CN101062043B - 3,4,5,4'-四甲氧基二苯乙烷-3’-o-磷酸二钠在抗肿瘤及其转移药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’O-磷酸二钠盐在制备抗肿瘤及抑制肿瘤转移药物中的应用。3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐通过抑制微管蛋白的聚合、选择性的导致肿瘤血管功能紊乱和结构的破坏、诱导血管内皮细胞调亡，使得肿瘤细胞失去营养和氧气的支持，而发挥其杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤转移的作用。
Description
技术领域
本发明涉及3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’O-磷酸二钠盐的用途。
背景技术
癌症是一种严重危害人类健康的疾病。在全球，癌症每年大约夺去600万人的生命，并有1000万人处于死亡的边缘。世界卫生组织预测：21世纪癌症将成为人类的“第一杀手”。根据全国性死因回顾调查表明，20年来中国的癌症发病和死亡率逐年上升，每5个因病死亡的人中，就有1个是死于癌症，每200个家庭中，有1个家庭因有癌症病人而遭受磨难。
在过去的几十年中出现了多种癌症治疗方法，主要包括手术治疗、放射治疗、化学治疗、激素治疗、基因治疗和免疫治疗。其中，手术治疗、放射治疗、化学治疗已成为主要手段。化学治疗指运用化学药物来治疗癌症。化学药物治疗是肿瘤诊疗中发展最快的一个领域，大量的针对不同靶点的新药开始应用于临床，对药物作用机制及药代动力学研究的进展，也使临床给药途径与方式更加适合于杀伤肿瘤细胞、保护正常组织。
目前化学治疗的药物主要有：影响核酸生物合成的药物(抗代谢物)，如：氟尿嘧啶、6-羟基嘌呤、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、羟基脲；直接破坏DNA并阻止其复制的药物如：烷化剂类；抗肿瘤抗生素类如：顺铂及卡铂；干扰转录过程阻止RNA合成的药物，如：放线菌素D、阿霉素、其他抑制转录过程的抗生素；影响蛋白质合成的药物，如：长春碱类、鬼臼毒素类、三尖杉酯碱、L-门冬酰胺酶；激素类，如：肾上腺皮质激素、雌激素、雄激素、他莫西芬、氨鲁米特。目前常用抗癌化疗与放疗的方法可造成对人体不利的严重毒副反应。
许多天然药物的干扰微管蛋白聚合或解聚特性，被认为是具有抗肿瘤的活性，包括长春新碱，紫杉烷和大环内酯类抗肿瘤药。微管在细胞分裂中具有重要作用，开发微管蛋白结合因子是基于他们具有干扰细胞增殖的能力。微管蛋 白的解聚因子，如秋水仙素和长春新碱，具有抗有丝分裂的作用，导致肿瘤血管闭合。但是这个使肿瘤血管闭合的作用只能在药量接近MTD(最高耐受剂量)时产生。最新被发现的血管生成抑制因子Endostatin，对新生血管生成有抑制作用，而对已形成的血管并没有明显作用，对肿瘤血管也没有明显的靶向作用。
近几年发现的一类新型的微管蛋白解聚因子能解决这个问题，它能在低于MTD的剂量下就能使血管闭合(Expert Opin Investig Drugs.2004Sep；13(9)1171-82)。Lo
c Vincent等人在2005年提到了一类具有类似属性的新型微管蛋白解聚因子，作为血管靶点因子(VTAs)能破坏微管蛋白骨架，文献数据显示血管靶点因子能选择性诱导肿瘤血管的衰退，部分通过VE-cadherin信号通道。这类微管蛋白解聚因子选择性的破坏肿瘤血管，并阻止新生肿瘤血管形成，而且对正常血管系统没有影响。同时它能抑制微管蛋白的聚合、选择性的导致肿瘤血管功能紊乱和结构的破坏、诱导血管内皮细胞调亡，使得肿瘤细胞失去营养和氧气的支持，而发挥其杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤转移的作用。
Gillian M.Tozer等人于2005年曾在具影响力的杂志Nature Rev Cancer中报道，指出该类化合物不但影响血管内皮细胞的增殖，也影响内皮细胞的迁移，快速改变血管内皮细胞形态，引起内皮细胞凋亡，打断血管中内皮细胞的连接，从而迅速导致肿瘤血管功能紊乱和结构的破坏。由于一般正常血管都是通过平滑肌细胞支撑的，这一类化合物只作用于没有平滑肌细胞支持的血管，对平滑肌支持的血管没有影响，从而迅速并有选择性的导致肿瘤血管功能紊乱和结构的破坏，进而能选择性的作用于肿瘤细胞，对正常细胞的毒性大大降低(NatRev Cancer.2005Jun；5(6)423-35、J.Clin.Invest.，November1，2005；115(11)：2992-3006)。这类药物目前被认为是抗肿瘤最有前景的药物之一。
目前国外同时在开展研究的该类药物只有CombretastatinA-4进入临床研究，由于通过双键连接，在Combretastatin中芪类单元的最有效破坏肿瘤血管是顺式构型，而反式构型的芪类化合物对肿瘤没有抑制作用。由于存在顺反异构，极易发生异构化等反应，反式结构不但没有药效，同时也会带来一定的毒副作用(CombretastatinA-4LD50为500mg/kg)，使得CombretastatinA-4在保存和实际应用中带来了很大的困难。
本发明中3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐(AP)为合成的化合物，其结构式如式(I)：
它是由本公司自己创新、研制的一种全新化学物质、全新结构的肿瘤血管抑制剂，不同于CombretastatinA-4，两个苯环是通过单键连接，使得3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐和CombretastatinA-4结构的不同、构象、结合力、逆反等作用都不同，极大的提高了药物的稳定性(光能使CombretastatinA-4异构为反式构型。因此需要避光保存)，也提高了对微管蛋白的作用功能，同时具有了更低的毒副作用(3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐的LD50为1243.0377mg/kg，CombretastatinA-4的LD50为500mg/kg，而环磷酰胺为小鼠和大鼠口服LD50分别为350和94mg/kg，顺铂大鼠腹腔给药为13-14mg/kg)和更低的有效浓度，实验结果表明，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐的最低有效剂量为20mg/kg，相比CombretastatinA-4的50mg/kg，要降低一倍以上。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐具有良好的水溶性，它通过定向打靶，针对性地作用于是肿瘤血管，对非肿瘤血管没有作用，这比直接抑制肿瘤细胞生长的传统化疗药物有更大的优势；克服了传统的抗肿瘤药物的毒副作用大，会导致耐药的局限。对其在抗肿瘤和抑制肿瘤转移的作用的研究表明，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐不但对肿瘤细胞具有杀伤作用，在对肝癌、肺癌等肿瘤的试验表明，它比目前常规的化疗药物环磷酰胺的抗癌作用更强，而且具有显著的抑制肿瘤转移的效果。联合用药的试验表明，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐对于化疗药物具有显著的增效作用。
发明内容
本发明的一个目的在于提供式(I)化合物，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐在制备治疗肿瘤药物中的应用。
其中Na也可以为H、Na、K或NH4等金属、铵盐或有机胺。
本发明的另一个目的在于提供式(I)化合物，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐在制备抑制肿瘤转移药物中的应用。
本发明的再一个目的在于提供式(I)化合物，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐在制备联合抗肿瘤药物的应用。
本发明所指的肿瘤可为实体肿瘤例如肉瘤和癌(例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝脏肿瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维耳姆斯氏瘤、颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和成视网膜细胞瘤)，也可为血液瘤例如白血病(例如急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性髓母细胞白血病、急性前髓细胞白血病、急性髓单核细胞白血病、急性单核细胞细胞白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多、淋巴瘤(何杰金氏病、非何杰金氏病)、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链病。优选地，为肉瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、白血病、人食管癌、胃腺癌。
研究表明，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐通过抑制微管蛋白的聚合、选择性的导致肿瘤血管功能紊乱和结构的破坏、诱导血管内皮细胞调亡，使得肿瘤细胞失去营养和氧气的支持，而发挥其杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤转移的作用。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐还可以联合其他治疗方法，如化学治疗、外科手术、放射治疗、免疫疗法、抗血管生成疗法或者基因疗法，显著增加对肿瘤的治疗效果。优选地，所述另外的治疗为使用抗肿瘤药物的化学疗法。更优选地，所述另外的治疗为使用细胞毒素和抗增殖、抑制血管生成的药物的治疗，优选的药物包括顺铂、氟尿嘧啶、阿霉素、瘤可宁、美法仑、红豆杉醇、依立替康(irinotecan，CPT-11)、阿瓦斯汀(Avastin)、ZD6126(N-acetylcochinol-O-phosphate)和脉管钙黏蛋白(vascular endothelial-cadherin)的抗体：anti-VE-cadherin(BV13)或against VE-cadherin(E4G10)等。
在抗肿瘤药物中使用3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐作为有效成分时，最低有效剂量为20mg/kg，相比CombretastatinA-4的50mg/kg，要降低一倍以上。3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐的LD50为1243.0377mg/kg，相比CombretastatinA-4的LD50为500mg/kg，要提高2倍以上，极大地增加了其安全窗口，对治疗各种肿瘤带来极大的便利和选择的余地。
实验数据表明，AP具有广谱的抗肿瘤作用，尤其在抗肺癌，黑色素瘤以及S180肿瘤模型中有更加明显的抑制肿瘤的效果。对肺癌有很好的抑制作用，特别是100mg/kg.d剂量组，抑瘤率达到72％以上，明显比目前常规的环磷酰胺的抗癌作用强(实施例3)。对小鼠黑色素瘤B16有很好的抑制作用，在25mg/kg剂量组的抑瘤率达到52％以上(实施例5)。对S180肿瘤的实验数据(实施例9)表明，该药物的最低有效剂量达到20mg/kg左右，比同类型的combretastatinA-4最低有效剂量要降低一倍以上。在与50mg/kg剂量组中，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐的抑瘤效果要好于combretastatinA-4。
在与DDP联合治疗肝癌实验中(实施例8)，AP100mg/kg的抑瘤率为41.9％、AP100mg/kg+DDP2.5mg/kg的抑瘤率为79.7％；阳性对照组抑瘤率为73.3％。表明3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐与DDP治疗肝 癌的联合用药具有很好协同治疗作用，联合用药不但比AP单独给药效果明显，同时也比阳性对照组有更好的抑制肿瘤效果。
在与DDP联合用药对S180肿瘤模型实验中(实施例10、11)，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐不但显示了与DDP的联合用药对抑制S180肿瘤有很好的协同作用，同时在改善动物生活质量以及延长生命有明显的效果。其中AP300mg/kg+DDP2.5剂量组平均延长生命达到10天左右，存活率增大一倍以上，实验延续了一个月左右，该剂量的肿瘤小鼠基本的存活，由此可见，AP可能达到治愈肿瘤的效果。
以3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐为药效成分，添加药学上可接受的药用辅料并通过本领域的常规方法可以制备用于本发明的药物制剂。本药物制剂的剂型可以是：口服给药的剂型诸如片剂、胶囊(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊和微囊)、粉剂、颗粒剂和糖浆剂；非口服给药的剂型诸如注射剂、冻干制剂、栓剂、丸剂、凝胶剂和贴剂。除这些常规剂型外，还可以将口服的速释固体制剂(例如片剂、颗粒剂等)和用于口服或非口服给药的缓释制剂(片剂、颗粒、精细颗粒、丸剂、胶囊、糖浆、乳剂、悬浮液、溶液)用于本发明，通过常规方法也可以制备这些制剂。本发明中的制剂可以是包衣或未包衣的形式，视需要而定。本发明优选的是将3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐用于注射给药和口服的剂型。
本发明中的药用辅料包括用于固体制剂的赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、稳定剂、发泡剂、包衣剂等，或用于半固体制剂、液体制剂的溶剂、增溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂、润肤剂、乳化剂等，此外，也可以根据需要使用其它药用添加剂诸如防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂和矫味剂等。
下列实施例只用于说明发明，而对本发明的保护范围无任何的限制。
具体实施方式
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐的制备
【实施例1】3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐的制备
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐(AP)由浙江赛尔生物医学研究有限公司提供，其他试剂材料如无特别说明均为市售产品。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐(AP)的制备方法具体描述如下：
1、3，4，5-三甲氧基苄醇的制备
250ml的三颈瓶中，加入3，4，5-三甲氧基苯甲醛15g(76.45mmol)，200ml的无水乙醇，加热40℃溶解，再加入硼氢化钠1.48g(38.23mmol)，加热回流45min后，TLC检测，反应完全后，冷却至室温，加入去离子水10ml(555.8mmol)，淬灭后，抽滤，滤渣用20ml无水乙醇洗涤，合并滤液后，用旋转蒸发仪浓缩至干，加入100ml二氯甲烷溶解，用2N氢氧化钠溶液50ml×2洗涤，再用去离子水50ml×2洗涤，加入适量的无水硫酸镁干燥过夜。过滤，用20ml二氯甲烷洗涤滤渣，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩至干，得3，4，5-三甲氧基苄醇，无色油状物14.05g，收率92.72％。
得到的产物不需要进一步纯化，即可进行下一步反应。若想得到纯品可以减压蒸馏，收集BP216-218℃/12mmHg的馏分。
2、3，4，5-三甲氧基苄溴的制备
3，4，5-三甲氧基苄醇14.05g(70.89mmol)，用100ml二氯甲烷溶解，加入到250ml的三颈瓶中，三溴化磷6.73ml(70.89mmol)溶于25ml二氯甲烷中，室温反应50min后，冰浴冷却，缓慢滴加18ml去离子水18ml(1.0mol)，淬灭反应。然后再用100ml×2去离子水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，用20ml二氯甲烷洗涤滤渣，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩至干，真空干燥，得3，4，5-三甲氧基苄溴，淡黄色固体16.05g，收率84.44％。
得到的产物不需要进一步纯化，即可进行下一步反应。若想得到纯品可以用乙酸乙酯：正己烷＝1：3重结晶，得到白色片状晶体。
3、3，4，5-三甲氧基苄溴-三苯基溴化磷的制备
3，4，5-三甲氧基苄溴16.05g(61.47mmol)溶于150ml甲苯中，加入到250ml的三颈瓶中，加入三苯基磷16.12g(61.47mmol)，立即溶解，加热回流1hr，有白色固体析出，冷却到室温，抽滤，滤饼用30ml甲苯洗涤，真空干燥后，得3，4，5-三甲氧基苄溴三苯基溴化磷，白色粉末固体27.81g，收率为86.44％
得到的产物不需要进一步纯化，即可进行下一步反应。若想得到纯品可以用丙酮洗涤固体，得白色粉末固体。
4、苄基保护异香兰素的制备
250ml三颈瓶中，加入异香兰素15g(98.59mmol)，200ml无水乙醇，加热到40℃溶解，加入碳酸钾9g(65.07mmol)，搅拌下加入氯化苄15ml(130.13mmol)，加热回流1hr，TLC检测反应完全后，冷却到50℃，趁热过滤，滤液放入冰箱中冷却过夜，晶体析出，抽滤，滤饼用30ml无水乙醇洗涤，真空干燥后，得苄基保护异香兰素，白色针状晶体19.72g，收率为82.56％。
得到的产物不需要进一步纯化，即可进行下一步反应。若想得到纯品可以用无水乙醇重结晶，得到白色柱状晶体。
5、(Z)和(E)-3，4，5-三甲氧基-3’-苄氧基-4’-甲氧基二苯乙烯的制备
250ml三颈瓶中，加入3，4，5-三甲氧基苄溴三苯基溴化磷20.00g(38.21mmol)，150ml四氢呋喃，搅拌悬浮液，苄基保护异香兰素10.00g(41.27mmol)溶于70ml四氢呋喃，放入100ml的滴液漏斗中。反应瓶中加入固体叔丁醇钾7.46g(66.49mmol)，反应体系变为血红色，室温搅拌5min，缓慢滴加苄基保护异香兰素的溶液，再室温搅拌20min，TLC检测反应完全后，倒入500ml的分液漏斗中，加入140ml去离子水后，溶液分层，加入乙醚300ml×2萃取，合并乙醚层，用无水硫酸镁干燥，过滤，滤饼用50ml乙醚洗涤，滤液旋转蒸发仪浓缩至干，得油状物25g，加入20ml无水乙醇固化，抽滤得淡黄色固体12.50g，收率为80.48％。
6、(Z)和(E)-3，4，5-三甲氧基-3’-苄氧基-4’-甲氧基二苯乙烯的重结晶
50ml的圆底烧瓶中，加入顺反异构体12.50g(30.75mmol)，加入20ml无水乙醇，加热部分固体溶解后，室温搅拌，抽滤，滤饼用10ml的无水乙醚洗涤后，红外灯干燥，得纯顺反异构体9.27g，淡黄色粉末固体，收率为74.16％。
7、3，4，5-三甲氧基-3’-羟基-4’-甲氧基二苯乙烷的制备
250ml的三颈瓶中，加入纯(Z)和(E)-3，4，5-三甲氧基-3’-苄氧基-4’-甲氧基二苯乙烯5.14g(12.56mmol)，溶于100ml乙酸乙酯和60ml无水乙醇中，淡黄色溶液，加入5％钯炭0.50g后，搅拌下通氢气，室温搅拌1hr，过滤，得无色滤液，旋转蒸发仪浓缩至干，得油状物4.05g，3，4，5-三甲氧基-3’-羟基-4’-甲氧基二苯乙烷粗品，收率为100％。
8、3，4，5-三甲氧基-3’-羟基-4’-甲氧基二苯乙烷的精制
500ml的圆底烧瓶中，加入3，4，5-三甲氧基-3’-羟基-4’-甲氧基二苯乙烷粗品4.05g(12.72mmol)，用20ml无水乙醇溶解，若有不溶物，过滤除去，室温静止，有晶体析出，放置过夜，溶剂挥发完全，大量白色晶体析出。过滤，滤饼用乙醇洗涤，白色晶体3.56g，收率为100％。
9、磷酰化反应
在100ml圆底烧瓶中，加入三氯氧磷4.4ml(47.4mmol)和二氯甲烷25ml，滴加入3，4，5-三甲氧基-3’-羟基-4’-甲氧基二苯乙烷5g(15.7mmol)于10ml二氯甲烷的溶液。滴完后，搅拌5分钟。滴加入三乙胺3.3ml(23.8mmol)于5ml二氯甲烷的溶液。室温搅拌3hr，TLC检测，反应完全后，加入100ml冷水淬灭。充分振荡分出有机相；再用水50ml×2洗涤，二氯甲烷萃取水层后合并有机层，用适量无水硫酸钠干燥过夜；抽滤，滤液减压蒸去溶剂，得粘稠液体，即为粗酰氯。
10、成盐反应
用冰浴冷却粗酰氯，搅拌下加入2mol/L的NaOH溶液，直到混合液pH值在8～10之间，50℃～80℃搅拌8小时。过滤除去不溶物，减压蒸去大部分溶剂，冷却析晶得白色固体，为3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐粗品。粗品用乙醇加热溶解，趁热过滤除去不溶固体，滤液冷却析晶得到3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐纯品约6.0克，为白色结晶产物，产率86％。M.p.266-269℃(分解)；在水中的溶解度：200mg/ml。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐的安全性评价
【实施例2】3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐的LD50测定
一、实验材料
实验动物：昆明小鼠，上海斯莱克实验动物中心提供，体重18～22g，雌雄各半。
试剂：0.9％NaCl，AP3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐(AP)：浙江赛尔生物医学研究有限公司提供，依上述方法制备，苦味酸
器材：1ml一次性注射器
二、实验方法和步骤
1.实验动物：选用KM小鼠，每组10只，雌雄各半，共设7组。用苦味酸标记。
2.每组分别按体重以1300mg/kg、1250mg/kg、1200mg/kg、1150mg/kg、1100mg/kg、1050mg/kg、1000mg/kg尾静脉注射给药。
3.给药后0.25h、0.5h、1h、2h、4h、24h分别观察一次，记录死亡率。以后每天观察1次，记录死亡率(表1)，持续14天，第15天处死未死亡的小鼠，进行病理解剖。
表1剂量—死亡率数据表(n＝4)
注：n为实验重复次数
三、实验结果：
AP LD50＝1243.0377mg/kg置信区间为：1049.9757≤LD50≤1471.5984
对实验过程中死亡的小鼠进行解剖后没有明显病变；14天处死存活小鼠并进行病理解剖，没有出现病理变化。
说明3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐毒性很低，具有很好 的临床用药安全性。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐的抗肺癌药效学试验
【实施例3】3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐抑制Lewis肺癌
实验
1、试验样品
样品：3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐(AP)用生理盐水溶解。
对照品：注射用环磷酰胺(CTX)，上海华联制药有限公司，批号：020806。配制时用生理盐水溶解。
2、动物和瘤株
C57小鼠24只，雌性，体重17-21g，由浙江赛尔生物医学研究有限公司动物房提供。
Lewis肺癌荷瘤裸鼠1只，由上海医药工业研究院提供。
3、试验方法
Lewis肺癌荷瘤裸鼠，在无菌条件下剥离腋下肿瘤，匀浆，记数细胞，用生理盐水稀释为1-2×107个/ml，按0.2ml/只给小鼠腋下皮下接种。接种后第2天将小鼠根据肿瘤大小随机均分为4组，每组6只。
给药剂量：
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐(AP)，尾静脉注射给药，分别为50mg/kg.d、100mg/kg.d两个剂量。
对照品环磷酰胺采用腹腔注射途径给药，剂量为30mg/kg.d。
另设空白对照组。
动物接种第2日开始按体重给药，连续10天，根据体重给药，接种后第12天处死，取瘤块称重，计算抑瘤率。
结果判定根据以下公式：
4、结果
实验期间各组均未见死亡。
表2、AP抑制LLC小鼠(C57)实验结果(n＝3)
注：n为实验重复次数
5、结论
本实验中显示，3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐对小鼠Lewis肺癌有良好的抑制作用，特别是100mg/kg.d剂量组效果特别突出，明显比常用的环磷酰胺的抗癌作用强。
【实施例4】3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐抑制NCI-H460肿瘤(人大细胞肺癌)
1、试验样品
样品：3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐(AP)用生理盐水溶解
对照品：注射用环磷酰胺(CTX)，上海华联制药有限公司，批号：020806。配制时用生理盐水溶解。
2、动物和瘤株
裸鼠BALB/c-nu15只，雌性，体重18-20g，由上海医药工业研究院提供。
NCI-H460荷瘤裸鼠1只，由上海医药工业研究院提供。
3、试验方法
NCI-H460荷瘤裸鼠，在无菌条件下剥离腋下肿瘤，匀浆，记数细胞，用生理盐水稀释为1-2×107个/ml，按0.2ml/只给小鼠腋下皮下接种。9天后肿瘤生长到0.1cm3时，将裸鼠根据肿瘤大小随机均分为3组，每组5只。
给药剂量：AP，0.2g/kg.d
对照品环磷酰胺采用腹腔注射途径给药，剂量为30mg/kg.d。
另设空白对照组。
动物接种第9日开始按体重给药，静脉，在给药第二天开始，每隔一天用游标卡尺测量、计算小鼠瘤重，接种后第17天处死，取瘤块称重，计算抑瘤率。
结果判定根据以下公式：
4、结果
实验期间各组均未见死亡。
表3、AP抑制NCI-H460荷瘤裸鼠实验结果(n＝5)
注：n为实验重复次数
**第8天为解剖数据，其它为游标卡尺测量数据。
5、结论
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐对NCI-H460肿瘤(人大细胞肺癌)的抑制作用明显高于阳性对照组(CTX)，即3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐对NCI-H460肿瘤(人大细胞肺癌)有特别突出的抑制作用。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3，-O-磷酸二钠盐抑制小鼠黑色素瘤B16药效试验
【实施例5】3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐和 combretastatinA-4抑制小鼠黑色素瘤B16试验
1、实验材料：
样品：3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐(AP)，由浙江赛尔生物医学研究有限公司提供。
阳性对照品：注射用环磷酰胺(CTX)，上海华联制药有限公司。
瘤源：小鼠B16黑色素瘤细胞由上海医药工业研究院药理室传代维持。
实验动物：C57BL/6小鼠50只，雌性，17-22克。由上海中科院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(沪)2003-0003。
2、实验方法：无菌条件下取对数生长期的B16小鼠黑色素瘤培养细胞，制备成约2.8×105/ml细胞悬液，于C57BL/6小鼠尾静脉接种0.2ml/每鼠，次日按实验设计方案给药，连续给药15天后处死，取瘤块称重，计算抑瘤率。
结果判定根据以下公式：
表4、ZC-1抑制B16小鼠实验结果(n＝3)
| 样品 | 剂量 mg/kg | 给药 途径 | 动物数 (只) | 瘤重 | 抑瘤率 |
| AP | 25 | i.v. | 10 | 0.88±0.54 | 52％ |
| AP | 75 | i.v. | 10 | 1.04±0.37 | 59％ |
| AP | 225 | i.v. | 10 | 0.51±0.29 | 77％ |
| CTX | 30 | i.v. | 10 | 0.08±0.04 | 96％ |
| Control | 10 | 2.16±0.44 |
注：n为实验重复次数
3、结果分析：
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐对小鼠黑色素瘤B16有很好的抑制作用，在25mg/kg低剂量组中，显示了很好抑瘤效果。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐抑制肿瘤转移药效及其与combretastatinA-4在抑制肿瘤转移药效的对比试验
【实施例6】3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐和combretastatinA-4抑制小鼠黑色素瘤B16肺转移试验
1、受试物：
1.1名称：样品：3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐(AP)，combretastatinA-4(A4)。
1.2来源：AP、A4均由浙江赛尔生物医学研究有限公司提供。
1.3配制：精确称取AP样品直接以生理盐水配制和稀释至所需浓度，置于4℃冰箱中备用。A4样品需加入少量吐温80湿润，助溶再逐渐加入0.5％CMC-Na溶液至完全混匀，稀释至所需浓度，该样品需避光且不稳定，故需每日现配现用。
2、实验材料：
2.1溶剂：生理盐水及0.5％CMC-Na溶液，吐温80。
2.2阳性对照品：注射用环磷酰胺，上海华联制药有限公司。
2.3瘤源：小鼠B16黑色素瘤细胞由上海医药工业研究院药理室传代维持。
3、实验动物：
3.1来源：C57BL/6小鼠由上海中科院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(沪)2003-0003。
3.2体重：C57BL/6小鼠20克左右。
3.3性别：雌性。
3.4动物数：实验组及阳性对照组为9-10只小鼠，阴性对照为两组。
4、实验方法：无菌条件下取对数生长期的B16小鼠黑色素瘤培养细胞，制备成约2.8×105/ml细胞悬液，于C57BL/6小鼠尾静脉接种0.2ml/每鼠，次日按实验设计方案给药，四周左右处死各组动物，剖取各组小鼠的肺脏，计测每鼠肺脏所转移的集落数，以各组肿瘤平均集落数，按下列公式计算抗肺转移率：
抗肺转移率％＝[(对照组平均集落数—给药组平均集落数)/对照组平均集落数]×100％
5、实验结果：AP样品100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg，iv×10qd对尾静脉接种小鼠B16黑色素瘤抗肺转移率分别为41.69％、35.36％、29.27％。参照品A450mg/kg，ip×10qd的疗效为32.79％。详见表5。
6、结果分析：AP样品在所设计的剂量范围内对尾静脉接种小鼠B16黑色素瘤模型具有一定的抗肺转移率。在同剂量时与参照品A4抗转移结果相似。实验过程中还观察到在给药前后体重变化与阴性对照组接近，反映出该样品在上述治疗剂量时比较安全。
表5小鼠黑色素瘤B16实验肺转移疗效结果(n＝3)
| 样品 | 剂量 mg/kg/d | 给药方案 | 动物数 (只) 始/终 | 动物体重 (g) 始/终 | 肺克隆数 (个) X±SD | 抗转移率％ |
| AP | 100 | iv×10qd | 10/9 | 20.5/25.8 | 24.9±7.4*** | 41.69 |
| AP | 50 | iv×10qd | 10/9 | 20.3/26.1 | 27.9±7.7*** | 35.36 |
| AP | 25 | iv×10qd | 10/9 | 20.1/26.4 | 30.2±7.9*** | 29.27 |
| A4 | 50 | iv×10qd | 10/9 | 20.4/25.5 | 28.7±7.3*** | 32.79 |
| 阳性对照 CTX | 100 | iv×2 第1、3天 | 10/9 | 20.6/24.9 | 3.3±4.2*** | 92.20 |
| 阴性对照 | 相应溶剂 | iv×10qd | 20/18 | 20.4/26.3 | 42.7±12.4 |
注：1)、***P值<0.01，**P值<0.05与阴性对照组相比
2)、试验组在接种后三周左右各解剖1只，观察肺转移情况，以正确确定最终的解剖日期，故终点时各组尚存9只小鼠。并非样品毒性所至的死亡。
3)、注：n为实验重复次数
3、结果分析：
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐对小鼠黑色素瘤B16实验肺转移有很好的抑制作用。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐的抗肝癌药效学试验
【实施例7】3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐对小鼠肝癌H22作用
1、试验样品
样品：3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐(AP)用生理盐水溶解。
对照品：注射用顺铂(DDP)，齐鲁制药有限公司，批号：0503008。配制时用生理盐水溶解。
2、动物和瘤株
小鼠40只，雌性，体重18-20g，由上海医药工业研究院提供。
H22荷瘤小鼠1只，由上海医药工业研究院提供。
3、试验方法
H22荷瘤小鼠，在无菌条件下剥离腋下肿瘤，匀浆，记数细胞，用生理盐水稀释为1-2×107个/ml，按0.2ml/只给小鼠腋下皮下接种。9天后肿瘤生长到0.1cm3时，将小鼠根据肿瘤大小随机均分为4组，每组5只。设2个药物计量组：50mg/kg、100mg/kg。对照品DDP采用腹腔注射途径给药，剂量为2.5mg/kg。
另设空白对照组。
动物接种第9日开始按体重静脉给药，接种后第24天处死，取瘤块称重，计算抑瘤率。
结果判定根据以下公式：
4、结果
实验期间各组均未见死亡。
表6AP对H22荷瘤小鼠的实验结果(n＝2)
| 组别 | 剂量 | 动物数 | 平均瘤重 | 抑瘤率 |
| 第1组 | AP50mg/kg | 5 | 3.319±1.81 | 20.6％ |
| 第2组 | AP100mg/kg | 5 | 2.430±0.94 | 41.9％ |
| 第3组 | DDP2.5mg/kg | 5 | 1.099±0.50 | 73.7％ |
| 第4组 | 0.9％NaCl | 5 | 4.179±1.80 |
注：n为实验重复次数
5、结论
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐对小鼠肝癌H22有很好的抑制作用，特别是100mg/kg剂量组效果更好。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐联合用药试验
【实施例8】3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐与DDP治疗肝癌的联合用药试验
1、试验样品
样品：3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐(AP)用生理盐水溶解。
对照品：注射用顺铂(DDP)，齐鲁制药有限公司，批号：0503008。配制时用生理盐水溶解。
2、动物和瘤株
小鼠40只，雌性，体重18-20g，由上海医药工业研究院提供。
H22荷瘤小鼠1只，由上海医药工业研究院提供。
3、试验方法
H22荷瘤小鼠，在无菌条件下剥离腋下肿瘤，匀浆，记数细胞，用生理盐水稀释为1-2×107个/ml，按0.2ml/只给小鼠腋下皮下接种。9天后肿瘤生长到0.1cm3时，将裸鼠根据肿瘤大小随机均分为4组，每组10只。
设4个剂量组分别为AP100mg/kg、AP100mg/kg+DDP2.5mg/kg、DDP2.5mg/kg，静脉给药。
另设空白对照组。
动物接种第9日开始按体重给药，接种后第24天处死，取瘤块称重，计算抑瘤率。
结果判定根据以下公式：
4、结果
AP100mg/kg的抑瘤率为41.9％、AP100mg/kg+DDP2.5mg/kg的抑瘤率为79.7％；阳性对照组抑瘤率为73.3％。
表明3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐与DDP治疗肝癌的联合用药具有很好协同治疗作用，联合用药不但比AP单独给药效果明显，同时也比阳性对照组有更好的抑制肿瘤效果。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐在S180肿瘤模型药效学试验
【实施例9】3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐对S180肿瘤作用
实验动物：昆明小鼠，体重18～22g，雌性，由上海斯莱克实验动物中心提供。
肿瘤细胞株：小鼠肉瘤S180，中科院上海细胞所提供，KM小鼠腹腔体内传代。
样品：3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐(AP)，用0.9％NaCl溶解。
对照品：注射用环磷酰胺(CTX)，上海华联制药有限公司，批号：020806。配制时用生理盐水溶解。
实验步骤：
1、选取生长状态良好的S180肉瘤细胞，配制成瘤细胞悬液，细胞数为(1～2)×107/ml，接种于昆明鼠腹腔，在无菌条件下，按常规方法抽取小鼠腹水。用生理盐水配置成5×107/ml单细胞悬液，接种于雌性昆明小鼠后肢皮下，每只小鼠注射0.2ml(含肿瘤细胞1×107个)，共接种50只小鼠。
2、接种后第3天开始测量肿瘤体积，待大部分小鼠肿瘤生长至0.5cm后剔除肿瘤生长不良的个别小鼠，进行随机分组，每组6只，按设计剂量每天给药，给药9天后动物称体重，并剖取各组动物的肿瘤，称湿重，最后统计各组动物的抑瘤率。
瘤重抑制率％＝(1-治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％
表7抑制S180荷瘤小鼠实验结果(n＝5)
| 样品 | 剂量 mg/kg | 给药途径 | 动物数 (只) | 瘤重 | 抑瘤率％ |
| AP | 12.5 | i.v | 6/6 | 2.70±0.63 | 21.66 |
| AP | 25 | i.v | 6/6 | 2.52±0.10 | 27.03 |
| AP | 50 | i.v | 6/6 | 2.25±0.52 | 33.75 |
| AP | 100 | i.v | 6/6 | 1.95±0.46 | 43.33 |
| AP | 200 | i.v | 6/6 | 1.83±0.52 | 46.86 |
| CTX | 30 | i.v | 6/6 | 0.84±0.31 | 75.77 |
| Control | 6/6 | 3.45±0.21 |
注：n为实验重复次数
结果分析：3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐对S180肿瘤有很好抑制作用，且最低有效计量为20mg/kg。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐及其联合DDP在S180肿瘤模型药效学试验
【实施例10】3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐及其联合DDP对S180肿瘤作用
实验材料
1.实验动物：昆明小鼠，体重18～22g，雌性，由上海斯莱克实验动物中心提供。
2.肿瘤细胞株：小鼠肉瘤S180，中科院上海细胞所提供，KM小鼠腹腔体内传代。
3.样品：3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐(AP)，用0.9％NaCl溶解；顺铂(DDP)，齐鲁制药有限公司，批号：0503008，配制时用生理盐水溶解。
4.对照品：注射用环磷酰胺(CTX)，上海华联制药有限公司，批号：020806。配制时用生理盐水溶解。
实验方法和步骤
1、选取生长状态良好的S180肉瘤细胞，配制成瘤细胞悬液，细胞数为(1～2)×107/ml，接种于昆明鼠腹腔，在无菌条件下，按常规方法抽取小鼠腹水。用生理盐水配置成5×107/ml单细胞悬液，接种于雌性昆明小鼠后肢皮下，每只小鼠注射0.2ml(含肿瘤细胞1×107个)，共接种40只小鼠。
2、接种后第3天开始测量肿瘤体积，待大部分小鼠肿瘤生长至0.5cm后剔除肿瘤生长不良的个别小鼠，进行随机分组，每组6只，按设计剂量给药，给药9天后动物称体重，并剖取各组动物的肿瘤，称湿重，最后统计各组动物的抑瘤率。
瘤重抑制率％＝(1-治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％
表8AP及其与DDP联合用药对S180肿瘤模型的作用结果(n＝3)
| 动物数 | 给药剂量 | 平均瘤重 | 标准差 | 抑瘤率％ | |
| 第一组 | 6 | AP100mg/kg | 0.626 | 0.270653 | 54.87 |
| 第二组 | 6 | AP100mg/kg +DDP2.5mg/kg | 0.4381 | 0.191702 | 68.41 |
| 第三组 | 6 | DDP2.5mg/kg | 0.5477 | 0.276407 | 60.51 |
| 第四组 | 6 | 0.9％NaCl | 1.387 | 0.408006 | |
| 第五组 | 6 | CTX30mg/kg | 0.6203 | 0.172807 | 55.27 |
结果分析
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐对S180肿瘤有良好的抑制作用，与DDP的联合用药对抑制S180肿瘤有很好的协同作用。
【实施例11】3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐及其与DDP治疗S180的联合用药生命延长率试验
实验材料
1、验动物：昆明小鼠，体重18～22g，雌性，由上海斯莱克实验动物中心提供。
2、瘤细胞株：小鼠肉瘤S180，中科院上海细胞所提供，KM小鼠腹腔体内传代。
3、AP：用0.9％NaCl溶解，
顺铂(DDP)，齐鲁制药有限公司，批号：0503008。配制时用生理盐水溶解。
注射用环磷酰胺(CTX)，上海华联制药有限公司，批号：020806。配制时用生理盐水溶解。
实验方法和步骤：
1、选取生长状态良好的S180肉瘤细胞，配制成瘤细胞悬液，细胞数为(1～2)×107/ml，接种于昆明鼠腹腔，在无菌条件下，按常规方法抽取小鼠腹水。用生理盐水配置成5×107/ml单细胞悬液，接种于雌性昆明小鼠后肢皮下，每只小鼠注射0.2ml(含肿瘤细胞1×107个)，共接种50只小鼠。
2、接种后第3天开始测量肿瘤体积，待大部分小鼠肿瘤生长至0.5cm后剔除肿瘤生长不良的个别小鼠，进行随机分组，每组6只，按设计方案给药，记录小鼠生存天数。31天后记录数据，并进行数据分析(见表9)。平均生存天数为每组中小鼠的生存天数的平均值；
生命延长天数为实验组的平均生存天数减去空白组的平均生存天数所得；
生命延长率＝(T/C-1)×100％，
T值为实验组小鼠的平均生存天数，C值为对照组小鼠的平均生存天数。
表9生命延长率实验结果(n＝3)
| 组 别 | 给药方案 | 给药剂量 (mg/kg) | 31天后 存活数量(只) | 平均生存 天数(d) | 生命延长 天数(d) | 生命延 长率 | 标准差 |
| 1 | 每天给药 | AP100 | 3 | 28.3 | 8.3 | 0.42 | 3.777124 |
| 2 | 隔2天给药 | AP300 | 3 | 27.8 | 7.8 | 0.39 | 3.544949 |
| 3 | 隔2天给药 | AP100+ DDP2.5 | 3 | 28.5 | 8.5 | 0.43 | 3.507136 |
| 4 | 隔2天给药 | AP300+ DDP2.5 | 5 | 29.8 | 9.8 | 0.49 | 2.857738 |
| 5 | 隔2天给药 | DDP2.5 | 1 | 22.5 | 2.5 | 0.13 | 4.806246 |
| 6 | 隔3天给药 | 环磷酰胺 30 | 2 | 25 | 5 | 0.25 | 6 |
| 7 | 隔3天给药 | 0.9％NaCl | 0 | 20 | 4.774935 |
结果分析：
1、从各组数据来看，无论是AP单独给药，还是与DDP联合给药，都具有很好的抗肿瘤作用。
2、联合用药的数据上，从第2组(300mg/kg隔2天给药)，第4组(AP300mg/kg+DDP2.5隔2天给药)，第5组(DDP2.5隔2天给药)的数据可以看出，联合用药药效结果优于单独化疗或单独给予AP的实验组。
3、从31天后的存活数量看，第4组(AP300mg/kg+DDP2.5隔2天给药)死亡一只，尚有5只存活，阳性对照组DDP死亡5只，存活1只，阴性对照组全部死亡，由此可以看出，AP能明显地改善动物生活质量、延长肿瘤动物的生命。
3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐通过定向打靶，针对性地作用于肿瘤血管，对所有的实体瘤均有抑制肿瘤的效果，对于同类药物CombretastatinA-4也有各种适应证的研究报道，因此可利用以上实验作出各种改变，适用的所有实体瘤均在本发明要求的权利范围之内。
以上对本发明实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
Claims (6)
1.式(I)化合物3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐在制备抑制实体肿瘤转移药物中的应用：
2.权利要求1所述的应用，其中Na为H、K或NH4替代。
3.权利要求1所述的应用，其中所述实体肿瘤为所有肉瘤和癌。
4.权利要求3所述的应用，其中所述肉瘤和癌为肝癌、肺癌、黑色素瘤。
5.权利要求4所述的应用，其中所述肺癌为Lewis肺癌、人大细胞肺癌。
6.式(I)化合物3，4，5，4’-四甲氧基二苯乙烷-3’-O-磷酸二钠盐与化疗药物在制备联合抗实体肿瘤药物中的应用，其中所述化疗药物为顺铂：
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