KR20200092620A - 심바스타틴을 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

심바스타틴을 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 심바스타틴을 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

심바스타틴을 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {Composition for treatment and prevention of Arthritis disease comprising simvastatin}
본 발명은 심바스타틴을 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
퇴행성관절염이라고도 불리는 골관절염(osteoarthritis, 이하, OA)은 55세 이상 인구의 약 10%가 보유하며, 60세 이상 환자의 25%에서 심한 동통과 관절운동장애를 동반한다. 특히, 인구의 고령화 추세에 따라 유병률이 빠르게 상승하고 있는 대표적인 근골격계 질환이다. 연골세포의 증식은 연골 분해에 대항하기 위한 수단으로 고려될 수 있지만, 질환의 진행 및 이차 염증 등의 결과들은 이것이 성공적이지만은 않다는 것을 증명한다. 주요한 OA 치료방법으로는 체중감량, 하지근육 강화운동, 물리치료와 같은 비약물요법과 함께, 아세트아미노펜 혹은 비스테로이드성 소염진통제류(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)의 복용 또는 외용과, 스테로이드 약물의 관절강 내 주사와 같은 약물요법, 그리고 관절치환술과 같은 수술요법 등이 사용되고 있다. 하지만, 가장 흔히 적용되는 약물요법 중에서 NSAID는 위장관 장애 등이 빈발하며, 스테로이드는 전신 부작용 및 반복주사에 따른 연골의 파괴 또는 감염의 위험이 상승하므로 장기간 사용이 곤란하다는 단점 외에, 무엇보다도 이 약물들이 OA의 통증만을 완화시킬 뿐 적극적인 질병치료 수단으로서는 미흡한 점이 많다. OA 의 치료 목적은 통증의 경감, 운동성의 유지와 장애의 최소화인데, 통증의 기전과 연골 대사에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 예를 들어 한국공개특허번호 제 10-2016-0092550호에는 살리노마이신을 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있고, 한국공개특허번호 제 10-2012-0101136호에는 설포라판을 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물이 개시되어 있다.
심바스타틴 (simvastatin)은 HMG-CoA 환원효소 저해제 중에 하나로서 관상동맥질환 또는 고지혈증의 치료제로 널리 사용되는 약물 중에 하나이다.
본 발명자들은 관절염의 예방 또는 치료 효과가 있는 화합물을 연구하던 중, 심바스타틴이 나이트로프루사이드 나트륨 (sodium nitroprusside ; SNP)에 의한 NO의 발생 및 interleukin-1β (IL-1β)에 의한 ROS 생성을 감소시키고, COX-2의 발현을 감소시키며, NF-κB의 활성화를 억제하는 효과를 확인함으로써, 심바스타틴이 관절염에 예방 또는 치료효과가 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명자들은 관절염의 예방 및 치료용 조성물을 연구하던 중, 심바스타틴이 COX-2의 발현 및 NF-κB의 활성을 저해하여, ROS 및 NO의 발생을 감소하여 관절염의 치료할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 심바스타틴 (Simvastatin) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
Figure pat00001
.
본 발명의 하기 화학식 1로 표시되는 심바스타틴 (Simvastatin)을 포함하는, 관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
Figure pat00002
.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 심바스타틴 (Simvastatin) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다:
[화학식 1]
Figure pat00003
.
상기 관절염은 퇴행성관절염 또는 류마티스 관절염일 수 있다.
상기 심바스타틴의 농도는 1μM 내지 100μM일 수 있다.
상기 조성물은 사이클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2; COX-2)의 발현을 저해하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 조성물은 연골세포 염증을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 하기 화학식 1로 표시되는 심바스타틴 (Simvastatin)을 포함하는, 관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
Figure pat00004
.
상기 심바스타틴의 농도는 1μM 내지 100μM 일 수 있다.
본 발명의 심바스타틴은 토끼의 관절에서 유래된 세포에서 SNP 및 IL-1β에 의한 COX-2의 발현을 억제하고, NF-κB의 활성화를 억제하여 ROS 및 NO의 생성을 억제하여 관절염의 치료, 예방 또는 개선의 효과가 있다.
도 1은 심바스타틴의 처리가 관절 연골세포에서 SNP 또는 IL-1β로 유도된 COX-2의 발현을 억제한다는 것을 보여주는 결과로서, A 및 B는 관절 연골세포를 심바스타틴의 존 재하에서 SNP 또는 IL-1β로 24시간 처리한 후 웨스턴 블랏 및 mRNA를 분석한 결과이고, C는 프로스타글란딘의 측정결과이다.
도 2는 관절 연골세포에서 심바스타틴의 처리가 SNP 또는 IL-1β로 유도된 NO 및 ROS의 발생을 차단한다는 것을 보여주는 결과로서, 관절 연골세포를 심바스타틴의 존재 또는 부재 하에서 SNP 또는 IL-1β로 24시간 처리한 후 (A) NO 분석 또는 (B) ROS 분석을 한 결과이다.
도 3은 심바스타틴의 처리가 관절 연골세포에서 SNP 또는 IL-1β로 유도된 NF-κB를 활성화를 방지한다는 것을 보여주는 결과로서, (A)는 연골 세포를 NF-κB 루시퍼라제 리포터 벡터로 형질 감염시키고, 심바스타틴 부재 또는 존재 하에서 SNP 또는 IL-1β를 처리하고 24시간 배양한 뒤, 루시퍼라제 활성을 분석한 결과이고, (B 및 C)는 연골 세포에 심바스타틴의 부재 또는 존 재하에서 BMS345541 이전에 SNP 또는 IL-1β를 처리한 뒤 COX-2, IkBα, NF-kB p65 및 GAPDH의 발현을 Western blot 분석한 결과이고, (D)는 DAPI로 핵(파란색)을 염색하고, NF-kB p65 (빨간색)를 특정 항체로 염색한 결과이다.
도 4는 심바스타틴의 처리는 토끼 관절 연골 세포에서 NF-kB 경로를 억제함으로써, SNP에 의한 NO 생성과 IL-1β에 의한 ROS 생성을 억제한다는 것을 보여주는 결과로써, A 내지 C는 연골 세포를 심바스타틴 부재 또는 존 재하에서 SNP 또는 IL-1β 전에 NO 제거제인 NAC 또는 NO 합성물의 억제제인 L-NMMA로 처리한 결과로서, (A 및 B)는 연골 세포에서 COX-2, IkBα, NF-kB p65 및 GAPDH의 발현을 웨스턴 블랏 분석한 결과이고, (C)는 ROS 발생을 DCFH-DA를 사용하여 검출한 결과이다.
도 5는 심바스타틴의 처리가 SNP에 의한 NO 생성과 IL-1β에 의한 ROS 생성 증가를 억제하여 NF-kB의 활성 및 PGE2의 생성을 감소시키는 것을 보여주는 결과로서, A 및 B은 심바스타틴이 존재 또는 부재 하에서 SNP- 또는 IL-1β보다 먼저 NAC, L-NMMA 또는 BMS345541로 처리하였고, (A)는 PGE2를 측정한 결과이고, (B)는 루시퍼라제를 이용하여 NF-kB 프로모터 활성화를 확인한 결과이다.
도 6은 심바스타틴의 처리가 관절 연골 세포에서 SNP 유도 된 NO 생성 및 L-1β 증가 된 ROS 생성을 감소시키면서 COX-2 발현을 억제하는 것을 보여주는 결과로서, A와 B의 연골 세포는 심바스타틴의 존재 또는 부재할 때 SNP 또는 IL-1β보다 먼저 NAC, L-NMMA 또는 BMS345541로 처리하였고, COX-2 항체를 이용하여 (A)는 연골세포를 면역조직 화학염색 하였고 (B)는 면역형광염색하여 확인한 결과이다.
본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명자들은 관절염의 예방 및 치료용 조성물을 연구하던 중, 심바스타틴이 COX-2의 발현 및 NF-κB의 활성을 저해하여, ROS 및 NO의 발생을 저해하여 관절염의 치료할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 심바스타틴 (Simvastatin) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
Figure pat00005
.
본 발명의 용어, "관절염"은 하나 또는 그 이상의 관절에서의 염증과 관련된 관절장애의 하나의 형태로서, 100 종이 넘는 다른 형태로 존재한다. 가장 일반적인 형태는 퇴행성 관절질환인 골관절염(osteoarthritis)으로 관절에서의 외상, 관절의 감염 또는 노화의 결과로 발병한다. 다른 형태의 관절염으로는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 건선 관절염(psoriatic arthritis) 및 루푸스(lupus) 등의 관련 자가면역질환이 있다. 화농성 관절염(septic arthritis)은 관절감염에 의해 유발된다. 관절염 환자의 주된 증상은 관절통증이다. 통증은 지속적이며 영향을 받는 관절에 국소화되어 있을 수 있다. 관절염으로부터의 통증은 관절주위에 발
생하는 염증, 질환으로부터 관절에 미치는 손상, 일상적인 관절의 마모, 뻣뻣하고 고통스러운 관절에 대한 강제적인 움직임에 의해 야기되는 근육 긴장 및 피로에 의해 야기된다.
상기 관절염은 이에 제한되는 것은 아니나 골관절염, 류마티스 관절염, 통풍(gout), 루푸스, 가성통풍 (pseudo-gout), 화농성 관절염, 강직척추염(ankylosing spondylitis), 소아 특발성 관절염(juvenile idiopathic arthritis) 또는 스틸병(Still's disease)일 수 있다. 바람직하게 본 발명의 관절염은 퇴행성관절염 또는 류마티스 관절염일 수 있다.
본 발명의 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 관절염의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 관절염의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용 가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 약학조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 희렴 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다.
또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 바람직하게 연골세포의 증식을 조절하는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한, 바람직하게 염증유발인자인 사이클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2; COX-2)의 발현을 저해하는 것일 수 있으며, 상기 COX-2의 발현을 저해함으로써 연골세포의 염증을 저해할 수 있다. 따라서 다양한 관절염을 효과적으로 치료할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체예에서, 심바스타틴을 1시간 전처리 한 뒤 IL-1β 또는 SNP 처리를 각각 처리하여 24시간 반응 시킨 뒤, COX-2의 발현 량을 확인한 결과, IL-1β 또는 SNP 단독 처리시 보다 COX-2의 발현이 저해됨을 확인하였다. 상기 결과로 본 발명의 심바스타틴이 포함하는 약학 조성물은 IL-1β 또는 SNP가 토끼 연골세포에서 유도하는 COX-2의 발현을 저해시킴으로서 항염증 효과를 갖는 것을 확인할 수 있다.
한편, 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 용어, "개체"란 관절염이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
상기 용어, "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
따라서 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 관절염의 치료방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 용어, "개체"란 상기한 바와 같이 관절염이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 관절염을 효과적으로 예방 또는 치료 할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 기존의 관절염 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 하기 화학식 1로 표시되는 심바스타틴을 포함하는 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물을 제공할 수 있다:
[화학식 1]
Figure pat00006
.
상기 조성물이 건강기능식품용 조성물인 경우, 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화 될 수 있다. 상기 건강기능식품용 조성물은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 환제, 캅셀제, 현탁액, 유제, 시럽제, 침제, 액제, 엑스제 등의 일반적인 제형으로 제조될 수도 있고, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 젤리, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등의 임의의 건강식품 형태로 제조될 수도 있다. 상기 건강식품의 제제화를 위해 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 사용할 수 있으며, 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다. 상기 첨가제로서 각종 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 이외에도 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 첨가제의 비율은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 5 중량%, 또는 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 토끼의 관절 연골 세포의 분리 및 배양
관절연골세포는 2주령의 뉴질랜드 흰 토끼 관절 연골에서 얻었다. 토끼를 에테르 마취로 희생 시킨 후, 페니실린 및 스테렙토마이신을 함유하는 PBS로 세척하였다. 연골 조직을 1 mm2 내지 3 mm2의 조각으로 절단하고, 0.2% 콜라제나제 타입 2를 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, 미국 캘리포니아 소재 Invitrogen에서 구매)에서 배양하였다. 인큐베이션 후, 분리된 세포를 10분 동안 1000 rpm에서 원심 분리하여 수집한 후, 2*105 cells/cm 밀도로 스트렙토마이신 (50 μg/mL), 페니실린 (50 units/mL) 및 10%(v/v) 소 태아 혈청을 포함하는 DMEM에 세포를 재현탁 하였다. 3일 및 4일째 배양된 세포들을 본 발명에서 사용하였다. 상기 3일 배양후 세포를 심바스타틴 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, 미국), SNP(Sigma-aldrich) 또는 IL-1β (Sigma-Aldrich)로 처리 하였다. BMS345541 (Tocris Bioscience, Ellisville, MO)을 사용하여 NF-κB의 경로를 억제하였다. N-acetyl-N-cysteine (NAC; Sigma-Aldrich)은 프리라디칼 억제제로 사용하였다. NO의 합성을 억제하기 위해 NG-monomethyl-L-arginine (L-NMMA, Enzo Life Sciences, NY, USA)을 사용하였다.
실시예 2. Western blot 분석
실시예 1에서 분리된 세포에 심바스타틴 0 또는 50 μM을 1시간 처리한 후 SNP 1mM 또는 IL-1β 10 ng/ml을 24시간 처리하였다. 상기 연골 세포를 수집하고, 프로테아제 억제제 및 포스파타아제 억제제를 함유하는 RIPA 용해 완충액으로 용해시킨 다음, 4 ℃에서 10 분 동안 10,000 x g에서 원심 분리 하였다. 단백질 농도는 BCA 분석법을 사용하여 측정하였고, 동일한 양의 단백질을 도데실 황산나트륨 (SDS)-폴리아크릴아미드겔 전기영동 (PAGE) 겔에 넣었다. 분리 된 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮기고 COX-2 1차 항체로 블로팅한 후 강화된 화학 발광 시약을 사용하여 측정 하였다. 도 1A 및 도 2B와 같이, COX-2 단백질은 SNP 및 IL-1β의 처리에 의해 강하게 유도되었다. 그러나 SNP 및 IL-1β에 의해 상향조절 된 COX-2 활성은 심바스타틴에 의해 감소하였다 (도 1A 및 1B).
실시예 3. 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)
실시예 1에서 분리된 세포에 심바스타틴 0 또는 50 μM을 1시간 처리한 후 SNP 1mM 또는 IL-1β 10 ng/ml을 24시간 처리하였다. 총 RNA는 TRIzol 시약 (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)을 사용하여 연골 세포로부터 추출 하였다. 상기 추출한 RNA 및 Maxime ™ RT premix 키트 (iNtRON Biotechnology, 성남, 한국)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. RT-PCR의 증폭은 다음의 하기 표 1의 프라이머 및 조건으로 수행되었다. 합성 된 생성물을 1.5 % 아가 로스 겔에서 분리하고 EcodyeTM 핵산 염색 용액 (BioFact, 대전, 대한민국)으로 측정하였다. 도 1A 및 도 2B와 같이, COX-2 mRNA은 SNP 및 IL-1β의 처리에 의해 강하게 유도되었다. 그러나 SNP 및 IL-1β에 의해 상향조절 된 COX-2 발현은 심바스타틴에 의해 감소하였다 (도 1A 및 1B).
gene 염기서열 annealing temperature
COX-2 forward 5'-TCA GCC ACG CAG CAA ATC CT-3 52 ℃
reverse 5'-GTG ATC TGG ATG TCA CG-3
GAPDH forward 5'-TCA CCA TCT TCC AGG AGC GA-3 56 ℃
reverse 5'-CAC AAT GCC GAA GTG GTC GT-3'
실시예 4. PGE의 측정
연골 세포에서 PGE2는 COX-2 활성의 주요 산물이며 염증의 중요한 중재이다. 상기 연골세포에서 PGE2에 대한 심바스타틴의 어제 효과를 확인하기 위해 PGE2를 측정하였다. 실시예 1에서 분리된 세포에 심바스타틴 0 또는 50 μM을 1시간 처리한 후 SNP 1mM, IL-1β 10 ng/ml; 또는 SNP 및 IL-1β을 24시간 처리하여, PGE2의 생산을 유도하였다. PGE2는 PGE2측정 키트를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 세포의 상등액에서 측정하였다. 세포에서 얻은 배양 상등액(100 μl)을 96 well plate에 담은 후 PGE2 항체와 PGE2를 각 well에 첨가하여 실온에서 반응시켰다. OD 값은 마이크로 플레이트 판독기를 이용하여 620nm 범위에서 측정하였다. 그 결과 심바스타틴을 처리한 군에서 PGE2가 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다 (도 1C).
실시예 5. NO의 측정
ROS 및 NO는 염증반응을 관여하는 인자 중 하나로써 COX-2의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 심바스타틴이 NO 발생에 미치는 영향을 조사하였다. 실시예 1에서 분리된 세포에 심바스타틴 0 또는 50 μM을 1시간 처리한 후 SNP 1mM, IL-1β 10 ng/ml; 또는 SNP 및 IL-1β을 24시간 처리하여, NO의 생산을 유도하였다. NO는 griese 시약을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 세포의 상등 액에서 측정하였다. 각 세포에서 얻은 배양 상등액(100 μl)을 4,000 x g에서 10 분간 원심 분리하고 Griess reagent (100 μl)와 혼합하였다. OD 값은 마이크로 플레이트 판독기를 이용하여 570nm 범위에서 측정하였다. 도 2A와 같이 SNP 또는 IL-1β는 대조군과 비교하여 각각 28배 또는 9배 증가된 NO 생성을 보였고, 심바스타틴의 처리는 SNP 및 IL-1β에 의해 유도딘 NO의 생산을 감소시켰다 (도 2A).
실시예 6. ROS 생성의 측정
실시예 1에서 분리된 세포에 심바스타틴 0 또는 50 μM을 1시간 처리한 후 SNP 1mM, IL-1β 10 ng/ml; 또는 SNP 및 IL-1β을 24시간 처리하여, ROS의 생산을 유도하였다. ROS의 측정은 DCFH-DA 형광 프로브로 측정하였다. 상기 심바스타틴 및 ROS 유도하는 무질을 처리한 세포의 배지를 제거하고, PBS로 세척하였다. 20 μM DCFH-DA 프로브를 세포에 처리한 후 세포를 배양기에서 40분 동안 배양하였다. 배양된 세포를 PBS로 세척하였다. 세포 이미지는 형광 현미경(BTX51, Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 측정하였다. 그 결과 도 2B와 같이 SNP, IL-1β 또는 SNP 및 IL-1β 처리는 ROS 생산의 유의한 증가를 보였다. 1시간 동안 심바스타틴을 단독으로 처리하면 ROS의 생성이 약간 증가하였다. 그러나 심바스타틴은 SNP 및 IL-1β에 의한 ROS 생성을 억제 하였다 (도 2B). 따라서 심바스타틴이 NO 및 ROS의 생성을 억제함으로써, SNP 또는 IL-1β으로 유도된 COX-2의 발현을 억제할 수 있음을 확인하였다.
실시예 7. 루시퍼라제 분석
NF-kB는 연골의 염증에 관여하는 중요한 인자 중에 하나이다. 심바스타틴이 NF-kB 활성의 억제를 통한 COX-2 발현에 대한 억제 효과를 갖는지를 조사하기 위해 NF-kB 프로모터의 활성화를 분석하였다. 형질 감염된 연골 세포 (NF-kB 리포터 플라스미드 및 β-갈락토시다아제 플라스미드)를 12 시간 동안 배양하고 지시된 바와 같이 처리 하였다. 루시퍼라제 활성을 TD-20/20 단일 튜브 루미넌스 (Turner Designs, Sunnyvale, CA)를 사용하여 세포 용해 물에서 순차적으로 측정 하였다. 반딧불이 루시퍼라제 활성값은 β-갈락토시다아제 활성에 의해 보정하였다. 도 3A에 나타낸 바와 같이, 리포터 유전자의 활성화는 대조군 세포와 비교하여 SNP 또는 IL-1β에 의해 급격히 증가 하였다. SNP와 IL-1β에 의해 NF-kB p65의 활성화가 촉진된다는 것을 확인하였다. 그러나 심바스타틴을 처리한 결과 NF-kB p65의 활성화가 감소하는 것을 확인하였다 (도 3A). 또한 NF-kB와 관련된 유전자를 실시예 2에 개시되어 있는 western blot 방법을 이용하여 측정하였다. 도 3B 및 3C에 나타낸 바와 같이, SNP 또는 IL-1β의 처리는 NF-kB p65를 유의하게 유도하고 IkBα를 감소시켰다. 그러나 심바스타틴의 전처리는 SNP 및 IL-1β 유도된 COX-2 발현에서 NF-kB 신호 전달 경로의 활성화를 막았다 (도 3B 및 3C). IKK의 촉매 서브 유닛의 선택적 억제제인 BMS-345541의 처리는 SNP 및 IL-1β 유도된 COX-2 발현 에서 심바스타틴의 억제 효과를 상승적으로 유도 하였다 (도 3B 및 3C). 또한 심바스타틴의 처리는 IkB 발현에 강한 영향을 나타내는 것을 확인하였다 (도 4a 및 도 4b). 심바스타틴이 SNP와 IL-1β에 의한 IkBα의 분해를 억제한다는 것을 관찰하였으며 심바스타틴이 IkBα 분해를 막음으로써 SNP와 IL-1β 유도된 NF-kB 활성화를 억제하는 것을 확인하였다 (도 4A 및 4B). 또한 연골 세포에 NAC (ROS 억제제) 또는 L-NMMA (NO 억제제)과 심바스타틴을 같이 처리한 후 SNP 및 IL-1β을 세포에 처리하였다. SNP 및 심바스타틴에 의한 COX-2 발현 및 NF-kB 활성화는 NAC의 처리로 더욱 감소하였으며, IL-1β 및 심바스타틴에 COX-2는 NAC 처리에 의해 크게 변화하지 않았다. L-NMMA는 IL-1β에 의한 COX-2의 발현과 NF-κB의 활성화를 억제하는 반면, IL-1β 및 심바스타틴을 처리한 세포에 LNMMA 처리에 의한 COX-2 발현은 심바스타틴을 단독으로 처리한 것과 비교하여 변하지 않았다 (도 4B).
실시예 5. 면역 형광 염색
IkB는 세포질에서 NF-kB 전사 인자에 결합하여 핵으로의 활성화 및 전좌를 방지한다. 수많은 외부 자극에 대한 자극으로 IkBa는 먼저 IKK 복합체에 의해 인산화되어 ubiquitination으로 이어지고 proteasomal degradation이 일어나 핵 위치 확인 서열을 제거하여 NF-kB 단백질의 방출을 일으켜 핵으로 전이된다. 이에 SNP 및 IL-1β 처리된 연골 세포에서 p65의 전좌를 측정하였다. 연골 세포를 코팅 유리 커버 슬립상에서 성장시키고 15 분 동안 3.5 % 파라포름알데히드로 고정시키고 실온에서 15 분 동안 0.1 % 트리톤 X-100을 함유하는 PBS로 세포를 처리하여 투과하였다. PBS로 3 회 세척 한 후, 세포를 5% BSA에 37 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세포를 COX-2 및 p65 NF-kB에 대한 1차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 배양 하였다. 그 다음날, 세포를 PBS로 세척 한 후 1시간 동안 37 ℃에서 과산화 효소가 접합된 2차 항체와 함께 배양한 다음 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Invitrogen, Burlington, ON, 캐나다)로 실온에서 5 분간 반응 시켰다. 면역 형광 이미지는 BX51 형광 현미경 (Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 측정하였다. SNP 및 IL-1β의 처리는 세포질에서 핵 위치로의 p65의 유의한 전위를 유도하였다 (도 3D). 심바스타틴의 전처리는 p65의 핵으로의 전이를 억제하여, 심바스타틴의 처리군은 SNP 및 IL-1β에 의해 유도된 세포 NF-kB 신호 전달을 차단하는 것을 확인하였다 (도 3D). 또한 연골 세포에서 세포 내 ROS 수준을 측정하였다. 심바스타틴을 사용한 전처리는 연골 세포에서 SNP 및 IL-1β의 ROS 생성을 유의하게 감소시켰다 (도 4). 또한 심바스타틴과 NAC를 병용 투여할 시 ROS의 수준을 더욱 감소시키는 시너지 효과가 있었다 (도 4C). SNT 또는 IL-1β; 및 심바스타틴을 처리한 세포에서 BMS345541을 처리하면 심바스타틴이 처리된 세포의 SNP 및 IL-1β와 비교하여 ROS 생성에 유사한 효과를 나타내어 ROS 생성이 NF-kB의 상류에서 조절되는 것을 확인하였다 (도 4c). SNP 및 IL-1β 유도에 의한 PGE2 생성 및 NF-κB 활성화는 심바스타틴의 처리에 의해 효과적으로 억제되었다. 심바스타틴의 존재 하에 SNP에 의한 PGE2 생성 및 NF-κB 활성화는 L-NMMA에 의해 저해 되었지만, NAC는 효과가 없었다 (도 5). 대조적으로, NAC을 이용한 ROS의 차단은 PGE 2의 생산 및 NF-κB 활성화에 대한 심바스타틴의 억제효과를 가속화 시켰지만, L-NMMA에서는 그렇지 않았다 (도 5). 이러한 결과는 심바스타틴이 ROS 또는 NO 생산에 의해 유발된 NF-κB 억제를 통해 COX-2 억제효과를 나타낼 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 6. 면역조직화학염색
COX-2 발현을 면역 조직화학 염색법 및 면역 형광 염색법으로 분석하였다. 조직을 4 % 파라포름 알데하이드에 고정시키고, 농도 단계적인 에탄올로 탈수시키고, 파라핀에 매립시키고, 4 ㎛로 절편 하였다. 내인성 과산화효소의 활성을 차단하기 위해, 상기 절편을 실온에서 10분 동안 1% 과산화수소로 처리하였다. 연골 절편은 COX-2의 1차 항체로 4 ℃에서 밤새 배양한 후, IgG의 2차 항체로 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, DAB 기질 키트 (K3468, DAKO)로 배양 하였다. PBS로 세척 한 후, 세포를 헤마톡실린으로 대조 염색하고 슬라이드를 광학 현미경으로 관찰하였다. 웨스턴 블랏 결과와 일치하여, 심바스타틴은 SNP 및 IL-1β에 의해 유발 된 COX-2 발현을 억제하였고, 억제제 인 NAC, L-NMMA 및 BMS-345541은 각각 COX-2 발현에 대한 심바스타틴의 억제 효과를 상승적으로 증가시켰다 (도 6). 이러한 결과는 심바스타틴이 토끼 관절 연골 세포에서 NO 생산 유발 된 NF-kB 활성화를 억제함으로써 NO-유도된 COX-2 발현을 억제하고, ROS 생성 유도 된 NF-kB 활성화를 차단함으로써 COX-2의 발현을 억제하였다. 심바스타틴은 SNP 및 IL-1β에 의해 유발된 COX-2의 발현을 억제하고, 억제제인 NAC, L-NMMA 및 BMS-345541은 각각 COX-2 발현에 대한 심바스타틴의 억제 효과를 상승적으로 증가시켰다 (도 6).

Claims (7)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 심바스타틴 (Simvastatin) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00007
    .
  2. 제 1항에 있어서, 상기 관절염은 퇴행성관절염 또는 류마티스 관절염인, 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 심바스타틴은 1μM 내지 100μM의 농도로 포함되는, 안구 건조증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 사이클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2; COX-2)의 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 약학 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 연골세포 염증을 억제하는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 약학 조성물.
  6. 하기 화학식 1로 표시되는 심바스타틴 (Simvastatin)을 포함하는, 관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00008
    .
  7. 제 6항에 있어서, 상기 심바스타틴은 1μM 내지 100μM 농도로 포함되는, 안구 건조증의 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물.

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