JP2007516294A - 炎症性の疾患または症状の予防および治療のための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は全体として、生物科学の分野に関する。より具体的には、本発明は炎症性の疾患を治療または予防するための組成物およびその使用方法に関する。なお、本出願は、2004年4月2日付で出願した米国特許仮出願第60/559,112号および2003年12月23日付で出願した米国特許仮出願第60/531,828号の恩典を主張するものである。これらの仮出願は参照により組み入れられる。
炎症性の疾患および症状は今日の社会に深刻な健康上の懸念をもたらしている。そのような疾患および症状を治療する現行の方法は、患者に対しおよび医療制度に対し総じて、圧倒的にかつ財政的に負担となり得る。脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、ウイルス性脳炎、後天性免疫不全疾患(AIDS)による認知症、筋萎縮性側索硬化症、脳損傷、脊髄疾患、およびその他の神経変性疾患にわたる、いくつかの異なる種類の炎症性疾患が存在するという単純な事実により、この状況は腹立たしくある。
本発明者は特定の化合物を利用して、ヒトで炎症性疾患を治療または予防することができることを見出した。これらの化合物はグルタチオン供与体、5-アミノ4-イミダゾールカルボキサミドリボチド(AICAR)、AMP活性化キナーゼの活性化因子、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-トレオ-1-フェニル-2-デカノイルアミノ-3-モルホリノ-1-プロパノールHCl (D-PDMP)、および/または1,5-(ブチルイミノ)-1,5-ジデオキシ-D-グルシトール(ミグラスタット)を含む。これらの化合物の誘導体を利用して、炎症性疾患を治療または予防することもできる。
先述のとおり、炎症性の疾患および症状は、このような疾患で苦しめられている人々に数々の金銭上および健康上の負担を与える。脳卒中およびアルツハイマー病などの特定の炎症性疾患を治療しようとする先行する試みは完全に成功しているわけではない。さらに、これらの治療は患者に有害であり患者を衰弱させる可能性がある。
本明細書を通じて開示される方法および組成物を用いて治療可能および/または予防可能であると考えられる炎症性の疾患または症状としては、乾癬(Ruzicka et al., 1994; Kolb-Bachofen et al., 1994; Bull et al., 1994); ブドウ膜炎(Mandia et al., 1994); 1型糖尿病(Eisieik & Leijersfam, 1994; Kroncke et al., 1991; Welsh et al., 1991); 敗血症性ショック(Petros et al., 1991; Thiemermann & Vane, 1992; Evans et al., 1992; Schilling et al., 1993); 疼痛(Moore et al., 1991; Moore et al, 1992; Meller et al., 1992; Lee et al., 1992); 片頭痛(Olesen et al., 1994); 関節リウマチ(Kaurs & Halliwell, 1994); 変形性関節症(Stadler et al., 1991); 炎症性腸疾患(Miller et al., 1993; Miller et al., 1993); 喘息(Hamid et al., 1993; Kharitonov et al., 1994); Koprowski et al., 1993); 免疫複合体病(Mulligan et al., 1992); 多発性硬化症(Koprowski et al,, 1993); 虚血性脳浮腫(Nagafuji et al., 1992; Buisson et al., 1992; Trifiletti et al., 1992); 毒素性ショック症候群(Zembowicz & Vane, 1992); 心不全(Winlaw et al., 1994); 潰瘍性大腸炎(Boughton-Smith et al., 1993); アテローム性動脈硬化症(White et al., 1994); 糸球体腎炎(Muhl et al., 1994); パジェット病および骨粗鬆症(Lowick et al., 1994); ウイルス感染の炎症による後遺症(Koprowski et al., 1993); 網膜炎(Goureau et al., 1992); オキシダントにより誘導された肺損傷(Berisha et al., 1994); 皮膚炎(Ruzica et al., 1994); 急性同種移植拒絶反応(Devlin, J. et al., 1994); ならびにNOを生成する侵襲性の微生物によって引き起こされる感染症(Chen, Y and Rosazza, J. P. N., 1994)が挙げられるが、これらに限定されることはない。
グルタチオンはアミノ酸γ-グルタミン酸、システイン、およびグリシンを含むトリペプチドである。グルタチオンはγ-グルタミルシステイニルグリシンまたはGSHとしても知られる。GSHはヒトの肝臓中に見出すことができる。グルタチオン供与体として機能できる分子の限定するものではない例としては、L-2-オキソ-チアゾリジン4-カルボキシレート(プロシステイン)、N-アセチルシステイン(NAC)、N-アセチルグルタチオン、およびS-ニトログルタチオン(GSNO)が挙げられる。本発明により、グルタチオンを運搬できるあるいはグルタチオン産生の前駆体であるまたは前駆体として機能する任意の分子をグルタチオン供与体として使用できることも企図される。
5-アミノイミダゾール-4-カルボキサミドリボヌクレオシド(AICAR)は、さまざまな細胞種においてAMPKを活性化させるのに広く用いられている(Sullivan et al., 1994; Corton et al., 1995)。いったん細胞内に入ると、AICARはZMPにリン酸化され、ヌクレオチドのレベルを変化させることなくAMPKのアロステリック活性化に対するAMPの複合的な効果を模倣する(Corton et al., 1995)。AICARはアロステリック活性化を誘導するだけでなく、上流のキナーゼ、すなわちAMPKキナーゼのリン酸化および活性化も促進する(Moore et al., 1991; Sullivan et al., 1994)。AMPKα1およびα2触媒サブユニットの発現は、発生中のマウス脳内で報告されている(Turnley et al., 1999)が、その機能はまだ調査されていない。
HMG-CoA還元酵素はヒドロキシメチルグルタリル-CoAのメバロン酸への変換、すなわちコレステロール生合成における初期の律速段階を触媒する。本発明で使用できる具体的なHMG-CoA還元酵素阻害剤としては、スタチンが挙げられる。臨床試験では、スタチンは総コレステロール、LDLコレステロール、アポリポタンパク質Bおよびトリグリセリドのレベルを低下させている。スタチンは同様に、HDLレベルを増加させることができる。本発明で有用であると考えられるスタチンとしては、アトルバスタチン、ロバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、およびセリバスタチンが挙げられるが、これらに限定されることはない。これらのスタチンの化学式は以下を含む。
D-PDMPはグルコシルセラミド合成酵素およびラクトシルセラミド合成酵素阻害剤である。D-PDMPの分子式はC23H38N203HClである。D-PDMPは427.1の分子量を含み、水溶性である。D-PDMPの化学式は以下である。
1,5-(ブチルイミノ)-1,5-ジデオキシ-D-グルシトール(ミグラスタット)は、グルコシルセラミド合成酵素、つまり多くのスフィンゴ糖脂質の合成に関与するグルコシル転移酵素の阻害剤である。ミグラスタットは水溶性である。ミグラスタットの分子式はC10H21NO4であり、219.28の分子量を有する。ミグラスタットの化学式は以下である。
上述の化合物に加えて、本発明者は同様に、これらの化合物の重要な部分を模倣するようにその他の立体的に類似の化合物を構築できることが企図される。このような模倣化合物をグルタチオン供与体、AICAR、AMP活性化キナーゼの活性化因子、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、および/またはミグラスタットと同じ方法で使用することができる。
被験者において炎症性疾患を治療または予防する能力を有すると同定された化合物は、単独でまたは他のそのような化合物と組み合わせて、その最適な治療用量によりアッセイすることができる。このようなアッセイは当業者に周知であり、組織培養またはそのような作用物質で治療できるさまざまな疾病の動物モデルを含む。
本発明の化合物の精製に用いるのに適したさまざまな技術が当業者に周知であると考えられる。これらには、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、ゲルクロマトグラフィーまたは分子篩クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。本発明で使用できるこれらのおよびその他の技術の例は、Sambrook et al., 2001に載っている。
本発明の1つの態様は、グルタチオン供与体、AICAR、AMP活性化キナーゼ、HMG-COA還元酵素阻害剤、D-PDMP、および/またはミグラスタットのいずれか1つを必要のある患者に送達することにより、炎症性疾患を治療または予防する方法を含む。これらの化合物は、別個の賦形剤中で送達されてもよく、または1つの組成物の中に含まれてもよい。本発明の薬学的化合物および組成物の有効量は、一般に、疾患またはその症候の程度を検出可能にかつ繰り返し改善する、軽減する、最小化するまたは抑えるのに十分なその量と定義される。疾患の排除、根絶または治療を含めて、より厳密な定義が適用されることもある。
本発明の薬学的組成物はグルタチオン供与体、AICAR、AMP活性化キナーゼの活性化因子、HMG-COA還元酵素阻害剤、D-PDMP、および/またはミグラスタットを含むことができる。「薬学的または薬理学的に許容される」という語句は、例えば、ヒトなどの動物に投与された場合に副作用、アレルギー反応またはその他の有害反応をもたらさない分子的実体および組成物のことを指す。グルタチオン供与体、AICAR、AMP活性化キナーゼの活性化因子、HMG-COA還元酵素阻害剤、D-PDMP、および/またはミグラスタットを含む薬学的組成物の調製は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990などの、本開示に照らして当業者に公知であろう。さらに、動物(例えば、ヒト)投与の場合、調製物は生物学的標準品に関するFDA Office of Biological Standardsによって定められている無菌性、発熱性、一般的安全性および純粋性の基準を満たさなくてはならないことが理解されよう。
本発明は静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、腟内に、子宮内に、直腸内に、局所的に(topically)、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、眼球内に、経口に、局所的に(topically)、 局所的に(locally)、吸入(例えば、エアロゾル吸入)により、注射により、注入により、持続注入により、直接標的細胞を限局性灌流槽に浸すことにより、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリーム中で、脂質組成物(例えば、リポソーム)中で、あるいは当業者に知られているその他の方法または前記の任意の組合せにより投与することができる(Remington's, 1990)。
グルタチオン供与体、AICAR、AMP活性化キナーゼの活性化因子、HMG-COA還元酵素阻害剤、D-PDMP、および/またはミグラスタットのいずれかの組合せを含む組成物などの、本発明の組成物を用いた治療の有効性を高めるため、これらの組成物を炎症性の疾患または症状の治療に有効なその他の治療法と組み合わせることが望ましい場合がある。
以下の例は本発明の好ましい態様を実例説明するために含まれる。以下に続く例に開示される技術は、本発明の実施に際して十分に機能することが本発明者により見出されている技術に相当し、したがって、好ましいその実施様式を構成すると考えられることは当業者によって理解されるはずである。しかしながら、当業者は本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示される特定の態様において多くの変更を行うことができ、それでも同様のまたは類似の結果を得ることができることを理解するはずである。
材料と方法I
試薬
組換えラットインターフェロンγ(IFNγ)およびマウスマクロファージ由来iNOSに対する抗体は、Calbiochem(CA)から入手した。DMEMおよびFBSはLife Technologies社から入手した。リポ多糖類(大腸菌(Escherichia coli)抗原型0111:B4由来)はSigma (MO)から入手した。グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド、ガングリオシドおよびD-PDMP (C23H38N203・HCl; D-トレオ-1-フェニル-2-デカノイルアミノ-3-モルホリノ-1-プロパノール・HCl)はMatreya社(PA)から入手した。14C-ガラクトースおよび3H UDP-ガラクトースはAmerican Radiolabeled Chemicals (MO)から入手した。
星状細胞に富んだ初代培養物は、既報(Pahan et al., 1998)のように1日齢のSprague-Dawley系ラットの全皮質から調製した。手短に言えば、既報(Won et al., 2001)のように、皮質をpH 7.4の氷冷カルシウム/マグネシウムを含まないハンクス平衡塩類溶液(HBSS) (Gibco, Grand Island, NY)中で素早く解剖した。次いでこの組織を細かく切り刻み、トリプシン(2 mg/ml)含有HBSS中で20インキュベートし、10% FBSおよび10 μg/mlゲンタマイシンを含有する平板培地中で2回洗浄し、次にパスツールピペットに通してすり潰すことでバラバラにし、この後に細胞を75cm2の培養フラスコ(Falcon, Franklin, NJ)中で平板培養した。5% CO2中にて37℃で1日間インキュベーション後、この培地を培養培地(5% FBSおよび10 μg/mlゲンタマイシン含有DMEM)に完全に交換した。培養液は1週間に2回新鮮な培地で2分の1交換した。14日〜15日後、細胞を少なくとも1日オービタルシェーカー上で振盪して小膠細胞を取り去り、次いでマルチウェル組織培養ディッシュに蒔いた。薬物とのインキュベーションの前に、細胞を無血清DMEMで24時間インキュベートした。
細胞を12ウェルのプラスチック製組織培養皿の中で培養した。適当な処理の後、NOの生成をナイトライトに対する培養上清のアッセイにより測定した(Green et al., 1982)。手短に言えば、培養上清100 μlをGriess試薬100 μlと反応させた。アッセイ試料の吸光度を570 nmで分光光度的に測定した。ナイトライト濃度は新鮮培地中でのNaNO2の反応から得られた標準曲線から算出した。
iNOSタンパク質の場合、細胞を冷Tris緩衝生理食塩水(TBS; 20 mMトリズマベース(Trizma base)、および137 mM NaCl, pH 7.5)で洗浄し、1×SDSサンプルローディングバッファー(62.5 mMトリズマベース、2 % w/v SDS、10%グリセロール)中に溶解し、超音波処理および1,5000×gで5分間の遠心の後、上清をiNOSウエスタン免疫ブロットアッセイに使用した。試料のタンパク質濃度は、標準物質としてウシ血清アルブミン(BSA)を用い、界面活性剤適合性タンパク質アッセイ試薬(Bio-Rad Laboratories, CA)で測定した。試料を0.1容量の10%β-メルカプトエタノールおよび0.5%ブロモフェノールブルーミックスで3分間煮沸した。全細胞タンパク質50 μgを8%または12%ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動により分解し、ポリビニリデンジフルオライド(PVDF)フィルターに電気転写し、5%スキムミルク入りのTween 20含有Tris緩衝生理食塩水[TBST; 10 mMトリズマベース(pH 7.4)、1% Tween 20、および150 mM NaCl]でブロッキングした。このフィルターを、抗iNOS抗血清(BD PharMingen, CA)、または抗hRas抗血清(Upstate Biotechnology, CA)、または抗リン酸特異的MAPK(p42/44)抗血清(Signal Transduction)とPVDF緩衝液中にて室温で2時間インキュベーション後、TBST緩衝液で3回洗浄し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギまたはマウスIgGと1時間インキュベートした。この膜をTBST緩衝液で洗浄後、ECL-plus (Amersham Pharmacia Biotech)を用いてオートラジオグラフにかけた。
細胞(細胞1×107個)由来の核抽出物は、既刊の方法(Dignam et al., 1983)を用い、若干の変更を加えて調製した。細胞を回収し、氷冷TBSで2回洗浄し、10 mM KCl、2 mM MgCl2、0.5 mMジチオスレイトール、プロテアーゼインヒビターカクテル(Sigma)、および0.1% Nonidet P-40の10 mM HEPES, pH 7.9を含有する緩衝液A 400 μl中に氷上で10分間溶解した。5,000×gで10分間遠心後、ペレット化された核をNonidet P-40不含の緩衝液Aで洗浄し、25% (v/v)グリセロール、0.42 M NaCl、1.5 mM MgCl2、0.2 mM EDTA、0.5 mMジチオスレイトール、およびComplete(商標)プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)の20 mM HEPES, pH 7.9を含有する緩衝液B 40 μl中に氷上で30分間再懸濁した。この溶解物を15,000×gで15分間遠心し、核タンパク質を含む上清を、使用まで-70℃で保存した。AP-1、NFκB、およびC/EBP DNA結合活性を検出する電気泳動移動度シフトアッセイに、核タンパク質10 μgを使用した。DNAとタンパク質間の結合反応は、10 mMトリズマベース(pH 7.9)、50 mM NaCl、5 mM MgCl2、1 mM EDTA、1 mMジチオスレイトール、ポリ(dI-dC) 1 μg、5% (v/v)グリセロール、および末端デオキシヌクレオチジル転移酵素(Roche)を用いてDIG-ddUTPで標識したおよそ0.3 pmolのNFκB (Santa Cruz Biotech)中にて室温で20分間行った。タンパク質とDNAとの複合体を50 mM Tris, pH 8.3、0.38 Mグリシン、および2 mM EDTA中の室温の5%ポリアクリルアミドゲル中で無タンパク質DNAから分離し、プラスに帯電したナイロン膜上に電気ブロットした。DIG標識プローブの化学発光検出法は、先の非アイソトープノザンブロット解析について記述した方法と同じである。
トランスフェクションの前に、6ウェルプレート中で1ウェル当たり細胞3×105個を1日間培養した。トランスフェクションは一定のプラスミド濃度(2.5 μg/トランスフェクション)とFugeneトランスフェクション試薬(Roche Molecular Biochemicals) 8 μlで行った。トランスフェクションから1日後、細胞を無血清培地中に一晩置いた。適当な処理後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、かき集めて、溶解緩衝液(40 mMトリシンpH 7.8、50 mM NaCl、2 mM EDTA、1 mM MgSO4、5 mMジチオスレイトール、および1% Triton X-100) 100 μlを用いて再懸濁した。時折ボルテックスしながら室温中で15分間インキュベーション後、試料を遠心した。ルシフェラーゼおよびβ-ガラクトシダーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイキット(Stratagene, CA)およびβ-galアッセイキット(Invitrogen, CA)をそれぞれ用いることにより測定した。Spectra Max/Gemini XG (Molecular Device, CA)およびSpectraMax 190 (Molecular Device)を用いて、放射光および光学的吸収を測定した。
刺激後、6ウェルプレート中の初代星状細胞をPBSで洗浄し、膜溶解緩衝液(MLB; 0.5 mlの25 mM HEPES, pH 7.5、150 mM NaCl、1% Igepal CA-630、0.25%デオキシコール酸ナトリウム、10%グリセロール、10 mM MgCl2、1 mM EDTA、25 mM NaF、1 mMオルトバナジウム酸ナトリウム、およびEDTA不含のComplete(商標)プロテアーゼインヒビターカクテル)中に溶解した。4℃で5分間遠心(5,000×g)後、上清をRas活性化アッセイに使用した。既報(Herrmann et al., 1995)のとおり、pGEX-2T-GST-RBDを形質転換したBL21 (Invitrogen)大腸菌株中において0.1 mM IPTGの存在下で発現させた、アガロース結合Raf-1のRas結合ドメイン(RBD)との結合に、上清100 μgを使用した。結合反応はMLB中において4℃で30分間行った。MLBで3回洗浄後、2×SDSサンプルバッファーの添加によりRas-RBD複合体を変性させた。Upstate Biotechnologyから入手したRas抗体を用い、ウエスタン免疫ブロット解析によってRasタンパク質を同定した。
培養細胞を既報のように[14C]ガラクトース(5 μCi/ml)を含有する増殖培地中で24時間インキュベートした。培地を除去し、細胞単層を滅菌PBSで洗浄して、非特異的に吸着された放射活性を取り除き、新鮮な無血清培地を添加した。細胞をLPS/IFNγ(1 μg/ml; 10 U/ml)で各種時間刺激した後、細胞を回収し、氷冷PBSで洗浄し、超音波処理により溶解した。タンパク質定量化の後、クロロホルム:メタノール:HCl (100:100:1)による脂質の抽出にタンパク質200 μgを使用した。この有機層を窒素下で乾燥させた。高速薄層クロマトグラフィーにより、展開溶媒としてクロロホルム/メタノール/0.25% KCl (70:30:4, v/v/v)を用いてスフィンゴ糖脂質を分離した。このクロマトグラフプレートを風乾し、ヨウ素蒸気で染色した。LacCerに相当するゲル領域をかき取って、「liquiscint」(NEN Life Science Products)をシンチレーション液として利用し、放射活性を測定した。
LPS処理細胞由来のラクトシルセラミドをシリカゲル60 TLCプレートにより分離した。脂肪酸メチルエステル(FAME)を既報(Khan et al., 1998; Pahan et al., 1998)のように調製した。FAMEをシリカキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフィー(Shimadzu, GC 17Aガスクロマトグラフ)により分析し、同定された全脂肪酸に占める割合として定量化した。質量分析データをFinnegan LCQクラシック(イオントラップ四重極子)質量分析計で記録した。
GalT-2の活性は、既報(Yeh et al., 2001)のように[3H] UDP-ガラクトースをガラクトース供与体としておよびGlcCerを受容体として用い測定した。手短に言えば、細胞をPBS中に回収し、細胞ペレットをTriton X-100溶解緩衝液中に懸濁した。細胞溶解物を超音波処理し、タンパク質定量化の後、全量100 μl中に20 μMカコジル酸緩衝液(pH 6.8)、1 mM Mn/Mg、0.2 mg/ml Triton X-100 (1:2 v/v)、30 nmol GluCerおよび0.1 mmol UDP-[3H]ガラクトースを含有する反応混合物に、細胞溶解物100 μgを添加した。0.25 M EDTA 10 μl、0.5 M KCl 10 μlおよびクロロホルム/メタノール (2:1 v/v) 500 μlを添加することで反応を停止し、生成物を遠心により分離した。この下層を回収し、窒素下で乾燥させた。HPTLCプレート上で分離した後、ゲルを切り取り、放射活性をシンチレーションカウンタ中で測定した。外因性GluCerなしでのアッセイをブランクとし、その放射活性計数値を全ての各データポイントから差し引いた。
DNA組込み技術により、ラット・ラクトシルセラミド合成酵素(GalT-2)を標的とする次の配列
の20merアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。スクランブルオリゴヌクレオチド(5'-CTGATATCGTCGATATCGAT-3')を同様に合成し、対照として使用した。細胞をカウントし、トランスフェクションの前日に平板培養し、翌日にこれを無血清条件下でオリゴフェクタミン(Invitrogen)とオリゴヌクレオチドとの複合体(200 nMオリゴ)を用いて処理した。トランスフェクションから2日後、トランスフェクト細胞をLPS/IFNγ(1 μg/ml)で刺激し、刺激から24時間後に一酸化窒素のレベルを調べた。iNOSのmRNAおよびタンパク質のレベルをトランスフェクト細胞の刺激から6時間後および24時間後の時点でそれぞれ調べた。
製造元のプロトコルにしたがってTRIzol (GIBCO)を用い全RNAを抽出後、一本鎖cDNAを全RNAから合成した。1×PCR緩衝液および2 mM MgCl2を含有する18 μl容量中で、全RNA 5 μgを2 UのDNAse I (ウシ膵臓由来、Sigma)を用いて室温で15分間処理した。その後、25 mM EDTA 2 μlと65℃で15分間インキュベーションすることで、DNAse Iを不活性化した。製造元のプロトコルにしたがいランダムプライマー2 μlを添加し、RNAにアニールさせた。cDNAは全RNA 5 μgおよび50U〜100 Uの逆転写酵素を含有する反応液50 μl中で、この試験管を42℃で45分間インキュベートすることにより合成した。PCR増幅はcDNA 1.0 μl、0.5 mMの各プライマーが入った反応混合物25 μl中、製造元のTaqポリメラーゼ条件(Takara, takara Shuzo Co. Ltd, Japan)下で行った。PCR増幅に用いたプライマーの配列は次の通りである。
PCRプログラムの中には、95℃で4分間のプレインキュベーション、94℃で1分間さらに50℃で1分間のアニーリングさらに74℃で1分間の伸長を30サイクルの増幅および74℃で10分間の最後の伸長が含まれた。このPCR産物10 μlを1.2%アガロースゲル上で分離し、UV下で視覚化した。
製造元のプロトコルにしたがってTrizol (GIBCO, BRL)を用い、ラット脊髄切片からの全RNAの単離を行った。Biorad iCycler (iCycler iQ Multi-Color Real Time PCR Detection System; Biorad, Hercules, California, USA)を用いて、リアルタイムPCRを行った。一本鎖cDNAを全RNAから合成した。1×PCR緩衝液および2 mM MgCl2を含有する18 μl容量中で、全RNA 5 μgを2 UのDNAse I (ウシ膵臓由来、Sigma)を用いて室温で15分間処理した。その後、25 mM EDTA 2 μlと65℃で15分間インキュベーションすることで、DNAse Iを不活性化した。使用のためのプライマーセットをデザインし(Oligoperfect(商標) designer, Invitrogen)、組込みDNA技術(IDT, Coralville, IA, USA)より合成した。
のプライマー配列。IQTM SYBR Green SupermixをBIO-RAD (BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA)から購入した。熱サイクル条件は次のとおりとした: 95℃で10分間DNAポリメラーゼの活性化、その後95℃で30秒間および58.3℃で30秒間の増幅40サイクル。Microsoft Excelデータ表計算ソフトを用いて、GAPDHに対し正規化された標的遺伝子の発現を試料全てについてコンピュータ計算した。
Sprague-Dawley系雌性ラット(体重225g〜250g)をSCIの誘発用に購入した(Harlan laboratories, Durham, NC)。全てのラットに適宜、水と食用固形飼料を与え、それらをUS Department of Health and Human Services(国立衛生研究所, Bethesda, MD, USA)の「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(実験動物の管理と使用に関する指針)」にしたがって維持した。ラットでのSCIの誘発のため、臨床的に関連する重錘装置を既報(Gruner, 1992)のように利用した。手短に言えば、ケタミン(80 mg/kg)に加えキシラジン(10 mg/kg)の腹腔内(i.p.)投与によりラットに麻酔をかけた後、T12の椎弓切除術を行った。脊椎を定位固定装置により固定化した状態で、6 cmの高さから5 gmのおもりを脊椎上にそっと載せたインパウンダに落下させることで、損傷(30 g/cm力)をもたらした。偽手術動物には椎弓切除術のみ施した。麻酔から回復後、動物を神経学的に評価し、食料および飲料摂取についてモニターした。また一方で、予防的な抗生物質または鎮痛剤は、SCIの実験的治療とのその相互作用の可能性を回避するために使用しなかった。
SCIの誘発後10分以内に、ラットにスフィンゴ糖脂質阻害剤D-PDMP (Matreya Inc, Pleasant Gap, PA)を投与した。SCIラットへの腹腔内(i.p.)投与時に、D-PDMPを5% Tween 80の生理食塩水に溶解し、これを滅菌生理食塩水(0.85% NaCl)で希釈した。動物(1群当たり6匹)を無作為に選択して異なる4群を形成した: 賦形剤(5% Tween 80の生理食塩水)処置したシャム(偽手術)動物(椎弓切除術のみ)およびSCI動物(5% Tween 80の生理食塩水)、ならびにD-PDMP (5% Tween 80中で20 mg/kg)処置した偽手術動物およびSCI動物。D-PDMPの単回用量を初回投与(これはSCIから10分後に投与した)後から損傷後72時間後まで24時間毎に投与した。処置から1時間、4時間、12時間、24時間、48時間および72時間後、動物を麻酔下で殺処理した。
ラットを麻酔し、骨頭切除術により殺処理した。賦形剤処置した偽手術動物およびSCI動物ならびにD-PDMP処置した偽手術動物およびSCI動物から、発生地としての損傷部位を有する脊髄切片を注意深く抽出した。RNAおよびタンパク質抽出の使用に向けられた組織は速やかに、Trizol (GIBCO, BRL)中でホモジナイズし、液体窒素中で急速凍結し、さらに使用するまで-80℃で保存した。全RNAを製造元のプロトコルにしたがって抽出し、先述のとおりcDNA合成に使用した。組織学的検査および免疫組織化学に使用される脊髄切片は、10%中性緩衝ホルマリン(Stephens Scientific, Riverdale, NJ)中で固定した。この組織をパラフィン中に包埋し、4 μM厚の薄片に切った。
脊髄切片を脱パラフィン処理し、アルコール割合を段階的にし連続的に再水和させた。次にスライドを抗原脱マスキング液(Vector Labs, Burlingame, CA)中で10分間煮沸し、同じ溶液中でさらに20分間冷却し、その後、0.05% Tween-20 (TNT)入りのTris-ナトリウム緩衝液(0.1 M Tris-HCL, pH-7.4, 0,15 M NaCl)中で各5分間3回洗浄した。切片をトリプシン処理(0.1% 10分間)し、3%過酸化水素水中に10分間浸漬して内因性のペルオキシダーゼ活性を除いた。0.5%ブロッキング試薬入りのTrisナトリウム緩衝液(TNB) (TSA-Directキット、NEN Life Sciences, Boston MAに同梱されている)中で、切片を30分間ブロッキングして非特異的な染色を減らした。免疫蛍光二重標識の場合、切片を抗iNOS抗体(1:100、マウスモノクローナル、Santa Cruz, CA)と一晩インキュベートし、続いて星状細胞マーカーGFAPに対する抗体(1:100、ウサギポリクローナル、DAKO, Japan)と1時間インキュベートした。抗iNOSはフルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合抗マウスIgG (1:100、Sigma)を用いて視覚化し、GFAPはテトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)結合抗ウサギIgG (1:100、Sigma)を用いて視覚化した。この切片を封入剤(EMS, Fort Washington, PA)中で封入し、Adobe Photoshopソフトウェアを利用した免疫蛍光顕微鏡検査法(Olympus)により視覚化した。対照の一次抗体として、ウサギポリクローナルIgGを使用した。切片を同様に、陰性対照として一次抗体なしでFITC結合抗ウサギIgG (1:100、Sigma, St. Louis, MO)と、またはTRITC結合IgG (1:100)とインキュベートした。H&E染色を(Kiernan, 1990)による報告のとおり行った。ルクソールファーストブルーPASを(Lassmann and Wisniewski, 1979)にしたがって行った。
APOPTAGフルオレセイン・インサイチュー・アポトーシス検出キット(Serological Corporation, Norcross, GA)を製造元のプロトコルにしたがって用い、TUNELアッセイを行った。二重標識の場合、切片をマウス抗ニューロン核1:100(NeuN, Chemicon, USA)とインキュベートした。切片をTRITC結合マウスIgG 1:100(Sigma)とインキュベートし、封入剤中で封入し、蛍光顕微鏡検査法により視覚化した。
ステューデント・ニューマン・キュールズ(Student Newman- Keuls)検定を行うことにより、データを統計的に分析した。
結果I
GSLにより媒介されるLPS/IFNγにより誘導されるNO生成およびiNOS遺伝子発現
iNOS遺伝子発現をもたらす初代星状細胞のLPS/IFNγ刺激は、複雑な多段階過程である。本研究ではGSLが何らかの方法で関与するかどうかを調べた。いくつかの濃度(0、10、25および50 μM)のスフィンゴ糖脂質阻害剤D-PDMPを用いて0.5時間予め処理し、その後LPS/IFNγ (1 μg/ml; 10 U/ml)で刺激した初代星状細胞は、一酸化窒素(NO)生成の用量依存的な減少(図1A)ならびにiNOSのmRNAおよびタンパク質レベルの用量依存的な減少(図1B)を示した。しかしながら、漸増用量のLacCerの存在下では、D-PDMPを介したNO生成の阻害(図1C)およびiNOS遺伝子発現の阻害(図1D)は、鈍化された。これがLacCer特異的な効果であったことを証明するため、その他のスフィンゴ糖脂質誘導体を同様に、外因的に補充した。しかしながら、Glucer(図2A)、GalCer(図2B)ならびに各種のガングリオシド-GM1(図2C)、GM3(図2D)およびGD3(図2E)の存在によっては、LPS/IFNγにより誘導されたNO生成のD-PDMPを介した阻害をLacCerの補充が逆行させたようには逆行させることはなかった。これらの研究は、スフィンゴ糖脂質経路の代謝産物LacCerがLPS/IFNγを介したiNOS遺伝子発現およびNO生成の誘導の調節に関与する可能性があることを示唆している。
LPS/IFNγにより誘導されるiNOS遺伝子発現のLacCerによる機構を理解するため、ラクトシルセラミドのインサイチューレベルを定量化した。材料と方法に記述されているように高速薄層クロマトグラフィーによって14C標識LacCerを分離し、市販されているLacCer標準物質を用いて、Rf値により特徴づけた。図3Aに示されるように、LacCerレベルの急増がLPS/IFNγによる刺激から2分〜5分後以内に観測された。LPS/IFNγ刺激後、LacCerレベルは、刺激されていない細胞で観測されたものの約1.5倍に増加した。D-PDMPによるラクトシルセラミド合成酵素(GalT-2、LacCer生合成に関与する酵素)の阻害によって、LPS/IFNγ刺激後のこのLacCer生合成の増加が阻害された。さらに、GalT-2活性をLPS/IFNγ刺激後にアッセイしたところ、LPS/IFNγ刺激から5分後の時点にピークを有する酵素活性の急増が観測された(図3B)。ラットGalT-2 mRNAに対するアンチセンスDNAオリゴマーおよび対照としてスクランブル配列のオリゴマーを用いることにより、iNOS遺伝子発現におけるGalT-2およびその産物LacCerの役割をさらに確認した。図3Cに示されるように、アンチセンスDNAオリゴマーは顕著に、LPS/IFNγを介したNO生成ならびにiNOS mRNAおよびタンパク質のレベルを低下させた(図3D)。さらに、iNOS遺伝子の調節におけるLacCerおよびGalT-2の役割の可能性を詳しく調べるため、これらの実験から単離され精製されたLacCerを同様に、その組成および構造確定を目的に詳しく調べた。刺激細胞から得られたLacCerの質量分析結果は、LacCer中の3つの主要な脂肪酸(18:0, 56.2%; 18:1, 26.4%; 16:0, 12.9%)と一致していた。18:0からなるLacCerはm/z 889 (M, 1.1%)、m/z 890 (M+H, 1.4%)およびm/z 740 (M-[5×OH+2×CH3OH], 41.6%)として特徴的に存在していた。同様に、LacCerの16:0種はm/z 861 (M+, 0.8%)、862 (M+H, 1.2%)、m/z 860 (M-H, 1.1%)およびm/z 711(860-[5×OH+2×CH3OH], 51.9%)に顕著なピークが存在していた。オレイン酸(18:1)からなるLacCer種は、m/z 888 (M+H, 1.8%)およびm/z 739 (888-[5×OH+2×CH3OH], 100%)に顕著なピークが存在していた。2つのさらに重要なピークの存在がm/z 342 (M-スフィンゴ脂質主鎖, 4.4%)およびm/z 529 (M-Lac主鎖-H2O, 1.5%)であった。LPS/IFNγ刺激細胞では、ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸メチルエステル分析によって明らかとされたように脂肪酸プロファイルが変化していた。対照細胞に比べ、14:0 (167%)、16:0 (65.8%)、18:0 (7.3%)および20:0 (5.7%)を含めて全ての飽和長鎖脂肪酸が増加していることが分かった。総合すれば、GCおよびMSから得られたデータにより、精製された化合物の構造が主要な脂肪酸をステアリン酸、オレイン酸およびパルミチン酸として有するLacCerと裏付けられ確認された。
C6神経膠腫細胞でのiNOS遺伝子発現におけるLacCerの役割を比較するため、C6細胞をLPS/IFNγ刺激の前に、漸増用量のD-PDMP (10、25、50 μM)を用いて0.5時間前処理した。図4の説明文に記述されているようにC6細胞をLPS/IFNγとインキュベーション後、NO生成ならびにiNOSのタンパク質およびmRNAレベルを測定した。LPS/IFNγにより誘導されたNO生成(図4A)ならびにiNOSのタンパク質およびmRNAレベル(図4B)は、漸増用量のD-PDMPの存在下では阻害される。しかし、外因性LacCerの補充によって、NO生成(図4C)ならびにiNOSのmRNAおよびタンパク質の発現(図4D)から明らかにその阻害は逆転されたが、GluCerでは効果がなかった。これらの研究は、LacCerを介したLPS誘導iNOSの調節が星状細胞とC6神経膠腫細胞で同じであることを示している。
iNOSを誘導するLPS/IFNγ誘導性細胞シグナル伝達におけるLacCerの役割を理解するため、低分子GTPaseの活性化に対するLacCerの効果を詳しく調べた。低分子GTPase Rasの活性化はLPS/IFNγ誘導性のiNOS遺伝子発現にとって重大な意味を持つことが知られている(Pahan et al., 2000)。GST結合Raf-1 RBD (Ras結合ドメイン)を使用することで、Ras活性化を詳しく調べた。LPS/IFNγ刺激により、Rasの素早い活性化が観測された(図5A)。LPS/IFNγを介したRasの最大活性化(刺激から2分〜5分後以内に観測された)は、D-PDMPを用いた前処理によって低下し、外因的なLacCerの補充により、これは完全に逆転した(図5B)。これらの研究は、LacCerがLPS/IFNγによるRasの活性化に関与し、結果的にiNOS遺伝子発現の誘導を引き起こすことを示唆している。さらに、LPS/IFNγ刺激により、細胞外調節キナーゼ1 & 2 (これらはRasの下流標的である)の活性化も観測された。D-PDMPを用いた前処理はLPS/IFNγによるERK1/2のリン酸化を阻害し、これは外因性LacCerが存在する場合には逆転した(図5D)。さらに、ERKのリン酸化および活性化に関与するキナーゼMEK1/2のPD98059による阻害が、結果的にNO生成およびiNOS発現の阻害をもたらしたことは、ERK経路がiNOS遺伝子発現に関与していることを証明するものである(図5C)。外因性LacCerの補充はPD98059によるiNOS遺伝子発現阻害には影響せず、このことから、LPS/IFNγによるRas/MEK/ERKを介したiNOS遺伝子発現の調節を媒介する二次メッセンジャーとしてLacCerを上流に位置づけることができる。
LacCerを介したiNOS遺伝子調節の機構をさらに理解するため、iNOSの誘導に必要であることが知られているIκB/NF-κB経路(Nunokawa et al., 1996; Pahan et al., 1998; Taylor et al., 1998; Keinanen et al., 1999)の関与について調べた。この可能性を検証するため、κBリピートルシフェラーゼ・トランスフェクト細胞において、ルシフェラーゼ活性に対するD-PDMPの効果を観測した。LPS/IFNγによるルシフェラーゼ活性はD-PDMP処理によって無効にされるが、これは外因性LacCerによって効果的に回避される(図6A)。図6Bに示されるように、電気泳動移動度シフトアッセイにより試験されたNF-κB DNA結合活性は、漸増用量のD-PDMPによって阻害されたが、これは外因性LacCerの存在下では逆転した。標識されたNF-κBの結合活性を打ち負かす、50倍量の非放射性プローブを用いることにより、NF-κBプローブの結合特異性が証明された。IκBのリン酸化と分解がNF-κBの活性化と核への移行に必要とされるので、リン酸化IκBレベルについても調べた。D-PDMPの存在下では、IκBリン酸化の減少が観測された。しかしながら、LacCerが加えられると、NF-κBの核移行やDNA結合活性の増大と相関するリン酸化IκBのレベルが増加した(図6C)。これらの研究は、LacCerを介したLPS/IFNγ誘導性iNOS遺伝子発現の転写調節機構がIκB/NF-κB経路を介していることを描き出した。
先の観測結果の生理的関連性を検証するためおよび神経炎症性疾患でのiNOS誘導におけるLacCerの役割をさらに詳しく調べるため、ラット脊髄損傷モデルでのD-PDMPの効果について調べた。ラットにおける脊髄損傷は、iNOS陽性の反応性星状細胞およびマクロファージによる病変部とその周辺部での急速な浸潤を引き起こすことが示されている(Wada et al., 1998a; Wada et al., 1998b)。図7に示されるように、ナイーブまたは偽手術の動物に比べて、リアルタイムPCRにより測定されたiNOS mRNAの強力な誘導(図7A)およびタンパク質発現(図7B)がSCIから12時間後に観測される。SCIから10分後以内のD-PDMP(20 mg/Kg)処置により、このiNOS発現の増加は著しく抑制される。賦形剤(VHC)およびD-PDMP処置SCIラットの損傷部位から得られた脊髄切片の二重免疫蛍光解析は、損傷から24時間後にGFAP(図8D)およびiNOS(図8E)レベルの顕著な増加とその共局在化(図8F)を示したが、D-PDMP処置SCIラットは著しく低下したGFAP(図8J)およびiNOS(図8K)発現を示したことから、星状細胞の反応性形質転換およびiNOS遺伝子発現の制御におけるD-PDMPのインビボ効果が実証された。これらの研究から、SCIおよび可能なその他の神経炎症性疾患のインビボモデルにおいて損傷部位での反応性星状細胞によるiNOS遺伝子発現にスフィンゴ糖脂質が関与することやiNOS生成、つまり二次損傷を悪化させる主要な炎症性事象を阻害するうえでのD-PDMPによるスフィンゴ糖脂質減少の効果が示唆された。
分子のレベルで外傷後の脊髄障害について、NOは外傷後空洞形成、ニューロン死、軸索変性およびミエリン破壊の発生に密接に関与することが報告されている。著しく多数のTUNEL陽性細胞がSCI後の病変部に点在し(図9E)、これらのうちのいくつかは同様に、抗ニューロン核(NeuN)抗血清を用いた二重免疫蛍光染色によってニューロンと同定された(図9Dおよび9F)。D-PDMPはラットSCIモデルにおいて二重の有益な効果があった。D-PDMPはSCI後のiNOS発現を阻害することができた。さらに図9J〜9Lに示されるとおり、D-PDMPは同様にアポトーシスからニューロンおよびその他の細胞を保護した。これはかなり重要である。その理由は、D-PDMPの副作用が偽手術動物でのニューロンの生存に対して認められず(図9G〜9I)、投与した用量が何ら明白な副作用なしにiNOSを効果的に阻害し、またニューロンの脱落という点でのSCI関連の病状の軽減につながったことを示しているからである。さらに、図10に示されるように、損傷ラット脊髄切片の組織学的検査によって観察されたSCIによる白質の空胞変性および組織壊死(図10B)は、D-PDMPによってiNOSが阻害されたSCIラットの組織切片では阻害された(図10D)。重錘による損傷は後肢の運動機能障害に至るミエリン空胞形成を引き起こすことも知られている(Suzuki, et al., 2001)。賦形剤処置SCIラットから得たミエリンに対する脊髄切片のLFB染色は、深在性の髄鞘脱落を示し(図10F)、これは同様に、D-PDMPを介したiNOS阻害によって減弱された(図10H)。総合すれば、これらの研究は、D-PDMPによる本研究でのiNOS発現などの炎症性事象の阻害がSCI動物モデルにおいて有益な効果を有することを実証している。それらは同様に、神経炎症性疾患におけるスフィンゴ糖脂質の重要性を明確に示すものである。
考察I
一酸化窒素を介した病態生理は、脳卒中および脊髄損傷(SCI)を含め、多くの神経炎症性疾患に共通している。炎症性疾患ではどの因子がiNOS遺伝子発現を誘導し調節しているかは完全に知られていないので、本研究では、スフィンゴ糖脂質の関与について詳しく調べ、初代星状細胞においてRas/ERK1/2およびIκ-B/NF-κB経路を含むLacCer媒介性の事象を通じたiNOS遺伝子調節の新たな経路を実証した。これらの結論は以下の所見に基づくものである。(1) LPS/IFNγはiNOS遺伝子発現を誘導し、LacCer生成はスフィンゴ糖脂質合成阻害剤D-PDMPによって阻害された。他のいかなるスフィンゴ糖脂質ではなく、外因性ラクトシルセラミドを加えることで、D-PDMPによるiNOS遺伝子発現の阻害が逆転した。(2) LPS/IFNγはGalT-2活性を5分以内に刺激し、細胞内ラクトシルセラミドのレベルを素早く増加させた。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてGalT-2をノックダウンさせると、結果的にNO生成およびiNOS発現が減少した。(3) D-PDMPはLPSによるRas活性化を無効としたことから、LacCerによるiNOS調節に関わる経路は低分子GTPase-Rasによって誘発される。ERK1/2キナーゼがさらにiNOS発現を媒介していた。MEK1/2阻害剤PD98059がLPS/IFNγを介したiNOS遺伝子発現を阻害したからである。(4) LacCer媒介性のiNOS転写調節はIκ-B/NF-κB経路を介している。D-PDMPは、LPS/IFNγを介したκBリピート最小プロモーターのレポーター遺伝子活性の誘導ならびにNF-κB転写促進およびIκB分解を阻害した。図11に図解されるように、LPS/IFNγ誘導性iNOS遺伝子調節のLacCerを介した調節と関連のある事象について、以下のモデルを提唱する。LPS/IFNγ刺激はLacCer合成酵素(GalT-2)を活性化し、細胞内のLacCerレベルを増加させた。これが結果として、どちらもサイトカイン誘導性のiNOS遺伝子発現およびNF-κB活性化を媒介することが以前に実証されている低分子G-タンパク質 Rasとその下流の細胞外調節キナーゼ1 & 2 (ERK1/2) (Pahan et al., 1998 ; Marcus et al., 2003)を活性化することになる。さらに、LacCerは、Ras活性化を介してであれそれ自体で媒介される事象を介してであれ、IκB-NFκB経路を誘発することができる。NF-κBは、iNOS遺伝子発現に対し立証された主要な転写因子である(Pahan et al., 1998)。IκBのリン酸化がその分解を引き起こし、これにより細胞質ゾル中でIκBによって隔離されていたNF-κBは核内に移行され、iNOS遺伝子の発現を開始することができる。本研究で示されたデータは、セラミド誘導体LacCerをiNOS遺伝子発現におけるシグナル伝達分子と同定するものである。
材料と方法II
試薬
ApopTag(登録商標)プラス・ペルオキシダーゼ・インサイチュー検出キット(S7101)は、Intergen (CITY, NY)から入手した。マウスモノクローナルTNF-抗体(SC-7317)およびウサギポリクローナルIL-1抗体(SC-7884)は、Santa Cruz Biotechnology社(Santa Cruz, CA)から入手した。ウサギポリクローナルiNOS抗体(N32030-050)は、Transduction Laboratories (San Diego, CA)から入手した。GSNOはWorld Precision Instruments社(Sarasota, Florida)から購入した。DMEM (4.5 gm グルコース/L)、RPMI 1640培地、ウシ胎仔血清およびハンクス塩類溶液はLife Technologies (Grand Island, NY)から購入した。使用したその他全ての化学物質および試薬は、特に明記しない限りSigma (St. Louis, MO)から購入した。
本研究では、体重250g〜300gの雌性Sprague-Dawley系ラット(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)計60匹を使用した。サウスカロライナ医科大学(Medical University of South Carolina)のガイダンスおよび「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(実験動物の管理と使用に関する指針)」に概説されているように人道的管理に関するNational Research Councilの基準にしたがい、全ての動物を人道的に管理した。体温を直腸プローブによってモニターし、恒温性ブランケット制御ユニット(Harvard Apparatus, Holliston, MA)によって37±0.5℃に維持した。頭蓋温度および平均動脈圧をそれぞれ、HSE Plugsys TAM-DおよびTCAM (Harvard Apparatus)により測定した。
全ての動物手順はサウスカロライナ医科大学動物審査委員会(Medical University of South Carolina Animal Review Committee)によって承認されており、国立衛生研究所(National Institute of Health)によって発行されている動物使用に関するガイドラインにしたがった。動物を次の3群に分けた: (1) 対照(偽手術)群(Sham、n=20); (ii) 虚血(20分)および再灌流(24時間)群(賦形剤、n=20); (iii) GSNO処置群(GSNO、n=20)。処置群では、再灌流時に大腿静脈カニューレ挿入により、GSNO (1 mg/kg体重)の生理食塩水(約250 l)溶液をゆっくり注入した。虚血(賦形剤)および対照(sham)群のラットにはGSNOの代わりに、同量の生理食塩水を投与した。
ラットを終夜絶食としたが、ただし実験の前に水を自由に飲ませた。キシラジンの腹腔内注射(10 mg/kg体重)および塩酸ケタミンの筋肉内注射(100 mg/kg)により、ラットを麻酔した。直腸温プローブを導入し、加温パッドによって体温を37±0.5℃に維持した。本発明者の先の公開(Sekhon et al. 2003)に記述されているとおり、右MCAを塞いだ。外科的処置は15分のうちに完了したので、著しい失血はなかった。虚血期間の終了時に、ナイロン・モノフィラメントを引き抜き、総頸動脈鉗子を取り除いて、総頸動脈を通じた再灌流を顕微鏡によって確認した。動物をその後、加温パッド上で麻酔から回復させた。一定の再灌流時間の後に、動物を殺処理した。ラットの脳を、虚血性の脳半球(同側性)および虚血の影響がない(対側性)領域と同定された二つの部分に分けて、解析のためすぐに使用するかまたは後に解析するため液体窒素中で凍結し-70℃で保存した。
生理的変数をMCA閉塞の前に、その間に、再灌流時におよび再灌流から30分後に測定した。直腸温度をモニターし、約37℃から37.6℃に維持した。レーザードップラー血流計(Perimed Sweden and Oxford Optronix Ltd., Oxford, UK)を用い、実験動物および偽手術対照で局所脳血流(rCBF)を調べた。
虚血性梗塞の評価に2,3,5-塩化トリフェニルテトラゾリウム(TTC)染色法を用い、その後コンピュータにより画像収集を行った。手短に言えば、ペントバルビタールの過剰摂取後、ラットを再灌流から24時間後に骨頭切除術により殺処理した。脳を素早く取り出し、氷冷生理食塩水の中に5分間入れておいた。Brain Matrix (Brain Tree Scientific)により、各脳から6連続切片を、前頭極から2 mmの間隔で切断した。この切片を2% TTC (Sigma, MO)中でインキュベートし、37℃で15分間生理食塩水に溶解した。染色された脳切片を10%ホルマリン中で保存し、さらなる加工処理および保存の場合には4℃で冷蔵保存した。冠状切片(2 mm)をコンピュータに接続された平床式カラースキャナ(HPスキャンジェット5400 C)に載せた。白で境界線の示された梗塞領域を画像解析ソフトウェア(Photoshop 4.0 Adobe System)により取得し、NIH画像ソフトウェアにより測定した。神経学的評価は、ラット群のアイデンティティに盲目的な観察者により行われた。神経学的欠損を再灌流後の30分、24時間、および72時間の時点(殺処理前)で評価し、次のようにスコア化した: 0、観察可能な神経学的欠損なし(正常); 1、尾部によって全身を持ち上げるときに左前肢を伸ばせず(軽度); 2、対側への旋回(中等度); 3、安静時に対側への傾斜または自発運動活性なし(重度)。本発明者の先の公開(Sekhon et al. 2003)に記述されているとおり、上記の時点で神経学的欠損を示さない動物は研究から除外された。生理食塩水またはGSNOで処置した動物の一部では、CBFをMCAOの前に、その間に、および再灌流の開始から3時間後に測定した。各動物を、麻酔下で、定位固定装置にセットし、針状プローブを次の座標(前後方向、-1.0 mm; 横方向、-4.0 mm)の十字縫合でセットした。
以前に報告されている(Haq et al. 2003)とおりに、カスパーゼ-3酵素活性アッセイを行った。手短に言えば、反応混合物には緩衝液B (100 mM HEPES, pH 7.4; 20%グリセロール; および2 mMジチオスレイトール) 900 lの中に、ラット脳ホモジネートから調製された細胞質タンパク質50 gと500 M Ac-DEVD-AMC (カスパーゼ-3基質II、蛍光性; Caibiochemカタログ番号235425)が含まれた。基質を組織抽出物に加えることで酵素反応を開始し、37℃でインキュベートした。AMCフルオロフォアの切断による蛍光の変化を検出するため、蛍光分光光度計を用いて380 nmの励起波長および460 nmの発光波長でカスパーゼ-3様活性を測定した。
生後1日〜3日齢のSprague-Dawley系ラット産仔から初代ラット星状細胞を調製し、10%ウシ胎仔血清(FBS)および抗生物質を加えたDMEM (4.5 gmグルコース/L)中で維持した。GFAP (グリア細胞繊維性酸性タンパク質)陽性の免疫染色に基づいて、星状細胞が95%を超える純度であることが確認された。BV2細胞は、Dr. Michael McKinneyにより提供していただいたマウス初代小膠細胞に由来する小膠細胞系であり、10% FBSおよび抗生物質を添加したDMEM (4.5 gmグルコース/L)中で維持した。3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)を用いて細胞の代謝活性を測定することによりおよびLDH放出アッセイ(Roche)により、処置の細胞毒性効果を測定した。
新鮮なまたは凍結された脳組織または培養細胞をウエスタンブロット解析に使用した。20 mM Tris, pH 7.4; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 1% Triton; 2.5 mMピロリン酸Na; 1 mMバナデート; ロイペプチン1 gを含有する氷冷緩衝液中で、組織(脳)をホモジナイズした。このホモジネート(各タンパク質160 g)を冷アセトンで処理し、ボルテックスし、-70℃で4時間保存した。この試料を12,000×gで10分間遠心して、タンパク質を沈殿させた。次に、この乾燥ペレットをローディングバッファー中で5分間煮沸した。等量(1レーン当たりタンパク質40 g)のタンパク質をSDS-PAGE解析に供し、これをニトロセルロース(Amersham)に転写した。免疫ブロット用に培養細胞から得た試料は、以前に報告されている(Giri et al. 2002)ように調製した。手短に言えば、細胞を回収し、その後、氷冷溶解緩衝液(50 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5 mM EGTA、10%グリセロール、およびプロテアーゼインヒビターカクテルを含有する50 mM Tris-HCl, pH 7.4)中で溶解した。この試料をSEE P. 12で10分間遠心した。上清(タンパク質50 g/レーン)をSDS-PAGEにより解析し、ニトロセルロース(Amersham)にブロットした。ブロットを5%脱脂粉乳-TBS-0.1% Tween 20中で1時間ブロッキングし、洗浄し、その後、5% BSA-TBS-0.1% Tween 20中のiNOS抗体(1:1000)とともに4℃で一晩インキュベートした後、洗浄した。これに続けて、ペルオキダーゼ結合ウサギ二次抗体(1:5,000, Sigma)との1時間のインキュベーションを行った。製造元の使用説明書(Amersham Pharmacia Biotech)にしたがって高感度化学発光検出法を利用し、その後X線フィルムに膜を露出することにより、免疫反応性を検出した。デンシトメトリー解析をBio-Radデンシトメーター(モデルGS-670、イメージングデンシトメーター)で行った。Bio-Radから市販されているタンパク質定量色素(Bradford試薬)を使って、タンパク質濃度を測定した。
記述(Giri et. al.報告)のように12ウェルプレート中で製造元の使用説明書にしたがい、星状細胞の場合にはリポフェクタミン2000 (Invitrogen)およびBV2細胞の場合にはリポフェクタミンプラス(Invitrogen)により、初代星状細胞または小膠細胞系(BV2)にβ-ガラクトシダーゼとともにNF-B-またはiNOS-ルシフェラーゼレポーター遺伝子(1.5 g/ウェル)を一過性にトランスフェクトした。コトランスフェクション研究の場合、細胞に、HA-IKKaまたはHA-IKKまたはp65またはp50発現ベクターの存在下でまたは非存在下でレポーターをトランスフェクトした。全DNA (3 g/ウェル)を一定に維持し、pcDNA3を使って全群を等しいDNA量に正規化した。ルシフェラーゼキット(Promega)を用い、ルシフェラーゼ活性を測定した。
TUNEL (TdT仲介性dUTPニック末端標識)アッセイにより、アポトーシスを検出した。手短に言えば、切片をキシレンで脱パラフィン処理し、段階的アルコール液の3回交換を通じて再水和し、スライド上で直接的にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中にて室温で15分間、その後20 g/mlのプロテイナーゼK中にて室温で15分間インキュベートした。アポトーシスの検出にはApopTag (登録商標)プラスペルオキシダーゼキット(Intergen社)を用いた。3% H2O2のPBS液との5分間のインキュベーション、続いて平衡化緩衝液との10秒間のインキュベーションによって、脳切片の内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。
特異抗体を用いた免疫組織化学解析により、サイトカイン(TNF- & IL-1)およびiNOSの発現を検出した。ホルマリン固定脳組織からのパラフィン包埋切片をTNF-、IL-1およびNOSについて染色した。手短に言えば、脳組織切片を脱パラフィン処理し、段階的アルコール液中で連続的に再水和し、その後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS, pH 7.4)中に浸漬した。次にスライドを抗原脱マスキング液(Vector Labs, CA)中で2分間レンジ加熱し、冷却しPBS中で2分間3回洗浄した。切片を3%過酸化水素の蒸留水中に25分間浸漬して内因性のペルオキシダーゼ活性を除き、次いで免疫組織化学用の1%ウシ血清アルブミンのPBS中で1時間および希釈したヤギ血清中で30分間ブロッキングして非特異的な染色を減らした。切片を、ブロッキング緩衝液中に希釈した一次マウスモノクローナルTNF-抗体(1:50、Bio Source)、IL-1抗体(1:25、Santa Cruz Biotechnology, CA)およびウサギポリクローナルiNOS抗体(1:10、Transduction Labs, CA)と一晩インキュベートし、その後、0.1% Tween-20を含有するPBS中で6分間3回洗浄した。iNOSおよびIL-1はビオチン化抗ウサギ抗体により、TNF-は(ビオチン化)抗マウス抗体により、続いてアビジン-ビオチンHRP複合体(Vectastain ABC-Eliteキット, Vector Labs, CA)を用い、ジアミノベンジジンを基質として用い検出した。スライドを次に、段階的な一連のアルコール液を通じて脱水し、Permount中で封入し、これにカバーガラスをのせた。Olympus社製の顕微鏡を用いて全ての切片を解析し、Adobe Photoshop (Adobe Systems, CA)によって制御されるデジタルビデオカメラ(Optronics)を用いて画像をキャプチャした。
全ての値は平均±SDとして表現されている。群の平均間の比較は、対応のない変数に関するスチューデントの両側t検定を用いて行った。群間の相違は、p < 0.05の場合に有意と考えられた。
結果II
GSNOの梗塞の縮小に対するおよび神経学的スコアの回復に対する効果
生理食塩水処置(賦形剤)による虚血脳およびGSNO処置(GSNO)による虚血脳から得た代表的なTTC染色切片(頭側から尾側領域まで並べられた計6切片のうちの3番および4番)を図12Aに示す。GSNOによる処置は、賦形剤と比べて、脳の白色域のうち相当な領域が消失したことから判断されるとおり、梗塞を減少させた。全6切片に基づいた梗塞体積(図12B)が大幅に減少していることが分かった。虚血動物とGSNO処置動物との間の神経学的スコアには著しい違いがあった(図12C)。20分のMCA閉塞と24時間の再灌流により、結果として神経学的スコアは2.70±0.48になった。GSNO処置動物は平均の神経学的スコアが1.10±0.32であった。GSNOの用量(1 mg/kg体重)の選択は、最大の脳保護(梗塞体積)に基づいている。この用量では安静時の血圧、頭蓋内圧、およびその他の生理的パラメータに影響しなかった。しかし、虚血の発症後のGSNO投与は、虚血から3時間後に11.2% (各群の動物2匹の平均値)に対して128.0%という脳血流(CBF)の著しい増加を伴っていた。GSNO処置と未処置の両群で、虚血から7日後まで、動物の生存を同様にモニターした。処置動物(n=7)は全て7日まで生存し、健康状態を維持し、神経学的欠損がなかったが、未処置動物(n=7)は虚血から3日後以内に死んだ。
脳の虚血および再灌流後のTNF-αを介したiNOSの誘導は、相当な量のNOの生成に関連している。その後、NOはO2 -と反応して強力なオキシダントONOO-を形成し、これは直接的に細胞死に関与しており、間接的にヒドロキシルラジカルの生成を引き起こす。TNF-α (図13A〜C)およびIL-1β (図13D〜F)は虚血脳の同側半球(主に皮質)中で再灌流から24時間後に高度に発現されていることが判明し、この発現はGSNO処置動物では著しく低下した。再灌流から24時間後の免疫染色によって検出されたiNOSの発現(図13G〜I)は、TNF-αおよびIL-1βと類似のパターンにしたがっており、GSNOによる処置はiNOS陽性細胞の数を劇的に減少させた。偽手術群では調べた脳領域のどこにもiNOS陽性細胞が存在していなかった。虚血脳の同側半球中にiNOSの発現が有ることおよびGSNOにより処置した虚血脳の同側半球中にその発現が無いことは、図14Aおよび14Bに示されるようにウエスタンブロット解析によっても支持された。iNOSの発現は主にマクロファージ/小膠細胞に見られた。それはiNOSに対する染色がED-1の発現と重なり合っていたからである(図16D〜16I)。iNOSを発現しているマクロファージ/小膠細胞は、血管中(図16D〜16F)だけでなく皮質領域中(図16G〜16I)にも存在していた。iNOSの発現は活性化星状細胞のマーカーGFAPとも重なり合っており(図16A〜16C)、したがって活性化星状細胞がiNOS誘発性の窒素ストレスに関与することを示唆している。
実験的証拠から、炎症性メディエータが関与するまでは、虚血性障害や梗塞の進行はゆっくりしたペースで進むことが示唆される。浸潤性の血液由来細胞によってまたは活性化グリア細胞によって分泌される炎症性メディエータは、酸化ストレスおよび窒素ストレスを増強し、アポトーシス細胞死を誘導する。EDIを使用して、活性化小膠細胞を含む、単球由来の細胞を検出した。同側半球の周辺部域内にEDIに著しく特異的な染色(図15B)が存在していた(賦形剤)。GSNOを用いた処置によって、EDI陽性細胞の数が低下した(図15C)。偽手術群ではEDIに対する染色がなかった(図15A)。虚血の場合、梗塞は、高レベルのグリア細胞繊維性酸性タンパク質(GFAP、星状細胞特異的な細胞骨格タンパク質)を発現している多数の肥大型星状細胞で取り囲まれている。図15Eに示されるとおり、GFAP陽性の星状細胞は、虚血性の皮質領域中で顕著に増加しているのが認められた。GSNOを用いた処置によって、活性化星状細胞の数が減少した(図15F)。
アポトーシスの指標としてDNA断片化を転移酵素仲介性d-UTP標識ニック末端標識(TUNEL)アッセイにより測定した。梗塞のとりわけ辺縁周囲の同側半球におけるDNA断片化が著しく増加した(図13J〜13L)。GSNO処置によって、アポトーシス細胞数の減少が起こった。対照脳および虚血脳の対側半球では、TUNEL陽性細胞が示されなかった。TUNEL陽性細胞が主にニューロンに存在していたという事実は、TUNEL染色をニューロン特異的マーカーNSEと重ね合わせることで確認された(図16J〜16L)。さらに、偽手術のものに比べて虚血脳の同側半球では、カスパーゼ-3活性が著しく増加していることが判明し、GSNO処置脳では、この活性が基礎レベルに戻った(図17)。
サイトカインに応じたNOの生成は、脳虚血の病理生物学において重要であることが示されている。GSNO処置によるiNOSの阻害に関与する機構を詳しく調べるため、ラット初代星状細胞および小膠細胞をインビトロ研究に使用した。これらの細胞が虚血性傷害後の脳内における炎症の伝播に関与しているからである。これらの細胞を異なる濃度(0.1mM〜2mM)のGSNOで前処理し、その後、BV2の場合にはLPS (1 μg LPS/ml)でまたは星状細胞の場合にはLPS (1 μg LPS/ml) + IFN-γ (50 U IFN-γ/ml)で処理した。24時間後、ウエスタンブロットにより、iNOSタンパク質がないかどうか細胞を分析した。GSNOを用いた処理によって、星状細胞(図18A)とBV2(図18C)の両方で用量依存的にiNOSの発現が阻害された。GSNO (1 mM)単独ではiNOS発現に効果がなかった。GSNOのサイトカイン誘導性iNOS発現に対する阻害効果をさらに、星状細胞(図18B)とBV2 (図18D)細胞の両細胞でiNOSルシフェラーゼ活性測定法により確認した。
GSNOを介したiNOS発現の下方制御の機構を理解するため、LPS/IFN-γまたはLPSを介したNF-κB活性化に対するGSNOの効果を星状細胞とBV2細胞のそれぞれで詳しく調べた。刺激されていない細胞では、NF-κBはp65/p50ヘテロ二量体からなり、IγBとのその結合によって細胞質中に保持される。細胞質NF-κB/IγB複合体が解離し、遊離NF-κBが核に移行し、細胞の刺激後のiNOSを含むNF-κB応答性遺伝子の転写を調節する。上流のキナーゼIKKによるIγBのリン酸化が、NF-κBからのIγBの解離には不可欠である。NF-κBの活性化と核への移行(Hallenbeck 2002; Han et al. 2003)が、iNOSおよび炎症誘発性サイトカイン(TNFα、IL-1βおよびIL-6β)の発現には極めて重要であることが示されている。NF-κBルシフェラーゼベクターをトランスフェクトした細胞において、LPS/IFN-γまたはLPS攻撃に応じたそのレポーター活性をモニターすることで、NF-κB活性に対するGSNOの阻害効果をさらに解析した。異なる濃度(0.1〜2MM)のGSNOを用いた処理により、ラット初代星状細胞とBV2細胞のそれぞれで、NF-κBルシフェラーゼレポーター活性のLPS/IFN-γまたはLPS依存的な活性化が低下した(図19A、19D)。NF-κBルシフェラーゼ活性に対するGSNOの直接的効果を詳しく調べるため、NF-κBルシフェラーゼレポーターに加えてNF-κBのp65とp50サブユニットの発現ベクターを、初代星状細胞とBV2細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後、細胞を異なる濃度のGSNOで、続いてLPSまたはLPS/IFNγで5時間処理した。GSNO処理によって初代星状細胞でおよびBV2細胞系で(図19B、19E)、p65/p50を介したルシフェラーゼ活性が用量依存的に阻害された。GSNOはこれらの細胞でp65/p50を介したiNOSルシフェラーゼも減弱させた(図19C、19F)ことから、GSNOは同様に、NF-κBサブユニットに対し直接的にその効果を媒介し、損傷に関与する炎症誘発性遺伝子の転写のために、それらのサブユニットがDNAに結合する能力を変化させたことがさらに示唆された。IKKまたはIKKを介したiNOSのおよびNF-κBのルシフェラーゼ活性に対するGSNOの効果を同様に、星状細胞とBV2細胞で調べた。GSNOによる星状細胞およびBV2細胞の処理は、IKKおよびIKKを介したiNOSルシフェラーゼ活性およびNF-κBルシフェラーゼ活性を用量依存的に阻害した(データは示されていない)ことから、GSNOはNF-κB経路を阻害するIKKの上流に作用している可能性があることが示唆された。
考察II
GSNOによる処置は実験的脳卒中のラットモデルで、TNF-α、IL-1βおよびiNOSの発現を阻害し、脳の同側半球中のアポトーシスによる神経細胞死を低下させた。これが結果として、梗塞形成の減少(図12A〜12B)と神経学的スコアの改善(図12C)という両観点で保護作用をもたらした。GSNOによる神経保護作用という結論は、GSNO処置が星状細胞および小膠細胞/マクロファージの活性化を阻害し、炎症を減らしたという観測結果に基づいている。この処置は同様に、iNOS発現の誘導を阻害し、ニューロンのアポトーシスを低下させた。さらに、GSNOによるインビトロの処理によって、ラット初代星状細胞とBV2細胞の両細胞で、サイトカインによるiNOS誘導とサイトカンを介したNF-κBルシフェラーゼ活性が阻害された(図18〜19)。
材料と方法III
細胞培養および試薬
初代ラット星状細胞および小膠細胞は、生後1日〜3日齢のSprague-Dawley系ラット産仔から調製し(McCarthy and de Vellis, 1980)、10%ウシ胎仔血清(FBS)および抗生物質を加えたDMEM (4.5 gmグルコース/L)中で維持した。GFAP (グリア細胞繊維性酸性タンパク質)およびMAC1染色に基づき、星状細胞および小膠細胞が95%を超える純度であった。腹腔マクロファージを単離し、加熱不活性化した1% FBSを添加したRPMI 1640培地中で培養した(Pahan et al., 1997)。BV2は、Dr. Michael McKinney (Mayo Clinic, Jacksonville, FL)により提供していただいたマウス初代小膠細胞に由来する小膠細胞系であり、10% FBSおよび抗生物質を添加したDMEM (4.5 gmグルコース/L)中で維持した。DMEM (4.5 gmグルコース/L)、RPMI 1640培地、ウシ胎仔血清およびハンクス平衡塩類溶液はLife Technologies (Grand Island, NY)から入手した。LPS (大腸菌、抗原型055:B5)、GGPP、FPP、AICAR、メバロネートおよびプロテアーゼインヒビターカクテルはSigma (St. Louis, MO)から入手した。iNOSに対する抗体はUpstate (Waltham, MA)から入手した。[γ-32P]ATP (3000 Ci/mmol)および[γ-32P]dCTP (3000 Ci/mmol)はNEN (Boston, MA)から入手した。p65、p50、IKKα、C/EBP-α、-β、-γ、-δに対する抗体ならびにNF-κBおよびC/EBPに対するオリゴヌクレオチドは、Santa Cruz (Santa Cruz, CA)から入手した。組換えTNF-α、IL-1β、IFN-γならびにTNF-α、IL-1β、IL-6およびIFN-γに対するELISAキットはR & D Systems (Minneapolis, MN)から入手した。TRIZOLおよびトランスフェクション試薬(リポフェクタミン2000、リポフェクタミンプラスおよびオリゴフェクタミン)はInvitrogen (Carlsbad, California)から入手した。CAT ELISA、β-ガラクトシダーゼ、MTTおよびLDHキットはRoche (Nutley, New Jersey)から入手した。高感度化学発光(ECL)検出試薬はAmersham Pharmacia Biotech (Arlington Heights, IL)から購入した。ルシフェラーゼアッセイ系はPromega (Madison, WI)から入手した。炎症性サイトカインに対する遺伝子発現アレイはSuperarray (Bethesda, MD)から入手した。非リン酸化p42/44、p38、JNK1/2およびAMPKに対する抗体ならびにp42/44、p38、JNK1/2およびAMPKに対するリン酸特異的な抗体はCell Signaling (Beverly, MA)から入手した。NF-κBルシフェラーゼ、iNOSルシフェラーゼ(3.2 kb)およびAMPKα2ドミナントネガティブ発現ベクター(D157A)は、それぞれDr. W.J. Murphy、Dr. ZhangおよびDr. David Carlingにより親切にも提供していただいた。HA-IKKαに対する発現ベクターはDr. Zheng-Gang Liuからの贈与であった。iNOS (-1486/+145)ルシフェラーゼおよびiNOS-C/EBPdelルシフェラーゼは、Dr. Bruce C. Kone (Houston)により親切にも提供していただいた。iNOS (-234/+31)ルシフェラーゼおよびiNOS (-331/+31 NF-γB突然変異)ルシフェラーゼは、Dr. Mark A. Perrella (Boston)から親切にも贈呈していただいた。
NOの合成は、以前に述べられている(Pahan et al., 1997; Giri et al., 2002)とおり、ナイトライト、つまり酸素分子とのNOの安定な反応生成物に対する培養上清のアッセイによって測定した。手短に言えば、96ウェルプレート中で上清を等量のGriess試薬と混合し、これを穏やかに振盪し、マイクロプレートリーダー中で570 nmにて測定した。このアッセイで、ナイトライト濃度はNaNO2の反応から得られた標準曲線から算出した。
細胞を氷冷溶解緩衝液(50 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5 mM EGTA、10%グリセロールおよびプロテアーゼインヒビターカクテルを含有する50 mM Tris-HCI, pH 7.4)中に回収し、Bradford試薬(Bio-Rad, USA)を用いてタンパク質量を推定した。1レーン当たり全タンパク質50マイクログラムをSDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロース(Amersham Pharmacia Biotech)にブロットした。ブロットを5%脱脂粉乳-TBS-0.1% Tween 20中で1時間ブロッキングし、5% BSA-TBS-0.1% Tween 20中の一次抗体(1:1000)とともに4℃で一晩インキュベートした。これに続けて、適当なペルオキダーゼ結合二次抗体(1:10,000, Sigma)との1時間のインキュベーションを行った。製造元の使用説明書(Amersham Pharmacia Biotech)にしたがって高感度化学発光検出法を利用し、その後X線フィルムに膜を露出することにより、免疫反応性を検出した。
6ウェルプレート(約80%の集密度)中で増殖されAICAR入りの無血清培地中で2時間プレインキュベートされた星状細胞に[2-14C]アセテート(5 μCi/ウェル)を与えた。2時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、かき落とした。以前に述べられているように(Khan et al., 2000)、脂肪酸およびコレステロール中の標識アセテートの取込みを分析した。
内因性AMPKのレベルを減少させるため、星状細胞を、AMPKのα1とα2の両サブユニットに直接的に向けられる25 μmのホスホチオエート(phosphothiorated)アンチセンス(AS)オリゴヌクレオチド
で48時間前処理した(Culmsee et al., 2001)。ミスセンス(MS)オリゴヌクレオチド
を対照培養に使用した。オリゴヌクレオチドは、製造元の使用説明書にしたがい、オリゴフェクタミン(商標)試薬を用いてトランスフェクトした。
AMPK活性を報告のとおり(Kim et al., 2001)、初代ラット星状細胞でアッセイした。IKKα/βアッセイの場合、初代星状細胞をAICAR (1 mM)で前処理し、その後、LPS (1 μg/ml-1)で30分間刺激した。細胞を冷PBSで洗浄し、溶解緩衝液(50 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5 mM EGTA、10%グリセロールおよびプロテアーゼインヒビターカクテルを含有する50 mM Tris-HCI, pH 7.4)中で溶解した。細胞抽出物およそ200 μgを抗IKKα/β抗体(Santa Cruz)と2時間、その後、プロテインA/G PLUSアガロース30 μlを加え4℃でさらに1時間インキュベートした。この免疫複合体を溶解緩衝液中で2回およびキナーゼ緩衝液(20 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM MgCl2)中で2回洗浄し、20 mMβ-グリセロホスフェート、20 mM p-ニトロフェニルホスフェート、1 mMジチオスレイトール、50 μM Na3VO4、20 μM ATP、および[γ-32P]ATP 5 μCiを含有するキナーゼ緩衝液30 μl中にて30℃でインキュベートした。各反応において、GST-IκBα融合タンパク質(Santa Cruz)およそ2 μgを基質として使用した。SDSローディングバッファー中での変性により、反応を30分後に停止させた。タンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、基質のリン酸化をオートラジオグラフィーによって視覚化した。
刺激されたまたは刺激されていない星状細胞から核抽出物を調製した。EMSAは、[γ-32P]ATPで末端標識されたNF-κBおよびC/EBPコンセンサス配列を用い、以前に報告されているように(Giri et al., 2002)行った。タンパク質濃度に基づいて核抽出物を正規化し、等量(5 μg)のタンパク質を負荷した。DNAとタンパク質との複合体を45 mM Tris、45 mMホウ酸、1 mM EDTA (0.5×TBE)中での5%未変性PAGEにて分離し、11 V/cmで泳動した。このゲルを乾燥後、X線フィルムを使い、-70℃でオートラジオグラフにかけた。
製造元のプロトコルにしたがい、全RNAをTrizol (Gibco)で抽出した。iNOSに関するノザンブロットは、以前に報告されているように(Pahan et al., 1997)、1反応当たりRNA 15 μgを用いて行った。RNA負荷の対照として、β-アクチンを使用した。炎症性サイトカイン(TNFα、IL-1β、IL-6およびIFN-γ)に対する遺伝子発現アレイは、製造元のプロトコル(Superarray)にしたがって使用した。イメージングデンシトメーター(Bio-Rad Lab, Hercules, California)を用い、シグナルの定量化を行った。RT-PCRの場合、処置したラット脳の大脳皮質から、前記のようにTrizol中で抽出することによりRNAを単離した。製造元の使用説明書にしたがい、Moloneyマウス白血病ウイルス逆転写酵素(Promega)とプライマーとしてポリdTを用いて、cDNAを全RNA 5 μgから調製した。cDNA 2 μlを使用して、以下の産物を増幅した[産物名、予想サイズ、ならびに使用したフォワード(F)およびリバース(R)プライマーとして示した]。
エチジウムブロマイド0.5 μgを含有する1.2%アガロースゲル中の電気泳動によって、PCR産物を視覚化し、UVP Bio-docシステム(Upland, CA)によって写真撮影した。
製造元(R & D Systems, MN)が提供しているプロトコルによって酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を利用することにより、TNFα、IL-1βおよびIFN-γのレベルを培養上清でおよび血清で測定した。
製造元の使用説明書にしたがい、リポフェクタミン-2000 (星状細胞)およびリポフェクタミン-プラス(BV2, Invitrogen)により、初代星状細胞または小膠細胞系(BV2)にドミナントネガティブなAMPKα2またはHA-IKKβの存在下または非存在下でβ-ガラクトシダーゼとともにNF-κB-またはiNOS-ルシフェラーゼレポーター遺伝子を一過性にトランスフェクトした。pcDNA3を使って全群を等しいDNA量に正規化した。ルシフェラーゼキット(Promega)を用い、ルシフェラーゼ活性を測定した。
動物の使用は「Guide for the Care & Use of Laboratory Animals(実験動物の管理と使用に関する指針)」(National Institute of Health、出版番号86-23)およびMedical University of South Carolina, Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)によって承認されたプロトコルにしたがった。Sprague-Dawley系雌性ラット(200g〜250g; Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)を12時間:12時間の明暗条件下、適宜食料と水を与えながら室温で群飼育した。0.9%生理食塩水に溶解したLPS (0.5 mg/kg体重)または0.9%無菌生理食塩水のみの処置30分前に、動物にAICAR (100 mg/kg体重)を腹腔内注射(i.p.)した。6時間後、大脳皮質を単離し、さらに使用するまで液体窒素、その後-70℃の中で凍結させた。
3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)を用いて細胞の代謝活性を測定することによりおよびLDH放出アッセイ(Roche)により、処置の細胞毒性効果を測定した。
示された結果は平均±S.D.を表す。GraphPad InStatソフトウェア(San Diego, CA)を用い、ステューデント・ニューマン・キュールズ検定によるANOVAによって、統計分析を行った。
結果III
AICARによる脳グリア細胞および腹腔マクロファージにおけるLPSによる炎症誘発性サイトカインの発現の下方制御
活性化された星状細胞、小膠細胞およびマクロファージは、NOおよびサイトカイン生成の主要源であり、炎症性疾患に積極的に関与する(Benveniste, 1997)。ラット初代星状細胞、小膠細胞および腹腔マクロファージを異なる濃度のAICARで前処理し、その後LPS (1 μg/ml)にさらした。ELISAによって測定された星状細胞(図20a)、小膠細胞(図20b)およびマクロファージ(図20c)において、細菌性LPSは炎症誘発性サイトカイン(TNFα、IL-1βおよびIL-6)の生成を著しく誘導した。AICARのみではサイトカインの生成に効果がなかった; しかしながら、それはこれらの細胞の上清中でLPSによるTNFα、IL-1βおよびIL-6の生成を用量依存的に強力に阻害した(図20)。サイトカイン生成の阻害にはmRNA発現の減少が付随して起きた(データは示されていない)。興味深いことに、マクロファージは星状細胞および小膠細胞に比べて、マイクロモル濃度のAICARで炎症誘発性サイトカインの生成を阻害するのに十分であったので、AICARに対し感受性がずっと高かった(図20c)。AICARまたはLPSは、LDHおよびMTTアッセイにより試験された細胞生存性に効果がなかった(データは示されていない)。
炎症誘発性サイトカインの生成に加えて、サイトカインに応じたNO生成が多くの炎症性疾患の病態生理に重要であることが示されている(Smith et al., 1999)。ラット初代星状細胞、小膠細胞およびマクロファージを異なる濃度のAICARで前処理し、その後LPS (1 μg/ml)にさらした。LPSは未処理細胞に比べて10倍高いNO生成(ナイトライトとして測定された)を誘導した。AICAR処理は初代星状細胞、小膠細胞および腹腔マクロファージにおいてLPSによるナイトライトの生成を用量依存的に阻害した(図21AおよびB)。サイトカインの生成と同様に、マクロファージは初代星状細胞および小膠細胞に比べて、AICAR処理に対し感受性がずっと高かった(図20c)。
AICARはAMPKを活性化することによりその効果を媒介する; 炎症過程の調節におけるAMPKの役割を確立することが不可欠であった。AMPKは、いったん活性化されると、アセチル-CoA-カルボキシラーゼ(ACC)およびHMG-CoA還元酵素をリン酸化することにより、脂肪酸およびコレステロール合成などのATP消費経路を下方制御する。AICAR (1 mM)を用いた初代星状細胞の処理がコレステロールおよび脂肪酸生合成の著しい阻害(約80%)をもたらした際(図22a)に、本発明者は同じことを観測した。AICARを用いた星状細胞の処理がACCのリン酸化も誘導したこと(図22b)は、AICARがAMPK活性を誘導したことを実証するものである。AMPKはAMPによりアロステリックに活性化されるだけでなく、上流のキナーゼAMP活性化プロテインキナーゼキナーゼ(AMPKK)の標的でもあり、AMPKKによるAMPKのリン酸化はその完全な活性化に必要である(Moore et al., 1991; Hawley et al., 1996; Hardie et al., 1998; Stein et al., 2000)。AICAR処理した星状細胞におけるAMPKのリン酸化は、AICARがAMPK活性を誘導(ACCのリン酸化を誘導)しただけでなく、(AMPKのリン酸化を誘導する)上流のキナーゼ(AMPKK)活性を誘導したことも明らかに示している(図22b)。AICARを用いた星状細胞の処理はAMPKおよびACCのリン酸化を誘導し(図23b)、これは5-ヨードツベルシジンおよびIC51、つまりAICARからのZMP (AICARの5'-リン酸化型)の形成を阻止するアデノシンキナーゼ(ADK)阻害剤によって阻止された。ZMPはAMP、ADPおよびATPのレベルを変化させることなくAMPKのアロステリック活性化におけるAMPの効果を模倣する(Corton et al., 1995)。ADK阻害剤はAICARによるAMPKのリン酸化を阻止することができ(図22b)、LPSによるiNOSタンパク質の発現に対するAICARの阻害効果を逆転させることができる(図22c)。
AICARを介した炎症過程の下方制御の機構を理解するため、本発明者はLPSを介したNF-κB活性化に対するAICARの効果を詳しく調べた。刺激されていない細胞では、NF-κBはp65/p50ヘテロ二量体からなり、IκBとのその結合によって細胞質中に保持される。さまざまな作用物質による細胞の刺激後、細胞質NF-κB/IκB複合体が解離し、遊離NF-κBが核に移行し、さまざまな遺伝子の転写を調節する。上流のキナーゼIKKによるIκBαのリン酸化が、NF-κBからのIκBαの解離およびその分解には不可欠である(Ghosh and Karin, 2002)。NF-κBの活性化が、iNOSおよび炎症誘発性サイトカイン(TNFαおよびIL-6)の発現には極めて重要であることが示されている(Zagariya et al., 1998; Zhang et al., 1998; Hu et al., 2000)。AICARの役割を初代星状細胞でのLPSを介したNF-κBの活性化で詳しく調べた。図24aに示されるように、LPS処理によって30分以内にNF-κBは活性化して核内に移行し、これが処理から3時間後まで持続する。AICARによる前処理はLPS誘導性のNF-κB DNA結合活性を有意に低下させた(図24a)。NF-κB依存的な転写レポーター(3×NF-κB-luc)を、ドミナントネガティブなAMPKをコードする発現ベクターとともにBV2細胞にコトランスフェクトすることにより、NF-κB転写活性の調節におけるAMPKの役割の可能性を詳しく調べた。図24bに描かれているように、AICARの前処理によってLPS誘導性のNF-κB-Luc活性が有意に阻害された。ドミナントネガティブなAMPKα2はLPS誘導性のNF-κB-Luc活性に効果がなかったが、しかしそれはAICAR誘導性の阻害を顕著に逆転させた(図24b)。LPSを介したNF-κB核移行におけるAICAR誘導性の阻害は、p65およびp50 (NF-κBファミリーのメンバー)に対する核抽出物の免疫ブロット解析の結果と一致していた(図24c)。さらに、これらの結論はAICAR処理によるIκBαの分解の阻害によってさらに支持される(図24d)。
AICARは培養細胞において(NF-κBおよびC/EBPの核移行を阻害することにより)抗炎症性を示したので、AICARのインビボでの同一効果を調べることがさらなる関心の対象になった。TNFα、IL-1βおよびIFN-γなどの、炎症誘発性サイトカインの発現はインビボのLPS腹腔内注射により誘導されることは十分に立証されている(Hesse et al., 1988)。それ故に、本発明者はLPS注射ラットにおいて血清中サイトカインレベルに対するAICARの効果を調べた。TNFα、IL-1βおよびIFN-γのレベルをLPS注射から6時間後の血清中で測定した。図27aに示されるように、LPSは炎症誘発性サイトカイン(TNFα、IL-1βおよびIFN-γ)を効果的に誘導したのに対し、AICARによる前処理はLPSを介して増加した血清中IL-1βおよびIFN-γのレベルをほとんど無効にした。しかしながら、それはTNFαのレベルには効果がなかった。AICAR処理は同様に、これらの動物から単離された腹腔マクロファージにおけるLPS誘導性のiNOSの発現を顕著に阻害した(図27b)。さらに、本発明者は遺伝子アレイ解析により、脾臓においてこれらのサイトカインの発現に対するAICARの効果を調べた。血清中での観測結果と同様に、LPSの腹腔内注射は、脾臓においてTNFα、IL-1βおよびIFN-γの伝達暗号の発現を顕著に誘導した(図27c)。脾臓において、IL-1βおよびIFN-γのmRNA発現はAICARによって著しく低下したが、TNFαの発現に有意な変化は観測されなかった(図27c)。生理食塩水もAICARのみもこれらのサイトカインに対して検出可能なシグナルを誘導しなかった。
考察III
AMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK)はもともと、アセチル-CoA-カルボキシラーゼ(脂肪酸合成)およびHMG CoA還元酵素(イソプレノイドおよびコレステロール生合成)などの、生合成経路に関与する重要な酵素をリン酸化し阻害するその能力によって同定された(Moore et al., 1991; Vincent et al., 1991; Hardie and Carling, 1997; Hardie et al., 1998; Winder and Hardie, 1999)。最近になって、コレステロール代謝産物は炎症過程を減弱することが報告されたので(Pahan et al., 1997; Kwak et al., 2000)、本発明者は培養細胞においておよびLPS注射動物において炎症過程の誘導におけるAMPKの役割の可能性を調べた。本明細書に示されたいくつかの証拠は、AICARによるAMPKの活性化がNF-κBおよびC/EBP転写因子の核移行を阻害することにより、ラット初代星状細胞、小膠細胞および腹腔マクロファージにおいてLPSを介した炎症誘発性サイトカイン、iNOSおよび一酸化窒素(NO)生成の誘導を下方制御するという結論を明らかに指示するものであり、したがってAMPKが炎症性メディエータの発現の調節に関与することを実証するものである。本研究は同様に、炎症性疾患にAICARまたはAMPKの他の薬理的活性化因子を治療的に使用することを示唆する。AICARは組織培養およびLPS注射ラットのCNSにおいて炎症誘発性サイトカインを阻害するが、しかしそれがLPS誘導性の血清中TNFαレベルに影響を与えなかった理由は、現時点では説明することができない。
炎症性疾患に対する治療法としてのスタチン
本実施例は、とりわけ、スタチンを利用して炎症性疾患を治療できるまたは予防できることを示すデータを提供する。例えば、表1は、ロバスタチンとFPP脱炭酸酵素の阻害剤(例えば、NaPA)の組合せがラット初代星状細胞、小膠細胞、およびマクロファージにおいてLPSによる一酸化窒素、TNF-α、IL-1β、およびIL-6の生成を阻害することを示す。
投与経路はD-PDMPの場合には腹腔内(IP)およびアトルバスタチンの場合には胃管補給とした。損傷から1時間、4時間、24時間、48時間、および1週間後に、脊髄組織を動物から抽出した。神経学的スコアリングを目的に、損傷した動物を15日間観察した。図39〜図42はラットでの脊髄損傷に対するアトルバスタチンの効果に関するデータを含む。
Claims (54)
- (a) グルタチオン供与体; および
(b) 5-アミノ4-イミダゾールカルボキサミドリボチド(AICAR)、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A (HMG-CoA)還元酵素阻害剤、D-トレオ-1-フェニル-2-デカノイルアミノ-3-モルホリノ-1-プロパノールHCl (D-PDMP)、もしくは1,5-(ブチルイミノ)-1,5-ジデオキシ-D-グルシトール(ミグラスタット)、またはそれらの誘導体
の治療的有効量を患者に投与する段階を含む、患者において炎症性の疾患または症状を予防または治療する方法。 - 患者が予防または治療の必要があることを判定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 予防または治療の必要がある患者を判定する段階が、患者が炎症性の疾患または症状を発症する危険性があるかどうかを判定する段階を含む、請求項2記載の方法。
- 患者が炎症性の疾患または症状を発症する危険性があるかどうかを判定する段階が家族歴または患者歴を取得する段階を含む、請求項3記載の方法。
- グルタチオン供与体が薬学的に許容される賦形剤中に製剤化される、請求項1記載の方法。
- AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットが薬学的に許容される賦形剤中に製剤化される、請求項1記載の方法。
- AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットを患者に投与する前に、投与する間に、または投与した後に、GSNOを患者に投与する、請求項1記載の方法。
- GSNOを患者に投与する前に、投与する間に、または投与した後に、AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットを患者に投与する、請求項1記載の方法。
- AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットを患者に投与する前に、投与する間に、および投与した後に、グルタチオン供与体を患者に投与する、請求項1記載の方法。
- グルタチオン供与体を患者に投与する前に、投与する間に、および投与した後に、AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットを患者に投与する、請求項1記載の方法。
- グルタチオン供与体がグルタチオンを含む分子である、請求項1記載の方法。
- グルタチオン供与体がグルタチオンの前駆体分子である、請求項1記載の方法。
- グルタチオン供与体がS-ニトログルタチオン(GSNO)、L-2-オキソ-チアゾリジン4-カルボキシレート(プロシステイン)、N-アセチルシステイン(NAC)、またはN-アセチルグルタチオンである、請求項1記載の方法。
- グルタチオン供与体がS-ニトログルタチオン(GSNO)である、請求項13記載の方法。
- グルタチオン供与体およびAICARを患者に投与する、請求項1記載の方法。
- グルタチオン供与体およびHMG-CoA還元酵素阻害剤を患者に投与する、請求項1記載の方法。
- HMG-CoA還元酵素阻害剤がスタチンである、請求項16記載の方法。
- スタチンがアトルバスタチン、ロバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、またはセリバスタチンである、請求項17記載の方法。
- スタチンがアトルバスタチンである、請求項18記載の方法。
- グルタチオン供与体およびD-PDMPを患者に投与する、請求項1記載の方法。
- グルタチオン供与体およびミグラスタットを患者に投与する、請求項1記載の方法。
- グルタチオン供与体、AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、およびミグラスタットを患者に投与する、請求項1記載の方法。
- 炎症性の疾患または症状が脳卒中、X-副腎白質ジストロフィー(X-ALD)、がん、敗血症性ショック、成人呼吸窮迫症候群、心筋炎、関節炎、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、炎症性神経系疾患、炎症性肺疾患、炎症性眼疾患、慢性炎症性歯肉疾患、慢性炎症性関節疾患、皮膚疾患、骨疾患、心疾患、腎不全、慢性脱髄疾患、内皮細胞疾患、心臓血管疾患、肥満症、風邪、狼瘡、鎌状赤血球貧血、糖尿病、または神経変性疾患である、請求項1記載の方法。
- 炎症性の疾患または症状が脳卒中である、請求項23記載の方法。
- 炎症性の疾患または症状が神経変性疾患である、請求項23記載の方法。
- 神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ランドリーギランバレーストロール症候群、多発性硬化症、ウイルス性脳炎、後天性免疫不全症候群(AIDS)関連認知症、筋萎縮性側索硬化症、脳損傷、または脊髄疾患である、請求項25記載の方法。
- 炎症性の疾患または症状を治療または予防するために使われる第二療法を施す段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- グルタチオン供与体が薬学的に許容される組成物中に含まれる、請求項1記載の方法。
- AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットが薬学的に許容される組成物中に含まれる、請求項1記載の方法。
- グルタチオン供与体およびAICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットが別個の組成物中に含まれる、請求項1記載の方法。
- グルタチオン供与体およびAICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットが同じ組成物中に含まれる、請求項1記載の方法。
- グルタチオン供与体がGSNOではない、請求項1記載の方法。
- (a) グルタチオン供与体; および
(b) 5-アミノ4-イミダゾールカルボキサミドリボチド(AICAR)、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A (HMG-CoA)還元酵素阻害剤、D-トレオ-1-フェニル-2-デカノイルアミノ-3-モルホリノ-1-プロパノールHCl (D-PDMP)、もしくは1,5-(ブチルイミノ)-1,5-ジデオキシ-D-グルシトール(ミグラスタット)、またはそれらの誘導体
を含む組成物。 - 薬学的に許容される組成物とさらに定義される、請求項33記載の組成物。
- グルタチオン供与体およびAICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットが薬学的に許容される賦形剤中に製剤化される、請求項33記載の組成物。
- グルタチオン供与体がS-ニトログルタチオン(GSNO)、L-2-オキソ-チアゾリジン4-カルボキシレート(プロシステイン)、N-アセチルシステイン(NAC)、またはN-アセチルグルタチオンである、請求項33記載の組成物。
- グルタチオン供与体がS-ニトログルタチオン(GSNO)である、請求項36記載の組成物。
- グルタチオン供与体およびAICARを含む、請求項33記載の組成物。
- グルタチオン供与体およびHMG-CoA還元酵素阻害剤を含む、請求項33記載の組成物。
- HMG-CoA還元酵素阻害剤がスタチンである、請求項33記載の組成物。
- スタチンがアトルバスタチン、ロバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、またはセリバスタチンである、請求項40記載の組成物。
- スタチンがアトルバスタチンである、請求項41記載の組成物。
- グルタチオン供与体およびD-PDMPを含む、請求項33記載の組成物。
- グルタチオン供与体およびミグラスタットを含む、請求項33記載の組成物。
- グルタチオン供与体、AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、およびミグラスタットを含む、請求項33記載の組成物。
- グルタチオン供与体がGSNOではない、請求項33記載の組成物。
- グルタチオン供与体、5-アミノ4-イミダゾールカルボキサミドリボチド(AICAR)、スタチン、D-PDMP、もしくはミグラスタット、またはそれらの誘導体
の治療的有効量を患者に投与する段階を含む、患者において炎症性の疾患または症状を予防または治療する方法。 - グルタチオン供与体およびスタチン、またはその誘導体を含む、薬学的に許容される組成物。
- グルタチオン供与体がS-ニトログルタチオン(GSNO)、L-2-オキソ-チアゾリジン4-カルボキシレート(プロシステイン)、N-アセチルシステイン(NAC)、またはN-アセチルグルタチオンである、請求項48記載の薬学的に許容される組成物。
- グルタチオン供与体がS-ニトログルタチオン(GSNO)である、請求項49記載の薬学的に許容される組成物。
- スタチンがアトルバスタチン、ロバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、またはセリバスタチンである、請求項50記載の薬学的に許容される組成物。
- スタチンがアトルバスタチンである、請求項51記載の薬学的に許容される組成物。
- グルタチオン供与体がL-2-オキソ-チアゾリジン4-カルボキシレート(プロシステイン)、N-アセチルシステイン(NAC)、またはN-アセチルグルタチオンである、請求項48記載の薬学的に許容される組成物。
- グルタチオン供与体がGSNOではない、薬学的に許容される組成物。
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