ１８タンパク質（完全長ハツカネズミ）の結合の阻害剤に関してスクリーニングした。
本発明者らは、Ｐｒｏｘ１遺伝子の第１のイントロンに見出される、コンセンサスＳＯＸモチーフを持つ蛍光標識オリゴヌクレオチドである、ＳＯＸ１８直接標的を選択した（Ｆｒａｎｃｏｉｓら、２００８）（図１Ａ）。
ライブラリーは、５０，０００以上の構造を含む、２，０００の精製代謝物および２，６８８の海産物抽出物を含む。
この一次スクリーニングは、様々な門から収集した、１６の活性な抽出物、即ち、海綿（１０）、藻類（５）および尾索類（１）を特定した（ヒット率０．６％、一次スクリーニングＺ’値＝０．６２）（Ｚｈａｎｇら、１９９９）。
続く抽出物解析は、生物学的に活性な分子の効力および存在量に基づいて優先順位をつけられ、最も活性な抽出物は、２つの活性化合物：６－ウンデシルサリチル酸（Ｓｍ１）、および６－トリデシルサリチル酸（Ｓｍ２）を生成する褐藻カウロシスティス・セファロルニトス（Ｃａｕｌｏｃｙｓｔｉｓ ｃｅｐｈａｌｏｒｎｉｔｈｏｓ）に由来した（図１Ｂ）。
Ｓｍ１およびＳｍ２の両方に関する用量応答スクリーニングは、高いマイクロモル範囲にて阻害効果（ＩＣ５０）をもたらした（図１Ｃ）。
両方の活性化合物は、大きい脂肪族基を有するサリチル酸骨格を含む。
フォーカスされたライブラリーの設計および一次スクリーニング。
次のステップにおいて、本発明者らは、類似体の小ライブラリーを設計して、サリチル酸（ヒドロキシル安息香酸）活性骨格を検証し、その構造－活性関連性プロファイルを研究した。
図２Ａに示した選択は、類似するレゾルシノール骨格（カルボキシル酸を更なるヒドロキシルで置き換えている）を有する化合物、並びに類似するサリチル酸またはアントラニル酸骨格（ヒドロキシルをアミンで置き換えている）を含む多数の承認されたＮＳＡＩＤも含んでいた。
ライブラリーを購入し、ＦＰアッセイを用いて、ＳＯＸ１８－ＤＮＡ結合の阻害に関してスクリーニングした。
このアッセイでは、高親和性タンパク質－ＤＮＡ相互作用の邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）には、特に両親媒性および高ｌｏｇＰ分子の場合、凝集が起こり得る高いマイクロモル範囲の阻害剤濃度を必要とした（Ｉｒｗｉｎら、２０１５）。
したがって、化合物を臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）に関して、対抗スクリーニングして、凝集体またはミセル形成化合物を偽陽性として除外した（表１、列２および５、並びに図２Ｂ）。
ＣＭＣアッセイでは、２０および３０μＭでＣＭＣを示す５つの化合物、Ｓｍ３、Ｓｍ６、Ｓｍ７、Ｓｍ９およびＳｍ１０を除外した（表１、列２）。
その他は、１０００μＭまでミセル形成を示さず、そして、ＳＯＸ１８－ＤＮＡ結合アッセイに含めた。
Ｓｍ１およびＳｍ２のＣＭＣは、化合物の供給不足のため決定することができなかった。
ＳＯＸ１８－ＤＮＡ結合アッセイは、１０００μＭ未満のＩＣ５０値を有する７つの化合物を特定し、Ｓｍ４およびＳｍ１４の２つは、元のヒットＳｍ１およびＳｍ２（約３５０μＭのＩＣ５０）と比較して、改善された約１００μＭのＩＣ５０値を示した（表１、列１；図２Ｃ）。
興味深いことに、３つのアントラニル酸類似体、メクロフェナム酸、ニフルミン酸およびフルフェナミン酸の全ても、１００～４００μＭ範囲のＩＣ５０値の活性を示す（表１、列１；図２Ｃ）。
小分子の可能な結合部位を特定するために、より短い、ＤＮＡ結合を中心に置くタンパク質断片を用いてＦＰアッセイを繰り返した。
ＳＯＸ ＴＦのＤＮＡ結合ドメインは、７９アミノ酸長の高移動度（Ｈｉｇｈ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｇｒｏｕｐ）（ＨＭＧ）ボックスからなる。
１０９アミノ酸長のＳＯＸ１８断片（ＳＯＸ１８［１０９］）は、残基６９－１７７（マウスＳＯＸ１８によるナンバリング）に対応し、これはＨＭＧボックス（残基７８－１４９）並びに各々９および２８アミノ酸のＮ－およびＣ－末端隣接配列を含む。
ＳＯＸ１８［１０９］断片を用いたＦＰアッセイは、完全長ＳＯＸ１８（データは示さず）とほぼ同一のＩＣ５０値を示し、小分子は、タンパク質のこの１０９ａａ部分と相互作用することが示唆された。
結合選択性
分子の観点から、ＳＯＸ１８－ＤＮＡ結合の阻害剤は、ＤＮＡ若しくはタンパク質と直接相互作用するか、またはタンパク質とＤＮＡの界面で相互作用することにより作用し得る。
ＤＮＡへの小分子の直接の結合は、他のＴＦに関して報告されてはいるが（Ｌｅｕｎｇら、２０１３）、非特異的ＤＮＡ結合の可能性があり、これは、遺伝毒性、変異原性または発癌性をもたらす可能性がある。
そのために、本発明者らは、直接結合アッセイを開発して、活性化合物がＤＮＡまたはタンパク質と直接相互作用するか否かを決定した。
表面プラズモン共鳴ベースの方法を開発して、ストレプトアビジンチップの表面上に固定化されたビオチン化二本鎖ＤＮＡに対する小分子の結合を分析した。
この方法は、結合速度（ｋｏｎ）、解離速度（ｋｏｆｆ）および結合定数（ＫＤ）を測定し、そして、２つの異なるＤＮＡ配列：ＳＯＸ結合部位コンセンサスＤＮＡ、およびスクランブルＤＮＡに対する結合の測定に使用された。
インターカレーター剤である、臭化エチジウムおよびアクチノマイシンＤ、並びに小溝バインダーである、４’，６－ジアミノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を、非選択的ＤＮＡ結合に関するポジティブコントロールとして使用した。
全てのポジティブコントロールは、ＤＮＡ配列に無関係のＫＤを示し、そして、文献と一致した。
この分析は、ＳＯＸ１８阻害剤のいずれも、コンセンサスまたはスクランブルＤＮＡに対する結合を示さないことを示した（図３Ａおよび３Ｂ）。
阻害剤がタンパク質と直接相互作用するか否かを研究するために、本発明者らは、タンパク質変性平衡の、より高温への移動を評価することによって、得られたＳＯＸ１８熱安定性の増大を測定した（ＳｈｒａｋｅおよびＲｏｓｓ、１９９２、ＳｈｒａｋｅおよびＲｏｓｓ、１９９０、ＢｒａｎｄｔｓおよびＬｉｎ、１９９０、Ｆｕｋａｄａら、１９８３）。
これを目的として、本発明者らは、タンパク質－阻害剤複合体凝集の読み取りとして静的光散乱を用いた（Ｍｉｔｔａｌら、２０１４、Ｓｅｎｉｓｔｅｒｒａ ら、２００６、Ｓｅｎｉｓｔｅｒｒａら、２００８、ＳｅｎｉｓｔｅｒｒａおよびＦｉｎｅｒｔｙ、２００９、Ｓｅｎｉｓｔｅｒｒａら、２０１２）。
ＨＭＧのみのＳＯＸ１８［１０９］断片、およびＳＯＸモチーフで装飾したＤＮＡプローブをポジティブコントロールとして使用して熱安定性を測定した。
Ｓｍ４、Ｓｍ５およびＳｍ１４を、全てのＳＯＸ１８の潜在的な結合部位を飽和する濃度、各々、Ｓｍ４およびＳｍ１４では５００μＭ、およびＳｍ５では１．５ｍＭで試験した。
これらの最大リガンド結合状態においては、温度依存性タンパク質凝集はもはや結合部位占有により制限されず、そして、プラトーに到達するまで測定された。
各阻害剤は、３℃を超えるＴａｇｇの増大を示し、これはタンパク質に対する阻害剤の直接的な相互作用と一致する（図３Ｃ）。
両方の結合試験をまとめると、結果は小分子阻害剤がＤＮＡと直接相互作用することなく、ＳＯＸ１８タンパク質と相互作用することを示す。
加えて、ＦＰアッセイおよび熱安定性アッセイのデータの組み合わせは、阻害剤－タンパク質相互作用部位が、ＳＯＸ１８－ＨＭＧボックス内またはこのボックスの直近に位置することを示唆する。
ＳＯＸ ＤＮＡ結合阻害選択性
全てのＳＯＸタンパク質のＤＮＡ結合ドメインは高度に保存され、哺乳動物精巣－決定因子ＳＲＹのＨＭＧドメインと４６％配列同一性を共有するが（Ｂｏｗｌｅｓら、２０００、Ｇｕｂｂａｙら、１９９０）、ＨＭＧドメインに隣接するＳＯＸ ＴＦの残りのドメインは、低いレベルの類似性を示す。
ＳＯＸ１８阻害剤の選択性を研究するために、異なるＳＯＸタンパク質からのＨＭＧのみのタンパク質断片を、既知のＳＯＸモチーフ、５’ＡＡＣＡＡＴ３’を持つ、蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用するＤＮＡ結合ＦＰベースアッセイに使用した。
異なるＳＯＸ ＴＦは：ＳＯＸ２（グループＢ）、ＳＯＸ１１（グループＣ）、ＳＯＸ６（グループＤ）、ＳＯＸ９（グループＥ）、ＳＯＸ１８（グループＦ）およびＳＯＸ１５（グループＧ）を含む。
最も活性な阻害剤Ｓｍ４を全ての異なるＳＯＸ ＴＦに対して評価し、全てのケースでＤＮＡ結合阻害を示し（ＩＣ５０は、約２００～３００μＭ）、ＳＯＸ１８およびＳＯＸ１５に関して僅かな優先度を有し（ＩＣ５０は、他の２７０～３１０μＭに対して約２００～２２０μＭ）、ＤＮＡ結合における邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）に関しては、阻害剤はＳＯＸ ＴＦに対して非選択的であることが示唆された（図３Ｄ）。
オフターゲット分析
ＣＯＸ阻害
サリチレートは、プロ炎症性プロスタグランジンのシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）依存的産生の直接または非直接的抑制を介して作用するＮＳＡＩＤの重要なクラスである（Ｐｉｌｌｉｎｇｅｒら、１９９８）。
この研究では、本発明者らは、ＣＯＸ阻害剤に構造的類似性を有するＳＯＸ１８阻害剤を特定し、ＮＳＡＩＤおよび新規なＳＯＸ１８阻害剤の間の任意の機能的重複を研究するために、本発明者らは、構造的に類似したＮＳＡＩＤをＳＯＸ１８研究に含めた。
同様に、本発明者らは、新規なＳＯＸ１８阻害剤がＣＯＸ１／２酵素活性を阻害するか否かを研究した。Ｓｍ４、Ｓｍ５、Ｓｍ８、Ｓｍ１１、Ｓｍ１２、Ｓｍ１３およびＳｍ１４のＣＯＸ－１およびＣＯＸ－２阻害効果を、商業的なＣＯＸ－１／２ ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、メクロフェナム酸をポジティブコントロールとして使用して評価した。
ＳＯＸ１８阻害剤のいずれも、濃度２００μＭまでＣＯＸ－１またはＣＯＸ－２阻害活性を示さなかった（図Ｓ１Ａ、Ｓ１Ｂ）。
オフターゲットプロファイリング
本発明者らは、更に、本発明者らのリードのＳｍ４の潜在的なＳＯＸ１８－非依存性効果を、広範囲の潜在的なオフターゲット効果に関与する（表４）、Ｇ－タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャネル、膜受容体、キナーゼおよび非キナーゼ酵素、並びに核受容体を含む様々な受容体、酵素および輸送体に対する放射性リガンド結合アッセイのＥｕｒｏｆｉｎｓ－ＣＥＲＥＰ／Ｐａｎｌａｂｓパネルを用いて、調査した。
一連の組換え－酵素蛍光定量アッセイを用いて、多数の後生的修飾因子も試験した。
有意な阻害（＞５０％）は１０μＭで観察されず、Ｓｍ４選択性と、更なる薬物開発の可能性が示された。
ＳＯＸ１８タンパク質－タンパク質相互作用
ＳＯＸ転写因子の高度に保存されたＨＭＧドメインは、タンパク質－ＤＮＡおよびタンパク質－タンパク質相互作用の両方に関与することが報告されている（ＡｇｒｅｓｔｉおよびＢｉａｎｃｈｉ、２００３、Ｐｒｏｋｏｐら、２０１２、Ｈｕａｎｇら、２０１５）。
したがって、ＨＭＧドメインに直接、またはこのドメインの直近に結合する化合物は、直接、またはＳＯＸ１８タンパク質の立体構造に対するアロステリック変化のいずれかにより、ＳＯＸ１８－ＤＮＡおよびＳＯＸ１８－タンパク質相互作用の両方を調節する可能性を有する。
本発明者らの小分子が、ＳＯＸ１８－タンパク質相互作用を調節する可能性を研究するために、本発明者らは、内皮細胞の転写調節に関与することが既知の２つのＳＯＸ１８ ＰＰＩを選択した：
ＭＥＦ２Ｃは、ＧＳＴプルダウンアッセイにおいてＳＯＸ１８に結合することが報告され（Ｈｏｓｋｉｎｇら、２００１）、および、
ＲＢＰＪは、ＳＯＸ１８と遺伝子的に相互作用することが報告されているが、直接結合は未だ特定されていない（Ｓａｃｉｌｏｔｔｏら、２０１３）。
加えて、ＸＲＣＣ６（ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＩＩ）を、ネガティブコントロールとして、非結合パートナーとして選択した。
本発明者らは、タグ化タンパク質の発現に、細胞フリーの発現システムを使用して、ＰＰＩ阻害を分析し、そして、これをＡＬＰＨＡＳｃｒｅｅｎ技術（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ）と組み合わせ、タグ化タンパク質の近似（ｐｒｏｐｉｎｑｕｉｔｙ）を測定することができるようにした（Ｓｉｅｒｅｃｋｉら、２０１３）。
この手法によって、ＳＯＸ１８とその既知のパートナーＭＥＦ２Ｃとの間の直接的なペアワイズ相互作用が確認され、そして、ＳＯＸ１８とＲＢＰＪとの間の直接ＰＰＩが明らかとなった（図４Ａ、左パネル）。
直接的な物理的相互作用を、標準的な共免疫沈降を用いて更に検証した（図４Ａ、右パネル）。
次に、本発明者らは、本発明者らの最も強力な小化合物、Ｓｍ４、並びにメクロフェナム酸、ニフルミン酸およびフルフェナミン酸が、ＳＯＸ１８－ＭＥＦ２ＣまたはＳＯＸ１８－ＲＢＰＪ相互作用を邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔ）する能力を研究した。Ｓｍ４は、４２．３μＭのＩＣ５０で、ＳＯＸ１８－ＲＢＰＪ相互作用を邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔ）するが、しかし、ＳＯＸ１８－ＭＥＦ２Ｃ相互作用には効果を有さなかった（図４Ｂ、左上および右上パネル）。
逆に、フルフェナム酸は、ＳＯＸ１８－ＭＥＦ２Ｃ相互作用を邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔ）する一方（２９．１μＭのＩＣ５０）、ＳＯＸ１８－ＲＢＰＪ相互作用は僅かに邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔ）するのみであった（～４４４μＭのＩＣ５０）（図４Ｂ、左上および右下パネル）。
他のＮＳＡＩＤは、ＰＰＩのいずれに対しても、殆どまたは全く効果を示さなかった。
ＳＡＲライブラリー
ＳＯＸ１８－ＤＮＡ結合およびＳＯＸ１８／ＲＢＰＪのＰＰＩのサリチル酸タイプの阻害剤の構造－活性関連性（ＳＡＲ）を、類似体の別個のライブラリーを用いてより詳細に研究した。
このライブラリーは、以下を含む、Ｓｍ４のいくつかおよび他のサリチレートの特有の特徴の有意性をクエリーするよう設計された：
サリチレート芳香族環の電子密度、
β―ヒドロキシルカルボン酸モチーフの２つの酸の水素の有意性、
親油性テールを有する、飽和－またはエチレン結合、並びに
親油性テールの構造および親油性。
本発明者らは、３０の類似体、Ｓｍ１５～Ｓｍ４４を合成し（図５）、これをＨＭＧのみのＳＯＸ１８［１０９］断片に対するＤＮＡ結合の阻害、およびＳＯＸ１８－ＲＢＰＪ相互作用の邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）に関してスクリーニングした（上および下パネル）。
加えて、多数のこれらの類似体（即ち、Ｓｍ４、Ｓｍ１７～Ｓｍ２４、Ｓｍ２６、Ｓｍ３１、Ｓｍ３４、Ｓｍ３７およびＳｍ４０～Ｓｍ４２）も、前述したＡＬＰＨＡＳｃｒｅｅｎアッセイを用いて、ＳＯＸ１８－ＳＯＸ１８ホモ二量体化の相互作用の邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）に関して試験した。
図５に示すように、Ｓｍ４、Ｓｍ１７～Ｓｍ２３、Ｓｍ２６、Ｓｍ３１、Ｓｍ３４、Ｓｍ３７、Ｓｍ４０およびＳｍ４１は、濃度５ｕＭで、ＳＯＸ１８－ＳＯＸ１８ホモ二量体化に関連した幾分かの阻害活性を示した。
このライブラリーを、２つの細胞株、ＨＥＫ２９３およびＨｅｐＧ２に対する一般的細胞毒性に関してもスクリーニングして、それらの開発可能性を評価した（表３）。
多くの生化学的ハイスループットスクリーニングで偽陽性として作用する、雑多なフリークエントヒッター（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｈｉｔｔｅｒｓ））に共通の潜在的なＰＡＩＮＳ（パンアッセイ干渉化合物Ｐａｎ Ａｓｓａｙ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）の化学部分を、インシリコプレディクター（ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）「ＦＡＦ－Ｄｒｕｇｓ３」（ｈｔｔｐ：／／ｆａｆｄｒｕｇｓ３．ｍｔｉ．ｕｎｉｖ－ｐａｒｉｓ－ｄｉｄｅｒｏｔ．ｆｒ／）（ＢａｅｌｌおよびＨｏｌｌｏｗａｙ、２０１０、Ｌａｇｏｒｃｅら、２００８）を使用して分析した。
合計で３つのみの化合物が、ＰＡＩＮＳ部分でフラグ（ｆｌａｇｇｅｄ）された（Ｓｍ１４、Ｓｍ４０およびＳｍ４４）。
Ｓｍ１４は、メチレン－チアゾロンモチーフ、または反応性α，β－不飽和カルボニル基を含む一方、Ｓｍ４０およびＳｍ４４の両方は、酸化的で不安定なカテコール基を含む（表２）。
Ｓｍ４０およびＳｍ４４はＦＰアッセイで活性ではなかった一方、Ｓｍ１４は結合アッセイを越えて追及しなかった。
加えて、新たなライブラリーを「Ａｇｇｒｅｇａｔｏｒ Ａｄｖｉｓｏｒ」データベースを使用して、潜在的なアグリゲーターに関して分析したが、いずれも既知のアグリゲーターに対する類似性を示さず、そして、全て中程度の親油性を示し、ｌｏｇＰ値は５．８未満であった（表３）。
ＳＯＸ１８－ＤＮＡ結合阻害に関するＳＡＲ
活性データは、ＳＯＸ１８－ＤＮＡ結合阻害に関する幾分かの明らかなＳＡＲを示し、β―ヒドロキシルまたはカルボン酸の両方またはいずれか１つの任意のエーテル化、エステル化またはアミド化による活性の低下または消失があった。
興味深いことに、ヒドロキシルによるカルボン酸の置き換えは、化合物の阻害活性を低減するにも関わらず許容される。
同様に、小電子供与基でパラ置換されたサリチル酸は、同様の活性を示し許容される；しかしながら、酸性の低下は、細胞毒性を増大させると思われる。
芳香族テールの場合、ナフチルをフェニル（Ｓｍ２２）で置き換えると、全ての活性が完全に消失した。
この小ライブラリーから、Ｓｍ４の不飽和類似体である、Ｓｍ２０のみが、Ｓｍ４と同様に、ＳＯＸ１８－ＤＮＡ結合阻害活性および低い細胞毒性を示した（図５）。
ＳＯＸ１８－ＲＢＰＪタンパク質－タンパク質結合阻害に関するＳＡＲ
類似体を最初に５０μＭで試験した。
次いで、５０％を超える阻害を示す化合物を、より低い５μＭで再試験した。
同様に両方の濃度で試験したリード化合物Ｓｍ４を有するまたは有さない、ビヒクル溶媒の存在下、活性を、ＳＯＸ１８－ＲＢＰＪのコントロールレベルと比較する。
図４Ｂに示すＩＣ５０プロット（右上パネル）から予想されるように、５０μＭのＳｍ４による阻害は、ほぼ完全であり（１１．９±５．６％、図５、下パネル）、そして、５μＭで僅か（ｍａｒｇｉｎａｌ）である。
５０μＭの高濃度では、全ての試験化合物の半分は、強い活性を示したが、Ｓｍ１８、Ｓｍ１９、Ｓｍ２６、Ｓｍ３４およびＳｍ４０のみは、５μＭで依然として高い活性を有し、Ｓｍ２６は中程度に活性のままであった。
興味深いことに、これら５つの強力なＰＰＩ阻害剤のいずれも、タンパク質－ＤＮＡ結合は阻害しなかった。
ＳＯＸ１８－ＲＢＰＪタンパク質－タンパク質相互作用の阻害のパターンは、ＳＯＸ１８－ＤＮＡ相互作用の阻害よりも明確ではない。
ビニルナフタレンを含む化合物の数個は、ＰＰＩ阻害において活性であるが；活性はリンカーの剛性の増大によるものか、またはＭｉｃｈａｅｌアクセプターとしてのビニル－芳香族基の活性によるものかは明らかではない。
このライブラリーの明確な特徴は、ジエチルアミドまたはポリヒドロキシル／メトキシ含有化合物は、５０μＭでＰＰＩ阻害を示すため、遊離カルボキシレートはＰＰＩ活性に必要ではないが、ＤＮＡ結合の阻害は示さないことである。
最後に、ＤＮＡおよびＰＰＩの両方を阻害するＳｍ４およびＳｍ２０を除き、ＰＰＩおよびＤＮＡ結合阻害の間には殆ど重複はない。
構造研究
ＳＯＸモチーフを持つＤＮＡに結合したマウスＳＯＸ１８－ＨＭＧドメインの三次元構造が、Ｘ線結晶構造解析により最近決定され（Ｋｌａｕｓら、２０１６）、他のＨＭＧドメインと高い類似性を示している。
しかしながら、Ｓｍ４の存在下でＤＮＡに結合したＳＯＸ１８ ＨＭＧドメインを共結晶化する試みでは、阻害剤の電子密度が検出できなかったため、阻害剤の結合ポケットを特定できなかった。
このことは、Ｓｍ４のタンパク質／ＤＮＡ邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）特性に起因する可能性があった。
Ｓｍ４の可能な結合部位を評価するために、本発明者らは、ＳＯＸ１８／ＤＮＡ結晶構造を使用して、インシリコドッキングおよび分子動力学計算を用いた。
ＳＯＸ１８－ＨＭＧドメイン内の規定された結合ポケットの非存在下で、インシリコドッキングは、数個の可能な結合ポーズを生成し、これらを分子動力学（ＭＤ）シミュレーションにより更に検証した。
これらのシミュレーションは、２００ｎｓの全シミュレーション時間の間、安定なままであった１つの結合ポーズを特定した。
比較して、他の全てのポーズにおいて、阻害剤は３～１４ｎｓ後にそのタンパク質相互作用を破壊し、タンパク質接触を有さずに周囲の溶媒中に残留した。
同様に、ＤＮＡを有さないＳＯＸ１８－ＨＭＧ構造を使用して、Ｓｍ４の安定な結合ポーズは見出されなかった。
ＳＯＸ１８／ＤＮＡ構造における、Ｓｍ４の安定な結合ポーズは、タンパク質とＤＮＡとの間の溶媒接近可能なポケット内に阻害剤を置き、このポケットは、そうでない場合、Ｘ線結晶構造で水分子により占有される。
Ｓｍ４の主な極性相互作用は、Ａｒｇ１３６およびＬｙｓ１４７とであり、これは、その相互作用をｄＧ１５と交換し、そして、いくつかは、Ｈｉｓ１４３への立体構造の変化を誘導し、その側鎖をＳｍ４に向かって回転させる（図６Ａ、Ｂ）。
しかしながら、Ｓｍ４のＤＮＡ結合阻害モードを直接説明する、他の主な立体構造変化は観察できなかった。
ＳＯＸ１８の可能なタンパク質－タンパク質相互作用部位を研究するために、本発明者らは、インシリコタンパク質－タンパク質ドッキングを、ＭＤシミュレーションと組み合わせて使用して、ＳＯＸ１８／ＤＮＡとそのタンパク質パートナーＲＢＰＪの複合体モデルを構築した。
ＲＢＰＪの場合、本発明者らは、２０１２に解明された、ヒトＮｏｔｃｈ転写複合体の部分のＸ線結晶構造を使用した（Ｃｈｏｉら、２０１２）。
この部分は、共活性化因子ＭＡＭＬ１に結合した、アンキリン（ＡＮＫ）反復ドメイン、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインのＲＢＰＪ－Ｊ関連分子（ＲＡＭ）ドメイン、およびそのコンセンサスＤＮＡに結合した転写因子ＲＢＰＪを含む。
このＮｏｔｃｈ転写複合体の構造内へのＳＯＸ１８／ＤＮＡ構造のドッキングと、続く最適化のためのＭＤシミュレーションとにより、図６Ｃに示す複合体モデルが得られた。
このモデルは、ＲＢＰＪ／ＳＯＸ１８複合体がＨＭＧドメインにより仲介され得、そして、両ＤＮＡ分子により妨害されずにタンパク質複合体を形成できることを示す。
実際に、ＲＢＰＪおよびＳＯＸ１８からの両ＤＮＡ鎖は、ヌクレオソームに対するＤＮＡ配向と同様、互いにほぼ平行して配向される。
加えて、ＨＭＧドメインのＣおよびＮ－末端テールの両方は、溶媒に向かって配向され、ＲＢＰＪ複合体を直接妨害することなく、欠損したＳＯＸ１８ドメインの追加を可能にする。
ＳＯＸ１８とＲＢＰＪとの間の相互作用は、ヘリックス３のＣ末端部分とＨＭＧドメインのＣ末端テール（残基Ｇｌｎ１３８、Ａｒｇ１４１、Ａｓｐ１４２およびＨｉｓ１４３）からの残基により提供される。
それにより、このタンパク質－タンパク質界面は、その領域のＤＮＡ結合界面と反対である。
ＲＢＰＪ／ＳＯＸ１８複合体に対する、Ｓｍ４の推定結合部位のマッピングは、その主タンパク質－タンパク質界面と反対の、ヘリックス－３およびＣ末端テールのＳＯＸ１８ ＤＮＡ結合領域内に阻害剤をぴったりと位置付け、Ｓｍ４の結合が、タンパク質－タンパク質およびタンパク質－ＤＮＡ相互作用の両方を攪乱し得る可能性を示唆する。
ＳＯＸ１８転写活性の調節
ＳＯＸ１８阻害剤の機能的効果を更に評価するために、本発明者らは、ＳＯＸ１８転写活性の読み取りとして、インビトロでの細胞ベースのレポーターシステムを使用した。
ルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合したＶｃａｍ－１プロモーター断片を含むコンストラクトおよびＳＯＸ１８発現ベクターでＣＯＳ－７細胞をトランスフェクトした。
Ｓｍ４、ＰＰＩ邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）特異性の意味で、本発明者らのリード化合物を、メクロフェナム酸、ニフルミン酸およびフルフェナミン酸と共に、この細胞ベースのアッセイで試験した。
これらの４つの小分子のうち、Ｓｍ４は、ＳＯＸ１８転写活性の最も有効な阻害を示し、ＩＣ５０値は５．２μＭであった（図６Ｄ）。
任意の濃度依存性ＳＯＸ１８阻害が観察され得る前に、メクロフェナム酸およびフルフェナミン酸の細胞毒性に達した。
全ての他の試験化合物は、より低い効力を示した（２０μＭ＜ＩＣ５０＜５０μＭ、表１、列３）。
Ｓｍ４が、インビトロでのその転写活性を阻害するのに必要なものと同様の濃度範囲で、特定のＰＰＩを選択的に攪乱（ｐｅｒｔｕｒｂ）するという観察事項は、この小化合物の作用モードが、タンパク質パートナー採用（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）の、妨害によるものである可能性があることを示唆する。
単分子追跡（ＳＭＴ）を用いたＳＭ４によるＳＯＸ１８標的結合の評価
本発明者らは、ＳＭＴ技術によって、クロマチン上のその標的遺伝子に対するＳＯＸ１８タンパク質のサーチパターンを、単一分子の解像度（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）で、生細胞核においてリアルタイムで視覚化することができる。
ＳＯＸ１８クロマチン結合動態に対する、ＳＭ４の撹乱を視覚化することが可能であるという事実は、ＳＭ４オンターゲット関与を明白に示す。
この効果は、任意の細胞毒性を欠いた濃度で観察される。
ＳＭ４の効果により、ＳＯＸ１８はクロマチン上の特定の部位により長く滞在し、このタンパク質動態の変化は、ＳＭ４により損なわれたＳＯＸ１８タンパク質－タンパク質相互作用の変化の結果である可能性がある（ＡＬＰＨＡＳｃｒｅｅｎアッセイにより以前に示されたように）。
転写因子の作用様式は、遺伝子標的選択性を指示するタンパク質－タンパク質相互作用のコードにより推進される。
このコードが変更された場合、転写因子活性は無効となる。
考察
転写因子は、ＤＮＡ結合ドメイン、多数のタンパク質パートナー、および、いくつかの場合では、内因性リガンドさえも有するタンパク質である。
ＴＦの活性がこのタイプの相互作用に依存しているという概念は、たとえば、タンパク質－ＤＮＡまたはタンパク質－タンパク質相互作用阻害剤のスクリーニング等の、その機能を調節する分子を発見するための異なる手段を開くものである。
ＴＦが関与する遺伝経路に関する大量の情報が存在するが、その分子作用様式、そして、より詳細には、多数のタンパク質パートナーの採用に関しては殆ど報告されていない。
したがって、ＤＮＡ結合ドメインがＴＦファミリー内で高度に保存され、そして、選択のための低い可能性を有する領域を構成していても、ＤＮＡ結合阻害剤のスクリーニングは、最近まで、ＴＦモジュレーターを見出すための主要な選択肢を提供していた。
この研究では、本発明者らは、ハイスループットＤＮＡ結合アッセイを用いて、化学的に多様な天然産物ライブラリーをスクリーニングし、転写因子ＳＯＸ１８のＤＮＡ結合を阻害することができる化合物を特定した。
スクリーニングは、両方ともサリチル酸コアおよび親油性テールを有する、類似した構造の２つの化合物を特定した。
２つの活性化合物の周辺で設計された、フォーカスされたライブラリーは、様々な活性度を有する、より広範な類似化合物を特定し、これらの化合物がＳＯＸ１８ ＤＮＡ結合阻害剤のクラスターを形成することを証明した。
本発明者らは、このフォーカスされたライブラリーを用いて、阻害活性がタンパク質に対する小化合物の結合に起因し、そして、ＤＮＡ自体に対する結合には起因しないことを更に示した。
活性分子は、ＳＯＸ１８タンパク質と相互作用し、結合によりその熱安定性を増大させる。
加えて、ＳＯＸ１８完全長またはＨＭＧボックスのみのタンパク質のいずれかを使用して、本発明者らは、化合物がＤＮＡ結合ドメインまたはその直近と直接相互作用することを証明した。
本発明者らは、ＤＮＡ結合の邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）をフィルターとして使用すると、ＨＭＧ－ボックスの高いレベルの配列保存に起因して、ＳＯＸ転写因子間の選択性が低い化合物が得られることを以前主張した。
これと一致して、本発明者らのリード化合物、Ｓｍ４は、高濃度（２００～３００μＭ）で使用された際、様々なＳＯＸタンパク質からの広範なＨＭＧ－ボックスのＤＮＡ結合活性を邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔ）することができた。
ＳＯＸタンパク質のＨＭＧボックスは、３つのα－ヘリックスからなり、２つはＤＮＡ結合のための主な界面を提供する。
しかしながら、ＳＯＸ９ ＨＭＧボックスは、タンパク質－タンパク質相互作用にも関与することが報告されており（Ｈｕａｎｇら、２０１５、ＡｇｒｅｓｔｉおよびＢｉａｎｃｈｉ、２００３、Ｐｒｏｋｏｐら、２０１２）、第３のα－ヘリックスはパートナータンパク質のための主な界面として提案されている。
この研究では、本発明者らは、タンパク質－タンパク質相互作用（ＰＰＩ）検出のインビトロ方法を適用して、ＴＦタンパク質パートナー採用の邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）を研究した。
転写因子ＳＯＸ１８の直接タンパク質－タンパク質相互作用は、ＭＥＦ２Ｃに関してのみ報告されている（Ｈｏｓｋｉｎｇら、２００１）が、ＲＢＰＪとの遺伝子相互作用は、Ｄｌｌ４遺伝子の転写促進においてのみ示されている（Ｓａｃｉｌｏｔｔｏら、２０１３）。
両方のタンパク質は、細胞フリー／ＡＬＰＨＡＳｃｒｅｅｎおよび共ＩＰアッセイにおいて、ＳＯＸ１８に対する直接結合を示す。
重要なことには、小分子のいくつかは、特定のＰＰＩを異なって、邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔ）することである。
それにより、サリチル酸骨格を有するＳｍ４は、ＳＯＸ１８／ＲＢＰＪ複合体を邪魔する（ｄｉｓｒｕｐｔ）ことにおいて、より選択的である一方、アントラニル酸骨格を有するフルフェナミン酸は、ＳＯＸ１８／ＭＥＦ２Ｃ複合体に関して、より選択的である。
更に、インシリコドッキングは、ＨＭＧボックスのＣ－末端テールに近接した、ＤＮＡおよびタンパク質の第３のヘリックスの間に割り込んだ、Ｓｍ４に関する推定結合ポケットを提供する。
この位置は、Ｓｍ４のような阻害剤が、ＤＮＡ結合に影響するだけでなく、ＲＢＰＪ等のタンパク質パートナーとの相互作用表面に影響するように、ＳＯＸ１８タンパク質の立体構造を変更することができることを示唆する。
更に、ＳＯＸ１８転写活性に対する小化合物の効果の研究は、Ｓｍ４が、ルシフェラーゼレポーター遺伝子と融合された際、ＳＯＸ１８依存性Ｖｃａｍ－１プロモーター活性を遮断できることを明らかにした。
フルフェナミン酸は、ＳＯＸ１８転写遮断にごく僅かな効果を示す。
このレポーターアッセイは、Ｓｏｘ１８およびルシフェラーゼ発現ベクターの両方をトランスフェクトされたＣＯＳ－７細胞で行われ、したがって、潜在的なＳＯＸ１８内因性パートナー採用の邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）の解釈が制限されている。
にもかかわらず、Ｓｍ４による、ＳＯＸ１８調節による転写の阻害は、小分子が細胞ベースの環境内で転写因子活性を妨害できることの明らかな指標である。
拡張されたライブラリーの合成およびスクリーニングは、更に、ＳＯＸ１８／ＤＮＡ結合の阻害のためのいくつかの明らかな構造－活性関連性を示した。
親油性テールおよびそのリンカーにおいて幾分かの変動が許容されるが、ヒドロキシルまたはカルボン酸基の両方は、任意のエステル、エーテルまたはアミドが活性を消失させるため、それらの水素結合供与能力を保持する必要がある。
パラ置換された電子供与基を有するカルボン酸の変化は、酸をヒドロキシル（レゾルシノール骨格）で置き換えるのと同様、殆ど影響はなく、両方ともＳＯＸ１８ ＤＮＡ結合を阻害するそれらの能力を保持する。
アントラニル酸骨格を有する化合物を、ＮＳＡＩＤ化合物に対するサリチル酸骨格の化学的類似性の延長として選択した。
研究では、ＳＯＸ１８阻害剤がＣＯＸ１またはＣＯＸ２に対して阻害活性を有さないことを示したが、いくつかのＮＳＡＩＤ化合物は、ＳＯＸ１８ ＤＮＡ結合阻害を示す。
しかしながら、ＳＯＸ１８－タンパク質結合阻害（ＳＯＸ１８－ＲＢＰＪの代わりに、ＳＯＸ１８－ＭＥＦ２Ｃ阻害）における差異は、異なる結合または作動モードを示唆する。
ＴＦの転写活性を阻害する化合物の有効性は、核内のＴＦおよび化合物の両方の濃度に依存する。
ＴＦの濃度は、核内でほぼミリモルレベルに達し得るが（Ｃｈｅｎら、２０１４）、化合物濃度は、その細胞および核膜の両方を通した分配の能力に依存する。
創薬の初期段階では、化合物濃度が規定される均一アッセイにおいてＩＣ５０を測定することは、より情報価値がある（即ち、ＳＡＲモデルを構築するために）。
しかしながら、更なる薬物最適化のためには、予測モデル、または化合物の有効な阻害濃度（ＩＣ５０）を測定する細胞ベースのアッセイのいずれかにより、核内への化合物の浸透も考慮する必要がある。
ＴＦ阻害剤を開発する際に行う必要がある他の考慮事項は、どのＰＰＩが化合物により優位に影響を受けるかである。
ＴＦ間の相互作用を含む、タンパク質－タンパク質相互作用は、比較的弱い。
たとえば、ｐ３２とＨＤＭ２の間の相互作用は、低～中のマイクロモル範囲のＫＤを有する（Ｄａｗｓｏｎら、２００３、Ｃｈｅｎら、２０１３）。
これと比較して、抗体－抗原相互作用または内因性ペプチドリガンドと受容体（たとえば、ＥＧＦ－ＥＧＦＲ）の間の相互作用は遥かに強く、ＫＤは、低ナノモル～高ピコモル範囲である（Ｍｉａｎら、１９９１、Ｌａｘら、１９８８）。
同様に、タンパク質とＤＮＡの間の相互作用は、負に帯電したＤＮＡと通常正に帯電したＤＮＡ結合ドメインとの間の強い静電気相互作用にほぼ起因して、低ナノモル範囲にある。
Ｓｍ４は、ＳＯＸ１８／ＤＮＡおよびＳＯＸ１８／ＲＢＰＪ相互作用の両方を阻害することができるが、阻害効果は、より弱いＰＰＩに対してより高い。
ＴＦ阻害剤の開発における重要な考慮事項は、特にＴＦが半ダースの異なるタンパク質パートナーを採用することが可能であるため、ＰＰＩを選択的に阻害する能力である（ＧａｍｐｅｒおよびＲｏｅｄｅｒ、２００８）。
ＴＦは本質的に無秩序であるとしても（ＷｒｉｇｈｔおよびＤｙｓｏｎ、２０１５）、これらのタンパク質は、異なるタンパク質－タンパク質界面に関するドメインモジュール性を示す（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、２００５）。
このことは、いくつかの相互作用が、異なる下流経路を活性化する一方、構造的類似性を共有することを暗示する。
キナーゼ等の他の調節タンパク質および酵素と同様に、ＴＦタンパク質－タンパク質阻害の選択性プロファイルを考慮する必要がある。
全ＰＰＩの遮断は望ましくない可能性があるが、最大の有効性は単一のＰＰＩ阻害では達成されず、選択されたタンパク質パートナーのサブセットの採用を同時に阻害することにより達成される可能性がある。
結論として、この研究は、ＳＯＸ１８阻害のための主要なファルマコフォアとしてのサリチル酸誘導体を特定し、およびＳｍ４をリード化合物として特定した。
タンパク質－ＤＮＡ結合およびＰＰＩアッセイの両方からの手がかりにしたがって、更なる薬物最適化を行って、選択性および効力を更に洗練させる必要がある。
Figure 2023011613000024
上記の表１に関して、第１の列において、化合物ＦＰ ＩＣ５０は、可変Ｈｉｌｌ勾配曲線適合を用いて概算した。
異なる濃度範囲を、ＤＭＳＯ濃度を０～３．３３％ ｖ／ｖの範囲で含む、ＦＰベースのＤＮＡ結合競合アッセイにて試験した（０．２～２００ｕＭ、１０～５００ｕＭ、１０ｕＭ～３ｍＭ）。
実験は、３回の独立反復で行った。
第２の列は、化合物Ｓｍ１～１４が、生理食塩水（２００ｍＭのＮａＣｌ）または蛍光分極緩衝液（３０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、４０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮＨ４ＯＡｃ、１０ｍＭのグアニジニウム、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のＮＰ－４０）中でミセルの形成を開始する閾値濃度をまとめている。
第３および第４の列は、全活性化合物について、ＣＯＳ７線維芽細胞内での細胞ベースのルシフェラーゼＳＯＸ１８依存性転写促進化の－ＩＣ５０－と、細胞毒性－ＣＣ５０－の、５０％阻害濃度をまとめている。
最終列において、本発明者らは、「Ａｇｇｒｅｇａｔｏｒ Ａｄｖｉｓｏｒ」（Ｉｒｗｉｎら、２０１５）を使用して、物理的性質（ＣＬｏｇ Ｐ＞３）および既知のアグリゲーターの強力なライブラリー－１２，６００化合物に対する類似性に基づいて、アグリゲーターを予測した
＊：既知のアグリゲーターに類似した化合物、
＃：任意の既知のアグリゲーターに類似していないが、「高い」ＬｏｇＰゆえ高いリスクがある
：予測された凝集のリスクはない）。
Figure 2023011613000025
Figure 2023011613000026
Figure 2023011613000027
Figure 2023011613000028
Figure 2023011613000029
化合物Ｓｍ１５～Ｓｍ４４の化学的分析
化合物の純度を、ＨＰＬＣ（ＥＳＩ－ＭＳ／ＵＶ／ＥＬＳＤ）により決定し、そして、それらの分子式を、ＨｉｇｈＲｅｓ ＭＳ（ＥＳＩ ｍｉｃｒｏＴＯＦ－ＬＣ）により決定した。
１Ｈおよび１３Ｃ－ＮＭＲ実験を用いて構造を確認した（付録Ａ参照）。
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ＣＨＯＩ，Ｓ．Ｈ．，ＷＡＬＥＳ，Ｔ．Ｅ．，ＮＡＭ，Ｙ．，Ｏ’ＤＯＮＯＶＡＮ，Ｄ．Ｊ．，ＳＬＩＺ，Ｐ．，ＥＮＧＥＮ，Ｊ．Ｒ．＆ ＢＬＡＣＫＬＯＷ，Ｓ．Ｃ．２０１２．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｌｏｃｋｉｎｇ ｕｐｏｎ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｎｏｔｃｈ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２０，３４０－９．
ＤＡＲＮＥＬＬ，Ｊ．Ｅ．，ＪＲ．２００２．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｓ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，２，７４０－９．
ＤＡＷＳＯＮ，Ｒ．，ＭＵＬＬＥＲ，Ｌ．，ＤＥＨＮＥＲ，Ａ．，ＫＬＥＩＮ，Ｃ．，ＫＥＳＳＬＥＲ，Ｈ．＆ ＢＵＣＨＮＥＲ，Ｊ．２００３．Ｔｈｅ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｐ５３ ｉｓ ｎａｔｉｖｅｌｙ ｕｎｆｏｌｄｅｄ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，３３２，１１３１－４１．
ＤＵＯＮＧ，Ｔ．，ＫＯＬＴＯＷＳＫＡ，Ｋ．，ＰＩＣＨＯＬ－ＴＨＩＥＶＥＮＤ，Ｃ．，ＬＥ ＧＵＥＮ，Ｌ．，ＦＯＮＴＡＩＮＥ，Ｆ．，ＳＭＩＴＨ，Ｋ．Ａ．，ＴＲＵＯＮＧ，Ｖ．，ＳＫＯＣＺＹＬＡＳ，Ｒ．，ＳＴＡＣＫＥＲ，Ｓ．Ａ．，ＡＣＨＥＮ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．２０１４．ＶＥＧＦＤ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｂｌｏｏｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ＳＯＸ１８ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｌｏｏｄ，１２３，１１０２－１２．
ＦＥＨＥＲ，Ｍ．＆ ＳＣＨＭＩＤＴ，Ｊ．Ｍ．２００３．Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｄｒｕｇｓ，ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｊ Ｃｈｅｍ Ｉｎｆ Ｃｏｍｐｕｔ Ｓｃｉ，４３，２１８－２７．
ＦＩＬＩＰＰＡＫＯＰＯＵＬＯＳ，Ｐ．，ＱＩ，Ｊ．，ＰＩＣＡＵＤ，Ｓ．，ＳＨＥＮ，Ｙ．，ＳＭＩＴＨ，Ｗ．Ｂ．，ＦＥＤＯＲＯＶ，Ｏ．，ＭＯＲＳＥ，Ｅ．Ｍ．，ＫＥＡＴＥＳ，Ｔ．，ＨＩＣＫＭＡＮ，Ｔ．Ｔ．，ＦＥＬＬＥＴＡＲ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＢＥＴ ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ，４６８，１０６７－７３．
ＦＯＮＴＡＩＮＥ，Ｆ．，ＯＶＥＲＭＡＮ，Ｊ．＆ ＦＲＡＮＣＯＩＳ，Ｍ．２０１５．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｏｂｓｔａｃｌｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｅｎ（Ｌｏｎｄ），４，２．
ＦＲＡＮＣＯＩＳ，Ｍ．，ＣＡＰＲＩＮＩ，Ａ．，ＨＯＳＫＩＮＧ，Ｂ．，ＯＲＳＥＮＩＧＯ，Ｆ．，ＷＩＬＨＥＬＭ，Ｄ．，ＢＲＯＷＮＥ，Ｃ．，ＰＡＡＶＯＮＥＮ，Ｋ．，ＫＡＲＮＥＺＩＳ，Ｔ．，ＳＨＡＹＡＮ，Ｒ．，ＤＯＷＮＥＳ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．２００８．Ｓｏｘ１８ ｉｎｄｕｃｅｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ，４５６，６４３－７．
ＦＵＫＡＤＡ，Ｈ．，ＳＴＵＲＴＥＶＡＮＴ，Ｊ．Ｍ．＆ ＱＵＩＯＣＨＯ，Ｆ．Ａ．１９８３．Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ ａｎｄ ｏｆ Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２５８，１３１９３－８．
ＧＡＧＯＳＫＩ，Ｄ．，ＭＵＲＥＥＶ，Ｓ．，ＧＩＬＥＳ，Ｎ．，ＪＯＨＮＳＴＯＮ，Ｗ．，ＤＡＨＭＥＲ－ＨＥＡＴＨ，Ｍ．，ＳＫＡＬＡＭＥＲＡ，Ｄ．，ＧＯＮＤＡ，Ｔ．Ｊ．＆ ＡＬＥＸＡＮＤＲＯＶ，Ｋ．２０１５．Ｇａｔｅｗａｙ－ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒＨｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏ－ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９５，１－７．
ＧＡＭＰＥＲ，Ａ．Ｍ．＆ ＲＯＥＤＥＲ，Ｒ．Ｇ．２００８．Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｐ５３ ｔｏ ｔｈｅ ＳＴＡＧＡ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｍｅｄｉａｔｅｓ Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ａｆｔｅｒ ＵＶ Ｄａｍａｇｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８，２５１７－２５２７．
ＧＵＢＢＡＹ，Ｊ．，ＣＯＬＬＩＧＮＯＮ，Ｊ．，ＫＯＯＰＭＡＮ，Ｐ．，ＣＡＰＥＬ，Ｂ．，ＥＣＯＮＯＭＯＵ，Ａ．，ＭＵＮＳＴＥＲＢＥＲＧ，Ａ．，ＶＩＶＩＡＮ，Ｎ．，ＧＯＯＤＦＥＬＬＯＷ，Ｐ．＆ ＬＯＶＥＬＬ－ＢＡＤＧＥ，Ｒ．１９９０．Ａ ｇｅｎｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｘ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ Ｙ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｉｓ ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ，３４６，２４５－５０．
ＨＯＰＫＩＮＳ，Ａ．Ｌ．＆ ＧＲＯＯＭ，Ｃ．Ｒ．２００２．Ｔｈｅ ｄｒｕｇｇａｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ，１，７２７－３０．
ＨＯＳＫＩＮＧ，Ｂ．Ｍ．，ＷＡＮＧ，Ｓ．Ｃ．，ＣＨＥＮ，Ｓ．Ｌ．，ＰＥＮＮＩＮＧ，Ｓ．，ＫＯＯＰＭＡＮ，Ｐ．＆ ＭＵＳＣＡＴ，Ｇ．Ｅ．２００１．ＳＯＸ１８ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＭＥＦ２Ｃ ｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２８７，４９３－５００．
ＨＯＳＫＩＮＧ，Ｂ．Ｍ．，ＷＡＮＧ，Ｓ．Ｃ．，ＤＯＷＮＥＳ，Ｍ．，ＫＯＯＰＭＡＮ，Ｐ．＆ ＭＵＳＣＡＴ，Ｇ．Ｅ．２００４．Ｔｈｅ ＶＣＡＭ－１ ｇｅｎｅ ｔｈａｔ ｅｎｃｏｄｅｓ ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｒｙ－ｒｅｌａｔｅｄＨｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｂｏｘ ｇｅｎｅ，Ｓｏｘ１８．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７９，５３１４－２２．
ＨＵＡＮＧ，Ｙ．Ｈ．，ＪＡＮＫＯＷＳＫＩ，Ａ．，ＣＨＥＡＨ，Ｋ．Ｓ．，ＰＲＡＢＨＡＫＡＲ，Ｓ．＆ ＪＡＵＣＨ，Ｒ．２０１５．ＳＯＸＥ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒｍ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｄｉｍｅｒｓ ｏｎ ｎｏｎ－ｃｏｍｐａｃｔ ＤＮＡ ｍｏｔｉｆｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄＨｉｇｈ－ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ，５，１０３９８．
ＩＲＷＩＮ，Ｊ．Ｊ．，ＤＵＡＮ，Ｄ．，ＴＯＲＯＳＹＡＮ，Ｈ．，ＤＯＡＫ，Ａ．Ｋ．，ＺＩＥＢＡＲＴ，Ｋ．Ｔ．，ＳＴＥＲＬＩＮＧ，Ｔ．，ＴＵＭＡＮＩＡＮ，Ｇ．＆ ＳＨＯＩＣＨＥＴ，Ｂ．Ｋ．２０１５．Ａｎ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ａｄｖｉｓｏｒ ｆｏｒ Ｌｉｇａｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５８，７０７６－７０８７．
ＫＬＡＵＳ，Ｍ．，ＰＲＯＫＯＰＨ，Ｎ．，ＧＩＲＢＩＧ，Ｍ．，ＷＡＮＧ，Ｘ．，ＨＵＡＮＧ，Ｙ．Ｈ．，ＳＲＩＶＡＳＴＡＶＡ，Ｙ．，ＨＯＵ，Ｌ．，ＮＡＲＡＳＩＭＨＡＮ，Ｋ．，ＫＯＬＡＴＫＡＲ，Ｐ．Ｒ．，ＦＲＡＮＣＯＩＳ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｅｃｏｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＳＯＸ１８／Ｐｒｏｘ１－ＤＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，４４，３９２２－３５．
ＫＯＶＴＵＮ，Ｏ．，ＭＵＲＥＥＶ，Ｓ．，ＪＵＮＧ，Ｗ．，ＫＵＢＡＬＡ，Ｍ．Ｈ．，ＪＯＨＮＳＴＯＮ，Ｗ．＆ ＡＬＥＸＡＮＤＲＯＶ，Ｋ．２０１１．Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５５，５８－６４．
ＬＡＧＯＲＣＥ，Ｄ．，ＳＰＥＲＡＮＤＩＯ，Ｏ．，ＧＡＬＯＮＳ，Ｈ．，ＭＩＴＥＶＡ，Ｍ．Ａ．＆ ＶＩＬＬＯＵＴＲＥＩＸ，Ｂ．Ｏ．２００８．ＦＡＦ－Ｄｒｕｇｓ２：ｆｒｅｅ ＡＤＭＥ／ｔｏｘ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ ｔｏｏｌ ｔｏ ａｓｓｉｓｔ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｐｒｏｊｅｃｔｓ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，９，３９６．
ＬＡＸ，Ｉ．，ＪＯＨＮＳＯＮ，Ａ．，ＨＯＷＫ，Ｒ．，ＳＡＰ，Ｊ．，ＢＥＬＬＯＴ，Ｆ．，ＷＩＮＫＬＥＲ，Ｍ．，ＵＬＬＲＩＣＨ，Ａ．，ＶＥＮＮＳＴＲＯＭ，Ｂ．，ＳＣＨＬＥＳＳＩＮＧＥＲ，Ｊ．＆ ＧＩＶＯＬ，Ｄ．１９８８．Ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＥＧＦ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，８，１９７０－８．
ＬＥＵＮＧ，Ｃ．－Ｈ．，ＣＨＡＮ，Ｄ．Ｓ．－Ｈ．，ＭＡ，Ｖ．Ｐ．－Ｙ．＆ ＭＡ，Ｄ．－Ｌ．２０１３．ＤＮＡ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ，３３，８２３－８４６．
ＬＩＵ，Ｌ．Ｊ．，ＬＥＵＮＧ，Ｋ．Ｈ．，ＣＨＡＮ，Ｄ．Ｓ．，ＷＡＮＧ，Ｙ．Ｔ．，ＭＡ，Ｄ．Ｌ．＆ ＬＥＵＮＧ，Ｃ．Ｈ．２０１４．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ－ｌｉｋｅ ＳＴＡＴ３ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｂｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｖｉｒｔｕａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ，５，ｅ１２９３．
ＬＯＰＥＺ－ＢＩＧＡＳ，Ｎ．，ＢＬＥＮＣＯＷＥ，Ｂ．Ｊ．＆ ＯＵＺＯＵＮＩＳ，Ｃ．Ａ．２００６．Ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｆｏｒ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄＨｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｅｖｅｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２２，２６９－７７．
ＭＡＰＰ，Ａ．Ｋ．，ＰＲＩＣＥＲ，Ｒ．＆ ＳＴＵＲＬＩＳ，Ｓ．２０１５．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｓ ｎｏ ｌｏｎｇｅｒ ａ ｑｕｉｘｏｔｉｃ ｑｕｅｓｔ．Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，１１，８９１－８９４．
ＭＣＭＩＬＬＩＡＮ，Ｍ．Ｋ．，ＬＩ，Ｌ．，ＰＡＲＫＥＲ，Ｊ．Ｂ．，ＰＡＴＥＬ，Ｌ．，ＺＨＯＮＧ，Ｚ．，ＧＵＮＮＥＴＴ，Ｊ．Ｗ．，ＰＯＷＥＲＳ，Ｗ．Ｊ．＆ ＪＯＨＮＳＯＮ，Ｍ．Ｄ．２００２．Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｒｅｓａｚｕｒｉｎ－ｂａｓｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ ｆｏｒＨｅｐａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ，１８，１５７－７３．
ＭＩＡＮ，Ｉ．Ｓ．，ＢＲＡＤＷＥＬＬ，Ａ．Ｒ．＆ ＯＬＳＯＮ，Ａ．Ｊ．１９９１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１７，１３３－１５１．
ＭＩＴＴＡＬ，Ｄ．，ＹＯＵＮＧ，Ａ．，ＳＴＡＮＮＡＲＤ，Ｋ．，ＹＯＮＧ，Ｍ．，ＴＥＮＧ，Ｍ．Ｗ．，ＡＬＬＡＲＤ，Ｂ．，ＳＴＡＧＧ，Ｊ．＆ ＳＭＹＴＨ，Ｍ．Ｊ．２０１４．Ａｎｔｉｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＰＤ－１ ａｎｄ ｔｈｅ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ａ２Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，７４，３６５２－８．
ＭＩＹＯＳＨＩ，Ｋ．，ＴＡＫＡＩＳＨＩ，Ｍ．，ＮＡＫＡＪＩＭＡ，Ｋ．，ＩＫＥＤＡ，Ｍ．，ＫＡＮＤＡ，Ｔ．，ＴＡＲＵＴＡＮＩ，Ｍ．，ＩＩＹＡＭＡ，Ｔ．，ＡＳＡＯ，Ｎ．，ＤＩＧＩＯＶＡＮＮＩ，Ｊ．＆ ＳＡＮＯ，Ｓ．２０１１．Ｓｔａｔ３ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ：ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｓｔｕｄｙ ｗｉｔｈ ＳＴＡ－２１，ａ Ｓｔａｔ３ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１３１，１０８－１７．
ＭＵＲＥＥＶ，Ｓ．，ＫＯＶＴＵＮ，Ｏ．，ＮＧＵＹＥＮ，Ｕ．Ｔ．＆ ＡＬＥＸＡＮＤＲＯＶ，Ｋ．２００９．Ｓｐｅｃｉｅｓ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｌｅａｄｅｒｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２７，７４７－５２．
ＮＡＲＡＳＩＭＨＡＮ，Ｋ．，ＭＩＣＯＩＮＥ，Ｋ．，ＬＡＣＯＴＥ，Ｅ．，ＴＨＯＲＩＭＢＥＲＴ，Ｓ．，ＣＨＥＵＮＧ，Ｅ．，ＨＡＳＥＮＫＮＯＰＦ，Ｂ．＆ ＪＡＵＣＨ，Ｒ．２０１４．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｏｒｇａｎｏ－ｐｏｌｙｏｘｏｍｅｔａｌａｔｅＨｙｂｒｉｄｓ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ ＳＯＸ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｅｎ（Ｌｏｎｄ），３，１０．
ＮＡＲＡＳＩＭＨＡＮ，Ｋ．，ＰＩＬＬＡＹ，Ｓ．，ＢＩＮ ＡＨＭＡＤ，Ｎ．Ｒ．，ＢＩＫＡＤＩ，Ｚ．，ＨＡＺＡＩ，Ｅ．，ＹＡＮ，Ｌ．，ＫＯＬＡＴＫＡＲ，Ｐ．Ｒ．，ＰＥＲＶＵＳＨＩＮ，Ｋ．＆ ＪＡＵＣＨ，Ｒ．２０１１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｏｌｙｏｘｏｍｅｔａｌａｔｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｘ２．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，６，５７３－８１．
ＮＧ，Ｃ．Ｋ．，ＬＩ，Ｎ．Ｘ．，ＣＨＥＥ，Ｓ．，ＰＲＡＢＨＡＫＡＲ，Ｓ．，ＫＯＬＡＴＫＡＲ，Ｐ．Ｒ．＆ ＪＡＵＣＨ，Ｒ．２０１２．Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｏｘ－Ｏｃｔ ｐａｒｔｎｅｒ ｃｏｄｅ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，４０，４９３３－４１．
ＮＩＷＡ，Ｈ．，ＯＧＡＷＡ，Ｋ．，ＳＨＩＭＯＳＡＴＯ，Ｄ．＆ ＡＤＡＣＨＩ，Ｋ．２００９．Ａ ｐａｒａｌｌｅｌ ｃｉｒｃｕｉｔ ｏｆ ＬＩＦ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ＥＳ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ，４６０，１１８－１２２．
ＰＥＮＮＩＳＩ，Ｄ．，ＧＡＲＤＮＥＲ，Ｊ．，ＣＨＡＭＢＥＲＳ，Ｄ．，ＨＯＳＫＩＮＧ，Ｂ．，ＰＥＴＥＲＳ，Ｊ．，ＭＵＳＣＡＴ，Ｇ．，ＡＢＢＯＴＴ，Ｃ．＆ ＫＯＯＰＭＡＮ，Ｐ．２０００．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｓｏｘ１８ ｕｎｄｅｒｌｉｅ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｄＨａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｒａｇｇｅｄ ｍｉｃｅ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２４，４３４－７．
ＰＥＲＩＳＳＩ，Ｖ．＆ ＲＯＳＥＮＦＥＬＤ，Ｍ．Ｇ．２００５．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｔｈｅ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｌｏｇｉｃ ｏｆ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｃｙｃｌｅｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，６，５４２－５４．
ＰＩＬＬＩＮＧＥＲ，Ｍ．Ｈ．，ＣＡＰＯＤＩＣＩ，Ｃ．，ＲＯＳＥＮＴＨＡＬ，Ｐ．，ＫＨＥＴＥＲＰＡＬ，Ｎ．，ＨＡＮＦＴ，Ｓ．，ＰＨＩＬＩＰＳ，Ｍ．Ｒ．＆ ＷＥＩＳＳＭＡＮＮ，Ｇ．１９９８．Ｍｏｄｅｓ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｐｉｒｉｎ－ｌｉｋｅ ｄｒｕｇｓ：Ｓａｌｉｃｙｌａｔｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔ Ｅｒｋ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，９５，１４５４０－１４５４５．
ＰＲＯＫＯＰ，Ｊ．Ｗ．，ＬＥＥＰＥＲ，Ｔ．Ｃ．，ＤＵＡＮ，Ｚ．Ｈ．＆ ＭＩＬＳＴＥＤ，Ａ．２０１２．Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｏｃｋｉｎｇ ｓｉｔｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｖａｒｉａｎｔｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ，ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ：ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅＨＭＧ ｄｏｍａｉｎ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１３ Ｓｕｐｐｌ ２，Ｓ３．
ＲＥＩＣＨＭＡＮＮ，Ｄ．，ＲＡＨＡＴ，Ｏ．，ＡＬＢＥＣＫ，Ｓ．，ＭＥＧＥＤ，Ｒ．，ＤＹＭ，Ｏ．＆ ＳＣＨＲＥＩＢＥＲ，Ｇ．２００５．Ｔｈｅ ｍｏｄｕｌａｒ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１０２，５７－６２．
ＳＡＣＩＬＯＴＴＯ，Ｎ．，ＭＯＮＴＥＩＲＯ，Ｒ．，ＦＲＩＴＺＳＣＨＥ，Ｍ．，ＢＥＣＫＥＲ，Ｐ．Ｗ．，ＳＡＮＣＨＥＺ－ＤＥＬ－ＣＡＭＰＯ，Ｌ．，ＬＩＵ，Ｋ．，ＰＩＮＨＥＩＲＯ，Ｐ．，ＲＡＴＮＡＹＡＫＡ，Ｉ．，ＤＡＶＩＥＳ，Ｂ．，ＧＯＤＩＮＧ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．２０１３．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｄｌｌ４ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｓｏｘ ａｎｄ Ｎｏｔｃｈ ｉｎ ａｒｔｅｒｉａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１１０，１１８９３－８．
ＳＡＲＫＡＲ，Ａ．＆ＨＯＣＨＥＤＬＩＮＧＥＲ，Ｋ．２０１３．Ｔｈｅ Ｓｏｘ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ｓｔｅｍ ａｎｄ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｆａｔｅ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１２，１５－３０．
ＳＥＮＩＳＴＥＲＲＡ，Ｇ．，ＣＨＡＵ，Ｉ．＆ ＶＥＤＡＤＩ，Ｍ．２０１２．Ｔｈｅｒｍａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｓｓａｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ，１０，１２８－３６．
ＳＥＮＩＳＴＥＲＲＡ，Ｇ．Ａ．＆ ＦＩＮＥＲＴＹ，Ｐ．Ｊ．，ＪＲ．２００９．Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ，５，２１７－２３．
ＳＥＮＩＳＴＥＲＲＡ，Ｇ．Ａ．，ＭＡＲＫＩＮ，Ｅ．，ＹＡＭＡＺＡＫＩ，Ｋ．，ＨＵＩ，Ｒ．，ＶＥＤＡＤＩ，Ｍ．＆ ＡＷＲＥＹ，Ｄ．Ｅ．２００６．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｌｉｇａｎｄｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｇｅｎｅｒｉｃ ａｎｄＨｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｌｉｇｈｔ－ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ．Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ，１１，９４０－８．
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実施例２
転写因子ＳＯＸ１８の薬理学的標的化は、マウスにおける乳癌を遅延させる
材料および方法
実験再現性
この研究における全てのデータおよび統計分析は、別に示さない限り、少なくとも３つの独立した実験から生成した。
バックグラウンドノイズを低減し、技術的例外を検出するために、各実験に技術的反復が含まれていた。
異なる実験条件のサンプルは、無作為化の任意の特定の方法には晒されず、そして、グループは非盲検条件下で評価された。
細胞フリーの発現のためのプラスミド調製
本明細書で使用した遺伝子にコードされたタグは、増強ＧＦＰ（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ（Ｃｈｅｒｒｙ）およびｃＭｙｃ（ｍｙｃ）である。
タンパク質を、各々、以下の細胞フリーの発現Ｇａｔｅｗａｙデスティネーションベクター（Ｇａｔｅｗａｙ ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ）にクローニングした：
Ｎ―末端ＧＦＰタグ化（ｐＣｅｌｌＦｒｅｅ＿Ｇ０３）、
Ｎ―末端Ｃｈｅｒｒｙ－ｃＭｙｃ（ｐＣｅｌｌＦｒｅｅ＿Ｇ０７）および
Ｃ―末端Ｃｈｅｒｒｙ－ｃＭｙｃタグ化（ｐＣｅｌｌＦｒｅｅ＿Ｇ０８）（Ｇａｇｏｓｋｉら、２０１５）。
ヒトＳＯＸ７（ＢＣ０７１９４７）、ＳＯＸ１７、ＲＢＰＪ（ＢＣ０２０７８０）およびＭＥＦ２Ｃ（ＢＣ０２６３４１）に対応するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、以前記載されたように、ヒトＯＲＦｅｏｍｅコレクションバージョン１．１および５．１またはヒトＯｒｆｅｏｍｅ ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ ＯＣＡＡコレクション（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から調達され、ＡＲＶＥＣ施設である、ＵＱ Ｄｉａｍａｎｔｉｎａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにてクローニングされた。
エントリークローンｐＤＯＮＯＲ２２３またはｐＥＮＴＲ２０１ベクターを、ＬＲ組換えにより、発現プラスミド内のｃｃｄＢ遺伝子と交換した（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オーストラリア）。
完全長ヒトＳＯＸ１８遺伝子を合成し（ＩＤＴ）、そして、ベクターへの移動は、Ｇａｔｅｗａｙ ＰＣＲクローニングを使用して実現した。
細胞フリーのタンパク質発現
翻訳コンピテントのリーシュマニア・タレントラエ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ）抽出物（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ ｅｘｔｒａｃｔ）（ＬＴＥ）を、以前記載されたように調製した（Ｍｕｒｅｅｖら、２００９、Ｋｏｖｔｕｎら、２０１１）。
３０ｎＭのＧＦＰ鋳型プラスミドおよび６０ｎＭのＣｈｅｒｒｙ鋳型プラスミドをＬＴＥに加え、そして、２７℃で３時間インキュベートすることによりタンパク質対を共発現させた。
ＡＬＰＨＡ－Ｓｃｒｅｅｎアッセイ
ＡＬＰＨＡ－Ｓｃｒｅｅｎアッセイを、ｃＭｙｃ検出キットおよびＰｒｏｘｉｐｌａｔｅ－３８４ Ｐｌｕｓプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、以前記載されたように行った（Ｓｉｅｒｅｃｋｉら、２０１４）。
段階希釈の各サンプルを測定した。
関心対象のタンパク質を共発現しているＬＴＥ溶解物を、緩衝液Ａ（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ）中で希釈した。
アッセイのために、緩衝液Ｂ（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のＮＰ４０、０．００１％のカゼイン）中の１２．５μＬ（０．４μｇ）の抗ｃＭｙｃ被覆アクセプタービーズを各ウェル内に等分した。
次いで、２μＬの希釈サンプルおよび緩衝液Ａ中の２μＬのビオチン標識ＧＦＰ－Ｎａｎｏｔｒａｐを加えた。
プレートを、室温で、４５分間、インキュベートした。
その後、緩衝液Ａ中で希釈した、２μＬ（０．４μｇ）のストレプトアビジン被覆ドナービーズを加え、その後、暗所内で、室温で、４５分間、インキュベートした。
Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で、製造業者の推奨設定を用いて（励起：６８０／３０ｎｍで、０．１８秒間、発光：３７ｍｓ後に、５７０／１００ｎｍ）、ＡＬＰＨＡ－Ｓｃｒｅｅｎシグナルを得た。
得られた鐘形曲線は、正の相互作用を示す一方、平坦な線は、タンパク質間の相互作用の欠如を反映する。
各タンパク質対（ｐｒｏｔｅｉｎ ｐａｉｒ）の測定は、別個のプレートを使用して、最低３回繰り返した。
結合指数を次のように計算した：
ＢＩ＝［（Ｉ－Ｉ＿ｎｅｇ）／（Ｉ＿ｒｅｆ－Ｉ＿ｎｅｇ）］×１００
各実験に関して、Ｉは、最大シグナルレベル（フック効果曲線の頂部）であり、そして、Ｉｎｅｇは最小（バックグラウンド）シグナルレベルである。
シグナルを、ＳＯＸ１８とそれ自体との相互作用に関して得られたＩｒｅｆシグナルに対して正規化した。
ＰＰＩの邪魔アッセイ（ＰＰＩ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ａｓｓａｙ，）に関しては、ＬＴＥ中で発現したタンパク質対を、１００μＭのＳｍ４またはＤＭＳＯ単独（０．７％のＤＭＳＯ最終）と共に１時間インキュベートした。
また、１００μＭのＳｍ４またはＤＭＳＯを緩衝液Ｂに加えた。
ＰＰＩの邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）を次のように計算した：
（１－Ｉ＿Ｓｍ４／Ｉ＿ＤＭＳＯ）×１００。
ＩＣ５０決定のために、アッセイは同一であったが、Ｓｍ４の希釈範囲を用いた（０．３～３００μＭ）。
相互作用の百分率は、次のように計算した：
Ｉ＿Ｓｍ４／Ｉ＿ＤＭＳＯ×１００。
少なくとも３回の独立した実験のデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿００７３７０）バージョン６．０において、３－パラメーター非線形回帰を用いて適合させた。
細胞培養およびトランスフェクション
ＣＯＳ－７細胞を、ＡＴＣＣから購入し（ＣＲＬ－１６５１、ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿０２２４）、ＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、非必須アミノ酸およびＨＥＰＥＳ（Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸）を添加した、ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１９９５）中で、３７℃、５％ ＣＯ２で培養した。
ＣＯＳ－７細胞を、４～６時間トランスフェクトし、そして、溶解およびルシフェラーゼアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、６０１６７１１）の前に、更に２４時間インキュベートした。
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＬｏｎｚａオーストラリアから購入した（ＣＣ－２５１９Ａ）。
ＣｈＩＰ－ＭＳ、ＣｈＩＰ－ｓｅｑおよびＲＮＡ－ｓｅｑ分析のために、ＨＵＶＥＣを、７時間トランスフェクションし、そして、更に１４時間インキュベートした。
小分子処理中、低血清（０．４％ ＦＢＳ）を含む培地中で細胞を増殖させた。
ＨＵＶＥＣを、ＥＧＭ－２ブレットキット説明書（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ－３１６２）にしたがって、補充したＥＧＭ－２培地中で、３７℃、５％ ＣＯ２で培養した。
細胞を、３５ｍｍ皿内で、８０～９０％コンフルエンシーまで増殖させ、そして、Ｘ－ｔｒｅｍｅｇｅｎｅ ９ ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、０６３６５７８７００１）を使用して、製造業者の説明書にしたがって、プラスミド、マウスｐＳＧ５ Ｓｏｘ１８、プラスミド、ｐＳＧ５ ｃＭｙｃ－Ｓｏｘ１８、またはプラスミド、ｃＭｙｃで、トランスフェクトした。
全ての細胞株（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ）は、マイコプラズマ汚染に関して陰性であった。
クロマチン免疫沈降
ＣｈＩＰ実験を、以前記載されたように行った（Ｓｃｈｍｉｄｔら、２００９）。
ｃＭｙｃ－タグ化ＳＯＸ１８を過剰発現しているＨＵＶＥＣに関して、抗ｃＭｙｃ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃２２７６、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２３１４８２５）を使用して免疫沈降を行った。
ＣｈＩＰ－ｓｅｑおよび分析
ＩＰ後、ＴｒｕＳｅｑ ＣｈＩＰｓｅｑキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＩＰ－２０２－１０１２）を使用して、５０μＬの１×ＮＥＢＮｅｘｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０５４１）中の、選択のインデックス配列を含む０．５μＭの汎用リバースＰＣＲプライマーおよびフォワードＰＣＲプライマーを用いて、ＤＮＡ増幅を行った。
ＰＣＲサイクルの数は、ＣｈＩＰ効率に応じて、１３～１８の範囲であった。
ＡＭＰｕｒｅビーズ（１．８容積）を使用して、ＰＣＲ産物を精製し、そして、２０μＬの再懸濁緩衝液（Ｔｒｉｓ酢酸１０ｍＭ、ｐＨ８）中に溶出した。
ライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットフォーム（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＫＫ４８２４）のための、ＫＡＰＡライブラリー定量化キットを使用して定量化し、そして、５０ｂｐ単一末端読み取りを、ＨｉＳｅｑ２５００上で製造業者のプロトコルにしたがって、配列決定した。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｆａｓｔｑファイルを、ｂｏｗｔｉｅを使用して、ＧＲＣｈ３７／ＵＣＳＣ ｈｇ１９ゲノムアセンブリーにマッピングし、そして、ＭＡＣＳバージョン２．１．０を使用して入力を用いてピークを要求した。
ｃＭｙｃエピトープに起因する偽陽性ピーク要求を避けるために、ｃＭｙｃエピトープのみを有するＣｈＩＰ－ｓｅｑを、ＳＯＸ１８－ｃＭｙｃ ＣｈＩＰ－ｓｅｑと並行して行い、これらの実験状態において要求されたピークをＳＯＸ１８－ｃＭｙｃ条件で要求されたピークに減算した。
Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ Ｔｏｏｌ（ＧＲＥＡＴ、ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿００５８０７）を使用して、ｃｉｓ調節領域の機能的有意性を分析した。
ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータは、ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓデータベース（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ａｒｒａｙｅｘｐｒｅｓｓ、ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿００２９６４）において受入番号Ｅ－ＭＴＡＢ－４４８０（ＳＯＸ７）およびＥ－ＭＴＡＢ－４４８１（ＳＯＸ１８）で入手可能である。
ＣｈＩＰ－ＭＳ（ＲＩＭＥ）
ＣｈＩＰ－ＭＳ実験を、以前に記載したように行った（Ｍｏｈａｍｍｅｄら、２０１３）。
ＳＯＸ１８－ｃＭｙｃおよびネガティブコントロール（ｃＭｙｃのみ）の間で共通するペプチドを捨て、そして、ＳＯＸ１８－ｃＭｙｃトランスフェクト細胞中で独自に検出されたペプチドのみを分析に関して考慮した。
ＲＮＡ－ｓｅｑおよび分析
４連のサンプルを全トランスクリプトーム配列決定のために、ＴｒｕＳｅｑ ｓｔｒａｎｄｅｄ総ＲＮＡライブラリーｐｒｅｐキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して処理した。
読み取りを、ＳＴＡＲアライナー（Ｄｏｂｉｎら、２０１３）を使用して、ｈｇ１９参照ヒトゲノムにマッピングし、そして、独特に整列した読み取りのみを考慮した。
転写産物を、ｈｔｓｅｑ＿ｃｏｕｎｔ（ＨＴｓｅｑパッケージ）（Ａｎｄｅｒｓ、ＰｙｌおよびＨｕｂｅｒ、２０１５）を使用して遺伝子に割り当て、差次的発現を、ＤＥｓｅｑ２（Ｌｏｖｅ、ＨｕｂｅｒおよびＡｎｄｅｒｓ、２０１４）を使用して計算した。調整されたｐ値＜０．０５を有する遺伝子を有意とみなした。
差次的発現された遺伝子を、ＳＯＸ１８過剰発現細胞において、Ｓｍ４処理およびＤＭＳＯコントロールの間で特定し、そして、上方調節および下方調節（ＤＯＷＮ）遺伝子に分離した。
それらの転写開始部位（ＴＳＳ）の位置を、ＥＮＣＯＤＥコンソーシアム（ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿００６７９３）と、本発明者らがこの研究にて行ったＳＯＸ１８およびＳＯＸ７ ＣｈＩＰ－ｓｅｑ実験とから、入手可能な転写因子結合事象の位置と相関させた。
ＴＳＳが非依存性であることを確認するため、ＴＳＳは、１ ＣｈＩＰ－ｓｅｑピークのみに割り当てることが許された。
２倍以上の絶対倍数変化（ｌｏｇ２ＦＣ≧１または≦－１）を有する転写産物を、ＴＳＳ分析の距離に含めた。ＴＳＳと結合事象の間の距離の中央値を、一組の無作為に選択された遺伝子の予想距離と比較して、中央比（ｍｅｄｉａｎ ｒａｔｉｏ）を得た。
遺伝子のコントロールセットを、ＨＵＶＥＣ内で発現した遺伝子のプールから、それらが同様の発現レベルの分布を有するように選択した。
ＳＯＸ１８および分析した任意の他の転写因子による、遺伝子の潜在的な共調節によりバイアスが導入されないことを確実にするために、本発明者らは、ＳＯＸ１８ピークを有する遺伝子を、他の転写因子の分析から減算した。
逆分析も行い、ｃ－ＪＵＮピークを含む遺伝子を、ＳＯＸ１８の分析から減算した。
ＲＮＡ－ｓｅｑデータは、ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓデータベース（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ａｒｒａｙｅｘｐｒｅｓｓ）にて受入番号Ｅ－ＭＴＡＢ－４５１１で入手可能である。
定量的ＲＴ－ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、７４１０６）を使用して、製造業者のプロトコルにしたがって、総ＲＮＡを抽出し、オンカラムＤＮＡ消化を含んだ。
高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、４３６８８１３）を使用して、１μｇの精製ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ＳＹＢＲグリーン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、４３１２７０４）方法を用いて、少なくとも３回の生物学的反復の技術的３連において、標的ｃＤＮＡの増幅および定量化を行った。
ＶｉｉＡ ７ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムを使用して、反応を３８４ウェルプレート内で、１０μＬで行った。
ハウスキーパー遺伝子（ｔｇ（Ｄｌｌ４ｉｎ３：ｅＧＦＰ）の場合はβ－アクチン、ｔｇ（－６．５ｋｄｒｌ：ｅＧＦＰ）の場合はｅｆ１α、ｔｇ（ｆｌｉ１ａ：ｅＧＦＰ、－６．５ｋｄｒｌ：ｍＣｈｅｒｒｙ）の場合はｃｈｄ５、ＨＵＶＥＣの場合はＲＰＬ１３およびＧＡＰＤＨ）を、実験条件のセットを通したそれらの発現の安定性に基づいて選択し、またはそれらの血管発現に基づいて選択して、内皮細胞含有量に対して正規化した。プライマー効率をＬｉｎＲｅｇＰＣＲを使用して計算し、そして、増幅データをＶｉｉＡ７ソフトウエアおよびＱ－ｇｅｎｅ ＰＣＲ分析テンプレートを使用して分析した。
ゼブラフィッシュ水産養殖および分析
ゼブラフィッシュを、以前記載されたように維持し（Ｈｏｇａｎら、２００９）、動物に関与する全手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ（ＩＭＢ／０３０／１６／ＮＨＭＲＣ／ＡＲＣ／ＨＦ）の動物倫理委員会のガイドラインに適合し、または地元の倫理評価により承認され、およびＵＫ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ（ＰＰＬ ３０／２７８３およびＰＰＬ ３０／３３２４）によりライセンス化された。
ｔｇ（－６．５ｋｄｒｌ：ｅＧＦＰ）、
ｔｇ（ｆｌｉ１ａ：ｅＧＦＰ、－６．５ｋｄｒｌ：ｍＣｈｅｒｒｙ）および
ｔｇ（Ｄｌｌ４ｉｎ３：ＧＦＰ）は、以前に記載された（Ｓａｃｉｌｏｔｔｏ ら、２０１３、Ｄｕｏｎｇら、２０１４、ＬａｗｓｏｎおよびＷｅｉｎｓｔｅｉｎ、２００２）。
デコリオネーション（Ｄｅｃｈｏｒｉｏｎａｔｉｏｎ）は、２５μｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬのプロナーゼを用いる処置により、各々２時間または一晩行った。
ゼブラフィッシュ幼生に、０．０１％トリカインを用いて麻酔をかけた。
代表的な幼生を、０．５％低融点アガロース中に包埋し、そして、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡を用いて画像化した。
ゼブラフィッシュインサイチューハイブリダイゼーションおよび切片分析
ゼブラフィッシュ（２８および４８ｈｐｆ）のホールマウントインサイチューハイブリダイゼーションを、ｄａｂ（Ｓｏｎｇら、２００４）およびエフリンＢ２ａ（Ｄｕｒｂｉｎら、１９９８）に関するプローブ鋳型を用いて、以前記載されたように行った（ＴｈｉｓｓｅおよびＴｈｉｓｓｅ、２００８）。
７０％グリセロールの添加前にＹｏｌｋ ｓａｃを除去した。
横行切片の場合、４％アガロース中に包埋された幼生全体を、Ｌｅｉｃａ ＶＴ１０００ Ｓ振動ミクロトームを使用して、１５０μｍで切片を作製した。
画像化は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ－５１明視野顕微鏡（ＩＳＨ）、およびＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０共焦点顕微鏡上で行った。
蛍光画像のために、幼生を包埋前にＤＡＰＩ染色した。
小分子処理およびモルホリノ注射
推定小分子阻害剤、および対応するコントロール条件を用いた全ての処理は、信頼できる均質な溶液を得るために低濃度のＤＭＳＯ（≦１％ ｖ／ｖ）の存在下で行い、そして、１０ｍＭ ＤＭＳＯストックから調製した。
細胞培養のために、トランスフェクション後に小分子を新鮮な培地に直接加え、そして、細胞回収の時点まで、この培地中で細胞を増殖させた。
ゼブラフィッシュが関与するインビボ実験のために、培地を置き換えることにより、指定した時点にて、化合物処理を開始し、培地＋化合物は、実験の期間中、毎日リフレッシュした。
必要な場合、ＰＴＵ処理（０．００３％）を、小分子と並行して行って、色素形成を遮断した。
以前公表され、検証された、ｓｏｘ７、ｓｏｘ１８（Ｈｅｒｐｅｒｓら、２００８）およびｒｂｐｊ（Ｓａｃｉｌｏｔｔｏら、２０１３）に対するモルホリノオリゴマーを、ｔｇ（６．５ｋｄｒｌ：ｅＧＦＰ）およびｔｇ（ｆｌｉ１ａ：ｅＧＦＰ，－６．５ｋｄｒｌ：ｍＣｈｅｒｒｙ）を用いて行った実験では、５ｎｇで、ｔｇ（Ｄｌｌ４ｉｎ３：ｅＧＦＰ）を用いて行った実験では、０．１２５～０．１５ｐｍｏｌの準最適濃度で、単一細胞ゼブラフィッシュ接合体にマイクロ注入した。
マウスおよびマウスモデル
ＢＡＬＢ／ｃ野生型（ＷＴ）をＷａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入し、そして、６～１０週齢の間に使用した。
マウス４Ｔ１．２乳癌細胞を、５％のＣＯ２インキュベーター内で、１０％のＦＢＳを有する完全ＲＰＭＩ中で培養した。
５×１０４の４Ｔ１．２腫瘍細胞を、前述されているようにＢＡＬＢ／ｃ ＷＴマウスの第４の乳房脂肪体中に接種した（Ｍｉｔｔａｌら、２０１４）。
手短には、腫瘍移植から３日後、マウスに２５ｍｇ／ｋｇ体重のＳｍ４、アスピリンまたはビヒクルＰＢＳを、毎日、１０日間、経口経管栄養した。
デジタルノギスを用いて、腫瘍サイズを２つの垂直直径の積として測定した。
７および１２日目にマウスから血漿を収集し、そして、４０００ Ｑｔｒａｐ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステム質量分析計を使用してＳｍ４濃度を分析した。
１２日目に、マウスに麻酔をかけて一次腫瘍を外科的に取り除き、または一次腫瘍を切除せずにマウスに手術手順を施し、創傷を外科用クリップで閉鎖した。腫瘍を組織学的検査のためにホルマリン中に収集した。
２８日目に肺を回収し、そして、ブアン固定液中で２４時間固定し、そして、転移性腫瘍小結節を切開顕微鏡下で計数した。
肺を回収しない実験においてマウスの生存率を監視した。
実験当たり６～１４匹のマウスのグループを実験腫瘍アッセイに使用して、生物学的差異の検出の十分な能力を確実にした。
全ての実験は、ＱＩＭＲ Ｂｅｒｇｈｏｆｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｐ１５０５）により承認された。
腫瘍中の脈管構造の定量化のために、固定組織を４％アガロース中に包埋し、Ｌｅｉｃａ ＶＴ１０００ Ｓ振動ミクロトーム上で、３００μｍで、全体の薄片を作製した。
切片をスライドガラス上に収集し、そして、灌流血管の浸透の明視野分析のために画像化した。
続いて、抗マウスエンドムチン（ｃａｔ＃ ｓｃ－５３９４１、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２１０００３８）、ＥＲＧ（ｃａｔ＃ ａｂ９２５１３、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２６３０４０１）、ＰＲＯＸ１（ＡｎｇｉｏＢｉｏ ｃａｔ＃１１－００２、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１００１３７２０）およびポドプラニン（ＡｎｇｉｏＢｉｏ ｃａｔ＃１１－０３３、ＡＢ＿２６３１１９１）抗体を使用して、切片に関する免疫蛍光染色を行った。
Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡上の１０×対物レンズを使用して、ｚ軸に沿って一連の画像を獲得することによって腫瘍切片全体を画像化した。
続いて、２０×対物レンズを使用して、各腫瘍から３～４つの別個の領域に関する高解像度画像を撮影して、腫瘍内の血管密度の不均一性を説明し、バイアスを最小限とした。
同一寸法（１２７４．８７μｍ×１２７４．８７μｍ×８９．０５μｍ）の未加工画像ファイルを、Ｉｍａｒｉｓ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ、ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿００７３７０）にロードし、そして、「ｓｐｏｔｓ」関数を使用して、ＥＲＧまたはＰＲＯＸ１陽性核および「表面」を計数して、エンドムチンまたはポドプラニン陽性血管の体積または面積を計算した。
各腫瘍に関して（ｎ＝６）、多数の領域からの数を平均し、データをＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６にてプロットした。
ＢＡＬＢ／ｃ野生型（ＷＴ）をＷａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入し、６～１０週齢で使用した。
マウス４Ｔ１．２乳癌細胞を、１０％ＦＢＳを有する、完全ＲＰＭＩ中で、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。
５×１０４の４Ｔ１．２腫瘍細胞を、以前記載されたように、ＢＡＬＢ／ｃ ＷＴマウスの第４の乳腺脂肪体内に接種した（Ｍｉｔｔａｌら、２０１４）。
手短には、腫瘍移植後の３日目に、マウスに、５ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の異なる用量のＳｍ４、またはビヒクルＰＢＳを毎日、１０日間、経口経管栄養した。
腫瘍サイズを、デジタルノギスを用いて、２つの垂直直径の積として測定した。
１２日目、マウスに麻酔をかけて、一次腫瘍を外科的に取り除き、そして、創傷を外科用クリップで閉鎖した。
腫瘍を、組織学的検査のためにホルマリン中に収集した。
マウスの生存を、実験当たり６～１２匹のマウスのグループにて監視して、生物学的差異の検出の十分な能力を確実にした。
全ての実験は、ＱＩＭＲ Ｂｅｒｇｈｏｆｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｐ１５０５）により承認された。
結果および考察
ＳＯＸタンパク質は、特異的相互作用パートナーを採用することにより、個々の標的遺伝子を活性化するが（ＳａｒｋａｒおよびＨｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ 、２０１３）、ＳＯＸＦグループ（ＳＯＸ１８－ＭＥＦ２ＣおよびＳＯＸ１７－ＯＣＴ４）に関する２つのみのタンパク質－タンパク質相互作用が今日まで特定されている（Ｈｏｓｋｉｎｇら、２００１、Ｊａｕｃｈら、２０１１）。
本発明者らは、最初に、不偏プロテオミクス技術の組み合わせを使用して、ＳＯＸ１８インタラクトーム（ＳＯＸ１８相互作用パートナーのネットワーク）をマッピングした。
質量分析と結合したクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ－ＭＳ）は、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）内のクロマチン結合ＳＯＸ１８に関連したタンパク質の初回通過スクリーニングを提供し（Ｍｏｈａｍｍｅｄら、２０１３）、次いで、ＡＬＰＨＡ－Ｓｃｒｅｅｎは、インビトロで翻訳された完全長タンパク質を使用して、ＳＯＸ１８依存性複合体をペアワイズ相互作用に転換した（図９Ａ）（Ｍｕｒｅｅｖら、２００９、Ｋｏｖｔｕｎら、２０１１、Ｓｉｅｒｅｃｋｉら、２０１３、Ｓｉｅｒｅｃｋｉら、２０１４、Ｇａｍｂｉｎら、２０１４）。
ＣｈＩＰ－ＭＳ分析は、ＳＯＸ１８に直接または間接的に関連した分子機能の多様な遺伝子オントロジー（ＧＯ）クラスを表す、２８９タンパク質を明らかにした（図９Ｂおよび１０Ａ～Ｃ）。
直接相互作用物質を特定する本発明者らの機会を増大させるために、本発明者らは、核酸および／またはタンパク質結合であることが既知のタンパク質に焦点を当てた（図９Ｂ、紫色）。
このサブセットから、本発明者らは、８つの既知の転写因子、ヘリカーゼ、コリプレッサー、ＲＮＡ結合およびＤＮＡ修復分子を選択した（図１０Ａ、Ｂ）。
本発明者らは、ＡＬＰＨＡ－Ｓｃｒｅｅｎを使用して、ＳＯＸ１８がそれ自体と相互作用し、そしてまた、ＤＤＸ１、ＤＤＸ１７、ＩＬＦ３、ＳＴＡＴ１、ＴＲＩＭ２８およびＸＲＣＣ５ともペアワイズ（ｐａｉｒｗｉｓｅ）相互作用を形成することを観察した（図９Ｃ、左列「＋」、および図１０Ｄ）。
加えて、本発明者らは、内皮細胞機能（ＥＳＲ１、ＮＲ２Ｆ２、ＲＢＰＪ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７およびＣＴＮＮＢ１）を調節できる、６つの周知のＴＦの潜在的なペアワイズ相互作用（ｐａｉｒｗｉｓｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）を研究し、そして、ＳＯＸ１８タンパク質パートナーＭＥＦ２Ｃのみを特定した（Ｈｏｓｋｉｎｇら、２００１）。
よく特徴付けられたＳＯＸ９ホモ二量体（Ｂｅｒｎａｒｄら、２００３）をポジティブコントロールとして含めてＡＬＰＨＡ－Ｓｃｒｅｅｎシグナルを検証した（図１０Ｄ）。
ＳＯＸ１８は、試験した全ての内皮転写因子と相互作用することが見出され、任意の閾値を下回る結合親和性を示すＳＯＸ１７およびＣＴＮＮＢ１は除外される可能性があった（図９Ｃ、「－」）。
ＳＯＸ１８と相互作用できる多種のタンパク質を特定し、次いで本発明者らは、これらの相互作用に対する小分子化合物、Ｓｍ４（図１０Ｅ）の活性試験に進んだ。
褐藻カウロシスティス・セファロルニトス（Ｃａｕｌｏｃｙｓｔｉｓ ｃｅｐｈａｌｏｒｎｉｔｈｏｓ）に見出される天然産物に由来するＳｍ４を、ハイスループットスクリーニングにて、潜在的なＳＯＸ１８遮断剤に関して特定した（実施例１参照）。
本発明者らは、Ｓｍ４が、検証された１２のＳＯＸ１８相互作用のうち６を有意に邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔ）することを見出し（図９Ｃ、右列）、ＩＣ５０値は、ＳＯＸ１８－ＳＯＸ１８の３．３μＭから、ＳＯＸ１８－ＲＢＰＪ二量体の６５．９μＭの範囲であった（図９Ｄおよび１０Ｆ）。
異なるＳＯＸＦメンバーに対するＳｍ４の差分効果（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ）を評価するために、本発明者らは、３つの全ＳＯＸＦタンパク質と、ＭＥＦ２Ｃ、ＲＢＰＪおよびＯＣＴ４との間の、ＰＰＩの更なるセットを探索した（図１１）。
ＳＯＸ１８と同様に、ＳＯＸ７は、その両方の相互作用がＳｍ４により、少なくとも部分的に邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔ）される、ＲＢＰＪおよびＳＯＸ１８自体と相互作用することができる。
本発明者らは、更に、３つの全ＳＯＸＦタンパク質が、ＯＣＴ４とヘテロ二量体を形成できるが、ＳＯＸ１７－ＯＣＴ４相互作用のみがＳｍ４の影響を受けることを見出した。
重要なことに、ＳＯＸ７およびＳＯＸ１７のいずれも、ホモ二量体を形成する能力を有さず、そして、したがって、Ｓｍ４作用モードのこの構成成分は、ＳＯＸ１８－ＳＯＸ１８相互作用に非常に特異的である。
更にこれを実証するように、ＳＯＸ９ホモ二量体化は、２００μＭまでＳｍ４により影響を受けなかった（Ｕｎｐｅｒｔｕｒｂｅｄ））（図９Ｃ―Ｄおよび１０Ｄ）。
これらの結果は、Ｓｍ４の選択性が、ＳＯＸ１８関連ＰＰＩのサブセットに傾くが、ＳＯＸ７またはＳＯＸ１７タンパク質パートナー採用を妨害する能力を有することを示す。
Ｓｍ４のこの特徴は、ＳＯＸＦリダンダンシー機構の阻止に利点を有する可能性がある（Ｈｏｓｋｉｎｇら、２００９、Ｋｉｍら、２０１６）。
ＳＯＸ１８ ＰＰＩ邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）がどのように転写調節不全に移行するかを評価するために、本発明者らは次に、ＨＵＶＥＣにおけるゲノムワイドＲＮＡ－ｓｅｑおよびＣｈＩＰ－ｓｅｑ分析の組み合わせを行った。
ＳＯＸ１８ ＣｈＩＰ－ｓｅｑピークから特定された、最も一般的な結合モチーフは、以前報告されたＳＯＸモチーフ５’－ＡＡＣＡＡＴ－３’に対応し（図１３Ａ）、そして、このＣｈＩＰ－ｓｅｑデータセットの有効性を、更にＧＯ ｔｅｒｍ分析と、Ｐｒｏｘ１およびＶｃａｍ１等の既知のＳＯＸ１８標的遺伝子の特定とにより確認した（図１３Ｂ）（Ｆｒａｎｃｏｉｓら、２００８、Ｈｏｓｋｉｎｇら、２００４）。
本発明者らは、ＳＯＸ１８過剰発現細胞におけるＳｍ４処理とＤＭＳＯコントロールとの全体的な転写効果を比較し（図１３Ｃ～Ｅ）、この差次的発現遺伝子のリストをＳＯＸ１８ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータセットに重ね合わせた。
この重ね合わせを使用して、本発明者らは、遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）とＴＦ結合事象との間の距離を、直接転写調節の可能性の代理として計算した。
この距離がどのようにＳｍ４により変更されるかの分析を可能にするために、本発明者らはランダム遺伝子セットのＴＳＳとＳＯＸ１８結合事象との間の参照距離を確立した（図１２Ａ）。
並行して、本発明者らは、ＳＯＸ７（インハウスで生成した）、およびＥＮＣＯＤＥコンソーシアムから入手可能な７つの全転写レギュレーター（ＧＡＴＡ２、ｃ－ＦＯＳ、ｃ－ＪＵＮ、ＣＴＣＦ、ＥＺＨ２、ＭＡＸ、ｃ－ＭＹＣ）に関して同じ分析を行った。
それにより、本発明者らは、ＳＯＸ１８を標的とする転写と、他の内皮特異的転写因子に関する潜在的なオフターゲット効果とを区別することができた。
累積的なＳＯＸ１８ピークからＴＳＳへの距離は、全体的に、ＳＯＸ１８ピークは、無作為に分布するＴＳＳより、Ｓｍ４下方調節遺伝子のＴＳＳに、３．６倍近い（ｐ値＜０．００１）ことを示した（図１２Ｂ、左上）。
これらの結果は、Ｓｍ４が影響を与えた遺伝子が、ＳＯＸ１８転写活性に対する特異的効果により調節不全にされることの間接的な指示である。
この相関は、試験した他の転写因子の７つでは観察されず（図１２Ｂおよび１３Ｆ）、Ｓｍ４がこれらのＴＦ活性にオフターゲット効果を有さないことを示している。
興味深いことに、Ｓｍ４下方調節遺伝子のＴＳＳは、ｃ－ＪＵＮ結合事象に、２．０５倍近かった（ｐ値＝０．０１１、添付ファイル１ｃ）。軽度にのみ有意であるが、このことは、Ｓｍ４下方調節遺伝子のこのサブセットに対するＳＯＸ１８およびｃ－ＪＵＮによる可能な共調節を示唆し得る。
実際に、ＳＯＸ１８ ＣｈＩＰ－ｓｅｑピークにおける既知のモチーフの分析により、ｃ－ＪＵＮ結合モチーフの過剰提示が明らかとなり（ＳＯＸ１８ピークの３．２３％、ｐ値＝１ｅ－３０２）、そして、ＡＬＰＨＡ－Ｓｃｒｅｅｎ分析は更に、ＳＯＸ１８およびｃ－ＪＵＮが物理的に相互作用し得ることを確立した（図１４）。
本発明者らは、試験した他のＴＦの発現レベルが、Ｓｍ４処理により変更されないことを見出した。
Ｓｍ４の存在下で、これらの転写因子に関する転写産物レベルのオフターゲット調節により、バイアスが導入されないことを示しているため、これは重要な観察事項である。
ＳＯＸ ＴＦファミリーメンバーに対する、Ｓｍ４の潜在的な転写オフターゲット効果の争点に対処するために、本発明者らは、密接に関係したＳＯＸＦおよびＳＯＸＥタンパク質に焦点を当てた。
Ｓｍ４は、細胞ベースのレポーターアッセイにおいて、任意の試験濃度（≦５０μＭ）で、ＳＯＸ１７またはＳＯＸ９タンパク質のいずれの転写活性にも影響を与えなかった（図１５）（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、２０１４、Ｌｅｆｅｂｖｒｅ ら、１９９７）。
まとめると、これらの結果は、他の重要な内皮転写因子およびＳＯＸタンパク質と比較して、ＳＯＸ１８介在転写を選択的に標的とすることの強力な証拠を提供する。
Ｓｍ４が、インビボで、Ｓｏｘ１８転写活性を攪乱できるか否かを研究するために、本発明者らは、Ｓｏｘ７およびＳｏｘ１８の組み合わせ活性に関する読み取りとして以前に検証されている、ｔｇ（－６．５ｋｄｒｌ：ｅＧＦＰ）遺伝子導入ゼブラフィッシュレポーターラインを使用した（Ｄｕｏｎｇら、２０１４）。
本発明者らは、これらの幼生を受精後（ｈｐｆ）の２０時間において処理し、Ｓｍ４処置は、モルホリノオリゴヌクレオチド（ＭＯ）を使用した、組み合わせｓｏｘ７／１８枯渇の効果と同様に、ＳＯＸ１８依存性ｅｇｆｐ転写産物レベルを有意に低下させる（６１％）ことを観察した（図１６Ａ、Ｂ）。
重要なことには、これらのゼブラフィッシュ胚は正常に発達し、そして、本発明者は毒性の証拠を見出さなかった。
次いで、本発明者らは、ｄｌｌ４遺伝子のイントロン３に位置する調節エレメントを持つ、第２の遺伝子導入ゼブラフィッシュレポーターラインｔｇ（Ｄｌｌ４ｉｎ３：ｅＧＦＰ）を使用した。
このＤｌｌ４ｉｎ３エンハンサーの活性は、内因性ｄｌｌ４発現を完全に再現するものではないが（Ｗｙｔｈｅら、２０１３、Ｓａｃｉｌｏｔｔｏら、２０１３）（Ｗｙｔｈｅら、２０１３およびＳａｃｉｌｏｔｔｏら、２０１３）、Ｓｏｘ７、Ｓｏｘ１８およびＮｏｔｃｈエフェクターＲｂｐｊの組み合わせ活性を研究する有用なツールを提供する。
ｓｏｘ７、ｓｏｘ１８およびｒｂｐｊとの組み合わせ遺伝的干渉は、Ｄｌｌ４ｉｎ３活性化を消失させることが示されているが、単一または二重ＭＯノックダウンは、遥かに軽度の効果を有する（Ｓａｃｉｌｏｔｔｏら、２０１３）。
この軽度の抑圧効果は、Ｓｍ４単独を用いた処理により再現された（図１６Ｃ、Ｄ）。
加えて、準最適用量のｒｂｐｊ ＭＯ注射を、Ｓｍ４処理と組み合わせた場合、抑圧効果は有意に１１．５％増大した（図１６Ｃ、Ｄ）。これらのデータは、Ｓｍ４が、Ｄｌｌ４ｉｎ３エンハンサーのＳｏｘ７／１８およびＲｂｐｊ協調活性化を妨害することを示す。
インビボでのネガティブコントロールとして、本発明者らは、Ｓｏｘ９依存性ｔｇ（ｃｏｌ２ａ１：ｙｆｐ）レポーターラインを使用し、そして、受精後の２～６日の間の連続Ｓｍ４処理は、Ｓｏｘ９の転写活性、または軟骨形成のプロセスを攪乱しないことを観察した（図１７）。
まとめると、これは、インビボでの選択的ＳＯＸ１８阻害剤としてのＳｍ４に関する提案された作用機構を支持する。
更にインビボでのＳｏｘ１８機能の小分子阻害を示すために、本発明者らは、次にＳｍ４処置が、ｓｏｘ７／ｓｏｘ１８遺伝的邪魔された（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ）ゼブラフィッシュのものと同様の血管表現型を生じることができるか否かを研究した（Ｈｅｒｍｋｅｎｓら、２０１５）。この表現型は、動静脈特定化欠陥により特徴付けられ、動脈マーカーの発現レベルが低下している（Ｃｅｒｍｅｎａｔｉら、２００８、Ｈｅｒｐｅｒｓら、２００８、Ｐｅｎｄｅｖｉｌｌｅら、２００８）。
本発明者らは、関連発達時間中に、１６ｈｐｆから開始して、動脈／静脈レポーターｔｇ（ｆｌｉ１ａ：ｅＧＦＰ、－６．５ｋｄｒｌ：ｍＣｈｅｒｒｙ）を持つゼブラフィッシュ幼生を１．５μＭ Ｓｍ４で処理した（図１８Ａ）。
これらの幼生は、背側大動脈（ＤＡ）を犠牲にして、拡大した後主静脈（ＰＣＶ）を獲得し（図１６Ｅ～Ｇおよび１８Ｂ）、動静脈シャントおよび不完全な体幹循環を有した（図１８Ｃ、Ｄ）。２４および４８ｈｐｆにおける血管マーカーのｑＲＴ－ＰＣＲ分析により、ＤＭＳＯと比較して、Ｓｍ４処理条件下での動脈および静脈遺伝子、特にｅｆｎｂ２ａ、ｈｅｙ１およびｅｆｎｂ４ａの有意な調節不全が明らかとなった（図１６Ｈおよび１８Ｅ）。
動静脈特定化におけるＳｏｘＦリダンダンシーに起因して、Ａ／Ｖ形成異常表現型は、一般に、Ｓｏｘ７およびＳｏｘ１８機能の二重喪失においてのみ観察される。Ｓｍ４はインビトロでＳｏｘ７－ＲｂｐｊおよびＳｏｘ７－Ｓｏｘ１８ ＰＰＩを部分的に妨害するように思われるため、本発明者らは、Ｓｏｘ７特異的表現型に注目して、このＴＦ活性がインビボでＳｍ４により阻害されるか否かを評価した。ｓｏｘ７遺伝的邪魔（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）の特徴は、背外側動脈により形成された頭部内の短い循環ループであり（Ｍｏｈａｍｍｅｄら、２０１３）、顔面循環に攪乱をもたらす（Ｈｅｒｍｋｅｎｓら、２０１５）。
Ｓｍ４の存在下で、本発明者らは、部分的Ｓｏｘ７機能喪失表現型のＬＤＡレミニセント（ｒｅｍｉｎｉｓｃｅｎｔ）に対する少々の形成異常を観察した。
しかしながら、頭部内の血液循環は、Ｓｍ４処理幼生では影響がなく、短い循環ループは完全には形成されていないことを示す。この表現型は、Ｓｏｘ７活性が小化合物の存在下でのみ部分的に影響を受けるという結論を支持する。
概して、これらの結果は、インビトロで観察されたゲノムワイド阻害効果と一致し、Ｓｍ４がインビボでＳｏｘ１８の転写活性およびＳｏｘＦ仲介血管形成を選択的に妨害することを示す。
治療関連の設定におけるＳｍ４の抗血管新生の可能性の最終的な証明として、本発明者らは次に、乳癌の前臨床モデルにおけるその有効性を評価した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺脂肪体内に、高転移性の４Ｔ１．２乳癌細胞を接種し、そして、３日間腫瘍を生着させ、その後、２５ｍｇ／ｋｇ／日のＳｍ４、アスピリンまたはビヒクルＰＢＳのいずれかを用いた処置を開始した（図１９Ａ）。
アスピリンは、Ｓｍ４との構造的類似性によって、ネガティブコントロールとして選択された。
毎日の処置を１０日間の間維持し、その後、一次腫瘍を切除し、疾病反応時間（ｌａｔｅｎｃｙ）に対する効果を監視した（図１９Ａ）。
標的関与の間接的な指標として、本発明者らは、最初に、インサイチューハイブリダイゼーションにより、４Ｔ１．２腫瘍脈管構造内のＳｏｘ１８の発現を確認した（図１９Ｂ）。
本発明者らは、次に、処置の過程中のＳｍ４バイオアベイラビリティの測定に進んだ。
２つの異なる時点で、血漿中のＳｍ４を一貫して検出し、平均濃度は経時的に３８．３μｇ／ｍＬから５５．２μｇ／ｍＬへ増大した（図１９Ｃ）。
ＰＢＳビヒクル－またはアスピリン処置マウスは、４Ｔ１．２腫瘍負荷に屈し、中央反応時間は各々３３および３４日であった（図１９Ｄ）。
一方、Ｓｍ４処置マウスは、全体的な生存が有意に増大し、中央反応時間は４４日であった（ｐ値＜０．０１）。
図２０ＩのＳｍ４用量応答の評価に示すように、Ｓｍ４の濃度の増大により、４Ｔ１．２接種マウスの全体的な生存の更なる改善がもたらされた。
例として、５０ｍｇ／ｋｇのＳｍ４によるマウスの処置は、７３日間の中央反応時間をもたらし、一方、ビヒクル処置マウスでは４０日間の中央反応時間がもたらされた。
更に、何がそのような効果を引き起こし得るかを研究するために、処置中に腫瘍のサイズおよび自発的肺転移の形成を監視した。
一次腫瘍のサイズは、Ｓｍ４処置により不変であったが（図１９Ｅ）、本発明者らは、腫瘍接種後の２８日目に、肺転移の平均数における６７％の低下を見出した（図１９Ｆ）。
手術の結果としての炎症性応答による任意の寄与を排除するために、本発明者らは、腫瘍を切除することなく、偽手術を行うことにより研究を繰り返した（図２０Ａ、Ｂ）。この手法により、手術後の期間中、一次腫瘍成長はＳｍ４処置により 影響を受けない（Ｕｎｐｅｒｔｕｒｂｅｄ）ことが確認され、そして、Ｓｍ４と手術誘導による炎症との組み合わせ効果は、生存の増大に関与しない可能性があることが示された。
転移率と、腫瘍により誘導される血管応答との相関関係を確立するために、本発明者らは、腫瘍内および腫瘍周辺領域内の血管密度を研究した（図１９Ｇおよび２１）。
腫瘍全体を切開し、明視野顕微鏡法により、赤血球の存在により示されるように、血管適用範囲の全体的な低下が明らかとなった（図１９Ｇ、星形）。
更に、免疫蛍光染色を用いた内皮細胞マーカーＥＲＧ（核）およびエンドムチン（ＥＭＣＮ、膜性）に関する分析により、Ｓｍ４処理マウスの腫瘍において、内皮細胞数（４８％、ｐ値＜０．０５）および血管体積の有意な低下（５５％、ｐ値＜０．０１）が示された（図１９Ｈ、Ｉおよび２２）。
リンパ特異的マーカーである、ＰＲＯＸ１およびポドプラニン（ＰＤＰＮ）を使用して、本発明者らはまた腫瘍誘導リンパ脈管新生応答に対するＳｍ４の効果を評価し、リンパ管に関連した腫瘍の密度、およびリンパ内皮細胞の数（７０％、ｐ値＜０．００１）は、処置状態において、多大に低下することを見出した（６５％、ｐ値＜０．０１）（図２３）。
このＳｍ４処置に対するリンパ応答は、固形癌のリンパ伝播中のＳＯＸ１８機能喪失と一致する（Ｄｕｏｎｇら、２０１２）。
まとめると、このことは、Ｓｍ４が、腫瘍誘導脈管新生およびそれに関連した転移を妨害することにより、誘導された乳癌の予後を改善したことを示す。
血管－およびリンパ脈管新生の誘導は、固形癌の特徴であり、腫瘍転移性播種の可能化への重大な一歩である。
標的転写因子に対する従来の手法は、腫瘍細胞変換を促進することが、調整不能になった癌遺伝子を妨害することに焦点を当てていた（Ｇｏｒｍａｌｌｙ、２０１４、Ｉｌｌｅｎｄｕｌａら、２０１５、Ｍｏｅｌｌｅｒｉｎｇら、２００９、Ｚｈａｎｇら、２０１２）。
本明細書で、本発明者らは、転移性伝播を促進し得る、宿主脈管構造からの発達転写因子の標的化に依存する新規な相補的戦略を検証する。
本発明者らの結果は、Ｓｍ４による転写因子ＳＯＸ１８の標的化が、乳癌の前臨床モデルにおける転移性伝播を妨害するための有効な分子戦略であるという概念の証明を提供する。
本明細書全体を通して、目的は、本発明を任意の一実施形態または特定の特徴の収集に限定することなく、本発明の好ましい実施形態を記載することであった。
したがって、本開示を踏まえて、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な修正および変更を例示された特定の実施形態に為し得ることが当業者により認識されるであろう。
本明細書に言及した全てのコンピュータープログラム、アルゴリズム、特許および科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
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Ｓｏｎｇ，Ｈ．Ｄ．，Ｘ．Ｊ．Ｓｕｎ，Ｍ．Ｄｅｎｇ，Ｇ．Ｗ．Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｚｈｏｕ，Ｘ．Ｙ．Ｗｕ，Ｙ．Ｓｈｅｎｇ，Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｚ．Ｒｕａｎ，Ｃ．Ｌ．Ｊｉａｎｇ，Ｈ．Ｙ．Ｆａｎ，Ｌ．Ｉ．Ｚｏｎ，Ｊ．Ｐ．Ｋａｎｋｉ，Ｔ．Ｘ．Ｌｉｕ，Ａ．Ｔ．Ｌｏｏｋ，ａｎｄ Ｚ．Ｃｈｅｎ．２００４．“Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｋｉｄｎｅｙ ｍａｒｒｏｗ．”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０１（４６）：１６２４０－５．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０４０７２４１１０１．
Ｔｈｉｓｓｅ，Ｃ．，ａｎｄ Ｂ．Ｔｈｉｓｓｅ．２００８．“Ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｓｉｔｕＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｗｈｏｌｅ－ｍｏｕｎｔ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｅｍｂｒｙｏｓ．”Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ３（１）：５９－６９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００７．５１４．
Ｗｙｔｈｅ，Ｊ．Ｄ．，Ｌ．Ｔ．Ｄａｎｇ，Ｗ．Ｐ．Ｄｅｖｉｎｅ，Ｅ．Ｂｏｕｄｒｅａｕ，Ｓ．Ｔ．Ａｒｔａｐ，Ｄ．Ｈｅ，Ｗ．Ｓｃｈａｃｈｔｅｒｌｅ，Ｄ．Ｙ．Ｓｔａｉｎｉｅｒ，Ｐ．Ｏｅｔｔｇｅｎ，Ｂ．Ｌ．Ｂｌａｃｋ，Ｂ．Ｇ．Ｂｒｕｎｅａｕ，ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｆｉｓｈ．２０１３．“ＥＴＳ ｆａｃｔｏｒｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ Ｖｅｇｆ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｒｔｅｒｉａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．”Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ２６（１）：４５－５８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｄｅｖｃｅｌ．２０１３．０６．００７．
Ｙａｎｇ，Ｈ．，Ｓ．Ｌｅｅ，Ｓ．Ｌｅｅ，Ｋ．Ｋｉｍ，Ｙ．Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｈ．Ｋｉｍ，Ｒ．Ｈ．Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ｍ．Ｗｅｌｌｓ，Ｓ．Ｊ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｇ．Ｙ．Ｋｏｈ，ａｎｄ Ｉ．Ｋｉｍ．２０１３．“Ｓｏｘ１７ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｕｍｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ ｔｕｍｏｒ ｖｅｓｓｅｌｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．”Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２３（１）：４１８－３１．ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ６４５４７．
Ｙｏｕｎｇ，Ｎ．，Ｃ．Ｎ．Ｈａｈｎ，Ａ．Ｐｏｈ，Ｃ．Ｄｏｎｇ，Ｄ．Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｊ．Ｏｌｓｓｏｎ，Ｇ．Ｅ．Ｍｕｓｃａｔ，Ｐ．Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｊ．Ｒ．Ｇａｍｂｌｅ，ａｎｄ Ｐ．Ｋｏｏｐｍａｎ．２００６．“Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ ＳＯＸ１８ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ，ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．”Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９８（１５）：１０６０－７．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｊｎｃｉ／ｄｊｊ２９９．
Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｐ．Ｙｕｅ，Ｂ．Ｄ．Ｐａｇｅ，Ｔ．Ｌｉ，Ｗ．Ｚｈａｏ，Ａ．Ｔ．Ｎａｍａｎｊａ，Ｄ．Ｐａｌａｄｉｎｏ，Ｊ．Ｚｈａｏ，Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｔ．Ｇｕｎｎｉｎｇ，ａｎｄ Ｊ．Ｔｕｒｋｓｏｎ．２０１２．“Ｏｒａｌｌｙ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｌｅ ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｔ３ ｒｅｇｒｅｓｓｅｓＨｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０９（２４）：９６２３－８．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１１２１６０６１０９．
Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｓ．Ｈｕａｎｇ，Ｗ．Ｄｏｎｇ，Ｌ．Ｌｉ，Ｙ．Ｆｅｎｇ，Ｌ．Ｐａｎ，Ｚ．Ｈａｎ，Ｘ．Ｗａｎｇ，Ｇ．Ｒｅｎ，Ｄ．Ｓｕ，Ｂ．Ｈｕａｎｇ，ａｎｄ Ｊ．Ｌｕ．２００９．“ＳＯＸ７，ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ，ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．”Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２７７（１）：２９－３７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃａｎｌｅｔ．２００８．１１．０１４．

Claims (25)

  1. 式（Ｉ）：
    Figure 2023011613000030
     式中、
    Ｒ１は、ＯＨおよびＯＲ６からなる群から選択され、
    Ｒ６はＣ１～Ｃ４アルキルであり；
    Ｒ２は、Ｈ、ＣＯＯＲ７およびＣ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９からなる群から選択され、
    Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、独立してＨおよびＣ１～Ｃ４アルキルから選択され；
    Ｒ３は、Ｌ－Ａであり、
    Ｌは、Ｃ２～Ｃ８アルキル、Ｃ２～Ｃ８アルケニルおよびＣ２～Ｃ８アルコキシアルキルから選択されるリンカーであり、
    Ａは、所望により置換されたフェニルおよび所望により置換されたナフチルから選択され；
    Ｒ４は、Ｈ、ＯＲ１０、ハロおよびＣ１～Ｃ４アルキルからなる群から選択され、
    Ｒ１０は、ＨおよびＣ１～Ｃ４アルキルから選択され；そして、
    Ｒ５は、ＨおよびＯＲ１１、ハロおよびＣ１～Ｃ４アルキルからなる群から選択され、
    Ｒ１１は、ＨおよびＣ１～Ｃ４アルキルから選択され、
    前記化合物は、ＳＯＸ１８活性の阻害に使用されるためのものである。
    の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物若しくはプロドラッグ。
  2. Ｒ１が、ＯＨおよびＯＭｅからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｒ２が、Ｈ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅおよび
    Figure 2023011613000031
     からなる群から選択される、請求項１または２に記載の化合物。
  4. Ｒ４が、Ｈ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＣｌおよびＭｅからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。
  5. Ｒ５が、Ｈ、ＯＨおよびＯＭｅからなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。
  6. Ｒ４およびＲ５がＨである、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物。
  7. Ｌが、Ｃ２～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニルおよびＣ２～Ｃ６アルコキシアルキルから選択されるリンカーである、請求項１～６のいずれか一項に記載の化合物。
  8. Ｒ３が：
    Figure 2023011613000032
     式中、破線は、隣接する原子から式Ｉの環への結合を示し、示される構造は、そのＥ／Ｚ異性体を含む）
    からなる群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物。
  9. 前記化合物が：
    Figure 2023011613000033
    Figure 2023011613000034
    Figure 2023011613000035
    からなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物。
  10. 前記ＳＯＸ１８活性が、ＤＮＡ配列および／またはタンパク質に対する接触および／または結合を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物。
  11. 前記タンパク質が、ＳＯＸ７、ＲＢＰＪ、ＸＲＣＣ５、ＳＯＸ１８、ＩＬＦ３、ＤＤＸ１７およびそれらの任意の組み合わせからなるリストから選択される、請求項１０に記載の化合物。
  12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物若しくはプロドラッグと、薬学的に許容できる担体、希釈剤および／または賦形剤とを含む医薬組成物。
  13. 対象における血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態の処置または予防方法であって、有効量の請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物、若しくはその薬学的に有効な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグ、または請求項１２に記載の医薬組成物を前記対象に投与することにより、前記血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態を処置または予防するステップを含む、方法。
  14. 血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態の前記処置または予防のための医薬の製造における、請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に有効な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグの使用。
  15. 前記血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態が、眼科疾病、疾患または状態でありまたはそれを含む、請求項１３に記載の方法または請求項１４に記載の使用。
  16. 前記眼科疾病、疾患または状態が、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、虚血性網膜症、未熟児の網膜症、血管新生緑内障、虹彩血管新生、角膜血管新生、毛様体炎、鎌状細胞網膜症、翼状片、角膜損傷中の血管応答およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法または使用。
  17. 前記血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態が、癌でありまたは癌を含む、請求項１３に記載の方法または請求項１４に記載の使用。
  18. 前記癌が、前立腺癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、腎癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、黒色腫、肝細胞腫、肝細胞癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、血管新生物およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法または使用。
  19. 前記化合物または前記医薬組成物が、前記癌の転移を予防および／または阻害する、請求項１７または１８に記載の方法または使用。
  20. 前記血管新生および／またはリンパ脈管新生関連の疾病、疾患または状態が、腎疾病、疾患または状態でありまたはそれを含む、請求項１３に記載の方法または請求項１４に記載の使用。
  21. 前記腎疾病、疾患または状態が、慢性腎移植片機能不全、原発性腎線維化疾患、蛋白尿、糖尿病性腎症、腎炎症およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法または使用。
  22. 対象における癌の転移の阻害または予防方法であって、有効量の請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物、若しくはその薬学的に有効な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグ、または請求項１２に記載の医薬組成物を前記対象に投与することにより、前記癌の転移を阻害または予防するステップを含む、方法。
  23. 対象におけるＳＯＸ１８活性の阻害、予防または低減方法であって、有効量の請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物、若しくはその薬学的に有効な塩、溶媒和物若しくはプロドラッグ、または請求項１２に記載の医薬組成物を前記対象に投与することにより、前記対象における前記ＳＯＸ１８活性を阻害、予防または低減するステップを含む、方法。
  24. 前記ＳＯＸ１８活性が、ＤＮＡ配列および／またはタンパク質に対する接触および／または結合を含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記タンパク質が、ＳＯＸ７、ＲＢＰＪ、ＸＲＣＣ５、ＳＯＸ１８、ＩＬＦ３、ＤＤＸ１７およびそれらの任意の組み合わせからなるリストから選択される、請求項２４に記載の方法。
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