JP5232241B2 - ヘルパーｔ細胞の選択的機能制御法 - Google Patents
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Description
本発明は、ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤を含有する、免疫抑制活性、抗喘息活性及び／又は抗アレルギー活性を有する医薬組成物に関する。また、本発明は、ヘルパーＴ細胞の選択的活性抑制能を測定する工程を含む、免疫抑制活性、抗喘息作用及び／又は抗アレルギー作用を示す物質のスクリーニング方法などに関する。
Ｔ細胞は末梢血リンパ球の70-80%を占める免疫細胞であり、脾臓や全身のリンパ節にも広く分布して生体防御に寄与している。Ｔ細胞はその表面にＴ細胞抗原受容体(T cell receptor; TCR)を発現する細胞であり、獲得免疫系の中枢を担っている。Ｔ細胞の活性化は、抗原提示細胞が表出する主要組織適合遺伝子複合体(MHC)＋抗原をＴ細胞膜上のTCRが認識することによって惹起される。１個のＴ細胞は抗原特異的なただ１種類のTCRを発現することによりあらゆる抗原に対して特異的な免疫応答を発揮することができる。また、Ｔ細胞は細胞表面にCD4あるいはCD8分子を発現しており、それぞれCD4陽性Ｔ細胞およびCD8陽性Ｔ細胞サブセットとして区別され、免疫機能も異なる全く別の細胞集団を形成している。CD4陽性Ｔ細胞サブセットはヘルパーＴ細胞と呼ばれ、他のＴ細胞の機能発現を誘導したりB細胞を抗体産生細胞へと分化させたりする機能を有する。一方、CD8陽性Ｔ細胞サブセットはキラーＴ細胞と呼ばれ、ウイルス感染細胞やがん細胞などを破壊する機能を有し、臓器移植の際に問題となる拒絶反応にも関与する。また、ヘルパーＴ細胞は機能的にさらに4つの亜群（Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、Treg細胞）に区別される。Th1細胞は主にIL-12の存在下で分化したエフェクター細胞であり、IFN-γを主に産生して細胞性免疫を誘導することにより自己免疫疾患や遅延型アレルギーに関与する。Th2細胞は主にIL-4の存在下で分化したエフェクター細胞であり、IL-4を主に産生して液性免疫を誘導することにより即時型アレルギーに関与する。Th17細胞は最近同定された亜群であり、IL-6やTGF-β存在下で分化してIL-17を産生し、機能的には自己免疫疾患に関与すると考えられている。Treg細胞は制御性Ｔ細胞と呼ばれるCD25陽性のCD4陽性Ｔ細胞であり、免疫反応を制御することにより免疫系の恒常性維持に寄与している。このように、Ｔ細胞は感染症、腫瘍、臓器移植、アレルギーなど免疫が関与するあらゆる病態において重要な役割を果たしている。なかでもCD4陽性ヘルパーＴ細胞は、他の免疫細胞をコントロールするなど生体防御の中心的な役割を果たす一方、過剰なヘルパーＴ細胞の免疫応答は自己免疫疾患やアレルギー疾患の原因ともなっている。すなわち、適切かつ適度なヘルパーＴ細胞の活性化が免疫系の恒常性維持に必須である。
従来のＴ細胞免疫の制御方法として免疫抑制剤が繁用されている。しかしながら、免疫抑制剤の効果はＴ細胞サブセットに非特異的であることが問題点として挙げられる。代表的な免疫抑制剤としてシクロスポリンやFK506が知られているが、これらはすべてのＴ細胞の活性化を抑制する。また、ステロイド系の薬剤も自己免疫疾患やアレルギー疾患の治療に繁用されているが、細胞非特異的に作用するとともに副作用も強いことが問題である。このように、ヘルパーＴ細胞の機能を選択的に制御する方法は未だ確立されていない。
ガングリオシドはシアル酸を有するスフィンゴ糖脂質の一群であり、すべての内在性のスフィンゴ糖脂質はセラミドから一連の酵素反応を経て生合成される（図１）。GM3はすべてのガングリオシドの起点となる分子であり、ラクトシルセラミドからGM3生合成酵素（sialic acid transferase I; SAT-I）によって合成される。ガングリオシドはすべての哺乳動物細胞に発現しており、コレステロールやスフィンゴミエリンとともにラフトと呼ばれる細胞膜上のマイクロドメインを構成している。近年の研究より、ラフトは受容体からの情報を細胞内に伝達する重要な場として機能することが明らかとなってきた（非特許文献１）。Ｔ細胞においても、ラフトはTCRを介した細胞内情報伝達に必須の場を提供しており、細胞膜からコレステロールを除去する薬剤を用いてラフト構造を破壊すると、TCR媒介性情報伝達は抑制されＴ細胞は活性化されなくなる（非特許文献２）。これまでにＴ細胞活性化におけるガングリオシドの機能的役割は、スフィンゴ糖脂質生合成酵素阻害剤あるいは外来性のガングリオシドの添加という方法で検証されてきたが、それらの結果として顕著な影響はなかったあるいは添加するガングリオシドごとに様々な効果が認められた（非特許文献３）。加えて、in vivoにおいて、Ｔ細胞サブセットごとにTCR媒介性の活性化に対するガングリオシドの機能を解析したという研究は皆無である。
K Simons and D Toomre. Lipid raft and signal transduction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39, 2000 P.W. Janes, S.C. Ley, A.I. Magee and P.S. Kabouridis. The role of lipid rafts in T cell receptor signaling. Semin. Immunol. 12, 23-34, 2000 M Potapenko, G.V. Shurin and J de Leon. Gangliosides as immunomodulator. Adv. Exp. Med. Biol.601, 195-203, 2007
K Simons and D Toomre. Lipid raft and signal transduction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39, 2000 P.W. Janes, S.C. Ley, A.I. Magee and P.S. Kabouridis. The role of lipid rafts in T cell receptor signaling. Semin. Immunol. 12, 23-34, 2000 M Potapenko, G.V. Shurin and J de Leon. Gangliosides as immunomodulator. Adv. Exp. Med. Biol.601, 195-203, 2007
感染、腫瘍、臓器移植拒絶反応、アレルギーなど免疫反応が関与する病態にはヘルパーＴ細胞の機能異常あるいは機能亢進が原因のものもあり、そのような病態に対して、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞などの免疫系全体を制御することは、免疫不全症あるいは免疫亢進状態に陥る要因となる。そのような観点から、ヘルパーＴ細胞の機能を選択的に制御できる方法が望まれる。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意努力し、ガングリオシド生合成に関与する遺伝子（ガングリオシドGM3合成酵素遺伝子）の欠損マウス（SAT-I KO）を作製し、このマウスを用いて、個体レベルでＴ細胞サブセットの活性化におけるガングリオシドの機能的役割を解析した。
その結果、ガングリオシドGM3の生合成を阻害することによって、キラーＴ細胞の機能を保持した状態でヘルパーＴ細胞のＴ細胞受容体（TCR)刺激による増殖を選択的に抑制できることを確認した。さらにこのヘルパーＴ細胞選択的な増殖抑制によって、個体において炎症性浸潤を低減できることを確認した。
したがって、本発明は、ヘルパーＴ細胞におけるスフィンゴ糖脂質の生成を制御することを含む、免疫応答時におけるヘルパーＴ細胞選択的な増殖抑制、およびこの増殖抑制に起因する過剰な免疫応答の緩和又は抑制を誘導する物質、すなわち免疫抑制活性、抗喘息作用及び／又は抗アレルギー作用を示す物質のスクリーニング方法などを提供する。
具体的に、本発明は、以下に記載の医薬組成物、スクリーニング方法、治療方法などに関する：
（１） ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤を含有する、免疫抑制活性、抗喘息活性及び／又は抗アレルギー活性を有する医薬組成物。
（２） 前記ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤が、ヘルパーＴ細胞の増殖を選択的に抑制する物質である、（１）に記載の組成物。
（３） 前記ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤が、ヘルパーＴ細胞におけるスフィンゴ糖脂質の産生を選択的に抑制する物質である、（２）に記載の組成物。
（４） 前記スフィンゴ糖脂質がガングリオシドである、（３）に記載の組成物。
（４ａ） 前記ガングリオシドがGM3である、（３）に記載の組成物。
（５） 前記ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤がGM3に対する抗体を含む、（４）に記載の組成物。
（６） 前記ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤が、GM3合成酵素阻害剤である、（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（７） 前記ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤が、GM3合成酵素の発現を阻害する、アンチセンス核酸、リボザイムまたはRNAi効果を有するRNAである、（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（８） ヘルパーＴ細胞の選択的活性抑制能を測定する工程を含む、免疫抑制活性、抗喘息作用及び／又は抗アレルギー作用を示す物質のスクリーニング方法。
（９） 被験物質を、ヘルパーＴ細胞に接触させ、ヘルパーＴ細胞における細胞増殖を測定する、免疫抑制作用、抗喘息作用及び／又は抗アレルギー作用を示す物質のスクリーニング方法。
（１０） 被験物質を、ヘルパーＴ細胞に接触させ、ヘルパーＴ細胞におけるスフィンゴ糖脂質の産生量を測定する、免疫抑制作用、抗喘息作用及び／又は抗アレルギー作用を示す物質のスクリーニング方法。
（１１） 前記スフィンゴ糖脂質がガングリオシドである、（１０）に記載の方法。
（１１ａ） 前記ガングリオシドがGM3である、（１１）に記載の方法。
（１２） 被験物質を、ヘルパーＴ細胞に接触させ、ヘルパーＴ細胞におけるGM3合成酵素の発現量を測定する、免疫抑制作用、抗喘息作用及び／又は抗アレルギー作用を示す物質のスクリーニング方法。
（１３） ヘルパーＴ細胞の細胞増殖活性を有することが確認された被験物質を、免疫疾患、喘息及び／又はアレルギー反応を示す非ヒト動物に投与する工程を含む、（８）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４） 前記非ヒト動物がマウスである、（１３）に記載の方法。
（１５） 前記非ヒト動物の炎症部位における好酸球及び／又はリンパ球の浸潤細胞数を対照と比較する工程をさらに含む、（１３）に記載の方法。
（１６） ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤の有効量を患者に投与することによりヘルパーＴ細胞の免疫機能を選択的に制御する、免疫疾患、喘息及び／又はアレルギーの治療方法。
（１７） 前記ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤が、ヘルパーＴ細胞の増殖を抑制する、（１６）に記載の方法。
（１７ａ） 前記非ヒト動物において、血清中IgE濃度、IL-4濃度およびIL-5濃度のうちの少なくとも１つを低減させる被験物質を決定する工程を含む、（１６）に記載のスクリーニング方法。
（１８） 前記ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤が、ヘルパーＴ細胞に発現するスフィンゴ糖脂質の産生量を抑制する、（１６）に記載の方法。
（１９） 前記スフィンゴ糖脂質がガングリオシドである、（１８）に記載の方法。
（１９ａ） 前記ガングリオシドがGM3である、（１８）に記載の組成物。
（２０） 前記ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤が、GM３合成酵素阻害剤又はGM３合成酵素の発現を阻害する物質である、（１６）に記載の方法。
（２０ａ） 前記ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤が、GM3合成酵素の発現を阻害するアンチセンス核酸、dsRNAまたはリボザイムである、（２０）に記載の組成物。
（２１）ヘルパーＴ細胞におけるスフィンゴ糖脂質の産生を制御することによりヘルパーＴ細胞の免疫機能を選択的に制御する方法。
（２２） ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤のスクリーニング方法であって、以下：
(i) ヘルパーＴ細胞と、グルコシルセラミド合成酵素阻害剤D-PDMPおよびガングリオシドGM3とを接触させる工程、
(ii) ヘルパーＴ細胞と、グルコシルセラミド合成酵素阻害剤D-PDMP、ガングリオシドGM3および被験物質とを接触させる工程、ならびに
(iii)上記(i)と(ii)との細胞増殖を比較し、ヘルパーＴ細胞の増殖を抑制する被験物質を決定する工程
を含む、スクリーニング方法。
（２３） (v) キラーＴ細胞と上記被験物質とを、キラーＴ細胞が増殖できる条件下で接触させる工程、および
(vi) キラーＴ細胞の細胞増殖には影響しない被験物質を決定する工程、
をさらに含む、（２２）に記載のスクリーニング方法。
（２４） ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤のスクリーニング方法であって、以下：
(i) ヘルパーＴ細胞と、被験物質としてGM3合成酵素発現阻害ポリヌクレオチドとを接触させる工程、および
(ii) ヘルパーＴ細胞を増殖させない被験物質を決定する工程、
を含む、スクリーニング方法。
（２５） ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤のスクリーニング方法であって、以下：
(i) SAT-I遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を発現するよう組み換えられた哺乳動物細胞を作製する工程、
(ii)上記遺伝子組み換え細胞が増殖する条件下で、その細胞と被験物質とを接触させる工程、および
(iii)レポーター遺伝子の発現量を低減させる被験物質を決定する工程
を含む、スクリーニング方法。
（２６） ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤のスクリーニング方法であって、以下：
(i) ヘルパーＴ細胞と、被験物質とを接触させる工程、
(ii) 上記細胞の細胞膜における、GM3、GM2、GM1、GD1aおよびGT1a（a-シリーズ）、GD3、GD2、GD1b、GT1bおよびGQ1b（ｂ-シリーズ）、ならびにGT3、GT2、GT1c、GQ1cおよびGP1c（ｃ-シリーズ）からなる群より選択される少なくとも１つのガングリオシド量を測定する工程、ならびに
(iii)少なくとも１つのガングリオシド量を低減させる被験物質を選択する工程
を含む、スクリーニング方法。
（２７） 抗CD3抗体と抗CD28抗体との組合せ、スーパー抗原または同系異種抗原サブセットの共存下では上記細胞が増殖せず、IonomycinとPMAとの組合せの共存下では上記細胞が増殖する被験物質を決定する工程をさらに含む、上記（２２）〜（２６）のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
（１） ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤を含有する、免疫抑制活性、抗喘息活性及び／又は抗アレルギー活性を有する医薬組成物。
（２） 前記ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤が、ヘルパーＴ細胞の増殖を選択的に抑制する物質である、（１）に記載の組成物。
（３） 前記ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤が、ヘルパーＴ細胞におけるスフィンゴ糖脂質の産生を選択的に抑制する物質である、（２）に記載の組成物。
（４） 前記スフィンゴ糖脂質がガングリオシドである、（３）に記載の組成物。
（４ａ） 前記ガングリオシドがGM3である、（３）に記載の組成物。
（５） 前記ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤がGM3に対する抗体を含む、（４）に記載の組成物。
（６） 前記ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤が、GM3合成酵素阻害剤である、（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（７） 前記ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤が、GM3合成酵素の発現を阻害する、アンチセンス核酸、リボザイムまたはRNAi効果を有するRNAである、（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（８） ヘルパーＴ細胞の選択的活性抑制能を測定する工程を含む、免疫抑制活性、抗喘息作用及び／又は抗アレルギー作用を示す物質のスクリーニング方法。
（９） 被験物質を、ヘルパーＴ細胞に接触させ、ヘルパーＴ細胞における細胞増殖を測定する、免疫抑制作用、抗喘息作用及び／又は抗アレルギー作用を示す物質のスクリーニング方法。
（１０） 被験物質を、ヘルパーＴ細胞に接触させ、ヘルパーＴ細胞におけるスフィンゴ糖脂質の産生量を測定する、免疫抑制作用、抗喘息作用及び／又は抗アレルギー作用を示す物質のスクリーニング方法。
（１１） 前記スフィンゴ糖脂質がガングリオシドである、（１０）に記載の方法。
（１１ａ） 前記ガングリオシドがGM3である、（１１）に記載の方法。
（１２） 被験物質を、ヘルパーＴ細胞に接触させ、ヘルパーＴ細胞におけるGM3合成酵素の発現量を測定する、免疫抑制作用、抗喘息作用及び／又は抗アレルギー作用を示す物質のスクリーニング方法。
（１３） ヘルパーＴ細胞の細胞増殖活性を有することが確認された被験物質を、免疫疾患、喘息及び／又はアレルギー反応を示す非ヒト動物に投与する工程を含む、（８）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４） 前記非ヒト動物がマウスである、（１３）に記載の方法。
（１５） 前記非ヒト動物の炎症部位における好酸球及び／又はリンパ球の浸潤細胞数を対照と比較する工程をさらに含む、（１３）に記載の方法。
（１６） ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤の有効量を患者に投与することによりヘルパーＴ細胞の免疫機能を選択的に制御する、免疫疾患、喘息及び／又はアレルギーの治療方法。
（１７） 前記ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤が、ヘルパーＴ細胞の増殖を抑制する、（１６）に記載の方法。
（１７ａ） 前記非ヒト動物において、血清中IgE濃度、IL-4濃度およびIL-5濃度のうちの少なくとも１つを低減させる被験物質を決定する工程を含む、（１６）に記載のスクリーニング方法。
（１８） 前記ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤が、ヘルパーＴ細胞に発現するスフィンゴ糖脂質の産生量を抑制する、（１６）に記載の方法。
（１９） 前記スフィンゴ糖脂質がガングリオシドである、（１８）に記載の方法。
（１９ａ） 前記ガングリオシドがGM3である、（１８）に記載の組成物。
（２０） 前記ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤が、GM３合成酵素阻害剤又はGM３合成酵素の発現を阻害する物質である、（１６）に記載の方法。
（２０ａ） 前記ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤が、GM3合成酵素の発現を阻害するアンチセンス核酸、dsRNAまたはリボザイムである、（２０）に記載の組成物。
（２１）ヘルパーＴ細胞におけるスフィンゴ糖脂質の産生を制御することによりヘルパーＴ細胞の免疫機能を選択的に制御する方法。
（２２） ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤のスクリーニング方法であって、以下：
(i) ヘルパーＴ細胞と、グルコシルセラミド合成酵素阻害剤D-PDMPおよびガングリオシドGM3とを接触させる工程、
(ii) ヘルパーＴ細胞と、グルコシルセラミド合成酵素阻害剤D-PDMP、ガングリオシドGM3および被験物質とを接触させる工程、ならびに
(iii)上記(i)と(ii)との細胞増殖を比較し、ヘルパーＴ細胞の増殖を抑制する被験物質を決定する工程
を含む、スクリーニング方法。
（２３） (v) キラーＴ細胞と上記被験物質とを、キラーＴ細胞が増殖できる条件下で接触させる工程、および
(vi) キラーＴ細胞の細胞増殖には影響しない被験物質を決定する工程、
をさらに含む、（２２）に記載のスクリーニング方法。
（２４） ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤のスクリーニング方法であって、以下：
(i) ヘルパーＴ細胞と、被験物質としてGM3合成酵素発現阻害ポリヌクレオチドとを接触させる工程、および
(ii) ヘルパーＴ細胞を増殖させない被験物質を決定する工程、
を含む、スクリーニング方法。
（２５） ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤のスクリーニング方法であって、以下：
(i) SAT-I遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を発現するよう組み換えられた哺乳動物細胞を作製する工程、
(ii)上記遺伝子組み換え細胞が増殖する条件下で、その細胞と被験物質とを接触させる工程、および
(iii)レポーター遺伝子の発現量を低減させる被験物質を決定する工程
を含む、スクリーニング方法。
（２６） ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤のスクリーニング方法であって、以下：
(i) ヘルパーＴ細胞と、被験物質とを接触させる工程、
(ii) 上記細胞の細胞膜における、GM3、GM2、GM1、GD1aおよびGT1a（a-シリーズ）、GD3、GD2、GD1b、GT1bおよびGQ1b（ｂ-シリーズ）、ならびにGT3、GT2、GT1c、GQ1cおよびGP1c（ｃ-シリーズ）からなる群より選択される少なくとも１つのガングリオシド量を測定する工程、ならびに
(iii)少なくとも１つのガングリオシド量を低減させる被験物質を選択する工程
を含む、スクリーニング方法。
（２７） 抗CD3抗体と抗CD28抗体との組合せ、スーパー抗原または同系異種抗原サブセットの共存下では上記細胞が増殖せず、IonomycinとPMAとの組合せの共存下では上記細胞が増殖する被験物質を決定する工程をさらに含む、上記（２２）〜（２６）のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
本発明の医薬組成物は、キラーＴ細胞の機能は保持した状態でヘルパーＴ細胞の機能を選択的に制御できるので、臨床的にも新たな免疫制御法としての治療方法を提供することができる。
また、本発明の医薬組成物、または本発明のスクリーニング方法によって得られる物質は、例えば細胞療法において、ヘルパーＴ細胞を選択的に増殖抑制させる目的にも有用であると考えられる。
１．本発明の医薬組成物及び治療方法
本発明は、ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤を含有する、免疫抑制活性、抗喘息活性及び／又は抗アレルギー活性を有する医薬組成物を提供する。
本発明は、ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤を含有する、免疫抑制活性、抗喘息活性及び／又は抗アレルギー活性を有する医薬組成物を提供する。
本発明において使用される「ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤」とは、ヘルパーＴ細胞（4つの亜群であるTh1細胞、Th2細胞、Th17細胞、Treg細胞を含む）による生理活性機能を選択的かつ特異的に抑制する物質である。すなわち、例えばヘルパーＴ細胞には作用するが、キラーＴ細胞にはほとんど影響しないかまたは有害な影響を及ぼさない物質である。より具体的には、本発明において使用される「ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤」は、免疫学的プロトコール 中内 啓光／編、2004年9月発行、羊土社）に記載された方法によって測定される刺激時のヘルパーＴ細胞の増殖抑制活性が、１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは、８０％以上であり、対照である刺激時のキラーＴ細胞の増殖抑制活性が、２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下の物質である。
細胞増殖以外に、容易にヘルパーＴ細胞選択的活性を示す方法として，活性化により選択的にヘルパーＴ細胞より産生されるサイトカインであるIL-4, IL-5およびIFN-γの産生量をもって評価する方法がある。さらに，ヘルパーＴ細胞の活性化に伴って発現亢進する転写因子（T-bet, GATA-3）の遺伝子またはタンパクの発現量により評価できる。
本発明において好ましく使用される「ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤」は、ヘルパーＴ細胞の増殖を選択的に抑制する物質であり、ヘルパーＴ細胞におけるスフィンゴ糖脂質の産生量を選択的に抑制する物質である。
上述のように、ヘルパーＴ細胞の生理活性機能により生体に誘導される代表的な免疫応答としては、例えば、IFN-γを産生して細胞性免疫を誘導することにより自己免疫疾患や遅延型アレルギーに関与すること、IL-4を産生して液性免疫を誘導することにより即時型アレルギーに関与すること、IL-17を産生することにより機能的には自己免疫疾患に関与すること、免疫反応を制御することにより免疫系の恒常性維持に寄与すること、などが挙げられる（Shu L and Paul WE CD4T cells:fates, functions, and faults. Blood, 112, 1557-1569, 2008）。
本発明において、「免疫抑制活性」とは、生体における過剰な免疫応答を抑制、軽減、緩和、鎮静、改善などを引き起こす活性を意味する（例えば、Gummert JF et al. Newer Immunosuppressive Drugs: A Review. J Am Soc Neprol 10, 1366-1380, 1999を参照できる）。このような活性を有する物質として、例えば、シクロスポリン等の公知の免疫抑制剤が挙げられる。
本発明において、「抗喘息活性」とは、喘息の症状を治療及び／又は予防することを意味する。喘息とは、アレルゲンや細菌・ウイルス感染などが発端となった気道の炎症が増悪することで気道過敏性の亢増、可逆性の気道狭窄をおこし、発作的な喘鳴、咳などの症状をきたす呼吸器疾患である。現在の喘息の治療薬には、気管支拡張薬（β受容体作動薬、キサンチン誘導体、抗コリン剤）、副腎皮質ホルモン（吸入ステロイド剤としてプロピオン酸ベクロメタゾンなど）、抗アレルギー薬（ヒスタミン遊離抑制剤としてクロモグリク酸、ヒスタミン受容体拮抗薬としてテルフェナジン，トロンボキサンA2受容体拮抗薬、ロイコトリエン拮抗薬などが挙げられる）などが含まれる（例えば、喘息予防・管理ガイドライン 2006; 日本アレルギー学会監修を参照できる）。
本発明において、「抗アレルギー活性」とは、アレルギー症状を治療及び／又は予防することを意味する。免疫反応は、異物（抗原）を排除するために働く、生体にとって不可欠な生理機能である。アレルギーとは、この免疫反応が、特定の抗原に対して過剰に反応することをいう。アレルギーが起こる原因は不明であるが、抗原に対する過剰な曝露のような外来的要因、遺伝性の内因性要因などが原因として考えられている（例えば、喘息予防・管理ガイドライン 2006; 日本アレルギー学会監修を参照できる）。
本発明において、「ヘルパーＴ細胞の増殖を選択的に抑制する」とは、体細胞のなかでヘルパーＴ細胞の増殖のみを選択的かつ特異的に抑制することを意味する。ヘルパーＴ細胞の選択的な増殖としては、例えば、ヘルパーＴ細胞特異的なＣＤ４を介した増殖刺激を受けることによる細胞増殖が挙げられる。その他のヘルパーＴ細胞特異的な増殖刺激としては、例えば、MHC class II分子依存性の抗原及び同分子特異的抗体が挙げられる。
スフィンゴ糖脂質とは、分子内に糖、脂肪酸及び長鎖塩基であるスフィンゴシンを含む脂質をいう。ガングリオシドは、シアル酸を含むスフィンゴ糖脂質ファミリーの総称であって、シアル酸を含む糖鎖がセラミドと呼ばれる脂質に共有結合で結合している分子である。今日では、様々な糖鎖構造のガングリオシドが知られており、ＧＭ３はその生合成経路における最初のガングリオシド分子である（図１を参照）。すなわち、すべての内在性のガングリオ系ガングリオシドは、セラミドを出発物質として、GM3合成酵素を最初とする一連の酵素反応によって生合成される。この中でGM3はすべてのガングリオシドの起点となる分子であり、ラクトシルセラミドからGM3生合成酵素（SAT-I）によって合成される。糖鎖部分は、細胞内のゴルジ体内腔で糖ヌクレオチドを供与体としてグリコシルトランスフェラーゼよりに逐次合成される。
具体的なガングリオ系ガングリオシドの生合成経路について、図１に示されるように、GM3生合成酵素（SAT-I）によってGal-Glc-CerからGM3が生成され、このGM3よりａ-シリーズ（GM3、GM2、GM1、GD1aおよびGT1a）、ｂ-シリーズ（GD3、GD2、GD1b、GT1bおよびGQ1b）およびｃ-シリーズ（GT3、GT2、GT1c、GQ1cおよびGP1c）のガングリオシドが生成される。この図から、これらのガングリオシド分子群の生成がGM3合成酵素に依存していることが理解される。
本発明において、ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤はGM3に対する抗体によって特異的にGM3の機能を阻害してもよい。このような抗体としては、GM3に対して特異性を有する公知のモノクローナル抗体を挙げることができる（Kotani, M., et al.,:Biochem. Biophys. Acta，1117，97-103（1992））。このような抗体は、特定の実施態様において、ヘルパーＴ細胞における細胞膜においてGM3の作用を阻害し得る。本発明の文脈において、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体フラグメント（例えば、Fab、およびF(ab')2、Fv可変領域、または相補性決定領域）を包含することが理解される。抗体は、10-7Ｍ以上、好ましくは10-8Ｍ以上のＫaで結合するならば、GM3またはGM3合成酵素に対して特異的であることが理解される。モノクローナル抗体のアフィニティーは、当業者により容易に決定され得る（Scatchard，Ann．N.Y．Acad．Sci．51:660-672，1949を参照のこと）。
本発明において、ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤は、GM3の生合成を抑制する化合物であってもよい。本明細書中のGM3合成酵素（SAT-I）は、配列番号：２若しくは４のアミノ酸配列、またはそれらの配列に１〜数個（１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２または１個）のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列を含有するタンパク質のことをいう。GM3の生合成について、図１に示したように、セラミド（Cer）にグルコシルセラミド合成酵素が作用してグルコシルセラミド（GlcCer）が合成され，次にラクトシルセラミド合成酵素によってラクトシルセラミド（LacCer）生成する。GM3合成酵素はこのLacCerを基質として認識し，GM3を合成する。すなわち，グルコシルセラミド合成酵素，ラクトシルセラミド合成酵素およびGM3合成酵素の基質アナログによる酵素反応の阻害や，これらの酵素に結合してGM3量を減少できるものが挙げられる。本発明のGM3合成酵素阻害剤としては、グルコシルセラミド生合成阻害剤D-PDMPおよびその類縁体（Inokuchi, J., and Radin, N. Preparation of active isomer of 1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol. J. Lipid Res. 28, 565-571, 1987; Radin NS., et al. Metabolic effects of inhiboting glucosylceramide synthesis with PDMP and other substances. Adv. Lipid. Res. 26, 183-213, 1993; Lee. L., et al. Improved inhibitors of glucosylceramide synthase., J. Biol. Chem. 274, 14662-14669, 1999; Jimbo M., et al. Development of a New Inhibitor of Glucosylceramide Synthase. J. Biochem. 127, 485-491, 2000）や，別の基本骨格を有するAMP-DNM (N-(5-adamantane-1-yl-methoxy)-pentyl-1-deoxynojirimycin, Pharmacological Inhibition of Glucosylceramide Synthase Enhances Insulin Sensitivity. Diabetes 56, 1341-1349, 2007)が挙げられる。
本発明において、ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤は、GM3合成酵素の発現を阻害する物質であり得る。本明細書中のGM3合成酵素（SAT-I）のcDNAは、例えば配列番号：１又は３に示される。このようなGM3合成酵素の発現を阻害する物質としては、アンチセンス核酸、リボザイム、RNAi効果を有するdsRNA等が挙げられる。
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」は、「ポリヌクレオチド」、「遺伝子」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
本発明に係る核酸は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
本明細書における「GM3合成酵素の発現を阻害する物質」には、GM3合成酵素遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、DNAの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
「GM3合成酵素の発現を阻害する物質」の一つの態様は、GM3合成酵素遺伝子と相補的なアンチセンス鎖をコードする核酸である。アンチセンス技術は、特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法として公知であり、種々の文献に記載されている（例えば、平島および井上: 新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現 （日本生化学会編, 東京化学同人） pp.319-347, 1993などを参照）。アンチセンス核酸は、例えば、配列番号：１または３に記載のcDNAの配列情報を基にホスホロチオネート法（Stein, Nucleic Acids Res., 16: 3209-3221, 1988）などにより調製することが可能である。調製された核酸は、公知の方法で、直接的に細胞に適用される形態を利用でき、また公知の発現系を備えたベクターに組み込まれて適切に発現される形態で所望の細胞を形質転換できる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換する細胞が持つ内因性遺伝子の転写産物と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上（例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上）の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンス核酸の長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンス核酸の長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。
本発明において、内因性のGM3合成酵素遺伝子の発現の抑制は、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいい、ターゲットとするDNAの転写産物を切断することにより、その遺伝子の機能を阻害する。リボザイムの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、FEBS Lett. 228: 228, 1988； FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875, 1991; Nucl. Acids Res. 19: 5125, 1991; Biochem Biophys Res Commun 186: 1271, 1992など参照）。また、「DNAの発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、「共抑制」によって、ターゲットとなるDNAの機能を阻害するヌクレオチドをいう。
さらに、本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子で所望の細胞を形質転換することによっても達成することができる。ドミナントネガティブの形質を有する遺伝子とは、該遺伝子を発現させることによって、所望の細胞が本来持つ内在性の野生型遺伝子の活性を消失もしくは低下させる機能を有する遺伝子のことをいう。
GM3合成酵素遺伝子の発現を抑制するために用いる核酸の他の一つの態様は、DNAの発現をRNAi効果により抑制するRNAである。「RNAi」とは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNAを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ここで用いられるＲＮＡとしては、例えば、21〜25塩基長のRNA干渉を生ずる二重鎖RNA、例えば、dsRNA (double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)又はshRNA(short hairpin RNA)が挙げられる。このようなＲＮＡは、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記二重鎖RNAが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。このような二重鎖RNA(dsRNA、siRNA又はshRNA)の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表2002-516062号公報; 米国公開許第2002/086356A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.; Genesis, 26(4), 240-244, 2000 April； Nature, 407:6802, 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev., Vol.16, (8), 948-958, 2002 Apr.15; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99(8), 5515-5520, 2002 Apr. 16; Science, 296(5567), 550-553, 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99:9, 6047-6052, 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol.20 (5), 497-500, 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20(5), 500-505, 2002 May; Nucleic Acids Res., 30:10, e46,2002 May 15等参照）。
本発明において、免疫抑制活性、抗喘息活性及び／又は抗アレルギー活性を有する医薬組成物は、ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制作用を有する物質を含有し、自己免疫疾患、喘息、アレルギー、感染症、腫瘍、臓器などの移植拒絶（腎移植，心移植，骨髄移植など）反応などの治療又は予防に用いることができる。本発明のヘルパーＴ細胞選択的活性抑制作用を有する医薬組成物は、好ましくは、臓器などの移植拒絶反応，自己免疫疾患，喘息，感染症，アレルギー，腫瘍，より好ましくは自己免疫疾患、喘息、感染症，アレルギーなどの治療又は予防に用いられ、特に好ましくは、喘息及び／又はアレルギー疾患の治療又は予防に用いられる。
本発明の医薬組成物を使用する場合、例えば、経口、静脈、口腔粘膜、直腸、膣、経皮、鼻腔経由または吸入経由などですることができるが、経口的に投与するのが好ましい。本発明の医薬組成物の有効成分は単独で、あるいは組み合わせて配合されても良いが、これに製薬学的に許容しうる担体あるいは製剤用添加物を配合して製剤の形態で提供することもできる。この場合、本発明の有効成分は、例えば、製剤中、０．１〜９９．９重量％含有することができる。
製薬学的に許容しうる担体あるいは添加剤としては、例えば賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、溶解剤、溶解補助剤、等張化剤、ｐH調整剤、安定化剤等を用いることが出来る。
経口投与に適する製剤の例としては、例えば散剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、液剤またはシロップ剤等を挙げることが出来る。経口投与の場合、微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジカリウム、グリシンのような種々の賦形剤を、澱粉、好適にはとうもろこし、じゃがいもまたはタピオカの澱粉、およびアルギン酸やある種のケイ酸複塩のような種々の崩壊剤、およびポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼラチン、アラビアゴムのような顆粒形成結合剤と共に使用することができる。また、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の滑沢剤も錠剤形成に非常に有効であることが多い。同種の固体組成物をゼラチンカプセルに充填して使用することもできる。これに関連して好適な物質としてラクトースまたは乳糖の他、高分子量のポリエチレングリコールを挙げることができる。経口投与用として水性懸濁液および／またはエリキシルにしたい場合、活性成分を各種の甘味料または香味料、着色料または染料と併用する他、必要であれば乳化剤および／または懸濁化剤も併用し、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等、およびそれらを組み合わせた希釈剤と共に使用することができる。
非経口投与に適する製剤としては、例えば注射剤、坐剤等を挙げることが出来る。非経口投与の場合、本発明の有効成分をゴマ油または落花生油のいずれかに溶解するか、あるいはプロピレングリコール水溶液に溶解した溶液を使用することができる。水溶液は必要に応じて適宜に緩衝し（好適にはｐＨ８以上）、液体希釈剤をまず等張にする必要がある。このような水溶液は静脈内注射に適し、油性溶液は関節内注射、筋肉注射および皮下注射に適する。これらすべての溶液を無菌状態で製造するには、当業者に周知の標準的な製薬技術で容易に達成することができる。さらに、本発明の有効成分は皮膚など局所的に投与することも可能である。この場合は標準的な医薬慣行によりクリーム、ゼリー、ペースト、軟膏の形で局所投与するのが望ましい。
本発明の医薬組成物の投与量は特に限定されず、疾患の種類、患者の年齢や症状、投与経路、治療の目的、併用薬剤の有無等の種々の条件に応じて適切な投与量を選択することが可能である。本発明の医薬組成物の投与量は、例えば、成人（例えば、体重６０ｋｇ）１日当たり1〜5000mg、好ましくは10〜1000mgである。これらの１日投与量は２回から４回に分けて投与されても良い。
２．本発明のスクリーニング方法
本発明はさらに、ヘルパーＴ細胞の選択的活性抑制能を測定する工程を含む、ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤、すなわち免疫抑制活性、抗喘息作用及び／又は抗アレルギー作用を示す物質のスクリーニング方法を提供する。このようなスクリーニング方法としては、インビトロ及び／又はインビボで実施する方法が挙げられる。
本発明はさらに、ヘルパーＴ細胞の選択的活性抑制能を測定する工程を含む、ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤、すなわち免疫抑制活性、抗喘息作用及び／又は抗アレルギー作用を示す物質のスクリーニング方法を提供する。このようなスクリーニング方法としては、インビトロ及び／又はインビボで実施する方法が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法としては、インビトロにおいて被験物質をヘルパーＴ細胞に接触させ、ヘルパーＴ細胞における選択的な細胞増殖を測定する方法が挙げられる。被験物質としては、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられる。ヘルパーＴ細胞は、生体より単離された細胞であっても、株化された細胞であってもよい。ヘルパーＴ細胞の増殖の測定については、直接測定する方法としてヘモサイトメーターを使用して目視により計測する方法、コールターカウンター、フローサイトメーターなどの機器を使用する方法が挙げられる。間接的に測定する方法としては、XTTアッセイキットなどの市販の試薬・キット（例えば、R & D systems MN USA社製のキット）を使用する方法が挙げられる。また、必要に応じて死細胞を除外するための公知の方法（トリパンブルー染色など）を併用することも可能である。このようなスクリーニング方法において、例えば、前述の免疫学的プロトコール 中内 啓光 ／編 羊土社）に記載された方法によって測定される、刺激時のヘルパーＴ細胞の増殖抑制活性は、１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは、８０％以上であり、対照である同条件下のキラーＴ細胞の増殖抑制活性は、２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下である。
本発明のスクリーニング方法としては、インビトロにおいて被験物質をヘルパーＴ細胞に接触させ、ヘルパーＴ細胞における選択的なスフィンゴ糖脂質の産生量を測定する方法が挙げられる。この測定されるスフィンゴ糖脂質としては、好ましくはガングリオシドであり、さらに好ましくは、GM3である。糖脂質の精製や定量的検出については公知の方法が挙げられ、例えば、Macher BA and Klock JC (J. Biol. Chem. 255, 2092-2096, 1980)やLedeen et al. (J. Neurochem. 21, 829-839, 1973)の方法を参照できる。また例えば、GM3などのガングリオシドに特異的に作用する抗体を使用する定量的検出も可能である。このようなスクリーニング方法において、例えば、前述の免疫学的プロトコール 中内 啓光 ／編 羊土社に記載された方法によって測定される、刺激時のヘルパーＴ細胞におけるGM3産生の抑制は、１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは、８０％以上である。
本発明のスクリーニング方法としては、インビトロにおいてヘルパーＴ細胞と被験物質とを接触させ、ヘルパーＴ細胞におけるガングリオシド組成を調べるアッセイ方法が挙げられる。具体的には、GM3、GM2、GM1、GD1aおよびGT1a（a-シリーズ）、GD3、GD2、GD1b、GT1bおよびGQ1b（ｂ-シリーズ）、ならびにGT3、GT2、GT1c、GQ1cおよびGP1c（ｃ-シリーズ）からなる群より選択される少なくとも１つのガングリオシドを、有意に低下させる被験物質を選択する方法である。本明細書中、「有意に低減させる」とは、対照と比較して少なくとも１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上、９０％以上の低下をいう。
本発明のスクリーニング方法としては、インビボにおいて被験物質をヘルパーＴ細胞に接触させ、ヘルパーＴ細胞における選択的なGM3合成酵素の発現量を測定する方法が挙げられる。GM3合成酵素の発現量を測定する方法として、GM3合成酵素の配列を利用したハイブリダイゼーションを介する方法が挙げられ、例えば、ノーザンブロット、担体上に固定化されたプローブを利用する方法、遺伝子チップを用いた方法、定量的PCRなどが挙げられる。このようなスクリーニング方法において、例えば、前述の免疫学的プロトコール 中内 啓光 ／編 羊土社 に記載された方法によって測定される、刺激時のヘルパーＴ細胞におけるGM3合成酵素発現の抑制は、１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは、８０％以上、９０％以上である。
本明細のスクリーニング方法における被験物質として、GM3合成酵素の発現を特異的に阻害するポリヌクレオチドが挙げられる。このようなGM3合成酵素発現阻害ポリヌクレオチドの形態としては、前述のアンチセンス核酸、リボザイム、二本鎖RNAなどの形態が挙げられる。これらのGM3合成酵素発現阻害ポリヌクレオチドは、公知の方法によって作製できる。さらにこれら核酸は、種々の化学修飾を受けてもよい。
本発明のスクリーニング方法としてはまた、GM3合成酵素のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を繋いだ、遺伝子組み換え動物由来の細胞または遺伝子組み換え細胞を用いて、インビボにおいて被験物質をその細胞に接触させ、その細胞におけるレポーター遺伝子の発現量を測定する方法が挙げられる。この方法において使用される遺伝子組み換え細胞としては種々の細胞を用いることができるが、好ましくはＴ細胞、さらに好ましくはヘルパーＴ細胞である。GM3合成酵素遺伝子の5’上流の遺伝子配列は、Kim J-W., et al., Gene 273, 163-171, 2001に記載され、そのプロモーターについては、Kim S-W., et al., Biochim. Biophys. Acta 1578, 84-89, 2002.; Choi H-J., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 313, 142-147, 2004に記載されている。具体的には、例えば転写因子AP4、MZF1、SP1、ATF/CREB、NFY、IK2およびLYF1の推定結合部位が見出されており、またPMA誘導性プロモーターとして機能するCREBが挙げられている。使用されるレポーター遺伝子がコードするタンパク質としては、好ましくはホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなど、種々の公知のものが挙げられる。これらレポータータンパク質は、公知の検出方法またはキットを用いて検出できる。このようなスクリーニング方法において、例えば、被験物質による刺激時のレポータータンパク質発現の抑制は、１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは４０％以上、６０％以上、さらに好ましくは８０％以上、９０％以上である。
本発明のスクリーニング方法において選択される被験物質のヘルパーＴ細胞選択性については、種々の公知のＴ細胞受容体刺激、例えば、抗CD3抗体と抗CD28抗体との組合せ、スーパー抗原、またはアロ抗原（同種異系抗原）の存在下でのヘルパーＴ細胞の細胞増殖によって確認できる。対照としてのＴ細胞受容体を介しない刺激としては、例えばIonomycinとPMAとの組合せが挙げられ、この刺激によってヘルパーＴ細胞もキラーＴ細胞も増殖できる。免疫学的プロトコール 中内 啓光 ／編 羊土社などを参照のこと。
本発明のスクリーニング方法はさらに、ヘルパーＴ細胞の細胞増殖活性を有することが確認された被験物質を、免疫疾患、喘息及び／又はアレルギー反応を示す非ヒト動物に投与する工程を含むことができる。この際、被験物質は、生体内のヘルパーＴ細胞に特異的に作用するように修飾すること、またはヘルパーＴ細胞に特異的な送達系を利用することなど、公知の改変を付加することができる。
あるいは、本発明のスクリーニング方法は、例えばヘルパーＴ細胞によるサイトカイン産生量によって検出可能である。ヘルパーＴ産生するサイトカインとしては、Ｂ細胞を活性化するＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γなど、マクロファージを活性化するＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−βなど、好酸球を活性化するＩＬ−３、ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦなど、マスト細胞を活性化するＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γなどが挙げられる。これらのサイトカインを検出する方法として、これらサイトカイン依存性細胞の増殖を測定する方法、抗体産生などの生理活性を確認する方法、各々のサイトカインに対する抗体を用いる方法などが挙げられるが、これらに限定されない。このようなスクリーニング方法において、例えば、前述の免疫学的プロトコール 中内 啓光 ／編 羊土社に記載された方法によって測定される、刺激時におけるヘルパーＴ細胞による特定のサイトカイン産生の低減は、１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上、９０％以上であり、対照である同条件下のキラー細胞における特定のサイトカイン産生の抑制は、２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下である。
上記の非ヒト動物は、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウマなど、医薬品の試験において一般に利用される動物が挙げられる。好ましくはサル、チンパンジー、ラット、マウスであり、より好ましくはマウスまたはラットである。
本発明のスクリーニング方法はさらに、例えば、in vivoにおいて、炎症性部位などにおけるマクロファージ、好酸球、好中球、リンパ球、マスト細胞などの浸潤細胞数を測定する工程を含むことができる。すなわち、例えば、炎症性部位を有する被験体に対して被験物質を投与するときに炎症性部位におけるマクロファージ、好酸球、好中球、リンパ球、マスト細胞などの全て又はいずれか１つ以上が有意に低減する場合、該被験物質は治療上有効であると推定できる。本明細書中、「有意に低減する」とは、対照と比較して少なくとも１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上、９０％以上、９５％以上の低下をいう。
本発明のスクリーニング方法はさらにまた、例えば、in vivoにおいて、アレルギー応答時における血清中のＩｇＥ濃度を測定する工程を含むことができる。例えば、炎症性部位を有する被験体に対して被験物質を投与するときに、その被験体の血中ＩｇＥ濃度が有意に低減する場合、該被験物質は治療上有効であると推定できる。
さらに本発明は、ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤の有効量を患者に投与することによりヘルパーＴ細胞の免疫機能を選択的に制御する、免疫疾患、喘息及び／又はアレルギーの治療方法を提供する。また、ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤としては、上記の医薬組成物またはスクリーニング方法によって確認された被験物質が挙げられる。
本発明の治療方法において、ヘルパーＴ細胞選択的活性抑制剤は、上述のとおり、ヘルパーＴ細胞の増殖を選択的に抑制する物質、ヘルパーＴ細胞に発現するスフィンゴ糖脂質の産生量を抑制する物質、ヘルパーＴ細胞に発現するガングリオシドの産生量を抑制する物質、ヘルパーＴ細胞に発現するGM3の産生量を抑制する物質、GM3合成酵素阻害剤、GM3合成酵素の発現を阻害する物質などが挙げられる。これら医薬組成物などを投与する場合、その投与量は症状、投与対象の年令、性別などを考慮して個々の場合に応じて適宜調節できる。投与量および投与回数などについては、被験体の年齢、病歴、現在使用している薬剤などを医師が考慮した上で、適宜調整され得る。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であり、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
１．概要
ガングリオシドのin vivoにおける免疫機能における役割を解析するために、卵白アルブミン（OVA）に対する喘息・アレルギー反応モデルを用いて、GM3合成酵素遺伝子欠損マウス（SAT-I KOマウス）の喘息・アレルギー反応を検討した。その結果、アレルギー性免疫応答および気道炎症の惹起にはGM3および関連ガングリオシドの関与が証明され、ガングリオシドはヘルパーT細胞の機能に必須であることが強く示唆された。
ガングリオシドのin vivoにおける免疫機能における役割を解析するために、卵白アルブミン（OVA）に対する喘息・アレルギー反応モデルを用いて、GM3合成酵素遺伝子欠損マウス（SAT-I KOマウス）の喘息・アレルギー反応を検討した。その結果、アレルギー性免疫応答および気道炎症の惹起にはGM3および関連ガングリオシドの関与が証明され、ガングリオシドはヘルパーT細胞の機能に必須であることが強く示唆された。
そこで、Ｔ細胞サブセットの免疫機能におけるガングリオシドの役割を実証するために、SAT-I KOマウスを用いてヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞のTCR依存的な活性化を野生型マウス（コントロールマウス）と比較検討した。尚、本SAT-I KOマウスはａ-シリーズ（GM3、GM2、GM1、GD1aおよびGT1a）、ｂ-シリーズ（GD3、GD2、GD1b、GT1bおよびGQ1b）およびｃ-シリーズ（GT3、GT2、GT1c、GQ1cおよびGP1c）のガングリオシドを完全に欠損している（図１を参照）。その結果、SAT-I KOマウスではヘルパーＴ細胞の機能が選択的に抑制されており、キラーＴ細胞の機能は正常であることが判明した。次に、SAT-I KOマウスのＴ細胞に対して欠如したガングリオシドを外来性に補充する、あるいはSAT-I遺伝子を再導入することによりＴ細胞の機能が回復するか否か検討した。
２．SAT-I KOマウスの作製について
SAT-I KOマウスの作製に用いたターゲティングベクターの模式図およびＫＯマウスにおける遺伝子欠損の確認をそれぞれ図２Ａおよび図２Ｂに示す。図２Ａの一番上にtargetting vector、2番目に野生型の遺伝子、３番目に変異体の遺伝子を示す。また、図２Ｂでは、PCRによるSAT-I ジェノタイプの決定を示す。野生型のSAT-I遺伝子アレル（エキソン２）の同定には、5’-GGAATCCATCCCTTTTCTCACAGAG-3（配列番号：５）と 5’-TGAACTCACTTGGCATTGCTGG-3’（配列番号：６）をプライマーとして用いた。SAT-I ノックアウトの確認には、挿入されたネオマイシン耐性遺伝子を、5’-GGAATCCATCCCTTTTCTCACAGAG-3’（配列番号：７） と 5’-TGAACTCACTTGGCATTGCTGG-3’（配列番号：８）のプライマーをもちいた。図２ (c)において、脳ガングリオシドのTLC分析の結果を示す。野生型マウス(+/+)およびヘテロマウス（+/-）では、GM1, GD1a, GD1b, GT1bなどが発現していたが、ノックアウトマウス（-/-）では、これらが全て消失し、代償的にGM1bおよびGD1aが発現していた（図１を参照）。
SAT-I KOマウスの作製に用いたターゲティングベクターの模式図およびＫＯマウスにおける遺伝子欠損の確認をそれぞれ図２Ａおよび図２Ｂに示す。図２Ａの一番上にtargetting vector、2番目に野生型の遺伝子、３番目に変異体の遺伝子を示す。また、図２Ｂでは、PCRによるSAT-I ジェノタイプの決定を示す。野生型のSAT-I遺伝子アレル（エキソン２）の同定には、5’-GGAATCCATCCCTTTTCTCACAGAG-3（配列番号：５）と 5’-TGAACTCACTTGGCATTGCTGG-3’（配列番号：６）をプライマーとして用いた。SAT-I ノックアウトの確認には、挿入されたネオマイシン耐性遺伝子を、5’-GGAATCCATCCCTTTTCTCACAGAG-3’（配列番号：７） と 5’-TGAACTCACTTGGCATTGCTGG-3’（配列番号：８）のプライマーをもちいた。図２ (c)において、脳ガングリオシドのTLC分析の結果を示す。野生型マウス(+/+)およびヘテロマウス（+/-）では、GM1, GD1a, GD1b, GT1bなどが発現していたが、ノックアウトマウス（-/-）では、これらが全て消失し、代償的にGM1bおよびGD1aが発現していた（図１を参照）。
３．SAT-I KOマウスのアレルギー応答について
SAT-I KOマウスにおける、卵白アルブミン（OVA）感作後のOVA吸入による喘息・アレル
ギー反応を検証した。コントロール（野生型）マウス（+/+）およびSAT-I KOマウス（-/-）に腹腔内投与にてOVAで感作し、12日後にOVAを吸入させることによって喘息・アレルギー反応を惹起させた。喘息・アレルギー反応の評価は、抗原吸入後５日目に肺洗浄液を採取してそこに含まれる炎症細胞数を計測することにより行った（図３）。その結果、SAT-I KOマウスでは、気道への炎症細胞数がコントロールマウスと比較して約50％以下に減少しており、なかでもリンパ球および好酸球の浸潤が約30％までに減少していた（*P<0.05）。さらに抗原吸入後５日目において、コントロール（野生型）マウス（+/+）およびSAT-I KOマウス（-/-）の気道粘膜をPAS染色により染色した。染色の結果、SAT-I KOマウスの気道粘膜は、コントロールマウスよりも明確に減少していた（図４）。以上より、SAT-I KOマウスでは喘息・アレルギー反応に対して抵抗性であることが判明した。アレルギー局所への好酸球の浸潤はヘルパーＴ細胞の活性化に依存することから（喘息予防・管理ガイドライン 2006; 日本アレルギー学会監修を参照のこと）、SAT-I KOマウスではin vivoにおいてヘルパーＴ細胞の活性が欠如していることが考えられる。
SAT-I KOマウスにおける、卵白アルブミン（OVA）感作後のOVA吸入による喘息・アレル
ギー反応を検証した。コントロール（野生型）マウス（+/+）およびSAT-I KOマウス（-/-）に腹腔内投与にてOVAで感作し、12日後にOVAを吸入させることによって喘息・アレルギー反応を惹起させた。喘息・アレルギー反応の評価は、抗原吸入後５日目に肺洗浄液を採取してそこに含まれる炎症細胞数を計測することにより行った（図３）。その結果、SAT-I KOマウスでは、気道への炎症細胞数がコントロールマウスと比較して約50％以下に減少しており、なかでもリンパ球および好酸球の浸潤が約30％までに減少していた（*P<0.05）。さらに抗原吸入後５日目において、コントロール（野生型）マウス（+/+）およびSAT-I KOマウス（-/-）の気道粘膜をPAS染色により染色した。染色の結果、SAT-I KOマウスの気道粘膜は、コントロールマウスよりも明確に減少していた（図４）。以上より、SAT-I KOマウスでは喘息・アレルギー反応に対して抵抗性であることが判明した。アレルギー局所への好酸球の浸潤はヘルパーＴ細胞の活性化に依存することから（喘息予防・管理ガイドライン 2006; 日本アレルギー学会監修を参照のこと）、SAT-I KOマウスではin vivoにおいてヘルパーＴ細胞の活性が欠如していることが考えられる。
４．SAT-I KOマウスのIgE産生能について
そこで、上記の方法により作成したOVA感作後のOVA吸入による喘息・アレルギーモデルにおける血清中のOVA特異的IgE抗体をELISAにて測定した。血清は、図３に示した喘息・アレルギー反応の評価時に同じ個体から採取した。その結果、SAT-I KOマウスでは、OVA特異的IgE抗体量がコントロールマウスに比較して約50%以下まで低下していた（**P<0.01）（図５）。このことから、SAT-I KOマウスにおける喘息・アレルギー反応の低下（図３）と対応して抗原特異的IgE抗体産生の低下が見られた。このことは、抗体産生におけるIgEクラススイッチの機能低下も考えられる。
そこで、上記の方法により作成したOVA感作後のOVA吸入による喘息・アレルギーモデルにおける血清中のOVA特異的IgE抗体をELISAにて測定した。血清は、図３に示した喘息・アレルギー反応の評価時に同じ個体から採取した。その結果、SAT-I KOマウスでは、OVA特異的IgE抗体量がコントロールマウスに比較して約50%以下まで低下していた（**P<0.01）（図５）。このことから、SAT-I KOマウスにおける喘息・アレルギー反応の低下（図３）と対応して抗原特異的IgE抗体産生の低下が見られた。このことは、抗体産生におけるIgEクラススイッチの機能低下も考えられる。
５．SAT-I KOマウスのIL-4/IL-5産生能について
喘息・アレルギー反応の惹起や抗原特異的IgE抗体の産生は、活性化ヘルパーＴ細胞から産生されるIL-4、IL-5などのいわゆる２型ヘルパーＴサイトカインに依存することから（アレルギー疾患 診断・治療ガイドライン 2007; 日本アレルギー学会作成を参照のこと）、上記と同様の方法により作成したOVA感作後のOVA吸入による喘息・アレルギーモデルにおける血清中のIL-4およびIL-5濃度をELISAにて測定した。血清は、図３に示した喘息・アレルギー反応の評価時に同じ個体から抗原吸入後５日目に採取した。その結果、SAT-I KOマウスでは、OVA特異的な血清中IL-4濃度およびIL-5濃度が、それぞれコントロールマウスに比較してそれぞれ約10％、約30％まで低下していた（*P<0.05）（図６）。一方、IFN-γは有意な差が見られなかった。この結果からも、SAT-I KOマウスにおける喘息・アレルギー反応の低下（図３）と対応して、抗原特異的なIL-4産生低下およびIL-5産生低下が見られた。
喘息・アレルギー反応の惹起や抗原特異的IgE抗体の産生は、活性化ヘルパーＴ細胞から産生されるIL-4、IL-5などのいわゆる２型ヘルパーＴサイトカインに依存することから（アレルギー疾患 診断・治療ガイドライン 2007; 日本アレルギー学会作成を参照のこと）、上記と同様の方法により作成したOVA感作後のOVA吸入による喘息・アレルギーモデルにおける血清中のIL-4およびIL-5濃度をELISAにて測定した。血清は、図３に示した喘息・アレルギー反応の評価時に同じ個体から抗原吸入後５日目に採取した。その結果、SAT-I KOマウスでは、OVA特異的な血清中IL-4濃度およびIL-5濃度が、それぞれコントロールマウスに比較してそれぞれ約10％、約30％まで低下していた（*P<0.05）（図６）。一方、IFN-γは有意な差が見られなかった。この結果からも、SAT-I KOマウスにおける喘息・アレルギー反応の低下（図３）と対応して、抗原特異的なIL-4産生低下およびIL-5産生低下が見られた。
６．SAT-I KOマウスのＴ細胞増殖について
６．１．SAT-I KOマウス由来Ｔ細胞のTCR媒介性増殖応答について
次に、喘息・アレルギーモデルにおいて、SAT-I KOマウスは気道炎症反応、ならびに血清IgE量、IL-4量およびIL-5量が低下する機序の一連の検討を行った。Ｔ細胞抗原受容体（TCR）に対する抗体にて刺激したときの細胞増殖応答を測定したコントロールおよびSAT-I KOのＴ細胞をCD4陽性とCD8陽性Ｔ細胞とに分離した後、各々の細胞に無刺激、抗CD3抗体+抗CD28抗体刺激あるいはPMA+Ionomycin刺激を行い、72時間後、XTTアッセイキット（R & D systems MN USA社製、カタログ番号4891-025-K）により細胞増殖を検出した。抗CD3抗体+抗CD28抗体によりTCRと共刺激分子CD28に刺激を与えることが公知である（免疫学的プロトコール 中内 啓光 ／編 羊土社）。また、ホルボールエステルでありプロテインキナーゼCの活性化剤であるPMA（例えば、Sigama-Aldrich Japan 社、カタログ番号P1585より入手可能である）、およびカルシウムイオノフォアであり細胞内カルシウム濃度を上昇させる薬剤であるIonomycin（例えば、Sigama-Aldrich Japan 社、カタログ番号I0634より入手可能である）のこれら両者は、同時使用によってTCRをバイパスした刺激を細胞に与えて細胞を増殖させる強制的な活性化剤であることが公知である（Davis L., and Lipsky PE., Signals involved in T cell activation. II. Distinct roles of intact accessory cells, phorbol esters, and interleukin 1 in activation and cell cycle progression of resting T lymphocytes. J. Immunol.136, 3558-3596, 1986）。これらの結果、SAT-I KOマウスのCD4陽性Ｔ細胞はTCR依存的な増殖応答がコントロールと比較して約３０％に低下していた（図７左）。PMA+ionomycinの刺激ではコントロールと同程度の増殖応答を示したことから、SAT-I KOマウスにおいてTCR媒介性の細胞内情報伝達が欠損していることが分かる。一方、CD8陽性Ｔ細胞では、TCR媒介性の増殖応答はSAT-I KOマウスの方が強い傾向が認められた（図７右）。
６．１．SAT-I KOマウス由来Ｔ細胞のTCR媒介性増殖応答について
次に、喘息・アレルギーモデルにおいて、SAT-I KOマウスは気道炎症反応、ならびに血清IgE量、IL-4量およびIL-5量が低下する機序の一連の検討を行った。Ｔ細胞抗原受容体（TCR）に対する抗体にて刺激したときの細胞増殖応答を測定したコントロールおよびSAT-I KOのＴ細胞をCD4陽性とCD8陽性Ｔ細胞とに分離した後、各々の細胞に無刺激、抗CD3抗体+抗CD28抗体刺激あるいはPMA+Ionomycin刺激を行い、72時間後、XTTアッセイキット（R & D systems MN USA社製、カタログ番号4891-025-K）により細胞増殖を検出した。抗CD3抗体+抗CD28抗体によりTCRと共刺激分子CD28に刺激を与えることが公知である（免疫学的プロトコール 中内 啓光 ／編 羊土社）。また、ホルボールエステルでありプロテインキナーゼCの活性化剤であるPMA（例えば、Sigama-Aldrich Japan 社、カタログ番号P1585より入手可能である）、およびカルシウムイオノフォアであり細胞内カルシウム濃度を上昇させる薬剤であるIonomycin（例えば、Sigama-Aldrich Japan 社、カタログ番号I0634より入手可能である）のこれら両者は、同時使用によってTCRをバイパスした刺激を細胞に与えて細胞を増殖させる強制的な活性化剤であることが公知である（Davis L., and Lipsky PE., Signals involved in T cell activation. II. Distinct roles of intact accessory cells, phorbol esters, and interleukin 1 in activation and cell cycle progression of resting T lymphocytes. J. Immunol.136, 3558-3596, 1986）。これらの結果、SAT-I KOマウスのCD4陽性Ｔ細胞はTCR依存的な増殖応答がコントロールと比較して約３０％に低下していた（図７左）。PMA+ionomycinの刺激ではコントロールと同程度の増殖応答を示したことから、SAT-I KOマウスにおいてTCR媒介性の細胞内情報伝達が欠損していることが分かる。一方、CD8陽性Ｔ細胞では、TCR媒介性の増殖応答はSAT-I KOマウスの方が強い傾向が認められた（図７右）。
６．２．SAT-I KOマウス由来Ｔ細胞の抗原特異的細胞増殖について
野生型およびSAT-I KOマウスの足底にハプテンとしてトリニトロフェノール（TNP）結合させたOVA (TNP-OVA（200 μg）)を皮下注射にて免疫した。８日後、免疫マウスより脾臓を摘出しCD4+T細胞, CD8+T細胞をそれぞれ精製した。このCD4+T細胞, CD8+T細胞に対して抗原提示細胞＋OVA抗原にて72時間再刺激を行うことによって、in vitroにおける抗原特異的なT細胞の増殖反応を検討した（図８）。その結果、SAT-I KOマウス由来のCD4+T細胞でのみ、抗原特異的反応が欠如していることが明らかとなった。
野生型およびSAT-I KOマウスの足底にハプテンとしてトリニトロフェノール（TNP）結合させたOVA (TNP-OVA（200 μg）)を皮下注射にて免疫した。８日後、免疫マウスより脾臓を摘出しCD4+T細胞, CD8+T細胞をそれぞれ精製した。このCD4+T細胞, CD8+T細胞に対して抗原提示細胞＋OVA抗原にて72時間再刺激を行うことによって、in vitroにおける抗原特異的なT細胞の増殖反応を検討した（図８）。その結果、SAT-I KOマウス由来のCD4+T細胞でのみ、抗原特異的反応が欠如していることが明らかとなった。
６．３．SAT-I KOマウス由来Ｔ細胞のスーパー抗原特異的細胞増殖について
そこで、SAT-I KOマウスにおけるヘルパーT細胞の選択的機能低下がスーパー抗原によっても認められるか否かを検討した。スーパー抗原としてTCR Vb8に結合するSEB (streptococcul enterotoxin B)を用い、これを野生型およびSAT-I KOマウスの脾臓から精製したCD4+T細胞およびCD8+T細胞にそれぞれ添加した後、72時間後のT細胞の増殖反応を検討した（図９）。その結果、SAT-I KOマウス由来のCD4+T細胞でのみ、スーパー抗原特異的反応が欠如していることが明らかとった。
そこで、SAT-I KOマウスにおけるヘルパーT細胞の選択的機能低下がスーパー抗原によっても認められるか否かを検討した。スーパー抗原としてTCR Vb8に結合するSEB (streptococcul enterotoxin B)を用い、これを野生型およびSAT-I KOマウスの脾臓から精製したCD4+T細胞およびCD8+T細胞にそれぞれ添加した後、72時間後のT細胞の増殖反応を検討した（図９）。その結果、SAT-I KOマウス由来のCD4+T細胞でのみ、スーパー抗原特異的反応が欠如していることが明らかとった。
６．４．SAT-I KOマウス由来Ｔ細胞のアロ抗原特異的細胞増殖について
次に、アロ抗原（同種異系抗原）に対するT細胞免疫応答を検討するため混合リンパ球試験（MLR: mixed lymphocyte reaction）を実施した（図１０）。Responder細胞として野生型およびSAT-I KOマウス(ともにC57BL/6系統)の脾臓から精製したCD4+T細胞およびCD8+T細胞を用い、Stimulator細胞としてBalb/c系統マウスの脾臓細胞を採取してマイトマイシン処理にて不活性化したものを準備した。Responder（3 x105個）とStimulator（6 x105個）を混合培養し、７２時間後の増殖反応およびサイトカイン産生を検定した。その結果、SAT-I KOマウス由来のCD4+T細胞でのみ、アロ抗原特異的反応が欠如していることが明らかとなった（図１０）。
次に、アロ抗原（同種異系抗原）に対するT細胞免疫応答を検討するため混合リンパ球試験（MLR: mixed lymphocyte reaction）を実施した（図１０）。Responder細胞として野生型およびSAT-I KOマウス(ともにC57BL/6系統)の脾臓から精製したCD4+T細胞およびCD8+T細胞を用い、Stimulator細胞としてBalb/c系統マウスの脾臓細胞を採取してマイトマイシン処理にて不活性化したものを準備した。Responder（3 x105個）とStimulator（6 x105個）を混合培養し、７２時間後の増殖反応およびサイトカイン産生を検定した。その結果、SAT-I KOマウス由来のCD4+T細胞でのみ、アロ抗原特異的反応が欠如していることが明らかとなった（図１０）。
６．５．結果
以上より、SAT-I KOマウスでは、ヘルパーＴ細胞の機能が選択的に低下していること、および対照的にキラーＴ細胞の免疫機能は正常であることを実証した。すなわち、ガングリオシドはＴ細胞サブセットのなかでヘルパーＴ細胞による免疫機能に対して不可欠な要素であることを示した。
以上より、SAT-I KOマウスでは、ヘルパーＴ細胞の機能が選択的に低下していること、および対照的にキラーＴ細胞の免疫機能は正常であることを実証した。すなわち、ガングリオシドはＴ細胞サブセットのなかでヘルパーＴ細胞による免疫機能に対して不可欠な要素であることを示した。
したがって、ヘルパーＴ細胞においてSAT-Iの発現を制御するか、またはガングリオシドの機能を制御することによって、ヘルパーＴ細胞の機能を抑制して好酸球及びリンパ球による浸潤を抑えることによって、過剰な免疫応答、喘息、アレルギー反応などに対する抵抗性を被験体に提供することが可能である。
７．SAT-I KOマウスのＴ細胞増殖機能の回復
７．１．ＧＭ３添加による回復
SAT-I KOマウスのヘルパーＴ細胞に対してそれが欠如するガングリオシドGM3を外来性に補充したときの細胞増殖応答を測定した。コントロールおよびSAT-I KOマウスのＴ細胞をCD4陽性とCD8陽性Ｔ細胞とに分離した後、各々の細胞に未処理(-)あるいはGM3処理(+)を1時間行い、続いて、図１と同じ方法で細胞を刺激して細胞増殖を解析した（図１１）。この結果、SAT-I KOマウスのCD4陽性Ｔ細胞におけるTCR媒介性の増殖応答の低下は、GM3の添加によって完全に回復した。
７．１．ＧＭ３添加による回復
SAT-I KOマウスのヘルパーＴ細胞に対してそれが欠如するガングリオシドGM3を外来性に補充したときの細胞増殖応答を測定した。コントロールおよびSAT-I KOマウスのＴ細胞をCD4陽性とCD8陽性Ｔ細胞とに分離した後、各々の細胞に未処理(-)あるいはGM3処理(+)を1時間行い、続いて、図１と同じ方法で細胞を刺激して細胞増殖を解析した（図１１）。この結果、SAT-I KOマウスのCD4陽性Ｔ細胞におけるTCR媒介性の増殖応答の低下は、GM3の添加によって完全に回復した。
７．１．SAT-I遺伝子の再導入による回復
図１２にSAT-I KOマウスのヘルパーおよびキラーＴ細胞にSAT-I遺伝子を再導入したときの細胞増殖応答を示す。コントロールおよびSAT-I遺伝子欠損マウスのＴ細胞をCD4陽性とCD8陽性Ｔ細胞とに分離した後、各々の細胞にアデノウイルスを介してSAT-I遺伝子あるいはLacZ遺伝子（実験コントロール）を導入あるいは未処理(-)した後、続いて、図１と同じ方法で細胞を刺激して細胞増殖を解析した（Miyake S. et al., Efficient generation of recombinant adenoviruses using adenovirus DNA-terminal protein complex and a cosmid bearing the full-length virus genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1320-1324, 1996）。その結果、 SAT-I KOマウスのCD4陽性Ｔ細胞におけるTCR媒介性の増殖応答の低下は、SAT-I遺伝子の再導入によってのみ完全に回復した。また、CD8陽性Ｔ細胞にSAT-I遺伝子を導入した場合には、全く変化は認められなかった。
図１２にSAT-I KOマウスのヘルパーおよびキラーＴ細胞にSAT-I遺伝子を再導入したときの細胞増殖応答を示す。コントロールおよびSAT-I遺伝子欠損マウスのＴ細胞をCD4陽性とCD8陽性Ｔ細胞とに分離した後、各々の細胞にアデノウイルスを介してSAT-I遺伝子あるいはLacZ遺伝子（実験コントロール）を導入あるいは未処理(-)した後、続いて、図１と同じ方法で細胞を刺激して細胞増殖を解析した（Miyake S. et al., Efficient generation of recombinant adenoviruses using adenovirus DNA-terminal protein complex and a cosmid bearing the full-length virus genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1320-1324, 1996）。その結果、 SAT-I KOマウスのCD4陽性Ｔ細胞におけるTCR媒介性の増殖応答の低下は、SAT-I遺伝子の再導入によってのみ完全に回復した。また、CD8陽性Ｔ細胞にSAT-I遺伝子を導入した場合には、全く変化は認められなかった。
７．３．結果
以上の結果より、SAT-I KOマウスでは、ヘルパーＴ細胞が選択的に機能不全に陥っており、SAT-I活性の遺伝子導入による回復またはSAT-I生成物であるGM3の補充によって、ヘルパーＴ細胞の抗原特異的細胞増殖が可能であった。したがって、これらヘルパー細胞特異的な機能不全が、SAT-IによるGM3合成活性単独の欠失によるものであることを確認した。
以上の結果より、SAT-I KOマウスでは、ヘルパーＴ細胞が選択的に機能不全に陥っており、SAT-I活性の遺伝子導入による回復またはSAT-I生成物であるGM3の補充によって、ヘルパーＴ細胞の抗原特異的細胞増殖が可能であった。したがって、これらヘルパー細胞特異的な機能不全が、SAT-IによるGM3合成活性単独の欠失によるものであることを確認した。
８．ヘルパーＴ細胞特異的な免疫応答抑制物質のスクリーニング系
８．１．目的
前述のように、SAT-I遺伝子ノックアウトマウスは、ａ-シリーズ、ｂ-シリーズおよびｃ-シリーズのガングリオシを完全に欠損している（図１）。その結果として、ヘルパーT細胞特異的にTCR媒介性増殖応答が低下し、種々の免疫応答の低下が認められた。現在のところ、このSAT-I合成酵素、またはGM3合成経路に着目してたヘルパーT細胞特異的な免疫抑制物質は報告されていない。そこで、本明細書中に記載されるようなSAT-I活性が欠失または低下した実験系を利用することにより、過剰な免疫応答、喘息、アレルギー反応などに対して有効な薬理物質の同定できる、以下のスクリーニング方法を構築した。
８．１．目的
前述のように、SAT-I遺伝子ノックアウトマウスは、ａ-シリーズ、ｂ-シリーズおよびｃ-シリーズのガングリオシを完全に欠損している（図１）。その結果として、ヘルパーT細胞特異的にTCR媒介性増殖応答が低下し、種々の免疫応答の低下が認められた。現在のところ、このSAT-I合成酵素、またはGM3合成経路に着目してたヘルパーT細胞特異的な免疫抑制物質は報告されていない。そこで、本明細書中に記載されるようなSAT-I活性が欠失または低下した実験系を利用することにより、過剰な免疫応答、喘息、アレルギー反応などに対して有効な薬理物質の同定できる、以下のスクリーニング方法を構築した。
８．２．主要な材料および原理
スフィンゴ糖脂質生合成阻害剤D-PDMP (D-threo-1-phenyl-2-decanoylamiono-3-morpholino-1-prppanol・HCl,製品名 D-threo-PDMP, メーカー：Matreya,Inc. カタログ番号：＃1756)、D-PPMP (D-threo-1-phenyl-2-hexadecanoylamiono-3-morpholino-1-prppanol・HCl, メーカー：Matreya, Inc. カタログ番号：#1865)、D-PBPP (D-threo-1-phenyl-2-benzyloxycarbonylamino-3-pyrrolidinoamino-1-prppanol・HCl: Jimbo et al., J. Biochem. 127 485-491, 2000)、D-threo-3',4'-Ethylenedioxy-P4 (D-threo-3', 4'-Ethylenedioxy 1-phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1-propanol, 文献名；Lee, L., et al. J Biol Chem. 274, 14662-14669, 1999)などの類縁化合物や別の基本骨格を有するAMP-DNM (N-(5-adamantane-1-yl-methoxy)-pentyl-1-deoxynojirimycin, Diabetes 56, 1341-1349, 2007)は、スフィンゴ糖脂質生合成の中でグルコシルセラミド（GlcCer）合成酵素を選択的に阻害し、すべてのガングリオシドの生成を抑制する（図１左上を参照のこと）。従って、D-PDMPなどのGlcCer合成酵素阻害剤で処理した場合、CD4陽性T細胞およびCD8陽性T細胞のどちらの機能も抑制することなる（Nagafuku,M., et al., J. Biol. Chem. 278, 51920-51927, 2003. ; Blank N. et al., Biochem. Pharmacol. 126-135, 2005）。そこで、CD4陽性T細胞の機能を選択に抑制する物質をスクリーニングできることを明確にするために、GlcCer合成酵素阻害剤で全T細胞を処理後、または処理と同時にGM3を培養液中に添加することで、CD4陽性T細胞の機能（増殖能）の回復を確認する。この時、GlcCer合成酵素阻害剤はCD8陽性T細胞の機能も抑制するが、GM3を加えてもCD8陽性T細胞の増殖能は回復しないことになる。
スフィンゴ糖脂質生合成阻害剤D-PDMP (D-threo-1-phenyl-2-decanoylamiono-3-morpholino-1-prppanol・HCl,製品名 D-threo-PDMP, メーカー：Matreya,Inc. カタログ番号：＃1756)、D-PPMP (D-threo-1-phenyl-2-hexadecanoylamiono-3-morpholino-1-prppanol・HCl, メーカー：Matreya, Inc. カタログ番号：#1865)、D-PBPP (D-threo-1-phenyl-2-benzyloxycarbonylamino-3-pyrrolidinoamino-1-prppanol・HCl: Jimbo et al., J. Biochem. 127 485-491, 2000)、D-threo-3',4'-Ethylenedioxy-P4 (D-threo-3', 4'-Ethylenedioxy 1-phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1-propanol, 文献名；Lee, L., et al. J Biol Chem. 274, 14662-14669, 1999)などの類縁化合物や別の基本骨格を有するAMP-DNM (N-(5-adamantane-1-yl-methoxy)-pentyl-1-deoxynojirimycin, Diabetes 56, 1341-1349, 2007)は、スフィンゴ糖脂質生合成の中でグルコシルセラミド（GlcCer）合成酵素を選択的に阻害し、すべてのガングリオシドの生成を抑制する（図１左上を参照のこと）。従って、D-PDMPなどのGlcCer合成酵素阻害剤で処理した場合、CD4陽性T細胞およびCD8陽性T細胞のどちらの機能も抑制することなる（Nagafuku,M., et al., J. Biol. Chem. 278, 51920-51927, 2003. ; Blank N. et al., Biochem. Pharmacol. 126-135, 2005）。そこで、CD4陽性T細胞の機能を選択に抑制する物質をスクリーニングできることを明確にするために、GlcCer合成酵素阻害剤で全T細胞を処理後、または処理と同時にGM3を培養液中に添加することで、CD4陽性T細胞の機能（増殖能）の回復を確認する。この時、GlcCer合成酵素阻害剤はCD8陽性T細胞の機能も抑制するが、GM3を加えてもCD8陽性T細胞の増殖能は回復しないことになる。
＜参考例１＞
スクリーニング系１（インビトロ系）の構築
実験手順
野生型マウスのリンパ節細胞よりCD4T陽性細胞を精製し、抗体96穴プレートに2x10^5個の細胞を播種し、無刺激、抗CD3抗体＋抗CD28抗体刺激あるいはPMA+ Ionomycin刺激を行う。刺激と同時にグルコシルセラミド（GlcCer）合成酵素阻害剤（例えば、D-PDMP（10μM））およびGM3（2μg/ml）について両方あるいは片方の添加あるいは両方無添加を行う。約72時間後、細胞の増殖応答をXTTアッセイにて評価する。この実験系において、糖脂質を枯渇した際、CD4T細胞の活性化に伴う細胞増殖が抑制されるが、GM3を共存させることで、D-PDMPによる増殖抑制効果が解除されることになるので、ヘルパーT細胞の活性を抑制する有効な化合物のスクリーニング法が確立される。
スクリーニング系１（インビトロ系）の構築
実験手順
野生型マウスのリンパ節細胞よりCD4T陽性細胞を精製し、抗体96穴プレートに2x10^5個の細胞を播種し、無刺激、抗CD3抗体＋抗CD28抗体刺激あるいはPMA+ Ionomycin刺激を行う。刺激と同時にグルコシルセラミド（GlcCer）合成酵素阻害剤（例えば、D-PDMP（10μM））およびGM3（2μg/ml）について両方あるいは片方の添加あるいは両方無添加を行う。約72時間後、細胞の増殖応答をXTTアッセイにて評価する。この実験系において、糖脂質を枯渇した際、CD4T細胞の活性化に伴う細胞増殖が抑制されるが、GM3を共存させることで、D-PDMPによる増殖抑制効果が解除されることになるので、ヘルパーT細胞の活性を抑制する有効な化合物のスクリーニング法が確立される。
＜参考例２＞
スクリーニング系２（インビボ系）の構築
実験手順
コントロール（野生型）マウス（+/+）およびSAT-I KOマウス（-/-）を腹腔内投与にてOVAで２回感作し、数日後にOVAを吸入させることによって喘息・アレルギー反応を惹起さる。グルコシルセラミド合成酵素阻害剤（例えば、D-PDMP）を5% Tween 80に10 mg/mlなどの濃度で溶解し、GM3を併用する場合のみCD4陽性Ｔ細胞が増殖するような条件で、例えば75 mg/kg を一日２回をOVAを吸入前から継続して６日間連続して腹腔内投与する。喘息・アレルギー反応の評価は、上記SAT-I KOマウスを用いて行ったように、肺洗浄液に含まれる炎症細胞数およびサイトカイン量の計測と肺組織の気道粘液（喀痰の主成分）染色、血清中の抗OVA特異的IgE量測定など、上記の種々の方法により行うことができる。
スクリーニング系２（インビボ系）の構築
実験手順
コントロール（野生型）マウス（+/+）およびSAT-I KOマウス（-/-）を腹腔内投与にてOVAで２回感作し、数日後にOVAを吸入させることによって喘息・アレルギー反応を惹起さる。グルコシルセラミド合成酵素阻害剤（例えば、D-PDMP）を5% Tween 80に10 mg/mlなどの濃度で溶解し、GM3を併用する場合のみCD4陽性Ｔ細胞が増殖するような条件で、例えば75 mg/kg を一日２回をOVAを吸入前から継続して６日間連続して腹腔内投与する。喘息・アレルギー反応の評価は、上記SAT-I KOマウスを用いて行ったように、肺洗浄液に含まれる炎症細胞数およびサイトカイン量の計測と肺組織の気道粘液（喀痰の主成分）染色、血清中の抗OVA特異的IgE量測定など、上記の種々の方法により行うことができる。
本発明は、ヘルパーＴ細胞の選択的な機能制御を可能にする今までにない画期的な発明である。この発明に基づいた、感染症、腫瘍、臓器移植拒絶、アレルギーなどを標的とした新規治療法の開発が期待できる。
Claims (5)
- 被験物質を、ヘルパーＴ細胞に接触させ、ヘルパーＴ細胞におけるGM3の産生量を測定する、免疫抑制作用、抗喘息作用及び／又は抗アレルギー作用を示す物質のスクリーニング方法。
- 被験物質を、ヘルパーＴ細胞に接触させ、ヘルパーＴ細胞におけるGM3合成酵素の発現量を測定する、免疫抑制作用、抗喘息作用及び／又は抗アレルギー作用を示す物質のスクリーニング方法。
- ヘルパーＴ細胞の細胞増殖活性を有することが確認された被験物質を、免疫疾患、喘息及び／又はアレルギー反応を示す非ヒト動物に投与する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
- 前記非ヒト動物がマウスである、請求項３に記載の方法。
- 前記非ヒト動物の炎症部位におけるマクロファージ、好中球、好酸球及び／又はリンパ球の浸潤細胞数を対照と比較する工程をさらに含む、請求項３または４に記載の方法。
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