JP4644829B2 - ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としての新規な化合物 - Google Patents

Description

本発明は、ヒストン脱アセチル化(deacetylase)活性を有する酵素の阻害剤としての化合物、それら化合物の調製方法、並びにヒストン及び／又はその他の分子の低アセチル化に関連した疾患の治療を目的とした、又は高アセチル化の誘導が有益である（例えば癌等の変質細胞の増殖阻害及び／又は分化誘導及び／又はアポトーシス誘導が得られる）場合の疾患の治療を目的としたそれら化合物の使用に関する。本発明の化合物はさらに、他の増殖性疾患の治療に有用であり、異常な遺伝子発現に関連した病状の治療又は予防に用いることができる。

クロマチンのリモデリングは、遺伝子の転写活性化に欠かせない段階である。転写蛋白質と鋳型ＤＮＡとが接触するには、ヌクレオソームのパッキング状態が大きく変化する必要がある。クロマチンリモデリングと遺伝子転写に影響を与える最も重要なメカニズムの一つに、アセチル化によるヒストン及び他の細胞蛋白質の翻訳後修飾とそれに続くクロマチン構造の変化がある（Davie, 1998, Curr Opin Genet Dev 8, 173-8；Kouzarides, 1999, Curr Opin Genet Dev 9, 40-8；Strahl及びAllis, 2000, Nature 403, 41-4）。ヒストンの高アセチル化が起こると、疎水性アセチル基が導入されＤＮＡに対する静電気引力の変化と立体障害が起き、ヒストンとＤＮＡとの相互作用が不安定になる。その結果個々のヌクレオソームが分離し、転写機構によるＤＮＡへの接触が可能となる。一方アセチル基が除去されると、ヒストンとＤＮＡ、そして隣接するヌクレオソームとがより緊密に結合し、転写抑制状態のクロマチン構造が保持される。アセチル化はヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）活性を有する一連の酵素によって調節されている。これに対し、アセチル基は特異的なヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）によって除去される。これらメカニズムが壊れると、転写の誤調節が起き腫瘍化が起こる可能性が出てくる。

また転写因子等の他の分子は、それら自身のアセチル化の状態に応じて活性及び安定性が変化する。例えばｐ５３は、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）関連の融合蛋白質ＰＭＬ−ＲＡＲにより脱アセチル化及び分解されて阻害され、その結果ＡＰＬ芽細胞はｐ５３による癌監視経路にかからないようになる。造血前駆細胞でＰＭＬ−ＲＡＲが発現すると、ｐ５３を媒介する転写活性が抑制され、遺伝毒性ストレス（Ｘ線、酸化）により誘導されるｐ５３依存性アポトーシスが起こらなくなる。しかしＨＤＡＣ阻害剤が存在するとｐ５３の機能は回復することから、ＰＭＬ−ＲＡＲによりＨＤＡＣがｐ５３にリクルートされる、というｐ５３阻害メカニズムがあると考えられる（Insingaら、2002、提出原稿）。従って、転写因子をアセチル化することがＨＤＡＣ阻害剤の抗腫瘍化活性に重要な役割を果たす。

核内ホルモン受容体は、遺伝子発現を正・負両方に制御することで発達と恒常性とを制御するリガンド依存性転写因子である。これらの制御メカニズムの欠陥が多くの疾病の原因となっており、癌の形成に重要な役割を担っている。Ｔ３Ｒ、ＲＡＲ及びＰＰＡＲ等の核内受容体の多くが、リガンドが存在しない場合にコリプレッサーＮ−ＣｏＲ及びＳＭＲＴと相互作用し、その結果転写が阻害されることがある。更にＮ−ＣｏＲは、アンタゴニストの結合したプロゲステロン及びエストロゲン受容体に対して相互作用することが報告されている。Ｎ−ＣｏＲ及びＳＭＲＴは、ｍＳｉｎ３蛋白質とヒストン脱アセチル化酵素と共に大型の蛋白質複合体を形成した状態で存在することが示されている（Pazin及びKadonaga, 1997; Cell 89, 325-8）。従って、リガンドにより誘導される核内受容体の抑制から活性化への切り替えには、コリプレッサー複合体と、拮抗する酵素活性を有するコアクチベーター複合体との入れ替わりが関与している。

Ｎ−ＣｏＲコリプレッサー複合体は核内受容体による抑制を媒介するだけでなく、Ｍａｄ−１、ＢＣＬ−６及びＥＴＯといった別の転写因子と相互作用する。これら多くの蛋白質が細胞増殖及び分化に関する疾患に大きな役割を果たしている（Pazin及びKadonaga, 1997, Cell 89, 325-8；Huynh及びBardwell, 1998, Oncogene 17, 2473-84; Wang, Jら, 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95, 10860-5）。例えばＴ３Ｒはウイルス性腫瘍遺伝子ｖ−ｅｒｂＡと類似性があることが同定されているが、野生型受容体とは異なってリガンドに結合せず、転写抑制体として構成的に機能する。更に、ＲＡＲの突然変異はヒトの多くの癌、特に急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）及び肝細胞癌に関与している。ＡＰＬ患者において、染色体転座に由来するＲＡＲ融合蛋白質は、前骨髄球性白血病蛋白質（ＰＭＬ）又は前骨髄球ジンク・フィンガー蛋白質（ＰＬＺＦ）のいずれかに関連している。両方の融合蛋白質がコリプレッサー複合体の構成要素と相互作用することができるが、レチノイン酸を添加するとＰＭＬ−ＲＡＲからコリプレッサー複合体が外れ、一方ＰＬＺＦ−ＲＡＲは構成的に相互作用する。これらの知見は、レチノイン酸による処置を施したＰＭＬ−ＲＡＲ ＡＰＬ患者が完全寛解を示すのに対し、ＰＬＺＦ−ＲＡＲ ＡＰＬ患者には殆ど応答が見られないということの説明になっている（Grignaniら, 1998, Nature 391, 815-8; Guidezら, 1998, Blood 91, 2634-42; Heら, 1998, Nat Genet 18, 126-35; Linら, 1998, Nature 391, 811-4）。更に、レチノイン酸処置後に再発を繰り返したＰＭＬ−ＲＡＲ患者を、ＨＤＡＣ阻害剤フェニルブチレートで処置したところ、白血病は完全寛解している（Warrellら, 1998, J. Natl. Cancer Inst. 90, 1621-1625）。

現在までのところ、単剤療法として酪酸誘導体Pivanex（Titan Pharmaceuticals）の第ＩＩ相臨床試験が行われており、ＩＩＩ／ＩＶ段階の非小細胞肺癌における活性が実証されている（Keerら, 2002, ASCO, Abstract No. 1253）。他にも第Ｉ相臨床試験に用いられたヒドロキサム酸構造クラスに属するＮＶＰ−ＬＡＱ８２４（Novartis）及びＳＡＨＡ（Aton Pharma Inc.）といったＨＤＡＣ阻害剤が同定されている（Marksら, 2001, Nature Reviews Cancer 1, 194-202）。別のクラスに属するものとしては、Ｔ細胞リンパ腫の治療を目的とした第ＩＩ相臨床試験において有効性が見られたデプシペプチド（ＦＲ９０１２２８−Fujisawa）等の環状テトラペプチドが挙げられる（Piekarzら, 2001, Blood 98, 2865-8）。また現在、ベンズアミドクラスに関連した化合物ＭＳ−２７−２７５（Mitsui pharmaceuticals）を用いて、血液悪性腫瘍患者の第Ｉ相臨床試験が行われている。

Int. J. Chem. Kinet. 1997, 29, 729-735には、３−シクロペンチル−Ｎ−ヒドロキシ−プロピオンアミド、４−シクロヘキシル−Ｎ−ヒドロキシ−ブチルアミド、及び２−シクロヘキシル−Ｎ−ヒドロキシ−アセタミドについての記載がある（更にBerndtら, 1992, Int. J. Chem. Kinet., 24, 695-701参照）。

２種の阻害剤ＴＳＡ及びＳＡＨＡと共結晶化した超高温度好熱性菌Aquifex aeolicus由来のヒストン脱アセチル化酵素様蛋白質の結晶構造については、Finninら, 1999, Nature, 401, 188-193に記載がある。

ヒストン脱アセチル化の阻害剤として、少なくとも１個の芳香環又は芳香族環系を有するヒドロキサム酸については、Lavoieら, 2001, Bioorg. Med. Chem. Letters 11, 2847-2850；Remiszewskiら, 2002, J. Med. Chem. 45, 4, 753-757；Massaら, 2001, J. med. Chem. 44, 2069-2072；Sternsonら, 2001, Org. Lett. 3, 26, 4239-4242；Maiら, 2002, J. Med. Chem. 45, 1778-1784；Wooら, 2002, J. Med. Chem. 45, 2877-2885に記載がある。

ＥＰ１１７４４３８、ＷＯ００５２０３３、ＷＯ０１１８０４５、ＷＯ０１１８１７１、ＷＯ０１３８３２２、ＷＯ０１７０６７５、ＷＯ９７３５９９０、ＷＯ９９１１６５９、ＷＯ０２２６７０３、ＷＯ０２３０８７９及びＷＯ０２２６６９６には、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としてのヒドロキサム酸についての記載がある。

ＷＯ９８０５６３５及びＷＯ９５３３７０９には、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤としてのヒドロキサム酸についての記載がある。

本発明の化合物はヒストン脱アセチル化活性を有する酵素の阻害剤としてのヒドロキサム酸である。本化合物はＨＤＡＣ阻害活性によって様々な癌細胞の分化及び／又はアポトーシスを誘導するが、それには（１）これらの酵素は全ての細胞中に存在する（２）本発明に説明される化合物とは異なるブチレート又はＴＳＡといったモデル化合物を用いた予備実験の結果、ＨＤＡＣ阻害剤が様々な細胞において分化を誘導することが示されている（３）癌患者の治療において、本発明の化合物に関係のない他の数種のＨＤＡＣ阻害剤について、臨床上の有効性が実証されている、という３つの理由が挙げられる。

幅広い種の変質細胞に分化及び／又はアポトーシスを誘導する活性は、単に増殖を阻害するだけの活性と比較してかなり複雑な生物学的活性である。後者の場合、変質（腫瘍）細胞の増殖のみが阻害され、正常細胞が阻害されないという根拠がはっきりしない。本発明の化合物ではアポトーシス、分化、又はより具体的には分化した癌細胞の再分化が誘導されるので、幅広い種の腫瘍において有益な効果がもたらされるということが論理的に説明されている。

新規な化合物が有するヒストン脱アセチル化酵素阻害活性は、転写抑制アッセイ、ヒストンＨ３及び／又はＨ４のアセチル化を検出するウェスタンブロット解析、酵素生体外アッセイといった様々な最新技術によって調べることができる。腫瘍細胞系に与える細胞毒性及び成長阻害効果や、細胞における遺伝子発現パターンを調節する能力について、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を特徴付けることもできる。

本発明は、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能な塩又は生理的に機能するその誘導体を対象とする。

［式中、
ｎは２〜６個の炭素原子を含む非芳香族環系であり、環系は１個又は２個の二重結合を有し；
ＸはＣ、ＣＨ又はＣＨ₂であり；
ＹはＣ、ＣＨ、ＣＨ₂、Ｓ、ＮＲ、ＣＨ₂−ＣＨ₂、Ｈ₂Ｃ−−ＣＨ、ＨＣ−−ＣＨ₂、Ｃ−−ＣＨ₂、Ｈ₂Ｃ−−Ｃ及びＣ−−Ｃからなる群より選ばれてなり；１個以上の水素原子が置換基Ｒ’で任意に置換されていてもよく；
点線はそれぞれ一重、二重又は三重結合を意味し（ただし三重結合と三重結合、及び二重結合と三重結合の組み合わせは除く）；
Ｒ’は互いに独立してＨ、−ＣＮ、アルキル基、シクロアルキル基、アミノアルキル基、アルキルアミノ基、アルコキシ基、−ＯＨ、−ＳＨ、アルキルチオ基、ヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアルキルアミノ基、ハロゲン、ハロアルキル基又はハロアルキロキシ基であり；
ＲはＨ、アルキル基又はシクロアルキル基であり；
ＺはＣＨ、Ｃ又はＰであり；
ｐは０又は１である（ただし以下の化合物は除く）。］

特に述べない限りは、アルキル基は好ましくは炭素数１〜６の直鎖又は分鎖であり、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル又はヘキシル基であり、メチル、エチル、イソプロピル又はｔ−ブチル基が最も好ましい。

特に述べない限りは、用語「アルキル」は、「不飽和アルキル」として下記に詳細を定義するアルキル誘導体を含むものとする。不飽和アルキル基とは、１個以上の二重結合又は三重結合を有するアルキル基であり、好ましくはビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−及び３−プロピニル、３−ブチニル、並びに高級同族体及び異性体である。

式（Ｉ）の化合物中のアルキル基は、上で定義した１個以上の置換基Ｒ’で任意に置換されていてもよい。

シクロアルキル基とは、３〜８個の炭素原子を含む非芳香族環系を意味し、環中の１個以上の炭素原子をＸ基で置換することができる（Ｘは上で定義した通りである）。

アルコキシ基とは、Ｏ−アルキル基を意味する（アルキル基は上で定義した通りである）。

アルキルチオ基とは、Ｓ−アルキル基を意味する（アルキル基は上で定義した通りである）。

ヒドロキシアルキル基とは、ＨＯ−アルキル基を意味する（アルキル基は上で定義した通りである）。

ハロアルキル基とは、１〜５個、好ましくは３個のハロゲン原子で置換されたアルキル基を意味する（アルキル基は上で定義した通りである）。中でもＣＦ₃が好ましい。

ハロアルキロキシ基とは、１〜５個、好ましくは３個のハロゲン原子で置換されたアルコキシ基を意味する（アルコキシ基は上で定義した通りである）。中でもＯＣＦ₃が好ましい。

ヒドロキシアルキルアミノ基とは、（ＨＯ−アルキル）₂−Ｎ−基又はＨＯ−アルキル−ＮＨ−基を意味する（アルキル基は上で定義した通りである）。

アルキルアミノ基はＨＮ−アルキル又はＮ−ジアルキル基を意味する（アルキル基は上で定義した通りである）。

アミノアルキル基はＨ₂Ｎ−アルキル基、モノアルキルアミノアルキル、又はジアルキルアミノアルキル基を意味する（アルキル基は上で定義した通りである）。

ハロゲン基は、塩素、臭素、フッ素又はヨウ素であり、中でもフッ素が好ましい。

本発明はまた、式（Ｉ）の化合物を単独で含む、又は薬学的に許容可能な塩及び生理的に機能する誘導体又はプロドラッグの形態として、薬学的に許容可能な希釈剤又は担体と共に含む、薬剤組成物を提供する。

本明細書でいう「生理的に機能する誘導体」の語は、エーテル類、エステル類、Ｎ−アルキル化又はアセチル化ヒドロキサム酸類、２，５−ジヒドロ−［１，２，４］−オキソジアゾリル又は４，５−ジヒドロ−［１，２，４］−オキソジアゾリルといった、それ自体は薬学的に活性ではないが生体内で（即ち化合物が投与される対象体内で）薬剤的に活性な形状に変形する化合物のことを意味する。

別の形態において、本発明はまた、ヒストン脱アセチル化酵素活性の阻害が有益である場合の疾病の治療又は予防方法を提供する。本方法は、式（Ｉ）の化合物、生理的に許容可能な塩又は生理的に機能するその誘導体を有効量、投与することを包含する。

本発明はまた、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害が有益である場合の疾病の予防及び治療用薬物生成を目的とした、式（Ｉ）の化合物及び薬学的に耐容な塩又は生理的に機能する誘導体の使用を対象とする。

更に本発明は、望ましい式（Ｉ）のヒドロキサム酸を調製する方法を提供する。

式（Ｉ）の化合物を合成する方法の一つとして、酸（式ＩＩ）を対応する酸塩化物（式ＩＩＩ）に変換し、その酸塩化物をヒドロキシルアミンと反応させるものがある（Watanabeら, 1989, J. Org. Chem., 54, 17, 4088-4097；Shishidoら, 1992, J. Org. Chem., 57, 10, 2876-2883）。

式（ＩＩ）の酸とヒドロキシルアミンとのカップリング反応、式（Ｉ）の化合物を調製する他の方法については、Wooら, 2002, J. Med. Chem. 45, 2877-2885；Knorrら, 1989, Tetrahedron Lett., 30, 1927-1930, Carpino, 1993, J. Am. Chem. Soc., 115, 4397-4398及びAlbericioら, 1998, J. Org. Chem., 63, 9678-9683に記載がある。

式（Ｉ）の化合物の別の調製方法としては、対応のエステルをヒドロキシルアミンと反応させるものがある（Stowellら, 1995, J. Med. Chem., 38, 8, 1411-1413参照）。

式（Ｉ）の化合物の一つの好ましい態様において、Ｚを含む環ｎはシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロペント−１−エニル、シクロヘキセ−１−エニル、シクロヘプテト−１−エニル、シクロペンテ−２−エニル、シクロヘキセ−２−エニル、シクロヘプテ−２−エニル、シクロヘキセ−３−エニル、シクロヘプテ−３−エニルであってもよい。

本発明の式（Ｉ）の化合物について別の好ましい態様において、Ｚを含む環ｎはシクロペンチル又はシクロヘキシルであり、ＹはＣＨ、ＣＨ₂、ＣＨ₂−ＣＨ₂、Ｓ、ＮＲから選ばれるかｐ＝０であり、ＺはＣＨ又はＰである。

本発明の式（Ｉ）の化合物について更に別の好ましい態様において、Ｚを含む環ｎはシクロペンチル又はシクロヘキシルであり、ＹはＣＨ、ＣＨ₂、ＣＨ₂−ＣＨ₂から選ばれるかｐ＝０であり、ＺはＣＨである。

更に別の好ましい態様において、アルキル基の炭素原子のいずれもが置換基Ａ（group A）で置換されない。

好ましい本発明の化合物は
３−シクロペンチル−Ｎ−ヒドロキシ−プロピオンアミド；
３−シクロヘキシル−Ｎ−ヒドロキシ−プロピオンアミド；
４−シクロヘキシル−Ｎ−ヒドロキシ−ブチルアミド；
２−シクロペプチル−Ｎ−ヒドロキシ−アセトアミド
である。

本発明による式（Ｉ）の化合物は、無機又は有機の酸又は塩基とともに塩を形成してもよい。そのような塩の例としては、アルカリ金属塩、特にナトリウム及びカリウム塩、又はアンモニウム塩が挙げられる。

式（Ｉ）の化合物は様々な方法で得ることができる。本発明の方法について好ましい態様においては、以下の２種の合成方法が用いられる。

式（Ｉ）のα−β不飽和化合物の酸又は酸塩化物を得ることができるが、まずは対応のエステルを加水分解することで酸を得ることができ（Bojicら, 1998, 354, 289-299）、これを塩素化剤（オキサリルクロライド、チオニルクロライド、ホスホルペンタクロライド）で処理して酸塩化物を得ることができる。対応のアルデヒドを（カルボエトキシメチレン）トリフェニルホスホラン（ＰｈＰ＝ＣＨＣＯＯＥｔ）と反応させてα−β不飽和エステルを合成することができる（Maryanoffら, 1989, Chem. Rev. 89, 863-927）。

別の酸を調製する他の方法については、Mancusoら, 1981, Synthesis, 165-185；又はBalら, 1981, Tetrahedron, 37, 2091-2096に記載がある。

本発明の化合物は、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害が有益である場合の、様々なヒト及び動物疾患、好ましくはヒトの疾患に使用することができる。

従って本発明の化合物及びそれを用いて調製した薬剤は、未分化腫瘍細胞といった細胞の分化及び／又はアポトーシスの誘導において概して有用である。本発明の治療効果は、細胞増殖の調節、細胞活性化、細胞生存、細胞分化、細胞周期、細胞成熟及び細胞死、あるいは糖、脂質又は蛋白質代謝等の代謝における全身性変化の誘導、新生血管形成の阻害（抗血管形成）、他臓器への腫瘍拡散の阻害（抗移転）、近接する正常組織への腫瘍拡散の阻害（抗侵襲性）又はプログラムされた細胞死の促進（アポトーシス）といった１種以上のメカニズムを通じて得られるが、これらに限定されるものではない。

本発明の化合物は、例えば毒物、放射能、免疫療法、成長欠陥、栄養失調、吸収不良、免疫無調節、貧血等を原因とする細胞減少又は細胞破壊後の血液細胞成長及び発生（前造血効果（prohematopoietic effect））といった、細胞新生（generation poiesis）の補助にも用いられ、あるいは治療において、組織発生及び分解を制御したり細胞及び組織維持や血液細胞恒常性を改変したりするのにも用いられる。

本発明の化合物及びそれを用いて調製した薬剤は、ヒストン又は他の分子（例えばｐ５３）の遺伝子特異的低アセチル化に関連した疾患の治療に有用である。さらに本発明の化合物は、ＢＣＬ−Ｘ_Lや他のＢＣＬファミリーといった抗アポトーシス遺伝子の抑制や、ｐ２１及び／又はｐ５３といった分子の腫瘍抑制活性の誘導が必要とされる、病気の治療に用いることができる。

本発明の化合物及びそれを用いて調製した薬剤は、ヒストンの高アセチル化が誘導されよって患者腫瘍細胞の分化及び／又はアポトーシスが誘導されその結果患者の病状に臨床上の改善が見られ有益となるような、疾病治療にも好適である。そのような疾患の例としては、皮膚癌、黒色腫、エストロゲン受容体依存性及び非依存性乳癌、卵巣癌、テストステロン受容体依存性及び非依存性前立腺癌、腎臓癌、大腸及び結腸直腸癌、膵臓癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、泌尿生殖器癌、消化管癌、子宮癌、星状細胞種、神経膠腫、基底細胞癌及び扁平上皮癌、カポジ肉腫及び骨肉種などの肉腫、頭部及び頚部癌、小細胞及び非小細胞肺癌、白血病、リンパ腫及びその他の血液細胞癌、角化棘細胞腫、ボーエン病、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫が挙げられ、更に前癌病変（光線性角化症など）に対する治療にも用いられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の治療法を組み合わせて用いると、微小残存腫瘍病変又は腫瘍転移の治療に特に有用である。
加えて本発明は、ヒストン脱アセチル化酵素活性の異常なリクルートを原因とする疾患（甲状腺抵抗性症候群等）における、又は異常な遺伝子発現に関連した他の疾患（炎症性疾患、糖尿病、サラセミア、肝硬変、原虫感染等、及び全ての種類の自己免疫疾患、特に関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、全ての種類のリウマチ、変形性関節症、痛風性関節炎、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病及び非インスリン依存性糖尿病、喘息、鼻炎、ぶどう膜炎、紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性大腸炎、及び他の慢性炎症、慢性下痢、全ての種類の皮膚及び／又は粘膜炎（乾癬、魚鱗癬、座瘡等））における不適当な遺伝子発現を元の状態に戻すので有益である。本発明は又、紫外線からの保護及び日焼けの処理を目的とした使用に関する。

更に本発明の化合物及びそれを用いて調製した薬剤は、乾癬、線維症、いぼ及びその他の皮膚疾患といった、増殖性疾患の治療に有用である。「増殖性疾患」及び「細胞増殖」の語は本明細書において同義に用い、過剰又は異常細胞の望ましくない又は制御不能な増殖、即ち生体外・生体内にかかわらず起こる、腫瘍性成長又は過形成成長といった望ましくない成長を意味する。増殖性疾患の例としては、悪性新生物及び腫瘍、癌、白血病、乾癬、骨疾患、（例えば結合組織の）線維増殖性疾患及びアテローム性動脈硬化等の前癌状態及び悪性細胞増殖が挙げられるが、これらに限定されるものではない。肺、結腸、胸、卵巣、前立腺、肝臓、膵臓、脳、皮膚等、あらゆる種類の細胞を処置することができ、さらに再生不良性貧血、ディジョージ症候群、グレーブス病等のＴ細胞に関連した疾患のあらゆる処置に用いることができるが、これらに限定されるものではない。

本発明は、患者に代謝されて式に示される化合物となる、式（Ｉ）の化合物も対象とする。本発明に記載される態様は、それら化合物にも適用される。

本発明はまた、式（Ｉ）の化合物を用いた処置又は従来確立された腫瘍治療法をさらに組み合わせた処置に腫瘍が応答を示すかどうかを生体外で試験する段階を包含する、腫瘍同定の診断方法に関する。本方法は好ましくは、これらの処置によって調節される遺伝子を同定する方法を包含する。ある特定の態様において、診断方法は核酸技術の使用を包含し、好ましくはハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ連鎖反応を検出に用いる。他の種類の核酸技術を用いてもよい。別の態様において診断方法は、異なって調節される（differentially regulated）蛋白質に対して特異的な抗体を検出に用いることを包含する。この目的を達するために、本発明の化合物及びその誘導体を組み合わせた処置を行った際に発現の脱制御を示した遺伝子によってコードされる蛋白質を（例えば組み替え発現系で）発現し、これらの蛋白質に対する抗体を作成する。得られた抗体を用いて（又は抗体のパターンによって）腫瘍又は腫瘍細胞の状態を特徴付け、診断及び／又は予後に用いることができる。

概して本発明は、様々なヒト疾患を処置する新たな可能性を提供する。由来が様々な腫瘍細胞の治療を目的として、式（Ｉ）の化合物の有するＨＤＡＣ阻害活性及び細胞分化誘導活性と、従来確立され臨床で用いられている治療薬とを組み合わせて用いることができることを本発明者らは発見した。腫瘍を有する患者に対してこのような化合物を用いた組み合わせ治療を行うと、それぞれ単独で対応の治療薬を用いる場合と比較して、より高い治療効果が得られると考えられる。本発明の目的は、癌治療のために本明細書に記載の化合物を用いる組み合わせ治療法を提供することにある。組み合わせ治療法を用いることで、（例えば必要とされる化学治療薬の）投薬量を減らすことができ、従って高頻度の治療の結果見られる、場合によっては非常に深刻な副作用を抑えることが可能になる。

本発明の形態は、式（Ｉ）の化合物と、以下に列挙する現在臨床使用されている又は臨床開発されている治療原理との組み合わせ：
すなわち、
−化学療法薬又は細胞毒性薬（例えば５−ＦＵ、タクソール、ｃｉｓ−白金、カンプトセシン、ゲムシタビン、ドキソルビシン、イリノテカン）
−分化誘導薬（例えばビタミンＤ、レチノイン酸、サイトカイン（ＩＩ−３、ＩＩ−６、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ等））
−放射線治療（例えばＸ線又はガンマ線）
−免疫学的方法（抗体治療、ワクチン接種）
−免疫療法／細胞毒の組み合わせ（例えば細胞毒性成分を結合した抗体）
−抗血管形成的方法
であるが、これらに制限されるものではない。

本発明の化合物及びその塩は、それら化合物の少なくとも１種を単独で又は薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤との混合物の形態で、薬剤組成物（例えば液体、懸濁液、エマルジョン、トローチ剤、カシェ剤、アンプル剤、坐薬、ペッサリー、軟膏、ゲル、ペースト、噴霧、ローション、油、ボーラス、舐剤、エアロゾル、粉末、顆粒、タブレット、丸薬、カプセル、注射、溶液、泡、クリーム、浣腸剤等）として調合することができる。薬剤組成物は一般的方法に従って調合することができる。

特定の患者に固有の投与量は、年齢、体重、健康状態、性別、食習慣、薬歴、特定の疾患の程度、投与した特定の化合物の活性度、投与時間、投与経路、排泄量、治療継続期間、組み合わせて用いられる他の薬剤、化合物及び／又は物質に応じて異なりうる。活性化合物及び活性化合物を含む組成物の適当な投与量が患者によって異なるということは理解されよう。最適な投与量を調べるにあたっては、治療により得られる効果のレベルと本発明の治療による危険性又は有害な副作用とのバランスが通常考慮される。

生体内投与は一回で行ってもよいし、治療期間中に連続的又は断続的に行ってもよい。最も効果的な手段と投与量を調べる方法は当業者に公知であり、治療に用いる配合、治療の目的、処置される標的細胞、処置される患者に応じて異なりうる。治療にあたる医師が選択した投与量やパターンで、一回又は複数回の投与を行うことができる。

一般に、活性化合物の好適な投与量は１日あたり患者の体重１ｋｇにつき約０．１〜約５００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇである。活性成分が塩、エステル、プロドラッグ等である場合、親化合物に基づいて投与量を計算し、実際に使用される重量はそれに比例させて増やす。

（実施例１）
［化合物１（３−シクロペンチル−Ｎ−ヒドロキシ−プロピオンアミド）の合成
塩化３−シクロペンチル−プロピオニル（１１．０ｍＬ、１１．６ｇ、７２．０ｍｍｏｌ）を含むジクロロメタン（５０ｍＬ）溶液に、塩酸ヒドロキシルアミン（５．００ｇ、７２．０ｍｍｏｌ）及び重炭酸ナトリウム（１２．０ｇ、１４４ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２４時間攪拌した後、塩化アンモニウム飽和溶液（５０ｍＬ）を添加して反応を停止した。混合物は複数層に分離した。水層を酢酸エチル（４×５０ｍＬ）で抽出した。溶媒としての複数の有機層を真空除去した。石油エーテルを添加して酢酸エチルから粗生成物の沈殿を回収したところ、白色固形のヒドロキサム酸塩（５．２５ｇ、３３．４ｍｍｏｌ、４６％）を得た。¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、［Ｄ₆−ＤＭＳＯ］：δ＝０．７４−０．９１（ｍ、２Ｈ）、１．０５−１．２５（ｍ、４Ｈ）、１．３６（ｑ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、４Ｈ）、１．５４−１. ７１（ｍ、５Ｈ）、１．９４（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、８．５９（ｓ、１Ｈ）及び１０．２８（ｓ、１Ｈ）（ＮＨ及びＯＨ）。¹³Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、［Ｄ₆−ＤＭＳＯ］：δ＝２５．６、２６．０、２９．７、３２．４、３６．５、１６９．２（Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ）。ＭＳ：（Ｃ₈Ｈ₁₄ＮＯ₂）［Ｍ＋Ｈ］⁺のｍ／ｚ計算値１５８；測定値１５８。

（実施例２）
［化合物２（３−シクロヘキシル−Ｎ−ヒドロキシ−プロピオンアミド）の合成］
塩化３−シクロヘキシル−プロピオニル（１２．１ｍＬ、１２．６ｇ、７２．０ｍｍｏｌ）を含むジクロロメタン（５０ｍＬ）溶液に、塩酸ヒドロキシルアミン（５．００ｇ、７２．０ｍｍｏｌ）及び重炭酸ナトリウム（１２．０ｇ、１４４ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２４時間攪拌した後、塩化アンモニウム飽和溶液（５０ｍＬ）を添加して反応を停止した。混合物は複数層に分離した。水層を酢酸エチル（４×５０ｍＬ）で抽出した。溶媒としての複数の有機層を真空除去した。石油エーテルを添加して酢酸エチルから粗生成物の沈殿を回収したところ、白色固形のヒドロキサム酸塩（７．２１ｇ、４２ｍｍｏｌ、５８％）を得た。¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、［Ｄ₆−ＤＭＳＯ］：δ＝０．９５−１．１２（ｍ、２Ｈ）、１．３８−１．６９（ｍ、６Ｈ）、１．６２−１．７７（ｍ、３Ｈ）、１．９４（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、８．５８（ｓ、１Ｈ）及び１０．２８（ｓ、１Ｈ）（ＮＨ及びＯＨ）。¹³Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、［Ｄ₆−ＤＭＳＯ］：δ＝２５．０、３１．８、３２．０、３２．３、３９．５、１６９．５（Ｃ（＝）ＮＨＯＨ）。ＭＳ：（Ｃ₉Ｈ₁₇ＮＯ₂）［Ｍ＋Ｈ］⁺のｍ／ｚ計算値１７２；測定値１７２。

（実施例３）
［化合物３（３−シクロヘキシル−Ｎ−ヒドロキシ−アクリルアミド）の合成］
３−シクロヘキシル−アクリル酸エチルエステル：塩化オキサリル（１１．１ｍＬ、１０５ｍｍｏｌ）を含むジクロロメタン（２５０ｍＬ）冷却溶液に、ジメチルスルホキシド（１４．６ｍＬ、２０６ｍｍｏｌ）を含むジクロロメタン（２５０ｍＬ）溶液を−７８℃で添加した。５分後、同じ温度でシクロヘキシルメタノール（１０．８ｍＬ、８７．５ｍｍｏｌ）を添加し、さらに５分後トリエチルアミン（６０．７ｍＬ、４３８ｍｍｏｌ）を添加した。反応を−７８℃で２時間維持した後、放置して室温まで暖めた。溶媒を真空除去した。得られたアルデヒドは、それ以上精製せず次の段階に用いた。粗シクロヘキサンカルバルデヒドをトルエン（２００ｍＬ）及びエタノール（１５０ｍＬ）に溶解した。７０℃で１５分攪拌した後、カルボエトキシ−メチレントリフェニルホスホラン（３３．６ｇ、９６．５ｍｍｏｌ）を一度に添加した。攪拌を更に２４時間継続した。溶媒を真空除去した。フラッシュクロマトグラフィーで得られた生成物の収量は７８％（１２．５ｇ）であった。¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、［Ｄ₆−ＤＭＳＯ］：δ＝１．０７−１．３４（ｍ、８Ｈ、ＣＨ₃及びシクロヘキシル−ＣＨ₂）、１．６０−１．８０（ｍ、５Ｈ、シクロヘキシル−ＣＨ₂）、２．０４−２．１８（ｍ、１Ｈ、シクロヘキシル−ＣＨ）；４．１６（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ、Ｅｔ−ＣＨ₂）、５．７４（ｄｄ、Ｊ＝１５．８Ｈｚ及びＪ＝１．５Ｈｚ、１Ｈ、Ｃ＝Ｃ−Ｈ）、６．８９（ｄｄ、Ｊ＝１５．８Ｈｚ及びＪ＝６．８Ｈｚ、１Ｈ、Ｃ＝Ｃ−Ｈ）。

３−シクロヘキシル−アクリル酸：
３−シクロヘキシル−アクリル酸エチルエステル（７．００ｇ、３８．４ｍｍｏｌ）を含むジオキサン（２００ｍＬ）溶液に、水（７０ｍＬ）に溶解した水酸化リチウム（４．０３ｇ、９６．１ｍｍｏｌ）を添加した。ＬｉＯＨは流出したので、メタノール（１７０ｍＬ）を反応に添加した。４時間後、７０℃にて溶媒の３／４を真空除去した。２Ｎ ＨＣｌをｐＨが３になるまで添加した。混合物を塩化アンモニウム飽和溶液（１５０ｍＬ）で処理した。生成物をジクロロメタン（２００ｍＬ×３）で抽出した。複数の有機相を飽和ナトリウム溶液（５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、溶媒を真空除去した。液体を４８時間、室温に置いて結晶化を進行させた。無色の結晶生成物が３４％の収率（２．０１ｇ、１３．１ｍｍｏｌ）で得られた。¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、［Ｄ₆−ＤＭＳＯ］：δ＝１．０１−１．３７（ｍ、５Ｈ、シクロヘキシル−ＣＨ₂）、１．５５−１．７９（ｍ、５Ｈ、シクロヘキシル−ＣＨ₂）、２．０６−２．２１（ｍ、１Ｈ、シクロヘキシル−ＣＨ）；５．６９（ｄｄ、Ｊ＝１５．７Ｈｚ及びＪ＝１．５Ｈｚ、１Ｈ、Ｃ＝Ｃ−Ｈ）、６．７６（ｄｄ、Ｊ＝１５．７Ｈｚ及びＪ＝６．８Ｈｚ、１Ｈ、Ｃ＝Ｃ−Ｈ）。１２．０１（広いｓ、１Ｈ、ＯＨ）。¹³Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、［Ｄ₆−ＤＭＳＯ］：δ＝２５．１、２５．４、３１．１（シクロヘキシル−ＣＨ₂）、３９．４（シクロヘキシル−ＣＨ）、１１９．５及び１５３．４（Ｃ＝Ｃ）、１６７．３（ＣＯＯＨ）。ＭＳ：（Ｃ₉Ｈ₁₄Ｏ₂）［Ｍ＋Ｈ］⁺のｍ／ｚ計算値１５５；測定値１５５。

３−シクロヘキシル−Ｎ−ヒドロキシ−アクリルアミド（Ｋ１ ００００３２８３）：
３−シクロヘキシル−アクリル酸（５．３０ｇ、３１．３ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（１００ｍＬ）溶液に、ＥＤＣ（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカーボジイミドヒドロクロリド）（７．８０ｇ、４０．７ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物）（５．０７ｇ、３７．６ｍｍｏｌ）を添加した。室温で３０分攪拌した後、塩酸ヒドロキシルアミン（３．２６ｇ，４７．０ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（６．９４ｍＬ、５０．１ｍｍｏｌ）を添加した。更に１８時間室温で攪拌した後、沈殿物を濾過しＤＭＦで洗浄した。得られたＤＭＦ相を合わせた。溶媒を真空で濃縮した。１Ｎ ＨＣｌ（５０ｍＬ）を添加した。酢酸エチル（３×１００ｍＬ）及びジクロロメタン（２×１００ｍＬ）で抽出した後、有機層を合わせ、１Ｎ ＨＣｌ（１０ｍＬ）及び塩化ナトリウム飽和溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を真空除去した。石油エーテルを添加して酢酸エチルから生成物を結晶化した。この工程で大量のＨＯＢｔが除去されたが、アセトニトリル／水グラジエントを用いた予備のＨＰＬＣを行って更に精製した。その結果、１．５４ｇ、９．０８ｍｍｏｌの３−シクロヘキシル−Ｎ−ヒドロキシ−アクリルアミドを回収した。¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、［Ｄ₆−ＤＭＳＯ］：δ＝０．９９−１．３５（ｍ、５Ｈ）及び１．５６−１．７３（ｍ、５Ｈ）（シクロヘキシル−ＣＨ₂）、２．００−２．１３（ｍ、１Ｈ、シクロヘキシル−ＣＨ）；５．６７（ｄ、Ｊ＝１５．７Ｈｚ、１Ｈ、Ｃ＝Ｃ−Ｈ）、６．５８（ｄｄ、Ｊ＝１５．７及びＪ＝６．３Ｈｚ、１Ｈ、Ｃ＝Ｃ−Ｈ）、８．７７（ｓ、１Ｈ）及び１０．４９（ｓ、１Ｈ）（ＮＨ及びＯＨ）。¹³Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、［Ｄ₆−ＤＭＳＯ］：δ＝２５．２、２５．５、３１．５（シクロヘキシル−ＣＨ₂）、４１．１（シクロヘキシル−ＣＨ）、１１８．８及び１４７．１（Ｃ＝Ｃ）、１６２．８（Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ）。ＭＳ：（Ｃ₉Ｈ₁₅ＮＯ₂）［Ｍ＋Ｈ］⁺のｍ／ｚ計算値１７０；測定値１７０。

（実施例４）
化合物１、２及び３はＨＤＡＣ活性を阻害し、ヒストンＨ４高アセチル化を誘導し、レポーター細胞系の転写抑制を緩和する（図１〜４）。ヒストンの高アセチル化はクロマチン構造の脱凝縮化及び遺伝子活性化に密接な関連があり、一方低アセチル化はクロマチンの凝縮化及び転写抑制に密接な関連がある。アセチル化はヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）活性を有する一連の酵素により媒介される。一方、アセチル基は特異的ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）により除去される。これらのメカニズムが壊れると、転写の誤調節が起きる。甲状腺ホルモン受容体ＰＰＡＲδ、レチノイン酸受容体Ｎ−ＣｏＲ及びＡＭＬ／ＥＴＯといった転写因子は、ＨＤＡＣ酵素をリクルートし、その結果、特定のプロモーター領域への結合が起こり転写が抑制される。後者の効果はＵＡＳ要素を含む構成的プロモーターで再現することができる。このプロモーターは、上記した転写因子のいずれか一つに融合した、酵母菌Ｇａｌ４蛋白質の非相同ＤＮＡ結合領域を含む融合蛋白質をリクルートする。Ｇａｌ４融合蛋白質が存在しない場合、チミジンキナーゼプロモーターには他の転写因子に対する結合部位が存在するので、リポーター遺伝子は高い基底転写活性を示す。

（方法）
転写リポーター遺伝子アッセイ
Ｇａｌ４依存性リポーター遺伝子の活性化及び抑制解除を利用して、リプレッサー活性についての転写アッセイを行った（Hildebrandら, 2001, J Biol Chem 276, 9889-95；Maurerら, 2002, Blood 99, 2647-52）。このアッセイには特異的に作製した永久細胞系を用いた。２９３Ｔ細胞をＵＡＳ ＴＫルシフェラーゼリポータープラスミド（Heinzelら, 1997 Nature 387, pp43-48）及びＨＤＡＣ依存性抑制分子に融合したＧａｌ４ＤＮＡ結合領域を発現するプラスミドで確実にトランスフェクションした。Ｇａｌ４融合蛋白質はこの活性を抑制するのに対し、ＨＤＡＣ阻害剤はこの抑制を緩和する。この緩和はリポーター遺伝子活性の増加として（例えばルシフェラーゼ活性検出アッセイで）検出することができる。

ヒストン高アセチル化の誘導
アセチル化したヒストンは、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理した２９３Ｔ細胞の全細胞抽出物を、ヒストンＨ４のアセチル化Ｎ末端リジン残基に特異的な抗体を用いてウエスタンブロット解析することで検出できる（Gottlicherら, 2001, EMBO J 20, 6969-78）。

組み替えＨＤＡＣの生体外阻害
ヒーラ核抽出物又は昆虫細胞Ｈｉｇｈ５由来の組換えＨＤＡＣ蛋白質におけるヒストン脱アセチル化酵素活性を調べるために、人工基質（Fluor de Lys, Biomol）の特異的脱アセチル化を行う。基質の変化は蛍光光度法で検出及び定量することができる。ＨＤＡＣ阻害剤と考えられるものを添加すると、基質の加水分解が抑圧され蛍光シグナルが減少する。用量反応曲線からＩＣ₅₀の値を計算することができる。

アッセイは２段階で行う。第一段階では、基質（Ｆｌｕｏｒ ｄｅ Ｌｙｓ／Ｂｉｏｍｏｌ ＫＩ−１０４）をヒストン脱アセチル化酵素で加水分解する。第二段階では、ＨＤＡＣ活性を停止し、顕色剤（Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ／Ｂｉｏｍｏｌ ＫＩ−１０５）で蛍光プローブを活性化する。ヒーラ核抽出物（Ｂｉｏｍｏｌ ＫＩ−１４０）又は組み替え蛋白質、及びＨＤＡＣ阻害剤と考えられる物質を反応緩衝液（Ｂｉｏｍｏｌ ＫＩ−１４３）と混合し、９６ウェルプレートの１ウェルあたりの全容積を２５μｌとする。１ウェルあたり２５μｌの基質（反応緩衝液での希釈１：１００）を添加して反応を開始する。ヒストン脱アセチル化酵素活性を含まない負の対照と、ＨＤＡＣ阻害剤を含まない正の対照も同様に処理する。１５〜６０分後に５０μｌの顕色剤（反応緩衝液での希釈１：２０）を添加して反応を停止する。更に室温で１５分保温した後は、蛍光シグナルは６０分間安定しており、蛍光リーダー（励起フィルター：３９０ｎｍ、発光フィルター：４６０ｎｍ）で検出が可能になる。

（結果）
図１から分かるように、Ｇａｌ４融合蛋白質はＴＫプロモーターが最低限示す活性とそれに続くルシフェラーゼ発現を抑制するが、化合物１、２及び３を添加するとこの抑制が緩和され、２４時間後に処理細胞溶解物のルシフェラーゼ発現及び活性の増加として測定される。化合物１及び２は共に、２４時間細胞を刺激した後で、８μＭ（２〜３倍）から２００μＭ（最大で２０倍以上）の濃度でルシフェラーゼリポーター遺伝子発現を誘導した。しかし化合物３は、リポーター遺伝子の発現を１．６μＭの濃度から誘導し始め、４０μＭでは約４０倍という最大の誘導を示した。

ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）とＨＡＴに対するヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）との酵素バランスを、ＨＤＡＣを阻害することによって変え、高アセチル化Ｎ末端を有するヒストンＨ４が凝縮される。このことは、化合物１、２及び３で６時間処理した後の２９３Ｔ細胞がヒストン高アセチル化誘導されることを示した図２によっても支持されている。化合物１及び２は最低濃度１．６μＭから高アセチル化を誘導し始め、４０μｌで最大の誘導を示している。一方化合物３は３２０ｎＭで高アセチル化を誘導し始めている。

殆どのＨＤＡＣが核内に存在するので、最も高いＨＤＡＣ活性は核抽出物から測定できる。図３に示すように、核抽出物のＨＤＡＣ活性は、化合物１、２及び３の存在下で著しく低下し、化合物１については１４．７μＭの濃度で、化合物２については６．１μＭの濃度で、化合物３については０．９μＭの濃度で、ＨＤＡＣ活性が５０％減少した。

核抽出物に化合物３を用いた場合の結果は、組換えＨＤＡＣを用いて確認できる。図４に示すように、組換えＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ６及びＨＤＡＣ８のＨＤＡＣ活性は化合物１及び２の存在下で著しく低下し、化合物３の濃度が０．３〜０．４μＭのとき、ＨＤＡＣ活性が５０％減少した。

（実施例５）
癌細胞を化合物１、２及び３で処理した後のＢＣＬ−Ｘ_Lの成長停止、アポトーシス及び発現低下の誘導。腫瘍細胞系をヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理すると、ヒストンが高アセチル化し、標的遺伝子の転写調節が起こる。一般に行われている癌治療では様々な作用メカニズムが用いられているが、いずれも最終的に癌細胞にアポトーシスを起こさせることで治療を行う。ＨＤＡＣ阻害剤は、抗アポトーシス分子（ＢＣＬ−Ｘ_L、ＢＣＬ−２等）の発現低下を通じて特定の癌細胞にアポトーシスを起こすことがこれまでに示されている。抗アポトーシス分子ＢＣＬ２ファミリーは、アポトーシスに対する癌細胞の耐性に深く関わっていると考えられる。例えば多くのヒト癌においてＢＣＬ−Ｘ_Lが大量に発現することが分かっており、しばしば予後不良因子として用いられている。従って、特定の癌細胞におけるＢＣＬ−Ｘ_L発現を低下させることで、細胞にアポトーシスを直接誘導するか、あるいは細胞がアポトーシス刺激による影響を受けやすくなるようにする。
従ってＨＤＡＣ阻害剤を用いることで、癌治療におけるアポトーシス誘導の利用が可能になる。

（方法）
蛋白質発現の分析
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤により誘導される発現パターンは、ｐ２１及びＢＣＬ−Ｘ_Lに対する抗体と図示する濃度のそれぞれの化合物で処理した細胞の全細胞抽出とを用いたウエスタンブロット解析でモニターすることができる。蛋白質発現の変調は、細胞周期阻害剤／腫瘍抑制剤ｐ２１の発現誘導と、抗アポトーシス分子ＢＣＬ−Ｘ_Lの発現抑制により実証する。

腫瘍細胞系の成長阻害
ＳＲＢアッセイを行って、細胞バイオマスの減少を測定した。具体的には、まず細胞を９６ウェル培養皿に入れた（３０００〜８０００個／ウェル）。２４時間のリカバリー（Recovery）後、図示の濃度の化合物の存在下又は非存在下で細胞を４８〜７２時間培養した。図示の濃度で化合物を培養基に添加し更に４８時間培養を行い、ＳＲＢアッセイで全細胞バイオマスの相乗的な減少を検定した。

冷クロロアセテート（ＴＣＡ）を用い、最終ＴＣＡ濃度を１０％として細胞を固定した。４℃で１時間保温した後、細胞を水で５回洗浄し風乾した。１％酢酸に溶解した０．４％（ｗｔ／ｖｏｌ）のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）で固定細胞を３０分間染色し、１％酢酸で４回洗浄し未結合の染料を除去した。風乾後、１０ｍＭの非緩衝トリス塩（ｐＨ１０．５）で５分間、結合染料を可溶化した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｖｅｒｓａ Ｍａｘ調整可能マイクロプレートリーダーを用い、５２０〜５５０ｎｍにて光学密度（ＯＤ）を読み取った。１細胞系あたり、各用量反応につき４個の試験用ウェルを１２個の対照ウェルと並列して行った。試験プレートに薬剤を添加する直前に、ＴＣＡ固定細胞を入れた１２個の基準ウェルについて、０時間（Ｔ₀；薬剤を投与した時間）での細胞群密度を測定した。上記したように５％ＦＢＳで固定染色した完全培地のバックグラウンドＯＤを、１２個のウェルについて測定した。各マイクロタイタープレートについて処理を加えていない場合のＯＤ値を得て、バックグラウンドＯＤ（即ち完全培地及び染料のＯＤとＴ₀での細胞のＯＤ）を差し引いて、細胞バイオマスの減少量を得た。

アポトーシスの測定
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色による細胞周期のＦＡＣＳ解析。細胞周期は４つに分割することができる。Ｇ_0/1期にある細胞では老化又は増殖が進行し、Ｓ期にある細胞はＤＮＡの複製を開始し、Ｇ₂及びＭ期では細胞分裂が起こる。細胞周期がどの段階にあるかによって、細胞のＤＮＡ量は異なる。Ｇ_0/1期の細胞は染色体が１組であるのに対し、Ｇ₂及びＭ期の細胞は染色体が２組存在する。Ｓ期の細胞ではＤＮＡの複製が進行しているので、ＤＮＡ量は染色体１組と２組との間の値をとる。ＤＮＡの分解はアポトーシスの一つの指標となる。ｓｕｂ−Ｇ₁領域は、ＤＮＡの断片化したアポトーシス細胞に相当する低二倍体ＤＮＡピークを示す。ＤＮＡ染料（ヨウ化プロピジウムＰＩ等）を用いて、細胞ＤＮＡ量を調べた。５×１０⁵〜１×１０⁶個の細胞を細胞培養皿に入れ、任意量の試験化合物で任意の時間、処理した。細胞を保温してから回収し、冷却ＰＢＳで洗浄し、細胞ペレットを１ｍｌの７０％エタノール（−２０℃）に再懸濁した。得られた細胞ペレットを数ヶ月静置した。３ｍｌの冷却クエン酸ナトリウム溶液（３８ｍＭ、ｐＨ７．４）を添加し、細胞をペレット化し、５０μｇ／ｍｌのＰＩ及び５μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼを含む５００μｌのクエン酸ナトリウム溶液（３８ｍＭ、ｐＨ７．４）でＰＩ染色した。暗所にて３７℃で３０分間保温した後、細胞をＦＡＣＳ解析にて調べた。ＳｕｂＧ₁ピークはアポトーシス細胞の量を表す。

（結果）
化合物１、２及び３で処理を行い、成長停止シグナル発信腫瘍抑制蛋白質ｐ２１（ｐ２１／ｗａｆ）及び抗アポトーシス蛋白質ＢＣＬ−Ｘ_L発現を解析した。後者の発現低下はアポトーシス誘導の必須条件と考えられる。図５は、化合物１、２及び３の使用がｐ２１の蛋白質発現量を実際に増加させ、同時にＢＣＬ−Ｘ_L蛋白質発現量を低下させたことを示す。化合物２及び３は８μＭでｐ２１発現とＢＣＬ−Ｘ_L発現低下とを誘導し、化合物１は４０μＭでｐ２１発現を、２００μＭでＢＣＬ−Ｘ_L発現低下を誘導した。

ヒトの胸、結腸、膵臓、前立腺由来の様々な腫瘍細胞系の成長は、化合物１、２及び３によって阻害された（図６）。５０％の成長停止を誘導する濃度は、化合物１で８〜７０μＭ（平均３３μＭ）、化合物２で５〜２６μＭ（平均１５μＭ）、化合物３で０．５〜８μＭ（平均２．６μＭ）であった。

ＢＶ１７３細胞系を用いた研究の結果、化合物１及び２には、プログラムされた細胞死（アポトーシス）誘導剤としての活性があることが確認された。これに関する解析を図７に示す。ｓｕｂ−Ｇ１領域（Ｍ１）は、ＤＮＡの断片化したアポトーシス細胞に相当する低二倍体ＤＮＡピークを示す。この量は１００μＭの化合物１で処理した細胞、５０μＭの化合物２で処理した細胞、５μＭの化合物３で処理した細胞において５０〜６０％まで顕著に増加した。しかしこのアポトーシスは汎カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤの存在下で完全に阻害された。この事実もまた、化合物１、２及び３にアポトーシス誘導能があることを裏付けている。

図１は、レポーター細胞系ＵＡＳ ＴＫ−ｌｕｃにおける、化合物１、２及び３の処理から２４時間後のＨＤＡＣ依存性転写抑制の緩和を示す。細胞を図示の濃度の化合物１、２及び３で処理した後のルシフェラーゼ発現を誘導倍率（fold induction）で表した。 図２は、図示の濃度の化合物１、２及び３で６時間処理した後の２９３Ｔ細胞におけるヒストンＨ４高アセチル化の誘導を示す。 図３は、図示の濃度の化合物１、２及び３で処理したヒーラ細胞の核抽出物における生体外ＨＤＡＣ活性の阻害を示す。相対ＨＤＡＣ活性は未処理核抽出物の活性のパーセントとして示した。 図４は、図示の濃度の化合物３で処理した組換えＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ６及びＨＤＡＣ８酵素の生体外ＨＤＡＣ活性の阻害を示す。相対ＨＤＡＣ活性は未処理ＨＤＡＣ酵素の活性のパーセントとして示した。 図５は、図示の濃度の化合物１、２及び３で３６時間処理して誘導したＫ５６２細胞における、抗アポトーシス分子ＢＣＬ−Ｘ_Lの蛋白質発現量の低下及び細胞周期阻害剤ｐ２１の蛋白質発現量の上昇を示す。 図６は、様々な癌細胞系を７２時間処理した後、細胞バイオマス５０％低減（ＩＣ₅₀）を誘導する化合物１、２及び３の濃度を示す。 図７は、図示の濃度の化合物１、２及び３で２４時間処理した後のＢＶ−１７３細胞におけるアポトーシスの誘導を示す。アポトーシスは、ヨウ化プロピジウムで処理した細胞中のｓｕｂ−Ｇ１個体群の増加（これは汎カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤで処理した後にベースラインレベルまで減少する）によって実証される。

Claims (17)

1. 一般式（Ｉ）
   

   

   （式中、
   ｎは３個から７個の炭素原子を有する非芳香族環系であり；
   ＸはＣＨ又はＣＨ_２であり；
   ＹはＣＨ又はＣＨ_２であり；
   ＺはＣＨであり；
   ＺとＹを結ぶ点線は一重結合であり；
   ＹとＸを結ぶ点線は一重結合または二重結合であり；
   ｐは１である；）
   で表される化合物又はその薬学的に認容可能な塩（但し、下記化合物
   

   

   は除く）。
2. ｎがシクロペンチル又はシクロヘキシルである請求項１に記載の化合物。
3. ｎがシクロペンチル又はシクロヘキシルである請求項１に記載の化合物。
4. 請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の化合物を遊離形態あるいはその薬学的に認容可能な塩を含むことを特徴とする薬学的組成物。
5. 医薬品としてヒストン脱アセチル化酵素阻害活性を有する請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の化合物。
6. ヒストン脱アセチル化活性を有する酵素の阻害剤として疾病の治療又は療法に使用する医薬品の製造に請求項５に記載の化合物を使用する使用方法。
7. ヒストン脱アセチル化活性の阻害が有効である疾病の治療又は療法に使用する医薬品の製造に請求項５に記載の化合物を使用する使用方法。
8. ヒトヒストン脱アセチル化酵素がＨＤＡＣ１〜１０又はＳＩＲ蛋白質属の構成要員から選択される請求項６に記載の使用方法。
9. 細胞の分化の誘導に対する医薬品の製造に請求項５に記載の化合物を使用する使用方法。
10. 形質転換細胞の分化の誘導に対する医薬品の製造に請求項５に記載の化合物を使用する使用方法。
11. 形質転換細胞のアポトーシスの誘導用の医薬品の製造に請求項５に記載の化合物を使用する使用方法。
12. 形質転換細胞の増殖阻害用の医薬品の製造に請求項５に記載の化合物を使用する使用方法。
13. 請求項１に記載の化合物よりなるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤。
14. ヒストンのハイパーアセチレーションの誘導が有利な効果を有する医薬品の製造に請求項５に記載の化合物を使用する使用方法。
15. 皮膚ガン、色素細胞腫、エストロゲンレセプタ−依存及び非依存線維芽ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、腎臓ガン、大腸ガン及び直腸ガン、脾臓ガン、頭部及び頸部のガン、微小細胞及び非微小細胞肺ガン、白血病及びその他の種類の血液細胞ガン及び甲状腺対抗症候群等のヒストンデアシラーゼの異常補充に基づく内分泌疾患からなる群より選択された疾患の治療及び療法に使用する医薬品の製造に請求項５に記載の化合物を使用する使用方法。
16. 炎症性の疾患、糖尿病、サラセミア、肝硬変又は原生動物感染等の異常遺伝子発現の抑制に使用するための医薬品の製造に請求項５に記載の化合物を使用する使用方法。
17. 式（ＩＩ）
    

    

    （式中、ｎ、Ｘ、Ｙ、Ｚ及びｐは請求項１で定義した通りである）
    で表される酸又は式（ＩＩＩ）
    

    

    （式中、ｎ、Ｘ、Ｙ、Ｚ及びｐは請求項１で定義した通りである）
    で表される酸塩化物をヒドロキシルアミンと反応させる工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の化合物の製造方法。

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